CN1955738A - 一种鲆鲽鱼类受精卵微管骨架免疫荧光染色观察方法 - Google Patents

一种鲆鲽鱼类受精卵微管骨架免疫荧光染色观察方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鲆鲽鱼类受精卵细胞骨架的免疫荧光显微观察技术。首先采用改进的固定液对样品进行固定，然后用解剖针将胚盘从整个胚胎中剥离出来，对样品进行打孔处理，并用硼氢化钠降低或消除未结合的醛基对实验结果的影响，再对样品进行间接免疫荧光染色，最后用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对样品进行观察。该发明的优点是操作过程简单，结果清晰度高，立体感强，可用于鲆鲽鱼类受精卵从胚盘形成到2－细胞、4－细胞、8－细胞、16－细胞等发育时期的微管骨架的动态变化研究，也适用于同属浮性卵、多卵黄的其它海水鱼类卵的免疫组化研究中，其适用范围广泛。

Description

一种鲆鲽鱼类受精卵微管骨架免疫荧光染色观察方法
技术领域
本发明涉及免疫荧光显微技术，具体地说是一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架的样品固定、免疫荧光染色和显微观察的方法。
背景技术
免疫荧光技术是利用抗原-抗体特异性反应来研究特定蛋白质在组织、细胞中表达时间和部位的有效方法。免疫荧光显微观察技术在卵细胞骨架方面的应用，主要集中于果蝇、爪蟾和鼠等。在海洋动物卵细胞骨架方面的应用，主要集中于海胆、海星和对虾等物种上。免疫荧光显微观察技术在鱼卵细胞骨架方面的研究较少，仅见于青鳉和斑马鱼等淡水鱼，在海水鱼卵微管骨架方面的应用至今未见报道。
该技术在卵细胞方面应用时，因抗原-抗体的特异性反应的需要，均需先将卵膜去掉，再进行固定、免疫荧光染色和观察。但是海水鲆鲽鱼类受精卵，均为端黄卵，且为浮性卵。卵相对较大，卵径在0.86-1.10mm之间，有一个油球，卵黄含量高。受精膜薄而坚韧，其与卵黄膜之间的卵周隙和大多数淡水鱼卵相比很窄小几乎不可见。在实验中，很难将成活受精卵的受精膜去掉，并将该受精卵进行固定。因此，现有的普通动物和淡水鱼类受精卵细胞骨架的免疫荧光显微观察技术并不适用于海水鲆鲽鱼类的受精卵，需要建立一整套适用于海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架的免疫荧光染色显微观察方法。
在研究中，如参照爪蟾受精卵的固定方案，将完整的鲆鲽鱼类受精卵先用哌嗪-N，N’-双2-乙烷磺酸配制的甲醛-戊二醛固定液固定2-4小时，再用甲醇-20℃固定过夜，结果固定的受精卵混浊，解剖镜下分辨不出胚盘结构、图像模糊、背景较深。采用改进的固定方案固定的海水鲆鲽鱼类受精卵透明，易于在解剖镜下观察卵的胚盘结构，而且胚盘结构完整，受精卵的微管骨架保存完好，图像清晰，背景色较浅。另外，鲆鲽鱼类受精卵较大，外面有受精膜和卵黄膜包被着，用于荧光染色的抗体不易于透过两层膜进入受精卵细胞质中进行染色，用解剖针将胚盘从整个受精卵中剥离出来，使得抗体得以与相应的抗体结合。但是所得图像模糊一片，看不出明显的微管结构，如再用相应浓度的Triton-100对胚盘进行打孔处理，则能使受精卵的微管骨架结构在荧光显微镜下得以清楚地显现出来。
发明内容
针对现有免疫荧光显微观察技术在海水鲆鲽鱼类受精卵细胞骨架方面的应用限制，本发明提供一整套适用于海水鲆鲽鱼类卵细胞微管骨架的免疫荧光显微观察的材料固定、处理和染色观察方法。
本发明的技术方案如下：
一种鲆鲽鱼类受精卵微管骨架免疫荧光染色观察方法，包括如下步骤：
