CN1980685B - 人中hiv感染抗性的生物标记及其生物学应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及甲酰基肽受体(FPR)家族和甲酰基肽受体样1(FPRL1)的一种或多种激动剂作为人类中感染抗性的生物标记的用途。这样的生物标记可用于诊断、预防和治疗中。

Description

人中HIV感染抗性的生物标记及其生物学应用

本发明涉及人中传染病抗性的生物标记以及它们的生物学应用，尤其是在诊断、预防和治疗中的应用。

本发明涉及抗一般病原体感染的抗性标记，尤其是抗病毒和逆转录病毒造成的感染、更具体而言是HIV-感染的抗性标记。

在二十世纪末期出现了许多病毒病，尤其引人注目的是由人免疫缺陷病毒(HIV)所引起的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。在其被发现的二十多年后，人免疫缺陷病毒(HIV)传染病仍然在世界范围内对健康、社会及经济各方面造成极大的负担。

在2002年，所列举到的死亡人数大约有310万个，同时登记的新感染病例约为5百万例。全世界有4千万以上的人被感染，所以急需寻找药剂用于防止此病毒的传播以及改善目前的治疗方法。迄今为止，两种宿主遗传特性、先天和获得性免疫反应、病毒突变或减毒，都被用于解释对该传染病较高或较低的个体易感性。在了解人类免疫缺陷病毒如何进入靶细胞的机制上有许多进展。诸如病毒共受体的鉴定以及与其受体结合的病毒外壳蛋白(Env)的结构等标志性的发现对于了解Env如何如图1所述介导病毒和细胞膜的融合具有重要的意义。

某些人对感染有些“免疫力”，即使重复暴露于HIV病毒亦如此，还有某些HIV感染者发病过程极其缓慢，这些现象的存在为阐明天然HIV抗性的潜在机制提供了有价值的线索。令人惊奇的是，上述的两种类型，即所谓的有接触史的血清反应阴性者、有接触史的未感染者(ESN，EU)和发病缓慢、长期患病(SP，LTNP)个体都具有共同的免疫反应，例如针对共同靶目标的中和抗体的产生，它可以在病毒的进入和/或扩散方面起到保护作用。

1989年，Ranki的文章论述了一个奇怪的现象：在已知HIV阳性男患者的抗体和抗原阴性性伴侣体内可检测到对于HIV天然蛋白gp120和重组衣壳及核心蛋白的HIV特异性T细胞反应[1]。另外两份报告也证实了最初的发现，作者提出，有可能接触不会导致血清转化和感染的HIV可能与T辅助淋巴细胞的独特引发有关[2，3]。对不同类别的高危HIV感染个体进行分析，其中包括非肠道暴露于HIV的健康中心工作人员和HIV感染母亲的健康新生儿，结果表明在所有这些受试者中都存在的是HIV特异性T辅助细胞，而非抗体[4]。这些观察资料导致这样一个假设，即引起HIV特异性T细胞唯一引发的病毒暴露可能与针对真正HIV感染的保护作用有关。此假设得到了Narobi[5](thePumwaani组)中三名商业性性工作者的极大支持，清楚的证明了尽管大部分女性在开始做妓女后1年内感染了HIV，但有相当一部分，据后来估计大约为被测受试者的15％左右对感染有明显的抗性。2)SarahRowland-Jones[6]指出在HIV感染母亲的健康新生儿中存在HIV特异性CTL。在这些新生儿中检测到HIV特异性的分泌IFNα的CD8T淋巴细胞是一个转折点，认识到与血清转化不相关的HIV暴露是与实际上失败的感染相联系的，并且活的复制病毒是真正造成特异免疫性激发的原因。事实上，只有用病毒进行真正感染会导致病毒抗原与I型HLA分子联合呈递，并诱发CD8介导的免疫反应。(更晚一些时间，在此情形中细胞介导的免疫保护作用得到了如下观察结果的进一步证实，即中断商业性性工作一段时间后的KenyanHIV抗性性工作者中存在的晚期血清转化由于抗原暴露程度的降低而使HIV特异性CD8+反应减弱)[7]。3)有关使短尾猿体内暴露于亚感染剂量的SIV并在其中检测SIV特异性T辅助细胞的实验显示出对用感染剂量的同种病毒进行后续攻击的保护作用[8](这些结果并未得到其它研究者确定的证实)。

