CN1985007A - 鉴定介导活细胞对药物响应的基因的方法 - Google Patents

Abstract

一方面，本发明提供了确定一个基因是否介导活细胞对药物响应的方法。另一方面，本发明提供了对KSP抑制剂响应的哺乳动物受试者的鉴定方法。

Description

鉴定介导活细胞对药物响应的基因的方法

发明领域

本发明涉及鉴定介导活细胞对药物(agent)响应的基因的方法，例如活细胞对治疗性药物分子的响应。

发明背景

对介导活细胞响应药物的基因鉴定使得组合物和方法获得了发展，该组合物和方法能够使活细胞对药物的响应发生所希望的变化。例如，研发治疗哺乳动物疾病新方法的一种途径是，首先鉴别出一个在哺乳动物体内表达的基因，该基因有助于发展和/或维持这种疾病。这种基因相比正常表达方式和表达水平，可能会诸如过度表达、不表达和/或在错误地点或时间表达。再如一个突变基因可能会表达出其正常基因产物的变异体(如蛋白或生物活性RNA分子)，并且这种变异基因产物可能会对一个或多个生物过程产生错误的影响。例如一个可编码变异受体蛋白的突变基因在一种哺乳动物细胞中表达，从而使一个或多个与该受体相关的生化信号传导途径组成型活化。这种组成型活化的途径可能会引起疾病在患病哺乳动物上发展。

因此一种突变的基因产物，或一种表达水平、表达时间、表达地点错误的基因产物，或者任何非正常表达模式的基因产物，都可能成为药物治疗的靶标，这种治疗使用与该基因产物相互作用并抑制其生物活性的分子。鉴别并测试新的药物分子是一项耗时并且昂贵的过程，所以在尝试鉴别与该基因产物相互作用并抑制其生物活性的分子之前，首先正确的鉴别有助于发展和/或维持哺乳动物疾病的基因是重要的。因此，不断需要有通过基因的编码产物来确定基因是否介导活细胞对化学药物响应的方法。更一般来说，不断需要有确定基因是否介导活细胞响应药物的方法，这种药物可能是化学药物(如治疗药物)，能量(如紫外辐射)或者物理作用(如作用力，如作用在血管细胞上的剪切力)。

发明概述

首先，本发明提供了确定基因是否介导活细胞响应药物的方法，该方法的步骤包括：(a)通过向细胞型的活细胞中引入干扰RNA，使该细胞中的基因功能性失活，这个基因的表达模式与该细胞型活细胞对药物的响应有关，同时这个基因在该细胞性所有活细胞中都有拷贝存在；(b)使该药物与包含干扰RNA的活细胞接触；(c)确定该活细胞对药物的响应是否不同于不含干扰RNA的同型活细胞对该药物的响应，从而确定该基因是否介导了该型活细胞对这种药物的响应。本发明此方面的这个方法任选包括在使用干扰RNA使该基因功能性失活之前鉴别表达模式与该活细胞响应药物相关的基因这一步骤。

本发明第一方面的方法是用于确定是否有何种基因介导了何种活细胞对何种药物的何种响应。例如，本发明第一方面的方法可用于确定一个基因是否(通过其编码产物)介导了一种哺乳动物活细胞对治疗性药物的有利或不利响应。这种介导了哺乳动物活细胞对治疗性药物的有利或不利响应的基因编码产物(如蛋白)，其本身就是一个适于提高该治疗性药物的作用(或减少其不利的副作用)的药物的潜在靶标。例如，本发明第一方面的方法可用来确定基因是否介导了哺乳动物癌细胞对化学治疗剂的抗性(即癌细胞在被重复暴露于该治疗剂后对其敏感性降低)。这种介导了哺乳动物癌细胞对化学治疗剂的抗性的基因编码产物(典型的为蛋白)，可能就是一个药物靶标，这种药物抑制了这个基因产物在癌细胞中的活性，因此减弱了癌细胞对化学治疗剂产生抗性的趋势。又如，本发明第一方面的方法可用来鉴别介导了哺乳动物活细胞、组织、器官和/或生物体对治疗性药物的有利响应(如一种病态的好转)的基因。这种基因产物可能是新型药物的靶标，可用于进一步使这种病态好转。因此本发明第一方面的方法可以在例如研发人类和/或其它哺乳动物疾病的新型治疗性药物或研发用以改进现有药物疗效的新型药物的过程中发挥作用。

另一方面，本发明提供了确认一个基因有助于活细胞对药物的响应的方法。本发明这个方面的方法分别包括以下步骤，(a)通过向一种细胞型的活细胞中引入干扰RNA，使该细胞中的基因功能性失活，其中基因的表达模式与该细胞型活细胞对药物的响应有关，并且这个基因在该细胞型所有活细胞中都有拷贝存在；(b)通过确定该活细胞对药物的响应不同于不含干扰RNA的活细胞对该药物的响应，从而确认该基因有助于活细胞对这种药物的响应。本发明此方面的方法可用来确认何种基因有助于活细胞对何种药物的何种响应。例如本发明此方面的方法可用于确认一个基因有助于哺乳动物活细胞对治疗性药物的所需或相反响应。

另一方面，本发明提供了哺乳动物受试者对KSP抑制剂响应的鉴别方法。这些方法的每一个都包括分析哺乳动物受试者癌细胞的20号染色体的步骤，以确定20号染色体的20q段在该癌细胞中是否被扩增，如果20号染色体的20q段在该癌细胞中未被扩增，则该哺乳动物受试者被鉴定为响应KSP抑制剂。因此，本发明这个方面的方法可用于如鉴别出可能受益于KSP抑制剂治疗的人类癌症患者(即经鉴定为响应KSP抑制剂的这些癌症患者，可作为接受KSP治疗的候选人)。

优选实施方案详述

这里除非特别指明，则本文所用的所有术语都具有与本发明领域技术人员所知的相同的含义。关于本领域的定义和术语，操作者具体参考Sambrook等(1989)的分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)2nd ed.，Cold Spring Harbor Press，Plainsview，New York(1989)，以及Ausubel等的分子生物学通用方法(Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47))，John Wiley&Sons，New York(1999)。

这里所用的术语“药物”包括任何在体内和/或体外引起活细胞生物响应的物理、化学或能量作用。因此，比如术语“药物”包括化学分子，如可用于治疗一种或多种活体生物如哺乳动物(例如人类)疾病的候选治疗性分子。术语“药物”也包括能量刺激，如紫外线。术语“药物”还包括物理刺激，例如施加于活细胞上的作用力(如压力、拉力或剪切力)。术语“药物”也包括能够感染活细胞的病毒。术语“药物”包括KSP蛋白的抑制剂。代表性的KSP抑制剂包括小分子有机化合物，例如缩氨基脲和缩氨基硫脲。比如KSP抑制剂可能是一种芳基缩氨基硫脲。芳基缩氨基硫脲KSP抑制剂的例子包括但不限于1，1’-联苯基-4-甲醛缩氨基硫脲、4-异丙基苯甲醛缩氨基硫脲(参见美国专利No.3,849,575)、4-环己苯基甲醛缩氨基硫脲和4-异丙基-3-硝基-苯甲醛缩氨基硫脲(参见Saripinar et al.(1996)Arzneimittel-Forschung 46(II)：824-8)。其它KSP抑制剂的例子被描述于以下公开的国际专利申请书，其中每个均通过引用结合到本文：WO 2003/106417A1、WO 2003/105855A1、WO 2003/099211A2、WO2003/079973A2、WO 2003/050122A2、WO 2003/050064A2、WO2003/049679A2、WO 2003/049678A2、WO 2003/049527A2，WO2003/039460A2。

KSP是驱动蛋白纺锤体蛋白(kinesin spindle protein)的缩写。KSP有时在文献中又称为hsKSP、KNSL-I或kinesin-like-1。KSP是BimC驱动蛋白亚家族的成员，并且是细胞有丝分裂必需的有丝分裂驱动蛋白。驱动蛋白是一种酶，它将ATP水解释放的能量转化为沿细胞内丝方向的机械力以在胞内发挥作用。有丝分裂驱动蛋白是一种功能性驱动蛋白亚组，它以规则的方式发挥作用以驱动有丝分裂和细胞分裂过程中的DNA分离。这些细胞骨架动力蛋白以机械级联方式协同作用，以影响有丝分裂中的纺锤体形成及其作用。KSP综述见Miki et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci 98：7004-7011(2001)和Dagenbach andEndow，J.Cell Sci 117：3-7(2004)。典型的KSP与SEQ ID NO：1中列出的代表性KSP氨基酸序列至少有90％以上的一致性。

STK6是丝氨酸/苏氨酸激酶6的缩写，它是极光激酶(Aurorakinase)家族的成员。极光激酶家族的成员有助于调节有丝分裂过程中的染色体分离和胞质分裂。STK6蛋白的描述见如Kimura，M.；et al.，J.Biol.Chem.272：13766-13771(1997)和Kimura，M.，et al.，Cytogenet.Cell Genet.79：201-203(1997)。典型的STK6蛋白编码基因至少与SEQID NO：2中列出的代表性STK6基因序列有90％以上的一致性。典型的STK6蛋白编码基因与SEQ ID NO：2中列出的代表性STK6基因序列的互补序列在55℃、5×SSC的条件下杂交12h，然后于55℃、5×SSC洗涤1h。一些STK6蛋白编码基因与SEQ ID NO：2中列出的代表性STK6基因序列的互补序列在65℃、5×SSC的条件下杂交12h，然后65℃、5×SSC洗涤1h。代表性的杂交方法在上述Sambrook等9.52-9.55页中列出。

TPX2蛋白有助于有丝分裂过程中与染色体相关的微管蛋白的形成(见如Grass，et al.，Nature Cell.Biol.4：871-879(2002)，Heidebrecht，H.J.et al.，Blood 90：226-233(1997)，Kufer，T.A.，J.Cell Biol.158：617-623(2002)，Manda，R.，et al.，Genomics 61：5-14(1999)和Zhang，Y.，etal.，Cytogenet.Cell Genet.84：182-183(1999))。典型的TPX2蛋白编码基因至少与SEQ ID NO：3中列出的代表性TPX2基因序列有90％以上的一致性。典型的TPX2蛋白编码基因与SEQ ID NO：3中列出的代表性TPX2基因序列的互补序列在55℃、5×SSC的条件下杂交12h，然后55℃、5×SSC洗涤1h。一些TPX2蛋白编码基因与SEQ IDNO：3中列出的代表性TPX2基因序列的互补序列在65℃、5×SSC的条件下杂交12h，然后65℃、5×SSC洗涤1h。代表性的杂交方法在上述Sambrook等9.52-9.55页中列出。

术语“百分一致性”或“一致性百分比”是候选多肽序列氨基酸残基中与主题多肽分子序列相同的序列所占百分比，或者是候选核酸中与主题核酸分子序列相同的序列所占百分比，这个数据是在将候选物与主题序列进行比对后得到的最大相同程度的百分比。

