CN1829914A - 用于分析细胞的光学生物盘和射流回路及其相关方法 - Google Patents

用于分析细胞的光学生物盘和射流回路及其相关方法 Download PDF

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CN1829914A CNA028272633A CN02827263A CN1829914A CN 1829914 A CN1829914 A CN 1829914A CN A028272633 A CNA028272633 A CN A028272633A CN 02827263 A CN02827263 A CN 02827263A CN 1829914 A CN1829914 A CN 1829914A
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拉蒙西托·马格潘塔伊·瓦伦西亚
陈一发
苏珊·纽卡姆·赫尔特
约瑟夫·罗比·伊里甘·乌尔西亚
高利·普亚帕利·塞尔万
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Nagaoka Co Ltd
Nagaoka KK
Burstein Technologies Inc
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Burstein Technologies Inc
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Abstract

本发明涉及用于临床诊断的光学生物盘、方法和光学生物盘驱动器。本发明进一步还涉及测定生物样品中特定类型的血细胞的量的方法，该方法包括：在盘上进行样品的制备和处理；将预处理的样品提供到捕获区上；将未结合到捕获区上的部分样品去除；以及对所结合的细胞进行计数。本发明还公开了用于光学生物盘中的簇标记标志物测定的处理血样的射流回路。

Description

用于分析细胞的光学生物盘和射流回路及其相关方法
相关申请的交叉引用
本申请是2001年11月20日提交的序列号为09/988,728的美国专利申请的部分继续。
本申请还要求以下美国临时申请的优先权：2002年1月17日提交、序列号为60/349,392；2002年1月18日提交、序列号为60/349,449；2002年2月5日提交、序列号为60/355,644；2002年2月19日提交、序列号为60/358,479；以及2002年5月22日提交、序列号为60/382,327。这些申请的全部内容以引用方式结合在本文中。
发明背景
1、技术领域
本发明通常涉及生物检定和诊断检定，尤其是涉及在光学生物盘上进行的这些检定。更具体地说，但不局限于下文参照最佳实施方式所描述的具体实施例，本发明进一步涉及细胞检定和相关的光学生物盘系统中所用的样品制备方法。
有利的是，本发明可以与以下共同转让和共同待审的专利申请中所公开的任何盘、检定和系统结合使用：2001年7月3日提交的序列号为60/302,757的题为“用于选择并检测包括辅助性-诱导性/抑制性-细胞毒性细胞的淋巴细胞的临床诊断光学生物盘及相关方法”(ClinicalDiagnostic Optical Bio-Disc And Related Methods For Selection AndDetection Of Lymphocytes Including Helper-Inducer/Suppressor-Cytotoxic Cells)的美国临时申请；2001年7月17日提交的序列号为60/306,035的题为“包括免疫表型分型的细胞分离和分型的定量及定性方法”(Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation andTyping Including Immunophenotyping)的美国临时申请；2001年7月17日提交的序列号为60/305,993的题为“免疫表型分型的捕获层组件和光学生物盘”(Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs forImmunophenotyping)的美国临时申请；2001年7月19日提交的序列号为60/306,592的题为“血细胞、血载寄生虫和病原体以及其它生物物质的成像方法，包括相关的光学生物盘和驱动组件”(Methods forImaging Blood Cells，Blood-borne Parasites and Pathogens，and OtherBiological Matter Including Related Optical Bio-Discs and DriveAssemblies)的美国临时申请；2001年7月23日提交的序列号为60/307,263的题为“包括免疫表型分型的细胞分离和分型的定量及定性方法”(Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation andTyping Including Immunophenotyping)的美国临时申请；2002年8月30日提交的序列号为10/233,322的题为“用于包括相关的光学分析盘和方法的细胞检定的捕获层组件”(Capture Layer Assemblies forCellular Assays Including Related Optical Analysis Discs and Methods)的美国专利申请；以及2002年9月6日提交的序列号为10/236,857的题为“利用光学生物盘系统基于细胞核形态学的白血细胞类型的鉴定和定量”(Nuclear Morphology Based Identification and Quantification ofWhite Blood Cell Types Using Optical Bio-Disc Systems)的美国专利申请。所有这些申请通过引用结合在本文中。
2.背景技术
血细胞计数被用在诊断、治疗和后续病人跟踪过程中以确定病人的健康状况。全血细胞计数(CBC)是一组包括血红蛋白、血球容量、平均血球血红蛋白(mean corpuscular hemoglobin)、平均血球血红蛋白浓度、平均血球体积(mean corpuscular volume)、血小板计数和白细胞计数的检验。血细胞计数是每立方毫米全血的红细胞和白细胞的计数。
白细胞计数(WBC，白细胞)是标准血样中的白细胞总数。在正常健康人中，通常WBC计数为每微升(μl)4000至10800个细胞。诸如锻炼、压力和疾病等因素可以影响该数值。高WBC可能指示感染、白血病或者组织损伤。当WBC数低于每微升1000个细胞时感染风险增大。
对于收集从白细胞计数本身可获得的信息之外的信息而言，白细胞分类检验(leukocyte differential testing)是必不可少的。白细胞分类计数用于评估新可疑感染或发烧(即使CBC正常)、与异常情况相关的可疑疾病，异常情况包括异常白细胞数、可疑白血病，和其它例如嗜曙红细胞增多、单核细胞增多或嗜碱性细胞增多的异常情况。可以在严重的白细胞减少症(例如药物治疗的并发症)存在的情况下实施白细胞或白细胞分类的重复检验。在治疗过程中，例如在化学疗法或放射疗法过程中，对于确定治疗除癌细胞之外是否还消耗健康血细胞而言，血细胞计数是非常重要的。由于化学疗法影响血细胞的生成，因此检查血液中的各种细胞的数量是很重要的。
可以通过计算机化细胞计数设备来确定分类白细胞数。这种设备确定五种主要的白细胞的总数和百分比。在正常个体中，主要有中性白细胞(50-60％)，其次是淋巴细胞(20-40％)，然后是单核细胞(2-9％)，还有少量嗜伊红性粒细胞(1-4％)和嗜碱性粒细胞(0.5-2％)。
在淋巴细胞的分类中还有细胞亚类。举例说来，淋巴细胞可以大致分为分别负责细胞促成性免疫(Cell-mediated immunity)和体液免疫的T细胞(胸腺衍生的淋巴细胞)(thymus-derived lymphocytes)和B细胞(囊等价淋巴细胞)(bursal-equivalent lymphocytes)。虽然形态特征已经用于分类白细胞，但是已经证明，形态本身不足以区分淋巴细胞亚类的许多功能。为了区分具有多种功能的淋巴细胞，已经开发出多种技术，包括通过红细胞形成玫瑰花结(resetting)的分析、免疫荧光显微镜法、酶组织化学以及最近的针对独一的细胞表面标志物的单克隆抗体。
通过两种主要细胞表面抗原(例如CD4和CD8)之一的存在而通常进一步区分T细胞。CD4+型细胞被称作辅助性T细胞并且涉及抗体促成性免疫。这些T细胞结合到由B细胞递呈的抗原上，并导致分泌针对抗原材料的抗体的克隆浆细胞的产生。CD4+T细胞对细胞促成性免疫而言也是必不可少的。应该理解，CD4+T细胞结合到由例如巨噬细胞和树状细胞之类的抗原递呈细胞(APCs)所递呈的抗原上，并释放吸引其它免疫系统至该区域的淋巴细胞活素。结果是，导致炎症的产生，以及试图隔开并破坏抗原材料的细胞及分子的集聚。
CD8+型T细胞被称作细胞毒性或杀伤性T细胞。这种T细胞分泌破坏其所结合的细胞的分子。这对抵抗病毒感染很重要，因为CD8+T细胞在被感染细胞释放能够感染其它细胞的新一组病毒之前破坏被感染细胞。
人免疫缺陷病毒(HIV)是一种对CD4+T细胞具有高亲和力的反向病毒，并且因此CD4+T细胞是该病毒的有效目标。获得性免疫缺陷综合症(AIDS)提供CD4+T细胞在免疫中的重要性的清晰不幸示例。人免疫缺陷病毒(HIV)结合到CD4+T分子上并进攻和感染CD4+T细胞。随着该病的进展，CD4+T细胞的数量下降至它的约每微升1000的正常范围以下。一种解释可以是，病人的CD8+T细胞不停破坏被感染的CD4+细胞的效果。或者是，可诱导未感染的CD4+细胞，以定型自杀(细胞凋亡)。
当CD4+T细胞的数目下降到400/μl之下时，病人固定免疫应答的能力就显著减小。不仅仅是病人变得过于易受来自攻击机体的病原体的感染，这些病原体包括微生物，尤其是通常栖息在我们的组织中而又不伤害我们的病毒和真菌。最终病人死于机会致病菌的感染例如念珠菌病、巨细胞病毒、单纯性疱疹病毒、卡氏肺囊虫、肺炎、弓形体病、结核病及其它疾病。
除了CD4和CD8，还有许多可以用于鉴定淋巴细胞亚类的其它细胞表面抗原(例如，CD3、CD16、CD19、CD45和CD56)。通过抗体技术检测这些细胞表面抗原的能力已经为诊断病理学添加了新的维度，并且各种技术可用于研究血淋巴组织(hematolymphoid)紊乱症(例如，AIDS、白血病和淋巴瘤)的免疫表型。例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)之类的传统微免疫测定法(microimmunoassay)分别利用同位素、酶或荧光物质来检测相应的与之发生特异性反应的抗体或抗原的存在或是不存在。
标准血样中的血小板数通常为每微升(μl)133,000至333,000个血小板。血小板数过量被称作血小板增多。血小板数在正常血小板数之上可以归因于反应性反应或骨髓故障。反应性反应通常是由出血、感染、瘤形成和骨髓增生异常(myeloproliferative disorder)导致的。骨髓故障通常涉及被称作全血细胞减少症(pancytopenia)的血细胞的损失。另一方面，减少的血小板数归因于免疫血小板减少症。如果血小板数低于30,000，就发生血小板减少症，该病导致异常出血。血小板数低于5000则认为危及生命。
利用许多治疗方法来治疗AIDS，包括蛋白酶抑制剂、反转录酶抑制剂、整合酶抑制剂及其它方法。为了评估免疫损害病病人的免疫健康状况以及评估治疗效果，对CD4+和CD8+T淋巴细胞数及其(CD4+/CD8+T淋巴细胞)之比率的估算是致关紧要的。
利用抗体技术检测细胞相关的抗原的能力已经扩大了用于诊断病原体的技术范围。各种技术对血管淋巴管紊乱症的免疫表型研究都是有用的。象放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)之类的常规微免疫测定法利用同位素、酶或荧光物质，以分别检测与其发生特异性反应的相应抗体或抗原。然而，上述方法具有局限性和缺陷。RIA要求专门的场所、预防措施、有限的半衰期和多种其它因素。用酶或荧光物质作为标记物的方法由于需要通过测定颜色或发光来进行测定，因此要求灵敏、精密的仪器来检测比色或荧光反应，除此之外，还需要几个洗涤步骤，用以去除过量、未结合、未反应的试剂。而且，上述方法在用于检测细胞，尤其是淋巴细胞和癌细胞以及类似物种时，需要对技术进行改进，以便进行高效的制备、检测和分析。
围绕特异于细胞表面抗原的荧光抗体的用途所开发的一种工具是，流式细胞计量术的荧光激活细胞分类(FACS)技术。这是一种非常可靠、快速和灵敏的方法。流式细胞计量分析是对全血样品实施的，其中需要对全血样品进行RBC溶解，以留下完整无损的白细胞。然后用荧光标记物来标记感兴趣的白细胞，以便用FACS扫描仪进行鉴定。对用于流式细胞计量分析的样品的首要要求是，样品是纳米分散悬浮液形式，并且用荧光标记物来标记所需的细胞。这是价格非常高的检验，并且整个系统需要由受过训练的技术人员在临床分析实验室中来操纵，而且还需要昂贵的仪器。流式细胞计量术的另一个缺陷是，细胞一旦被分析，就对重复分析或其它调查(诸如稀有事件细胞的显微镜检查)不再有用。
表面标志物分析是非常有用的实验室工具，尤其是在研究白血病、淋巴瘤和免疫缺陷疾病方面已经非常有用。基于抗体的微阵列技术当然代表着本领域的技术水平，特别是在临床诊断方面，可用于鉴定样品中的特异性抗原。大多数的诊断检验都要求仅仅测定有限板的分析物(例如在癌症、白血病、淋巴瘤、甲状腺病等情形中)。因此，对仅需要非常少量血样的最小化技术、在时间和实验室人员成本上的节省、又能在一个检验中同时测定所有临床相关参数的需要，由于其成本的经济性、劳力的有效性和简便性，而得到医院实验室和关键设施的极大关注。
我们已经开发出一种简单、廉价的系统，用于以常规方法的一部分时间和成本，来分析特异性细胞表面抗原和进行数据分析。该系统采用专门制备的光学生物盘、相关的检测组件、以及支持软件和处理方法。
与用于FACS扫描仪的规程类似，血样在进行分析之前需要处理。红血球(红细胞)由于其数量繁多而能够干扰白血球(白细胞)的特异性结合。因此，在用FACS扫描仪分析样品之前，血样要与破坏红细胞(不包括白细胞)的RBC溶解缓冲剂一起温育。
在2001年7月27日提交的序列号为60/308,197的共同转让的美国临时申请中，我们描述了一种方法，该方法的开发和设计是为了通过利用密度梯度法从全血中分离单核细胞，而能够在光学生物盘上实施辅助/诱导-抑制/细胞毒性测定。在本发明中，我们描述了一种微流室或回路，其可用来在盘上实施溶解过程，并将上面留下的白血球材料压入已经用辅助/诱导-抑制/细胞毒性测定的特异性捕获抗体分层的测定或分析室。该具体的室设计可包括两个互连室。其中一个室含有溶解缓冲剂。将待分析的血样注入该“溶解”室。温育15分钟以使溶解完成。一旦溶解完成，就使盘自旋，以便使剩余白细胞穿过已经用特异性捕获抗体分层的分析室。在化学物与细胞样品温育30分钟之后，用激光对盘进行读取和成像，并用适当的软件对图像进行分析。
发明内容
本发明通常涉及临床诊断检定及相关的光学生物盘。更具体地说，但不局限于下文参照最佳实施方式所描述的具体实施例，本发明涉及细胞分型，包括CD(簇标记)标志物测定。本发明的CD标志物测定是用于测定样品中的CD4+和CD8+T淋巴细胞数量的细胞捕获测定。本发明还涉及利用全血和相关的光学生物盘进行的RBC溶解、细胞分离以及辅助性/诱导性-抑制性/细胞毒性T淋巴细胞的评估。
本发明提供了以一种即时、成本有效和技术相关的方式对例如血液、脑脊髓液、唾液、尿液、结肠液(colonocytes)或其它生物源之类的试样进行分析的改进的方法和设备。具体说来，需要更容易、更有效的方式来定量各种类型的白细胞、或其它细胞类型、寄生虫、病原体和生物物质。本发明响应这种需求。此外，本发明涉及血细胞成像，进行白细胞分类计数，以及相关的处理方法和软件。
该检验是基于盘上特定部位的局部细胞捕获原理。通过局部施加基于针对特定淋巴细胞(白血球)抗原的单克隆或多克隆抗体，而产生几个特异性细胞捕获区。
在包括具有附着到固相上的特异性抗体的流动室的生物盘内实施测定。CD标志物测定或辅助性-诱导性/抑制性-细胞毒性检验测定靶细胞的绝对数，靶细胞包括由捕获或靶区中的特异性抗体所捕获的CD4+、CD8+、CD3+和CD45+淋巴细胞。
利用光学盘驱动组件来旋转盘，读取和处理盘上贮存的任何编码信息，并分析生物盘流动室中的细胞捕获区。光学生物盘驱动器配有用于旋转生物盘的电机、用于控制盘旋转速率的控制器、用于处理来自盘的返回信号的处理器、以及用于分析所处理的信号的分析仪。旋转速率是可变的，并且可从旋转速度和时间上对其进行紧密控制。在流动室和靶区的检验材料被驱动器的读取束讯问以及用分析仪分析之前或之后，还可利用光学盘驱动器将信息书写到生物盘上。生物盘可包括编码信息，该信息用于控制盘的旋转、提供针对待实施的免疫表型分型测定的类型的处理信息、并将结果显示在与驱动器相联的监视器上。
一方面，本发明提供了结合光学分析盘进行测定以检测并计数细胞的方法和设备。另一方面，本发明提供了结合光学分析盘进行测定以检测淋巴细胞的方法和设备。
按照本发明的另一方面，提供了一种方法，该方法包括在盘表面之中或之上提供试样，该盘具有利用光学读取器可读取的编码信息。该信息可以用来控制读取器相对于盘的扫描。
将盘载入光学读取器，并且使来自辐射源的电磁辐射的入射束指向该盘。通过绕中心轴旋转盘并通过沿该轴线的径向移动入射束，而使该电磁辐射束扫描过该盘。检测并分析被传送通过盘或从盘反射的一束电磁辐射，以提取该试样的信息特征。
本发明的实施例还包括带有彼此隔开的基底和盖以形成室的盘。一种材料试样，例如带有细胞的血液，被提供在该室中。当旋转该盘时，试样就移动通过捕获区。该捕获区包括带有抗体或结合到抗原上的其它特异性结合配对的捕获层，抗原是感兴趣的细胞类型上的细胞表面标志物，例如CD4和CD8。优选的是，利用一种检验来使血样中的CD4和CD8以及其它抗原成像。按照本发明的另一方面，提供了一种盘读取器，用以引导光线至捕获区所位于的观察窗，并检测被传送或反射的光线以识别并计数被捕获的细胞。这些CD4和CD8计数，以及它们之间的比率对监测例如AIDS之类的状况很有用。
将试样优选地提供给盘内的室。单个室最好具有多个捕获区，每个捕获区可以具有一种或多种抗体。在一个实施例中，一个通道具有多个捕获区，各捕获区带有不同类型的抗体，并且可以具有起对照区作用的捕获区。使这些捕获区沿盘的一个或更多个半径排列。检测方法包括检测特征中的转变，或使观察窗成像并利用图像识别软件来计数被捕获的细胞。计数可以是直接的，例如计数所需的细胞；或者是间接的，例如计数所需的和非所需的细胞集合，然后计数非所需的细胞，再减去，以获得所需细胞的计数。捕获区可以具有一层或多层抗体。
当将细胞试样提供给盘时，可在一个或多个阶段来旋转盘，以移动细胞至捕获区，然后使未结合的细胞运动离开捕获区。可以通过其它方式(例如，利用被用于检测的光源温育或加热)来处理该试样。可以利用微流技术来添加染色剂或试样的盘上处理所需的其它液体。该处理最好被指定在信息存储区中的盘上的编码信息中。可以有利地采用存储信息来使驱动器和读取器以所需速度旋转所需时间，并带有其它中间步骤，例如温育。
微技术在临床诊断中特别有用，以鉴定细胞类型、寄生虫、病原体和其它生物物质。本发明利用微技术进行光学生物盘上的全血中的分类白细胞计数。此外，本发明涉及血细胞成像，进行分类白细胞计数，以及相关的处理方法和软件。
按照本发明的另一检验或检定可以利用至少两种方式来实施。第一种方法是基于位于光学生物盘上的特定通道中的血细胞的光学成像原理。将大约5至20微升的全血注入盘上的专门设计的通道中。利用鉴定各种白细胞亚类并产生白细胞分类计数的细胞识别软件，来分析图像。第二种方法是基于利用针对特定细胞的细胞特异性抗体的特定细胞捕获。举例说来，在这个具体实施例中，抗体是针对淋巴细胞(CD2、CD19)、单核细胞(CD14)和嗜伊红性粒细胞(CD15)的。正如以上所述的相关测定那样，这些白细胞亚类特异性抗体被装配/固定到包括流动室的生物盘内的固相表面上。
利用一种生物盘驱动组件来旋转生物盘、读取并处理存储在盘上的任何编码信息，并分析生物盘的流动室中的细胞捕获区。生物盘驱动器拥有旋转生物盘的电机、控制盘的旋转速率的控制器、处理盘的返回信号的处理器，和分析所处理的信号的分析仪。该旋转速率可变并且可以从速度、旋转时间和旋转方向上进行紧密控制。在流动室和目标区中的试验材料被驱动器的读光束询问以及被分析仪分析之前、之中或之后，也可以利用生物盘写信息至生物盘上。生物盘可以包括编码信息，该信息用于控制盘的旋转、提供针对待实施的免疫分型测定的类型的处理信息、并在与生物驱动器相联的监视器上显示结果。
通常分类细胞计数规程(protocols)，尤其是分类白细胞计数规程是采用CD、CD-R或DVD格式、这些格式的修改版，及其可替换的格式来开发的。驱动器的读或询问光束检测分析试样中的各种细胞并产生可以用分类细胞计数软件来分析的图像。
显微镜法或复杂细胞计数对执行这些乏味和费力的细胞计数测定而言是必不可少的。本发明的方法使用光学生物盘和相关组件。产生在分析室中的游离的各种白细胞亚类或被特异性抗体方法捕获的白细胞亚类的光学图像，并利用细胞识别软件程序分析图像，这些程序通过细胞的光散射性质来鉴定血液或其它体液中的各种细胞成分。在入射束与感兴趣试样之间的光/物质相互作用之后，检测返回光线。处理所检测的回光信号，以提供可辨别的信号签名或数字ID。虽然现有技术的方法通常需要准备例如细胞染色、RBC消除、或其它费力的规程，但是本方法的实施例不需要试样的任何预处理过程。这些方法包括采用顶部检测器、底部检测器、事件计数器或细胞计数器的CD型或光学盘读取器中的显微分析或细胞检测。
以下段落提供了按照涉及生物盘制造的本发明的某些具体优选实施例的基本方法步骤的总结。
盘制备：利用气枪清洁金反射盘或透射盘，以去除任何灰尘颗粒。利用旋涂装置，用异丙醇冲洗该盘两次。将2％的聚苯乙烯旋涂在盘上，以给定非常厚的全涂层。
化学沉积：一种实施方式包括三步沉积规程：温育：抗生蛋白链菌素，温育30分钟；生物素化的第一抗体温育60分钟；以及第二捕获抗体温育30分钟。所有这些步骤都是在潮湿室中于室温下利用沉积之间的严格冲洗和干燥步骤来完成的。
简言之，将1μl的1mg/ml抗生蛋白链菌素磷酸盐缓冲盐水涂在各窗上并温育30分钟。将过量的抗生蛋白链菌素用蒸馏水冲洗掉并将盘烘干。通过组合等量的生物素化lgG(PBS中125μg/ml)和醛活化的葡聚糖(200μg/ml)，来制备生物素化lgG-葡聚糖复合物。在各捕获窗口中将葡聚糖-醛生物素化lgG复合物涂在抗生蛋白链菌素上，并在冰箱中温育60分钟或整夜。冲洗掉过量的试剂并将盘自旋。通过将捕获抗体涂在生物盘槽中的指定位置上，而产生特定的条码捕获图。对分类计数而言，举例说来，将抗中性白细胞(CD128或其它)、抗淋巴细胞(CD2、CD19、CD56及其它)、抗嗜伊红性粒细胞(CD15)、抗单核细胞(CD14)、抗嗜碱性粒细胞(CD63)和抗血小板(CD32和CD151)涂在各槽的指定位置处。下表1列出捕获层组件的捕获图案的变型示例。在冰箱中温育30分钟或整夜。利用25μm、50μm、或100μm(50μm通道需要两倍体积的25μm室所需的试样)直线、U形或其它通道格式和透明盖盘(与顶部检测器一起使用)或反射盖盘(与底部检测器一起使用)来装配盘。
                                             表1
                                       捕获层组件及变型
 窗口   1   2   3   4   5   6
 第一层(活性层)   聚苯乙烯   聚苯乙烯   聚苯乙烯   聚苯乙烯   聚苯乙烯   聚苯乙烯
 第二层   抗生蛋白链菌素   抗生蛋白链菌素   抗生蛋白链菌素   抗生蛋白链菌素   抗生蛋白链菌素
 继发抗体   B抗小鼠lgG+DCHO   B抗小鼠lgG+DCHO   B抗小鼠lgG+DCHO   B抗小鼠lgG+DCHO   B抗小鼠lgG+DCHO
 原发抗体   参比点(referenceDot)   淋巴细胞特异性抗体   中性白细胞特异性抗体   嗜伊红性粒细胞特异性抗体   嗜碱性粒细胞特异性抗体   单核细胞特异性抗体
盘泄漏检查和阻断不需要细胞的非特异性结合：由于分析的是血液，一种生物危险性材料，因此作为本发明的质量控制制造方面的一部分，要对盘进行泄漏检查，以确保在盘与原位试样自旋过程中没有室泄漏发生。最好用StabilGuard(一种商业上购买的阻断剂)填充各通道，并阻断一小时。将盘以5000rpm旋转5分钟并检查泄漏和盘的稳定性。在检查泄漏之后，将盘放在真空室中24小时。真空处理之后，将用PBS缓冲剂填充的室或空室放置在真空袋中并储存到冰箱中直至使用。
从全血中分离白细胞层：通过以2800rpm将离心管中的去纤维蛋白静脉血离心25分钟，来制备白细胞层。用细吸管小心去除上清血浆。然后用吸管吸取下面的含有白细胞和血小板的白细胞层。无需离心而从血液中获得白细胞层的另一方法是，用例如凝血因子、葡聚糖、阿拉伯树胶、水溶性聚蔗糖(Ficoll)或甲基纤维素之类的沉淀增强剂使血液沉淀。Boyum氏(Boyum’S)试剂(甲基纤维素和甲泛影钠)特别适合用于获得无任何红细胞污染的白细胞制备。另外，淋巴细胞可以通过正或负选择、或溶解方法从全血中分离出来。
盘上检定--基础技术的描述：分类白细胞计数盘检验的一个优选实施例包括三个独立部件：(1)包括化学物质的基盘，(2)通道层，和(3)盖盘。
将最好在PBS中稀释的白细胞层注入盘室，室的入口和出口用胶带密封，并且盘最好在室温下温育所需的时间。在其他相关的共同转让的采用生物盘的细胞测定中，将全血直接加入到生物盘上的射流回路中，并对全血样品进行分析。然而，在本发明中，由于以下提到的原因而优选地采用纯化的T淋巴细胞样品。对于纯化的样品和全血方法而言，用带有顶部和底部检测器的光学驱动器的标准780nm激光扫描盘上的给定区域(例如，面积为1平方毫米)。例如，由专利受让人开发并公开在以下文献中的相关细胞识别软件，从最好等于1平方毫米的捕获图像中，自动给出分类计数：2002年3月12日提交的题为“包括白细胞的分类细胞计数方法和执行该分类细胞计数的光学生物盘的使用”的第60/363,949号美国临时申请，和2002年8月21日提交的题为“包括执行分类细胞计数的相关设备和软件的分类细胞计数方法”的第60/404,921号美国临时专利。对第二种方法而言，举例说来，用标准780nm激光扫描盘，以使包括淋巴细胞、中性白细胞、嗜碱性粒细胞、嗜伊红性粒细胞、单核细胞和血小板的捕获区成像。由专利受让人开发的细胞识别软件自动执行以下程序：(a)离心盘，以旋转分离过量的未结合细胞，(b)使特定区域和特定捕获区成像，和(c)数据处理，包括对每个捕获区中的特异性捕获的细胞进行计数，并得出不同白细胞亚类的数目。