1)采用改进的哌嗪-N，N’-双2-乙烷磺酸(PIPES)配制的甲醛-戊二醛(FGP-fix)固定液对样品进行固定；固定液配制为：先配制微管聚合液，其成分为80-100mM K-PIPES，pH 6.8-7.0，5-10mM EGTA，100-200mM MgCl2，400-500mM NaCl，于4℃保存；固定前，在微管聚合液中加入甲醛、戊二醛、Triton X-100，加入量分别占微管聚合液浓度百分比的3.7-4.0％、0.25-0.5％和0.5-1％配制成固定液；受精卵在固定液中室温抚育3-6小时后，用磷酸吐温缓冲溶液(PBST)清洗两次，其中磷酸吐温缓冲溶液含128mMNaCl，2mM KCl，8mM NaH2PO4，2mM KH2PO4及吐温-20(Tween-20)，pII 7.2-7.4，吐温-20加入的浓度百分比为所述磷酸吐温缓冲溶液的0.1-0.3％；最后于PBST中4℃保存，待用。
2)解剖镜下挑选出发育状态较正常的受精卵，并用解剖针将胚盘从整个受精卵中剥离出来。
3)常温下用浓度百分比1-2％Triton-100对样品进行打孔处理，再在含有80-200mM NaBH4磷酸缓冲溶液(PBS)中室温下抚育6-16小时，降低或消除未结合的醛基对实验结果的影响。
4)采用改进的间接免疫荧光染色步骤对样品进行染色，间接免疫荧光染色的步骤为：清洗→抚育一抗→清洗→抚育二抗→清洗。
其中：清洗液为含有155mM NaCl、10mM Tris-Cl、pH为7.2-7.4的Tris盐酸缓冲液，及诺纳德P-40，其中诺纳德P-40占Tris盐酸缓冲液浓度百分比的0.1-0.2％；抗体稀释液为含有浓度百分比为10％的山羊血清和5％的二甲亚砜(DMSO)的Tris盐酸缓冲液。抚育抗体前非特异结合位点不封闭；抚育一抗(单克隆鼠抗α-微管蛋白(α-Tubulin))过夜，抚育二抗为(异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG)避光2-4小时。
5)用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜进行观察。
本发明原理是：免疫荧光技术原理是利用抗原-抗体特异性反应来研究特定蛋白质在组织、细胞中时空表达的有效方法。其基本原理是利用特定蛋白质的抗体，即第一抗体，使之与整装片中的该种蛋白质结合，然后加入荧光物质标记的抗第一抗体的抗体，即第二抗体，在显微镜下用合适的入射光观察，由于抗原-抗体的结合是高度专一性的，只有在具有该种蛋白质的部位才可见荧光，由此研究蛋白质的表达规律。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本发明改进了现有样品固定方法，不需要甲醇-20℃重新固定过夜，直接用PBST 4℃保存。该固定方法固定的海水鲆鲽鱼类受精卵透明，易于在解剖镜下观察卵的胚盘结构，并且胚盘结构完整，受精卵的微管骨架保存完好。
2、本发明采用解剖针将固定的受精卵的胚盘从整个卵中剥离出来，一方面易于对海水鲆鲽鱼类受精卵的微管骨架进行间接免疫荧光染色，另一方面避免了卵黄和油球对观察的影响。
3、本发明采用Triton-100对样品进行打孔处理，使得第一抗体和第二抗体能够透过较致密的卵膜而与特异性的位点结合，从而使受精卵的微管骨架结构得以清楚地显现出来。
4、本发明是对常规的免疫荧光染色步骤进行了改进。在抗体稀释液中加入了较高浓度的山羊非免疫血清，省去了加入抗体前对样品的非特异性结合位点进行封闭的步骤；在抗体稀释液中加入DMSO对荧光抗体进行保护，使得荧光信号更强，图象更清晰。
5、本发明抗体的抚育均在4℃条件下较长时间进行，使得图象的背景降低，抗体结合的更充分，荧光信号的淬灭速度降低，荧光信号更强，图象更清晰。
6、本发明固定的受精卵透明，在解剖镜下可清楚地看到卵的胚盘结构，易于挑选出发育正常的进行相应的实验处理，所以该方法对样品质量要求较粗放，只要有部分正常发育的卵就可以了。
7、本发明制备过程简单，容易掌握，不但适用于海水鲆鲽鱼类受精卵免疫荧光染色，用于从其胚盘形成到2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞等发育时期的微管骨架动态变化的研究，也适用于同属浮性卵、多卵黄的其它海水鱼类的卵免疫组化研究中，其适用范围广泛。
附图说明
图1本发明用于牙鲆受精卵胚盘前期形成前期纺锤体的免疫荧光染色图片。
图2本发明获得的大菱鲆受精卵2-细胞后期微管骨架的免疫荧光显微观察图片。