由此产生了研究抗HIV感染保护作用的免疫相关性领域。随后，关键的报告显示，在暴露于HIV但未感染的个体内：I)可能存在特殊的遗传背景[10-12]，简而言之是在CCR5受体的.32缺失[9]；2)可溶性因子的产量增加，包括细胞抗病毒因子(CAF)[13，14]、β趋化因子和α防御因子[15][16-18]；3)在宫颈阴道液和精液中可检测到分泌性HIV特异性IgA及T辅助细胞和CTL[19-22]；以及4)NK细胞活性特别强[23]。因而，在首次描述在血清反应阴性个体内检测到HIV特异性T辅助细胞后15年，针对HIV感染的可能抗性可总结为，可能在有利的遗传和天然免疫环境条件下，与全身性和粘膜细胞介导的免疫力诱发相关，与粘膜局限性IgA相关。

表1.可能与HIV感染抗性相关的机制。

获得性机制	遗传机制	先天免疫性
			HIV特异性T辅助细胞	HIV-1共受体的缺失	NK活性的提高
HIV特异CTL	特殊的HLA等位基因	β趋化因子的产量增加
			粘膜HIV特异性IgA		CAF的产量增加
抗CD4抗体		α防御素浓度的提高
			抗CCR5抗体

对HIV感染天然抗性机制的了解可能对于确定新的抗病毒策略具、尤其是对于开发新的诊断、治疗和疫苗产品具有意义。

本发明的发明者比较了来自暴露于HIV但未感染的个体(EU)、暴露于HIV并感染的个体(HIV+)和健康供体(HC)的蛋白图谱(蛋白组)和基因组表达(转录谱)的研究资料，以便从EU中鉴定能解释抗HIV感染抗性机制的生物标记。

他们已鉴定了一种重要的细胞因子，它负责诱导与病毒抗性相关的蛋白。

他们还发现另一细胞因子在被测试的组群中显示出多态性，在EU中呈现出特殊的模式。其它同工型也似乎通过它们对FPR或FPRLI受体的作用以及随后CCR5或CXCR4HIV共受体的磷酸化作用而与HIV抗性过程有关。这些细胞因子的组合被认为是间接参与阻断病毒感染的要素。无论是单独地还是以联合的方式，它们均显现出参与了HIV抗性机制。

因此，本发明的一个目的是提供HIV感染抗性的生物标志，包括所述的细胞因子以及所诱导级联反应中的蛋白质。

根据另一目的，本发明意在提供用于诊断、预防和治疗的新工具，其中包括单独使用或联合使用所说细胞因子以及它们所诱导的级联反应中的蛋白质。

因此，本发明涉及甲酰基肽受体(FRP)受体家族和类甲酰基肽受体1(FPRLI)的一种或多种激动剂作为HIV感染抗性的生物标志的用途。更具体而言，所说的激动剂选自可溶性SAA，WKYMWVm肽，细菌趋化肽fMLF及其约8.6kDa的片段中。

更特别的是，本发明涉及至少一种先天免疫反应蛋白质，包括IL-22、Jack/STAT途径、SOCS3、β防御素(2和3)和急性期载脂蛋白血清淀粉样Ac或A-SAA或其片段、IL-8细胞因子及其同工型用作VIH感染抗性的生物标志的用途。

有利地，所述的生物标志选自由IL-22和/或SOCS1和/或STAT3和/或根据SELDI-TOF在血浆中鉴定的约8.6kDa可溶性蛋白质和/或IL-8以及它们的同工型所组成的组中。

本发明还涉及磷酸化的STAT和/或SOCS蛋白质的用途。

另外地和/或附加地，本发明涉及用作生物标志的趋化因子，包括GRO-α、MIP-3β、SDF1-β和γ趋化因子lymphotactin以及它们的同工型。

所述蛋白质由于其作为HIV感染抗性生物标志的特性而在生物学应用中很有价值。尤其是，它们在诊断、治疗和预防中很有用处。

本发明因此还涉及它们作为诊断工具的用途，其中包括利用所述蛋白质。

本发明还涉及用于预防或治疗由病原体造成的任何感染、尤其是病毒或逆转录病毒感染、更具体而言是HIV感染的药物组合物。

所述的组合物包括有效量的至少一种被定义为生物标志的上述蛋白质，以及药用可接受载体。

优选的药物组合物包括有效量的一种或数种如下所述的蛋白质：包括IL-22、Jack/STAT途径、SOCS3、β防御素(2和3)以及急性期载脂蛋白血清淀粉样Ac或A-SAA或其片段、IL-8细胞因子和同工型，并联合了药用惰性载体。

