CN1925848A - 具有黑色素生物合成抑制活性的土曲霉酮化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有土曲霉酮化合物作为有效成分的黑色素生物合成抑制剂。所述土曲霉酮化合物可以从国内土壤中寄居的青霉菌spKCTC 26245真菌菌株中容易地分离出来。这种抑制剂不直接抑制酪氨酸酶，而是通过活化黑色素嗜铬细胞中的ERK(胞外信号调节激酶)来抑制MITF(小眼畸形相关转录因子)表达以产生增白作用。因此，这种化合物的黑色素生物合成抑制作用远大于任何其他常规的抑制剂，并且当这种化合物与其他常规抑制剂一起使用时，由于它们不同的作用机制，可进一步提高作用效果。因此，本发明的化合物可有效地用作皮肤病治疗剂、皮肤增白剂和褐变抑制剂。

Description

具有黑色素生物合成抑制活性的土曲霉酮化合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及具有黑色素生物合成抑制活性并源于真菌的化合物的新用途及其制备方法。
背景技术
黑色素是一种酚类生物高聚物，并广泛地分布在自然界中。它是黑色色素和蛋白的复合物，并具有提高抵抗任何环境和竞争的生存能力的活性。然而，黑色素的过度产生会引起变色和雀斑，导致皮肤老化或甚至导致皮肤癌。黑色素之所以过度生物合成，其原因在于臭氧层被破坏而严重接触UV光，而过度生物合成会对人类造成伤害，尤其是对皮肤造成伤害。因此，做出了多种尝试来研发具有较强黑色素生物合成抑制活性的新物质。
在皮肤癌方面，黑色素生物合成已成为研究的主要目标，研发了各种黑色素生物合成抑制剂，并应用到医药、化妆品和食品工业领域，例如，用于制备皮肤病治疗剂、预防和治疗变色和雀斑的皮肤增白剂和褐变抑制剂等。并且从环境角度出发，对抑制剂有极大的需求。
黑色素生物合成所涉及的因素可分成两类；其中一类由直接抑制酪氨酸酶的各种因素构成，而酪氨酸酶是一种黑色素生物合成速度调节酶。
酪氨酸酶是一种与铜结合的酶，并广泛地存在于动物、植物、微生物和人类中。它可以加速酚类化合物如一羟基-或二羟基-苯丙氨酸(DOPA)等的需氧氧化，并诱导因黑色素沉积在接触UV光的皮肤上而造成的皮肤损伤和老化。此外，多酚氧化酶如酪氨酸酶引起食物发生褐变反应，尤其是蔬菜或水果。
对黑色素生物合成抑制剂的研究集中在研发酪氨酸酶抑制剂，迄今所研发的代表性酪氨酸酶抑制剂是能够与酪氨酸酶活性部位的铜离子产生螯合作用的物质、使醌类转化成酚类的还原剂如抗坏血酸、以及使酪氨酸酶本身变性的非亚硫酸盐试剂。
酪氨酸酶抑制剂已被研发成各种形式的增白剂，尽管已被应用，但仍存在问题。例如，4-羟基茴香醚和氢化奎宁，已被局部使用以治疗黑素增多病，如变色、雀斑、斑点、妊娠期的色素沉着过度等，尽管它们具有较强的黑色素生物合成抑制活性，但同时也会诱导嗜铬细胞的恶化或甚至死亡并损害细胞的原始功能。特别地，氢醌化合物已被研发成具有黑色素生物合成抑制活性的增白霜剂，据说其可诱导皮肤病或因其细胞毒性而产生的疾病，因而它们仅在一些国家被允许使用。
黑色素生物合成所涉及的另一类因素不直接抑制酪氨酸酶，但可以调节黑色素嗜铬细胞中酪氨酸酶表达所涉及的转录因子。
根据近来关于ERK抑制测试的报道，黑色素细胞中的黑色素生物合成可能受到ERK活化作用的抑制(Englaro W等人，Inhibition of the mitogen-activated protein kinase pathway triggers B16melanoma cell differentiation.J Biol Chem，1998，273：9966-9970)和由ERK活化作用产生的MITF分解的抑制(Wu M等人，c-Kit triggers dualphosphorylations，which couple activation and degradation of the essentialmelanocyte factor Mi.Genes Dev 2000，14：301-312)。