图3本发明获得的大菱鲆受精卵4-细胞中后期微管骨架的免疫荧光显微观察图片。
具体实施方式
下面结合实施例详述本发明。
实施例1
1)当牙鲆受精卵发育至胚盘形成时，制备改进的PIPES配制的FGP-fix固定液，方法为：先配制微管聚合液-80mM K-PIPES，5mM EGTA，100mM MgCl2，400mM NaCl，pH6.8于4℃保存；固定前，再在微管聚合液中加入甲醛、戊二醛、Triton X-100，加入量分别占微管聚合液浓度百分比的3.7％、0.25％、0.5％配制成固定液。
2)对样品进行固定，受精卵在固定液中室温下抚育3小时后，用PBST缓冲液洗两次，其中PBST缓冲液含有128mM NaCl，2mM KCl，8mMNaH2PO4，2mMKH2PO4，及Tween-20，pH7.2，Tween-20加入的浓度百分比为所述磷酸吐温缓冲溶液0.1％，最后于PBST中4℃保存。
3)在解剖镜下挑选出发育状态较正常的受精卵，并用解剖针将胚盘从整个受精卵中剥离出来。
4)室温下用浓度百分比1％Triton-100对样品进行打孔处理，再在含有80mM NaBH4的PBS溶液中，抚育6小时，降低或消除未结合的醛基对实验结果的影响
5)间接免疫荧光染色步骤为：清洗→抚育一抗→清洗→抚育二抗→清洗。
其中用含有155mM NaCl，10mM Tris-Cl，pH7.2的Tris盐酸缓冲液，及诺纳德P-40，其中诺纳德P-40占Tris盐酸缓冲液浓度百分比的0.1％，清洗3次，每次30分钟；进行间接免疫荧光染色的抗体稀释均用含有浓度百分比10％的山羊血清和5％DMSO的TBS缓冲液；受精卵在加入单克隆鼠抗α-tubulin(在抗体稀释液中按1∶800稀释)的抚育一抗液中，4℃抚育过夜；清洗液清洗5次，每次30分钟，然后在加入FITC标记的羊抗鼠IgG(在抗体稀释液中按1∶100稀释)的抚育二抗液中，避光，4℃抚育3小时；用清洗液清洗3次，每次30分钟。
6)在荧光显微镜下观察并拍照(参见图1)。
实施例2
1)当大菱鲆受精卵发育至2-细胞时，制备改进的PIPES配制的FGP-fix固定液，方法为：先配制微管聚合液-90mM K-PIPES，7mM EGTA，150mMMgCl2，450mM NaCl，pH 6.9，于4℃保存；固定前，在微管聚合液中加入甲醛、戊二醛、Triton X-100加入量分别占所述聚合液的浓度百分比的3.8％、0.4％和0.75％，配制成固定液。
2)对样品进行固定，受精卵在固定液中室温抚育6小时后，用PBST缓冲液洗两次，其中PBST缓冲液含有128mM NaCl，2mM KCl，8mMNaH2PO4，2mMKH2PO4，及Tween-20，pH7.3，吐温-20加入的浓度百分比为所述磷酸吐温缓冲溶液0.2％，最后于PBST中4℃保存。
3)在解剖镜下挑选出发育状态较正常的受精卵，并用解剖针将胚盘从整个受精卵中剥离出来。
4)在常温下用浓度百分比为1.5％的Triton-100对样品进行打孔处理，再在含有100mMNaBH4的PBS溶液中，室温抚育16小时，降低或消除未结合的醛基对实验结果的影响。
5)间接免疫荧光染色步骤为：清洗→抚育一抗→清洗→抚育二抗→清洗。
其中用含有155mM NaCl，10mM Tris-Cl，pH7.2的Tris盐酸缓冲液，及诺纳德P-40，其中诺纳德P-40占Tris盐酸缓冲液浓度百分比的0.15％，清洗3次，每次30分钟；进行间接免疫荧光染色抗体稀释液均用含有浓度百分比10％山羊血清和5％DMSO的TBS缓冲液；受精卵在加入单克隆鼠抗α-tubulin(在抗体稀释液中按1∶1200稀释)的抚育一抗液中，4℃抚育过夜；清洗液清洗5次，每次30分钟；然后在加入FITC标记的羊抗鼠IgG(在抗体稀释液中按1∶150稀释)的抚育二抗液中，避光4℃抚育2小时；用清洗液清洗3次，每次30分钟。
6)在荧光显微镜下观察并拍照(参见图2)。
实施例3
