CN1875690A - 一种大麦耐镉毒基因型筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大麦耐镉毒基因型筛选方法，包括选种，灭菌，育苗，移栽、预培养，镉胁迫处理，耐镉毒评价：镉处理20天，用叶绿素计测定功能叶中部叶绿素计读数；下降率(％)＝100＊(20μM Cd处理测定值－对照测定值)/对照测定值；各品种的综合得分＝叶绿素计读数下降率＊0.5+根数下降率＊0.1+根体积下降率＊0.1+株高下降率＊0.1+根干重下降率＊0.1+地上部茎叶干重下降率＊0.1。本发明建立了大麦耐镉性基因型差异筛选的有效指标与方法－叶绿计读数，并辅以其它形态与生理指标分析测定。
Description
技术领域
本发明属于农业领域中的品种筛选技术，特别涉及耐重金属镉毒害种质的筛选方法，是一种抗/耐镉大麦育种材料的快速筛选方法。
背景技术
镉(Cadmium，Cd)是对人类和动植物具有毒害作用的重金属。由于工业“三废”排放量和农药化肥用量的增多以及固体废弃物处理不善等多种原因，农田土壤中镉含量呈增加趋势，土壤-植物-食品系统中镉污染日趋严重，使农产品的安全性受到威胁。据报道，大米镉污染是日本重金属污染的主要问题；日本、韩国和我国不同地区食用禾谷类籽粒的测定分析表明，不少试样镉含量明显超过FAO/WHO推荐的最高限额(0.1μg/g)(Watanabe等，1996，SciTotal Environ 184，191-196)。据调查，我国受镉污染的耕地已超过1.33万hm2，涉及11个省25个地区。镉在土壤中不能被微生物分解，其半衰期长达20年左右，因此镉污染是一种不可逆的累积过程；同时，镉是生物迁移性较强的重金属，极易被植物吸收累积，超过一定限度不仅严重影响作物的产量和品质，而且通过食物链富集危害人体健康。人体过量摄入镉会导致蛋白尿、氨基酸尿和糖尿，影响磷、钙的吸收和代谢，增加肾骨病变的概率，并有可能致癌和致畸。1955年至上世纪70年代初，在日本富山市神通川流域曾因大米镉含量超标引起第二公害病—“骨痛病”，先后导致80多人死亡，政府与民众即使时至今日亦谈虎色变，为此政府对各种食品的镉含量制订了严格的标准要求。近年来，在浙江遂昌县和温州等地区也出现过镉中毒事件，病因与当地农田的镉污染有关，如其糙米镉含量分别为1.17和1.30μg/g，远超过FAO/WHO推荐的最高限额。总之，镉污染已对农业生产的可持续发展和人类的生存质量产生了巨大的威胁(Davis，1984，Experientia 40，117-126)。近年来，利用重金属超积累植物修复污染严重的土壤已成为全球的研究热点，且已展示出良好的发展前景，但对于大面积已受不同程度污染具有潜在毒害的农田，最经济有效的治理对策是培育与栽培耐性强而食用部位重金属积累低的品种。为此，应加强镉毒害耐性遗传资源的鉴定，为育种提供优异种质和选择指标。但有关耐镉毒基因型差异的鉴定和筛选指标迄今仍未有过报道。
植物对Cd的积累和耐性作物种间和品种间存在着明显的差异(Florijn和Beusichem，1993，Plant Soil 150，25-32；Arthur等，2000，Interna J Phytoremedi2(1)，1-21；Yin等，1995，Crop Sci 35，137-141)。Yin(1995)、Li等(1995，CropSci 35，137-141)报道，莴苣、亚麻、向日葵、硬粒小麦、花生等作物较易积累Cd；杨居荣等(1994，应用生态学报，5(2)，192-196)发现，禾谷类作物对Cd的耐性普遍高于蔬菜类。已有研究表明，大豆(Boggess等，1978，Agron J70，756-760)、玉米(Florijn和Beusichem，1993，Plant Soil 150，25-32)、莴苣(Costa和Morel，1994，J Plant Nutri 17(4)，627-637；John和Laerhoven，1976，Environ Pollut 10，163-173)、马铃薯(Mclaughlin等，1994，Aust J Agric Res45，1483-1495)、小麦(Oliver等，1995，Aust J Agric Res 46，873-886；张国平等，2000，J Plant Nutri 23(9)，1337-1350)、向日葵(Yin等，1995，Crop Sci35，137-141)、大麦(邬飞波、张国平，2002，Bull Environ Contam Toxicol69，219-227)等作物在耐镉性、镉吸收和积累上品种间存在着显著差异。但在鉴定重金属耐性的基因型(品种)差异方面，缺少可在种质筛选和育种实践上应用的相关技术。