在处理步骤中，识别软件贯穿每个捕获区来读数并对所遇到的细胞进行标记。在处理每个捕获区的数据之后，该软件显示每微升体积血液中的淋巴细胞、中性白细胞、嗜碱性粒细胞、嗜伊红性粒细胞、单核细胞和血小板的数量。整个过程从将盘插入光学驱动器到显示感兴趣的结果为止需要大约10-15分钟。
与本发明有关的相关公开内容还公布在以下文献中：2001年7月23日提交的序列号为60/307,262的题为“免疫表型分型的捕获层组件和光学生物盘”(Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discsfor Immunophenotyping)的美国临时申请；2001年7月23日提交的序列号为60/307,264的题为“血细胞、血载寄生虫和病原体以及其它生物物质的成像方法，包括相关的光学生物盘和驱动组件”(Methods forImaging Blood Cells Blood-Borne Parasites and Pathogens，and OtherBiological Matter Including Related Optical Bio-Discs and DriveAssemblies)的美国临时申请；2001年7月23日提交的序列号为60/307,562的题为“包括用于光学成像并定量评价包括淋巴细胞的血细胞的射流回路的光学分析盘”(Optical Analysis Discs IncludingFluidic Circuits for Optical Imaging and Quantitative Evaluation ofBlood Cells Including Lymphocytes)的美国临时申请；和2001年7月24日提交的序列号为60/307,487的题为“包括白细胞的分类细胞计数的方法和执行该方法的光学生物盘的使用”(Methods forDifferential Cell Counts Including Leukocytes and Use of OpticalBio-Disc for Performing Same)的美国临时申请，所有这些申请通过引用结合在本文中。
以下段落提供了按照本发明的某些具体优选实施例的盘说明的要素概述。
跟踪设计：在本发明的一个优选实施例中，盘是一种涂有300nm金的前摆动部件(forward Wobble Set)FDL21：13707或FDL21：1270。在此反射盘上，通过光刻技术蚀刻出尺寸为2×1mm的椭圆形数据窗口。利用“U”形通道产生高度为25μm的室。大约需要7μl的试样来填充包括入口和出口的整个室。优选的是可以使用4窗口/4通道格式。但是在透射盘上，没有蚀刻数据窗口，并且整个盘都可用。
粘合剂和结合：在一个优选实施例中，包括本发明的“U”形射流回路的粘合剂或通道层由Fraylock粘合剂DBL 201 Rev C 3M94661制成。或者，利用直通道产生这些室。
盖盘：在本发明的盘组件的一个具体实施例中，采用全反射性的具有48个直径为0.040英寸、位于半径为26mm等距离处的试样入口的透明盘(clear disc)。
数据捕获和处理：利用专利受让人的细胞识别软件，以优选的X4速度和2.67MHz的取样速率、用该软件扫描并读取数据盘。
软件：本发明还包括处理方法和相关的细胞识别及成像软件。该软件用于执行并显示细胞计数和分类细胞计数。本发明的软件可以存储在光学生物盘上、光学盘驱动读取设备中、或仅被安全服务器的光学读取器访问。可以在计算网络中实施该服务器，例如局域网(LAN)、广域网(WAN)、或通过互联网在指定条件下实施。这些分布方法公开在共同受让的以下申请中：2000年11月8日提交的序列号为60/246,824的题为“分析生物样品和利用专门制备的生物光学盘、光学盘驱动器和互联网连接处理相关医疗信息的交互方法和系统”(Interactive Method and System for Analyzing Biological Samplesand Processing Related Medical Information Using SpeciallyPrepared Bio-Optical Disc，Optical Disk Drive，and InterentConnections)的美国临时申请，和2001年11月7日提交的序列号为09/986,078的题为“分析生物样品并处理相关信息的交互系统及其使用”(Interactive System for Analyzing Biological Samples andProcessing Related Information and the Use Thereof)的相关美国专利申请，这两件申请通过引用结合在本文中。
材料：用于实施本文所公开的不同优选实施例的材料包括前摆动金属化光致抗蚀剂盘、透射性金属化盘、吸管和喷嘴(tip)、旋涂器、离心机、转位式转子(swing-out rotor)、带有例如柠檬酸钠或乙二胺四乙酸(EDTA)之类的抗凝血剂的VacutainerTM CPT管、潮湿室、盘压(disc press)、粘合剂、盖盘、透明盖盘、胶带或等价物、真空装置、黄喷嘴(yellow tip)和真空室。
试剂：按照本发明的某些方法进行细胞计数所采用的试剂包括磷酸盐缓冲盐水、异丙醇、蒸馏水和StabilGuard。
本发明的一个目的是克服已知技术的局限性。本发明的另一目的是，采用已知的光学盘系统在光学生物盘上实施全血中的分类白细胞计数。本发明的进一步目的是，使血细胞成像并执行分类白细胞计数。
在用于实施簇标记计数的光学盘和驱动系统中能够实现本发明的这些和其它目的和优点，这种光学盘和驱动系统包括光学测定盘、光源、光学盘驱动器的光检测器电路、和处理器。光学测定盘包括基底、沉积在基底上的活性层、以及利用粘合剂或通道部件一体固定到活性层上的盖盘或帽部分。粘合剂部件具有从其中除去的一个或多个部分，借此形成固定有一种或多种捕获剂的多个室。固定在活性层上并位于室内的捕获剂限定出多个离散的捕获区。光源将光线指向捕获区处的盘。光学盘驱动器的光检测器电路的构造使其可检测从盘反射或透过盘的光线，并提供来自光学盘组件的携带信息的信号。使处理器与光检测器电路耦合，以便从携带信息的信号中获得用于操作光学盘系统并计数结合到捕获剂上的样品中的项目的操作信息。
按照该系统的一个具体方面，处理器包括用于对细胞进行检测和成像的图像识别软件。在一个实施例中，为了检测从捕获区反射的光线，光检测器与光源都在盘的同一侧上。在另一个实施例中，为了检测透过捕获区的光线，光检测器与光源在盘的相反两侧上。
本发明还涉及一种用光学盘和盘驱动器实施簇标记计数的方法。该方法包括以下步骤：将血样提供在含有分离梯度的第一管内；以足以将血样分成层的时间和速度旋转第一管；使含有T细胞的MNC层再悬浮，以形成MNC悬浮液；将MNC悬浮液样品提供在盘表面上，该表面至少包括一个含有至少一种捕获剂的捕获区；将盘装到光学读取器内，并旋转盘；将电磁辐射的入射束指向捕获区，并检测与捕获区处的盘相互作用之后所形成的电磁辐射束；将所检测的束转换成输出信号，并分析该输出信号，以提取与在捕获区所捕获的细胞数相关的信息。在该方法的一个实施例中，该光学盘配有反射层，从而使指向捕获区但不攻击细胞的光线被反射。在该方法的另一个实施例中，该光学盘的结构使得指向捕获区但不攻击细胞的光线透过光学盘。有关测定样品中的细胞群浓度的其它相关方面公开在共同转让和共同待审的2002年5月30日提交的序列号为60/384,205、题为“用于测定样品中的细胞或颗粒浓度的光学盘系统及其相关方法”(Optical DiscSystems For Determining The Concentration Of Cells or Particles InA Sample And Methods Relating Thereto)的美国临时申请中。该申请作为参考全部引入本文。
按照该方法的另一方面，盘表面涂有第一组捕获剂。在其一个实施例中，通过交联系统将捕获剂固定在盘上。在另一个实施例中，将捕获剂直接固定在盘表面上。
按照该方法的又一方面，捕获剂限定出一个或多个离散的捕获区。在其一个具体实施例中，使一个或多个捕获区位于光学盘内的一个或多个室内。在该方法的另一个实施例中，捕获剂对细胞表面抗原具有选择性亲和力。在又一个实施例中，捕获剂是与对细胞表面抗原具有选择性亲和力的原发捕获剂结合。在一个优选实施例中，细胞表面抗原是从抗原的CD族中单独选出的。在一个更优选的实施例中，细胞表面抗原是从包括CD3、CD4、CD8和CD45的组合中选出的。
按照该方法的再一方面，所述的旋转包括以足够的速度旋转足够的时间，以使细胞具有与捕获剂结合的机会。在该方法此方面的一个实施例中，该旋转还进一步包括以足够的速度旋转足够的时间，以使未结合的细胞从捕获区上被除去。在该方法的这方面的一个优选实施例中，该旋转是以一个速度进行的。
按照本发明这些方面的方法的实施例还有益地包括以下步骤：将MNC细胞样品引入具有捕获剂的近端，然后在捕获剂的存在下温育这些细胞，并使细胞特异性结合到捕获剂上。该方法的一个实施例还包括以下步骤：分析所捕获的细胞数，借此确定样品中的细胞浓度。在该实施例的一个方面，所述分析包括充分检测从盘反射或透过盘的光线水平的较大变化。在该实施例的另一个方面，所述分析包括用图像识别来计数所捕获的细胞。在该方法的一个优选实施例中，该图像识别将白细胞的类型彼此区分开。
该方法的另一个实施例还包括以下步骤：计数每个捕获区中的所捕获的细胞，并提供包括细胞数的输出。在该实施例的一个方面，该输出包括CD4细胞和CD8细胞的计数以及CD4与CD8细胞的比例。
按照本发明的又一原理方面，提供了另一种用于实施簇标记计数的方法。该方法包括以下步骤：(1)将血样提供在含有分离梯度的管内；(2)以足以将血样分成层的时间和速度旋转该管；(3)使含有T细胞的MNC层再悬浮，以形成MNC悬浮液；(4)将原发抗体加入到MNC悬浮液中，以形成原发抗体-T细胞复合物；(5)将原发抗体-T细胞复合物样品提供在盘表面上，该表面至少包括一个含有至少一种捕获剂的捕获区；(6)将盘装到光学读取器内；(7)将电磁辐射的入射束指向捕获区；(8)检测与捕获区处的盘相互作用之后所形成的电磁辐射束；(9)将所检测的束转换成输出信号，以及(10)分析该输出信号，以提取与在捕获区所捕获的细胞数相关的信息。
同样，在该方法的一个实施例中，该光学盘配有反射层，从而使指向捕获区但不攻击细胞的光线被反射。在该方法的另一个实施例中，该光学盘的结构使得指向捕获区但不攻击细胞的光线透过光学盘。
按照该方法的一个方面，盘表面涂有第一组捕获剂。在其一个实施例中，通过交联系统将捕获剂固定在盘上。在另一个实施例中，将捕获剂直接固定在盘表面上。
按照该方法的又一方面，捕获剂限定出一个或多个离散的捕获区。在其一个具体实施例中，使一个或多个捕获区位于光学盘内的一个或多个室内。在该方法的另一个实施例中，捕获剂对细胞表面抗原具有选择性亲和力。在又一个实施例中，捕获剂是与对细胞表面抗原具有选择性亲和力的第二组捕获剂结合。在一个优选实施例中，细胞表面抗原是从抗原的CD族中单独选出的。在一个更优选的实施例中，细胞表面抗原是从包括CD3、CD4、CD8和CD45的组合中选出的。
按照该方法的再一方面，所述的旋转包括以足够的速度旋转足够的时间，以使细胞具有与捕获剂结合的机会。在该方法的这方面的一个实施例中，该旋转还进一步包括以足够的速度旋转足够的时间，以使未结合的细胞从捕获区上被除去。在该方法的这方面的一个优选实施例中，该旋转是以一个速度进行的。
按照本发明这些方面的方法的实施例还有益地包括以下步骤：将原发抗体-T细胞复合物样品引入具有捕获剂的近端，然后在捕获剂的存在下温育这些复合物，并使复合物异性结合到捕获剂上。该方法的一个实施例还包括以下步骤：分析所捕获的复合物的数目，借此确定样品中的细胞浓度。在该实施例的一个方面，所述分析包括充分检测从盘反射或透过盘的光线水平的较大变化。在该实施例的另一个方面，所述分析包括用图像识别来计数所捕获的复合物。在该方法的一个优选实施例中，该图像识别将白细胞的类型彼此区分开。
该方法的另一个实施例还包括以下步骤：计数每个捕获区中所捕获的细胞，并提供包括细胞数的输出。在该实施例的一个方面，该输出包括CD4细胞和CD8细胞的计数以及CD4与CD8细胞的比例。
在任何上述方法中，管内还可含有抗凝剂。而且，在这些方法的许多特定实施方式和实施例中，固定有捕获剂的表面是盘的内面，并结合在基底和帽的相反侧上。
按照本发明的制造方面，提供了一种用于实施簇标记计数的光学测定盘的制造方法。光学测定盘的这种制造方法包括以下步骤：将交联剂提供在管内，并将捕获剂加入到管中；使交联剂与捕获剂结合(形成复合物)；提供基底，并且用活性层涂布该基底；将复合物沉积到活性层上，并利用粘合剂部件将盖盘或帽部分固定到活性层上。在该实施例中，交联剂是醛活化的葡聚糖。捕获剂是与细胞表面抗原结合。
按照该方法的一个方面，所述沉积涉及将复合物沉积在预定部位，借此形成捕获区。在其一个实施例中，所述固定涉及固定具有反射层的盖盘或帽部分，以使指向捕获区但不攻击细胞的光线被反射。在其另一个实施例中，所述固定涉及固定具有半反射层的盖盘或帽部分，以使指向捕获区但不攻击细胞的光线透过光学盘。
在又一个实施例中，捕获剂包括原发和继发捕获抗体。将继发捕获抗体结合到盘表面上并对原发捕获抗体具有特异性亲和力。在该实施例中，原发捕获抗体对感兴趣的细胞表面抗原具有选择性亲和力。在其一个优选实施例中，细胞表面抗原是从抗原的CD族中选出的。在一个更优选的实施例中，细胞表面抗原是从包括CD3、CD4、CD8和CD45的组合中选出的。
还是按照本发明的制造方面，提供了用于实施簇标记计数的光学测定盘的另一种制造方法。光学测定盘的这种制造方法包括以下步骤：提供基底，并且用活性层涂布该基底；将捕获剂沉积到活性层上(形成捕获区)，然后温育基底；旋转基底，并利用粘合剂部件将盖盘或帽部分固定到活性层上。在该方法的一个具体实施例中，温育步骤涉及在足够的温度下温育足够的时间，以便将捕获剂固定到活性层上。在该方法的另一个实施例中，旋转步骤涉及以足够的速度旋转足够的时间，以便将未固定的捕获剂从捕获区上除去。
按照该方法的另一方面，捕获剂是从包括以下物质的组合中选出的：IgG、生物素化IgG、抗-CD3抗体、生物素化抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、生物素化抗-CD4抗体、抗-CD8抗体、生物素化抗-CD8抗体、抗-CD45抗体和生物素化抗-CD45抗体。在该方面的一个实施例中，捕获剂是原发捕获剂。在另一个实施例中，捕获剂是继发捕获剂。按照该另一实施例的一个方面，该方法还包括以下步骤：在旋转步骤之后将原发捕获剂沉积到继发捕获剂上。在该另一实施例的另一个方面，该方法还包括以下步骤：在将原发捕获剂沉积到继发捕获剂上之后，温育基底并旋转基底。
按照本发明的另一个原理方面，提供了一种用于实施簇标记计数的光学测定盘。该光学测定盘包括基底、沉积到基底上的活性层、利用粘合剂部件(具有一个或多个部分被除去，从而在其间限定出一个或多个室)一体固定到活性层上的盖盘或帽部分、以及固定在活性层上的一种或多种捕获剂。捕获剂在一个或多个室内限定出多个离散的捕获区。在这种测定盘的一个实施例中，通过交联系统来固定捕获剂。在这种测定盘的另一个实施例中，通过活性层来固定捕获剂。
在这种测定盘的一个具体实施例中，捕获剂是对细胞表面抗原具有选择性亲和力的抗体。在一个优选的实施例中，捕获剂是从包括针对CD3、CD4、CD8和CD45的抗体的组合中选出的。在这种测定盘的另一个实施例中，捕获剂是对原发抗体具有选择性亲和力的抗体，而原发抗体对细胞表面抗原具有选择性亲和力。同样，在光学测定盘该方面的一个优选实施例中，原发抗体是从包括针对CD3、CD4、CD8和CD45的抗体的组合中选出的。在光学测定盘的该实施例中，原发捕获剂是在小鼠身上产生的抗人抗体，而继发捕获剂是在山羊身上产生的抗鼠抗体。
与本发明有关的技术方面也在以下申请中做出说明：2001年7月24日提交的序列号为60/307,489的题为“包括执行细胞计数的微流回路的光学分析盘”(Optical Analysis Discs Including MicrofluidicCircuits for Performing Cell Counts)的美国临时申请；2001年7月25日提交的序列号为60/307,825的题为“利用包括肝素、血浆或聚赖氨酸的带电物质减少光学生物盘上细胞的非特异结合的方法”(Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on OpticalBio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin，Plasma，orPoly-Lysine)的美国临时申请；2001年7月25日提交的序列号为60/307,762的题为“利用阻断剂减少光学生物盘上细胞的非特异结合的方法”(Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells onOptical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents)的美国临时申请；2001年7月25日提交的序列号为60/307,764的题为“利用聚乙烯醇减少射流室中的气泡的方法以及在光学生物盘中获得相同效果的相关技术”(Methods for Reducing Bubbles in Fluidic Chambers UsingPolyvinyl Alcohol and Related Techniques for Achieving Same inOptical Bio-Discs)的美国临时申请；2001年7月27日提交的序列号为60/308,214的题为“光学分析盘组件内的危险生物材料的容器的密封方法”(Sealing Methods for Containment of Hazardous BiologicalMaterials within Optical Analysis Disc Assemblies)的美国临时申请；和2001年7月27日提交的序列号为60/308,197的题为“利用光学生物盘平台计算辅助性/诱导性-抑制性/细胞毒性T淋巴细胞的定性和定量比率的方法”(Methods for Calculating Qualitative and QuantitativeRatios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes UsingOptical Bio-Disc Platform)的美国临时申请，所有这些申请的全部内容通过引用结合在本文中。现在更具体地说，本发明进一步涉及一种用于实施细胞测定的光学生物盘。本发明的光学生物盘可包括以下部件：可旋转的基底、与基底相联的帽部分、以及在所述基底和所述帽部分之间形成的射流回路。该射流回路可包括与带有入口的基底相联的混合室、与混合室以流体相通的纯化室、与所述纯化室相联的过滤装置、具有与纯化室以流体相通的捕获区的分析室、以及与分析室相联的排气孔。所述过滤装置可由微球或网状筛制成。微球上可涂有纯化剂。纯化剂可包括单克隆抗体、多克隆抗体、寡核苷酸、配体、受体和结合剂；其中单克隆抗体可以是抗-CD56、抗-CD14、抗-CD19、抗-CD9、抗-CD31、抗-CD41、抗-CD13、抗-CD31和抗-CD43抗体。捕获区上涂有捕获剂，其中该捕获剂可以是单克隆抗体、多克隆抗体、寡核苷酸、配体、受体或结合剂。单克隆抗体可以是抗-CD4、抗-CD8和抗-CD2抗体。
这种光学生物盘还可具有溶解缓冲剂贮器和位于流动通道之间的溶解缓冲剂阀，其中溶解缓冲剂阀将溶解缓冲剂贮器与混合室连接起来。可用溶解缓冲剂预填充溶解缓冲剂贮器。该光学生物盘还可包括分析缓冲剂贮器和位于流动通道之间的分析缓冲剂阀，其中分析缓冲剂阀将分析缓冲剂贮器与纯化室连接起来。可用分析缓冲剂预填充分析缓冲剂贮器。该光学生物盘还可包括与分析室及排气孔以流体相通的废物室。该光学生物盘还可具有位于射流回路中、将混合室和纯化室连接起来的样品混合阀。以下结合附图59和60来描述有关本发明的上述光学生物盘的进一步细节。
上述的光学生物盘还可包括将混合室与纯化室连接起来的RBC捕获区，以便在将样品装载到混合室内时，样品在进入纯化室之前流过RBC捕获区。RBC捕获区可包括分布在整个RBC捕获区上的墩柱。RBC捕获区可以是直的通道。它还可以是蛇形、波状或正弦曲线形。RBC捕获区可涂有包括凝集素的RBC捕获剂。以下结合附图61A、61B和61C来描述这种射流回路的实例。
本发明还涉及一种上述光学生物盘的使用方法，包括以下步骤：通过入口将全血样品装入混合室内；将生物盘装到光学读取器内，并以第一速度旋转该生物盘，所述第一速度足以打开溶解缓冲剂阀并将溶解缓冲剂释放到含有血样的混合室内；在所述溶解缓冲剂中将样品温育足够的时间，以溶解样品中的红血球；以及，以第二速度旋转生物盘，该第二速度足以打开样品混合阀并使样品移动进入并穿过纯化室(在纯化室中不需要的细胞被捕获)，并通过分析室，在分析室将特异性细胞捕获在捕获区上。一旦细胞穿过分析室，电磁辐射的入射束就可指向捕获区。然后，可检测与捕获区处的盘相互作用之后形成的电磁辐射束，接下来将所收集的信号转换成输出信号并进行分析，以便从其中提取与捕获区中所捕获的细胞数有关的信息。
本发明还涉及用于实施细胞测定的另一种方法，包括以下步骤：通过上述的光学生物盘入口将全血样品装入混合室内；将生物盘装入光学读取器内；以足够的速度和时间旋转生物盘，以使样品穿过RBC捕获区，(在捕获区样品中的红细胞被捕获)，通过纯化室(在纯化室样品中不需要的细胞被捕获)，然后通过分析室，在分析室将特异性细胞捕获在捕获区上；将电磁辐射的入射束指向捕获区；检测与捕获区处的盘相互作用之后形成的电磁辐射束，将所检测的束转换成输出信号；以及分析输出信号，以提取与捕获区中所捕获的细胞数有关的信息。
本发明光学生物盘的另一个实施例包括可旋转的基底、连接到基底上的微流盒、以及在微流盒内形成的射流回路。微流盒可由板形成，而板具有多个不同的切掉部分，以便在组装板以形成微流盒时形成射流回路的多个不同部件，包括入口、混合室、流动通道和纯化室。以下结合附图62A、62B、62C和63来讨论有关微流盒的进一步细节。
本发明还公开了一种用于接收样品的光学盘和驱动系统，其包括光学盘，该盘具有基底；帽，该帽与基底、限定在基底与帽之间的混合室、纯化室和分析室(具有捕获区)平行；以及在捕获区处的基底上的捕获层，从而第一捕获区具有第一细胞捕获剂，第二捕获区具有第二细胞捕获剂。该系统包括光学盘驱动器，该驱动器具有用于将光线指向捕获区处的盘的光源、用于检测从盘反射或透过盘的光线并提供信号的检测器、以及利用信号来计数结合到捕获分子上的样品中的项目的处理器。
本发明的再一方面包括一种细胞测定中所用的光学生物盘的制造方法。这种生物盘的制造方法包括以下步骤：形成可旋转的光学盘基底；形成与基底尺寸相同的盖盘；形成具有多个切掉部分以形成射流回路的通道层，其中射流回路包括入口、混合室、纯化室、分析室和排气孔，所述分析室包括捕获区。本发明的方法进一步还包括以下步骤：使捕获探针结合到捕获区上；将通道层连接到基底上；将过滤装置装入纯化室；以及将盖盘连接到通道层上，借此形成光学生物盘。盖盘、通道层和基底的固定可利用粘合剂和塑料焊接来完成。过滤装置可由涂有纯化剂的微球和网状筛来制成。
上述方法和设备可以具有一个或多个优点，这些优点包括(但不限于)不需要有经验的技术员执行试验就能简单快速地进行盘上处理、所需的样品体积小、使用廉价材料、使用已知光学盘格式及驱动器制造。通过参照以下结合附图及技术实例所进行的详细说明，将更好地理解这些及其它特征和优点。
附图说明
本发明的其它目的以及致力于这些目的的附加特征和由此产生的优点将从下面对本发明的优选实施例的详细说明中显现出来，优选实施例表示在附图中，图中相同标号表示相同部件，其中：
图1是按照本发明的生物盘系统的直观显示；
图2是与本发明结合使用的反射性生物盘的分解透视图；
图3是图2所示盘的顶视图；
图4是图2所示盘的透视图，其具有表示盘的不同层的切掉部分；
图5是与本发明结合使用的透射性生物盘的分解透视图；
图6是图5所示盘的透视图，其具有表示盘的半反射层的功能的切掉部分；
图7的图表表示出金薄膜的厚度与透射之间的关系；
图8是图5所示盘的顶视图；
图9是图5所示盘的透视图，其具有表示包括图6所示半反射型层的类型的盘的不同层的切掉部分；
图10的透视图及框图更详细地表示出图1的系统；
图11为垂直于图2、3和4所示反射光学生物盘的半径所作的局部截面图，表示形成于其中的流动通道；
图12为垂直于图5、8和9所示的透射光学生物盘的半径所作的局部截面图，表示形成于其中的流动通道和顶部检测器；
图13为图2、3和4所示的反射光学生物盘的局部纵截面图，表示形成于其中的摆动槽；
图14为图5、8和9所示的透射光学生物盘的局部纵截面图，表示形成于其中的摆动槽和顶部检测器；
图15与图11类似，表示出反射盘的总厚度及其初始折射性质；
图16与图12类似，表示出透射盘的总厚度及其初始折射性质；
图17A是利用本发明的方法分析血样的流程图；
图17B表示将抗体固定到白细胞上，以用于图17A所示的盘；
图18A表示抗生蛋白链菌素；
图18B表示生物素；
图18C表示构成抗生蛋白链菌素和生物素的交联系统；
图18D表示继发抗体；
图18E表示生物素基化的继发抗体；
图18F表示原发抗体；
图18G表示生物素基化的原发抗体；
图18H图示出表明四个CD4表面抗原的CD4+细胞；
图18I图示出表明四个CD8表面抗原的CD8+细胞；
图18J表示被结合到醛活化葡聚糖上的继发抗体；
图18K是图18J的截面图；
图19A和19B图示出由原发抗体进行的细胞捕获，该抗体在本发明的第一实施方式中通过交联系统结合到基底上；
图19C和19D图示出由原发抗体进行的细胞捕获，该抗体在本发明的第一实施方式中直接结合到基底上；