利用这种因素的黑色素生物合成抑制剂不会产生与直接抑制酪氨酸酶有关的副作用，此外，当它们与常规黑色素生物合成抑制剂一起使用时，由于其不同的作用机制可能会提高效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种黑色素生物合成抑制剂，它不直接抑制酪氨酸酶而产生增白作用，但是通过加速ERK(胞外信号调节激酶)的活化作用可抑制MITF(小眼畸形相关转录因子)的表达，本发明还提供这种黑色素生物合成抑制剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供一种含有土曲霉酮化合物作为有效成分的黑色素生物合成抑制剂。
为实现上述目的，本发明也提供一种从青霉菌sp(Penicillium sp)分离具有抑制黑色素合成特性的土曲霉酮化合物的方法。
尽管本发明的土曲霉酮化合物不直接抑制酪氨酸酶，但是它通过加速黑色素嗜铬细胞中的ERK活化作用而抑制MITF的表达，从而表现出增白效果。此外，与直接作用于酪氨酸酶的常规黑色素生物合成抑制剂相比，这种化合物几乎没有细胞毒性，因此它不会引起明显的副作用，这说明这种化合物是皮肤病治疗剂、皮肤增白剂或褐变抑制剂的有应用前景的候选物。
附图说明
从下面结合附图的详细说明中，可以更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征以及优点，在附图中：
图1是示意图，表明从青霉菌sp KCTC 26245的代谢物分离土曲霉酮化合物的分离过程。
图2是表明本发明的土曲霉酮化合物的1H-NMR(600MHz)谱图。
图3是表明本发明的土曲霉酮化合物的HMBC(600MHz)谱图。
图4是表明本发明的土曲霉酮化合物的细胞毒性测试结果的示意图。
图5是表明本发明的土曲霉酮化合物的黑色素生物合成抑制活性的示意图。
图6是表明曲酸(一种标准物质)的黑色素生物合成抑制活性的示意图。
图7是一组照片，表明本发明的土曲霉酮化合物的黑色素生物合成抑制活性。
图8是电泳照片，表明本发明的土曲霉酮化合物对于MITF表达和ERK信号转导途径的影响。
具体实施方式
下面详细地说明本发明。
本发明提供一种含有下式1所代表的土曲霉酮化合物作为有效成分的黑色素生物合成抑制剂。
Figure A20048003691200071
式1所代表的土曲霉酮化合物具有黑色素生物合成抑制作用。如图5-图7所示，如同常规黑色素生物合成抑制剂曲酸一样，本发明的土曲霉酮化合物以剂量依赖的方式抑制黑色素生物合成，但是本发明的化合物的抑制作用是曲酸的10倍。
尽管本发明的土曲霉酮化合物不直接抑制酪氨酸酶，但是它通过加速黑色素嗜铬细胞中的ERK(胞外信号调节激酶)活化作用而特异性地抑制MITF(小眼畸形相关转录因子)表达，从而进行增白。由于与直接抑制酪氨酸酶的常规黑色素生物合成抑制剂相比具有低的细胞毒性，因而副作用更小。此外，当与常规抑制剂一起使用时，由于它们不同的作用机制，增白效果会增强。因此，本发明的化合物可以有效地用作皮肤病治疗剂、皮肤增白剂或褐变抑制剂。
本发明还提供一种从青霉菌sp分离土曲霉酮化合物的方法。
具体而言，本发明提供一种制备土曲霉酮化合物的方法，该方法包括如下步骤：
培养青霉菌sp菌株(步骤1)；
从上述步骤1得到该菌株或其培养液(步骤2)；
从上述菌株或培养液得到乙酸乙酯提取物(步骤3)；和
通过柱色谱法对上述乙酸乙酯提取物进行处理得到式1的土曲霉酮化合物(步骤4)。
在步骤1中，培养青霉菌sp菌株。
可以从土壤中分离青霉菌sp菌株。本发明优选使用青霉菌sp KCTC26245。在步骤1中，在酵母-麦芽提取物介质(YM介质)中，以140rpm的转速将青霉菌sp KCTC 26245在28℃培养8天。