大麦适应性强，用途广，是重要的粮食、饲料及工业原料作物，是全球各地普遍栽培的主要禾谷类作物，其质量安全与国民的健康素质休戚相关。同时，大麦是二倍体自花授粉作物，其染色体数目少，可作为其它麦类作物的模式植物，十分适合生理和遗传机理研究。叶绿素计(Minolta SPAD-502Chlorophyll Meter)由日本学者在80年代末研制，它能在田间快速、简便、无损伤地检测作物叶绿素含量(叶绿录计读数，SPAD值)，诊断氮素营养状况。近年来，在国外已成为作物栽培科学研究中一个热点，展示了良好应用前景。但有关叶绿素计读数与作物重金属胁迫耐性相关性仍缺乏研究。目前，尚未开展有关应用叶绿素计诊断作物重金属胁迫耐性的研究。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种优选耐重金属镉毒害种质的筛选方法。
本发明的大麦耐镉毒基因型筛选方法包括以下步骤：
(1)选不同类型大麦种质，灭菌，播种育苗：选取的大麦种子用重量百分比浓度为2％的Ca(Cl0)2消毒20分钟，或用体积百分比浓度为2-3％H2O2消毒10-20分钟；消毒后冲洗，于25℃黑暗发芽2-3天，萌发后在20℃、光照15小时/18℃、黑暗9小时的人工气候箱中培养7天；
(2)移栽、预培养：播种后10天，在不含镉的培养液通气预培养5天，营养液pH为6.5±0.1，7天更换新培养液；
(3)镉胁迫处理：移栽第6天，进行镉处理；
(4)耐镉毒评价：镉处理20天，用叶绿素计测定功能叶中部叶绿素计读数；
下降率(％)＝100*(20μM Cd处理测定值-对照测定值)/对照测定值；
各品种的综合得分＝叶绿素计读数下降率*0.5+根数下降率*0.1+根体积下降率*0.1+株高下降率*0.1+根干重下降率*0.1+地上部茎叶干重下降率*0.1；
根据综合分大小对各品种进行综合排序：耐镉性与综合得分绝对值呈负相关，即综合得分绝对值越大其镉胁迫后各性状受抑制越严重，因此其耐性越差；相反，综合得分绝对值越小其镉胁迫后各性状受抑制越轻，因此其耐镉性越强。
步骤(1)中消毒后用蒸馏水冲洗7-10次。
步骤(1)中黑暗发芽于人工气候箱内砂床。
步骤(2)中选长势一致麦苗移至温室内在不含镉培养液预培养5-7天。
步骤(2)中所用培养液为水培营养液，其成分(μM)的组成为：(NH4)2SO4，365.2；MgSO4，547.0；K2SO4，91.3；KNO3，183.0；Ca(NO3)2，364.9；KH2PO4，182.2；柠檬酸铁，19.5；MnCl2，2.89；ZnSO4，0.23；CuSO4，0.13；HBO3，46.90；H2MoO4，0.06。
步骤(3)中镉以CdCl2形式供给。
本发明的优点：本发明建立了大麦耐镉性基因型差异筛选的有效指标与方法--叶绿计读数，并辅以其它形态与生理指标分析测定。
本发明可广泛应用于植物耐/抗重金属种质资源筛选与评价，特别是大麦耐镉品种筛选。筛选到的优良品系，既可作为一种抗镉大麦育种材料加以直接利用，也可与优良品种进行回交转育，选育抗/耐镉性强的大麦新品种。
附图说明
图1为本发明实施例中，与对照相比，20μM Cd处理20天后SPAD值、分蘖数、根数及根体积、株高、根和地上部茎叶干重下降率的基因型差异；
图1中：“|”为LSD值(p＜O.05)(LSD：least significant difference最小显著)。
图2是本发明实施例中的镉胁迫对萎缩不知、东17生长的影响。
具体实施方式
以下通过实施例进一步对本发明进行描述：
实施例1：
