CN204925134U - 一种用于膀胱癌的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及医学检验技术领域，具体涉及一种用于膀胱癌的检测试剂盒。该检测试剂盒包括设有凹槽的盒体(1)，所述盒体(1)内设置有酶标板(2)和试剂瓶(3)；所述酶标板(2)包括包被有抗EpCAM抗体的反应槽(21)；所述试剂瓶(3)包括酶标瓶、抗EpCAM标记抗体瓶。应用本实用新型的检测试剂盒可以判断癌症侵略性水平，灵敏度高，操作简便，使用尿液作为检测标本，具有采集方便，操作无创的优势。

Description

一种用于膀胱癌的检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及医学检验领域，具体涉及一种用于膀胱癌的检测试剂盒。

背景技术

膀胱癌是中国泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤，近年来其发病率仍呈上升趋势。早期诊断患者的预后良好，术后5年生存率可达94％。

膀胱癌的诊断主要依赖膀胱镜检查和尿液脱落细胞学检查。膀胱镜检是膀胱癌诊断的主要手段，但侵入性检查导致患者痛苦大，依从性差，且费用较高，可发生尿道感染、出血等并发症，约有10％的病灶被漏诊，且其诊断原位癌的敏感度很低。尿细胞学是膀胱癌诊断和术后随诊的主要方法之一，但检查结果回报慢，且受检查员的主观影响大，其诊断膀胱癌敏感度仅为35％，易产生假阳性，据推测，尿液脱落细胞学检查会漏诊约60％的高级别膀胱癌。

国内外很多研究致力于寻找更理想的膀胱癌早期诊断标志物，以期减少膀胱镜的使用，并补充、替代尿液脱落细胞学检查，以提高诊断准确性，协助疾病风险评估，监测肿瘤的恶性程度，预测肿瘤进展，使膀胱癌的诊断更为准确、经济。

目前发现的主要膀胱癌肿瘤标志物包括BAT、NMP22、FDP、CK、EpCAM等。

BAT(膀胱肿瘤抗原)又被称为补体因子H相关蛋白，对膀胱肿瘤诊断的准确率中等，易随尿液状态的改变而出现假阳性，如浓缩尿、血尿、行侵入性检查及经BCG治疗后。还不能代替尿细胞学检查，也不能单独应用于膀胱癌诊断。

NMP22(核基质蛋白22)可用于膀胱癌的早期筛查，但假阳性率较高，泌尿系统感染、结石、前列腺增生、放疗、BCG治疗、泌尿系腔内器械操作等均会增加NMP22的假阳性率，减弱了NMP22的临床实用性。

FDP(纤维蛋白降解产物)，膀胱癌的临床分期越高，尿FDP的浓度越高，尿FDP水平检测对判断膀胱癌的复发具有参考价值，可以用于膀胱癌的诊断及是否复发的判断。高分级的肿瘤更易引起FDP的漏检，所以FDP对高分级的肿瘤预测价值更好。

CK(细胞角蛋白)，与膀胱癌诊断、检测复发及预后关系最相关的主要有CK19、CK20，需通过外周血检测，可监测肿瘤转移、复发。

EpCAM(Epithelialcelladhesionmolecule，上皮细胞黏附分子)，膀胱癌患者EpCAM含量与正常对照组相比明显升高，且EpCAM含量的升高对于分级为3级及以上和T2+膀胱癌具有特异性。

以上膀胱癌肿瘤标记物中，通过对EpCAM蛋白进行检测，不仅可以实现膀胱癌的快速灵敏诊断，而且针对EpCAM蛋白检测，可以检测膀胱癌的侵略性水平，对患者的诊断和病情风险分级具有极大的临床应用价值。

