发明内容
本发明所要解决的技术问题在于扩大聚-γ-谷氨酸应用范围,作为一种生物可降解型肥料吸收促进剂,聚-γ-谷氨酸能够节省肥料,减少由于肥料的过分使用对环境造成的污染,提高农作物的产量与品质。
实现本发明的技术方案为:
所述的聚-γ-谷氨酸由D型谷氨酸(D-Glu)和L型谷氨酸(L-Glu)通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物,在每一个重复单元的α-碳原子还有一个游离的羧基,平均分子量10,000-10,000,000道尔顿。
所述的聚-γ-谷氨酸用于氮(N)、磷(P)、钾(K)单一元素或其组合使用的肥料吸收促进剂。
所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂可为聚-γ-谷氨酸液态发酵制品,或者为固态发酵的含聚-γ-谷氨酸的生物有机肥。
聚-γ-谷氨酸的液体发酵生产方式可采用专利ZL03118908.3中的液体发酵法生产。
固态发酵的含聚-γ-谷氨酸的生物有机肥通过固态发酵的方式生产,以猪粪或奶牛粪为主要原料,按一定比例添加豆粕、麸皮、谷氨酸和柠檬酸等辅料,采用菌株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilisCCTCC202048)接种,室外堆积发酵生产含肥料吸收促进剂(聚-γ-谷氨酸含量10%-12%)的生物有机肥。
所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂的应用方法包括水培:发芽3d后,将标准营养液(Ca(NO3)2·4H2O 945mg/L,KNO3 809mg/L,(NH4)H2PO4 153mg/L,MgSO4·7H2O 493mg/L,H3BO3 2.86mg/L,MnSO4·4H2O 2.13mg/L,ZnSO4·7H2O 0.22mg/L,CuSO4·5H2O 0.08mg/L,Fe-EDTA 30mg/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.02mg/L)稀释4倍后,浇施培养;7d后,将所用标准营养液稀释2倍浇施培养;二叶一心期时,选取均匀一致的幼苗移栽到水培黑色塑料盆钵(φ7cm×15cm)中。每钵加400mL标准营养液并溶解4-40mg的聚-γ-谷氨酸肥料促进剂。
所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂的应用方法包括灌根:将不同作物正常施用量的三元复合肥和聚-γ-谷氨酸混合溶解在水中。作物定植后,在作物生长适当的时期灌根,聚-γ-谷氨酸灌根量为10-50g/666平方米(亩)。
所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂的应用方法包括叶面喷施:将不同作物正常施用量的三元复合肥和聚-γ-谷氨酸混合溶解在水中。在作物生长适当的时期喷施叶面,聚-γ-谷氨酸喷施量为10-50g/666平方米。
种植的农业作物包括蔬菜、谷物、大豆及烟叶、茶叶、中药材等经济作物。
本发明的有益效果在于:
(1)生物降解:聚-γ-谷氨酸是微生物合成的由D型和L型谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物,可被土壤中微生物降解。与TPA相比具有更大的环保价值;
(2)在保证植物生长正常的情况下,每666平方米施用肥料促进剂10克至50克,可减少化学肥料正常施用量10-30%,降低了成本;
(3)在植物正常的化学肥料施用量的基础上,每666平方米施用肥料促进剂10克至50克,可提高作物的产量,增产10-30%以上,提高了效益;
(4)改善了作物的品质,提高了作物中N、P、K的含量;扩大聚-γ-谷氨酸应用范围。
具体实施方式
实施例1:固态发酵生产聚-γ-谷氨酸
聚-γ-谷氨酸也可通过固态发酵的方式生产,本发明以猪粪或奶牛粪为主要原料,按一定比例添加豆粕、麸皮、谷氨酸和柠檬酸等辅料,采用专利菌株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis CCTCC202048)接种,室外堆积发酵生产含聚-γ-谷氨酸的生物有机肥。
固体发酵方法如下:
1)制备种子液:将菌株进行活化,然后将活化好的菌株接种于种子液培养基中,该培养基的组分及其配比如下:牛肉膏10.0g,蛋白胨5.0g,NaCl 10.0g,蒸馏水1000ml,pH7.2-7.4。种子的培养条件及方法是:30℃培养4.5h,取生长至对数中期(OD600nm=1.4)的菌株为生产用菌种。