本发明的药物组合物被有利的制备成经口服、肌肉内、静脉内或粘膜途径给药。

对于口服而言，它们可制备成药片、药丸、胶囊、滴剂、药膏或雾化剂形式。

对于注射施用而言，药物组合物是由无菌的或可灭菌的溶液或悬浮液或乳剂制成的静脉内、皮下或肌肉内途径注射用溶液形式。

对于粘膜施用路径而言，药物组合物是凝胶形式的。

施用剂量可由本领域技术熟练人员根据患者的病情方便的进行调整。

另一方面，本发明涉及促进宿主对病毒感染的先天性抗性的方法，包括利用至少一种上述定义为生物标志的蛋白质，尤其是IL-22，作为有助于针对感染的先天性免疫反应的起始细胞因子。

本发明的其它特性及优点将在以下实施例中有进一步的描述，并可分别参阅图1-10，各图分别代表：

图1：病毒外壳附着于细胞受体的不同步骤。

图2：来自不同组受试者的SELDI-TOF蛋白图谱。

图3：对级联感染EU的HIV-1感染的抑制作用。

图4：用抗A-SAA单抗耗尽约8.6kDa的蛋白质。

图5和6：来自不同组的受试者的比较性IL-8(图5)和IL-22(图6)RT-PCR。

图7：来自不同组受试者的SAGE分析的蛋白质印迹验证。

图8：急性期SAA蛋白质与FPR受体的结合所诱导的VIH-1CCR5共受体磷酸化作用。

图9：未成熟树突状细胞的HIV-1R5传染性。

图10：展示约8.6kDa片段的SAA制品的SELDI-TOF图谱。

材料和方法

暴露但未感染(EU)的受试者募集

本试验召集了暴露于HIV但未感染的受试者。在各个案例中ESN是HIV感染患者的性伴侣，据报道每一对都有较长的不带避孕套插入式性交史(并无其它已知的危险因素)。EU的包含标准是有至少4年的多次未保护性生活史且在该研究期之前4个月内有至少4次危险性交。通过培养和RNA病毒负荷方法发现EU可重复地是HIV血清反应阴性。在此试验中还募集了HIV感染者和健康的对照。H1V患者和健康对照的年龄和性别与EU相当。所有的EU、HIV+和HC受试者已被Florence的SantaMariaAnnunziata医院纵向跟踪至少4年(在研究期之前)。这使得我们可以从试验中排除在此期间内已报道过患性传播疾病或任何其它疾病的ESN和HC。

基于CCR5-Δ32等位基因的存在情况表征EU，在1个受试者体内检测到杂合缺失。所有的EU、HIV患者和低风险的未感染受试者均同意捐赠外周血单核细胞。

细胞

用曾经有频繁的未受保护性交或交换注射器进行侵入性药物注射的EU和HIV+不一致配偶的T细胞进行蛋白质组和转录物组比较研究。用来自HC的T细胞作为这些分析的对照。收集获自三个组即HC、EU和H1V+的外周血单核细胞(PBMC)并在Ficoll-Hypaque上分离，短期(6天)培养(Yssel，H.和Spits，H，免疫学通用方法CurrentProtocolsinImmunology，第7章第19节)，然后将T淋巴细胞(CD4+和CD8+)用CD3/CD28活化，并培养于补充了10％FCS的RPMI中。简而言之，为了活化CD3-TCR复合物，用10μg/mL的抗CD3、SPV-T3b单抗(MAb)在37℃包被24孔板4小时。随后，将106个细胞置于这些包被孔内，其中存在有包含1％AB+人血清和1μg/ml抗CD28L293单抗的培养基(Yssel′s培养基，Irvinescientific，SantaAna，CA)。分别采用了3种T细胞活化时间：2、6和18小时。从每组5个受试者(分别具有相等的细胞数目和总RNA，表2)中富集活化的细胞，以备用连续分析基因表达法(SAGE，Velculescu1995，[24])进行T细胞基因表达研究。随后，冻存集合中各受试者的一套总ARN备用，以便进行进一步独立证实SAGE结果。一组这些细胞也用于进行Power和蛋白质印迹分析(见下文)。通过SELDITOICiphergen方法对3组受试者(n＝25，表2)血浆中存在的可溶性蛋白质进行分析。