在从土壤中分离出新菌株KCTC 26245后，观察菌株的黑色素生物合成抑制作用，以选择主要活性菌株。在选择的含有可被乙酸乙酯提取的高度激活的活性因子的活性菌株中，选择具有最高活性的菌株。选择的菌株称作‘青霉菌sp F020135’，并于2003年8月24日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型菌种保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC 26245)。
在步骤2中，得到菌株或其培养液。具体而言，从培养的青霉菌spKCTC 26245的丙酮提取物得到含有菌株代谢物的菌株或其培养液。
在步骤3中，从上述菌株或其培养液得到乙酸乙酯提取物。即，用乙酸乙酯提取上述菌株或菌株培养液的丙酮提取物的等份试样，然后将其减压浓缩。
在步骤4中，用柱色谱法对上述得到的乙酸乙酯提取物进行处理，以得到土曲霉酮化合物。
具体而言，步骤4包括如下两个子步骤；
使用CHCl3和甲醇的混合溶剂作为流动相，经硅胶柱色谱分离步骤3中制得的乙酸乙酯提取物，得到馏份(步骤4-1)；和
使用甲醇作为流动相，经交联葡聚糖-LH20柱色谱分离上述馏份，得到本发明的土曲霉酮化合物(步骤4-2)。
在步骤(4-1)中，CHCl3和甲醇的混合溶剂用作流动相，CHCl3与甲醇的混合比优选是20∶1-1∶1。
在步骤(4-2)中，使用甲醇作为流动相。此时，100％甲醇优选用于第一柱色谱，然后70％甲醇优选用于第二柱色谱。
下面的实施例阐明本发明的可实施的和目前优选的实施方案。
然而，可以理解，本领域所属技术人员在考虑发明内容后，可以在本发明的精神和范围内做出各种修改和改进。
<实施例1>制备本发明的土曲霉酮化合物
本发明的黑色素生物合成抑制剂可以从由土壤中分离的青霉菌sp菌株的肉汤培养基中分离出来。
具体而言，在500ml Erlenmeyer烧瓶中，以140rpm的转速将青霉菌sp F020135(保藏号：KCTC 26245)(一种从土壤中分离出的真菌菌株)在100ml酵母-麦芽提取物(YM)介质上在28℃培养8天。使用滤纸将细胞和培养液彼此分离，将细胞置于等量丙酮中，放置过夜。用滤纸过滤除去细胞，减压浓缩得到丙酮提取物。将丙酮提取物和培养液置于等量乙酸乙酯中，进一步提取。减压浓缩混合物，得到乙酸乙酯提取物。
通过硅胶柱色谱从制备的乙酸乙酯提取物得到馏份。首先，制备20：1的CHCl3和甲醇的混合溶剂，用于洗脱。逐渐提高混合溶剂中的甲醇含量，以提高极性，直到比例达到1∶1。在得到的馏份中，选择表现出黑色素生物合成抑制活性的那些馏份。
使用100％甲醇溶剂饱和的交联葡聚糖LH-20柱色谱纯化得到的馏份。此时，甲醇用作洗脱溶剂，仅收集活性馏份，以得到式1的土曲霉酮化合物(图1)。
本发明的黑色素生物合成抑制剂的物理-化学性质
研究本发明的化合物即一种黑色素生物合成抑制剂的物理-化学性质，其结果是，它被证实是白色粉末。
对该化合物进行质量分析，其结果证实该化合物的分子量是154。基于上述结果以及1H，13C NMR光谱数据分析，本发明的化合物其分子式被确定为C8H10O3。
本发明的化合物的化学结构
为表征该化合物的化学结构，进行包括1H NMR光谱和13C NMR光谱的一维NMR以及进行二维NMR(例如HMBC谱)。
将本发明的化合物溶解在氘代甲醇(CD3OD)中，研究1H NMR谱和13C NMR谱。其结果证实为一种土曲霉酮化合物，其化学结构如式1所代表的4，5-二羟基-3-丙烯基-2-环戊烯-1-酮。
