CN1900308A - 耐热菌的qc－pcr快速定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐热菌的QC－PCR快速定量检测方法，是在不增加仪器配置要求的条件下，利用常规PCR仪，结合特定技术措施，进行耐热菌的QC－PCR快速定量检测。本发明的操作过程如下：耐热菌的捕集→目标菌DNA的提取→竞争模板的制备→QC－PCR扩增→扩增产物凝胶电泳检测→结果判断。利用本发明进行耐热菌检测，若采取预增菌，可在10h内实现被检样品中有或无耐热菌的快速定性检测。也可不经预增菌环节，在4－5h内实现快速定量检测，最低检测限为5×10²个目标模板/反应体系，或5×10³－5×10⁴个耐热菌/反应体系样品。此方法比传统检测所需4～5d时间大大缩短，完全可满足耐热菌及时准确检测的需要。

Description

耐热菌的QC-PCR快速定量检测方法

                        技术领域

本发明涉及一种食品有害微生物的快速检测方法，特别涉及一种可用于苹果浓缩汁中耐热菌的快速定量检测方法。

                        背景技术

苹果浓缩汁中含有的酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)，是环状脂肪酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的一员，俗称耐热菌，是一种嗜热、嗜酸的细菌，其芽孢能经受酸性条件下的巴氏杀菌过程而存活，在适宜条件下，耐热菌在果汁中大量繁殖时，不产生气体，不改变果汁的pH值，但会产生特殊气味化合物，有时还使果汁产生轻微沉淀或雾状浑浊，对果汁感官品质有很大影响。尽管耐热菌并不致病，也不产生毒素，但其引起的果汁感官性状劣变，甚至引起果汁腐败，完全破坏了果汁的食用性和商品价值。所以，国际贸易中对苹果浓缩汁中的耐热菌含量要求很严，耐热菌是苹果浓缩汁产品的必检项目，也常常成为苹果浓缩汁贸易中的技术壁垒，从而为苹果浓缩汁的生产、贸易和商检提出了新的挑战。

我国苹果总产量位居世界第一，苹果浓缩汁生产发展迅速，生产量及出口量均居世界第一，2002年我国苹果浓缩汁加工能力总和为每小时处理鲜果量1500～2000吨，产品85％以上进入国际市场，年出口量30万吨左右，出口创汇1.5亿美元。然而我国苹果浓缩汁中耐热菌含量常常严重超标，在对外贸易中因耐热菌超标引起的经贸纠纷时有发生，严重影响了我国苹果浓缩汁的出口创汇，从而给苹果产业带来巨大的经济损失。耐热菌的超标成了我国苹果浓缩汁质量安全的一个瓶颈。解决这一问题的关键之一是要有快速、特异、灵敏的检测技术手段，以便及时反馈到生产线，实施有效的控制，以保证产品质量与安全。

目前国内外对苹果浓缩汁中耐热菌检测的通用方法是细菌平皿培养记数法，检测周期为4-5天，不能及时有效控制产品安全质量。关于PCR检测方法，目前有RT-PCR检测AJC中的耐热菌，及实时PCR检测AJC中的耐热菌。但前者只能定性，不能定量，况且，由于RNA的提取过程要求苛刻，反转录又使检测结果的不确定因素增多，后者除操作过程复杂外，对仪器设备要求也很高。