图20A-20I的截面侧视图表示出利用按照本发明的交联系统将捕获剂沉积到反射生物盘的捕获区上的一种方法的第一实施方式；
图21是图20A-20I所示的反射盘的另一实施方式，其不采用交联系统；
图22表示以透射盘格式实施的图20A-20I中所采用的捕获化学物质；
图23A和23B表示由结合到继发抗体上的原发抗体所进行的细胞捕获，在本发明的第二实施方式中继发抗体通过交联系统结合到基底上；
图23C和23D表示由结合到继发抗体上的原发抗体所进行的细胞捕获，在本发明的第二实施方式中继发抗体直接结合到基底上；
图24A-24L的截面侧视图表示出利用原发捕获抗体和继发捕获抗体以及按照本发明的交联系统，将捕获剂沉积到反射生物盘的捕获区上的一种方法的第二实施方式；
图25是图24A-24L所示的反射盘的另一实施方式，其不使用交联系统；
图26表示出以透射盘格式实施的图24A-24L中所采用的捕获化学物质；
图27A和27B表示由结合到继发抗体的原发抗体进行的细胞捕获，在本发明的第二实施方式中继发抗体通过DCHO链结合到基底上；
图27C和27D表示由原发抗体进行的细胞捕获，该抗体在本发明的第二实施方式中通过DCHO链直接结合到基底上；
图28A是制备抗体-DCHO复合物的流程图；
图28B-28J的截面侧视图表示利用原发抗体和继发抗体以及DCHO链，将捕获剂沉积到反射生物盘的捕获区上的一种方法的第二实施方式；
图29是图28B-28J所示的反射盘的另一实施方式，其不使用继发抗体；
图30表示出以透射盘格式实施的图28B-28J中所采用的捕获化学物质；
图31A为光学生物盘的顶视图，表示出四条射流回路，每个射流回路具有特定细胞表面标志物的几个捕获区，和一个阴性对照区；
图31B和31C表示由继发抗体进行的原发抗体-细胞复合物的捕获，该继发抗体在本发明的第三实施方式中通过交联系统结合到基底上；
图31D和31E表示由继发抗体进行的原发抗体-细胞复合物的捕获，该继发抗体在本发明的第三实施方式中直接结合到基底上；
图32A-32I的截面侧视图表示利用交联系统将捕获剂沉积到反射生物盘的捕获区上的一种方法的第三实施方式；
图33是图32A-32I所示反射盘的另一实施方式，其不使用交联系统；
图34表示以透射盘格式实施的图32A-32I中所采用的捕获化学物质；
图35A为光学生物盘的顶视图，表示出四个射流回路，每个射流回路具有不同细胞表面标志物的几个捕获区和一个阴性对照区；
图35B、35C和35D为反射光学生物盘的截面侧视图，表示采用交联系统的血样分析方法的第一实施方式的实施例；
图36是图35B、35C和35D所示反射盘的另一实施方式，其不使用交联系统；
图37表示以透射盘格式实施的图35B、35C和35D中所采用的捕获化学物质；
图38A、38B和38C为反射光学生物盘的截面侧视图，表示采用原发捕获抗体和继发捕获抗体以及交联系统的血样分析方法的第二实施方式的实施例；
图39是图38A、38B和38C所示反射盘的另一实施例，其不使用交联系统；
图40表示以透射盘格式实施的图38A、38B和38C中所采用的捕获化学物质；
图41A、41B和41C为反射光学生物盘的截面侧视图，表示采用原发抗体和继发抗体以及DCHO链的血样分析方法的第三实施方式的实施例；
图42是图41A、41B和41C所示反射盘的另一实施例，其不使用继发抗体；
图43表示以透射盘格式实施的图41A、41B和41C中所采用的捕获化学物质；
图44A是制备原发抗体-细胞复合物的流程图；
图44B、44C和44D为反射光学生物盘的截面侧视图，表示采用原发捕获抗体和继发捕获抗体以及交联系统的血样分析方法的第四实施方式的实施例；
图45是图44B、44C和44D所示反射盘的另一实施例，其不使用交联系统；
图46表示以透射盘格式实施的图44B、44C和44D中所采用的捕获化学物质；
图47示出了按照本发明一个实施例的具有表示条形码技术的室的光学盘；
图48A表示出按照本发明一个实施例利用条形码格式从测定中获得的结果；
图48B表示CD4、CD8和对照区的相应显微镜和盘图像；
图49是相应的显微镜和盘图像的更大视图，以说明从本发明的方法和设备中可获得的结果；
图50和51表示按照本发明一个实施例的图像识别的应用；
图52是按照本发明一个实施例的从条形码预期输出的屏幕截面图；
图53表示按照本发明一个实施例的从被捕获细胞转为可用输出的方法；
图54表示抽样模拟信号向相应的以一维阵列存储的数字信号的转变；
图55是带有指示部分的放大细节视图的光盘透视图，该指示部分表示相对于生物盘的轨迹定位的捕获白细胞，在与入射束相互作用之后产生含有信号的光束；
图56A表示相对于按照本发明的光学生物盘的轨迹定位的白细胞；
图56B表示按照本发明的从图56A的白细胞衍生的一系列签名轨迹；
图57表示图57A、57B、57C和57D之间的关系；
图57A、57B、57C和57D当放在一起时，表示从图56B的签名轨迹转变成以一维阵列存储并合并为数据输入的二维阵列的数字信号；
图58是按照与本发明相关的处理方法和计算算法进行数据评价的主要步骤的逻辑流程图；
图59是用于从全血或MNC样品中分离T细胞的射流回路的顶部平面图；
图60表示用于纯化和分析T细胞的射流回路的另一实施例，包括RBC的溶解和白细胞的纯化步骤；
图61A表示具有用于从全血样品中纯化T细胞的射流回路的又一实施例的光学生物盘；
图61B和61C表示出图61A所示射流回路的两个实施例；
图62A是穿过表示微流盒的中心所作的光学生物盘的截面图；
图62B和62C是其上固定有微流盒的光学生物盘的顶视图和侧视图；
图63是微流盒的透视分解图；以及
图64是表示利用本发明的光学生物盘对CD标志物进行测定的结果的条形图。
具体实施方式
本发明涉及盘驱动系统、光学生物盘、细胞测定和相关的细胞计数方法、图像处理技术、和相关软件。下文更详细地说明本发明的每个方面。
本发明与本文所公开的盘驱动系统、光学生物盘、细胞测定和相关的细胞计数方法、图像处理技术、和相关软件有关的方面还表示在以下文献中：2001年11月13日提交的序列号为60/338,679的题为“包括免疫表型分型的细胞分离和分型的定量及定性方法”(Quantitativeand Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing includingImmunophenotyping)的美国临时申请；2001年11月14日提交的序列号为60/332,001的题为“用于免疫表型分型的捕获层组件和光学生物盘”(Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs forImmunophenotyping)的美国临时申请；2001年11月30日提交的序列号为60/334,131的题为“利用光学生物盘平台计算辅助性/诱导性-抑制性/细胞毒性T淋巴细胞的定性和定量比率的方法”(Methods forCalculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-DiscPlatform)的美国临时申请；2002年1月31日提交的序列号为60/353,300的题为“包括白细胞的分类细胞计数方法以及光学生物盘在实施该方法中的应用”(Methods for Differential Cell CountsIncluding Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for PerformingSame)的美国临时申请；2002年3月12日提交的序列号为60/363,949的题为“包括白细胞的分类细胞计数方法以及光学生物盘在实施该方法中的应用”(Methods for Differential Cell Counts IncludingLeukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same)的美国临时申请；2002年8月21日提交的序列号为60/404,921的题为“分类细胞计数方法，包括用于实施该方法的相关装置和软件”(Methods ForDifferential Cell Counts Including Related Apparatus and SoftwareFor Performing Same)的美国临时申请，所有这些申请作为参考引入本文。
驱动系统和相关盘
图1为用于实施本文所公开的细胞计数和分类细胞计数的按照本发明的光学生物盘110的透视图。本发明的光学生物盘110结合有光学盘驱动器112和显示器114。有关这种类型的盘驱动器和盘分析系统的进一步细节公开在以下共同转让和共同待审的美国申请中：2001年11月9日提交的题为“与光学生物盘一起使用的盘驱动器系统和方法”(Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs)的第10/008,156号美国专利申请；2002年1月10日提交的题为“包括用于生物和医学成像的相关方法的光学盘分析系统”(Optical DiscAnalysis System Including Related Methods For Biological andMedical Imaging)的第10/043,688号美国专利申请；和2002年10月24日提交的题为“用于生物驱动器的分段区域检测器及其相关方法”(Segmented Area Detector for Biodrive and Methods RelatingThereto)的第10/279,677美国专利申请，这些专利申请通过参考结合在本文中。
图2是光学生物盘110的一个实施例的主要结构部件的分解透视图。图2为可以用于本发明的反射区光学生物盘110(下文称为“反射性盘”)的示例。主要结构部件包括盖盘或帽部分116、粘合部件或通道层118、和基底120。盖盘116包括一个或多个入口122和一个或更个出气口124。盖盘116可以用聚碳酸脂形成，并且当从图2的透射方向看时最好在它的底部涂有反射性表面146(图4)。在这个优选实施例中，触发标记或标志126包括在反射层142的表面上(图4)。如图10所示，触发标志126可以在编码有传送数据至处理器166的信息的生物盘、不透明区域、或反射性或半反射性区域的所有三层中包括透明窗，这反过来又与询问或入射束152的操作功能相互作用(图6和图10)。
图2所示的第二部件为一种具有射流回路128或形成于其中的U形通道的粘合部件或通道层118。通过压制或切削膜以去除塑料薄膜并形成如图所示的形状，而形成射流回路128。每个射流回路128包括流动通道或分析室130和回流通道132。图2所示的一些射流回路128包括混合室134。图中表示出两种不同类型的混合室134。第一种是相对于流动通道或分析室130对称形成的对称混合室136。第二种是偏置混合室138。偏置混合室138形成于所示流动通道或分析室130的一侧。
图2所示的第三部件为包括目标或捕获区140的基底120。基底120最好由聚碳酸脂制成，并具有沉积在其顶部上的反射层142(图4)。通过以所示形状或其它任何所需形状去除反射层142，而形成目标区140。此外，目标区140可以通过掩蔽技术形成，该掩蔽技术包括在施加反射层142之前掩蔽目标区140。反射层142可以由例如铝或金之类的金属形成。
图3为图2所示光学生物盘110的顶视图，其中在显示为透明的盖盘或帽部分116上具有反射层142，以展示位于盘内的射流回路128、目标区140和触发标记126。
图4为按照本发明一个实施例的反射区型光学生物盘110的放大透视图。该图包括它的各个层的一部分，切掉以表示每个主要层、基底、涂层或膜的部分截面图。图4表示涂有反射层142的基底120。将活性层144施加于反射层142上。在这个优选实施例中，活性层144可以由聚苯乙烯形成。此外，可以使用聚碳酸脂、金、活性玻璃、改性玻璃、或例如聚苯乙烯共马来酐之类的改性聚苯乙烯。此外，可以采用水凝胶。此外，如本实施例所示，将塑料粘合部件118施加于活性层144之上。塑料粘合部件118的暴露部分表示出产生射流回路128的切掉或被压制的U形。此生物盘的这种反射区实施例中的最终主要结构层为盖盘或帽部分116。盖盘116在其底部包括反射表面146。反射表面146可以由例如铝或金之类的金属制成。
现在参照图5，该图是按照本发明的透射型光学生物盘110的主要结构部件的分解透视图。透射型光学生物盘110的主要结构部件同样包括盖盘或帽部分116、粘合或通道部件118、和基底120层。盖盘116包括一个或多个入口122和一个或多个出气口124。盖盘116可以由聚碳酸脂形成。任选的触发标记126包括在半反射性薄层143的表面上，如图6和9所最佳示出的。触发标志126可以在编码有传送数据至处理器166的信息的生物盘、不透明区域、或反射性或半反射性区域的所有三层中包括透明窗，如图10所示，这反过来又与询问光束152的操作功能相互作用(图6和图10)。
图5所示的第二部件为具有射流回路128或形成于其中的U形通道的粘合部件或通道层118。通过压制或切削膜以去除塑料薄膜并形成如图所示的形状，而形成射流回路128。每个射流回路128包括流动通道或分析室130和回流通道132。图5所示的一些射流回路128包括混合室134。图中表示出两种不同类型的混合室134。第一种是相对于流动通道或分析室130对称形成的对称混合室136。第二种是偏置混合室138。偏置混合室138形成于所示流动通道130的一侧。
图5所示的第三部件为包括目标或捕获区140的基底120。基底120最好由聚碳酸脂制成，并具有沉积在其顶部上的半反射层143(图6)。与图5和图6所示的盘110的基底120相联的半反射层143与图2、3和4所示的盘110的基底120上的反射层142相比要薄得多。较薄的半反射层143允许询问光束152穿过图6和12所示的透射盘的结构层具有一些透射。该半反射薄层143可以由例如铝或金之类的金属形成。
图6为图5所示的光学生物盘110的透射实施例的基底120和半反射层143的放大透视图。薄半反射层143可以由例如铝或金之类的金属制成。在这个优选实施例中，图5和6所示的透射盘的薄半反射层143的厚度大约为100-300埃，并且不超过400埃。该较薄的半反射层143允许一部分入射或询问光束152透过并通过半反射层143，以便被图10和12所示的顶部检测器158检测，而一些光线沿入射光路反射或返回。如下文所示，表2表示金薄膜相对于膜的厚度的反射和透射性质。厚度大于800埃的金薄膜层完全反射。而光线穿过金属膜透射的临界密度大约为400埃。
除表2之外，图7的图表还提供了基于金的厚度、薄半反射层143的反射和透射性质的相反关系。图7所示的图表中所使用的反射和透射值为绝对值。
                         表2
              金膜的反射和透射(绝对值)
  厚度(埃)   厚度(nm)   反射比   透射比
  0   0   0.0505   0.9495
  50   5   0.1683   0.7709
  100   10   0.3981   0.5169
  150   15   0.5873   0.3264
  200   20   0.7142   0.2057
  250   25   0.7959   0.1314
  300   30   0.8488   0.0851
  350   35   0.8836   0.0557
  400   40   0.9067   0.0368
  450   45   0.9222   0.0244
  500   50   0.9328   0.0163
  550   55   0.9399   0.0109
  600   60   0.9448   0.0073
  650   65   0.9482   0.0049
  700   70   0.9505   0.0033
  750   75   0.9520   0.0022
  800   80   0.9531   0.0015
接下来参照图8，图8是图5和6所示的透射型光学生物盘110的顶视图，其具有展示出位于盘内的射流通道、触发标记126和目标区140的透明盖盘或帽部分116。
图9为按照本发明的透射盘实施例的光学生物盘110的放大透视图。所示的盘110具有它的各种层的一部分，切掉以表示各主要层、基底、涂层或膜的部分截面图。图9表示具有透明盘或帽部分116、基底120上的薄半反射层143、和触发标志126的透射盘格式。在这个实施例中，触发标志126包括放置在帽的顶部的不透明材料。此外，触发标志126可以由刻蚀在盘的薄反射层143上的透明、非反射性窗口，或者任何吸收或不反射来自触发检测器160(图10)的信号的标志形成。图9还表示出，通过以指定形状或其它任何所需形状标记指定区域而形成的目标区140。指示目标区140的标记可以做在基底120的薄半反射层143上或基底120的底部(盘下)。此外，可以通过掩蔽技术形成目标区140，该技术包括掩蔽除目标区140之外的整个薄半反射层143。在这个实施例中，目标区140可以通过丝网印印墨至薄半反射层143上而产生。在图5、8和9所示的透射盘格式中，还可以由盘上编码的地址信息来定义目标区140。在这个实施例中，目标区140不包括物理可识别的边界。
继续参照图9，表示出将活性层144施加于薄半反射层143上。在这个优选实施例中，活性层144是厚度为40至200μm的2％聚苯乙烯层。此外，可以使用聚碳酸脂、金、活性玻璃、改性玻璃、或例如聚苯乙烯共马来酐之类的改性聚苯乙烯。此外，可以采用水凝胶。如该实施例所示，将塑料粘合部件118施加于活性层144之上。塑料粘合部件118的暴露部分表示出产生射流回路128的切掉或被压制的U形。
此生物盘110的这种透射实施例中的最终主要结构层为，包括入口122和出气口124的透明、非反射性盖盘或帽部分116。
现在参照图10，该图以透视图和框图的形式表示出光学部件148、产生入射或询问光束152的光源150、返回光束154和透射光束156。在图4所示的反射性生物盘的情况下，返回光束154从光学生物盘110的盖盘116的反射表面146反射回来。在此光学生物盘110的这种反射实施例中，利用底部检测器157检测返回光束154并分析信号码元的存在。另一方面，在透射性生物盘格状中，利用顶部检测器158检测透射光束156并且也分析信号码元的存在。在这个透射实施例中，光检测器可以用作顶部检测器158。
图10还表示出包括盘上的触发标记126和触发检测器160的硬件触发机构。该硬件触发机构用于反射性生物盘(图4)和透射性生物盘(图9)中。该触发机构允许处理器166仅当询问光束152在相应的目标区140上时收集数据。此外，在透射性生物盘系统中，也可以使用软件触发器。软件触发器利用底部检测器给处理器166发信号，以便入射束152一击中相应的目标区140的边缘就收集数据。图10还表示出驱动电机162和控制光学生物盘110的旋转的控制器164。图10还表示出用于处理与投射光学生物盘相联的返回光束154和透射光束156的处理器166和分析仪168。
如图11所示，该图是按照本发明的光学生物盘110的反射盘实施例的局部截面图。图11表示出基底120和反射层142。如上所述，反射层142可以由例如铝、金或其它合适的反射性材料制成。在这个实施例中，基底120的顶面为光滑的。图11还表示出施加于反射层142之上的活性层144。同样如图11所示，通过在所需位置去除反射层142的一个区域或一部分，或者通过在施加反射层142之前掩蔽所需区域，而形成目标区140。还是如图11所示，将塑料粘合部件118施加到活性层144之上。图11还表示出盖盘116和与之相联的反射表面146。因此当将盖盘116施加于包括所需切掉形状的塑料粘合部件118上时，就形成流动通道或分析室130。如图11的箭头所示，入射束152的光路最初是从盘110的下部指向基底120。入射束然后聚焦在最接近反射层142的点上。由于该聚焦发生在目标区140中(在该区中缺少一部分反射层142)，因此入射束沿光路继续通过活性层144并进入流动通道或分析室130。入射束152然后继续向上横穿过流动通道最终入射至反射表面146上。此时，入射束152沿入射光路返回或反射并因此形成返回光束154。
图12为按照本发明的光学生物盘110的透射实施例的局部截面图。图12表示出具有透明盖盘116和基底120上的薄半反射层143的透射盘格式。图12还表示出施加于薄半反射层143之上的活性层144。在这个优选实施例中，透射盘具有由例如铝或金之类的金属制成的厚度大约为100-300埃并不超过400埃的薄半反射层143。这种薄半反射层143允许一部分来自光源150(图10)的入射或询问光束152穿透并向上通过盘，以便被顶部检测器158检测，而一些光线沿与入射束相同的光路但以相反的方向反射回来。在这种设置中，返回或反射光束154从半反射性层143反射回来。因此，在这种方式中，返回光束154不进入流动通道或分析室130。正如结合图13和14更详细说明的那样，反射光或返回光束154可用于跟踪形成在半反射层143之中或之上的预录制信息轨迹上的入射束152。在图12所示的盘实施例中，物理限定的目标区140可存在或不存在。目标区140可以通过在基底120上的薄半反射层143上直接进行标记而产生。可以利用丝网印制或任何等价方法来形成这些标记。在没有物理标记用于定义目标区的替代性实施例中(例如，当使用编码软件寻址时)，流动通道或分析室130实际上可以用作执行调查特征的检查的受限目标区。
图13是穿过按照本发明的生物盘110的反射盘实施例的信道所作的截面图。本图是沿半径和盘的流动通道横纵向所取。图13包括基底120和反射层142。在这个实施例中，基底120包括一系列槽170。槽170处于从靠近盘的中心向外缘螺旋延伸的形式。槽170用以使询问光束152可以沿盘上的螺旋槽170进行跟踪。这种类型的槽170被称作“摆动槽”。具有波动或波状侧壁的底部形成槽170，而升高或提高部分在螺旋方向分离相邻的槽170。在这个实施例中，施加于槽170之上的反射层142如图所示，实质上共性。图13还表示出施加于反射层142之上的活性层144。如图13所示，通过在所需位置去除反射层142的一个区域或一部分，或者通过在施加反射层142之前掩蔽所需区域，而形成目标区140。还是如图13所示，将塑料粘合部件118施加于活性层144之上。图13还表示出盖盘或帽部分116和与之相联的反射表面146。因此当将盖盘116施加于包括所需切掉形状的塑料粘合部件118上时，就形成流动通道或分析室130。
图14是穿过按照本发明的生物盘110的透射盘实施例的信道所作的截面图(例如，如图12所述)。本图是沿盘的半径和流动通道纵向所取。图14表示出基底120和薄半反射层143。该薄半反射层143允许来自光源150的入射或询问光束152穿透并通过盘，以便被顶部检测器158检测，而一些光线以返回光束154的形式反射回来。利用盘读出器保持其循迹能力所需的反射光的最小数量来确定该薄半反射层143的厚度。在这个实施例中，与图13所述相似，基底120包括一系列槽170。在这个实施例中，槽170也优选地处于从靠近盘的中心向外缘螺旋延伸的形式。槽170用以使询问光束152可以沿盘上的螺旋槽170进行跟踪。图14还表示出施加于薄半反射层143之上的活性层144。还是如图14所示，将塑料粘合部件118施加于活性层144之上。图14还表示出没有反射表面146的盖盘或帽部分116。因此，当将帽施加于包括所需切掉形状的塑料粘合部件118上时，就形成流动通道或分析室130，并且使一部分入射束152基本上无反射地通过。
图15与图11类似，表示反射盘的总厚度及其初始折射性质。图16与图12类似，表示透射盘的总厚度及其初始折射性质。图15和16中未显示槽170，因为沿槽170切取截面。图15和16表示这些实施例中位于垂直于槽170的位置的窄流动通道或分析室130的存在。图13、14、15和16表示相应的反射性或透射性盘的总厚度。在这些图中，入射束152被表示为最初与具有改变入射束的光路的折射性质的基底120相互作用(如图所示)，以便使光束152在反射层142或薄半反射层143上聚焦。
细胞测定
可以利用本发明的方法来实施普通均匀固相细胞捕获测定，以便快速测定血样中的CD4+和CD8+T淋巴细胞群的绝对数和CD4+/CD8+淋巴细胞的比率。在并入生物盘的小流动通道中运行的该检验，测定在从全血分离的7-15μl的单核细胞(MNC)中捕获区上的特异性抗体所捕获的CD4+、CD8+、CD2+、CD3+、CD19+和CD45+细胞的数量。该检验是基于盘上的特定位置的局部细胞捕获原理。通过基于针对具体血细胞表面抗原的单克隆抗体或多克隆抗体，局部施加捕获化学物质，在盘上产生几个特定细胞捕获区。当用MNC血(10,000-30,000个细胞/微升)充满25-100微升的室时，表达CD4、CD8、CD2、CD3、CD19和CD45抗原的细胞被捕获在盘内的捕获区中。也被结合到捕获区内的是所限定的阴性对照区。涉及对样品中的细胞进行分类和分析的其它相关方面公开在共同转让和共同待审的2002年7月25日提交的序列号为60/398,464、题为“光学生物盘细胞分类器及分析仪”(Optical Bio-disc Cell Sorter and Analyser)的美国临时申请中。该申请作为参考全部引入本文。
图17A是血样分析的流程图。在步骤1，将血液(4-8mi)直接收集到4或8mi的Becton Dickinson CPT VacutainerTM和例如EDTA、酸性柠檬酸盐葡萄糖(ACD)、或肝素之类的抗凝血剂中。在本发明的另一实施例的等价步骤中，将3ml的带抗凝血剂的血叠加入包含例如Histopaque1077之类的分离梯度(separation gradient)176的试管172中。在任何情况下，血样174最好在两小时的收集时间内使用。叠加有血样174的包含分离梯度176的试管172，在带有水平转子和转位式桶的生物危害离心室中以400×g于室温下离心30分钟。离心后，将血浆层178去除(步骤2)，在单核细胞(MNC)部分180之上留下约2mm的血浆。收集MNC层180并用磷酸缓冲盐水(PBS)冲洗。通过以250×g在室温下离心10分钟将细胞压成丸，以去除任何剩余的血小板。将上清液去除，并通过轻敲试管使MNC丸180在PBS中再悬浮。根据生物盘110的流动通道或分析室130的高度，使最终形成的丸180再悬浮(步骤3)至10,000-30,000细胞/微升的细胞计数。
