CN1876842A - 一种辅助筛选高油大豆品种的方法及其专用引物 - Google Patents

一种辅助筛选高油大豆品种的方法及其专用引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辅助筛选高油大豆品种的方法及其专用引物。该辅助筛选高油大豆品种的方法，以待测大豆的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测大豆得到450－500bp的DNA片段，则该待测大豆为候选高油大豆品种。

Description

一种辅助筛选高油大豆品种的方法及其专用引物
技术领域
本发明涉及基因工程领域中一种辅助筛选高油大豆品种的方法及其专用引物。
背景技术
大豆的大部分农艺性状是由多基因或QTL控制的数量性状，在这样一个多基因体系中，每个基因对目标性状只表现微效作用，没有明显的显性，而且表现型受环境条件影响很大。因而采用传统的育种途径对这些性状进行选择有很大的难度。分子标记辅助选择为数量性状的改良提供了新的研究思路。Paterson等(Paterson A H，Landon E S，Hewitt J D，et al.Resolution of quantitativeinto Mendelian factors by using acomplete RFLP linkage map.Nature，1988，335：721-726)认为高密度分子遗传图谱的建立，使覆盖全基因组的分子标记将控制数量性状的微效多基因分解成孟德尔遗传因子，并定位到分子标记所在的染色体上，进而按照经典遗传模式进行研究。这就使得利用与QTL紧密连锁的分子标记对这些QTL进行转移以达到对这些数量性状的改良成为可能。
微卫星是以少数几个核苷酸为核心单位多次串联重复的DNA序列，是一种简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)，两侧一般是保守序列。由于它具有多态性高、共显性、容易用PCR检测和结果稳定可靠等特点，因此是一种十分理想的分子标记。
油分是大豆重要的品质性状和数量性状，利用分子标记技术寻找与高油基因连锁的分子标记一直是大豆数量性状定位研究中的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助筛选高油大豆品种的方法及其专用引物。
本发明所提供的用于辅助筛选高油大豆品种的引物，名称为Satt160，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列。
本发明所提供的辅助筛选高油大豆品种的方法，是以待测大豆的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测大豆得到450-500bp的DNA片段，则该待测大豆为候选高油大豆品种。
实验证明，以24个大豆品种品系的总DNA为模板，以用Satt160引物进行PCR扩增，扩增得到的带型与高油亲本黑农45的带型的符合率为83.33％。说明Satt160引物可用于高油大豆的辅助选择。本发明的辅助筛选高油大豆品种的方法将在高油大豆的育种中发挥重要作用，为选育高油大豆提供了一种快捷的选择方法。
附图说明
图1为部分SSR引物多态性筛选结果
图2为satt160引物在120个单株中的PCR扩增结果
图3为6个连锁群的分子遗传图谱
图4为satt160引物在24个大豆品种品系及亲本中的PCR扩增结果
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的大豆品种品系均可从商业途径获得。
实施例1、与大豆高油基因连锁的分子标记的获得
1、多态性SSR引物的筛选
以高蛋白大豆品系哈交99-5448-4为父本和高油大豆品种黑农45作为母本，配制杂交组合。杂种F1代种子温室种植。F2代种子在实验田种植，小区行长3米，株距10厘米，获得F2:3家系，共120个单株，作为供试分离群体。通过田间鉴定和室内鉴定对亲本和群体农艺性状进行考察。
参照Cregan(Cregan P B，Jarvik T.An integrated genetic linkage map ofthe soybean genome.Crop Sci，1999，35(5)：1464-1490)的“大豆公共图谱”选择SSR引物，选择的标准之一是座位分布均匀，二是基因多样性程度高。选择基本覆盖大豆全基因组的239对SSR引物(见表1)SSR引物的序列在大豆数据库SoyBase中获得，网站地址是 http：//www.soybase.com/。
表1  本实验所使用的239对SSR引物
  satt001   satt151   satt259   satt345   satt485   satt598
  satt009   satt152   satt260   satt346   satt487   satt600
  satt012   satt159   satt262   satt349   satt488   satt604
  satt020   satt160   satt263   satt352   satt489   satt605
  satt022   satt164   satt269   satt353   satt491   sat_001
  satt030   satt167   satt272   satt356   satt492   sat_003
  satt032   satt173   satt273   satt357   satt494   sat_020
  satt033   satt175   satt277   satt358   satt496   sat_033
  satt038   satt179   satt279   satt362   satt500   sat_038
  satt042   satt185   satt280   satt363   satt501   sat_039
  satt045   satt186   satt281   satt369   satt503   sat_040
  satt046   satt187   satt286   satt371   satt504   sat_043
  satt050   satt188   satt288   satt374   satt505   sat_044
  satt052   satt190   satt289   satt381   satt507   sat_064