序列一致性可以用如确定相似性的计算机程序来确定，如使用TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、CLUSTALW(Pearson andLipman，1988，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.85：2444-2448；Altschul et al.，1990，J.MoI.Biol.215：403-410；Thompson et al.，1994，Nucleic AcidsRes.22：4673-4680；和Higgins et al.，1996，Methods Enzymol.266：383-402)。具体说，基本的局部比对搜索工具(Basic Local AlignmentSearch Tool，BLAST)(Altschul et al.，1990，J.MoI.Biol.215：403-410，BLAST算法“The BLAST Algorithm”；Altschul et al.，1997，Nucl.AcidsRes.25：3389-3402)是一种启发式(heuristic)的搜索算法，它用以搜索具备相似性的序列，这种相似性使用统计学方法(Karlin and Altschul(1990，Proc.Nat′l Acad.ScL U.S.A.，87：2264-2268；1993，Proc.Nat′lAcad.ScL U.S.A.90：5873-5877))来归纳显著程度。5种特殊BLSAT程序被用于以下任务：(1)WU-BLASTP程序将待测氨基酸序列与蛋白序列数据库进行比较；(2)WU-BLASTN程序将待测核酸序列与核酸序列数据库进行比较；(3)WU-BLASTX程序将待测核酸序列(两条链)的6个阅读框(six-frame)的相关翻译产物与蛋白序列数据库进行比较；(4)TBLASTN程序将待测蛋白序列与核酸序列数据库中的核酸(两条链)所有6个阅读框翻译产物进行比较；(5)TBLASTX程序将待测核酸序列的6个阅读框翻译产物与核酸序列数据库的6个阅读框翻译产物进行比较。美国国家医学图书馆、国立生物技术信息中心的网站(National Center for Biotechnology Information，NationalLibrary of Medicine，Building 38 A，Bethesda，MD 20894，U.S.A.)提供了上述BLAST工具。

Smith-Waterman算法(Smith-Waterman，1981，J.MoI.Biol.147：195-197)是一种计算严密的算法。FASTA(见Pearson et al.，1988，Proc.Nat′l Acad.ScL U.S.A.，85：2444-2448)是Smith-Waterman算法的启发式(heuristic)近似算法。关于BLAST、Smith-Waterman和FASTA算法的方法和优点的综合讨论见1998年Nicholas等的数据库序列搜索和序列赋值(Scoring)方法指南″A Tutorial on Searching SequenceDatabases and Sequence Scoring Methods″以及该文献引用的参考文献。

本发明的第一方面：首先本发明提供了确定一个基因是否介导活细胞对药物进行响应的方法，该方法步骤包括：(a)通过向一种细胞型的活细胞中引入干扰RNA，使该细胞中的基因功能性失活，这个基因的一种表达模式与该细胞型活细胞对药物的响应有关，同时这个基因在该细胞性所有活细胞中都有拷贝存在；(b)使该药物与包含干扰RNA的活细胞接触；(c)确定该活细胞对药物的响应是否不同于不含干扰RNA的同型活细胞对该药物的响应，从而确定该基因是否介导了该型活细胞对这种药物的响应。本发明此方面的这个方法可任选包括在使用干扰RNA使基因功能性失活之前的基因鉴定步骤，该基因的表达模式与该细胞型的活细胞对药物的响应相关。

本发明第一方面的方法可在体内活细胞中应用，或者在体外培养的活细胞中应用。当然可根据本发明第一方面的方法，处理多种代表性的活细胞(如体外培养的细胞群例如包含多种细胞的经培养的动物组织，或者如单细胞培养物)。

本发明的方法可应用于任何细胞类型，包括微生物细胞、昆虫(例如果蝇)细胞、其它无脊椎动物(例如线虫)细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、灵长类动物细胞、猫细胞、犬细胞和家畜细胞(如奶牛)。本发明此方面的方法可应用于任何哺乳动物癌细胞。

在本发明的这个方面，如果活细胞对一种药物的响应全部或部分依赖于基因编码的产物，那么就认为该基因介导了此活细胞对该药物的响应。因此当缺少该基因产物时此活细胞对该药物不响应，或者当缺少该基因产物时，此活细胞对该药物的响应的量度和/或持续时间相比该基因产物存在时的响应有所降低。基因产物包括蛋白、肽和核酸分子(如任何种类的RNA分子)。

活细胞对药物的响应可以为任何种类的响应，包括如生化响应或生理响应的强度和/或持续时间的水平升高或降低，或者如基因表达模式的任何变化。

本发明此方面的应用中被功能性失活的基因，具有与活细胞对药物响应相关的表达模式。这种相关性必须是统计学显著的，可以是正相关或负相关。

使用干扰RNA进行基因功能性失活：本发明此方面的应用中，通过向活细胞中引入干扰RNA分子来使该细胞中的基因发生功能性失活。文中所用的基因“功能性失活”指完全或部分破坏从基因转录的RNA，和/或完全或部分阻止从基因转录的RNA的翻译。因此通过将干扰RNA分子引入细胞，该基因的功能基本上被废除或完全被废除。

干扰RNA分子是双链RNA，它与活细胞中的信使RNA(mRNA)的全部或部分序列完全互补(或基本上互补)，并通过RNA干扰机制(RNAi)促进该mRNA的降解。RNA干扰是一种自然出现的现象，据信其功能在于保护细胞免受RNA病毒的侵入。尽管不希望受到理论的约束，但现在认为在RNA干扰过程中，当双链RNA病毒(缩写为dsRNA病毒)感染细胞时，该dsRNA被识别并被作为称为切酶的RNaseIII型酶裂解的靶标。该切酶将此dsRNA“切”为21个核苷酸的短双链结构，命名为siRNA或短-干扰RNA，由19个核苷酸长度的完全配对的核糖核苷酸对和每条链的3’末端各两个未配对的核苷酸所组成。这些短双链结构与一种名为RISC的多蛋白复合体结合，并将这个复合体定位于序列与该siRNA相似的mRNA转录物上。结果，RISC复合体中的核酸酶裂解此mRNA转录物，从而废除了该基因的表达。在病毒感染的情况下，该机制导致病毒转录物的裂解，从而防止病毒合成。

因为siRNA是双链结构，所以每条链都可能与RISC结合并使序列相似的转录物沉默。RNA干扰作用于任何外来双链RNA分子，并且不仅限于对RNA病毒的基因组发生作用。

干扰RNA分子的种类包括短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和长双链RNA，以及这些种类的化学修饰衍生物。短干扰RNA(siRNA)是双链RNA分子，长度为21-23核苷酸，它介导信使RNA(mRNA)分子的降解，使编码该mRNA的基因发生功能性失活。被降解的mRNA分子包括与此siRNA分子两条链中的一条互补(或至少部分互补)的核酸序列。一些siRNA分子包括9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个连续的核酸残基，这些核酸残基形成的序列与靶mRNA分子部分序列互补。

siRNA通常(虽然不是必需)包含一个与靶mRNA分子的一个19核苷酸区域完全互补(或至少部分互补)的19核苷酸区域，以及位于该19核苷酸区域的每个末端的长2个核苷酸的3’突出端。市售的具有限定核酸序列的定做的(custom)siRNA例如On-Target^TM siRNA，或者SMART^TM siRNA(Dharmacon，Inc.，2650 Crescent Drive，#100，Lafayette，CO 80026)。

选择用于介导靶mRNA分子降解的siRNA的代表性方法见美国临时专利申请序号60/515,180(提交于2003年10月27日)，该文献通过引用整体结合到本文。用siRNA分子促进哺乳动物细胞中靶mRNA分子降解的代表性方法示于美国临时专利申请序号60/515,223(提交于2003年10月27日)，该文献通过引用整体结合到本文。

应用本发明时可将合成的siRNA分子引入到活细胞中，从而模仿切酶裂解产物(参见如Elbashir et al.，Nature 411：494-498，2001；Elbashir et al.，Genes Dev.i5：188-200，2001，每个公开均通过引用整体结合到本文)。siRNA可是化学合成，或者可在体外用如重组切酶裂解双链RNA来产生。

已显示siRNA可用于体内使基因功能性失活。例如，Fas介导的细胞凋亡与许多肝脏疾病相关，通过抑制肝细胞的凋亡可挽救肝脏。Song(Song et al.，Nat.Medicine 9：347-351，2003)将以Fas受体为靶标的siRNA静脉注射到小鼠体内。小鼠肝脏细胞Fas的基因在mRNA和蛋白水平被沉默，从而阻止细胞凋亡，并保护小鼠免受肝炎引起的肝脏损伤。另一例子是Sorensen等人(J.MoI.Biol.327：761-766(2003))将以TNF-α为靶标的siRNA通过腹膜注射到小鼠体内。脂多糖诱导的TNF-α基因表达被抑制，从而保护这些小鼠免遭脓毒症。

短发夹RNA(shRNA)是短RNA分子，其中同一RNA分子内的两个互补部分相互杂交，形成了一个双链茎(通常为19-29个碱基对)和一个单链环。当shRNA被导入活细胞内时，此双链茎被加工为由19-23bp组成的一个短双链RNA分子。例如可通过载体(例如质粒或病毒)表达一个所需shRNA序列，该shRNA序列包含一个反向重复结构(可自身杂交以形成一个发夹结构)和一个间插序列(当反向重复序列杂交在一起后形成的一个单链环)。shRNA被导入细胞或通过载体在胞内表达，在胞内它被切酶加工以除去单链环，从而产生siRNA。质粒编码的shRNA可以在细胞内稳定表达，从而在体内或体外引起胞内基因长时间的功能性失活(动物实验见如McCaffrey etal.，Nature 418：3S-39，2002；Xia et al.，Nat.Biotech.20：1006-1010，2002；Lewis et al.，Nat.Genetics 52：107-108，2002；Rubinson et al.，Nat.Genetics 33：401-406，2003；Tiscornia et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA100：1844-1848，2003，所用文献均通过引用结合到本文)。使用shRNA进行基因功能性失活的论述见以下代表性文献：Paddison et al.，GenesDev.16：948-958(2002)；Brummelkamp et al.，Science 296：550-553(2002)；Sui，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：5515-5520(2002)；Paddison，et al，Nature 428：427-431(2004)；Bems et al.，Nature 428：431-437(2004)。所有文献均通过引用整体结合到本文。

长双链RNA是长度大于23bp(典型大于100bp)，以及在活细胞内被加工为一个或多个siRNA分子的双链RNA分子。

其它使用干扰RNA分子进行基因功能性失活的代表性方法在以下待审的美国临时专利申请中有描述(均通过引用整体结合到本文)：美国临时专利申请序号60/515,223(提交于2003年10月27日)；美国临时专利申请序号60/515,180(提交于2003年10月27日)。其它使用干扰RNA分子进行基因功能性失活的代表性方法在以下专利和公开的专利申请书中有描述(均通过引用整体结合到本文)：美国专利2002/0086356；美国专利申请公开号US2002/0086356；PCT公布说明书WO 02/44321和PCT公布说明书WO 03/006477。

可通过任何有效方法将干扰RNA分子(或编码干扰RNA分子的载体)导入细胞。例如可使用脂质转染法(使用脂质试剂如脂质转染胺试剂或oligofectamine(转染寡核苷酸专用的阳离子脂质体)或电穿孔将干扰RNA分子(或编码干扰RNA分子的载体)导入哺乳动物细胞。又如干扰RNA分子可以被果蝇细胞和线虫自发摄入摄入(如通过在果蝇培养基中添加干扰RNA分子，或者通过将线虫浸泡与含有干扰RNA分子的培养基中)。此外如可将编码shRNA的载体克隆到大肠杆菌(E.coli)中，再将该菌与线虫食物混合，从而干扰RNA分子被线虫内脏摄入摄入。