实用新型内容

本实用新型需要解决的现有技术的问题是：现有的用于膀胱癌检测的试剂盒，只用于检测是否患有癌症，无法确定癌症侵略性水平，而且检测灵敏度和特异性低。

为了解决上述问题，本实用新型提供了如下技术方案：

本实用新型提供了一种用于膀胱癌的检测试剂盒，包括设有凹槽的盒体1，其特征在于：所述盒体1内设置有酶标板2和试剂瓶3；

所述酶标板2包括包被有抗EpCAM抗体的反应槽21；

所述试剂瓶3包括酶标瓶、抗EpCAM标记抗体瓶。

优选的，所述酶标瓶为辣根过氧化物酶标记的亲和素酶标瓶。

优选的，所述反应槽的数量为96或48个。

优选的，所述试剂瓶3还包括标准品瓶、稀释液瓶、洗涤液瓶、底物液瓶和终止液瓶。

优选的，所述底物液瓶包括显色液A瓶和显色液B瓶。

优选的，所述酶标瓶：抗EpCAM标记抗体瓶：所述稀释液瓶：洗涤液瓶：终止液瓶：显色液A瓶：显色液B瓶：标准品瓶的容积比为:5-10:5-10:10-20:30-50:5-10:5-10:5-10:1-2。

优选的，所述酶标瓶的容积为5-10ml、抗EpCAM标记抗体瓶的容积为5-10ml、所述稀释液瓶的容积为10-20ml、所述洗涤液瓶的容积为30-50ml、所述终止液瓶的容积为5-10ml、所述显色液A瓶的容积为5-10ml、所述显色液B瓶的容积为5-10ml、所述标准品瓶的容积为1-2ml。

本试剂盒的检测原理为：采用抗体-抗原-抗体双抗体夹心法对膀胱癌的肿瘤标记物EpCAM蛋白进行检测，检测相抗体经生物素(biotin)标记。样品和生物素标记的抗体先后加入酶标板的反应槽反应后，采用PBST洗涤。随后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素反应；经过PBST的彻底洗涤后用底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB在辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，其颜色的深浅和样品中的待测因子呈正相关。

其中，所述酶标板、试剂瓶的数量和容积不受限制，可根据实际需要进行调整。

采用不同浓度的EpCAM抗体标准品进行定量测定，根据不同浓度标准品和样品检测的结果，进行线性范围的计算得到检测范围，EpCAM的检测范围为25pg/ml～1000pg/ml。选用不含EpCAM的空白样本，测定均值和标准差，计算EpCAM的检测限为1pg/ml。

本实用新型的有益效果是：

(1)本试剂盒通过检测结果可以判断癌症侵略性水平，即恶性程度，指导医生进行检查和治疗，有助于调整和加快患者治疗。

(2)本试剂盒灵敏度高，早期诊断不漏诊，防止治疗延误，可以用于对新发患者进行检测，也可以用于对复发患者进行检测。

(3)使用尿液作为检测标本，具有采集方便，操作无创，采集的标本量大，易获得对照人群的标本等优势。

(4)酶联免疫法技术操作简便，结果回报快，费用低。

下面结合附图和各个具体实施方式，对本实用新型及其有益技术效果进行详细说明。

附图说明

图1为实施例一的用于膀胱癌的检测试剂盒的结构示意图，其中，1为盒体，2为酶标板，3为试剂瓶。

图2为实施例一所述的试剂盒内部结构的俯视图，其中12为酶标板槽，13为试剂瓶槽。

图3为实施例一所述的试剂盒的酶标板的结构示意图，其中21为反应槽。

具体实施方式

如上所述，本实用新型的目的在于：提供一种用于膀胱癌检测的试剂盒，实现膀胱癌的高灵敏度和高特异性检测，不仅用于膀胱癌的检测，同时用于检测膀胱癌的侵略性水平。

下面结合附图和实施例对本实用新型作进一步详细的说明。其中，实施例中，所用各试剂的厂家如下：

EpCAM标准品，厂家：上海华壹生物科技有限公司

抗EpCAM多克隆抗体，厂家：武汉伊莱瑞特生物科技有限公司

生物素标记试剂盒，厂家：武汉伊莱瑞特生物科技有限公司

链酶亲和素-HRP，厂家：上海华壹生物科技有限公司

3,3',5,5'，-四甲基联苯胺(TMB)，厂家：上海华壹生物科技有限公司，作为实施例中的底物液A和底物液B用。

牛血清白蛋白(BSA)，厂家：天津希恩思生化科技有限公司

聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯(TWEEN20，吐温20)，厂家：天津开发区乐泰化工有限公司

磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、碳酸钠、碳酸氢钠、浓硫酸等常用试剂均购自于天津市科密欧化学试剂有限公司