用7微升的MNC悬浮液充满生物盘110的流动通道或分析室130，并用胶带或其它适当的密封部件密封室的入口122和出气口124(图3和8)(步骤4)。将生物盘110在室温下温育15分钟，然后在光学驱动器112中用780nm的激光扫描，以使捕获区成像(步骤5)。应该理解，如果使用透射性生物盘110，光学驱动器112就任选地包括顶部检测器158(图10)，以使捕获区成像。最后软件被编码在盘上，以指示驱动器自动执行以下任务：(a)在一个或多个阶段中离心盘，以分离过量的未结合细胞；(b)在显示监视器114上成像具体的捕获窗口；和(c)处理数据。数据处理包括(但不限于)计数每个捕获区中的特异性捕获的细胞，并得出CD4+/CD8+比率或者程序待确定的任何比率。通过本发明的其它实施例可以容易地提供其它所需的比率。
还是如图17A所示，本发明涉及一种利用光学盘和盘驱动器系统执行簇标记计数的方法。该方法包括以下步骤：在包含分离梯度的第一试管中提供血样，以足以将血样分离成层的时间和速度旋转第一试管；再悬浮包含T细胞的MNC层，以形成MNC悬浮液，并且将MNC悬浮液试样提供到包括至少一个捕获区(包含至少一种捕获剂)的盘表面上；将盘载入光学读取器，然后旋转盘；将电磁辐射的入射束指向捕获区，检测在与盘的捕获区相互作用之后所形成的电磁辐射束，然后将所检测的光束转换为输出信号；以及分析该输出信号，以提取与在捕获区处所捕获的细胞数量相关的信息。在该方法的一个实施例中，光学盘带有反射层，以便使指向捕获区但不击中细胞的光反射。在该方法的另一实施例中，光学盘的构造使得指向捕获区但不击中细胞的光线穿过光学盘透射。
在分析/处理步骤中，软件穿过每个捕获区图像进行读取，并且在与这些细胞图像相遇时标记细胞图像。举例说来，在计数所捕获的CD4+和CD8+细胞数量之后，软件计算CD4+/CD8+的比率，并显示每微升全血的CD4+、CD8+、CD3+和CD45+捕获区中的细胞绝对数以及CD4+/CD8+比率。整个过程从将盘插入光学驱动器到获得这些绝对数和比率需要12分钟。有关对样品中的特定细胞群进行定量的其它相关方面公开在共同转让和共同待审的以下申请中：2002年5月22日提交的序列号为60/382,319、题为“在光学生物盘中捕获的特定细胞群的计算方法”(Methods for Calculating Specific Populations ofCells Captured In An Optical Bio-Disc)的美国临时申请；和2002年5月24日提交的序列号为60/382,944、题为“用于检测和定量细胞群的方法和设备以及光学生物盘在实施该方法中的用途”(Methods andApparatus for Use in Detection and Quantitation of Cell Populationsand Use of Optical Bio-Disc for Performing Same)的美国临时申请。这些申请作为参考全部引入本文。
在一个实施例中，盘是涂有作为编码信息层的300nm金的前摆动部件FDL21：13707或FDL21：1207CD-R盘。在反射盘上，利用已知的光刻技术从反射层蚀刻出尺寸为2×1mm的椭圆形观察窗。在透射盘的一些设计中，没有蚀刻分离开的观察窗，并且整个盘都可用。在一个具体实施例中，粘合层为Fraylock粘合剂DBL 201 Rev C3M94661。盖为具有48个直径为0.040英寸、位于半径为26mm等距处的试样入口的透明盘。利用CD4+/CD8+计数软件以4X的速度和2.67MHz的取样速率、用该软件扫描并读取数据盘。
参照图17B，在本发明的一个实施例中，聚苯乙烯厚层118形成于基底120之上，并且(任选地)与抗生蛋白链菌素182分层。通过生物素将细胞捕获抗体固定到抗生蛋白链菌素182上。这些抗体可包括固定到涂在抗生蛋白链菌素上的葡聚糖活化醛上的生物素化抗体，以便为捕获抗体产生足够数量的结合位点。这样就产生了可以与白细胞(WBC)特异性地形成强结合的强捕获化学物质。
图18A、18B、18C图示出在本发明的一个实施例中所使用的交联或结合系统。应该理解，交联系统涉及一种或多种交联剂、受体-配体剂或共轭物，以便使一个或多个大分子片断与另一个交联。交联可以是两个大分子片断之间的共价或非共价相互作用，通常在两个大分子自由基结合时形成。获得交联的化学改性或共扼方法涉及一个官能团与另一个官能团的反应，从而导致键的形成。带有反应性或选择反应性官能团的生物共扼剂的产生，形成了靶分子的简单和可重复的交联或标记的基础(Greg T.Hermanson 1996年在Academic Press，SanDiego，CA发布的“生物共扼技术”(Bioconjugate Techniques))。
交联剂包括(但不限于)同双功能交联剂(homobifunctionallinker)、异双功能交联剂(heterobifunctional linker)和零长度交联剂。同双功能交联剂为具有两个相同功能性的反应位点的交联剂，例如戊二醛。这些试剂通过与两个分子上的相同公共基团(commongroup)发生共价反应，可以将一个蛋白质结合到另一个蛋白质上。异双功能共扼剂包含可以结合到蛋白质和其它大分子上的两不同功能目标上的两个不同反应基。例如，交联剂的一部分可以包含胺反应基，而另一部分可以包含硫氢反应基。结果是，能够使靶分子的选定部分发生交联反应，因此能够对共扼工艺进行更好的控制。零长度交联剂通过形成不包含附加原子的键而介导两个分子的共扼。因此，在没有中间连接剂或间隔物的情况下，分子的一个原子被共价固定到第二分子的一个原子上。关于交联剂的详细说明，本领域的普通技术人员可以参考Greg T.Hermanson 1996年在Academic Press，San Diego，CA发布的“生物共扼技术”(Bioconjugate Techniques)。
在本发明中，使交联剂结合到生物盘的表面上，以固定目标区内的捕获剂。优选的交联或结合系统为包含生物素和抗生物素蛋白的异双功能团，即结合到抗生物素蛋白偶合的基底上的生物素化捕获剂。图18A图示出抗生物素蛋白182。抗生物素蛋白包括(但不局限于)中性抗生物素蛋白(neutravidin)、抗生蛋白链菌素及其修饰。如图所示，蛋白质包括四个亚基，每个亚基包含一个生物素(Hermanson)结合位点。抗生物素蛋白182可以通过各种化学物质结合到例如聚苯乙烯之类的塑料上。理想的是，将抗生物素蛋白182固定到生物盘的活性层144(图4和图9)上，实质上不可逆地结合到生物素化的传感元件(例如抗体)上。
图18B图示出生物素184。生物素(或维生素H)是在每个细胞内少量存在的自然产生的增长因子。生物素与蛋白质抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)及抗生蛋白链菌素的相互作用是已知的最强的非共价键和之一。生物素分子184通过它的戊酸侧链可以直接结合到蛋白质上，或者与其它有机成分衍生，以产生间隔壁(spacerarm)和多种反应基。通过适当地选择生物素衍生物(Hermanson)，胺、羧酸盐、硫氢和碳水化合物基团可以专门作为生物素化的目标。图18C图示出包含与抗生物素蛋白182相互作用的生物素184的交联系统。
本发明实施例的实施利用捕获剂来执行本文所述的测定。应该理解，捕获剂是指用于检测分析物的任何大分子。本发明的捕获剂包括针对感兴趣的分析物优先选择、或具有选择性结合亲和力的大分子。捕获剂包括(但不限于)合成或生物制备的核酸以及合成或生物制备的蛋白质。本发明可以采用的捕获剂的实例有(但不限于)：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、聚合酶链反应产物、或这些核苷酸的组合(嵌合体)、抗体(单克隆或多克隆)、细胞膜受体、以及针对特异性抗原定子(例如在病毒、细胞或其它材料上)的抗血清反应物、药物、肽、辅因子、外源凝集素、多糖、细胞、细胞膜和细胞器。优选的是，本发明的捕获剂为抗体。
抗体包括(但不限于)多克隆、单克隆和重组体产生的抗体。本发明的抗体可以在活体内或活体外制备。抗体的制备方法是本领域的技术人员所熟知的。例如，参见Peter Delves(Ed.)、John Wiley和Son Ltd所著的编号为ISBN：0471970107(1997)的抗体制备：基本技术，该书的全部内容通过引用结合在本文中。此外，可以从商业来源获得抗体，例如Flanders的Pleasant Hill路，NJ 07836的ResearchDiagnostics股份有限公司。本发明的抗体不限于任何一个特定物种的抗体；例如人类、老鼠、大鼠和山羊的抗体都是本发明所考虑的。优选的是，本发明的原发抗体为在老鼠身上所制备的抗-人抗体，本发明的继发抗体是在山羊身上所制备的抗-鼠抗体。
作为任何或所有可以用来结合到细胞表面抗原上的抗体类型，术语“抗体”也包括抗体的任何类或亚类。抗体在医疗诊断技术领域中的应用为本领域技术人员所熟知。例如，参见Diagnostic and TherapeuticAntibodies(Methods in Molecular Medicine)，Andrew J.T.George andCatherine E.Urch(Eds.)，Humana Press；ISBN：0896037983(2000)andAntibodies in Diagnosis and Therapy：Technologies，Mechanisms andClinical Data(Studies in Chemistry Series)，Siegfried Matzku andRolf A.Stahel(Eds.)，Harwood Academic Pub.；ISBN：9057023105(1999)，这些材料的全部内容通过引用结合在本文中。
在本发明的至少一些实施例中，利用多种捕获剂来检测感兴趣的分析物。图18D图示出作为继发捕获剂186用于本发明的方法中的lgG类抗体。应该理解，本发明的继发捕获剂包括(但不限于)对另一捕获剂具有亲和力的捕获剂，该捕获剂对感兴趣的分析物具有亲和力。图18E表示出结合到生物素分子184上的继发捕获剂lgG186，下文称为生物素化lgG。
图18F图示出原发捕获剂188。应该理解，本发明的原发捕获剂188对感兴趣的分析物具有选择性亲和力。优选地，原发捕获剂为对白细胞具有亲和力的抗体。更具体地说，这些抗体是针对淋巴细胞(CD2、CD19)、单核细胞(CD14)、嗜伊红性粒细胞(CD15)和其它感兴趣的细胞表面标记物。图18G表示出结合到生物素分子184上的原发捕获剂188。除CD4和CD8之外，还有针对许多其它细胞表面抗原(例如CD3、CD16、CD19、CD45、CD56)的抗体，利用这些抗体来鉴定淋巴细胞亚类。
图18H图示出CD4+T细胞190。CD4+T细胞结合到由例如巨噬细胞和树状细胞之类的抗原递呈细胞(APC)表达的特异性抗原上，并释放吸引其它免疫细胞至该区域的淋巴因子。结果是导致炎症的产生，以及试图隔开和破坏抗原材料的细胞和分子的集聚。应该理解，CD4+T细胞具有覆盖整个细胞表面的多个抗原192。但是，仅是为了图示的目的，图18H表示出具有四个抗原192的CD4+T细胞190。
图18I图示出CD8+型T细胞194。这些T细胞分泌破坏它们所结合的细胞的分子。这对抵抗病毒感染很重要，因为CD8+T细胞在被感染细胞释放能够感染其它细胞的新一组病毒之前破坏这些被感染的细胞。应该理解，CD8+T细胞具有覆盖整个细胞表面的多个抗原196。但是，仅是为了图示的目的，图18I表示出具有四个抗原196的CD8+T细胞194。
图18J图示出结合到3维矩阵的醛活化葡聚糖(DCHO)198上的继发抗体186，借此形成DCHO-抗体复合物199。葡聚糖主要是一种由被糖苷键链接在一起的右旋葡萄糖的重复单位构成的线性多糖。作为被广泛使用的交联剂，葡聚糖实质上为多价，这允许分子结合在沿聚合物链(Hermanson)的多个位点上。仅是为了图示的目的，将如图18K所示来说明结合到葡聚糖198上的抗体186。
与本发明的细胞测定相关的方面也被公开在以下文献中：2001年7月27日提交的序列号为60/308,176的题为“利用光学生物盘平台表征包括白血病血样的癌血细胞的定性和定量方法”(Ouantitativeand Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood CellsIncluding Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临时申请；2001年8月15日提交的序列号为60/312,248的题为“利用光学生物盘平台定性和定量表征包括淋巴瘤血样的癌血细胞的方法”(Methods for Quantitative and Qualitative Characterizationof Cancerous Blood Cells Including Lymphoma Blood Samples UsingOptical Bio-Disc Platform)的美国临时申请；2001年8月20日提交的序列号为60/313,514的题为“利用原发抗体与试样的位点外温育进行特异性细胞捕获和利用表面结合的继发抗体进行后序捕获的方法以及包括该方法的光学生物盘”(Methods for Specific Cell Capture byOff-Site Incubation of Primary Antibodies with Sample andSubsequent Capture by Surface-Bound Secondary Antibodies andOptical Bio-Disc including Same)的美国临时申请；2001年8月20日提交的序列号为60/313,715的题为“利用全血和相关的光学生物盘的辅助性/诱导性-抑制性/细胞毒性T淋巴细胞的RBC溶解规程评价”(RBC Lysis Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related OpticalBio-Disc)的美国临时申请；2001年8月20日提交的序列号为60/313,536的题为“利用全血和相关的光学生物盘的辅助性/诱导性-抑制性/细胞毒性T淋巴细胞的RBC筛分规程评价”(RBC SievingProtocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/CytotoxicT-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc)的美国临时申请；和2001年8月30日提交的序列号为60/315,937的题为“包括免疫表型分型的细胞分离和分型的定量及定性方法”(Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and TypingIncluding lmmunophenotyping)的美国临时申请，所有这些申请通过参考结合在本文中。
实施方式I
图19A-19D图示出本发明的第一实施方式中的分析物捕获。图19A和19B表示出利用生物素化的原发抗体(图18G)对CD4+T细胞190和CD8+T细胞194的捕获。通过交联剂抗生蛋白链菌素182将抗体188固定在生物盘110(图4和9)的活性层144上。图19C和19D表示出本发明的同一实施方式中没有交联系统的另一实施例。在这个实施例中，将原发抗体188直接固定到生物盘110的活性层144上。
图20A-20I是表示本发明第一实施方式的一个实施例的构造的截面图。第一实施方式涉及利用交联系统将捕获剂固定在生物盘流动通道内的反射盘的构造。参照图20A，该图表示出光学生物盘110的透光基底120、反射层142和活性层144。将部分反射层142去除(或者当沉积时产生开口)，以制造观察窗200，通过观察窗200光线可以指向抗体将被固定到其上的捕获区140的位置。图20A表示出5个这样的捕获区140，其中将第一个指定为捕获区141。活性层144最好为聚苯乙烯的，它被旋涂、或者通过本领域技术人员公知的其它方法沉积在反射层142之上，以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。然后，将抗生蛋白链菌素182沉积在每个捕获区140和141之上，而将盘110在湿气室中于室温下温育30分钟(图20B)。冲洗盘110，以去除未结合的抗生蛋白链菌素182，随后将盘自旋，以从盘110的表面完全去除水分(图20C)。将参比标记或参比点202沉积在第一捕获区141之上，并将生物素化的原发抗体188沉积在每个连续捕获区140之上(图20D和20E)。然后将盘110在湿气室中于室温下温育30分钟。用PBS冲洗去除未结合的抗体188，并将盘110自旋，以去除表面水分(图20F)。将粘合部件118固定到活性层144(图20G)上。盖盘或帽部分116(图2)可以由聚碳酸脂形成，并且最好在底部涂有反射性表面146(如图4所最佳示出的)。将盖盘116整体固定到粘合部件118上，借此在盘内形成流动通道130(图20G)。将阻断剂204，例如StabilGaurd，注入每个流动通道或分析室130内，以便迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余的非特异结合位点(图20H)。将盘110在湿气室中于室温下温育一段预定的时间(优选的是30分钟)，并通过真空完全去除任何剩余溶液(图20I)。
本发明第一实施方式的第二实施例涉及不用交联系统将捕获剂固定在生物盘110的流动通道130内的反射盘110的构造。在这个实施例中，将参比标记或参比点202沉积在第一窗口141之上，而将未生物素化的原发抗体188(图18F)直接沉积在每个连续捕获区140之上的活性层144(图20A)上。然后，将盘110在湿气室中于室温下温育最好30分钟(图20E)。用PBS冲洗去除未结合的抗体188，并将盘110自旋，以去除表面水分(图20F)。将粘合部件118固定到活性层144上。盖盘或帽部分116(图2)可以由聚碳酸脂形成，并且最好在底部涂有反射性表面146(如图4所最佳示出的)。使盖盘116整体固定到粘合部件118上，借此在盘内形成流动通道130(图20G)。将阻断剂204，例如StabilGaurd，注入到每个流动通道或分析室130内，以便迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余非特异性结合位点(图20H)。将盘110在湿气室中于室温下温育30分钟，并通过真空完全去除剩余的溶液(图20I)。图21是不使用交联系统的所完成的反射盘110的截面图。
本发明第一实施方式的第三实施例涉及用交联系统将捕获剂固定在生物盘110的流动通道130内的透射盘110的构造。在这个实施例中，基底120、没有观察窗200的半反射层143(图20A)、和活性层144如图5所示。抗生蛋白链菌素182、生物素化的原发抗体188、参比点202和阻断剂204的沉积如上所述，并如图20B-20H所示。将相应的粘合部件118固定到活性层144上。光学透明的盖盘或帽部分116(图5)可以由聚碳酸脂形成。将盖盘部分116整体固定到粘合部件118上，借此在盘110内形成流动通道130(图20G)。图22是采用交联系统的所完成的透射生物盘110的截面图。应该理解，第一实施方式的第四实施例可以由本领域的技术人员构造。第四实施例涉及不使用交联系统将捕获剂固定在生物盘110(图21和22)的流动通道内的透射盘110的构造。
实施方式II
图23A-23D图示出本发明的第二实施方式中的分析物捕获。图23A和23B表示出利用原发抗体188(图18F)对CD4+T细胞190和CD8+T细胞194的捕获。将原发抗体188结合到通过交联剂抗生蛋白链菌素182固定在生物盘110(图4和9)的活性层144上的生物素化继发抗体186(图18E)上。图23C和23D表示出本发明同一实施方式中没有交联系统的另一实施例。在这个实施例中，将继发抗体186直接固定到生物盘110的活性层144上。
图24A-24L是表示本发明第二实施方式的一个实施例的构造的截面图。第一实施例涉及利用交联系统将捕获剂固定在生物盘110的流动通道130内的反射盘的构造。参照图24A，该图表示出光学生物盘110的透光基底120、反射层142和活性层144。将部分反射层142去除(或者当沉积时产生开口)，以制造观察窗200，通过观察窗200光线可以指向抗体将被固定到其上的捕获区140的位置。图24A表示出5个这样的捕获区140，其中将第一个指定为捕获区141。活性层144最好是聚苯乙烯的，它被旋涂在反射层142之上，以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。然后，将抗生蛋白链菌素182沉积在每个捕获区140和141之上，并将盘110在湿气室中于室温下温育约30分钟(图24B)。冲洗盘110，以去除未结合的抗生蛋白链菌素182，随后将盘自旋，以从盘110的表面完全去除水分(图24C)。将参比标记或参比点202沉积在第一捕获区141上，并将生物素化的继发抗体186沉积在每个连续捕获区140上(图24D和24E)。然后，将盘110在湿气室中于室温下温育最好30分钟(图24E)。用PBS冲洗去除未结合的继发抗体186，并将盘110自旋，以去除表面水分(图24F)。随后将原发抗体188(图18F)沉积在每个捕获区140上(图24G)。然后，将盘110在湿气室中于室温下培育约30分钟(图24H)。用PBS冲洗去除未结合的原发抗体188，并将盘110自旋，以去除表面水分(图24I)。将相应的粘合部件118固定到活性层144上。盖盘或帽部分116(图2)同样可以由聚碳酸脂形成，并且最好在底部涂有反射性表面146(如图4所最佳示出的)。将盖盘116整体固定到粘合部件118上，借此在盘内形成流动通道130(图24J)。将阻断剂204，例如StabilGaurd，注入每个流动通道130内，以便迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余的非特异性结合位点(图24K)。将盘110在湿气室中于室温下温育30分钟，并通过真空完全去除剩余溶液(图24L)。
本发明第二实施方式的第二实施例涉及不用交联系统将捕获剂固定在生物盘110的流动通道130内的反射盘110的构造。在这个实施例中，将参比标记或参比点202沉积在第一窗口141之上，并将未生物素化的继发抗体186(图18D)直接沉积在每个连续捕获区140之上的活性层144(图24A)上。然后将盘110在湿气室中于室温下温育30分钟(图24E)。用PBS冲洗去除未结合的继发抗体186，并将盘110自旋，以去除表面水分(图24F)。随后将原发抗体188(图18F)沉积在每个捕获区140之上(图24G)。然后将盘110在湿气室中于室温下温育30分钟(图24H)。用PBS冲洗去除未结合的原发抗体188，并将盘110自旋，以去除表面水分(图24I)。将粘合部件118固定到活性层144上。与前面的实施例相同，本实施例的盖盘或帽部分116可以由聚碳酸脂形成，并且最好在底部涂有反射性表面146(如图4多最佳示出的)。将盖盘或帽部分116整体固定到粘合部件118上，借此在盘内形成流动通道130(图24J)。将阻断剂204，例如StabilGaurd，注入每个流动通道130内，以便迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余的非特异性结合位点(图24K)。在这个实施例中将盘110在湿气室中于室温下温育最好30分钟，并通过真空完全去除剩余溶液(图24L)。图25表示不采用交联系统所完成的反射盘110的截面图。
本发明第二实施方式的第三实施例涉及利用交联系统将捕获剂固定在生物盘110的流动通道130内的透射盘110的构造。在这个实施例中，基底120、没有观察窗200的半反射性层143(图24A)、和活性层144如图5所示。抗生蛋白链菌素182、生物素化的继发抗体186、原发抗体188、参比点202和阻断剂204的沉积如上所述，并如图24B-24K所示。将粘合部件118以相似的方法固定到活性层144上。光学透明的盖盘或帽部分116(图5)可以由聚碳酸脂形成。将盖盘116整体固定到粘合部件118上，借此在盘内形成流动通道130(图24J)。图26是利用交联系统所完成的透射生物盘110的截面图。应该理解，第二实施方式的第四实施例可以由本领域的技术人员构造。第四实施例涉及不采用交联系统将捕获剂固定在生物盘110(图21和22)的流动通道内的透射盘110的构造。
实施方式III
图27A-27D图示出按照本发明第三实施方式的分析物捕获。图27A和27B表示出利用原发抗体188(图18F)对CD4+T细胞190和CD8+T细胞194的捕获。将原发抗体188结合到继发抗体186(图18D)上，而使继发抗体186结合到DCHO 198的一个链上，以形成如图28A所示的DCHO-抗体复合物199。DCHO-抗体复合物199可以包含一种或多种通过DCHO198交联的抗体。通过一些继发抗体186与生物盘110(图4和9)的活性层144的结合，而将DCHO-抗体复合物199固定在活性层144上。图27C和27D表示出本发明同一实施方式中没有继发抗体186的另一实施例。在这个实施例中，将原发抗体188直接结合到DCHO上，以形成DCHO-抗体复合物199，将DCHO-抗体复合物199固定到生物盘110的活性层144上。
图28A是制备抗体-DCHO复合的流程图，而图28B-28J是表示本发明第三实施方式的一个实施例的构造的多个图。该第三实施方式的第一实施例涉及利用交联剂DCHO交联两种或更多种捕获剂的反射盘的构造。图28A表示出DCHO-抗体复合物199的制备过程。将等浓度的DCHO 198和继发抗体186混合并使其结合，借此形成DCHO-抗体(继发)复合物199。参照图28B，该图表示出光学生物盘110的透光基底120、反射层142和活性层144。将部分反射层142去除(或者当沉积时产生开口)，以制造观察窗200，通过观察窗200光线可以指向抗体将被固定到其上的捕获区140的位置。图28B表示出5个这样的捕获区140，其中将第一个指定为捕获区141。活性层144最好是聚苯乙烯的，它被旋涂在反射层142之上，以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。然后将DCHO-抗体(继发)复合物199沉积在每个捕获区140之上，并且在这个具体实施例中将盘110在湿气室中于室温下温育30分钟(图28C)。冲洗盘110，以去除未结合的DCHO-抗体(第二)复合物199，随后将盘自旋，以从盘110的表面完全去除水分(图28D)。将参比点202沉积在第一捕获区141上，并将原发抗体188沉积在每个连续捕获区140上(图28E)。然后将盘110在湿气室中于室温下温育30分钟(图28F)。用PBS冲洗去除未结合的原发抗体188，并将盘110自旋，以去除表面水分(图28G)。将粘合部件或通道层118固定到活性层144上。与上述实施例相同，通常图2所示的盖盘或帽部分116可以由聚碳酸脂形成，并且最好在底部涂有反射性表面146(如图4所最佳示出的)。在本实施例中，将盖盘或帽部分116整体固定到粘合部件118上，借此在盘内形成流动通道130(如图28H所示)。将阻断剂204，例如StabilGaurd，注入每个流动通道或分析室130内，以便迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余的非特异性结合位点。该步骤显示在图28I中。在本实施例中，将盘110在湿气室中于室温下温育约30分钟，并通过真空完全去除剩余溶液(如图28J所示)。