                        发明内容

本发明的目的是在不增加仪器配置要求的条件下，利用常规PCR仪，结合特定技术措施，首次建立了耐热菌的QC-PCR(竞争定量PCR)快速定量检测方法。

本发明的操作步骤如下：

耐热菌的捕集→目标菌DNA的提取→竞争模板的制备→QC-PCR扩增→扩增产物凝胶电泳检测→结果判断。

                       具体实施方式

本发明的具体操作步骤如下：

a.耐热菌的捕集，

a.1取10g待检苹果浓缩汁，阳性对照样品取标准菌株培养液，以无菌水适度稀释后，经针筒式滤器过滤捕集目标菌

a.1.1滤膜直径25mm

a.1.2膜孔径0.22μm；

a.2耐热菌和其它微生物均被截留于滤膜表面；

b.目标菌DNA的提取，

b.1采用氯化苄法：取适量耐热菌培养液(或AJC检样经集菌)至1.5mL的Eppendorf离心管中，8000转离心10min，弃上清液；

b.2沉淀物加入250μL的TE，50μL SDS和150μL氯化苄，混匀，50℃温浴1h；

b.3加入150μL 3M的NaCl，冰浴15min；

b.48000转离心10min，取上清加0.6体积异丙醇，轻轻摇匀直到DNA沉淀下来；

b.512000转离心10min，弃上清；

b.6用体积分数70％的乙醇洗沉淀，12000转离心2min，2次，适当体积的TE缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用；

b.7氯化苄法提取耐热菌基因组DNA，分为5份，每反应体系5uL；

c.竞争模板的制备，

每反应体系取竞争模板5uL，分别为5×10¹～5×10⁵，

d.QC-PCR扩增，

d.1扩增引物：

引物1为5′-ACGGGTAGGCATCTACTTGT-3′，引物2为5′-AGGAGCTTTCCACTCTCCTTGT-3′，引物3为5′-AGGAGCTTTCCACTCTCCTTGTGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTT-3′：

d.225μL PCR扩增体系组成：

Taq DNA聚合酶：1.4U，   Mg²⁺浓度：2.0mmol/L，

dNTP浓度：0.2mmol/L，    引物浓度：0.2μmol/L，

添加10％的甘油作促进剂，10×Buffer(100mmol/L Tris-HCI，PH8.3，500mmol/L KCl)5μL，目标模板5μL，

竞争模板5uL，浓度为5×10¹～5×10⁵，

其余体积以无菌三蒸水补足；

d.3热启动PCR：在冰盒上将PCR反应体系各成分混匀后，当PCR循环仪温度上升至70℃以上时，再将各扩增样品置于循环仪中扩增；

d.4退火：退火温度由60℃降落到50℃；

d.5循环程序为：94℃变性4min后进入PCR循环，94℃30S、60℃降落到50℃30S、72℃30S，扩增35个循环后72℃延伸补足5min

e、扩增产物凝胶电泳检测，

e.1取10μL扩增产物及DNAMarker；

e.2加入2μL上样缓冲液(甘油-溴酚蓝溶液)，充分混匀；

e.3用精密微量移液器(10μL，100μL)上样；

e.4进行凝胶电泳

e.4.12.0％的琼脂糖凝胶

e.4.280V电压

e.4.3电泳30-40min；

e.5将电泳后的凝胶从电泳槽中取出，紫外检测仪观察电泳结果；

e.6紫外检测并拍照，一分钟凝胶成像

e.6.1F5.6

e.6.2曝光1s

e.6.3显影45-50s；

f结果判断，

f.1定量判断：以共扩增出约298bp和247bp产物为定量检测限，以已知竞争模板浓度定量；

f.2定性判断：若经集菌、预增菌，也可对样品中的耐热菌进行“有”或“无”的定性判断，即PCR扩增后有约298bp的扩增产物出现，则说明原样品中有耐热菌，结果应判定为“耐热菌阳性”，即判定结果为“有”耐热菌，否则，应判定为“耐热菌阴性”，即判定结果为“无”耐热菌。

本方法用于检测时同时要做阳性对照和阴性对照PCR扩增。在阳性对照有约298bp的扩增产物出现、同时阴性对照无扩增产物出现前提下，进行结果判断。

本发明建立的QC-PCR检测耐热菌，若采取预增菌，可在10h内实现被检样品中有(≥1CFU/mL)或无(＜1CFU/mL)耐热菌的快速定性检测。也可不经预增菌环节，在4-5h内实现快速定量检测，最低检测限为5×10²个目标模板/反应体系，或5×10³-5×10⁴个耐热菌/反应体系样品，此方法比传统的4～5d时间大大缩短。

Claims (2)