选取不同类型与生长习性大麦种质(基因型)106份，各基因型精选种子150粒，重量百分比浓度为2％的Ca(ClO)2消毒20分钟后，用蒸镏水冲洗7次，于25℃人工气候箱内砂床黑暗发芽3天，萌发后20℃光照15小时/18℃黑暗9小时下生长7天，播种后10天(包括黑暗发芽3天和萌发后20℃光照15小时/18℃黑暗9小时下生长7天)，2叶期，选长势一致麦苗移至温室内不含镉培养液预培养5天，然后进行镉处理：设0(对照，CK)，20μM Cd两种处理，Cd以CdCl2形式供给。裂区设计，镉处理为主区，品种为副区，重复3次。
不含镉培养液为水培营养液，其成分(μM)的组成为：(NH4)2SO4，365.2；MgSO4，547.0；K2SO4，91.3；KNO3，183.0；Ca(NO3)2，364.9；KH2PO4，182.2；柠檬酸铁，19.5；MnCl2，2.89；ZnSO4，0.23；CuSO4，0.13；HBO3，46.90；H2MoO4，0.06。
镉处理20天后，用日本产叶绿素计测定功能叶中部叶绿素计读数(SPAD值)，每处理测10-14株，重复3次。取植株样，测定分蘖数、根数及根体积(排水法)、株高；将根和地上部分开，烘干后称重计根和地上部不同器官生物学产量。以不施镉为对照，分别计算上述各形态生理指标在20μMCd处理后下降率，并分析基因型差异。
如图1所示，结果表明，上述各指标品种间存在极显著差异，因此，这些性状可作为筛选指标。
另一方面，其中SPAD值下降率基因型差异极显著，平均比对照下降17.9％，最大下降幅度为48.2％，最小的为1.4％，其变异系数最大(CV＝49.3％)。鉴于SPAD值测定方便，且与品种的耐镉性密切相关，在综合排序时以最大权重0.5(其它各性状为0.1)，对不同基因型镉胁迫后每一性状的下降率与权重相乘，然后求和，得各品种的综合得分；根据综合分大小对各品种进行综合排序，从106个大麦基因型中分别筛选获得镉敏感及耐镉基因型各5个，其综合得分绝对值，5个耐镉性相对较强的基因型：萎缩不知，吉啤1号，戈贝纳，Wx 24，哈林屯分别为17.7，18.0，23.9，26.1，28.8；5个对镉相对较敏感基因型：尼萨夫，秀97-2，浙原88-18，东17，苏引麦2号分别为91.7，98.4，102.6，108.5.113.3。
试验实施例2：
对上述筛选获得的10个基因型进行第二次筛选验证，实验步骤如同实施例1，结果表明，耐镉性基因型差异完全一致，同时，镉胁迫后，其中SPAD值下降率，5个基因型平均，耐性基因型比敏感基因型低29.2(表1)。由此可见，以SPAD值作为评价耐镉毒害指标最佳，因为它能更好地将各品种的遗传差异体现出来，SPAD值作为耐镉性鉴定指标是行之有效的。
表1.与对照相比，20μM Cd处理20天后SPAD值、根和地上部干重下降率的基因型差异
| 基因型 | SPAD值 | 单株地上部干重(mg plant-1)Cd处理(μM) | 单株根干重(mg plant-1) | |||
| 0 | 20 | 0 | 20 | 0 | 20 | |
| 耐镉基因型Relatively tolerant genotypes | ||||||
| 萎缩不知吉啤1号戈贝纳Wx 24哈林屯 | 38.333.438.136.540.2 | 356(-7.0)[1]262(-14.1)233(-38.7)227(-37.8)272(-32.3) | 122.0157.8165.3144.0156.4 | 92.1(-24.5)109.2(-30.8)110.1(-33.4)80.0(-44.4)71.9(-54.0) | 54.170.681.266.561.7 | 43.6(-19.4)33.6(-52.4)54.3(-33.1)34.6(-48.0)26.9(-56.4) |
| 镉敏感基因型Relatively sensitive genotypes | ||||||