按照本发明的制造方面，图28A-28J还表示出一种用于执行簇标示计数的光学测定盘的制造方法。这种制造光学测定盘的方法包括以下步骤：在试管中提供交联剂，然后将捕获剂加入到该试管中，使交联剂与捕获剂结合(形成一种复合物)；提供基底，用活性层涂覆该基底，然后将复合物沉积到活性层上；以及用粘合部件将盖盘或帽部分固定到活性层上。在这个实施例中，交联剂为醛活化葡聚糖。捕获剂用于与细胞表面抗原结合。在另一实施例中，捕获剂用于与对细胞表面抗原具有选择性亲和力的第一捕获剂结合。在一个优选实施例中，从抗原的CD族中单独选择细胞表面抗原。在更优选的实施例中，从由CD3、CD4、CD8和CD45构成的组中单独选择细胞表面抗原。
本发明第三实施方式的第二实施例涉及不用继发抗体将第一捕获剂固定在生物盘110的流动通道130内的反射盘110的构造。在这个实施例，将浓度的DCHO 198和原发抗体188混合，并使之结合，借此形成图28A所示的DCHO-抗体(原发)复合物199。将参比标记或参比点202沉积在第一窗口141上，并将DCHO-抗体(原发)复合物199沉积在每个连续捕获区140之上的活性层144(图28C)上。然后将盘110在湿气室中于室温下温育最好30分钟，并用PBS冲洗去除DCHO-抗体(原发)复合物199。将盘110自旋，以去除表面水分(如图28D所示)。将粘合部件或通道层118类似地固定到活性层144上。盖盘或帽部分116可以由聚碳酸脂形成，并且最好在底部涂有反射性表面146(如图4所最佳示出的)。将盖盘116整体固定到粘合部件118上，借此在盘内形成流动通道130(如图28H所示)。将阻断剂204，例如StabilGaurd，注入每个流动通道或分析室130内，以便迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余的非特异性结合位点(图28I)。将该盘在湿气室中于室温下温育约30分钟，并通过真空完全去除剩余溶液(如图28J所示)。图29是不使用继发抗体所完成的反射盘110的截面图。
本发明第三实施方式的第三实施例涉及利用交联剂DCHO将捕获剂固定在生物盘110的流动通道130内的透射盘110的构造。在这个实施例中，基底120、没有观察窗200的半反射层143(图28B)、和活性层144如图5所示。DCHO-抗体(第二)复合物199、原发抗体188、参比点202和阻断剂204的沉积如上所述，并如图28C-28I所示。将粘合部件或通道层118固定到活性层144上。光学透明的盖盘或帽部分116(图5)可以由聚碳酸脂形成。将盖盘或帽部分116整体固定到粘合部件118上，借此在盘110内形成流动通道130。图30是利用DCHO-抗体(第二)复合物199和原发抗体188所完成的透射生物盘110的截面图。应该理解，第三实施方式的第四实施例可以由本领域的技术人员构造。第四实施例涉及不用继发抗体将第一捕获剂固定在生物盘110(图29和30)的流动通道内的透射盘110的构造。其它实施例可能涉及用抗生蛋白链菌素182(图18A)和生物素184(图18B)将原发或继发抗体固定到生物盘110的活性层144上。然后使所固定的抗体(原发和继发抗体)与DCHO 198复合，以增加生物盘110的流动通道130内的捕获剂的浓度。
实施方式IV
图31A为光学生物盘110的顶视图，该图表示出四个射流回路128，每个射流回路具有特异性细胞表面标志物的几个捕获区140和一个阴性对照区。如图所示，将每个射流回路专门具有特异性针对CD3、CD4、CD8和CD45的捕获区140。可以采用任何其它所需图案或组合的细胞表面抗原，例如其它的CD标志物或细胞表面标志物。在这个具体实施例中，对于每个单独的射流回路而言，在每个捕获区140中仅需要具有一个公共捕获剂。图31A所示的盘特别适用于图31B-31E、44A-44D、45和46所示的细胞捕获化学和方法。图31A所示的生物盘110可以是反射盘或透射盘。
现在参照图31B-31E，该图表示出在本发明第四实施方式中的分析物捕获。图31B和31C表示出利用CD4+细胞190和CD8+细胞194的继发抗体186的捕获，这些细胞与原发抗体188(图18F)预先结合，以形成原发抗体-细胞复合物。使原发抗体188结合到通过交联剂抗生蛋白链菌素182固定在生物盘110(图4和9)的活性层144上的生物素化继发抗体186(图18E)上。图31D和31E表示出本发明同一实施方式中没有交联系统的另一实施例。在这个实施例中，将继发抗体186直接固定到生物盘110的活性层144上。
图32A-32I是本发明第四实施方式的一个实施例的构造的截面图。第一实施例涉及利用交联系统将捕获剂固定在生物盘的流动通道内的反射盘的构造。参照图32A，该图表示出光学生物盘110的透光基底120、反射层142和活性层144。将部分反射层142去除(或者当沉积时产生开口)，以制造观察窗200，通过观察窗200光线可以指向抗体将被固定到其上的捕获区140的位置。图32A表示出5个这样的捕获区140，其中将第一个指定为捕获区141。活性层144最好是聚苯乙烯的，它被旋涂在反射层142之上，以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。然后将抗生蛋白链菌素182沉积在每个捕获区140和141之上，并将盘110在湿气室中于室温下温育约30分钟(如图32B所示)。冲洗盘110，以去除未结合的抗生蛋白链菌素182，随后将盘自旋，以从盘110的表面完全去除水分(如图32C所示)。将参比标记或参比点202沉积在第一捕获区141上，并将生物素化的继发抗体186沉积在每个连续捕获区140上(如图32D和32E所示)。然后将盘110在湿气室中于室温下温育大约30分钟。该步骤如图32E所示。用PBS冲洗去除未结合的继发抗体186，并将盘110自旋，以去除表面水分。该步骤如图32F所示。将粘合部件或通道层118类似地施加到活性层144上。相应的盖盘或帽部分116最好由聚碳酸脂形成，并且在底部涂有反射性表面146(如图4所最佳示出的)。将盖盘116整体固定到粘合部件118上，借此在盘内形成流动通道130(如图32G所示)。将阻断剂204，例如StabilGaurd，注入每个流动通道或分析室130内，以便迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余的非特异性结合位点，这一步骤显示在图32H中。将盘110在湿气室中于室温下温育最好30分钟，并通过真空完全去除剩余溶液(如图32I所示)。
本发明第四实施方式的第二实施例涉及不用交联系统将捕获剂固定在生物盘110的流动通道130内的反射盘110的构造。在这个实施例中，将参比标记或参比点202沉积在第一窗口141上，并且如图18D所示，将未生物素化的继发抗体186直接沉积在每个连续捕获区140之上的活性层144上。然后将盘110在湿气室中于室温下温育30分钟。用PBS冲洗去除未结合的继发抗体186，并将盘110自旋，以去除表面水分。将粘合部件118固定到活性层144上。盖盘或帽部分116可以由聚碳酸脂形成，并且最好在底部涂有反射性表面146(如图4所最佳示出的)。将盖盘116整体固定到粘合部件118上，借此在盘内形成流动通道130。将阻断剂204，例如StabilGaurd，注入每个流动通道或分析室130内，以便迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余的非特异性结合位点。将盘110在湿气室中于室温下温育约30分钟，并通过真空完全去除剩余溶液。图33是不采用交联系统所完成的反射盘110的截面图。
本发明第四实施方式的第三实施例涉及利用交联系统将捕获剂固定在生物盘110的流动通道130内的透射盘110的构造。在这个实施例中，基底120、没有观察窗200的半反射层143(图32A)、和活性层144如图5所示。抗生蛋白链菌素182、生物素化原发抗体188、参比点202和阻断剂204的沉积如上所述，并如图32B-32H所示。将粘合部件118固定到活性层144上。光学透明的盖盘或帽部分116(图5)可以由聚碳酸脂形成。将盖盘116整体固定到粘合部件118上，借此在盘110内形成流动通道130(图32G)。图34是用交联系统所完成的透射生物盘110的截面图。应该理解，第四实施方式的第四实施例可以由本领域的技术人员构造。第四实施例涉及不利用交联系统将第二捕获剂固定在生物盘110(图33和34)的流动通道内的透射盘110的构造。
簇标示计数-实施方式I
图35A是光学生物盘110的顶视图，该图表示出四个射流回路128，每个射流回路具有四种不同的特异性细胞表面标志物的几个捕获区140和一个阴性对照区。如图所示，使每个射流回路专门具有四个分别针对CD3、CD4、CD8和CD45的捕获区140。可以采用任何其它所需图案或组合的细胞表面抗原，例如其它的CD标志物或细胞表面标志物。在这个具体实施例中，不限制对每个单独的射流回路而言，在每个捕获区140中只需仅有一个公共捕获剂。相反，在这个实施方式中，需要具有带不同捕获剂的捕获区。例如，这些捕获区可以按至少具有2×2矩阵的阵列格式排列。图35A所示的盘特别适用于图35B-35D、36、37、38A-38C、39、40、41A-41C、42和43所示的细胞捕获化学和方法。图35A所示的生物盘110可以是反射盘或透射盘。
接下来参照图35B-35D，该图表示出利用本发明第一实施方式的生物盘对纯化和冲洗后的MNC试样(图17A)进行的分析。用MNC试样充满生物盘110的流动通道130(如图35B所示)。将毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与原发抗体188的接触。如图35C所示，使原发抗体与试样中存在的任何CD4+细胞190和CD8+细胞194接触，随后捕获这些细胞。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的T细胞的捕获区140(图20I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的CD4+细胞190和CD8+细胞194相互作用(如图35D所示)，并且使返回光束154反射到检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
图36表示出利用本发明第一实施方式的第二实施例，对与图35B-35D相同的试样进行的分析。用MNC试样充满生物盘110的流动通道130(图35B)。将毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与原发抗体188的接触。使原发抗体与试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图35C)接触，随后捕获这些细胞。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的T细胞的捕获区140(图20I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图35D)，并且使返回光束154反射到检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
图37表示出利用本发明第一实施方式的第三实施例，对与图35B-35D相同的试样进行的分析。用MNC试样充满生物盘110的流动通道130(图35B)。将毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与原发抗体188的接触。使原发抗体与试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图35C)接触，随后捕获这些细胞。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的T细胞的捕获区140(图20I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图35D)，并将透射光束156传送到检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
簇标示计数-实施方式II
现在参照图38A-38C，这些图表示出利用本发明第二实施方式的生物盘对纯化和冲洗后的MNC试样(图17A)进行的分析。用MNC试样充满生物盘110的流动通道130(如图38A所示)。将毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与原发抗体188的接触。原发抗体与试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194接触，随后捕获这些细胞。该步骤表示在图38B中。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的T细胞的捕获区140(图24L)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(如图38C所示)，并且使返回光束154反射到检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
图39表示出利用本发明第二实施方式的第二实施例，对与图38A-38C相同的试样进行的分析。用MNC试样充满生物盘110的流动通道130(图38A)。使毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与原发抗体188的接触。原发抗体与试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图38B)接触，随后捕获这些细胞。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的T细胞的捕获区140(图24L)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图38C)，并且使返回光束154反射到检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
图40表示出利用本发明第二实施方式的第三实施例，对与图38A-38C相同的试样进行的分析。用MNC试样充满生物盘110的流动通道130(图38A)。使毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与原发抗体188的接触。原发抗体与试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图38B)接触，随后捕获这些细胞。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的T细胞的捕获区140(图24L)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图38C)，并且将透射光束156传送到检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
簇标示计数-实施方式III
接下来参照图41A-41C，这些图表示出利用本发明第三实施方式的生物盘，对纯化和冲洗后的MNC样品(图17A)进行的分析。用MNC试样充满生物盘110的流动通道130(图41A)。使毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与原发抗体188的接触。原发抗体与试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194接触，随后捕获这些细胞。本方法的此步骤如图41B所示。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的T细胞的捕获区140(图28J)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图41C)，并且使返回光束154反射到检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
图42表示出利用本发明第三实施方式的第二实施例，对与图41A-41C相同的试样进行的分析。用MNC试样充满生物盘110的流动通道130(图41A)。使毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与原发抗体188的接触。原发抗体与试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图41B)接触，随后捕获这些细胞。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的T细胞的捕获区140(图28J)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图41C)，并使返回光束154反射到检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
图43表示出利用本发明第三实施方式的第三实施例，对与图41A-41C相同的试样进行的分析。用MNC试样充满生物盘110的流动通道130(图41A)。使毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与原发抗体188的接触。原发抗体与试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图41B)接触，随后捕获这些细胞。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的T细胞的捕获区140(图28J)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图41C)，并且将透射光束156传送到检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
簇标示计数-实施方式IV
现在参照图44A-44D，这些图表示出利用本发明第四实施方式的生物盘对纯化和冲洗后的MNC试样(图17A)进行的分析。图44A是制备原发抗体-T细胞复合物的流程图。将包含CD4+T细胞190和CD8+T细胞194的MNC悬浮液与原发抗体188混合，并使之结合，借此形成原发抗体-T细胞复合物。正如本领域的技术人员所显而易见的，利用本实施方式也可以标记带有不同表面标志物的其它细胞。如图44B所示，用原发抗体-T细胞复合物充满生物盘110的流动通道130。将毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与生物盘110的活化层144上所固定的继发抗体188的接触。对原发抗体-T细胞复合物具有亲和力的继发抗体186捕获该复合物(如图44C所示)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的复合物的捕获区140(图32I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的复合物相互作用(如图44D所示)，并且使返回光束154反射到检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
图44A-44D还表示出本发明方法的另一主要方面。结合图17A，提供了另一种实施簇标示计数的方法。该方法包括以下步骤：(1)在包含分离梯度的试管中提供血样，(2)以足以将血样分离成层的时间和速度旋转试管，(3)再悬浮包含T细胞的MNC层，以形成MNC悬浮液，(4)将原发抗体加入到MNC悬浮液中，以形成原发抗体-T细胞复合物，(5)在包括至少一个捕获区(带有至少一种捕获剂)的盘表面上提供原发抗体-T细胞复合物的试样，(6)将盘载入光学读取器，(7)将电磁辐射的入射束指向捕获区，(8)检测在与盘的捕获区相互作用之后所形成的电磁辐射束，(9)将所检测的光束转换为输出信号，和(10)分析该输出信号，以提取与在捕获区处所捕获的细胞数量相关的信息。在该方法的一个实施例中，光学盘被构造成具有反射层，以使指向捕获区但不击中细胞的光线反射。在该方法的另一个实施例中，光学盘的构造使得指向捕获区但不击中细胞的光线通过光学盘透射。
图45表示出利用本发明第四实施方式的第二实施例，对与图44A-44D相同的试样进行的分析。用原发抗体-T细胞复合物充满生物盘110的流动通道130(图44B)。将毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与生物盘110的活化层144上所固定的继发抗体188的接触。对原发抗体-T细胞复合物具有亲和力的继发抗体186捕获该复合物(图44C)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的复合物的捕获区140(图32I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的复合物相互作用(图44D)，并且使返回光束154反射至检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
图46表示出利用本发明第四实施方式的第三实施例，对与图44A-44D相同的试样进行的分析。用原发抗体-T细胞复合物充满生物盘110的流动通道130(图44B)。将毛细管作用、用外部应用器施加的压力、和/或离心力(即，远离旋转中心或曲率或轴的曲线运动中的物体上的力)作用于试样上，以实现与生物盘110的活化层144上所固定的继发抗体188的接触。对原发抗体-T细胞复合物具有亲和力的继发抗体186捕获该复合物(图44C)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，以便清除未结合的复合物的捕获区140(图32I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与所捕获的复合物相互作用(图44D)，并将透射光束156传送到检测器157(图10)，以便进行处理和分析。
本领域的技术人员将根据这些教导理解，在不偏离本发明的领域的精髓和范围的情况下，可以组合本发明方法的一种或多种实施方式的一个或多个实施例。
细胞检测及相关软件
现在参照图47，该图表示出包括用于保持试样的射流回路128的光学生物盘110。图47还表示出放大的射流回路47，以便示出不同的捕获或目标区140和包括参比标记和参比点202的目标区141。在这个具体实施例中，采用5个捕获区140，每个俘获区分别用于捕获CD4+细胞、CD8+细胞、CD3+细胞、CD45+细胞和作为阴性对照的肌红蛋白。
图48A是从不同实施例获得的图像，该实施例包括6个捕获区140，其中每个捕获区分别用于捕获CD45+细胞、CD15+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、CD15+细胞的第二捕获区和CD45+细胞的第二捕获区。在这个实施例中，将两个CD45和CD15捕获区用作证实捕获效率和所期望的计数结果相符的验证对照或检查区。图48A还表示出一系列带有CD4、CD8和对照物的放大视图的细胞表面抗原。如本文所述，该图像是抵消背景场(background field)后所示出的许多细胞的图像。图48B是来自相对于按照本发明的生物盘衍生图像的实际显微镜图像的对照物、CD4和CD8捕获区的局部放大图。图49表示出实际显微镜图像和相应的按照本发明的生物盘图像的更详细的另一对比。如图48B和49所示，本发明人已经发现，生物盘图像与从显微镜获得的图像相比，二者的质量和分辨率是等同的。因此这些图像证明，利用本发明的设备和方法可以使得单个细胞相对于背景是可见的。检测调查特征的方法在以下文献中有更详细的说明：2001年2月2日和2001年5月18日提交的序列号为60/270,095和60/292,108的题目各为“获得在光学盘组件表面上所检测的调查特征的信号签名的信号处理设备和方法”(Signal Processing Apparatus and Methods forObtaining Signal Signatures of Investigational Features Detected ona Surface of an Optical Disc Assembly)的共同转让的美国临时申请，以及2002年1月10日提交的题为“包括用于生物和医学成像的相关方法的光学盘分析系统”(Optical Disc Analysis System IncludingRelated Methods for Biological and Medical Imaging)的共同转让的第10/043,688号美国专利申请，所有这些申请作为参考引入本文。
这些细胞能够通过各种不同方法之一进行检测，这些方法包括，例如，采用边缘检测硬件或软件来检测和计数透射或反射光水平中的足够大的变化，并因此计数该转变，并由此计数细胞。下文更详细说明的另一方法，利用图像和图案识别软件相对于背景来识别细胞。图像识别能够区分WBC和RBC，并且还能够区分嗜中性白细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜伊红性粒细胞、粒细胞和淋巴细胞。