其中，各试剂的配制方法如下：

1)稀释液(PBS)：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠2.7g，磷酸二氢钾0.2g，加蒸馏水至1000ml，pH：7.4。

2)包被液(0.05M碳酸盐缓冲液)：碳酸钠1.59克，碳酸氢钠2.93克，加蒸馏水至1000ml，pH9.6。

3)洗涤液(PBST)：含0.05％吐温-20的PBS溶液(1LPBS中加入500μlTween-20，充分混匀)。

4)封闭液：牛血清白蛋白(BSA)5克，加洗涤缓冲液至100ml。

5)终止液：双蒸水180ml，加浓硫酸至200ml。

6)生物素标记EpCAM抗体：按照生物素标记试剂盒的操作步骤，制备得到生物素标记的抗EpCAM抗体。

实施例一

一、试剂盒

实施例一提供了一种用于膀胱癌的检测试剂盒，所述试剂盒包括带有凹槽的盒体1，所述盒体1内设置有酶标板2和放置于凹槽上的试剂瓶3，所述酶标板包括包被有抗EpCAM的多克隆抗体的反应槽21，所述试剂瓶3包括酶标瓶、抗EpCAM标记抗体瓶，如图1所示。所述试剂盒的内部结构的俯视图，如图2所示，其中12为酶标板槽，13为试剂瓶槽，分别用于放置酶标板和试剂瓶。

其中，所述试剂盒含酶标瓶1瓶，其容积为10ml，其中装有辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素8ml。

所述酶标板设置有96个反应槽。与酶标板配套使用的板盖，用于酶标板上的反应槽与外界隔绝，以防被灰尘或者其他污染物污染。

所述试剂瓶3包括标准品瓶、稀释液瓶、洗涤液瓶、底物液瓶和终止液瓶，所述底物液瓶包括显色液A瓶和显色液B瓶。

其中，所述抗EpCAM标记抗体瓶装有生物素标记的抗EpCAM抗体8ml，其容积为10ml。

所述稀释液瓶1瓶，其容积为20ml，装有稀释液15ml。

所述洗涤液瓶1瓶，其容积为50ml，装有洗涤液40ml，用于每步反应之后洗去未结合的抗体及杂质。

所述终止液瓶1瓶，其容积为10ml，装有终止液8ml。

所述显色液A瓶装有底物A溶液8ml，其容积为10ml；所述显色液B瓶装有底物B溶液8ml，其容积为10ml。

所述标准品瓶1瓶，其容积为2ml，装有800pg/ml的EpCAM标准品1.0ml，用于检测时配制标准曲线，其目的是用来表征被测样本的浓度。

实施例中所述试剂盒中所述酶标板的制备方法如下：

用包被液将抗EpCAM多克隆抗体稀释为1μg/ml，取150μl/孔加入到酶标板的反应槽中，4℃放置过夜后，用洗涤液200μl/孔洗板三次，每次3分钟，甩干，除去多余的抗EpCAM多克隆抗体及其他杂质，用封闭液250μl/孔在室温下封闭1小时，甩干后在40℃下烘干0.5小时，得到包被有抗EpCAM多克隆抗体的酶标板。

所述试剂盒还包括干燥剂和说明书。

二、试剂盒检测

(一)试剂盒使用步骤如下：

(1)根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

(2)分别加入稀释好后的EpCAM标准品50μl于反应孔、加入待测样品50μl于反应槽内。立即加入50μl的生物素标记的抗EpCAM的抗体。盖上板盖，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

(3)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

(4)每孔加入100μl的链酶亲和素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

(5)甩去孔内液体，每孔加200μl洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

(6)底物A、B液混匀，每孔加入100μl，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟，避免光照。

(7)取出酶标板，迅速加入50μl终止液，加入终止液后应立即测定结果。

(8)利用酶标仪，在450nm波长处测定各孔的OD值。

注意：使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

结果判断与分析：

采用酶标仪(出售厂家：美国伯乐Bio-Rad，型号iMark)，在450nm波长处测定各孔的OD值。以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的EpCAM标准品浓度为横坐标(X)，做得相应的曲线，样品的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用抗EpCAM标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