1)对4-细胞期大菱鲆受精卵进行固定，制备改进的PIPES配制的FGP-fix固定液，方法为：先配制微管聚合液100mM K-PIPES，10mMEGTA，200mM MgCl2，500mM NaCl，pH 7.0，于4℃保存；固定前，在微管聚合液中加入甲醛、戊二醛、Triton X-100加入量分别占所述聚合液的浓度百分比的4.0％、0.5％和1％，配制成固定液。
2)对4-细胞期大菱鲆受精卵进行固定，受精卵在固定液中室温抚育4小时后，用PBST缓冲液洗两次，其中PBST缓冲液含有128mMNaCl，2mM KCl，8mM NaH2PO4，2mM KH2PO4，及Tween-20，pH7.4，Tween-20加入的浓度百分比为所述磷酸吐温缓冲溶液0.3％，最后于PBST中4℃保存。
3)在解剖镜下挑选出发育状态较正常的受精卵，并用解剖针将胚盘从整个受精卵中剥离出来。
4)在常温下用浓度百分比2％的Triton-100对样品进行打孔处理，再在含有 200mM NaBH4的PBS溶液中，室温抚育12小时，降低或消除未结合的醛基对实验结果的影响。
5)间接免疫荧光染色步骤为：清洗→抚育一抗→清洗→抚育二抗→清洗。
其中用含有155mM NaCl，10mM Tris-Cl，pH7.4的Tris盐酸缓冲液，及诺纳德p-40其中诺纳德P-40占Tris盐酸缓冲液浓度百分比的0.2％，清洗3次，每次30分钟；进行间接免疫荧光，染色抗体稀释液均用含有浓度百分比10％山羊血清和5％DMSO的TBS缓冲液；受精卵在加入单克隆鼠抗α-tubulin(在抗体稀释液中按1∶1500稀释)的抚育一抗液中，4℃抚育过夜；清洗液清洗5次，每次30分钟；然后在加入FITC标记的羊抗鼠IgG(在抗体稀释液中按1∶200稀释)的抚育二抗液中，避光4℃抚育2小时；用清洗液清洗3次，每次30分钟。
5)在荧光显微镜下观察并拍照(参见图3)。

Claims (3)

1、一种鲆鲽鱼类受精卵微管骨架免疫荧光染色和显微观察方法，其特征在于包括步骤如下：
①采用改进的哌嗪-N，N’-双2-乙烷磺酸配制的甲醛-戊二醛固定液对样品进行固定，受精卵在该固定液中室温下抚育3-6小时，磷酸吐温缓冲溶液清洗，然后在磷酸吐温缓冲溶液中于4℃下保存，待用；
②在解剖镜下挑选出发育状态正常的受精卵，并用解剖针将胚盘从整个受精卵中剥离出来；
③在常温下用浓度百分比为1-2％的Triton-100对样品进行打孔处理，再在含有80-200mM NaBH4的磷酸盐缓冲液中，室温下抚育6-16小时；
其中：磷酸盐缓冲液成分为128mM NaCl，2mM KCl，8mM NaH2PO4，2mMKH2PO4，pH 7.2-7.4；
④采用改进的间接免疫荧光染色步骤对样品进行染色，其中：抚育抗体前非特异结合位点不封闭；抚育一抗过夜，抚育二抗为避光2-4小时；清洗液为含有155mM NaCl、10mM Tris-Cl、pH为7.2-7.4的Tris盐酸缓冲液，及诺纳德P-40，其中诺纳德P-40占Tris盐酸缓冲液浓度百分比的0.1-0.2％；抗体稀释液含有浓度百分比为10％的山羊血清和5％的二甲亚砜的Tris盐酸缓冲液；
⑤用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜进行观察。
2、按权利要求1所述样鲆鲽鱼类受精卵微管骨架免疫荧光染色和显微观察方法，其特征在于：所述的甲醛-戊二醛固定液制备为，先制备微管聚合液80-100mM K-PIPES，5-10mM EGTA，100-200mM MgCl2，和400-500mMNaCl，pH 6.8-7.0；固定前，在微管聚合液中加入甲醛、戊二醛和TritonX-100，加入量分别占所述聚合液的浓度百分比的3.7-4.0％、0.25-0.5％、0.5-1％，配制成固定液。
3、按权利要求1所述鲆鲽鱼类受精卵微管骨架免疫荧光染色和显微观察方法，其特征在于：磷酸吐温缓冲溶液含128mM NaCl，2mM KCl，8mM NaH2PO4，2mM KH2PO4及吐温-20，pH 7.2-7.4，吐温-20加入的浓度百分比为所述磷酸吐温缓冲溶液的0.1-0.3％。
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