更一般的，可以使用磷酸钙法(最初由Graham和Van der Eb所述(Virology，52：546[1978])，此法改进见上述Sambrook等的16.32-16.37章)将核酸分子导入到培养哺乳动物细胞和其它没有致密细胞壁的细胞中。其它将DNA导入细胞的范例方法包括使用聚凝胺(Polybrene)(Kawai and Nishizawa，MoI.Cell.Biol，4：1172[1984])和电穿孔(Neumann et al.，EMSO J，1：841[1982])。

已知本领域有很多可用于将核酸分子导入植物细胞的方法。代表性的例子包括电穿孔易化的原生质体摄入摄入DNA法，其中瞬时电脉冲穿透细胞膜，使细胞可摄入摄入多种生物分子，包括核酸分子(Rhodes et al.，Science，240：204-207[1988])；聚乙二醇处理原生质体法(Lyznik et al.，Plant Molecular Biology，13：151-161[1989])；使用载有DNA的微轰击粒子轰击细胞，使其受爆炸力或压缩气体推动而穿过细胞壁(Klein et al.，Plant Physiol.91：440-444[1989]；Boynton etal.，Science，240：1534-1538[1988])。另外可使用植物病毒作为转运核酸分子的载体。这种植物病毒包括如花椰菜花叶病毒(Brisson et al.，Nature 310：511-514(1984))；此外Birch，R.G.，Ann Rev Plant PhysPlant MoI Biol，48：297(1997)和Forester等Exp.Agric，33：15-33(1997)综述了植物转化策略和技术。

干扰RNA分子可被导入到动物的器官或组织中，例如人体内(参见如Song et al.，Nat.Medicine 9：347-351，2003；Sorensen et al.，J.MoI.Biol.327：761-766，2003；Lewis et al.，Nat.Genetics 32：107-108，2002，均通过引用整体结合到本文)。例如可通过静脉将干扰RNA溶液注射到动物体内，随后干扰RNA被运输到目的器官或组织，干扰RNA在此处被该器官或组织细胞摄入。

检测转录物以确定基因表达模式：被功能性失活的基因的表达模式与某种细胞型的活细胞对药物的响应相关。在本发明的某些实施方案中，基因的表达模式是已知，而不必为实施本发明进行确定。在其它实施方案中，必须通过分析至少一个基因(典型的是几百或几千个基因)的响应某药物的表达模式，并将其与同类型细胞中相同基因在未接触该药物时的表达模式进行比较，来鉴别具有与该活细胞对该药物的响应相关的表达模式的基因。

一个具有与细胞对药物的响应相关的表达模式的基因可用于本发明第一方面的应用。可通过如鉴别与药物接触时表现出特定响应(特定响应如当接触化学药物时细胞(如体外培养细胞)死亡)的不同类型的活细胞(如不同类型的哺乳动物癌细胞)来鉴别这种基因。鉴定出的基因在未处理细胞中(此种细胞在用该药物处理时表现出响应)具有一种表达模式，而在用该药物处理时不表现出响应的未处理细胞中则没有发现此表达的模式。

这里的实施例1提供了在对KSP抑制剂L’962有抗性的结肠癌细胞系中也高水平表达的基因(即该基因在响应L’962(抗性)的癌细胞系中，表达水平被提高)实例。

又例如，具有与细胞对药物的响应相关的表达模式的基因可为具有如下表达模式的基因，它在接触了药物的细胞中的表达与在未接触该药物的同型细胞中的表达相比，有显著统计学差异。用在同样条件下培养的相同细胞类型的细胞进行这种表达模式的比较，除了一个细胞(或细胞群)与药物接触外，其他细胞(或细胞群)不与药物接触。

可通过使用如任何高通量技术来测量基因中核苷酸序列的表达水平。结果与所用测量表达水平的方法无关，为转录物或响应数据的绝对或相对量，包括但不限于表示丰度比的值。

基因的表达模式的测量可通过与转录物阵列杂交来进行。例如使用微阵列与带有可检测性标记的代表了细胞中存在的转录mRNA的核酸序列(如从全细胞mRNA合成荧光标记的cDNA)的多核苷酸进行杂交检测，来测得表达模式。微阵列是支持体上结合(如杂交)位点的位置可寻址的(positionally-addressable)阵列，阵列代表细胞或生物体基因组内的许多个核苷酸序列，优选大部分或几乎全部基因。每个这种结合位点都由连接于支持体上预定区域的多核苷酸探针组成。可通过许多途径来制备微阵列，其中数种描述如下。不管如何制备，微阵列具有一定共同特征。阵列可以再生，从而允许生产给定微阵列的多拷贝，便于相互比较。优选使用在结合(如核酸杂交)条件下稳定的材料制备微阵列。微阵列宜小，如在约1cm²-25cm²之间，优选约1-3cm²。但是，也可以考虑并可优选使用较大的阵列和较小的阵列，例如，来同时评价大量不同探针。

优选微阵列中给定的一个结合位点或单组结合位点可特异性结合(如杂交)来自细胞或生物体的单个基因(或来源于该基因的转录物)中的一段核酸序列。

微阵列包括一个或多个探针，其中每个探针都有一段与待测RNA或DNA的序列互补的多核苷酸序列。每个探针优选具有不同核酸序列，每个探针在阵列的固体表面的位置优选为已知。实际上，优选微阵列为可寻址的阵列，更优选为位置可寻址的阵列。更具体的说，阵列的每个探针优选定位在固体支持体上的已知预定位置，这样每个探针的标识(即序列)可从其在阵列上(即在支持体或表面上)的位置来确定。在本发明的一些实施方案中，阵列是有序的排列。

优选微阵列上或一组微阵列的探针密度为约每1cm²面积固定100个或更多的不同(即非同一)探针。更优选微阵列的每1cm²面积至少固定550个探针、每1cm²面积至少固定1,000个探针、每1cm²面积至少固定1,500个探针、每1cm²面积至少固定2,500个探针。在尤其优选的实施方案中，微阵列是高密度阵列，优选密度为每1cm²面积至少固定2,500个不同探针。因此用于本发明的微阵列优选含有至少2,500个、5,000个、10,000个、15,000个、20,000个、25,000个、50,000个或55,000个不同的(即非同一)探针。

在一个实施方案中，微阵列的阵列上每个位置代表一个独立的结合位点，以结合由基因编码的转录物中的核酸序列(如mRNA的外显子或来源于它的cDNA)。微阵列上结合位点的集合包含多个基因的多组结合位点。例如在不同实施方案中，微阵列可包含由生物体基因组少于50％的基因所编码的产物的结合位点。或者，微阵列可具有由生物体基因组中至少50％、75％、85％、90％、95％、99％，或100％的基因所编码的产物的结合位点。在其它实施方案中，微阵列可具有由生物体细胞表达少于50％，或至少为50％、75％、85％、90％、95％、99％，或100％的基因所编码的产物的结合位点。结合位点可以是DNA或DNA类似物，可与特定RNA进行特异性杂交。DNA或DNA类似物可以是，如相应基因的如合成低聚体或基因片段。

在本发明的一些实施方案中，通过一组结合位点表示概况分析(profiling)阵列中的基因或基因的外显子，这套结合位点包含的探针所具有的不同的多核苷酸与该基因或其外显子的不同编码片段互补。这种多核苷酸优选长度为15-200个碱基，更优选长20-100个碱基，最优选长40-60个碱基。当然探针序列也可含有除与其靶序列互补的序列之外的接头序列。这里所用的接头序列指位于探针上的与其靶序列互补的序列和支持体表面之间的序列。例如，概况分析阵列可包含一个特异于每个靶基因或外显子的探针。但是如果需要，概况分析阵列可包含至少2、5、10、100、1000个特异于一些靶基因或外显子的探针。例如，阵列包含的探针序列可按单个碱基变化覆盖一个基因最长的亚型mRNA序列。

例如可使用双色法，将来自两种不同条件的细胞样本的cDNA与微阵列的结合位点杂交。如果要对用siRNA分子处理的细胞和未用siRNA分子处理的同型细胞进行比较，则将一个细胞样本暴露于siRNA，而相同细胞型的另一样本不暴露于siRNA。来源于两种处理方式的cDNA分别用不同标记物进行标记(如用Cy3和Cy5)，这样就可以对其进行分辨。在一个实施方案中，例如用荧光标记的dNTP合成来自经siRNA处理的细胞的cDNA，而用若丹明标记的dNTP合成来自第二种未经siRNA处理的细胞的cDNA。当两种cDNA被混合并与微阵列杂交时，阵列中每个位点上来自每组cDNA的相对信号强度被确定，从而检测到特定基因丰度的任何相对差异。

在上述例子中，来自经siRNA处理的细胞的cDNA在荧光激发时显绿色荧光，而未经siRNA处理的细胞的cDNA显红色荧光。结果当siRNA处理对细胞中特定基因的转录和/或转录后拼接没有直接或间接影响时，两种细胞中该基因和/或外显子的表达模式将不能被识别，而对反转录无影响则红色标记和绿色标记的cDNA概率相同。当与微阵列杂交时，对应此种RNA的结合位点将发出两种特征波长荧光。与此对比，当暴露给siRNA的细胞经siRNA处理，细胞的特定基因的转录和/或转录后拼接发生了直接或间接的变化时，则该基因和/或外显子表达模式就会发生变化，由每个基因或外显子结合位点上的绿色和红色荧光的比来表示。当siRNA提高了mRNA的发生时，每个表达于该mRNA的基因或外显子的比例就会提高，而当siRNA降低了mRNA的发生时，每个表达于该mRNA的基因或外显子的比例就会降低。

使用双色荧光标记和检测法来确定基因表达的变化，以及mRNA的检测已被描述于如，Shena等的使用互补DNA微阵列定量监测基因表达模式，″Quantitative monitoring of gene expression patterns with acomplementary DNA microarray，″Science 270：467-470，1995。该文献特地通过引用整体结合到本文。该方法同样适用于基因或外显子的标记和检测。使用两种不同荧光团标记的cDNA的优点在于，可在内部直接进行两种细胞状态中每个阵列化基因相应的mRNA或外显子表达水平的有对照的比较，同时由实验条件(如杂交条件)的较小差异引起的变化不会影响后续分析。但是应认识到也可使用来自单个细胞的cDNA，并且对例如经siRNA处理和未处理细胞中特定基因或外显子的绝对量进行比较。此外，也可考虑在本发明中使用两种以上的荧光标记。在本发明的一些实施方案中，至少可使用5、10、20或100种不同染料来进行标记。这种标记使得可分辨的标记的大量cDNA同时与同一阵列进行杂交并进行测量，并可任选比较两种以上样本来源的mRNA分子的表达水平。可使用的染料包括但不限于荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、得克萨斯红、5’-羧基-荧光素(FMA)、2’，7’-二甲氧基-4’，5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、N，N，N’，N’-四甲基-6’-羧基-若丹明(TAMRA)、6’-羧基-X-若丹明(ROX)、HEX、TEL、IRD40、IRD41；花青(cyamine)染料，包括但不限于Cy3、Cy3.5、Cy5；BODIPY染料，包括但不限于BODIPY-630/650、BODIPY-650/670；ALEXA染料，包括但不限于ALEXA-488、ALEXA-532、ALEXA-546、ALEXA-568、ALEXA-594；以及其它本领域技术人员所知的荧光染料。