2)制备用于扩大培养的固体发酵培养基:该培养基包括下列成分(重量/重量计,w/w):
配方一:新鲜猪粪62.5%,黄豆饼粉25.0%,麦麸5.0%,谷氨酸5.0%,柠檬酸2.5%;补充水份至培养基的含水量60%,调整pH9.0。
配方二:56.32%新鲜奶牛粪,23.35%黄豆饼粉,16.08%麦麸和4.25%谷氨酸,补充水份至培养基的含水量60%,调整pH9.0。
3)将步骤1)培养好的种子液接种于步骤2)所述的培养基中进行发酵;
4)发酵生产的工艺条件:
发酵容器装料量10-30%,接种量8%,初始pH9.0,培养温度40℃,通风发酵48h;最终得到聚-γ-谷氨酸含量5%-6%(配方一:6%;配方二:5%)的固态发酵产物。
5)将步骤4)得到的发酵产物在80℃条件下干燥,使其水分含量低于5%,即为固态发酵含10%-12%聚-γ-谷氨酸的生物有机肥。
实施例2:聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)对营养钵栽培小白菜茎叶的养分积累
实验步骤:选择饱满一致的小白菜种子(品种为上海青)发芽。发芽3d后,将标准营养液(配方见发明内容第三条)稀释4倍后,浇施培养;7d后,将标准营养液稀释2倍后,浇施培养;二叶一心期时,选取均匀一致的幼苗移栽到水培黑色塑料盆钵(7cm×15cm)中,分为4大组,一组每钵加400mL标准营养液,其余各组的营养素依次将标准营养液稀释2倍、4倍和8倍,每一大组再分为5小组,分别加入聚-γ-谷氨酸,每小组聚-γ-谷氨酸的终浓度分别为0、50mg/kg、100mg/kg,每钵栽植4株幼苗,试验设10次重复,随机排列。每周更换营养液1次,同时加入对应浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿),经常调换营养钵位置,5-7叶期时收获幼苗茎叶烘干称重,消化后采用半微量凯氏定氮法测全氮;P、K的测定采用美国VARIAN公司生产的VISTA-MPX型ICP-OES。
实验结果如下:
表1不同浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)对小白菜茎叶中钾积累的影响(%)(钾在小白菜茎叶中含量的重量比)
标准培养液稀释倍数聚-γ-谷氨酸添加量 | 8倍 | 4倍 | 2倍 | 原液 |
050mg/kg |
5.055.28 |
5.15.23 |
5.515.6 |
6.26.34 |
100mg/kg |
5.4 |
6.15 |
5.78 |
6.85 |
表2不同浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)对小白菜茎叶中磷积累的影响(%)(磷在小白菜茎叶中含量的重量比)
标准培养液稀释倍数聚-γ-谷氨酸添加量 | 8倍 | 4倍 | 2倍 | 原液 |
050mg/kg |
1.2931.637 |
1.451.719 |
1.5831.84 |
1.652.031 |
100mg/kg |
1.516 |
1.831 |
1.688 |
1.59 |
表3不同浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)对小白菜茎叶中氮积累的影响(%)(氮在小白菜茎叶中含量的重量比)
标准培养液稀释倍数聚-γ-谷氨酸添加量 | 8倍 | 4倍 | 2倍 | 原液 |
0 |
4.66 |
4.78 |
5.32 |
6 |
50mg/kg |
5.7 |
5.32 |
6.67 |
7.79 |
100mg/kg |
4.33 |
6.12 |
7.44 |
6.05 |
实验结果表明:在营养液中添加聚-γ-谷氨酸,有利于K、P、N元素在小白菜茎叶中的积累。
实施例3:聚-γ-谷氨酸灌根(平均分子量10000千道尔顿)对盆栽小白菜产量的影响
试验处理:设不加聚-γ-谷氨酸和加不同浓度的聚-γ-谷氨酸(25mg/kg土、50mg/kg土、100mg/kg土、200mg/kg土、400mg/kg土),共6组,底肥的营养元素施用量设4组,一组为1kg土施氮0.20g、磷0.065g、钾0.16g,肥料种类分别为市售商品化肥:尿素、过磷酸钙、氯化钾,其余各组的营养素依次减为原来的75%、50%、33%。
实验步骤:将肥料溶于水与聚-γ-谷氨酸(平均分子量1000千道尔顿)溶液混合,每盆称土1kg,将其与以上肥料混匀后装盆,共24组实验,重复3次。每盆分别播种供试小白菜(品种为上海青)均匀饱满的种子15粒,在其生长到二叶一心期时定植10株,不定期浇水。于小白菜7-9叶期时收获幼苗,取地上部分在70℃下烘干称重。