  satt055   satt191   satt291   satt384   satt510   sat_071
  satt064   satt192   satt293   satt387   satt516   sat_074
  satt066   satt193   satt302   satt388   satt517   sat_076
  satt072   satt194   satt303   satt394   satt518   sat_084
  satt082   satt196   satt304   satt395   satt521   sat_087
  satt083   satt200   satt305   satt403   satt525   sat_088
  satt084   satt204   satt306   satt405   satt530   sat_091
  satt087   satt206   satt307   satt417   satt533   sat_093
  satt094   satt210   satt308   satt423   satt536   sat_094
  satt100   satt218   satt309   satt425   satt550   sat_105
  satt102   satt226   satt314   satt428   satt554   sat_106
  satt105   satt227   satt316   satt434   satt555   sat_108
  satt106   satt231   satt317   satt440   satt556   sat_112
  satt114   satt233   satt319   satt441   satt557   sat_114
  satt119   satt235   satt323   satt445   satt559   sat_116
  satt121   satt237   satt324   satt455   satt566   sat_117
  satt123   satt239   satt325   satt463   satt567   sat_119
  satt130   satt241   satt326   satt466   satt573   sat_121
  satt131   satt242   satt331   satt469   satt576   sat_122
  satt132   satt243   satt334   satt472   satt585   sat_128
  satt133   satt244   satt335   satt473   satt586   sat_130
  satt136   satt247   satt336   satt475   satt588   sat_131
  satt138   satt252   satt337   satt477   satt592   sat_132
  satt142   satt253   satt339   satt478   satt593   sat_133
  satt146   satt254   satt340   satt479   satt595   sat_136
  satt149   satt255   satt343   satt480   satt597
分别从供试分离群体中的120株供试单株、两个亲本植株哈交99-5448-4和黑农45上取大小约为2cm2的嫩绿叶片，置于1.5ml离心管中，向离心管中加入少量液氮，用玻璃棒或不锈钢锥子将冻干的叶片迅速捣碎(无液氮时可直接用玻璃棒将叶片捣碎)，备用。DNA提取采用SDS法(关荣霞，常汝镇，邱丽娟.用于SSR分析的大豆DNA的快速提取.大豆科学，2003，21(1)：73-74)。在上述装有备用材料的1.5ml离心管中加入400μl预热的SDS提取液(含100mmol/L Tris-HCl pH8.5，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，2％SDS)，65℃水浴30min，冷却后加入等体积酚/氯仿(1∶1)，充分混匀，静置10min，1000rpm离心5min，取上清液于另一新离心管中，加入2倍体积无水乙醇6000rpm离心2min，弃上清，用70％乙醇洗DNA沉淀一次，风干，加300μl超纯水溶解。
PCR反应在PCR扩增仪ABI-9700上进行。20ul反应体系中含有50-100ng基因组DNA模板，1×PCR缓冲液、1.25mM MgCl2、0.2mM dNTP、0.2μM SSR引物和1U Tag DNA聚合酶。PCR反应程序为：先95℃4min预变性；再95℃ 30s，47℃ 30s，72℃ 30s，35个循环。72℃ 10min后，于4℃保存。扩增产物用测序胶(6％聚丙烯酰胺，8mol/L尿素)分离，银染技术检测。检测结果表明所有251对SSR引物均扩增出稳定的产物，其中48对SSR引物具有多态性，多态性引物频率为25.1％(图1)，该48对SSR引物为(见表2)。
表2  48对在亲本间产生多态性的SSR引物
  sat_003   satt149   satt193   satt252   satt323   satt485
  satt038   satt150   satt196   satt255   satt336   satt488
  satt046   satt160   satt201   satt259   satt343   satt536
  satt064   satt160   satt204   satt260   satt362   satt551
  satt084   satt167   satt226   satt262   satt388   satt573
  satt121   satt179   satt233   satt269   satt423   satt590
  satt123   satt187   satt239   satt289   satt427   satt592
  satt131   satt191   satt247   satt308   satt440   satt594
2、多态性SSR标记的分离分析