可以在多个不同的杂交时间测量杂交数据，这样就可以确定杂交进行到平衡状态的水平。在这样的实施方案中，杂交水平的测量时间最优选为从杂交时间0到超过由标记多核苷酸结合的多核苷酸(即探针)的取样所需时间，这样混合物就能接近或基本上达到平衡，同时形成的双链体浓度就依赖于亲合力和丰度，而不依赖于扩散。但是杂交时间优选为足够短，从而使得标记多核苷酸与探针和/或表面的不可逆结合相互作用不会发生，或者至少有限度的发生。例如某些实施方案中，多核苷酸阵列被用于检测复杂的多核苷酸片段混合物，典型的杂交时间可大约为0-72h。其它实施方案中合适的杂交时间将取决于特定的多核苷酸序列和所用探针，并可由本领域技术人员确定(参见如Sambrook et al.，eds.，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。

在一个实施方案中，不同杂交时间的杂交水平使用不同、相同的微阵列分开测量。这种测量，每次都在测量杂交水平时的杂交时间进行，简单洗涤微阵列，优选使用高-中浓度盐溶液(如0.5-3M盐溶液)在室温下进行，洗涤条件确保所有的结合或杂交多核苷酸被保留而未杂交的多核苷酸被除去。然后使用适于所用的特定标记方法的测量方法，对保留的杂交多核苷酸分子上可检测标记进行测量。最后所得杂交水平数据被整理形成杂交曲线。在另一实施方案中，用单个的微阵列实时测量杂交水平。在这个实施方案中，微阵列与样品无间断的杂交，在每个杂交时间使用非侵入方法测量微阵列。而在又一个实施方案中，单个的阵列被短时间杂交、洗涤并测量每个基因的杂交量，该阵列再与相同样品杂交，洗涤并再次测量杂交量，得到杂交时间曲线。

优选在两个不同时间至少测量两次杂交水平，第一次在接近于交叉杂交平衡时间标度的时候进行，第二次的测量比第一个的杂交时间长。交叉杂交平衡时间标度依赖于样品组成和探针序列，及可由本领域技术人员确定。在优选实施方案中，第一次杂交水平的测量在反应进行1-10h间进行，而第二次杂交时间的测量在约2、4、6、10、12、16、18、48或72倍于第一次杂交时间时进行。

微阵列探针的制备：如上文所述，根据本发明，与特定多核苷酸分子如基因或外显子进行特异杂交的“探针”，是互补的多核苷酸序列。每个靶基因或外显子优选一个或多个探针。例如，当最小量的探针要用于基因或外显子的检测时，探针通常包含长度大于约40碱基的核苷酸序列。或者，当一大组冗余探针要用于基因或外显子时，探针通常包含约40-60个碱基的核苷酸序列。探针也可包括与全长外显子互补的序列。外显子长度范围可从少于50个碱基-多于200个碱基。因此当使用长度大于外显子的探针时，优选用外显子邻近的组成型拼接外显子序列来增长探针中包含的外显子序列，这样探针序列就与含有靶外显子的连续mRNA片段互补。这就使得外显子概况分析阵列的探针中有相当的杂交严格性。当然除与靶序列互补的序列之外，每个探针也可包含接头序列。

探针可包含DNA或“模拟”DNA(如衍生物或类似物)，它们对应于一个生物体基因组中的基因或外显子的一部分。在一个实施方案中，微阵列的探针是互补RNA或模拟RNA。组成模拟DNA的聚合物亚单位能够按Watson-Crick类似规则特异性的与DNA或RNA杂交。可以在碱基部分、核糖部分或磷酸骨架上对核酸进行修饰。示例的模拟DNA包括如硫代磷酸。DNA的获得可以通过如基因组DNA、cDNA(如RT-PCR)，或克隆的序列的基因或外显子片段PCR扩增进行。PCR引物优选根据已知的基因或外显子或cDNA序列进行选择，导致独特片段的扩增(即该片段与微阵列上任何其它片段没有10个碱基以上的连续性共同序列)。该领域熟知的电脑程序可用于设计具有所需特异性和最优扩增特性的引物，例如Oligo 5.0版(National Biosciences)。微阵列上每个探针的典型长度在20-600碱基之间，通常在30-200碱基之间。PCR法在该领域众所周知，如在Innis等(1990)PCR实验：方法与实践指南(PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications，Academic Press Inc.，San Diego，CA)中所述。对本领域技术人员显而易见的是受控自动系统有益于核酸的分离和扩增。

另一种优选的制备微阵列的多核苷酸的方法是通过合成法制备合成多核苷酸或核苷酸，如使用N-磷酸盐或亚磷酰胺化学合成法(Froehler et al.，Nucleic Acid Res.14：5399-5407，1986；McBride et al.，Tetrahedron Lett.24：246-248，1983)。合成序列的典型长度在约15-600碱基之间，更典型的在约20-100碱基之间，最优选在约40-70碱基之间。在一些实施方案中合成的核酸包括非天然碱基，如但不限于次黄嘌呤。如上文所述核酸类似物可用作杂交结合位点。合适的核酸类似物的例子如肽核酸(参见如Egholm et al.，Nature 363：566-568，1993；U.S.Patent No.5，539,083)。

在其它实施方案中杂交位点(即探针)制备自质粒或基因的噬菌体克隆、cDNA(如表达的序列标签)、或它们的插入片段。

探针附着到固体表面以形成微阵列：多核苷酸探针可沉积到支持体上以形成阵列。多核苷酸探针也可直接在支持体上合成以形成阵列。探针附着的固体支持体或表面可由如玻璃、塑料(如聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝基纤维素、凝胶或其它多孔性或无孔性材料制成。

将核酸附着到支持体表面的一种方法是如Schena et al.，Science270：467-470，1995所综述的，将其印迹在玻璃板上。这个方法尤其有利于制备cDNA微阵列(也参见DeRisi et al.，Nature Genetics 14：457-460，1996；Shalon et al，Genome Res.6：639-645，1996；and Schena et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10539-11286，1995)。

另一个制备微阵列的方法是制备高密度多核苷酸阵列。已知的技术是使用光刻技术在指定表面上的指定地点原位合成含有几千个与目的序列互补的寡核苷酸，从而产生阵列(参见Fodor et al.，Science251：767-773，1991；Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：5022-5026，1994；Lockhart et al.，Nature Biotechnology 14：1675，1996；U.S.Patent Nos.5,578,832；5,556,752；and 5,510,270)，或其它快速合成并沉积目的寡核苷酸的方法(Blanchard et al.，Biosensors&Bioelectronics11：687-690(1996))。当使用这些方法时，已知序列的寡核苷酸(例如60-mers)在表面如衍生的玻璃面直接被合成。产生的阵列可以是冗余的，其中每个基因或外显子对应几个多核苷酸分子。

其它微阵列的制备方法如掩膜法(masking)(Maskos and Southern，Nucl.Acids.Res.20：1679-1684，1992)也可被使用。如上文所述，原则上可以使用任何类型的阵列，如可使用尼龙杂交膜上的斑点印迹(见上文Sambrook等)。但是本领域技术人员应认识到，通常优选很小的阵列，因为杂交体积会更小。

本发明中所用的微阵列可使用如，用于合成寡核苷酸的喷墨打印装置进行制备，如使用Blanchard描述的系统和方法，国际专利公布说明书No.WO 98/41531，September 24，1998；Blanchard et al.，Biosensors and Bioelectronics 11：687-690，1996；Blanchard，1998，Synthetic DNA Arrays in Genetic Engineering，vol.20，J.K.Setlow，ed.，Plenum Press，New York，P111-123；Blanchard，美国专利No.6,028,189。具体来说，制备这种微阵列优选通过连续以高表面张力溶剂(如丙烯碳酸盐)的微滴逐个沉积核苷碱基于如玻璃表面上来合成多核苷酸探针的阵列。这种微滴体积小(如100pL或更小，更优选为50pL或更小)，并且在微阵列表面各自分离(如通过疏水区域)以形成圆形表面张力井，这就是给阵列元件(即不同探针)的定位。通常多核苷酸探针的3’末端共价连接到表面上。或者，也可使多核苷酸探针的5’末端共价连接到表面上(参见如Blanchard，1998，Synthetic DNAArrays in Genetic Engineering，vol.20，J.K.Setlow，ed.，P1enum Press，New York，P111-123)。

靶多核苷酸分子：可使用微阵列分析的靶多核苷酸分子包括RNA分子，例如但不限于信使RNA分子(mRNA)、核糖体RNA分子(rRNA)、cRNA分子(即从体内转录的cDNA制备的RNA分子)，以及它们的片段。可使用微阵列分析的靶多核苷酸分子包括DNA分子，例如但不限于基因组DNA分子、cDNA分子以及它们的片段(这包括寡核苷酸、ESTs和STSs)。

靶多核苷酸可来自任何来源。例如靶多核苷酸分子可以是自然出现的核酸分子，例如从生物体分离的基因组或基因组外的DNA分子，或RNA分子，例如从生物体分离的mRNA分子。或者，可合成多核苷酸分子，包括如体内或体外酶促合成的核酸分子，例如cDNA分子，或者通过PCR合成的多核苷酸分子，体外转录合成的RNA分子等。靶多核苷酸样品可包含如DNA、RNA，或DNA与RNA的共聚物。在优选的实施方案中，本发明的靶多核苷酸相应于特定基因或特定基因的转录物(如细胞表达的特定mRNA序列或来自这种mRNA序列的特定cDNA序列)。但是在许多实施方案中，特别是在那些多核苷酸分子来自于哺乳动物细胞的实施方案中，比如靶多核苷酸可以对应同一基因的不同外显子，这样不同拼接的变异基因就可以被分析/检测到。

在优选的实施方案中，待分析的靶多核苷酸在体外从分离自细胞的核酸进行制备。例如在一个实施方案中，从细胞提取RNA(如全细胞RNA、poly(A)⁺信使RNA，或它们的片段)，并从总提取RNA中纯化出信使RNA。本领域技术人员熟知制备总RNA和poly(A)⁺RNA的方法，综述参见如上文Sambrook等人的文献。在一个实施方案中，使用硫氰酸胍裂解本发明各类型目的细胞，从细胞中提取RNA，然后CsCl离心和oligo-dT进行纯化(Chirgwin et al.，Biochemistry18：5294-5299，1979)。在另一个实施方案中，使用硫氰酸胍裂解细胞，从细胞中提取RNA，然后用RNeasy柱(Qiagen)纯化。使用如oligo-dT或随机引物从纯化的mRNA合成cDNA。在优选的实施方案中，靶多核苷酸是由细胞中提取纯化的信使RNA制备的cRNA。这里所用的cRNA指与来源RNA互补的RNA。使用提取的RNA进行扩增，方法是使用一个连接到RNA聚合酶启动子的引物以能定向转录反义RNA的方向从该RNA合成双链cDNA。然后使用RNA聚合酶从双链cDNA的第二链转录反义RNA或cRNA(参见美国专利Nos.5,891,636、5,716,785；5,545,522、6,132,997；美国专利申请序号No.09/411,074，filed October 4，1999，by Linsley and Schelter；PCT公布说明书No.WO 02/44399)。可使用均包含一个RNA聚合酶启动子或其互补的oligo-dT引物(美国专利Nos.5,545,522和6,132,997)或随机引物(PCT公布说明书No.WO 02/44399)。优选靶多核苷酸为代表细胞原始核酸群体的短多核苷酸和/或多核苷酸片段分子。

要用本发明的方法和组合物分析的靶多核苷酸，优选进行可检测的标记。例如，cDNA可用如核苷类似物进行直接标记，或者以其第一链为模板合成有标记的第二链，以此间接进行标记。或者，也可将双链cDNA转录为cRNA并进行标记。