| 浙原88-18尼萨夫秀97-2东17苏引麦2号 | 38.427.835.239.241.0 | 253(-34.1)169(-39.2)140(-60.2)127(-67.6)104(-74.6) | 138.188.9117.7150.8162.3 | 62.5(-54.7)65.3(-26.5)62.7(-46.7)60.1(-60.1)75.0(-53.8) | 47.130.353.751.667.6 | 25.8(-45.2)18.0(-40.6)25.2(-53.1)21.0(-59.3)28.3(-58.1) |
| 5个耐镉基因型平均5个镉敏感基因型平均 | 37.336.3 | 270(-26.0)159(-55.2) | 149.1131.6 | 92.7(-37.4)65.1(-48.4) | 66.850.1 | 38.6(-41.9)23.7(-51.3) |
| LSD 0.05 | 4.4 | 46(15.8) | ns[2] | 14.6(20.2) | 18.4 | 8.1(17.5) |
[1]括号内数据为与对照相比20μM Cd处理SPAD值、根和地上部干重下降百分率(％)。
[2]ns，0.05水平不显著。
试验实施例3：
筛选获得耐镉基因型、镉敏感基因型各1个：萎缩不知、东17。对这2个基因型进行第3次镉胁迫试验，实验步骤如同实施例1。
如图2所示，结果表明，筛选获得的耐镉基因型表现强耐镉性，在20μM镉胁迫下，叶色正常，毒害症状相对较轻；镉敏感基因型对镉比较敏感，地上部镉毒害症状表现明显，表现为叶片失绿，植株矮化；株高、绿叶数和叶绿素计读数等测定值显著变小。由此同时，对上述2品种进行5μMCd胁迫处理25天，以不施镉为对照，结果5μMCd胁迫处理植株地上部及地下部干重比对照下降率，敏感品种分别为63.0％、59.8％，而抗性品种仅为32.7％和35.7％。进一步证明本发明的先进性和有效性。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1、一种大麦耐镉毒基因型筛选方法，其特征依次包括以下步骤：
(1)选大麦显著种质，灭菌，播种育苗：选取的大麦种子用重量百分比浓度为2％的Ca(ClO)2消毒20分钟，或用体积百分比浓度为2-3％H2O2消毒10-20分钟；消毒后冲洗，于25℃黑暗砂床发芽2-3天，萌发后温度控制在20℃光照15小时/18℃黑暗9小时培养7天；
(2)移栽、预培养：播种后10天，于不含镉培养液通气预培养5天，营养液pH为5.5-6.5±0.1，7天更换新培养液；
(3)镉胁迫处理：移栽第6天，进行镉处理；
(4)耐镉毒评价：镉处理20天，用叶绿素计测定功能叶中部叶绿素计读数；
下降率(％)＝100*(20μM Cd处理测定值-对照测定值)/对照测定值；
各品种的综合得分＝叶绿素计读数下降率*0.5+根数下降率*0.1+根体积下降率*0.1+株高下降率*0.1+根干重下降率*0.1+地上部茎叶干重下降率*0.1；
根据综合分大小对各品种进行综合排序：耐镉性与综合得分绝对值呈负相关，即综合得分绝对值越大其镉胁迫后各性状受抑制越严重，因此其耐性越差；相反，综合得分绝对值越小其镉胁迫后各性状受抑制越轻，因此其耐镉性越强。
2、根据权利要求1所述的大麦耐镉毒基因型筛选方法，其特征在于：步骤(1)中消毒后用蒸馏水冲洗7-10次。
3、根据权利要求1所述的大麦耐镉毒基因型筛选方法，其特征在于：步骤(1)中黑暗发芽于人工气候箱内砂床。
4、根据权利要求1所述的大麦耐镉毒基因型筛选方法，其特征在于：步骤(2)中选长势一致麦苗移至温室内不含镉培养液预培养5-7天。
5、根据权利要求1所述的大麦耐镉毒基因型筛选方法，其特征在于：步骤(2)中所用培养液为水培营养液，其成分(μM)的组成为：(NH4)2SO4，365.2；MgSO4，547.0；K2SO4，91.3；KNO3，183.0；Ca(NO3)2，364.9；KH2PO4，182.2；柠檬酸铁，19.5；MnCl2，2.89；ZnSO4，0.23；CuSO4，0.13；HBO3，46.90；H2MoO4，0.06。
6、根据权利要求1所述的大麦耐镉毒基因型筛选方法，其特征在于：步骤(3)中镉以CdCl2形式供给。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090722 Termination date: 20100630 |