树突状细胞衍生自健康供体的单核细胞。简而言之，加工淡黄色涂层以获得高度纯化的单核细胞，所述的单核细胞培养于含10％FCS并存在10ng/mLIL-4和150ngGM-CSF(Becton和Dickinson)的DMEM培养基中7天，直至获得用合适的单抗(抗-DC标记、抗-CDla、抗-CD83和抗CD86单抗)定性也很好的显示出甲酰基肽受体样1(FPRL1)(属于甲酰基肽受体(FPR)家族的受体)未成熟的树突细胞(iDC)。细胞培养于37℃含5％CO₂的潮湿空气中。

抗体和试剂

重组人IL-22、抗CCR5多克隆抗体、抗人IL-22多克隆抗体购自R&DSystems(Oxon，UK)。血清淀粉样A(A-SAA)和IL-8蛋白购自Peprotech(RockyHill，NJ)。MIP-I1β获自

Baleux(PasteurInstitute，Paris，France)。抗IL-8单抗购自Bender。抗-CXCR4、抗SAA1和2单抗(Biosource)、抗SAA单抗(Calbiochem)、抗活性Stat-1多克隆抗体、抗Statl单抗、抗活性Stat-3多克隆抗体、抗Stat-3多抗、抗活性Stat-5多克隆抗体、抗Stat-5单抗购自Becton和Dickinson(PaloAlto，CA)。抗SOCS3多克隆抗体(SantaCruzlaboratories，SantaCruz，CA)

通过蛋白质-芯片SELDI-TOF方法进行血浆分析

在分析前，将血浆样品在13000rpm离心15分钟，弃沉淀并将上清稀释于(1∶10)优化的结合缓冲液(BB：NaCl0.250M，Hepes50mM，pH7.5)中。在1小时中将稀释过的血浆样品施加到预先用结合缓冲液饱和两个5分钟的强阴离子交换剂(SAX2)蛋白质芯片^TM上。未结合的蛋白质用漂洗缓冲液(WB：NaCl1M，Hepes50mM，pH7.5)连续洗3次，每次5分钟，最后用纯的双蒸水5μL洗一次。随后在室温(RT)空气晾干被芯片俘获的蛋白质，然后用基质(3，5-二甲氧基-4-hydroxycinnapynicacide(SPA)溶于99.9％乙腈和0.1％三氟乙酸中)覆盖以吸收激光能量。制备好基质的样品在室温晾干。然后使这些样品接收平均100次实时激光发射，以便在10000直至40000击(任意单位)范围内的激光强度释放出所捕捉到的蛋白质，从而产生蛋白质谱(proteogram)。检测离子化并被释放的蛋白质，用TOF分析通过蛋白质-芯片生物学体系II软件(PBSII；Ciphergen)和CiphergenPeaks软件测定它们在蛋白质图谱上突出的分子质量。根据外部校准的标准测定被芯片表面所捕捉的各种蛋白质的质荷比(m/z)：人血管紧张素I(i.2965kilodaltons，kDa)、人ACTH(2.9335kDa)、人α-内啡肽(3.4650kDa)、牛胰岛素(5.7336kDa)和牛泛素(8.5648kDa)。

从EU血浆中耗尽约8.6kDa蛋白质

将来自Clinisciences、浓度为100μg/mL的抗A-SAA(SAA-1&SAA-2)单抗25ug加入用1mLPBS洗过3次的25微升磁珠(Dynal)中，并在4℃环形振荡18小时。随后将抗-A-SAA单抗包被的珠子用1mLPBS洗3次。然后加入500微升EU血浆并在37℃振荡保温3小时。然后用适当的Ciphergen芯片再次分析此血浆上清。施加与抗A-SAA1和2单抗预保温或未预保温的5微升EU并如前所述用SELDI-Tof(Ciphergen^TM)进行分析。