将这48对多态性引物逐一在F2分离群体(120个单株)中进行展开，所得扩增产物经电泳后进行银染检测，统计银染的带型并记录数据。经x2检验，其中有41个SSR标记在群体中呈1∶2∶1的分离比例，占85.42％，符合共显性标记的遗传特征，该41个SSR标记中的satt160引物在120个单株中的PCR扩增结果如图2所示；有7个SSR标记呈现偏分离，5个SSR标记偏向黑农45，2个SSR标记偏向哈交00-5448-4，偏分离引物的比例为14.58％，与Keim等(Keim，P.，B.W.Diers，T.C.Olson，and R.C.Shoemaker.1990.RFLP mapping in soybean：Associationbetween marker loci and variation in quantitative traits.Genetics126：735-742.)报道的13.3％相近，但低于张德水等(张德水，董伟，惠东威，陈受宜，庄炳昌.用栽培大豆与野生大豆间的杂种F2群体构建基因组分子标记连锁图谱框架图.科学通报，1997，42(2)：1326-1330)报道的25.0％和吴晓雷等(吴晓雷，王永军，贺超英，陈受宜，盖钧镒，王学臣.大豆重要农艺性状的QTL分析.遗传学报，2001a，28(10)：947-955)报道的21.7％。各标记的杂合率在39.58％～59.90％之间，平均49.74％，基本符合F2群体的遗传特征。分离群体中标记的偏分离现象普遍存在，与已有的报道相比，本研究群体的偏分离标记比例较小，这与吴晓雷等(吴晓雷，王永军，贺超英，陈受宜，盖钧镒，王学臣.大豆重要农艺性状的QTL分析.遗传学报，2001a，28(10)：947-955)的结果相似，他们也认为从不同类型的分子标记位点的偏分离情况来看，SSR位点偏分离比例最低。
3、SSR遗传图谱的构建
利用筛选的48个多态性SSR标记，在分离群体中，对个体进行SSR座位进行等位变异统计，与父本带型相同的等位变异记录为“A”，与母本带型相同的等位变异记录为“B”，杂合带型记录为“H”，数据缺失记录为“-”。应用软件MAPMAKER/EXPV3.0(Lander等，1987)进行图谱的构建。利用“Group”命令进行标记间的连锁分析和分组(LOD＝3.0)，连锁标记数小于8个的使用“Compare”命令进行排序，标记数大于等于8个的要重复使用Ripple命令进行排序。利用QTL Cartographer1.1软件进行复合区间作图，LR值11.5(LOD值2.5)为阈值对QTL进行定位和效应估算。结果得到一张包括6个连锁群的分子遗传图谱(图3)，图谱上的SSR标记数为18个，没有连锁的SSR标记为30个，整个图谱覆盖的基因组长度为306cM，平均长度为17cM，符合QTL定位的要求。而且与公共图谱(Cregan P B，Jarvik T.An integrated genetic linkage map of the soybean genome.CropSci，1999，35(5)：1464-1490)进行比较，结果表明6个连锁群完全可以与公共图谱中的连锁群对应上。图3中，连锁群(LG)中的数字表示相邻的两个SSR标记或QTL和相邻的SSR标记之间的遗传距离。
利用Mapmaker QTL1.1进行QTL定位，在连锁群F上定位了一个控制大豆油分含量的QTL，此QTL位于satt160-satt193这个区间内，与satt160的遗传距离是26.0cM，其遗传贡献率为23.2％。
其中，Satt160的引物序列为：正向引物：TCC CAC ACA GTT TTC ATA TAA TATA，反向引物：CAT CAA AAG TTT ATA ACG TGT AGA T。
实施例2、利用satt160引物辅助筛选高油大豆品种
实验材料包括父本高蛋白大豆品系哈交99-5448-4、母本高油大豆品种黑农45和表1中的24个材料。
表3  用于分子标记辅助选择的大豆品种品系
  序号   名称   性状   序号   名称   性状
  123456789101112   黑农35黑农43黑农44黑农45黑农47黑农48Hobbit合丰25合丰42合丰43垦农4垦农18   高蛋白高蛋白高油高油高产高蛋白高油高产高油高油高油高油   131415161718192021222324   辽豆14M9M12M14呼交251呼交03-286嫩丰17K97-126中32762851867622   高油高油高油高油高油高油高油高油高油高产高产高产
上述大豆材料的种子取单粒磨成豆粉，分别置于1.5ml离心管中，4℃保存，按照实施例1的方法提取基因组DNA。
用父本高蛋白大豆品系哈交99-5448-4、母本高油大豆品种黑农45和表3中的24个材料的分子标记辅助选择，具体方法如下：利用引物satt160，按照实施例1的方法对这26个品种品系的DNA进行PCR扩增，电泳检测，结果如图4所示，表明有12个材料(黑农44、黑农45(与P2同)、Hobbit、合丰25、合丰43、垦农4、垦农18、辽豆14、M14、嫩丰17、中32、5186)具有高油亲本黑农45所扩增出来的DNA片段，检测符合率达到了50％，其中所检测到的高油品种中只有二个材料(合丰25、5186)不是高油品种品系，在检测到的高油品种中的符合率达到了83.33％，说明与satt160这个标记连锁的高油基因同时在这10份材料中能够找到，从而达到了利用分子标记进行辅助选择的目的。图4中，P1为哈交99-5448-4，P2为黑农45，1至24对应表3中的品种。
                            序列表
<160>2
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
tcccacacag ttttcatata atata                                      25
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
catcaaaagt ttataacgtg tagat                                      25

Claims (2)

1、用于辅助筛选高油大豆品种引物，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列。
2、一种辅助筛选高油大豆品种的方法，以待测大豆的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测大豆得到450-500bp的DNA片段，则该待测大豆为候选高油大豆品种。
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