优选的可检测的标记物为荧光标记，如通过掺入核苷类似物。其它适合用于本发明的标记物包括但不限于生物素、亚氨基生物素(iminobiotin)、抗原、辅因子、二硝基酚、硫辛酸、烯化合物、可检测性多肽、富电子分子、底物作用下能产生可检测性信号的酶、以及放射性同位素。优选的放射性同位素包括³²P、³⁵S、¹⁴C、¹⁵N和¹²⁵I。适用于本发明的荧光分子包括但不限于荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、得克萨斯红、5’-羧基-荧光素(FMA)、2’，7’-二甲氧基-4’，5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6’-羧基-X-若丹明(ROX)、HEX、TEL、IRD40、IRD41。适用于本发明的荧光分子进一步包括但不限于：花青(cyamine)染料，包括但不限于Cy3、Cy3.5、Cy5；BODIPY染料，包括但不限于BODIPY-FL、BODIPY-TR、BODIPY-TMR、BODIPY-630/650、BODIPY-650/670；ALEXA染料，包括但不限于ALEXA-488、ALEXA-532、ALEXA-546、ALEXA-568、ALEXA-594；以及其它本领域技术人人员所知的荧光染料。适用于本发明的富电子指示剂分子包括但不限于铁蛋白、血蓝蛋白和胶体金。在可选的次选实施方案中，可通过将第一基团特异性复合于多核苷酸来标记靶多核苷酸。第二基团与一个指示分子共价连接，与第一基团有亲和作用，可用来间接检测靶多核苷酸。在这样的实施方案中，适合用作第一基团的化合物包括但不限于生物素和亚氨基生物素。适合用作第二基团的化合物包括但不限于抗生物素和链霉抗生物素。

与微阵列的杂交：如上文所述，选择核酸杂交和洗涤条件，以使得待测多核苷酸分子(这里指“靶多核苷酸分子”)特异性结合或特异性的与阵列中的互补多核苷酸序列杂交，优选与特异的阵列位点杂交，位于此处的是其互补DNA。

优选在变性条件下使用含有双链DNA探针的阵列，以使单链DNA优先与靶多核苷酸分子接触。而含有单链DNA探针的阵列(如合成的oligo-DNA)可能需要先变性再与靶多核苷酸分子接触，比如以除去自我互补序列形成的发夹结构或二聚物。

最优杂交条件依赖于探针和靶核酸的长度(如低聚物和长度大于200碱基的多核苷酸)和类型(如RNA和DNA)。关于核酸特异性(即严紧性)杂交条件的一般参数见上文Sambrook等人所述，以及Ausubelet al.，1987，当代分子生物学方法，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York。当使用Schena等人描述的cDNA微阵列时，典型的杂交条件为，5×SSC加0.2％SDS，65℃下杂交4h，然后在25℃下使用低严紧性洗涤缓冲液(1×SSC加0.2％SDS)洗涤，再用高严紧性洗涤缓冲液(1×SSC加0.2％SDS)洗涤(Shena et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.93：10614)。提供的有效洗涤条件也见如Tijessen，1993，核酸探针杂交，Hybridization With Nucleic Acid Probes，Elsevier Science Publishers B.V.，以及Kricka，1992，各向异性DNA探针技术，Nonisotopic DNAProbe Techniques，Academic Press，San Diego，CA。

尤其优选的杂交条件包括杂交温度要位于或接近(如5℃内，更优选2℃内)探针平均退火温度，在1M NaCl，50mM MES缓冲液(pH6.5)，0.5％肌氨酸钠和30％甲酰胺中进行。

信号检测和数据分析：当制得与细胞RNA互补的靶序列(如cDNA或cRNA)并在合适的杂交条件下与微阵列杂交后，阵列中相应于基因或任何特定基因外显子的位点上的杂交水平，反映了细胞中该基因外显子转录的mRNA的存在情况。例如当与总细胞RNA互补的被可检测标记的cDNA与微阵列杂交时，阵列中相应于细胞中未转录的基因外显子的位点，或相应于在RNA拼接期间被除去的阵列位点将几乎没有或无信号，而相应于被转录基因外显子的位点则有相对强的信号。通过可选择的拼接同一基因产生相对大量的不同mRNA，随后由该基因全部外显子组的检测信号的强度模式来确定。

在优选的实施方案中，来自两个不同细胞的靶序列(如cDNA或cRNA)与微阵列的结合位点杂交。例如，一个细胞样品暴露给siRNA而另一细胞样品则未暴露给siRNA。来自两个样品中每个的cDNA或cRNA被进行不同标记以分辨它们。在一个实施方案中，例如使用荧光素标记的dNTP合成经siRNA处理的细胞的cDNA，而第二种未经siRNA处理的细胞的cDNA则用若丹明标记的dNTP合成。当两种cDNA被混合并与微阵列杂交后，确定阵列中每个位点上每组cDNA的相对信号强度，及检测到的特定外显子的任何相对量差异。

在上述例子中，经siRNA处理的细胞的cDNA在荧光被激发时显绿色荧光，而未处理细胞的cDNA显红色荧光。结果当siRNA处理对细胞中特定基因的转录和/或转录后拼接没有直接或间接影响时，两种细胞中该基因和/或外显子的表达模式将不能辨别，且红色标记和绿色标记的的cDNA的反转录反应量相同。当与微阵列杂交时，此种RNA的结合位点将发出两种荧光团的特征波长光。与此相反，当经siRNA分子处理的细胞，细胞中的特定基因的转录和/或转录后拼接发生了直接或间接的变化时，该基因和/或外显子表达模式(由每个基因或外显子结合位点上的绿色和红色荧光的比例来表示)就会发生变化。当siRNA提高了mRNA的表达时，每个表达该mRNA的基因或外显子的比例就会提高，而当siRNA降低了mRNA的表达时，每个表达该mRNA的基因或外显子的比例就会降低。

使用双色荧光标记和检测法，结合mRNA的检测来确定基因表达的变化已有论述如，Shena et al.，Science 270：467-470，1995，该文献通过引用整体结合到本文。该方法同样适用于外显子的标记和检测。使用两种不同荧光团标记的靶序列(如cDNA或cRNA)的优点在于，可在内部直接对两种细胞状态下每个待测基因相应的mRNA或外显子表达水平进行受控比较，同时由实验条件(如杂交条件)的较小差异引起的变化不会影响后续分析。但是应认识到也可使用单个细胞的cDNA，并且对例如特定基因或外显子在如siRNA处理细胞与未处理细胞中的绝对量进行比较。

单通道检测方法，如使用单色荧光标记，也可以采用(参见申请于2000年8月25日的美国专利临时申请序号No.60/227,966，并通过引用整体结合到本文)。在此实施方案中，设计并制备包含反向-互补(reverse-complement，RC)探针的阵列。因为测量值不变(如反向-互补物的GC含量和GC趋势(trend)不变)，DNA序列的反向-互补物的序列复杂性与相应的正链(FS)探针相同，而正链(FS)探针与靶序列互补，所以使用RC探针作为对照探针以确定与相应FS探针非特异性交叉杂交的水平。通过比较FS探针的原始强度测量值与相应RC探针的原始强度测量值，并分别考虑测量误差，来确定靶序列的FS探针强度的显著度。在优选的实施方案中，如果FS探针和相应RC探针间的强度差异是显著的，则认为该基因或外显子存在。更优选的，如果FS探针强度也显著高于背景水平，则认为该基因或外显子存在。可联合使用单通道检测方法与多色标记方法。在一个实施方案中，多数不同的样品与一个阵列杂交，每个样品用不同颜色标记。使用每种颜色自身的FS和RC探针间的差异来确定相应样品的杂交水平。

当使用荧光标记的探针时，可优选使用激光共聚焦扫描显微镜来检测转录物阵列中每个位点上的荧光的发射。在一个实施方案中，使用合适的激发光线对两种所用颜色都进行分别扫描。或者，可使用两种荧光团特征波长的激光同时照射样品，两种荧光团的发射就可以同时被分析(参见Shalon et al.，Genome Res.6：639-645，1996)。可使用具有电脑X-Y控制策略的激光荧光扫描仪以及显微镜物镜来扫描阵列。使用多光线(multi-line)的混合气相激光对两种荧光团进行连续激发，并用两个光电倍增管将发出的光线按波长分开并检测。这种激光荧光扫描装置的描述参见如Schena et al.，Genome Res.6：639-645，1996。或者，也可使用光线束同时在大量位点上检测mRNA的丰度水平，描述参见Ferguson et al.，Nature Biotech.14：1681-1684，1996。

记录信号并可使用电脑进行分析，如用12位的模拟数字板。在一个实施方案中使用图片程序(如Hijaak Graphics Suite)将扫描图片降斑(despeckle)，并使用图片网格(gridding)程序进行分析，该程序创建了每个位点上每个波长的平均杂交水平电子数据表。如果有必要，可用实验确定校正两种荧光通道间的相互干扰(cross talk)(或重叠)。可以计算转录物阵列中任何特定杂交位点上两种荧光发射的比值。该比值不依赖同源基因的绝对表达水平，但可用于其表达被siRNA转染、基因删除其它任何经测验项目所显著调节的基因。

基因表达水平的比较：可使用本领域认识的统计方法来比较单个基因的表达水平，以鉴定具有与活细胞响应药物相关的表达模式的基因。例如可使用t-检验来确定，用接触药物并用siRNA处理的细胞与接触同一药物但未用siRNA处理的细胞中，特定基因表达水平的重复测量平均值是否有显著差异。

比较经处理和未经处理所哺乳动物细胞单个基因的表达水平，以鉴定表达模式有显著差异的基因，下文的公布说明书描述了可用的本领域所知方法的例子：Nature Genetics，Vol.32，ps.461-552(supplement December 2002)；Bioinformatics 18(4)：546-54(April2002)；Dudoit，et al.Technical Report 578，University of California atBerkeley；Tusher et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci U.S.A.98(9)：5116-5121(April 2001)；Kerr，et al.，J.Comput.Biol.7：819-837。

可用于本发明的其它统计学检验方法的代表性实例包括卡方检验，它可用于检验比如两个因子间的相关性(如哺乳动物细胞中基因表达与疾病状态的正相关或负相关性)。又例如，可用本领域所知的相关性分析方法来检验两组测量值之间(如基因表达与疾病状态之间)是否存在联系。标准的统计学方法可以在统计学教材中找到，例如Modern Elementary Statistics，John E.Freund，7^th edition，published byPrentice-Hall；Practical Statistics for Environmental and BiologicalScientists，John Townend，published by John Wiley&Sons，Ltd。

确认基因有助于活细胞对药物响应的方法：在第二方面，本发明提供了确认基因有助于活细胞对药物响应的方法。本发明此方面的每个方法都包括以下步骤(a)通过向一种细胞型的活细胞中引入干扰RNA，使该细胞中的基因功能性失活，其中基因的表达模式与该细胞型活细胞对药物的响应有关，同时这个基因在该细胞型所有活细胞中都有拷贝存在；(b)通过确定该活细胞对药物的响应相比不含干扰RNA的同型活细胞的响应有所不同，从而确认该基因有助于了该型活细胞对这种药物的响应。