实验结果见表4。
表4不同浓度聚-γ-谷氨酸(平均分子量10000千道尔顿)对小白菜产量的影响(盆栽试验)单位:g
肥料浓度聚-γ-谷氨酸浓度 |
33% |
50% |
75% |
100% |
025mg/kg土50mg/kg土100mg/kg土200mg/kg土 |
0.360.380.420.480.55 |
0.420.450.490.550.6 |
0.50.550.590.610.62 |
0.620.640.680.70.71 |
400mg/kg土 |
0.53 |
0.61 |
0.63 |
0.7 |
结果显示:当肥料浓度为100%时,加入25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg聚-γ-谷氨酸比对照分别增产3%、10%、13%、15%和13%;当肥料浓度为原浓度的33%、50%、75%和100%时,加入100mg/kg聚-γ-谷氨酸比对照分别增产33%、31%、22%和13%,加入200mg/kg聚-γ-谷氨酸与对照相比分别增产53%、43%、24%和15%,这个实验再次说明聚-γ-谷氨酸(平均分子量10000千道尔顿)可以促进小白菜的生长,在肥料较缺乏的时候,聚-γ-谷氨酸对小白菜增产效果尤为明显。当加入200mg/kg的聚-γ-谷氨酸时,50%肥料浓度的小白菜生长量与100%肥料浓度的生长量几乎相当,这说明在合适的情况下,聚-γ-谷氨酸可节约将近50%的肥料。
实施例4:聚-γ-谷氨酸(平均分子量10千道尔顿)灌根试验对田间小区栽培小白菜产量的影响
实验区域面积:在面积为2.0m×5.0m的田地里进行,
实验步骤:选取均匀饱满小白菜种子(品种为上海青),均匀播种,在其生长到二叶一心期时定植,株间保持10cm间距,不定期浇水。定植10d后灌根1次,40mL/株。定植18d后喷施1次,10mL/株,聚-γ-谷氨酸(平均分子量50千道尔顿)喷施量为灌根量的1/4。3个重复,区组随机排列。于7-9叶期时收获幼苗,取地上部分称鲜重。
试验设3个处理:聚-γ-谷氨酸溶液施用浓度为0、100mg/l和300mg/l。
实验结果见表5。:
表5不同浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量10千道尔顿)灌根对小白菜产量的影响
聚-γ-谷氨酸浓度 |
各重复平均株重(g) | 各处理平均株重(g) |
增产幅度(%) |
1 |
2 |
3 |
0(清水)100mg/l300mg/l |
26.4634.5036.56 |
27.0837.2033.30 |
22.8630.3031.72 |
25.4734.0033.86 | 33.5032.94 |
结果显示:加100mg/l和300mg/l的聚-γ-谷氨酸(平均分子量10千道尔顿)分别比对照增产33.50%和32.94%。在田间试验中选用100-300mg/l浓度的聚-γ-谷氨酸溶液灌根较为合适。
实施例5:平均分子量200千道尔顿的聚-γ-谷氨酸叶面喷施对田间小区小白菜产量的影响
为了与实际大田实验情况相接近,本实验采用田间小区(2.0m×5.0m)实验,常规施肥为1kg土施氮0.20g、磷0.065g、钾0.16g,肥料种类分别为市售商品化肥:尿素、过磷酸钙、氯化钾,采取聚-γ-谷氨酸水溶液叶面喷洒的方式,通过不同的处理得到的数据来统计分析聚-γ-谷氨酸叶面喷施对植物生状况的影响。
实验处理:
1、常规施肥,清水浇灌(空白对照);
2、常规施肥,用40mg/L的聚-γ-谷氨酸溶液叶面喷施一次,喷施量200L/666平方米,计聚-γ-谷氨酸用量5g/666平方米;
3、常规施肥,用60mg/L的聚-γ-谷氨酸溶液叶面喷施一次,喷施量200L/666平方米,计聚-γ-谷氨酸用量25g/666平方米;
4、常规施肥,用80mg/L的聚-γ-谷氨酸溶液叶面喷施一次,喷施量200L/666平方米,计聚-γ-谷氨酸用量50g/666平方米;
实验结果见表6:
表6聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)叶面喷施对植物生长状况的影响
处理 |
每株平均重量(g) |
增产率(%) |
1234 |
25283032 |
--122028 |
通过以上实验,小白菜在不同浓度聚-γ-谷氨酸叶面喷施的情况下,增产效果随聚-γ-谷氨酸添加量的增加而增加,叶面积增大,颜色更加浓绿,说明了聚-γ-谷氨酸叶面喷施对植物生长状况具有极大的促进作用。