带有数量级为1.6微米左右的信道的光学盘可以用于成像盘上的细胞或聚集体。例如，白细胞通常具有至少5和最多12信道的直径，因此可以获得白细胞的图像。
为了获得这种图像，可以采用图2、3和4所示类型的透射盘(虽然反射盘可操作)，和包括触发传感器160和顶部检测器158的图10所示类型的盘驱动系统。触发检测器158检测透射盘中的触发标记126，并提供信号至计算机，当标记被检测时计算机将收集和/或处理数据。当光源穿过观察窗中的信道时，就获得所接收的透射光的图像。在这种情况下，预部检测器可以是单检测器，或者是径向和/或周向定位的一排多个检测器部件。例如，这种检测器和检测方法在以下文献中有所描述：2000年11月9日提交的题为“生物光学盘的光学盘驱动器”(Optical Disc Drive for Bio-Optical Disc)的共同转让的第60/247,465号美国临时申请；2001年5月22日提交的题为“光学生物盘的盘驱动组件”(Disc Drive Assembly for Optical Bio-Discs)的第60/293,093号美国临时申请；和2001年11月9日提交的题为“使与光学生物盘一起使用的盘驱动器系统和方法”(Disc Drive System andMethods for Use with Bio-discs)的第10/008,156号美国专利申请，这些申请的全部内容通过引用结合在本文中。
在获得例如图48A、48B和49的图像之后，可以用设计为鉴定所需特征的图像识别软件进一步处理该图像数据。更需要的是，图像识别软件不仅具有区分细胞与背景的能力，而且具有区分一种类型的细胞与另一种类型的细胞的能力。
现在参照图50，该图表示出从包括红细胞和白细胞的调查数据中衍生出的图像。如该放大图所示，这些白细胞和红细胞具有清晰的独特特征，因此可以从背景中检测出来，并且用图像识别也可以互相区分开。此外，还可将白细胞类型彼此区分开，包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、嗜伊红性粒细胞、粒细胞和嗜碱性粒细胞。
图51表示出带有许多细胞的样品场(sample field)，各细胞带有加号表示每个对象被鉴定为细胞。在对每个区和任何数目的所需区检测细胞数量之后，所产生的细胞计数数据可在单个屏幕上显示出来，该屏幕提供容易观察的直观表示，例如图52所示。如图52所示，以柱状图的形式提供特定的细胞计数，以说明细胞的相对数目。在CD4/CD8分析的情况下，系统也可以产生CD4/CD8比率以及任何其它所需的数学计算或对比。图53提供了本过程的不同视图，表示图像场中的细胞被转换为CD4计数、CD8计数和比率，并带有指示比率处于正常范围的输出。
本发明有关细胞检测和相关处理方法的方面还公开在以下文献中：2001年8月31日提交的序列号为60/316,273的题为“免疫表型分型的捕获层组件和光学生物盘”(Capture Layer Assemblies andOptical Bio-Discs for immunophenotyping)的美国临时申请；2001年9月7日提交的序列号为60/318,026的题为“血细胞、血载寄生虫和病原体及其它生物物质的成像方法以及相关的光学生物盘和驱动部件”(Methods for Imaging Blood cells，Blood-Borne Parasites andPathogens，and Other Biological Matter Including Related OpticalBio-Discs and Drive Assemblies)的美国临时申请；2001年9月14日提交的序列号为60/322,527的题为“包括执行细胞计数的微射流回路的光学分析盘”(Optical Analysis Discs including MicrofluidicCircuits for Performing Cell Counts)的美国临时申请；2001年9月11日提交的序列号为60/322,040的题为“包括用于光学成像和定量评价包括淋巴细胞的血细胞的射流回路的光学分析盘”(Optical AnalysisDiscs Including Fluidic Circuits for Optical Imaging and QuantitativeEvaluation of Blood Cells Including Lymphocytes)的美国临时申请；2001年9月12日提交的序列号为60/322,863的题为“包括白细胞的分类细胞计数方法和执行该方法的光学生物盘的应用”(Methods forDifferential Cell Counts Including Leukocytes and Use of OpticalBio-Disc for Performing Same)的美国临时申请；和2001年9月17日提交的序列号为60/322,793的题为“利用包括肝素、血浆或聚赖氨酸的带电物质减少光学生物盘上的细胞非特异结合的方法”(Methodsfor Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-DiscsUtilizing Charged Matter Including Heparin，Plasma，or Poly-Lysine)的美国临时申请中，所有这些申请作为参考结合在本文中。
分类细胞计数方法和相关软件
这里进一步详细说明用光学盘数据进行的白细胞计数的许多方法和相关算法。这些方法和相关算法并不限于计数白细胞，而是可以容易地用于执行任何类型的细胞物质的计数，这些细胞物质包括(但不限于)红细胞、白细胞、珠(beads)和产生类似的可以通过光学读取器来检测的光学特征(signature)的任何其它生物和非生物物体。
为了说明的目的，正如参照图54-58所描述的，以下对与本发明相关的方法和算法的描述是指白细胞计数。经过一些修改，这些方法和算法可用于计数其它类型的细胞、或大小与白细胞类似的物体。这里对细胞计数方法和算法的数据评价方面进行一般性描述，以便为本发明的方法和设备提供相关背景。捕获并处理来自光学生物盘的调查数据的方法和算法通常具有广泛的适用性并且已经更详细地公开在以下文献中：2001年5月16日提交的题为“光学生物盘组件中的分析结果的透射象素的可变抽样控制和相关设备”(Variable SamplingControl for Rendering Pixelatlon of Analysis Results In OpticalBio-Disc Assembly And Apparatus Relating Thereto)的共同转让的第60/291,233号美国临时专利申请，其作为参考引入本文；和上文引入的题为“包括用于执行分类细胞计数的相关设备和软件的分类细胞计数方法”(Methods for Differential Cell Counts Including RelatedApparatus And Software For Performing Same)的第60/404,921号美国临时专利申请。在下面的讨论中，示出了带有简要解释的这些方法和算法的基本方案。如图10所示，将有关生物试样属性的信息以一束电磁辐射的形式从光学生物盘110中提取出来，其中这束电磁辐射通过与试样的相互作用已经被修改或调制。在结合图2、3、4、11、13和15所描述的反射性光学生物盘的情况下，返回光束154携带有关生物试样的信息。如上所述，实质上仅当入射束在流动通道或分析室130或目标区140内并因此与试样接触时，这种有关生物试样的信息才被包含在返回光束中。在生物盘110的反射实施例中，返回光束154也可以携带被编码在反射层142之中或之上或者被编码在图13和14所示的摆动槽170中的信息。正如本领域技术人员所清楚的那样，仅当相应的入射束与反射层142接触时，预记录的信息才被包含在带有目标区的反射盘的返回光束154中。当入射束152处于信息承载反射层142被去除或者不存在的区域中时，这种信息不被包含在返回光束154中。在结合图5、6、8、9、12、14和16所描述的透射性光学生物盘的情况下，透射光束156携带有关生物试样的信息。
继续参照图10，有关生物试样的信息无论是从反射盘的返回光束154还是从透射盘的透射光束156获得的，其都指向用于信号处理的处理器166。该处理涉及用底部检测器157(反射盘)或顶部检测器158(透射盘)所检测到的模拟信号向不连续数字形式的转换。
接下来参照图54，信号转换涉及以固定的时间间隔212抽样模拟信号210，并编码相应的信号瞬时模拟振幅214作为不连续的二进制整数216。抽样在某起始时间218开始并在某终止时间220结束。与任何模拟-数字转换过程相关的两个公值是抽样频率和位深(bitdepth)。抽样频率，也称为抽样速率，是每单位时间所取的样品数。较高的抽样频率获得连续样品之间的较小时间间隔212，这导致数字信号222相比于原始模拟信号210具有较高的保真度。位深是编码模拟信号210的抽样振幅214的每个样品点中所用的位(bit)数。位深越大，二进制整数216将越接近原始模拟振幅214。在本实施例中，在位深为12比特/样品的情况下，抽样速率为8MHz，因此使整数样品范围为0至4095(0至(2n-1)，其中n为位深。在其它实施例中这种组合可以改变，以适应特定的精度要求。通过借助于实例(而不是限定)，在涉及通常小于细胞的珠的计数方法的实施例中，可要求增加抽样频率。然后将抽样数据送至处理器166，用于进行模拟-数字转换。
在模拟-数字转换过程中，沿激光光路的每个连续样品点224作为一维阵列226被连续地存储在盘上或存储器中。每个连续信道提供独立的一维阵列，这产生类似于图像的二维阵列228(图57A)。
图55是带有局部的放大细节透视图的本发明光学生物盘110的透视图，该局部指示出相对于光学生物盘的信道232定位的捕获白细胞230。如图所示，入射束152与白细胞230的相互作用产生包含信号的光束，该光束既可是反射盘的返回光束154的形式，也可是透射盘的透射光束156的形式，该光束被检测器157或158检测。
图56A是相对于图55所示光学生物盘110的信道232而定位的捕获白细胞230的另一图示。如图55和56A所示，白细胞230覆盖大约四个信道A、B、C和D。图56B表示由图55和图56A的白细胞210所衍生的一系列特征(signature)轨迹。如图56B所示，检测系统提供相对于信道A、B、C和D的四个模拟信号A、B、C和D。如图56B进一步所示的，每个模拟信号A、B、C和D携带有关白细胞230的特定信息。因此如图所示，在白细胞230上的扫描产生可以能够检测和处理的入射束的独特扰动。模拟特征轨迹(信号)210随后被指向处理器166，以便转换为图57A和57C所示的模拟数字信号222(正如下文更详细描述的)。
图57图示出57A、57B、57C和57D之间的关系。图57A、57B、57C和57D图示出从图56B的特征轨迹到数字信号222的转变，该数字信号作为一维阵列226存储，并被合并为用于数据输入244的二维阵列228。
现在具体参照图57A，该图表示来自图55和56A所示光学生物盘的信道A和B的抽样模拟信号210。随后处理器166编码模拟信号210的相应瞬时模拟振幅214作为不连续二进制整数216(参见图54)。所产生的系列数据点是类似于抽样模拟信号210的数字信号222。
接下来参照图57B，来自信道A和B(图57A)的数字信号222作为独立的一维存储器阵列226存储。每个连续信道提供相应的一维阵列，该阵列在与前面的一维阵列结合时，产生类似于图像的二维阵列228。然后，该数字数据作为样品点224(图54)的二维阵列228存储在存储器中或盘上，其中样品点224代表样品区中特定点处的返回光束154或透射光束156(图55)的相对强度。随后，将该二维阵列以图57B所示的原始文件或图像文件240的形式存储在存储器中或盘上。然后将存储在图像文件240中的数据242提取到存储器中，并用作传送到分析仪168(如图10所示)的数据输入244。
图57C表示来自图55和56A所示光学生物盘的信道C和D的抽样模拟信号210。随后，处理器166编码模拟信号210的相应瞬时模拟振幅214作为不连续二进制整数216(图54)。所产生的系列数据点是类似于抽样模拟信号210的数字信号222。
现在参照图57D，来自信道C和D的数字信号222作为独立的一维存储器阵列226来存储。每个连续信道提供相应的一维阵列，该阵列在与前面的一维阵列结合时，产生类似于图像的二维阵列228。如上所述，该数字数据随后作为样品点224(图54)的二维阵列228存储在存储器中或盘上，其中样品点224代表样品区中特定点处的返回光束154或透射光束156(图55)的相对强度。该二维阵列随后以图57B所示原始文件或图像文件240的形式存储在存储器中或盘上。如上所述，然后，将存储在图像文件240中的数据242提取到存储器中，并用作传送到分析仪168(图10)的数据输入244。
将本发明的计算和处理算法存储在分析仪168(图10)中并应用于输入数据244，以产生可以显示在显示监视器114(图10)上的有用输出结果262(图58)。现在参照图58，该图表示按照本发明的处理方法和计算算法的数据评价的主要步骤的逻辑流程图。该处理方法的第一主要步骤涉及输入数据244的接收。如上所述，数据评价以范围为0至4096的整数阵列开始。
接下来的主要步骤246选择用于计数的盘区域。一旦该区域被限定，目标就变为对限定区域内所包含的所有白细胞进行实际计数。步骤246的实施是根据盘的构造和用户的选择而定。通过借助于实例(而不是限定)，即采用带有窗口(例如图2和5所示的目标区140)的盘的本发明的实施例，该软件识别这些窗口并剪切其中的一部分用于分析和计数。在一个优选实施例中，例如图2所示，目标区或窗口具有在其每一端带半圆形部分的1×2mm矩形形状。在这个实施例中，软件在相应的窗口内截取1×2mm的标准矩形区域。在该实施例的一个方面，读取器可以取几个连续样品值，以便与几个不同窗口中的细胞数目进行比较。
在采用无窗口的透射盘的本发明的实施例中，如图5、6、8和9所示，步骤246可以两种不同方法之一来实施。通过相对于具有固定坐标的一点来定位其中心，或者通过找出参比标记202(暗染料点)(参见例如图24L、25和26)，来选择标准矩形的位置。在采用参比标记202的情况下，将具有所需对比度的染料相对于两簇细胞沉积在盘上特定的位置141(例如图20E)上。然后使光学盘读取器滑向细胞簇之一的中心，并且使标准矩形随后居于所选择的簇的中心。
至于上述关于步骤246的用户选择，用户可以通过用鼠标选择或者其它方式的直接相互作用，指定细胞计数所需的样品区形状，例如矩形区。在该软件的此实施例中，这涉及到用鼠标单击并拖动矩形覆盖显示在监视器114上的光学生物盘衍生图像的所需部分。不管评价区域选择方法如何，在随后的步骤248中评价相应的矩形区域，以便进行计数。
图58中的第三主要步骤为步骤248，该步骤用于使背景照明均匀化。该过程纠正由某些硬件配置所导致的可能的背景不均匀波动。背景照明均匀化补偿每个样品点的强度水平，以便使总背景、或者不是细胞的图像部分接近带有任意背景值Vbackground的平面。而Vbackground可以多种方式来决定，例如取标准矩形样品区上的平均值，在本实施例中，该值被设定为2000。在所选择矩形样品区的每个点P处的值V可以用数字(Vbackground+(V-P的相邻点上的平均值))来替换，并且如果必要的话，可舍位，以适应数值的实际可能范围，在本发明的优选实施例中该范围是0至4095。选择相邻点的尺寸，以便充分大于细胞尺寸而充分小于标准矩形的尺寸。
图58的流程图的下一步骤为标准化步骤250。在执行标准化步骤250时，用标准矩形样品区中的数据来实施线性转换，以使平均值变为2000，标准偏差为600。如果必要的话，该值可舍位，以适合0至4096的范围。本步骤250，以及背景照明均匀化步骤248，使得软件对硬件的修改和调整更不敏感。通过借助于实例(而不是限定)，检测电路例如顶部检测器158(图55)中的信号增益，可以在不明显影响所获得的细胞计数的情况下改变。
如图58所示，接下来执行过滤步骤252。对于标准矩形中的每个点P而言，计算尺寸小于步骤248所表示的尺寸、且具有足以不同于Vbackground的值的P的相邻点的数量。所计算的点应该接近图像中的细胞尺寸。如果该数足够大，P处的值就保持不变；否则它就被指定为Vbackground。执行该过滤操作以去除噪音，并且在最佳情况下仅有细胞保持在图像中而背景均匀地等于Vbackground。
如图58所示，可以执行任选步骤254，该步骤用于去除有害部分。诸如划痕、气泡、沾污和其它类似不规则体之类的缺陷可以通过过滤步骤252。这些缺陷可以直接或通过影响图像柱状图中的总分布而导致细胞计数错误。通常，这些缺陷的尺寸比细胞足够大，并可以在如下的步骤254中去除。首先，形成与所选区域具有相同尺寸的二进制图像。如果原始图像的相应点处的值等于Vbackground，二进制图像中的A就被定义为白，否则为黑。接下来，提取黑点的连接部分。然后，使随后的腐蚀和膨胀用于调整这些部分的视图。并且最终，去除大于定义阈值的部分。在这个任选步骤的一个实施例中，通过指定原始图像中的相应样品点具有值Vbackground，而从原始图像中去除该部分。确定哪些部分构成可计数物体而哪些将被去除的阈值为用户定义值。该阈值也可以根据正在被计数的调查特征即白细胞、红细胞或者其它生物物质而变化。在任选步骤254之后，最好重复步骤248、250和252。
图58所示的下一主要步骤为步骤256，该步骤涉及利用亮中心计数细胞。计数步骤256由几个子步骤构成。第一子步骤包括执行卷积(convolution)。在该卷积子步骤中，形成被称作卷积图的辅助阵列。点P处的卷积图的值为，在P的环形相邻点中进行过滤之后的图像的集成结果。更精确地说，对于一个具体实施例，被集成的函数为，当v大于2000时等于v-2000而当v小于或等于2000时等于0的函数。在计数步骤256中所执行的下一子步骤为，在约为细胞尺寸的半径周边找出卷积图的局部最大值。接着，避免在互相紧邻点中复制带有相同值的局部最大值。在计数步骤256的最后子步骤中，剩余的局部最大值被声明用于标记细胞。
在一些硬件设置中，一些细胞在无亮中心的情况下出现。在这些情况下，仅有暗边是可见的，以下的两个任选步骤258和260是可用的。
步骤258涉及从图中去除所发现的细胞。在步骤258，用值2000填充围绕每个所发现细胞的中心的圆形区域，以便使带有亮中心和暗边的细胞不会被发现两次。
步骤260涉及利用暗边计数额外的细胞。在步骤258之后对图像进行两次转换。在本规程的第一子步骤，即子步骤(a)中，用(2000-v)替换各点的值v，并且如果该结果为负，它就用零替换。在子步骤(b)中，所产生的图随后用内径为R1和外径为R2的环卷积。R1和R2分别为细胞的最小和最大期望半径，随后，在子步骤(d)，该环被移动致左、右、上和下。在子步骤(c)，将这四个位移的结果合计。这种转换之后，暗边细胞的图像看起来象四瓣花。最后在子步骤(d)，子步骤(c)中所获得的函数的最大值在某种意义上被发现是计数步骤256中所采用的值。它们被声明用于标记在步骤256中所遗漏的细胞。
计数步骤256之后，或者在任选地采用计数步骤260之后，图58所示的最后主要步骤为结果输出步骤262。在标准矩形中所发现的细胞数被显示在图1和5所示的监视器114上，并且所鉴定的每个细胞用红十字标记在所显示的光学生物盘衍生图像上。
关于处理从光学生物盘测定中收集的数据的其它相关方面公开在2002年9月11日提出的序列号为10/241,512、题为“分类细胞计数方法，包括实施该方法的设备和软件”(Methods for DifferentialCell Counts Including Related Apparatus and Software PerformingSame)的共同转让的美国专利申请中。该申请就如同完全在本文中重复一样，全部引入本文作为参考。
从全血中分离T淋巴细胞的方法
需要一种从包括全血或单核细胞样品的细胞样品中分离T细胞或T淋巴细胞的方法，其中所述样品是利用以上结合图17所描述的梯度方法制备的。诸如，分离T淋巴细胞的一种方法是采用使不需要的细胞凝集和沉淀的生物活性试剂。这种方法的非限定性实例是用于分离T细胞的“生物富集和分离技术”(BEST)法。BEST法中所用的这种生物活性试剂被称作Prepacyte(BioE，St.Paul，MN)。通过有选择地去除不需要的细胞(包括粒细胞、血小板、单核细胞、B细胞和NK细胞)，Prepacyte将T细胞从包括全血和单核细胞的细胞样品中分离出来。利用Prepacyte法所分离的T细胞的百分回收率和纯度明显高于梯度法。通过采用对不需要的细胞具有亲和力的抗体，可介导不需要细胞的有选择去除。
利用Prepacyte的细胞制备过程需要花费30分钟。例如，利用以下工艺可从全血中分离T细胞。首先，将抗凝血与等量的Prepacyte混合。诸如，对于用于测定本发明的CD标志物的细胞制备，将1ml全血与1ml Prepacyte混合，以产生测定溶液。然后将该测定溶液轻轻混合约15分钟，以使不需要的细胞凝集。然后，将该测定溶液在试管架上直立放置大约15分钟，以使新凝集的不需要的细胞沉淀。在不需要的细胞沉淀之后，将含有T细胞的上清液然后去除并放置在新容器内。接下来在PBS中清洗T细胞。然后将清洗后的T细胞计数并在PBS中再悬浮到预定的细胞浓度。然后将T淋巴细胞悬浮液载入光学生物盘内，用于进行分析。
或者是，诸如，可以利用细胞捕获方法将包括T细胞的特定细胞族从细胞样品(包括全血)中分离出来。在该细胞捕获方法中，将针对不需要细胞的抗体结合到包括珠、生物介质或膜的固相上。然后使细胞样品通过固相并与之相互作用，从而使不需要的细胞结合到固相上，而仅有所需的细胞通过固相。关于利用生物介质进行细胞分离和纯化的其它方面的进一步细节公开在2002年3月18日提出的序列号为60/365,462、题为“在用于生物医药测定的光学生物盘分析室中分离全血成分的方法和设备”(Methods and Apparatus for SeparatingWhole Blood Components in an Optical Bio-disc Analysis Chamberfor use in Biomedical Asssays)的共同转让的美国临时申请中，该文献作为参考全部引入本文。
用于从包括全血和单核细胞的样品中分离感兴趣细胞的又一替换性方法是采用磁珠分离技术。在这种方法中，从样品中阳性或阴性地选择感兴趣的细胞。在阴性选择方法中，用特异于不需要细胞的抗体涂覆磁珠。然后使磁珠与样品混合并温育，以使磁珠结合到不需要的细胞上。接下来通过将样品暴露到磁场中而去除不需要的细胞。可在生物盘的射流回路内和/或利用磁光生物盘来完成不需要细胞的去除。相反，阳性选择采用具有针对感兴趣细胞类型的特异性抗体的磁珠。然后使磁珠与样品混合并温育，以使磁珠结合到不需要的细胞上。接下来通过将样品暴露到磁场中而从剩余样品中分离磁性标记的所需细胞类型。可在生物盘的射流回路内和/或利用磁光生物盘来完成感兴趣细胞的分离。例如，有关磁光生物盘的进一步细节公开在以下共同转让和共同待审的美国专利申请中：2002年3月14日提出的序列号为10/099,256、题为“包括相关方法和设备的利用可裂解的间隔和/或连接以提高特异性的双珠测定”(Dual Bead Assays using CleavableSpacers and/or Ligation to Improve Specificity including RelatedMethods and Apparatus)；和2002年3月14日提出的序列号为10/099,266、题为“限制酶和其它化学方法在减少双珠测定中的非特异性结合的应用以及用于检测医药靶物的相关生物盘、方法和系统设备”(Use of Restriction Enzymes and other Chemical Methods toDecrease Non-Specific Binding in Dual Bead Assays and RelatedBio-Discs，Methods，and System Apparatus for Detecting MedicalTargets)，这两件申请全部作为参考引入本文。有关用磁粒标记的细胞的分离细节公开在2002年7月25日提出的序列号为60/398,464、题为“光学生物盘细胞分选仪和分析仪”(Optical Bio-disc Cell Sorterand Analyser)的共同转让和共同待审的美国临时申请中，该申请作为参考全部引入本文。
用于分离细胞的又一种替换性方法利用微流室，该微流室通过与其成一体的筛分设备可用来分离或去除红细胞。具有大约5微米(μm)孔的筛允许红细胞通过并收集在废物室中。更大(＞5μm)的白细胞被挤压到测定室内，该室已经用针对辅助剂/诱导剂-抑制剂/毒素测定的特异性捕获抗体层化。这种具体的室设计具有两个相连的槽或室。其中一个室含有筛。将待分析的血样注入“筛”室。当血细胞与筛接触时，红细胞就穿过允许5μm或更小物体通过的筛。利用最佳离心力消除红细胞，而将留在筛上的白细胞压入“测定”室(已经涂有特异性捕获抗体)。温育30分钟以便使抗体-抗原相互作用之后，用激光光学装置读取盘并成像，然后用CD4CD8软件分析图像。
用于从全血中分离感兴趣细胞例如白细胞的再一种替换性方法，是在生物盘110中进行RBC溶解。溶解之后将剩下的白细胞材料驱赶到分析室内，该室已经用针对辅助剂/诱导剂-抑制剂/毒素测定的特异性捕获抗体层化。这种具体的射流回路可包括两个相连的槽或室。其中一个室可含有溶解缓冲剂(溶解室)。将待分析的血样注入“溶解”室并温育15分钟以便完全溶解。一旦溶解完成，就自旋盘，以便使剩余的白细胞能够通过分析室(已经涂有特异性捕获抗体)。在一段预定的温育时间之后，用激光光学装置读取盘并成像，然后用细胞分析系统分析图像。有关细胞分析系统的进一步细节诸如公开在以下申请中：分别于2002年2月13日、2002年4月11日和2002年9月9日提出的序列号为60/356,982、60/372,007和60/408,227、每个题为“包括相关方法的生物盘和生物驱动分析仪系统”(Bio-disc and Bio-driveAnalyser System including Methods Relating Thereto)的共同转让的美国临时申请；以及于2002年10月24日提出的序列号为10/279,677、题为“用于生物驱动的分段区域检测器及其相关方法”(SegmentedArea Detector for Biodrive and Methods Relating Thereto)的美国专利申请，和2002年9月11日提出的序列号为10/241,512、题为“分类细胞计数方法，包括实施该方法的设备和软件”(Methods forDifferential Cell Counts Including Related Apparatus and SoftwarePerforming Same)的美国专利申请。