关于本发明第一方面的本申请的论述也可用于本发明第二方面的方法(例如关于使用干扰RNA基因功能性失活的论述)。

哺乳动物受试者对KSP抑制剂响应的鉴定方法：

在第三方面，本发明提供了哺乳动物受试者对KSP抑制剂响应的鉴定方法。这些方法的步骤都包括，分析哺乳动物受试者癌细胞的20号染色体以确定20号染色体的20q段在该癌细胞中是否被扩增，如果20号染色体的20q段在该癌细胞中未被扩增，则该哺乳动物受试者被鉴定为对KSP抑制剂响应。

可使用任何有效方法来确定20q染色体在该癌细胞中是否被扩增。例如比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)可被用于确定20q染色体在该癌细胞中是否被扩增。CGH方法实例的描述见以下公布说明书，均通过引用整体结合到本文：Karhu R等CGH定性控制：中期染色体的影响及杂交动力学范围，″Quality controlof CGH：impact of metaphase chromosomes and the dynamic range ofhybridization″，Cytometry 28：198-205(1997)；Tirkkonen M等CGH法乳癌细胞分子遗传学初步，″Molecular cytogenetics ofprimary breastcancer by CGH″，Genes Chromosomes Cancer 21：177-184(1998)

以下实例仅用于阐明当前应用本发明的最佳模式，而不是用来限定本发明。

实施例1

这个实施例描述了确定STK6和TPX2基因是否介导人结肠癌细胞系对KSP抑制剂L’962的抗性的代表性方法。L’962((1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺])是一种公认的抗癌药物。

体外分析了24个人结肠癌细胞系，以确定它们对KSP抑制剂L’962的剂量响应特征。表1列出了24个细胞系(以及10个参考细胞系)的名称和ATCC登录号。

表1

细胞系	ATCC号	培养基
			SW620	CCL-227	DMEM
HT-29	HTB-38	DMEM
			SW480	CCL-228	DMEM
WiDr	CCL-218	DMEM
			Caco-2	HTB-37	DMEM
SW837	CCL-235	DMEM
			LS1034	CRL-2158	DMEM
LS123	CCL-255	DMEM
			SW1116	CCL-233	DMEM
SW948	CCL-237	DMEM

HCT116	CCL-247	DMEM
			SW48	CCL-231	DMEM
DLD-1	CCL-221	DMEM
			LoVo	CCL-229	DMEM
HCT-15	CCL-225	DMEM
			LS174T	CL-188	DMEM
RKO	CRL-2577	DMEM
			SW403	CCL-230	DMEM
SW1417	CCL-238	DMEM
			HCT-8	CCL-244	DMEM
T84	CCL-248	DMEM
			LS180	CL-187	DMEM
RKO-AS45-1	CRL-2579	DMEM
			SW1463	CCL-234	DMEM
			参考池
HCT116	CCL-247
			SW48	CCL-231
DLD-1	CCL-221
			HCT-15	CCL-225
LS174T	CL-188
			HT-29	HTB-38
SW480	CCL-228
			SW837	CCL-235
LS1034	CRL-2158
			SW620	CCL-227

结肠癌细胞系培养于DMEM(加10％FBS)中，或者在RPMI(加10％FBS、青霉素/链霉素、10mM HEPES、10mM丙酮酸钠)中。细胞接种于96孔板上，密度为每孔1500或3000个细胞。接种后24h，用溶于相同培养基的L’962处理细胞，对照细胞用DMSO而不是L’962处理。用L’962处理后72h，用Alamar蓝实验测量细胞存活，用背景(无细胞)做矫正。L’962存在下的细胞响应(存活)作为对照细胞生长的百分比而被确定。对L’962敏感的细胞系细胞存活水平低于对L’962有抗性的细胞系。

关于基因概况分析，结肠癌细胞系培养于DMEM(加10％FBS)中，或者在RPMI(加10％FBS)中。细胞接种于T75瓶中，培养至融合达70-80％。收集细胞并使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取总RNA，并按上文所述方法进行杂交(Hughes，T.R.and Mao，M，Nature Biotech.，19：342-347(2001))。来自每个单独细胞系的RNA对照参考池RNA，与Agilent微阵列杂交，该微阵列含有对应于约21,000个人类基因的寡核苷酸。比率杂交使用反向荧光标记进行，以除去染料偏差。微阵列可以从Agilent Technologies购买或者按上文所述(上文的Hughes，T.R.和Mao，M)制备。误差模型已在上文描述(Id)。参考池由来自10个结肠癌细胞系的RNA组成。(见表1)

将3个最高剂量L’962处理的对照细胞生长百分比值进行平均，以在每个细胞系中提供L’962的细胞生长抑制最大值。通过使用GraphPad Prism 4软件(GraphPad Software Inc.)分析生长量-剂量曲线，计算每个细胞系的EC50。根据EC50值观察到细胞系被清楚地分成对L’962的敏感性有差异的两类，一类对L’962更加敏感，而一类对L’962的敏感性较低。

微阵列上约有21,000个基因。最初从24个癌细胞系的10个细胞系参考池中选择3个以上细胞系中差别表达(p＜0.01平台误差模型(platform error model))的基因。这个步骤排除了在不同的癌细胞系间差别表达的基因，而这些基因可能会被误鉴别为由于细胞系响应L’962处理而表达。对该方法所选的每个基因，均使用Pearson相关系数计算其在所有细胞系中的表达水平与最大生长抑制间的相关性(比率的对数，log(ratio)，或者log(EC50))。选出那些相关系数大于0.5的基因作为响应L’962的报告基因。这些报告基因中有468个为正相关(即在抗L’962的细胞系中有更高表达)，有820个为负相关(即在抗L’962的细胞系中有更低表达)。

使用留出一个交叉验证法(leave-one-out cross-validation)确认用此法鉴别的报告基因，包括以下步骤。第一，留出一个样品，使用剩下的样品(或剩下的训练(training)样品，如这里所述)选择报告基因。将报告基因分成以下3个亚组：与最大生长抑制或log(EC50)为负相关的报告基因；与最大生长抑制或log(EC50)为正相关，并且也定位于染色体20q上的报告基因；与最大生长抑制或log(EC50)为正相关，但非定位于染色体20q上的报告基因。根据剩下的样品(或剩下的训练(trainin)样品)计算每个细胞系中每亚组报告基因的平均log(比率)，并进行平均log(比率)-最大生长抑制间的线性拟合(fit)。分别使用3亚组报告基因的拟合参数对被留出的样品进行预测。重复上述步骤使每个样品留出一次。最后通过计算测量的和预测的最大生长抑制与log(EC50)间的相关性来评估预测力。

关于选择训练样品以选择EC50报告基因，如下文用留出一个交叉验证法(LOOCV)的外层(extra-layer)来进一步限定训练样品。使用LOOCV法从所有样品中选择报告基因并预测留出(left out)样品。使用3亚组报告基因(即报告基因与log(EC50)为负相关；报告基因与log(EC50)为正相关，并且定位于染色体20q上；报告基因与log(EC50)为正相关，但不是定位于染色体20q上)重复预测。计算三组预测中预测log(EC50)值与测量log(EC50)值间的标准偏差。排除在2个或3个预测组中标准偏差大于1的样本。

该留出一个交叉验证法(leave-one-out cross-validation)显示，基线表达预测的log₁₀(EC50)相关度为0.65，P值(P-value)为0.02％。

在与抗性正相关的报告基因中，基因显著富集在20q染色体上。来自20q染色体的报告基因在整个正相关报告基因组中，具有多数预测能力(数据未列出)。在结肠癌、乳癌和卵巢癌中，染色体20q经常被扩增(Hodgson JG，et al.，Breast Cancer Res.Treat.78(3)：337-45(2003)；Tanner MM，et al.，CLin Cancer Res.6(5)：1833-9(2000)；WarnerSL，et al.，Mol Cancer Ther.2(6)：589-95(2003))。位于染色体20q的被扩增的一个基因与肿瘤发生有关，是STK6(Ewart-Toland A，et al.，NatGenet.34(4)：403-12(2003))，磷酸化KSP的非洲爪蟾丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Giet R，et al.，J Biol Chem.274(21)：15005-13(1999))。STK6是位于中心体的癌基因，其过表达导致多倍性、中心体扩增及紫杉醇抗性(Warner SL，et al.，Mol Cancer Ther.2(6)：589-95(2003))。STK6在预后不好的乳癌病人体内过表达(van’t Veer LJ，et al.，Nature415(6871)：530-6(2002))，并可在结肠瘤中被扩增(Bischoff JR，et al.，EMBO J.17(11)：3052-65(1998))。使用定量PCR分析(TaqMan)测量24个结肠癌细胞系中STK6 mRNA水平。计算这些细胞系中STK6mRNA水平与L’962的log₁₀(EC50)的相关性(r～0.7，数据未列出)。因而，STK6表达水平提高与对L’962的抗性提高之间为正相关性。

假设其在KSP途径中发挥作用，则STK6的扩增和/或过表达可能通过直接或间接影响KSP的功能，而影响细胞对KSP抑制剂的响应。然而，染色体扩增是不精确的，可能会导致驱动基因(drive gene)邻近基因的间接扩增。因而，siRNA被用来确定STK6的扩增是否介导了对L’962的抗性。

定向作用于STK6基因的siRNA分子只是三类使得Hela细胞对L’962敏感的siRNA分子之一，这三类siRNA属于由约800种siRNA分子组成的文库，这些siRNA定向作用于约800个不同基因。其它两类使得Hela细胞对L’962敏感的siRNA分子，定向作用于KSP本身和TPX2(KSP途径中的另一基因，启动STK6自磷酸化)(Bayliss R，et al.，Mol Cell 12(4)：851-62(2003))。虽然染色体20q上有17个基因表示在siRNA文库中，但只有功能性失活STK6和TPX2才能使得细胞对L’962敏感，因此支持以下结论，即STK6基因和/或TPX2基因表达水平的提高，至少部分的介导了一些人癌细胞系对L’962的抗性。

尽管已经阐述了本发明的优选实施方案，但是可以在不脱离本发明精神和本发明范围的前提下，对该实施方案进行各种修改。

本发明实施方案受到权利保护，具有排他性或优先权，详细说明见所附权利要求。

序列表

<110>Rosetta Inpharmatics LLC

     Mao，Mao

     Jackson，Aimee

     Linsley，Peter S.