重组A-SAA蛋白对HIV-1感染的抑制

在HIV-1感染前，将DC细胞以指定浓度与作为FPRL1激活剂的急性期人载脂蛋白血清淀粉样A(SSA，来自PeprotecTM)一起保温1小时。随后，以MOI为0.1用HIV-1ADA或HXB2感染细胞2小时。细胞被充分漂洗并在完全培养基中保温。在感染4天后，用酶联免疫吸附检测法(Beckman-Coulter，France)测定HIV-1的p24水平。

SAGE分析

SAGE基本上按照Velculescu′s方案所详述的要点[7](该方案可获自URL：WWW.sagenet.Org)以及Powell[8]和Kenzelmann[9]所作的改动进行。

Power印迹分析

蛋白质免疫印迹分析如文献所述(www.translab.com/shtml)进行。简而言之，将来自3组群的CD3/CD28刺激T细胞在裂解缓冲液(Tris10mMpH7.4，原钒酸钠1mM，SDS1％)中裂解，超声破碎并离心澄清。在5-15％梯度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质，以便在一块凝胶上检测分子量分布范围较广的蛋白质。将400微克蛋白质加样至横过整个凝胶宽度的长孔中。在标准的25孔凝胶上这相当于每条泳道加入约15μg蛋白质进行电泳。随后将凝胶转移至Immobilon-P膜(Millipore，Bedford，MA)上过夜。转移后，将膜用5％的牛奶封闭1小时。随后，将膜插入沿膜分隔成45个通道的蛋白质印迹复制膜上。在每个通道中加入不同的复合物抗体混合物并杂交1小时。染色后，将膜进行漂洗并与山羊抗小鼠二抗辣根过氧化物酶(HRP)杂交30分钟。所有的抗体均为小鼠单抗。漂洗膜并用SuperSignalWestPico(Pierce，SantaClara，CA)进行显影。

RT-PCR分析

将分离自活化T细胞的总RNA通过逆转录转变成cDNA。各个总RNA样品在42℃逆转录50分钟，使用试剂如下：1μg总RNA和200单位SuperscriptII逆转录酶(RT，Gibco-BRL)，随酶提供的RT缓冲液；100mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、40单位Rnasin(Promega，Madison，W1，USA)，1.25mmol/L各dNTP，以及500ng寡dTs。PCR进行如下：2uLcDNA；1.25mmo/L各dNTP，2.5单位Taq聚合酶(Promega)；2.5mmol/LMgCl2，2.5μL10X缓冲液和20pmol各特异引物对，总体积25μL。使用的特异引物如下：IL-22：SEQIDNo1有义链5′-TGACAAGTCCAACTTCCAGCAG-3′，SEQIDNo2反义链5′-TCTGGATATGCAGGTCATCACC-3′；IL-8：SEQIDNo3有义链5′-AACTTCTCCACAACCCTCTG-3′，SEQIDNo4反义链5′-TTGGCAGCCTTCCTGATT-3′；GAPDH：SEQIDNo5有义链5′-CCA-CCC-ATG-GCA-AAT-TCC-ATGGCA-3′和SEQIDNo6反义链5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3′。预保温后(94℃，5min)，各PCR样品进行29个循环，每个扩增循环包括变性(94℃，1min)、引物退火(56℃，1min)和引物延伸(72℃，1min)，并在最后延伸一次(72℃，10min)。

蛋白质印迹分析

将10⁶个来自各组群(HC，EU和HIV+)的CD3/CD28活化T细胞(如上指出的)于1％NP40缓冲液中裂解。对于各组而言，在还原条件下电泳等量蛋白质并电泳转移至硝酸纤维素膜上。将膜在含5％BSA和0.1％Tween20的TBS(50mmol/LNaCl，20mmol/LTrisHCI，pH7.5)中保温30分钟，然后在4℃与一抗保温过夜。蛋白质用ECL体系(AmershamPharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)显影。将印迹膜在含0.1％Tween20的TBS中漂洗并与缀合了HRP的山羊抗兔或抗小鼠二抗(AmershamPharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)一起保温。为了与另一抗体重新进行印迹分析，将滤膜如前所述剥离[10]。