实施例6:含聚-γ-谷氨酸(平均分子量2000千道尔顿)发酵猪粪作为底肥对田间小区栽培小白菜产量的影响
实验处理:在小区试验面积为4.0m×5.0m,施肥量为300g干重/m2田地中,将猪粪发酵肥料和猪粪未发酵肥料风干后施肥,底肥的施用设计如下表。
表7底肥的施用设计
|
肥料I(CK) |
肥料II |
肥料III |
组成 |
未发酵猪粪 |
发酵猪粪∶未发酵猪粪=1∶450(w/w) |
发酵猪粪∶未发酵猪粪=1∶150(w/w) |
聚-γ-谷氨酸含量(mg/kg肥料) |
0 |
100 |
300 |
实验步骤:选取均匀饱满小白菜种子(品种为上海青),均匀播种,在其生长到二叶一心期时定植,株间保持间距10cm,不定期浇水。于小白菜7-9叶期时收获,取地上部分称鲜重。实验结果见表8。
表8底肥中不同浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量2000千道尔顿)对小白菜产量的影响
处理 |
各重复平均株重(g) | 各处理平均株重(g) | 增产幅度(%) |
1 |
2 |
3 |
肥料I肥料II肥料III |
10.6814.8015.68 |
11.2413.6916.32 |
11.7515.7214.98 |
11.2214.7415.66 | 31.5639.57 |
肥料II(含100mg/kg聚-γ-谷氨酸)、肥料III(含300mg/kg聚-γ-谷氨酸)分别比肥料I(对照)增产31.56%和39.57%。该实验说明了聚-γ-谷氨酸对小白菜的增产有显著影响。
实施例7:玉米大喇叭口期尿素中施加聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)对玉米田间产量的影响
实验设计:
1、处理:设四个处理:
A、每666平方米施尿素15斤;B、每666平方米施尿素15斤+10g聚-γ-谷氨酸;
C、每666平方米施尿素30斤;D、每666平方米施尿素30斤+10g聚-γ-谷氨酸;
2、面积:每个小区64平方米,每个小区设4行,每行长16米,宽1米。
3、施肥时间:6月23日(玉米大喇叭口期)
4、施用方法:尿素+聚-γ-谷氨酸用水溶化后混合淋施。
实验结果见表9。
表9聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)灌根施用对玉米产量的影响
处理 |
A |
B |
C |
D |
小区产量(kg)株高(cm)比A增加(%)比C增加(%) |
40.5184 |
45.5192.612.3 |
52195.228.4 |
53.5194.632.12.9 |
实验结果分析:
1、聚-γ-谷氨酸在低施肥水平下增产明显,增产12.3%;
2、聚-γ-谷氨酸在高施肥水平下增产不明显,仅增2.9%;
实施例8:聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)在烟草栽培上对其保肥增效作用
实验步骤:烟草生育期分为团棵期、旺长期、成熟期三个时期,在基肥追肥并施的实际生产基础上,分别在三个不同生长阶段灌根施用不同量聚-γ-谷氨酸。666平方米施纯氮12.5kg,纯氮钾磷比为1∶1∶2。底肥施用量:50%氮肥、50%钾肥及100%磷肥;底肥种类:N、P、K三元复合肥+过磷酸钙+硫酸钾;追肥种类:硝酸铵、硫酸钾。
实验结果见表10。
表10聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)在烟草栽培上对烟叶产量的影响
处理 |
666平方米产量(kg) |
增产率(%) |
追肥+聚-γ-谷氨酸10g/亩、团棵期灌根追肥+聚-γ-谷氨酸20g/亩、团棵期灌根追肥+聚-γ-谷氨酸40g/亩、团棵期灌根追肥+聚-γ-谷氨酸10g/亩、旺长期灌根追肥+聚-γ-谷氨酸20g/亩、旺长期灌根追肥+聚-γ-谷氨酸40g/亩、旺长期灌根追肥+聚-γ-谷氨酸10g/亩、成熟期灌根追肥+聚-γ-谷氨酸20g/亩、成熟期灌根追肥+聚-γ-谷氨酸40g/亩、成熟期灌根追肥+清水灌根(对照) |
170.4177.8185.7156.5159.3161.0158.5160.6161.0160.1 |
6.411.116.0-2.2-0.50.6-1.00.30.60.0 |
总体而言,团棵期施用聚-γ-谷氨酸灌根,增产效果较佳,其中10g/666平方米的施用量效果最佳,较对照高出25.5kg,增产率达15.9%;旺长期和成熟期灌根无增产效果。从聚-γ-谷氨酸在团棵期灌根的浓度看,烟叶产量、产值都随聚-γ-谷氨酸的浓度增加而渐次增强。