经NMR数据分析和13C NMR谱研究，观察到8个碳峰：19.2(CH3)，78.0(CH)，82.5(CH)，125.0(CH)，126.1(CH)，145.0(CH)，170，和205.5ppm。经1H-NMR谱研究，还观察到其他峰：1.94ppm(3H，dd，J＝6.9，1.5Hz)，4.07ppm(1H，d，J＝2.7Hz)，4.67ppm(1H，d，J＝2.7Hz)，6.0ppm(1H，s)，6.44ppm(1H，dd，J＝15.6，1.5)，和6.81ppm(1H，aq，J＝6.9，15.6)。基于分子量分析和NMR数据分析结果，该化合物的结构最终确定为式1的土曲霉酮。
<制备实施例1>制备含有本发明的土曲霉酮化合物的霜剂
将硬脂酸、十六醇十八醇混合物、辛酸/癸酸甘油三酯、矿物油和丁二醇放入置于水浴中的烧杯中，加热至75℃成为油相。混合上述实施例1中制得的土曲霉酮化合物、水、甘油、吐温60，吐温80和氢氧化钾，生成水相，向水相中加入上述油相。反应溶液在1200-1500rpm的转速下搅拌10-20分钟，然后冷却。将溶液在室温下放置1-2天。霜剂中所含物质的含量如下表1所示(总重是100g)。
【表1】
  物质   量(g)   物质  量(g)
  土曲霉酮化合物   0.1   甘油  6.0
  硬脂酸   3.0   吐温60  2.5
  十六醇十八醇混合物   2.0   吐温80  1.0
  丁二醇   3.0   氢氧化钾  0.5
  矿物油   8.0   蒸馏水  适量
  辛酸/癸酸甘油三酯   3.0
<实验实施例1>本发明的化合物的细胞毒性测试
为研究本发明的土曲霉酮化合物的细胞毒性，用土曲霉酮化合物处理Mel-Ab细胞。
具体而言，在5％CO2、37℃条件下，用DMEM介质培养Mel-Ab黑色素细胞，该DMEM介质补充有10％胎牛血清(FBS)，100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phobol 12-myristate 13-acetate)，1nM霍乱毒素，50μg/ml链霉素和50U/ml青霉素。
以不同浓度(0，10，25，50，75，100μM)的土曲霉酮化合物处理上述培养的Mel-Ab黑色素细胞24小时，然后进一步培养。随后除去介质。用0.5ml 0.1％结晶紫使细胞染色，检查Mel-Ab黑色素细胞。通过洗涤几次除去结晶紫。使用1.0ml 95％乙醇提取细胞中残余的结晶紫。用ELISA测读仪测量提取的结晶紫的OD590，以研究细胞的活力。结果如图4所示。
如图4所示，在100μM浓度下，本发明的土曲霉酮化合物没有显示细胞毒性，表明该化合物可以安全地对人施用。
<实验实施例2>本发明化合物的黑色素生物合成抑制作用
分别用不同浓度的土曲霉酮化合物和曲酸(一种常规增白剂)(0，10，25，50，75和100μM的土曲霉酮化合物和0，1，10和100μM的曲酸)处理上述实验实施例1中培养的Mel-Ab黑色素细胞。然后，比较每一次处理所产生的黑色素生物合成，结果如图5和图6所示。
在显微镜下对比在一般培养条件培养的Mel-Ab黑色素细胞和用本发明的土曲霉酮化合物处理的Mel-Ab黑色素细胞，结果如图7所示。
如图5和图6所示，土曲霉酮化合物和曲酸剂量依赖性地抑制黑色素生物合成。然而，在10μM浓度时，土曲霉酮化合物的黑色素生物合成抑制作用是同浓度下曲酸的10倍。
如图7所示，经土曲霉酮化合物处理，在通常条件下培养的Mel-Ab黑色素细胞的深色黑色素剂量依赖性地显著下降，这表明土曲霉酮化合物可抑制Mel-Ab黑色素细胞中的黑色素生物合成。
<实验实施例3>Mel-Ab黑色素细胞中的ERK活化作用和MITF分解
为研究本发明的土曲霉酮化合物的黑色素生物合成抑制机理，用100μM土曲霉酮化合物处理上述培养的Mel-Ab黑色素细胞。在第0，2，10，30，60，180和360分钟的每一时间点，用西方点墨法(Western blot)分析ERK(胞外信号调节激酶)活化作用和MITF(小眼畸形相关转录因子)分解。结果如图8所示。