HIV-1共受体磷酸化评估

在指定浓度(图7)下用

或急性期A-SAA(Peprotec^TM)在指定时间内于37℃刺激未成熟的树突细胞。然后将细胞冰置20分钟，期间周期性的与含磷酸酯酶抑制剂(ImM苯磺酰氟，5μg/mLaprotinin，5μg/mLleupeptin，1mM原钒酸钠，1mMEGTA)的裂解缓冲液(1％TritonX-100，20mMTrisHClpH8.0，137mMNaCl，15％甘油，5mMEDTA)混合后，裂解细胞。细胞裂解物用30μl洗过的蛋白ASepharose珠子(15μL包装珠子)在4℃预先澄清1小时，并将1μg多克隆抗磷酸丝氨酸抗体(BD)加入200μg细胞裂解物中。将反应混合物4℃保温过夜。通过加入50uL漂洗过的蛋白Asepharose珠子(25pL包装珠子)俘获免疫复合物。将反应混合物在4℃继续放置2小时。将珠子瞬时离心沉淀(14000rpm，10秒)，甩干上清，用冰冷的1XIP缓冲液漂洗3次，然后重悬于30uL2XLaemli样品缓冲液中并煮沸5分钟以洗脱免疫复合物。在10％SDS-PAGE预制胶(Invitrogen)上进行电泳后，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。CCR5用多克隆抗-CCR5抗体(R&DSystems)和ECL系统(AmershamPharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)显影。

人趋化因子Searchlight^TM阵列

按照趋化因子Searchligh阵列(PierceEndogen，Perbio，Boston)制造商的说明书分析来自各受试组的4种不同的血清中8种趋化因子的血清含量。

结果

某些个体尽管通过性途径或全身途径重复暴露于I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中，却仍然未感染。为了研究抗HIV-1感染抗性的潜在分子机制，发明者对来自暴露于HIV-1、但未受感染的受试者(EU)、它们的HIV-1感染性伴侣和健康对照的CD3/CD28活化外周血T细胞(增强细胞信号传导和基因表达)和血浆(研究它们的可溶性蛋白质)进行了比较性研究(表2)。

n.	类别	每个EU的HIV+配偶	病毒负荷	CD4
EU		HIV+
					1	EU1	HIV+20	46-0	348
2	EU2	HIV+21	＜400	244
					3	EU3	HIV+22	400	327
4	EU4	HIV+23	9420	328
					5	EU5	HIV+24	9440	916
6	EU6	HIV+18	＜50	205
					7	EU7	HIV+25	750000	16
8	EU8	HIV+26	2070	636
					9	EU9	HIV+27	399	101
10	EU10	HIV+28	750000	424
					11	EU11	HIV+9	＜50	673
12	EU12	HIV+29	＜50
					13	EU13	HIV+16	＜50	472
14	EU14	HIV+19	＜50	1220
					15	EU15	HIV+13	＜50	321
16	EU16	HIV+30	＜400	385
					17	EU17	HIV+31	＞750000	49
18	EU18	HIV+32	400	339
					19	EU19	HIV+33	＜50
20	EU20	HIV+34	400	327
					21	EU21	HIV+35	350000	166
					HC
1	HC1		HIVneg
					2	HC2		HIVneg
3	HC3		HIVneg
					4	HC4		HIVneg
5	HC5		HIVneg
					6	HC6		HIVneg
7	HC7		HIVneg
					8	HC8		HIVneg
9	HC9		HIVneg
					10	HC10		HIVneg
11	HC11		HIVneg	7 -->
					12	HC12		HIVneg
13	HC13		HIVneg
					14	HC14		HIVneg
15	HC15		HIVneg
					16	HC16		HIVneg
17	HC17		HIVneg
					18	HC18		HIVneg
19	HC19		HIVneg
					20	HC20		HIVneg
21	HC21		HIVneg
					22	HC22		HIVneg

分别用连续分析基因表达(SerialAnalysisGeneExpression，SAGE)法、表面增强的激光解吸离子化及飞行时间质谱Surface-EnhancedLaserDesorptionlonisationandTimeOfFlyMassSpectrophotometry(SELDI-TOF，Ciphergen)和Power印迹法(参阅材料和6方法部分)进行补充性的基因组、蛋白质组和细胞信号传导分析。从遗传和生理学上了解长期病情不发展的受试者Longtermnonprogressors(LTNP)以及EU受试者的天然抗病毒机制可提供抗HIV感染疗法的基础。然后发明者以EU受试者中频繁暴露于HIV但未感染的个体为基础研究生理病理学机制。