如上所述，可以在光学生物盘的射流回路中来完成T细胞的分离。图59、60、61A、61B、61C、62A、62B和62C示出了可用来从样品中纯化感兴趣细胞的不同射流回路的实例。
参照图59，该图表示出用于从全血中分离T细胞的射流回路。在射流回路的这个实施例中，通过入口122将全血或MNC样品加入到混合室134内。然后，密封入口并以预定的速度将盘自旋，以便使样品中的细胞以这样的速率移动通过纯化室300：即，该速率使不需要的细胞有足够的时间结合到纯化室300中的捕获珠324上。捕获珠324上固定有针对不需要细胞的表面标志物的抗体。例如，捕获珠324上固定有针对NK细胞的抗-CD56、针对单核细胞的CD14、针对B细胞的CD19、针对血小板的CD9、CD31或CD41、以及针对粒细胞的CD13、CD31或CD43。因此，大部分不需要的细胞在纯化室300内被除去，而红细胞穿过纯化室300进入分析室130，在此处利用上述的方法来分析不同类型的T细胞。红细胞和过量的缓冲剂自旋到通道的底部，并且正常情况下不干扰测定。
接下来参照图60，该图示出了用于纯化和分析T细胞的射流回路，包括RBC溶解和白细胞纯化的步骤。在射流回路的这个具体实施例中，通过入口122将全血加入到混合室134内。然后，密封入口并以第一速度在盘驱动器内使盘自旋，以便使溶解阀304开启，而贮器303内的溶解缓冲器302中的溶解缓冲剂移入混合室134内并与血样混合。该第一速度应该不会导致阀306开启。然后可利用盘驱动器振摇盘，以增大溶解效率。在溶解步骤之后，接下来以第二速度使盘自旋，该速度足以打开阀306和310，由此移动样品并使缓冲剂贮器309内的分析缓冲剂308与样品混合。以第三速度使盘自旋，以便使样品中的细胞以这样的速率移动通过纯化室300：即，该速率使不需要的细胞有足够的时间结合到纯化室300中的捕获珠324上。捕获珠324上固定有针对不需要细胞的表面标志物的抗体。例如，捕获珠324上固定有纯化剂、包括诸如，DNA、配体、受体和抗体例如针对NK细胞的抗-CD56、针对单核细胞的CD14、针对B细胞的CD19、针对血小板的CD9、CD31或CD41、以及针对粒细胞的CD13、CD31或CD43。因此，大部分不需要的细胞在纯化室300内被除去，而红细胞穿过纯化室300进入分析室130，在此处利用上述的方法来分析不同类型的T细胞。过量的缓冲剂和样品移动到废物室312。有关用来将探针结合到固相支持体(例如珠和盘表面，包括金和聚碳酸酯表面)上的表面化学的进一步细节诸如公开在共同转让的：2002年1月30日提交的题为“包括用于固定受体分子的金属层和相关光学测定盘的捕获层组件”(Capture Layer Assemblies Including Metal Layer forImmobilization of Receptor Molecules and Related Optical AssayDiscs)、序列号为60/353,770的美国临时申请；和2002年1月30日提交的题为“包括用于固定受体分子的聚合物底物和相关光学测定盘的捕获层组件”(Capture Layer Assemblies Including PolymerSubstrates for Immobilization of Receptor Molecules and RelatedOptical Assay Discs)、序列号为60/353,745的美国临时申请；还公开在2002年7月12日提交的题为“用于实施测定的多用途光学分析盘以及与其一起使用的多种报道剂”(Multi-Purpose Optical AnalysisDisc for Conducting Assays and Various Reporting Agents for UseTherewith)、序列号为10/194,396的美国专利申请中。这些申请就如同完全在本文中重复一样，全部引入本文作为参考。
珠324可承载不同的化学官能度包括例如羰基、氨基、醛和易于结合纯化剂的肼官能团。纯化剂可通过下文所详细描述的多种化学工艺而结合到固相上。硫羟或氨活性基可共价结合到纯化剂上，借此产生改性的纯化剂。然后诸如，可将这种改性的纯化剂通过其直接共价配价结合而连接的活性基团，直接结合到金属表面(例如金)上。如果纯化剂是蛋白质，通过无需硫羟或胺改性而使蛋白质上的暴露半胱氨酸与甲硫氨酸配价结合，可完成纯化剂与金表面的直接结合。当旋转盘110时，纯化剂与珠表面之间的键例如足以使纯化剂仍然附着到珠上。
可利用几种方法在珠表面和盘基底120的聚碳酸酯(PC)或金表面上形成官能活性生化层。被动吸附是用于使生化、化学、结合剂，或纯化剂键接到盘基底120的聚合物或金属表面以及微球或珠的聚合物表面的一种优选方法。含有疏水性氨基酸、碳酸酯、以及类似成分的多个袋的大生物分子易于通过被动吸附键接到非极性聚合物表面上。由聚合物和生物分子或纯化剂所展示的疏水力，以及基底与纯化剂之间的静电作用导致稳定键合的形成。而其它因素诸如pH、盐浓度以及竞争物质的存在将决定多种纯化剂与聚合物平面或金属涂覆的聚合物表面的非共价键接的程度。如果纯化剂是蛋白质，含有该纯化剂的涂覆缓冲剂的pH就影响捕获剂结合到聚合物基底或金属层上。接近于纯化剂的等电点的涂覆缓冲液的pH将增大蛋白质的疏水性，由此导致蛋白质与基底发生更强的相互作用，从而导致对较高密度的固定捕获剂的更强的结合，而且还是最可能的。
或者是，通过纯化剂上硫羟活性基的配价键合，可将硫羟化纯化剂固定到金或金属表面上。在本发明的一个优选实施例中，纯化剂是蛋白质，通过配价键合以形成穿过纯化剂或结合蛋白质的半胱氨酸或甲硫氨酸的残余物的金属有机键，可使这些纯化剂直接共价结合到胶体金颗粒的金表面上。利用弱还原剂诸如氰基氢硼酸钠(NaCNBH3)，可以使硫羟或甲硫氨酸活性基的配价结合易于实现。在本发明的又一实施例中，通过这些蛋白质表面上的半胱氨酸或甲硫氨酸残余物的直接配价结合，或者通过硫羟化蛋白质上所附着的硫羟活性基的配价结合，可以使亲和剂例如生物素、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和BSA-生物素的硫羟化形式在初期结合到金表面上。然后，使与包括生物素、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的适当结合对共轭的纯化剂与珠或纳米颗粒混合，并结合到具有相应亲和剂的小珠上。在另一个实施例中，链霉抗生物素蛋白或生物素可用作分别将生物素化或链霉抗生物素蛋白化的小珠表面结合到其相应的链霉抗生物素蛋白化或生物素化纯化剂上的桥连剂。
纯化剂的被动吸附对于许多不与聚合物基底或金属涂覆的聚合物基底的化学惰性表面被动作用的生物聚合物是无效的。这是因为缺乏非共价作用位点。例如，低分子量的蛋白质、多肽以及具有优越的离子特性的分子，由于仅仅非常弱的疏水性或静电作用的缺乏或存在，而不链接到聚合物表面上。
将结合蛋白质或纯化剂固定到固相支持体上的另一关键方面是，保留所结合的蛋白质或纯化剂的官能活性。经常是，纯化剂由于在固定过程中的变性(涉及到结构重组之后的构象变化，并伴随着官能活性位点的变化)，而丧失其生化特性。酶、受体、凝集素和抗体是这些生物聚合物、结合蛋白或纯化剂的实例。
与支持聚合物基底的被动作用的缺乏或者由于固定过程而导致的官能活性的丧失这些情形，都需要开发另一种途径。在这些情形中所采取的这种途径导致打算将生化试剂固定到其上的小珠或盘基底的化学惰性表面的官能作用。官能作用是，通过将具有官能团的特异性分子或聚合物附着到表面上，而使珠表面、盘基底或金属表面改性的过程。然后，用这些官能团结合识别分子诸如结合蛋白、捕获抗体、受体和其它类似的测定成分。结合蛋白在分子区域上的结构变化将增大由改性基底或金属表面所作出的贡献。
以前业已对聚合材料的表面进行了改性。参见，例如，Braybrook等人的Prog.Polym.Sci.15：715-734，1990。本领域内公知的大多数改性方法都涉及用化学剂对表面进行顺序处理。实例包括聚苯乙烯的磺化(Gibson等人的“大分子”(Macromolecules)13：34，1980)；聚酰亚胺的碱性水解(Lee等人的“大分子”(Macromolecules)23：2097，1990)；以及聚偏1，1-二氟乙烯的碱性处理(Dias等人的“大分子”(Macromolecules)17：2529，1984)。用于改性聚合物表面的另一种常规方法包括：暴露碳氢化合物的表面，例如具有在气相中产生的氮宾或碳宾中间体的聚乙烯(Breslow in“Azides and Nitrenes”，chapter10，Academic Press，New York，1984)。业已表明，全氟叠氮基苯(PFPAs)在其非氟化类似物之上的CH键中进行插入是有效的(Keana等人，Fluorine Chem.43：151，1989)。最近，已经表明双(PFPA)s是聚苯乙烯的有效交联剂(Cai等人，Chem.Mater.2：631，1990)。
诸如，通过将薄的界面层、活性层或夹层沉积在珠表面上的接枝方法，而有效地实施惰性聚合物表面的化学改性。理想的是，界面层应该使接枝材料稳定键合到珠表面上，并含有末端为一个官能团或各种不同的化学官能团的间隔分子。这使得能够选择特异性表面化学，以便有效地共价固定对空间取向具有不同需求的各种纯化剂，包括结合蛋白结构内的侧指向附着。间隔分子，特别是作为接枝部分的亲水性间隔物的引入，明显增强了所固定的纯化剂的柔性和可及性。通过将间隔层放置在用不同官能团改性或接枝的基底的固相与结合蛋白之间，可消除蛋白质与这些官能团的直接接触所导致的潜在变性效果。
参照图61A，该图表示出具有用来从全血样品中施加到纯化T细胞的射流回路的另一实施例。该实施例的两个实例在图61A中示出，包括“锤头”型的射流回路314和“曲棍”型的射流回路316。以下结合图61B和61C详细讨论有关这些射流回路的细节。
现在参照图61B，该图示出了用于进行T细胞分析的“锤头”型的射流回路314。该“锤头”型的射流回路包括具有入口122的混合室134。混合室134与RBC捕获区318相连。所示出的RBC捕获区318是蛇形、波状或正弦曲线形的，以增加RBC捕获区308的整个长度，借此增加其表面积。RBC捕获区318可包括垂直定位并分散在整个RBC捕获区318上的“墩柱”320，从而进一步增大捕获区318的表面积，借此使其RBC的捕获效率最大。包括“墩柱”320表面的RBC捕获区通道318的表面上排列有RBC捕获剂(例如凝集素)，从而在RBCs与RBC捕获区通道318的表面以及“墩柱”320表面接触时，RBCs结合并持续结合到其中。本领域的普通技术人员仅仅利用常规实验就能够确定RBC捕获区通道318表面结合的捕获剂的浓度或密度。“锤头”射流回路314进一步包括与以上结合图59和60所表示和描述的类似的T细胞纯化室或区300。T细胞纯化室或区300含有由屏障322支持就位的珠324。这些珠上附着有针对不需要细胞的表面标志物的纯化剂。例如，可附着到捕获珠324上的纯化剂包括诸如，DNA、配体、受体和抗体例如针对NK细胞的抗-CD56、针对单核细胞的CD14、针对B细胞的CD19、针对血小板的CD9、CD31或CD41、以及针对粒细胞的CD13、CD31或CD43。
在使用时，通过“锤头”型射流回路314的入口122将全血加入到混合室134中。然后使盘以预定的速度和时间自旋，该速度和时间足以使样品移到RBC捕获区318内，并使RBC与区318和“墩柱”320上所排列的RBC捕获剂结合。当样品穿过RBC捕获区318时，所捕获的大部分(而不是全部)RBC和白细胞穿过并进入T细胞纯化区300。当白细胞穿过T细胞纯化区300时，不需要的细胞就被T细胞纯化区300中的珠324所截留或捕获。经过T细胞纯化区300的细胞是所纯化的T细胞，并在分析室130内进行分析，在此处捕获和定量特定类型的T细胞，包括诸如CD4+和CD8+细胞。过量的缓冲剂和样品移到废物室312。
接下来参照图61B，该图表示出用于进行T细胞分析、被称作“曲棍”的另一射流回路。该“曲棍”类似于“锤头”，只是用半环形分析室332取代“锤头”的径向分析室130。该“曲棍”中的另一个区别是，采用径向直线对准的捕获区334。
现在参照图62A，该图表示出具有微流盒326的光学生物盘110的另一个实施例。在该实施例中，以上所述的射流回路、通道和流体贮器形成在附着到盘基底表面的微流盒326的内部。样品的处理可在盒326的内部完成，而在生物盘110的分析室130内的基底120上进行分析。盒326可以是环330(图62C)的半环328(图62B)。
接下来翻到图63，该图是微流盒326的一个实施例的透视分解图。微流盒326可具有四个层，每个层具有被切掉的部分，以形成若干口和射流回路(如图所示)。每个层可由诸如聚碳酸酯和聚甲基甲基丙烯酸酯(PMMA)之类的塑料或任何生物相容性材料形成。这些层可通过粘合剂(包括UV胶)或通过塑料焊接(例如激光或紫外焊接)而保持在一起。将微流盒326设定在光学生物盘上，从而使近端最接近于盘的中心，而远端离盘的中心最远。如图63所示，微流盒326可包括入口122，在入口122装载缓冲剂和样品。如箭头所示，流入混合室134的样品(样品与缓冲剂在混合室134内进行混合)，然后进入射流回路128，以完成进一步的混合。接下来样品进入样品纯化区300，在此处去除不需要的污染物例如不需要的细胞，如以上结合图59、60、61B和61C所述。然后将纯化的分析物或样品引入分析室130。利用通过以预定的速度和时间段使盘自旋而产生的离心力，可控制样品穿过微流盒326内的不同流动通道和室的运动。
接下来翻到图64，该图是来自利用本发明光学生物盘110进行的CD标志物测定的数据集的柱状图。在该实验中，CD4+和CD8+细胞利用磁珠来纯化，而利用光学生物盘110进行测试。在该特定实施例中所用的捕获剂是抗-CD19、抗-CD2、抗-CD4和抗-CD8抗体。图64中的柱状图表示出在每个捕获区中所捕获的细胞数。以下结合例10来描述有关该实验的细节。
试验详述
虽然已经参照附图详细说明了本发明，但是下文给出本发明的某些实例和进一步示例。
                     实例1
图17A的流程图表示样品的制备、生物盘的使用和图52和53中更详细表示的结果的验证。例如方法步骤的单个时间段、旋转速率和其它细节的以下实例的细节比上文参照图17A、52和53所说明的细节要更具体。但是，本实例的基本步骤类似于上述步骤。
A.包括基底制备和化学沉积的盘制造
在本实例中，用气枪清洗反射盘和透射盘基底120(分别参见图2和图5)，以去除任何灰尘颗粒。用旋涂器将该盘用异丙醇冲洗两次。将2％的聚苯乙烯旋涂在盘上，以给定非常厚的全涂层。
然后沉积化学物。一个实施例包括温育的三步沉积规程：抗生蛋白链菌素，温育30分钟；生物素化的第一抗体温育60分钟；和第二捕获抗体温育30分钟。可以在第一物种(例如羊)中、针对第二物种(例如老鼠)的一种免疫球蛋白(例如lgG、lgE、lgM)来培养第一抗体。在第二物种中、针对特异性细胞表面抗原(例如CD4、CD8)来培养第二捕获抗体。这些步骤在潮湿室中于室温下利用沉积之间的冲洗和干燥步骤被完成。
将1μl、比率为1mg/ml的抗生蛋白链菌素磷酸盐缓冲盐水涂在每个窗上并温育30分钟。用蒸馏水将过量的抗生蛋白链菌素冲洗掉并将盘烘干。将等量的生物素化抗鼠lgG(PBS中125μg/ml)和醛活化葡聚糖(200μg/ml)合并。将醛活化葡聚糖(DCHO)-生物素化抗鼠lgG涂在每个捕获窗口中的抗生蛋白链菌素上并在冰箱中温育60分钟或整夜。将过量的试剂冲洗掉并使盘旋干。
如图47所示，可以有许多具有利用针对这些人细胞表面抗原的鼠lgG抗体进行的不同检验的径向观察窗，例如CD4(窗口2)、CD8(窗口3)、CD3(窗口4)和CD45(窗口5)，以及阴性对照(窗口6)。使这种所制备的基底在冰箱中温育30分钟或整夜。
化学沉积的图案提供在以下的表3中。
                                 表3
  窗口   1-2   3-4   5-6   7-8
  第一层   抗生蛋白链菌素   抗生蛋白链菌素   抗生蛋白链菌素   抗生蛋白链菌素
  继发抗体   B-抗小鼠lgG+DCHO   B-抗小鼠lgG+DCHO   B-抗小鼠lgG+DCHO   B-抗小鼠lgG+DCHO
  原发抗体   小鼠抗人CD4   小鼠抗人CD8   小鼠抗人CD3   小鼠抗人CD45
B.盘的装配
用例如25μm、50μm或100μm厚的粘合层(图2和5中的通道层118)装配盘，并带有被标记出的部分，例如U形或“e-rad”通道，以产生流动通道，还带有透明盖部分116(图5，与带有顶部检测器的透射盘一起使用)，或带有位于捕获区上的反射层142的盖116(图2，与带有底部检测器的反射盘一起使用)。
在一个实施例中，盘是涂有作为编码信息层的300nm金的前摆动部件FDL21：13707或FDL21：1270CD-R盘。在反射盘上，利用已知的光刻技术从反射层蚀刻出尺寸为2×1mm的椭圆形观察窗。在透射盘的一些设计中，没有蚀刻单独的观察窗，并且整个盘可用。在这种具体实例中，通道层由Fraylock粘合剂DBL 201 Rev C 3M94661形成。盖为具有48个直径为0.040英寸、位于半径为26mm等距处的试样入口的透明盘。用CD4/CD8计数软件、以4X的速度和2.67MHz的取样速率用该软件扫描并读取数据盘。
C.盘的泄漏检查
由于正在分析血液，因此可以首先检查盘的泄漏，以确保在具有试样就位的盘的自旋过程中没有室泄漏。用一种阻断剂，例如StabilGuard和PBS-Tween，填充每个通道。阻断至少一小时。使盘以5000rpm自旋5分钟，并检测泄漏以及检查盘的稳定性。在检查泄漏之后，将盘放在真空室中24小时。真空处理24小时之后，将盘放置在真空袋中并储存在冰箱中直至使用。
D.样品的收集、制备和应用于盘上
以下部分涉及图17A通常所示的样品的处理步骤。利用密度梯度离心法，例如使用Becton Dickinson CPT Vacutainer来提纯单核细胞(MNC)。将血液(4-8ml)直接收集到4或8ml的包含CPT Vacutainer的EDTA中。将试管在带有水平转子和转位式桶的生物危害离心室中以1500至1800×g于室温下离心25分钟。使血液最好在两小时的收集时间内被使用。离心后，将覆盖单核细胞部分的血浆去除，在MNC层上留下约2mm的血浆。收集MNC并用PBS冲洗。通过以300×g在室温下离心10分钟将细胞压成丸。将上清液去除并通过轻敲试管使包含MNC的丸在PBS中再悬浮。在室温下每次以300×g进行10分钟，来完成一次以上的冲洗，以去除血小板。使最终形成的丸再悬浮至10,000细胞/微升的细胞计数。将体积为18微升的MNC导入一个或更多分析室或通道，在盘静态情况下于室温下温育15分钟。通道被密封。然后用盘驱动器以3000rpm的转速使盘自旋3至4分钟。最好以4x的速度和2.67MHz的抽样速率用软件扫描和读取该盘。
如果血样不能立即处理，通过小心反转CPT管几次，在第一离心之后单核细胞可以在血浆中再悬浮，并在室温下存储达到24小时。在24小时内，可以如上所述收集和冲洗血浆中的细胞。
E.CD4/CD8的测定形式
本实例的测定为普通均匀固相细胞捕获测定法，以快速确定血样中的CD4+和CD8+T淋巴细胞族的绝对数和CD4+/CD8+淋巴细胞的比率。在被结合到CD-ROM中的小室内运行的该检测，确定从全血中分离的7μl单核细胞(MNC)中的由捕获区上特异性抗体所捕获的CD4+、CD8+、CD2+、CD3+和CD45+细胞数。该检测是基于盘上特定位置的局部细胞捕获的原理。基于针对具体的血细胞表面抗原的单克隆抗体或多克隆抗体，通过捕获化学物的局部应用，在盘上产生几个特异性细胞捕获区。当用MNC血(30,000细胞/微升)填充室时，表达CD4、CD8、CD2、CD3和CD45抗原的细胞被捕获在盘上的捕获区。也被结合到条形码中的是所限定的阴极对照区。
F.盘上分析
在上述步骤D中制备的MNC细胞(PBS中18微升)，被注入盘室中，并密封室的入口和出口。将该盘在室温下温育15分钟，然后在带有顶部检测器的光学驱动器中用780nm的激光扫描，以使如上所述的捕获区成像。
在盘上编码软件，以指示驱动器自动执行以下任务：(a)在一个或多个阶段中使盘离心，以分离过量的未结合细胞，(b)使特定的捕获窗口成像，和(c)处理数据，包括计数每个捕获区中特异性捕获的细胞和得出CD4/CD8比率(或者程序待确定的任何比率)。
在处理步骤中，软件贯穿每个捕获区图像来进行读取并在与这些细胞相遇时标记细胞。例如，在估算CD4+和CD8+细胞数之后，软件计算CD4+/CD8+比率，并显示每微升全血中的CD4+、CD8+、CD3+和CD45+捕获区中的细胞绝对数以及CD4+/CD8+比率。整个过程从将盘插入光学驱动器到获得这些绝对数和比率为止需要12分钟。
G.所使用的试剂
抗生蛋白链菌素(Sigma，cat.#S-4762)：添加去离子水以制作5mg/ml的溶液，等分量并储存在-30℃下。为了使用，添加三羟甲基氨基甲烷缓冲液，使最终浓度为1mg/ml。
阳性对照：CD45(Sigma，Lot#038H4892，cat#C7556)。储存在2-8℃下。
继发捕获抗体：在蒸馏水中制造的1.5mg/ml生物素化抗鼠lgG(在羊中培养，Vector实验室，lot#L0602，Catalog#BA-9200)储备液。在0.1M PBS中制造125μg/ml的b-lgG溶液。储存在2-8℃下。可以在-30℃下保持长期储存。
醛活化葡聚糖(Pierce，lot#97111761，cat#1856167)。PBS中5mg/ml储备液，储存在2-8℃下。
原发捕获抗体：CD4(DAKO，cat#M0716)、CD8(DAKO，cat#M0707)、CD2(DAKO，cat#M720)、CD45(DAKO，cat#M0701)、CD14(DAKO，cat#M825)、和CD3(DAKO，cat#M7193)。储存在2-8℃下。
阴性对照：小鼠lgG1(DAKO，cat#X0931)。储存在2-8℃下。
磷酸缓冲盐水(PBS)，pH7.4(Life Technologies/GIBCOBRL，cat.#10010-023)或等价物。储存在室温下
异丙醇，90-100％
H.RBC的溶解规程
氯化铵溶解缓冲液
1倍的氯化铵溶解缓冲剂储备液应该储存在2-8℃下。它包括0.155M NH4Cl、10mM的KHCO3和0.1mM的二钠EDTA；pH7.3至7.4。储存在2-8℃下。在使用之前达到室温。
程序
1.为每100μl血添加2ml的溶解缓冲液。(最好在生物危害通风厨(hood)中执行本程序。)
2.室温下涡动并温育15分钟。
3.以500×g于室温下将血液离心5分钟，使用生物危害通风厨中的离心室。
4.去除上清液并用2％的PBS中的FCS或FBS冲洗细胞。离心细胞。
5.计算WBC的总量并使WBC的最终浓度为10,000细胞/微升，用于样品注入。
                       实例2
                   单核细胞分离程序
利用含有柠檬酸钠的Becton和Dickinson Vacutainer CPT(BDcatalog#362760 4ml，#362761 8ml)细胞制备试管。在遵循所有生物危害预防措施的生物危害通风厨中执行程序。步骤如下：
1.将血直接收集到4或8ml包含CPT Vacutainer的EDTA中。如果血样已经在抗凝血剂中，首先倒出Vacutainer中的EDTA并随后将6-8ml的血样倒入CPT试管中。
2.在带有水平转子和转位式桶的生物危害离心室中以1500至1800×g于室温下离心试管25分钟。为了获得最好的结果，应该在两小时的收集时间内离心血液。但是，大于2小时的血液应该在MNC数量减少和RBC杂质增加的情况下离心。
3.离心后，去除血浆，在MNC层上留下约2mm的血浆。收集并传送发白的单核细胞层进入15ml的锥形离心管。
4.将10-15ml的PBS加入到MNC层，通过反转离心管几次小心混合细胞。
5.通过在生物危害离心室中于室温下以200×g离心10分钟，来冲洗细胞。
6.去除上清液。通过轻敲试管再悬浮细胞。
7.在10ml PBS中冲洗一次以上。室温下以200-300×g离心10分钟，以去除血小板。
8.去除上清液并在50μl PBS中再悬浮细胞丸。
9.估算血样中的细胞计数。运行CBC或将2μl的细胞稀释到18μl的锥虫蓝中，小心混合并用血细胞计数器计数细胞。将血样制备为用于进行分析的10,000细胞/微升的最终细胞计数。
10.如果细胞不能立即处理，通过小心反转CPT管几次，在第一离心(上述步骤2)之后使单核细胞于所分离的血浆中再悬浮，并在室温下存储达到24小时。在24小时内，收集血浆中的细胞并继续如上所述的冲洗。
每微升的总细胞计数＝25小平方(small squares)中的细胞数量×(乘)100。
                     实例3
        用Histopaque-1077从全血中分离MNC
将1ml的Histopaque-1077放置在15ml的离心管中并将1ml的全血小心地层叠在Histopaque-1077上面。然后以400×g于室温下进行离心30分钟。用牧场吸管(pasture pipette)小心吸出混合物并将半透明界面传送到离心管。然后将10ml的PBS添加到离心管中。接下来以250×g将溶液离心10分钟。将上清液轻轻倒出并使细胞丸在10mlPBS中再悬浮并以250×g自旋10分钟。然后通过在10ml PBS中使细胞丸再悬浮并以250×g进行自旋，而将细胞冲洗一次以上。使最终的细胞丸在0.5ml的PBS中再悬浮。
                        实例4
               用Dynal珠分离CD4+细胞
A.材料
1、冷的PBS/2％FBS，pH7.4
2、PBS/0.5％BSA，pH7.4