结果如图8所示，用土曲霉酮化合物处理Mel-Ab黑色素细胞2-10分钟后，ERK1和ERK2快速活化，该活化作用至少持续6小时。但是，MITF的表达随ERK活化作用下降。
根据对ERK抑制测试的近期报道，黑色素细胞中的黑色素生物合成可被ERK活化作用抑制(Englaro W等人，Inhibition of themitogen-activated protein kinase pathway triggers B16 melanoma celldifferentiation.J Biol Chem，1998，273：9966-9970)，和被ERK活化作用引起的MITF分解抑制(Wu M等人，c-Kit triggers dual phosphorylations，which couple activation and degradation of the essential melanocyte factorMi.Genes Dev 2000，14：301-312)。
综上所述，如图8所示，本发明的增白组合物中所含的土曲霉酮化合物可以活化ERK，从而调节MITF的表达，这表明该化合物通过抑制黑色素细胞中的黑色素生物合成而具有增白效果。
工业实用性
如上所述，本发明涉及一种含有土曲霉酮化合物作为有效成分的黑色素生物合成抑制剂。本发明的土曲霉酮化合物可以从国内土壤中寄居的青霉菌sp KCTC 26245真菌菌株中容易地分离出来。这种抑制剂不直接抑制酪氨酸酶，而是通过活化黑色素嗜铬细胞中的ERK来抑制MITF表达而产生增白作用。因此，这种化合物的黑色素生物合成抑制作用远大于任何其他常规的抑制剂，并且当这种化合物与其他常规抑制剂一起使用时，由于不同的作用机制，可进一步提高效果。因此，本发明的化合物可有效地用于制备皮肤病治疗剂、皮肤增白剂和褐变抑制剂。
本领域所属技术人员可以理解的是，前述说明书中所公开的构思和具体实施方案可以容易地用作改进或设计用于实现本发明目的其他实施方案的基础。本领域所属技术人员还可以理解的是，这种等同实施方案不会脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和保护范围。

Claims (6)

1.一种含有下式1所代表的土曲霉酮化合物作为有效成分的黑色素生物合成抑制剂。
<式1>
Figure A2004800369120002C1
2.如权利要求1所述的黑色素生物合成抑制剂，其特征在于，所述黑色素生物合成抑制剂用作皮肤病治疗剂。
3.如权利要求1所述的黑色素生物合成抑制剂，其特征在于，所述黑色素生物合成抑制剂用作皮肤增白剂。
4.如权利要求1所述的黑色素生物合成抑制剂，其特征在于，所述黑色素生物合成抑制剂用作褐变抑制剂。
5.一种土曲霉酮化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
培养青霉菌sp菌株KCTC 26245(步骤1)；
从上述步骤1得到所述菌株或其培养液(步骤2)；
从上述菌株或培养液得到乙酸乙酯提取物(步骤3)；和
通过柱色谱法对所述乙酸乙酯提取物进行处理得到权利要求1所述的土曲霉酮化合物(步骤4)。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4包括如下两个子步骤：
使用CHCl3和甲醇的混合溶剂作为流动相，经硅胶柱色谱分离步骤3中制得的乙酸乙酯提取物，得到馏份(步骤4-1)；和
使用甲醇作为流动相，经交联葡聚糖-LH20柱色谱分离所述馏份，得到本发明的土曲霉酮化合物(步骤4-2)。
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