用SAGE方法对大量基因标签(HC：21193个标签；EU：22697个标签，和HIV+：17285个标签)进行转录物组分析得到的最初结果显示EU过表达Th1IL-22和SOCS1，并且粒酶B在HIV+中的表达较在EU和HC中低，后二者显示出相似的水平(表3)，这些实验结果是在无任何“预想”前提下获得的。

SAGE

基因水平表达

基因	HC	ESN	HIV+
				IL-22	1	13	0
SOCS1	0	3	0
				粒酶B	3.91	3.96	0

Power印迹

蛋白质表达水平

蛋白质	HC	ESN	HIV+
				STAT3	0	5	0

用Power印迹分析平行分析来自3个测试组的合并T细胞的蛋白质，检测到急性期反应因子STAT3。来自每组25个受试者的血浆分析(用SELDI-TOF方法)显示出分子量约8.6kDa的可溶性蛋白表达增加(图2)。

由于IL-22引发了包括Jack/STAT途径、SOCS3、β-防御素和急性期载脂蛋白血清淀粉样A(A-SAA)：SAA-1和SAA2在内的先天免疫应答[25]级联反应(图3)，发明者进一步用不同的方法研究了这些数据以证实并扩大其显著性(参阅材料和方法部分)。ASAA在肝脏和诸如血管上皮等其它组织中合成，它被发现与血浆中有无HDL[26]相关。A-SAA启动子对诸如IL-1α、TNF、IFNα和IL6等可被LPS诱导的炎性细胞因子具高度反应性。此外，最近，研究显示Th1IL-22细胞因子能参与A-SAA表达。这些资料表明A-SAA可能在局部位点发挥免疫性先天防御分子的作用[27]。A-SAA的转导后裂解产生了分子量约为8.5kDa的C端片段[28，29]。为了鉴定获自SELDI-TOF分析的该约8.6kDa蛋白质，在进行血浆SELDI-TOF图谱分析之前使用了特异的抗-A-SAA单抗，结果如图4所示，可见相应于约8.6kDa的峰被此抗-A-SAA单抗所耗尽了。有趣的是，已知A-SAA能诱导IL-8细胞因子[30]，因而对来自每组5名受试者的样品进行IL-8特异性RT-PCR，以证实此细胞因子是EU级联反应的特征。图5清楚显示了与另两组(HIV+和HC)相比，EU中的IL-8呈特异多态性的PCR证据。此外，还对集合中每个受试者进行了特异的IL-22RT-PCR(图6)，我们可观察道只有EU显著过表达此重要的Th1细胞因子。

还进行了其它对照和证明，用来自汇集样品的蛋白质进行了蛋白质印迹分析。同样观察到，在EU组中STAT1和STAT3被磷酸化了(图7A和7B)，而STAT5在HIV+中被下调，但在HC和EU组中均表达较高且活化程度相等(图7C)。SOCS3蛋白质，一种STAT3反应性基因的表达在EU中上调了(图7D)。此外，这些EU受试者显示出过表达α防御素[15]。而且，研究显示IL-8能通过FRP受体家族使HIV共受体脱敏[31，32]，且Statl是细胞抗病毒因子(CAF)介导的对HIV-1长末端重复片段(LTR)活化和HIV复制的抑制作用所必需的。

由于FPR和FPRL1的激动剂，可溶性A-SAA、WKYMWVm肽、细菌趋化肽fMLF以及可能有的它的约8.6kDa片段诱发了磷酸化作用，如我们实验中用A-SAA进行特异性蛋白质印迹所显示的(图8)，且HIV-1共受体CCR5和CXCR4通过FPR的活化均得到下调[34-37]。因此如所报道的[31，37，38]，研究已显示A-SAA蛋白抑制HIV-1感染(图9)。