(二)试剂盒的性能检测

(1)准确性：采用回收实验，选择已知高浓度EpCAM标准品定量加入低浓度尿液样本中进行分析测定，按照从低到高的浓度顺序，每个样本测定3次，取平均值，测定结果与已知理论浓度相比较，平均回收率为100.4％，比例系统误差＝|100％-100.4％|＝0.4％。

表1回收实验测定数据

(2)特异性：指的是一种抗体不与其它细胞因子反应，识别特定抗原决定簇的能力，交叉反应率指的是将反应的最大结合率抑制下降50％时，特异性抗原与类似物的剂量之比。

实验测得，本试剂盒的交叉反应率＝20pmol/L÷1000pmol/L*100％＝2％，特异性为98％。

(3)精密度：分析内精密度，采用EpCAM标准品在同一条件下，采用同样的方法、试剂、参考物、仪器、实验室和操作人，重复测定10次，测定结果的变异系数CV％为7％；分析间精密度，采用EpCAM标准品在不同条件下，即不同时间，由不同的操作人员重复测定10次，CV％为9％。其中，采用标准差与平均数的比值称为变异系数，记为CV。

表2精密度实验测定数据

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	CV％
												分析内	80	73	78	74	85	75	86	88	74	83	7％
分析间	88	74	72	72	90	76	82	87	86	89	9％

(4)检测范围：配制8个不同浓度样本溶液，10，50，100，200，500，1000，1500，2000pg/ml，分别测定吸光度，计算样本浓度与吸光度的相关系数，R²不小于0.95的范围为线性范围，即25-1000pg/ml。

(5)检测限：选用不含EpCAM的空白尿液样本，重复测定20次，计算测定结果的均值和标准差，空白均值加两倍标准差即得到检测限1pg/ml。

(6)参考值：EpCAM的正常值为0-50pg/ml，当其浓度为50-400pg/ml时，表征的是侵略性低，浓度>400pg/ml时，表征的是侵略性高。

实施例二

实施例二与实施例一的不同之处在于：

实施例二中的酶标板设置有48个反应槽，与酶标板配套使用的板盖，用于酶标板的反应槽与外界的隔绝，以防被灰尘或者其他污染物污染。

其中，所述酶标瓶1瓶，其容积为5ml，酶标瓶中装有辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素4ml。

其中，所述抗EpCAM标记抗体瓶1瓶，其容积为5ml，装有抗EpCAM标记的抗体4ml。

所述稀释液瓶1瓶，其容积为10ml，装有稀释液8ml。

所述洗涤液瓶1瓶，其容积为30ml，装有洗涤液20ml。

所述终止液瓶1瓶，其容积为5ml，装有终止液4ml。

所述显色液A瓶装有底物A溶液3ml，其容积为5mL；所述显色液B瓶装有底物B溶液3ml，其容积为5ml。

所述标准品瓶1管，其容积为1ml，装有800pg/ml的抗EpCAM标准品0.5ml。

以上所述仅为本实用新型较佳实施例，并不用于局限本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在实用新型的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于膀胱癌的检测试剂盒，包括设有凹槽的盒体(1)，其特征在于：所述盒体(1)内设置有酶标板(2)和试剂瓶(3)；

所述酶标板(2)包括包被有抗EpCAM抗体的反应槽(21)；

所述试剂瓶(3)包括酶标瓶、抗EpCAM标记抗体瓶。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶标瓶为辣根过氧化物酶标记的亲和素酶标瓶。

3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反应槽的数量为96或48个。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶(3)还包括标准品瓶、稀释液瓶、洗涤液瓶、底物液瓶和终止液瓶。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述底物液瓶包括显色液A瓶和显色液B瓶。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶标瓶：抗EpCAM标记抗体瓶：所述稀释液瓶：洗涤液瓶：终止液瓶：显色液A瓶：显色液B瓶：标准品瓶的容积比为：5-10：5-10：10-20：30-50：5-10：5-10：5-10：1-2。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶标瓶的容积为5-10ml、抗EpCAM标记抗体瓶的容积为5-10ml、所述稀释液瓶的容积为10-20ml、所述洗涤液瓶的容积为30-50ml、所述终止液瓶的容积为5-10ml、所述显色液A瓶的容积为5-10ml、所述显色液B瓶的容积为5-10ml、所述标准品瓶的容积为1-2ml。