     Dai，Hongyne

<120>METHODS FOR IDENTIFYING GENES THAT MEDIATE A RESPONSE OF A LIVING CELL TO AN

AGENT

<130>ROSA124462

<150>US 60/562,392

<151>2004-04-15

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1056

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>1

Met Ala Ser Gln Pro Asn Ser Ser Ala Lys Lys Lys Glu Glu Lys Gly

1               5                   10                  15

Lys Asn Ile Gln Val Val Val Arg Cys Arg Pro Phe Asn Leu Ala Glu

            20                  25                  30

Arg Lys Ala Ser Ala His Ser Ile Val Glu Cys Asp Pro Val Arg Lys

        35                  40                  45

Glu Val Ser Val Arg Thr Gly Gly Leu Ala Asp Lys Ser Ser Arg Lys

    50                  55                  60

Thr Tyr Thr Phe Asp Met Val Phe Gly Ala Ser Thr Lys Gln Ile Asp

65                  70                  75                 80

Val Tyr Arg Ser Val Val Cys Pro Ile Leu Asp Glu Val Ile Met Gly

                85                  90                  95

Tyr Asn Cys Thr Ile Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Gly Thr Gly Lys Thr

             100                105                 110

Phe Thr Met Glu Gly Glu Arg Ser Pro Asn Glu Glu Tyr Thr Trp Glu

        115                 120                 125

Glu Asp Pro Leu Ala Gly Ile Ile Pro Arg Thr Leu His Gln Ile Phe

    130                 135                 140

Glu Lys Leu Thr Asp Asn Gly Thr Glu Phe Ser Val Lys Val Ser Leu

145                 150                 155                 160

Leu Glu Ile Tyr Asn Glu Glu Leu Phe Asp Leu Leu Asn Pro Ser Ser

                165                 170                 175

Asp Val Ser Glu Arg Leu Gin Met Phe Asp Asp Pro Arg Asn Lys Arg

            180                 185                 190

Gly Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile Thr Val His Asn Lys Asp

        195                 200                 205

Glu Val Tyr Gln Ile Leu Glu Lys Gly Ala Ala Lys Arg Thr Thr Ala

    210                 215                 220

Ala Thr Leu Met Asn Ala Tyr Ser Ser Arg Ser His Ser Val Phe Ser

225                 230                 235                 240

Val Thr Ile His Met Lys Glu Thr Thr Ile Asp Gly Glu Glu Leu Val

                245                 250                 255

Lys Ile Gly Lys Leu Asn Leu Val Asp Leu Ala Gly Ser Glu Asn Ile

            260                 265                 270

Gly Arg Ser Gly Ala Val Asp Lys Arg Ala Arg Glu Ala Gly Asn Ile

        275                 280                 285

Asn Gln Ser Leu Leu Thr Leu Gly Arg Val Ile Thr Ala Leu Val Glu

    290                 295                 300

Arg Thr Pro His Val Pro Tyr Arg Glu Ser Lys Leu Thr Arg Ile Leu

305                 310                 315                 320

Gln Asp Ser Leu Gly Gly Arg Thr Arg Thr Ser Ile Ile Ala Thr Ile

                325                 330                 335

Ser Pro Ala Ser Leu Asn Leu Glu Glu Thr Leu Ser Thr Leu Glu Tyr

            340                 345                 350

Ala His Arg Ala Lys Asn Ile Leu Asn Lys Pro Glu Val Asn Gln Lys

        355                 360                 365

Leu Thr Lys Lys Ala Leu Ile Lys Glu Tyr Thr Glu Glu Ile Glu Arg

    370                 375                 380

Leu Lys Arg Asp Leu Ala Ala Ala Arg Glu Lys Asn Gly Val Tyr Ile

385                 390                 395                 400

Ser Glu Glu Asn Phe Arg Val Met Ser Gly Lys Leu Thr Val Gln Glu

                405                 410                 415

Glu Gln Ile Val Glu Leu Ile Glu Lys Ile Gly Ala Val Glu Glu Glu

            420                 425                 430

Leu Asn Arg Val Thr Glu Leu Phe Met Asp Asn Lys Asn Glu Leu Asp

        435                 440                 445

Gln Cys Lys Ser Asp Leu Gln Asn Lys Thr Gln Glu Leu Glu Thr Thr

    450                 455                 460

Gln Lys His Leu Gln Glu Thr Lys Leu Gln Leu Val Lys Glu Glu Tyr

465                 470                 475                 480

Ile Thr Ser Ala Leu Glu Ser Thr Glu Glu Lys Leu His Asp Ala Ala

                485                 490                 495

Ser Lys Leu Leu Asn Thr Val Glu Glu Thr Thr Lys Asp Val Ser Gly

            500                 505                 510

Leu His Ser Lys Leu Asp Arg Lys Lys Ala Val Asp Gln His Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Asn Leu Asn Ser Leu Phe Asn Asn

    530                 535                 540

Met Glu Glu Leu Ile Lys Asp Gly Ser Ser Lys Gln Lys Ala Met Leu

545                 550                 555                 560

Glu Val His Lys Thr Leu Phe Gly Asn Leu Leu Ser Ser Ser Val Ser

                565                 570                 575

Ala Leu Asp Thr Ile Thr Thr Val Ala Leu Gly Ser Leu Thr Ser Ile

            580                 585                 590

Pro Glu Asn Val Ser Thr His Val Ser Gln Ile Phe Asn Met Ile Leu

        595                 600                 605

Lys Glu Gln Ser Leu Ala Ala Glu Ser Lys Thr Val Leu Gln Glu Leu

    610                 615                 620

Ile Asn Val Leu Lys Thr Asp Leu Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Leu

625                 630                 635                 640

Ser Pro Thr Val Val Ser Ile Leu Lys Ile Asn Ser Gln Leu Lys His

                645                 650                 655

Ile Phe Lys Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Lys Ile Glu Asp Gln Lys

            660                 665                 670

Lys Glu Leu Asp Gly Phe Leu Ser Ile Leu Cys Asn Asn Leu His Glu

        675                 680                 685

Leu Gln Glu Asn Thr Ile Cys Ser Leu Val Glu Ser Gln Lys Gln Cys

    690                 695                 700

Gly Asn Leu Thr Glu Asp Leu Lys Thr Ile Lys Gln Thr His Ser Gln

705                 710                 715                 720

Glu Leu Cys Lys Leu Met Asn Leu Trp Thr Glu Arg Phe Cys Ala Leu

                725                 730                 735

Glu Glu Lys Cys Glu Asn Ile Gln Lys Pro Leu Ser Ser Val Gln Glu

            740                 745                 750

Asn Ile Gln Gln Lys Ser Lys Asp Ile Val Asn Lys Met Thr Phe His

        755                 760                 765

Ser Gln Lys Phe Cys Ala Asp Ser Asp Gly Phe Ser Gln Glu Leu Arg

    770                 775                 780

Asn Phe Asn Gln Glu Gly Thr Lys Leu Val Glu Glu Ser Val Lys His

785                 790                 795                 800

Ser Asp Lys Leu Asn Gly Asn Leu Glu Lys Ile Ser Gln Glu Thr Glu

                805                 810                 815

Gln Arg Cys Glu Ser Leu Asn Thr Arg Thr Val Tyr Phe Ser Glu Gln

            820                 825                 830

Trp Val Ser Ser Leu Asn Glu Arg Glu Gln Glu Leu His Asn Leu Leu

        835                 840                 845

Glu Val Val Ser Gln Cys Cys Glu Ala Ser Ser Ser Asp Ile Thr Glu

    850                 855                 860

Lys Ser Asp Gly Arg Lys Ala Ala His Glu Lys Gln His Asn Ile Phe

865                 870                 875                 880

Leu Asp Gln Met Thr Ile Asp Glu Asp Lys Leu Ile Ala Gln Asn Leu

                885                 890                 895

Glu Leu Asn Glu Thr Ile Lys Ile Gly Leu Thr Lys Leu Asn Cys Phe

            900                 905                 910

Leu Glu Gln Asp Leu Lys Leu Asp Iie Pro Thr Gly Thr Thr Pro Gln

        915                 920                 925

Arg Lys Ser Tyr Leu Tyr Pro Ser Thr Leu Val Arg Thr Glu Pro Arg

    930                 935                 940

Glu His Leu Leu Asp Gln Leu Lys Arg Lys Gln Pro Glu Leu Leu Met

945                 950                 955                 960

Met Leu Asn Cys Ser Glu Asn Asn Lys Glu Glu Thr Ile Pro Asp Val

                965                 970                 975

Asp Val Glu Glu Ala Val Leu Gly Gln Tyr Thr Glu Glu Pro Leu Ser

            980                 985                 990

Gln Glu Pro Ser Val Asp Ala Gly Val Asp Cys Ser Ser Ile Gly Gly

        995                 1000                1005

Val Pro Phe Phe Gln His Lys Lys Ser His Gly Lys Asp Lys Glu

    1010                1015                1020

Asn Arg Gly Ile Asn Thr Leu Glu Arg Ser Lys Val Glu Glu Thr

    1025                1030                1035

Thr Glu His Leu Val Thr Lys Ser Arg Leu Pro Leu Arg Ala Gln

    1040                1045                1050

Ile Asn Leu

    1055

<210>2

<211>2346

<212>DNA

<213>人(Homo Sapiens)

<400>2

acaaggcagc ctcgctcgag cgcaggccaa tcggctttct agctagaggg tttaactcct     60

atttaaaaag aagaaccttt gaattctaac ggctgagctc ttggaagact tgggtccttg    120

ggtcgcaggt gggagccgac gggtgggtag accgtggggg atatctcagt ggcggacgag    180

gacggcgggg acaaggggcg gctggtcgga gtggcggagc gtcaagtccc ctgtcggttc    240

ctccgtccct gagtgtcctt ggcgctgcct tgtgcccgcc cagcgccttt gcatccgctc    300

ctgggcaccg aggcgccctg taggatactg cttgttactt attacagcta gaggcatcat    360

ggaccgatct aaagaaaact gcatttcagg acctgttaag gctacagctc cagttggagg    420

tccaaaacgt gttctcgtga ctcagcaatt tccttgtcag aatccattac ctgtaaatag    480

tggccaggct cagcgggtct tgtgtccttc aaattcttcc cagcgcattc ctttgcaagc    540

acaaaagctt gtctccagtc acaagccggt tcagaatcag aagcagaagc aattgcaggc    600

aaccagtgta cctcatcctg tctccaggcc actgaataac acccaaaaga gcaagcagcc    660

cctgccatcg gcacctgaaa ataatcctga ggaggaactg gcatcaaaac agaaaaatga    720

agaatcaaaa aagaggcagt gggctttgga agactttgaa attggtcgcc ctctgggtaa    780

aggaaagttt ggtaatgttt atttggcaag agaaaagcaa agcaagttta ttctggctct    840

taaagtgtta tttaaagctc agctggagaa agccggagtg gagcatcagc tcagaagaga    900

agtagaaata cagtcccacc ttcggcatcc taatattctt agactgtatg gttatttcca    960

tgatgctacc agagtctacc taattctgga atatgcacca cttggaacag tttatagaga   1020

acttcagaaa ctttcaaagt ttgatgagca gagaactgct acttatataa cagaattggc   1080

aaatgccctg tcttactgtc attcgaagag agttattcat agagacatta agccagagaa   1140

cttacttctt ggatcagctg gagagcttaa aattgcagat tttgggtggt cagtacatgc   1200

tccatcttcc aggaggacca ctctctgtgg caccctggac tacctgcccc ctgaaatgat   1260

tgaaggtcgg atgcatgatg agaaggtgga tctctggagc cttggagttc tttgctatga   1320

atttttagtt gggaagcctc cttttgaggc aaacacatac caagagacct acaaaagaat   1380

atcacgggtt gaattcacat tccctgactt tgtaacagag ggagccaggg acctcatttc   1440

aagactgttg aagcataatc ccagccagag gccaatgctc agagaagtac ttgaacaccc   1500

ctggatcaca gcaaattcat caaaaccatc aaattgccaa aacaaagaat cagctagcaa   1560

acagtcttag gaatcgtgca gggggagaaa tccttgagcc agggctgcca tataacctga   1620

caggaacatg ctactgaagt ttattttacc attgactgct gccctcaatc tagaacgcta   1680

cacaagaaat atttgtttta ctcagcaggt gtgccttaac ctccctattc agaaagctcc   1740

acatcaataa acatgacact ctgaagtgaa agtagccacg agaattgtgc tacttatact   1800

ggttcataat ctggaggcaa ggttcgactg cagccgcccc gtcagcctgt gctaggcatg   1860

gtgtcttcac aggaggcaaa tccagagcct ggctgtgggg aaagtgacca ctctgccctg   1920

accccgatca gttaaggagc tgtgcaataa ccttcctagt acctgagtga gtgtgtaact   1980

tattgggttg gcgaagcctg gtaaagctgt tggaatgagt atgtgattct ttttaagtat   2040

gaaaataaag atatatgtac agacttgtat tttttctctg gtggcattcc tttaggaatg   2100

ctgtgtgtct gtccggcacc ccggtaggcc tgattgggtt tctagtcctc cttaaccact   2160

tatctcccat atgagagtgt gaaaaatagg aacacgtgct ctacctccat ttagggattt   2220

gcttgggata cagaagaggc catgtgtctc agagctgtta agggcttatt tttttaaaac   2280

attggagtca tagcatgtgt gtaaacttta aatatgcaaa taaataagta tctatgtcta   2340

aaaaaa                                                              2346

<210>3

<211>3685

<212>DNA

<213>人(Homo Sapiens)