购自Peprotec^TM并用于这些检测中的A-SAA呈现该约8.6kDa的片段(图10)。

这些结果使得我们可以识别EU特征性的有利于针对HIV感染的先天宿主抗性的事件级联反应。因为IL-22能通过JAK/STAT诱导β防御素、A-SAA，而A-SAA诱发IL-8的分泌表达[30]，这些结果清楚的阐明了此级联反应。此外，IL-8[31]和α-防御素[39]已显示出可降低HIV-1感染。总而言之，我们的结果显示了IL-22是有助于提供针对HIV感染的抗性机制的先天免疫反应的起始细胞因子(图2)。

另一检测方法是利用Serchlight(Perbio^TM)人趋化因子阵列检测每组(EU，HC，HIV+)各4名受试者的血浆中的某些趋化因子(表4)。

来自Searchlight阵列(Perbio)的8种趋化因子

研究发现，与HIV+相比，GRO-α、MIP-3β、SDF1-β和γ趋化因子lymphotactin在某些EU以及有时在HC中高度过表达。这些趋化因子在HIV感染中的作用尚未清楚，但Lymphotactin显示出抗HIV活性[1]。不过，由于在我们的EU研究组中已发现EU特异性的IL-8多态，有可能认为这些趋化因子的特异多态性的存在可以具有某些EU的抗病毒效果(单独地或联合地)。

此外，SAGE分析有趣的显示出GranzymeB在HIV+中下调但在EU和HC受试者中得到维持。这证实了所观察到的在HIV-HAART处理受试者中granzyme丢失的现象[2，3]。同样，发明者在SAGE分析中观察到IFN-γ在EU中的产量较在HC和HIV+中的产量高。这些细胞因子是典型抗病毒的，这已经由其它研究者在有关EU的某些研究中发现了。

表4来自Searchlight阵列(Perbio)的8种趋化因子。

由于研究发现事件的级联反应诱导了先天免疫性的数个和主要方面，本发明的范围还延伸至除了HIV之外的其它病毒和逆转录病毒。

此外，还认为EU呈现出较高量的磷酸化STAT1，且重要的是，此成分是CD8T细胞所分泌的“细胞抗病毒因子”(CAF)的活性所必需的。同样还显示的是，与EU和HC相比，HIV+看上去释放了GranzymesB。GranzymesB是由CD8T细胞和NK所产生的，用于杀死受感染的细胞。

CAF的STAT-1依赖性产生

GranzymesB在感染HIV、但无AIDS发展的人体内的抗HIV活性中起主要作用。在SAGE分析中还观察到，EU中IFN-γ的产量较HC和HIV+中要高。这些细胞因子是典型抗病毒的。这些级联反应事件不仅是抗病毒感染的成分，还是抵抗所诱导的疾病的成分。

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Claims (12)

1.IL-22在制备用于诱导宿主对病毒感染的先天免疫反应的药物中的用途，其中IL-22作为有助于针对感染的先天免疫反应的起始细胞因子而用作预防剂。

2.IL-22在制备用于诱导宿主对病毒感染的先天免疫反应的药物中的用途，其中IL-22作为有助于针对感染的先天免疫反应的起始细胞因子而用作治疗剂。

3.权利要求1或2的用途，其中所述病毒感染是HIV感染。

4.IL-22在制备用于病毒感染的预防或治疗组合物中的用途，其中IL-22作为佐剂和先天系统诱导剂。

5.权利要求4的用途，其中所述病毒感染是HIV感染。

6.IL-22在制备用于通过诱导先天免疫性来治疗感染的具有佐剂和先天系统诱导剂性质的预防性或治疗性药物中的用途，其中IL-22为细胞因子或编码DNA形式，并且与药学惰性载体相组合。

7.权利要求6的用途，其中所述感染是病毒或逆转录病毒感染。

8.权利要求7的用途，其中所述逆转录病毒感染是HIV感染。

9.权利要求6-8中任一项的用途，其中所述药物是通过口服或粘膜途径或者通过注射施用的制剂形式。

10.权利要求9的用途，其中为了口服施用，所述药物以药片、药丸、胶囊、滴剂、贴片或喷雾剂形式呈现。

11.权利要求9的用途，其中为了通过注射施用，所述药物是由无菌或可灭菌溶液或悬浮液或乳剂生成的静脉内、皮下或肌肉内注射用溶液形式。

12.权利要求9的用途，其中为了粘膜施用，所述药物是凝胶形式。

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