3、CD4阳性Dynal分离工具
4、Dynal MPC、Dynal混合器、离心室、聚丙烯管
B.程序
运行CBC并确定每个细胞所需的珠数目(4-10个珠/细胞)。将1ml的冷PBS/2％FBS加入到需要量的珠(1×107珠/72μl)中并再悬浮。将试管在Dynal MPC中放置30秒并吸移掉上清液。将冲洗后的珠再悬浮到原始体积。然后将需要量的珠加入到细胞中。在设置到11的Dynal混合器中于2-8℃下温育20分钟。然后在Dynal MPC中将花结形的细胞分离2分钟。吸移掉上清液。在PBS/2％FBS中将花结形细胞冲洗4倍。使这些花结形细胞再悬浮到200-400μl的PBS/2％FBS中。每100μl细胞悬浮液中加入10ul的Detach-a-Bead。在设置到11的Dynal混合器中于2-8℃下温育60分钟。然后在Dynal MPC中将珠分离2分钟。转移并保留上清液。在500μl的PBS/2％FBS中将珠冲洗2-3次，以获得残余的细胞。在400μl的PBS/0.5％BSA中洗涤所收集的细胞。
运行CBC，以确定所分离的细胞浓度。
                         例5
        盘的制备和化学沉积(用抗生蛋白链菌素)
A.包括基底制备和化学沉积的盘制造
在本实例中，用气枪清洗透射盘基底，以去除灰尘。然后将该盘安装在旋涂器中并用异丙醇的稳定流漂洗两次。接下来，将带有溶解在310ml甲苯和65ml异丙醇中的2％聚苯乙烯的聚苯乙烯溶液均匀涂在盘上。
对于抗生蛋白链菌素的沉积而言，将抗生蛋白链菌素储备液稀释为PBS中1mg/ml。利用手工定位(pin)沉积，将大约1μl的抗生蛋白链菌素沉积在盘上的每个捕获区中。使盘在湿气室中温育30分钟。然后用D.I.水将过量的未结合抗生蛋白链菌素从捕获区上漂洗掉并将盘旋干。
对于继发抗体的沉积而言，使醛活化葡聚糖的新鲜溶液(PBS中200μg/ml)与等量的Vector lgG(PBS中125μg/ml)合并。利用手工定位沉积，将大约1μl的lgG+DCHO复合物沉积在盘上的每个捕获区中。使盘在湿气室中温育60分钟。用D.I.水将过量的抗体冲洗掉并使盘旋干。
对于原发抗体的沉积而言，将DAKO CD4稀释为PBS中的50μg/ml，将DAKO CD8稀释为PBS中的25μg/ml，而将DAKO CD45稀释为PBS中的145μg/ml。利用手工定位应用器，在所结合的继发抗体顶部沉积大约1μl的每种原发抗体。然后使盘在湿气室中温育30分钟。通过用PBS冲洗捕获区而将过量的未结合抗体去除，并使盘旋干。
B.盘的装配
所用的盖盘为带有被固定至其上的Fraylock粘合通道层的透明盘。被标记入粘合剂的是产生射流回路的4个U形通道。将盖放置到透射盘基底上，以使流动通道覆盖捕获区。接着，为了将盘固定到一起，使它们通过盘压8次。
C.盘泄漏检查、阻断
用StableGuard填充每个通道并温育一小时。在温育过程中，使盘在旋涂器中以5000rpm自旋5分钟。在自旋之后，检查盘通道的泄漏。接下来，将StableGuard吸出通道，并且将盘放置在真空室中在真空下过夜。第二天早晨，将盘放置在真空袋中并储存在4℃下。
                        实例6
将光学生物盘CD4/CD8的比率与FAC CD4/CD8的比率进行对比
A.利用CPT管制备临床血样
将3ml的临床EDTA血样(号码为29、30、31、32、33、34和35)倾注到柠檬酸钠被去除的各个CPT管中。然后以1500×g于室温下将这些管离心25分钟。离心之后，将上面的血浆(在0.5cm的半透明MNC层内)吸掉。将剩余的半透明MNC层转移到15ml的管内并将12ml的PBS加入到每个管中。
冲洗
然后以250×g将细胞悬浮液离心10分钟。接下来将上清液吸掉并使细胞再悬浮到14ml的PBS中。以250×g将悬浮液再离心10分钟。吸掉上清液并用200-175μl的PBS再悬浮每个细胞丸。通过用血细胞计对细胞进行计数来确定每个血样的细胞浓度。对于每个血样，将最终的细胞浓度调整到30,000个细胞/μl。
B.将光学生物盘CD4/CD8的比率与FAC CD4/CD8的比率进行对比
利用25μm粘合剂通道，类似于例5来制备盘(号码为27a、27b、27c、27d、27e、27f&28)。
将每个样品注入到每个对应盘中(如下面的表4所示)。30分钟之后，以3000rpm将盘离心5分钟。然后对化学物区上捕获的细胞进行光显微摄影，并对细胞进行计数。每个临床样品还具有所实施的FAC分析。由该实验所获得的结果如下面的表4所示。
                        表4
            将光学生物盘CD4/CD8的比率
           与FACs CD4/CD8的比率进行对比
  盘号   样品号   盘CD4/CD8   FAC CD4/CD8
  27a   29   2.39   2.43
  27b   30   1.47   1.67
  27c   31   0.8   0.98
  27d   32   1.84   2.16
  27e   33   0.96   1.14
  27f   34   1.59   1.49
  28   35   1.03   1.04
                      实例7
                  盘的制备和化学沉积
A.包括基底制备和化学沉积的盘制造
在本实例中，用气枪清洗透射盘基底，以去除灰尘。然后将该盘安装在旋涂器中并用异丙醇的稳定流漂洗两次。接下来，将带有溶解在310ml甲苯和65ml异丙醇中的2％聚苯乙烯的聚苯乙烯溶液均匀涂在盘上。
对于继发抗体的沉积而言，使醛活化葡聚糖的新鲜溶液(PBS中200μg/ml)与等量的Vector lgG(PBS中125μg/ml)合并。利用手工定位沉积，将大约1μl的lgG+DCHO复合物沉积在盘上的每个捕获区中。使盘在湿气室中温育60分钟。用D.I.水将过量的抗体冲洗掉并使盘旋干。
对于原发抗体的沉积而言，将DAKO CD4稀释为PBS中的50μg/ml，将DAKO CD8稀释为PBS中的25μg/ml，而将DAKO CD45稀释为PBS中的145μg/ml。利用手工定位应用器，在所吸收的继发抗体顶部沉积大约1μl的每种原发抗体。然后使盘在湿气室中温育30分钟。用PBS冲洗掉过量的抗体，并使盘旋干。
B.盘的装配
所用的盖盘为带有被固定至其上的Fraylock粘合剂通道层的透明盘。被标记入粘合剂的是产生射流回路的4个U形通道。将盖放置到透射盘基底上，以使流动通道覆盖抗体区。接着，为了将盘固定到一起，使它们通过盘压8次。
C.盘泄漏检查、阻断
用StableGuard填充每个流动通道并温育一小时。在温育过程中，使盘在旋涂器中以5000rpm自旋5分钟。在自旋之后，检查盘通道的泄漏。接下来，将StableGuard吸出通道，并且将盘放置在真空室中在真空下过夜。第二天早晨，将盘放置在真空袋中并储存在4℃下。
                      实例8
                 血样的CD标志物检验
A.用Histopaque 1077制备临床血样
在10:00am将12ml的血液(样品号为176)抽入EDTA管中。然后在12:00pm使3ml的血液在4×15ml管中的3ml Histopaque 1077上分层。以400×g于室温下将这些管离心30分钟。离心之后，将上面的血浆(在0.5cm的半透明MNC层内)吸掉。将剩余的半透明MNC层转移到干净的15ml管内并加入12ml的PBS。对剩余的3个管重复该操作。
冲洗
然后以250×g将细胞悬浮液离心10分钟。接下来将上清液吸掉并使细胞再悬浮到14ml的PBS中。以250xg将悬浮液再离心10分钟。吸掉上清液并用175ul的PBS再悬浮每个细胞丸。然后将所有4个MNC悬浮液合并，并通过用Cell Dyne细胞计数器运行CBC来确定细胞浓度。最终的体积为具有23.5K细胞/ul浓度的650ul。然后我们实施6个顺序稀释，以便将最终浓度从1000个细胞/ul调整至100,000个细胞/ul，如下面的表5所示。
B.将来自CAKO和Serotec的CD4抗体进行对比
利用100um粘合剂层，按照例7来制备具有6个通道的两个盘(号码为#338&339)。还来自Serotec的另一原发CD4抗体(50ul/ml，cat#LN1298)也用于该实验中。
我们将一个顺序稀释的样品176注入盘338的每个通道中。15分钟之后，以3000rpm将盘离心5分钟。然后对化学物区上捕获的细胞进行光显微摄影，并用细胞计数软件(Metamorph)对细胞进行计数。将DAKO CD4化学物区上捕获的细胞数与Serotec CD4化学物区上捕获的细胞数进行比较。从该实验所收集的数据如表5所示。
                                表5
              利用DAKO和Serotec CD4捕获抗体所捕获的细胞
样品176   CD4Dako   CD4Dako   CD4Dako   CD4Seroteck   CD4Seroteck   CD4Seroteck
  细胞浓度   盘338   盘339   平均值   盘338   盘339   平均值
  1,000个细胞/μl   76   59   68   71   49   60
  5,000个细胞/μl   282   211   247   287   273   280
  10,000个细胞/μl   559   526   543   530   525   528
  25,000个细胞/μl   1168   1205   1187   1015   1040   1028
  50,000个细胞/μl   2459   2595   2527   1726   1981   1854
  100,000个细胞/μl   3686   3835   3761   3513   3372   3443
                     实例9
        用被抽入ACD管内的溶解血来测试盘
A.用铵溶解缓冲剂制备临床样品
将4ml、1倍的氯化铵溶解缓冲剂加入到200μl的每个ACD血样(样品号为251、252、253、254、255&256)中。然后使样品涡流并在室温下温育15分钟。其次，以500×g于室温下将样品离心5分钟。然后除去上清液，并用3ml、2％的PBS中的FBS清洗细胞。再进行离心。除去上清液，并使细胞再悬浮到100μl、2％的PBS中的FBS中。使最终的浓度在10,000-5,500个细胞/μl之间。
B.用被抽入ACD管内的溶解血来测试盘
利用100μm粘合剂层，按照例7来制备具有6B-Rad通道的六个盘(号码为499、500、501、502、503&504)。
我们将样品251注入盘499的3通道中。15分钟之后，以3000rpm将盘离心5分钟。然后对化学物区上捕获的细胞进行光显微摄影，并用细胞计数软件(Metamorph)对细胞进行计数；结果如下面的表6所示。或者是，用光学盘读取器以及所带的软件来评估所捕获的细胞数。对剩余的5个盘和5个样品中的每一个来重复该操作过程。
                     表6
从溶解的ACD血样中捕获的CD4和CD8细胞的平均值
  盘号   样品号   CD4细胞   CD8细胞
  499   251   249   316
  500   252   85   101
  501   253   149   143
  502   254   136   129
  503   255   130   188
  504   256   103   96
                实例10
       用CD4和CD8分离细胞群来测试盘
A.制备CD4和CD8分离细胞群
通过使3ml的血液在4×15ml管中的3ml Histopaque 1077上分层，来制备12ml的血液(样品号为269)，如例8所示。运行CSC并确定所分离的MNC浓度为25,000个细胞/ul。将用于盘的100ul MNC放置在一边。将剩余的500ul MNC分成相等的体积。将1ml的冷PBS/2％FBS加入到200ul的CD4和200ul的CD8珠中，并使所述珠再悬浮。将管放置在Dynal MPC中30秒钟并吸走上清液。使清洗后的珠再悬浮到原始体积。将200ul的CD4和200ul的CD8珠加入到每个相应的细胞管中。在设置到11的Dynal混合器中于2-8℃下温育20分钟。然后在Dynal MPC中将花结形的细胞分离2分钟。吸移掉上清液。在PBS/2％FBS中将花结形的CD4和CD8细胞冲洗4倍。使每组花结形细胞再悬浮到200-400ul的PBS/2％FBS中。每个细胞悬浮液中加入15ul的Detach-a-Bead。在设置到11的Dynal混合器中于RT下温育60分钟。然后在Dynal MPC中将珠分离2分钟。转移并保留上清液。在500ul的PBS/2％FBS中将珠清洗2-3次，以获得残余的细胞。在400ul的PBS/0.5％BSA中洗涤所收集的细胞。运行CBC并确定所分离的细胞浓度。回收360ul的浓度为5000个细胞/ul的CD4细胞和215ul、浓度为5000个细胞/ul的CD8细胞。
B.用CD4和CD8分离细胞群来测试盘
利用100um粘合剂层，按照例7来制备具有6B-Rad通道的一个盘(号码为538)。
我们将来自样品269的分离细胞MNC、CD4细胞和CD8细胞注入盘538的1通道中。15分钟之后，以3000rpm将盘离心5分钟。然后对化学物区上捕获的细胞进行光显微摄影，并用细胞计数软件(Metamorph)对细胞进行计数。从该实验获得的结果如表7所示并在图64中示出。或者是，用光学盘读取器以及所带的软件来评估所捕获的细胞数。
                       表7
           MNC和分离的CD4及CD8细胞捕获
原发抗体   所捕获的分离MNC  所捕获的分离CD4细胞  所捕获的分离CD8细胞
  阴性对照   36  15  12
  CD19   249  30  28
  CD2   337  516  445
  CD4   247  501  35
  CD8   260  24  458
结论声明
本文所公开的涉及设备、方法和过程的本发明的方面也在以下文献中有所描述：2001年9月20日提交的序列号为60/323,682的题为“用阻断剂减少光学生物盘上细胞的非特异性结合的方法”(Methods forReducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs UtilizingBlocking Agents)的美国临时申请；2001年9月24日提交的序列号为60/324,336的题为“用聚乙烯醇减少射流室中的气泡的方法以及在光学生物盘中获得相同效果的相关技术”(Methods for ReducingBubbles in Fluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and RelatedTechniques for Achieving Same in Optical Bio-Discs)的美国临时申请；2001年10月3日提交的序列号为60/326,800的题为“光学分析盘组件内的危险生物材料的容器的密封方法”(Sealing Methods forContainment of Hazardous Biological Materials within OpticalAnalysis Disc Assemblies)的美国临时申请；2001年10月10日提交的序列号为60/328,246的题为“用光学生物盘平台计算辅助性/诱导性-抑制性/细胞毒性T淋巴细胞的定性和定量比率的方法”(Methods forCalculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/lnducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-DiscPlatform)的美国临时申请；2001年10月19日提交的序列号为60/386,072的题为“用光学生物盘平台表征包括白血病血样的癌血细胞的定性和定量方法”(Quantitative and Qualitative Methods forCharacterizing Cancerous Blood Cells Including Leukemic BloodSamples Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临时申请；2001年10月19日提交的序列号为60/386,073的题为“用光学生物盘平台定性和定量表征包括淋巴瘤血样的癌血细胞的方法”(Methods forQuantitative and Qualitative Characterization of Cancerous BloodCells including Lymphoma Blood Samples Using Optical Bio-DiscPlatform)的美国临时申请；2001年10月26日提交的序列号为60/386,071的题为“通过原发抗体与试样的位置外温育和随后由表面结合继发抗体进行的捕获而对特异性细胞进行捕获的方法以及包括该方法的光学生物盘”(Methods for Specific Cell Capture by Off-SiteIncubation of Primary Antibodies with Sample and SubsequentCapture by Surface-Bound Secondary Antibodies and OpticalBio-Disc including Same)的美国临时申请；2001年11月7日提交的序列号为60/344,977的题为“包括免疫表型分型的细胞分离和分型的定量及定性方法”(Quantitative and Oualitative Methods for CellIsolation and Typing Including lmmunophenotyping)的美国临时申请；和2001年11月9日提交的序列号为60/349,975的题为“用包括肝素、血浆或聚赖氨酸的带电物质减少光学生物盘上细胞的非特异性结合的方法”(Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells onOptical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin，Plasma，or Poly-Lysine)的美国临时申请中，所有这些申请通过参考结合在本文中。
所有专利、临时申请、专利申请和本说明书中提到的其它出版物作为参考被全部结合入本文中。
尽管本发明已经参照某些优选实施例进行了详细说明，但是应该理解，本发明并不局限于这些精确的实施例。相反，根据说明实施本发明的目前最佳方式的本光学生物公开内容，本领域的技术人员将明白，在不偏离本发明的精神和范围的情况下可作出许多修改和变化。因此，本发明的范围由后面的权利要求书而不是前面的说明所指示。在权利要求书的等价物的意思和范围内的所有改变、修改和变化将被认为是在其范围内。
此外，仅用常规试验，本领域的技术人员将认识或者能够确定这里所述的本发明的具体实施例的许多等价物。这些等价物也被确定为被后面的权利要求书所包括。

Claims (27)

1.一种用于进行细胞测定的光学生物盘，所述盘包括：
可旋转的基底；
与所述基底相联的帽部分；以及
在所述基底和所述帽部分之间形成的射流回路，所述射流回路包括：
混合室，所述混合室包括入口；
与所述混合室以流体相通的纯化室；
与所述纯化室相联的过滤装置；
与所述纯化室以流体相通的分析室，所述分析室包括捕获区；以及
与所述分析室相联的排气孔。
2.根据权利要求1所述的光学生物盘，其特征在于，所述过滤装置是从包括微球和网状筛的组合中选出的。
3.根据权利要求2所述的光学生物盘，其特征在于，所述微球涂有纯化剂。
4.根据权利要求3所述的光学生物盘，其特征在于，所述纯化剂是从包括以下物质的组合中选出的：单克隆抗体、多克隆抗体、寡核苷酸、配体、受体，及结合剂。
5.根据权利要求4所述的光学生物盘，其特征在于，所述单克隆抗体是从包括以下物质的组合中选出的：抗-CD56、抗-CD14、抗-CD19、抗-CD9、抗-CD31、抗-CD41、抗-CD13、抗-CD31和抗-CD43。
6.根据权利要求1所述的光学生物盘，其特征在于，所述捕获区涂有捕获剂。
7.根据权利要求6所述的光学生物盘，其特征在于，所述捕获剂是从包括以下物质的组合中选出的：单克隆抗体、多克隆抗体、寡核苷酸、配体、受体，及结合剂。
8.根据权利要求7所述的光学生物盘，其特征在于，所述单克隆抗体是从包括以下物质的组合中选出的：抗-CD4、抗-CD8和抗-CD2。
9.根据权利要求1所述的光学生物盘，其特征在于，还进一步包括溶解缓冲剂贮器、将所述溶解缓冲剂贮器与所述混合室连接起来的溶解通道、以及位于所述溶解通道内的溶解缓冲剂阀；用溶解缓冲剂预填充所述溶解缓冲剂贮器。
10.根据权利要求9所述的光学生物盘，其特征在于，还进一步包括分析缓冲剂贮器、将所述分析缓冲剂贮器与所述纯化室连接起来的缓冲剂通道、以及位于所述缓冲剂通道内的分析缓冲剂阀；用分析缓冲剂预填充所述分析缓冲剂贮器。
11.根据权利要求10所述的光学生物盘，其特征在于，还进一步包括与所述分析室和所述排气孔以流体相通的废物室。
12.根据权利要求11所述的光学生物盘，其特征在于，还进一步包括位于射流回路中、将所述混合室与所述纯化室连接起来的样品混合阀。
13.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、或8任一项所述的光学生物盘，其特征在于，还进一步包括将所述混合室与所述纯化室连接起来的RBC捕获区，从而当将样品装入所述混合室时，所述样品在进入所述纯化室之前流过所述RBC捕获区。
14.根据权利要求13所述的光学生物盘，其特征在于，所述RBC捕获区包括贯穿整个RBC捕获区而分布的墩柱。
15.根据权利要求14所述的光学生物盘，其特征在于，所述RBC捕获区涂有RBC捕获剂。
16.根据权利要求15所述的光学生物盘，其特征在于，所述RBC捕获剂是凝集素。
17.一种用于实施细胞测定的权利要求12所述光学生物盘的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
通过所述入口将全血样品装入所述混合室；
将所述生物盘装入光学读取器；
以第一速度旋转所述生物盘，所述第一速度足以打开所述溶解缓冲剂阀并将所述溶解缓冲剂释放到含有血样的所述混合室内；
将所述溶解缓冲剂内的所述样品温育足够的时间，以使样品中的红细胞溶解；
以第二速度旋转所述生物盘，所述第二速度足以打开所述样品混合阀并使所述样品进入和通过所述纯化室，并进入所述分析室，在所述纯化室，不需要的细胞被捕获，而在所述分析室，特异性细胞被捕获在所述捕获区上；
使电磁辐射的入射束指向所述捕获区；
检测与所述捕获区处的盘相互作用之后所形成的电磁辐射的所述束；
将所检测的束转换成输出信号；以及
分析所述输出信号，以便从其中提取与捕获区上捕获的细胞数相关的信息。
18.一种用于细胞测定的权利要求16所述光学生物盘的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
通过所述入口将全血样品装入所述混合室；
将所述生物盘装入光学读取器；
以一个速度将所述生物盘旋转一定的时间，所述速度和时间足以使所述样品通过所述RBC捕获区、通过所述纯化区、并通过所述分析室，在所述RBC捕获区，样品中的红细胞被捕获，在所述纯化区，样品中不需要的细胞被捕获，而在所述分析室，特异性细胞被捕获在所述捕获区上；
使电磁辐射的入射束指向所述捕获区；
检测与所述捕获区处的盘相互作用之后所形成的电磁辐射束；
将所检测的束转换成输出信号；以及
分析所述输出信号，以便从其中提取与捕获区上捕获的细胞数相关的信息。
19.一种用于进行细胞测定的光学生物盘，所述光学生物盘包括：
可旋转的基底；
与所述基底相连接的微流盒；以及
在所述微流盒内形成的射流回路。
20.根据权利要求19所述的光学生物盘，其特征在于，所述微流盒是由板形成的，所述板具有多个切掉部分，从而在组装板以形成所述的微流盒时，形成所述射流回路的多个部件，所述部件包括入口、混合室、流动通道和纯化室。
21.根据权利要求20所述的光学生物盘，其特征在于，所述纯化室填充有过滤装置。
22.根据权利要求21所述的光学生物盘，其特征在于，还进一步包括：
与所述基底相联的帽部分；以及
在所述帽部分和所述基底之间形成有捕获区的分析室；所述分析室与所述纯化室以流体相通。
23.一种用于接收样品的光学盘及驱动系统，所述系统包括：
生物盘，包括：
基底，
帽，所述帽与基底、限定在所述基底和所述帽之间的混合室、纯化室以及分析室平行，所述分析室具有捕获区；以及
在所述捕获区处的基底上的捕获层，从而第一捕获区具有第一细胞捕获剂，第二捕获区具有第二细胞捕获剂；
光学盘驱动器，包括：
用于将光线指向所述捕获区处的盘的光源，
用于检测从所述捕获区的盘反射或透过的光线并提供信号的检测器；以及
利用所述信号来计数结合到捕获分子上的样品中项目的处理器。
24.一种细胞测定中所用的光学生物盘的制造方法，所述制造方法包括以下步骤：
形成可旋转的光学盘基底；
形成与所述基底具有相似尺寸的盖盘；
形成具有切掉部分以形成射流回路的通道层；所述射流回路包括入口、混合室、纯化室、分析室和排气孔；所述分析室包括捕获区；
将捕获探针结合到所述捕获区上；
将所述通道层连接到所述基底上；
将过滤装置装入所述纯化室；
将所述盖盘连接到所述通道层上，借此形成所述的光学生物盘。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述连接步骤是利用从包括粘合剂和塑料焊接的组合中选出的技术来完成的。
26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述过滤装置是从包括微球和网状筛的组合中选出的。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述过滤装置涂有纯化剂。
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