<400>3

agtggactca cgcaggcgca ggagactaca cttcccagga actccgggcc gcgttgttcg     60

ctggtacctc cttctgactt ccggtattgc tgcggtctgt agggccaatc gggagcctgg    120

aattgctttc ccggcgctct gattggtg   ttcgac   g ctgcctgggt tcaaaatttc    180

aacgatactg aatgagtccc gcggcgggtt ggctcgcgct tcgttgtcag atctgaggcg    240

aggctaggtg agccgtggga agaaaagagg gagcagctag ggcgcgggtc tccctcctcc    300

cggagtttgg aacggctgaa gttcaccttc cagcccctag cgccgttcgc gccgctaggc    360

ctggcttctg aggcggttgc ggtgctcggt cgccgcctag gcggggcagg gtgcgagcag    420

gggcttcggg ccacgcttct cttggcgaca ggattttgct gtgaagtccg tccgggaaac    480

ggaggaaaaa aagagttgcg ggaggctgtc ggctaataac ggttcttgat acatatttgc    540

cagacttcaa gatttcagaa aaggggtgaa agagaagatt gcaactttga gtcagacctg    600

taggcctgat agactgatta aaccacagaa ggtgacctgc tgagaaaagt ggtacaaata    660

ctgggaaaaa cctgctcttc tgcgttaagt gggagacaat gtcacaagtt aaaagctctt    720

attcctatga tgccccctcg gatttcatca atttttcatc cttggatgat gaaggagata    780

ctcaaaacat agattcatgg tttgaggaga aggccaattt ggagaataag ttactgggga    840

agaatggaac tggagggctt tttcagggca aaactccttt gagaaaggct aatcttcagc    900

aagctattgt cacacctttg aaaccagttg acaacactta ctacaaagag gcagaaaaag    960

aaaatcttgt ggaacaatcc attccgtcaa atgcttgttc ttccctggaa gttgaggcag   1020

ccatatcaag aaaaactcca gcccagcctc agagaagatc tcttaggctt tctgctcaga   1080

aggatttgga acagaaagaa aagcatcatg taaaaatgaa agccaagaga tgtgccactc   1140

ctgtaatcat cgatgaaatt ctaccctcta agaaaatgaa agtttctaac aacaaaaaga   1200

agccagagga agaaggcagt gctcatcaag atactgctga aaagaatgca tcttccccag   1260

agaaagccaa gggtagacat actgtgcctt gtatgccacc tgcaaagcag aagtttctaa   1320

aaagtactga ggagcaagag ctggagaaga gtatgaaaat gcagcaagag gtggtggaga   1380

tgcggaaaaa gaatgaagaa ttcaagaaac ttgctctggc tggaataggg caacctgtga   1440

agaaatcagt gagccaggtc accaaatcag ttgacttcca cttccgcaca gatgagcgaa   1500

tcaaacaaca tcctaagaac caggaggaat ataaggaagt gaactttaca tctgaactac   1560

gaaagcatcc ttcatctcct gcccgagtga ctaagggatg taccattgtt aagcctttca   1620

acctgtccca aggaaagaaa agaacatttg atgaaacagt ttctacatat gtgccccttg   1680

cacagcaagt tgaagacttc cataaacgaa cccctaacag atatcatttg aggagcaaga   1740

aggatgatat taacctgtta ccctccaaat cttctgtgac caagatttgc agagacccac   1800

agactcctgt actgcaaacc aaacaccgtg cacgggctgt gacctgcaaa agtacagcag   1860

agctggaggc tgaggagctc gagaaattgc aacaatacaa attcaaagca cgtgaacttg   1920

atcccagaat acttgaaggt gggcccatct tgcccaagaa accacctgtg aaaccaccca   1980

ccgagcctat tggctttgat ttggaaattg agaaaagaat ccaggagcga gaatcaaaga   2040

agaaaacaga ggatgaacac tttgaatttc attccagacc ttgccctact aagattttgg   2100

aagatgttgt gggtgttcct gaaaagaagg tacttccaat caccgtcccc aagtcaccag   2160

cctttgcatt gaagaacaga attcgaatgc ccaccaaaga agatgaggaa gaggacgaac   2220

cggtagtgat aaaagctcaa cctgtgccac attatggggt gccttttaag ccccaaatcc   2280

cagaggcaag aactgtggaa atatgccctt tctcgtttga ttctcgagac aaagaacgtc   2340

agttacagaa ggagaagaaa ataaaagaac tgcagaaagg ggaggtgccc aagttcaagg   2400

cacttccctt gcctcatttt gacaccatta acctgccaga gaagaaggta aagaatgtga   2460

cccagattga acctttctgc ttggagactg acagaagagg tgctctgaag gcacagactt   2520

ggaagcacca gctggaagaa gaactgagac agcagaaaga agcagcttgt ttcaaggctc   2580

gtccaaacac cgtcatctct caggagccct ttgttcccaa gaaagagaag aaatcagttg   2640

ctgagggcct ttctggttct ctagttcagg aaccttttca gctggctact gagaagagag   2700

ccaaagagcg gcaggagctg gagaagagaa tggctgaggt agaagcccag aaagcccagc   2760

agttggagga ggccagacta caggaggaag agcagaaaaa agaggagctg gccaggctac   2820

ggagagaact ggtgcataag gcaaatccaa tacgcaagta ccagggtctg gagataaagt   2880

caagtgacca gcctctgact gtgcctgtat ctcccaaatt ctccactcga ttccactgct   2940

aaactcagct gtgagctgcg gataccgccc ggcaatggga cctgctctta acctcaaacc   3000

taggaccgtc ttgctttgtc attgggcatg gagagaaccc atttctccag acttttacct   3060

acccgtgcct gagaaagcat acttgacaac tgtggactcc agttttgttg agaattgttt   3120

tcttacatta ctaaggctaa taatgagatg taactcatga atgtctcgat tagactccat   3180

gtagttactt cctttaaacc atcagccggc cttttatatg ggtcttcact ctgactagaa   3240

tttagtctct gtgtcagcac agtgtaatct ctattgctat tgccccttac gactctcacc   3300

ctctccccac tttttttaaa aattttaacc agaaaataaa gatagttaaa tcctaagata   3360

gagattaagt catggtttaa atgaggaaca atcagtaaat cagattctgt cctcttctct   3420

gcataccgtg aatttatagt taaggatccc tttgctgtga gggtagaaaa cctcaccaac   3480

tgcaccagtg aggaagaaga ctgcgtggat tcatggggag cctcacagca gccacgcagc   3540

aggctctggg tggggctgcc gttaaggcac gttctttcct tactggtgct gataacaaca   3600

gggaaccgtg cagtgtgcat tttaagacct ggcctggaat aaatacgttt tgtctttccc   3660

tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                                         3685

Claims (25)

1.一种确定基因是否介导活细胞对药物响应的方法，该方法包括以下步骤：

(a)向细胞型的活细胞中导入干扰RNA分子，使该细胞中的基因功能性失活，其中所述基因具有与该细胞型活细胞对药物的响应相关的表达模式，并且此基因在该细胞型所有活细胞中都有拷贝存在；

(b)使药物与包含干扰RNA的活细胞接触；

(c)确定该活细胞对药物的响应是否不同于不合干扰RNA分子的同细胞型活细胞对该药物的响应，从而确定该基因是否介导了该细胞型活细胞对这种药物的响应。

2.权利要求1的方法，其中活细胞是哺乳动物细胞。

3.权利要求1的方法，其中活细胞是植物细胞。

4.权利要求1的方法，其中活细胞是线虫细胞。

5.权利要求1的方法，其中活细胞是果蝇细胞。

6.权利要求1的方法，其中活细胞是人细胞。

7.权利要求1的方法，其中的药物是化学药物。

8.权利要求1的方法，其中的药物是能量剂。

9.权利要求1的方法，其中的药物是病毒。

10.权利要求1的方法，其中的干扰RNA分子基本上由siRNA分子组成。

11.权利要求1的方法，其中的干扰RNA分子基本上由shRNA分子组成。

12.权利要求1的方法，其中的干扰RNA分子基本上由长双链RNA分子组成。

13.权利要求1的方法，其中的基因是STK6基因，该基因与SEQID NO：2中所列核酸序列至少有90％的一致性。

14.权利要求1的方法，其中的基因是TPX2基因，该基因与SEQID NO：3中所列核酸序列至少有90％的一致性。

15.权利要求1的方法，其中的相关性是正相关性。

16.权利要求1的方法，其中的相关性是负相关性。

17.权利要求1的方法，其中包含干扰RNA分子的活细胞，在目的基因被功能性失活及活细胞与药物接触期间，于体外进行培养。

18.权利要求1的方法，其中如果包含干扰RNA分子的活细胞对药物的响应，与不含干扰RNA的同细胞型活细胞对该药物的响应存在差异，则确定该基因介导此种细胞型的活细胞对该药物的响应。

19.权利要求1的方法，其中如果包含干扰RNA分子的活细胞对药物的响应，与不含干扰RNA分子的活细胞对该药物的响应不存在差异，则确定该基因不介导此种细胞型的活细胞对该药物的响应。

20.权利要求1的方法，其中的药物是KSP蛋白抑制剂。

21.权利要求1的方法，进一步包含在使用干扰RNA分子使基因功能性失活之前鉴别具有与该细胞型活细胞响应药物相关的表达模式的基因的步骤。

22.权利要求21的方法，其中基因表达模式是用核酸微阵列来确定。

23.权利要求21的方法，其中通过比较活细胞与药物接触之前与接触之后由该基因转录的mRNA的数量，来确定该基因的表达模式。

24.一种鉴定哺乳动物受试者对KSP抑制剂响应的方法，所述方法的步骤包括，分析哺乳动物受试者癌细胞的20号染色体以确定20号染色体的20q段在该癌细胞中是否被扩增，其中如果20号染色体的20q段在该癌细胞中未被扩增，则该哺乳动物受试者被鉴定为对KSP抑制剂响应。

25.一种确认基因有助于活细胞对药物响应的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)通过向细胞型的活细胞中导入干扰RNA分子，使该细胞中的基因功能性失活，其中基因的表达模式与该细胞型活细胞对药物的响应有关，并且此基因在该细胞型所有活细胞中都有拷贝存在；

(b)通过确定该活细胞对药物的响应不同于不含干扰RNA分子的同细胞型活细胞对该药物的响应，从而确认该基因有助于该活细胞对这种药物的响应。