1.耐热菌的QC-PCR快速定量检测方法，其特征是操作步骤如下：

耐热菌的捕集→目标菌DNA的提取→竞争模板的制备→QC-PCR扩增→扩增产物凝胶电泳检测→结果判断。

2.根据权利要求1所述的耐热菌的QC-PCR快速定量检测方法，其特征是按以下具体步骤进行：

2.a耐热菌的捕集，

2.a.1取10g待检苹果浓缩汁，阳性对照样品取标准菌株培养液，以无菌水适度稀释后，经针筒式滤器过滤捕集目标菌

2.a.1.1滤膜直径25mm

2.a.1.2膜孔径0.22μm；

2.a.2耐热菌和其它微生物均被截留于滤膜表面；

2.b.目标菌DNA的提取，

2.b.1采用氯化苄法：取适量耐热菌培养液(或AJC检样经集菌)至1.5mL的Eppendorf离心管中，8000转离心10min，弃上清液；

2.b.2沉淀物加入250μL的TE，50μL SDS和150μL氯化苄，混匀，50℃温浴1h；

2.b.3加入150μL 3M的NaCl，冰浴15min；

2.b.48000转离心10min，取上清加0.6体积异丙醇，轻轻摇匀直到DNA沉淀下来；

2.b.512000转离心10min，弃上清；

2.b.6用体积分数70％的乙醇洗沉淀，12000转离心2min，2次，适当体积的TE缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用；

2.b.7氯化苄法提取耐热菌基因组DNA，分为5份，每反应体系5uL；

2.c.竞争模板的制备，

每反应体系取竞争模板5uL，分别为5×10¹～5×10⁵，

2.d.QC-PCR扩增，

2.d.1扩增引物：

引物1为5′-ACGGGTAGGCATCTACTTGT-3′，引物2为5′-AGGAGCTTTCCACTCTCCTTGT-3′，引物3为5′-AGGAGCTTTCCACTCTCCTTGTGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTT-3′；

2.d.225μL PCR扩增体系组成：

Taq DNA聚合酶：1.4U，Mg²⁺浓度：2.0mmol/L，

dNTP浓度：0.2mmol/L，引物浓度：0.2μmol/L，

添加10％的甘油作促进剂，10×Buffer(100mmol/L Tris-HCI，PH8.3，

500mmol/L KCl)5μL，目标模板5μL，

竞争模板5uL，浓度为5×10¹～5×10⁵，

其余体积以无菌三蒸水补足；

2.d.3热启动PCR：在冰盒上将PCR反应体系各成分混匀后，当PCR循环仪温度上升至70℃以上时，再将各扩增样品置于循环仪中扩增；

2.d.4退火：退火温度由60℃降落到50℃；

2.d.5循环程序为：94℃变性4min后进入PCR循环，94℃30S、60℃降落到50℃30S、72℃30S，扩增35个循环后72℃延伸补足5min；

2.e、扩增产物凝胶电泳检测，

2.e.1取10μL扩增产物及DNAMarker；

2.e.2加入2μL上样缓冲液(甘油-溴酚蓝溶液)，充分混匀；

2.e.3用精密微量移液器(10μL，100μL)上样；

2.e.4进行凝胶电泳

2.e.4.12.0％的琼脂糖凝胶

2.e.4.280V电压

2.e.4.3电泳30-40min；

2.e.5将电泳后的凝胶从电泳槽中取出，紫外检测仪观察电泳结果；

2.e.6紫外检测并拍照，一分钟凝胶成像

2.e.6.1F5.6

2.e.6.2曝光1s

2.e.6.3显影45-50s；

2.f结果判断，

2.f.1定量判断：以共扩增出约298bp和247bp产物为定量检测限，以已知竞争模板浓度定量；

2.f.2定性判断：若经集菌、预增菌，也可对样品中的耐热菌进行“有”或“无”的定性判断，即PCR扩增后有约298bp的扩增产物出现，则说明原样品中有耐热菌，结果应判定为“耐热菌阳性”，即判定结果为“有”耐热菌，否则，应判定为“耐热菌阴性”，即判定结果为“无”耐热菌。