CN1811369A

CN1811369A - 组织特定区域的捕获方法及专用设备

Info

Publication number: CN1811369A
Application number: CNA2006100458528A
Authority: CN
Inventors: 李宏; 孔庆友; 孙媛; 刘佳; 文殊
Original assignee: Dalian Medical University
Current assignee: Dalian Medical University
Priority date: 2006-02-14
Filing date: 2006-02-14
Publication date: 2006-08-02
Anticipated expiration: 2026-02-14
Also published as: CN100587451C

Abstract

本发明公开一种组织特定区域的捕获方法，有如下步骤：从冰冻组织块上取切片置于显微镜下选定目的区域；用标定笔在冰冻组织切片的正面标定目的区域；在冰冻组织切片的背面涂信息转移膜液体并用水性笔在信息转移膜上镜像标出目的区域；将冰冻组织切片的信息转移膜面与冰冻组织块吻合相贴，然后再将冰冻组织切片取下；用切割刀沿冰冻组织上的目的区域标志进行切割，在冰冻条件下切片分离后收集目的区域。所用的专用设备是标定笔、电动切割刀，标定笔有笔芯(1)，笔芯(1)的上端设有显微镜标准接口(2)，中部设有弹性染料瓶(3)，下端是与弹性染料瓶(3)相接的标定头(4)，与笔芯(1)外接有笔套(5)。可避免其它实验方法出现的组织块在常温下长时间操作使标本溶化导致样本变质或降解的现象发生，剩余组织还可以用于其他研究目的。

Description

组织特定区域的捕获方法及专用设备

技术领域：

本发明涉及一种从组织中捕获特定区域的方法及专用设备，尤其是一种操作简单、成本低，可有效防止细胞交叉污染的组织特定区域的捕获方法及专用设备。

背景技术：

细胞分子遗传学尤其是基因组学研究是生命科学领域重要的组成部分。它要解决的核心问题包括：基因组的构成、遗传规律和多样性，不同生理和病理状态下的基因组表达特点和在时空上的调节以及借助生物信息学的手段对上述分析的数据进行储存、加工和分析。从而在基因组和蛋白质组学水平全面揭示与生命的发生、发展和演变密切相关的基因。

虽然国内外该研究领域进展十分迅速，但也面临某些技术问题，其中十分引人注目的是：与体外培养的、由单一类型细胞组成的细胞系不同，取自体内组织/器官的标本存在多种细胞成分，即便是同一个标本的不同区域，组织的构成也有明显的差异。各类组织中都有多种细胞成分存在，这很容易造成提取到的核酸和蛋白样本出现细胞间的交叉污染。由于不同细胞的基因表达特点有明显差异，因此很容易导致实验结果出现偏差。另外，目前的组织处理方法也很难保证用于上游基因组学检测和下游侯选基因核实的组织样本来源于(基本)相同的细胞群体，致使实验结果缺乏对应性，明显增加了侯选基因核实的工作量。为此，人们越发感到，原位的组织和分子病理学观察与组织特定区域的核酸和蛋白提取是互为补充，相得益彰的关系，应当在一个组织块上同步完成。只有这样，才能提高实验设计的严谨性，保证课题研究的科学性、可信性和高效性。

为了捕获组织特定区域，人们已做了种种努力。其中，颇为有效的方式是美国国立卫生研究院(NIH)科学家Emmert-Buck等人发明的激光捕获显微切割技术(Laser Capture Microdissection，LCM)。其基本原理是，在显微镜下选择组织切片内的特定区域，用激光束将其与主体分离，经特殊滤膜把它移至试管中做进一步处理(如DNA、RNA和蛋白提取)。该技术的准确性很高，但操作复杂，耗时较长，特别是在常温下操作容易造成RNA降解，而且，LCM的最大捕获直径仅有0.6mm，故每次采集的组织/细胞数量十分有限，即便经过多次捕获也未必能满足诸如基因表达谱分析、Northern或Western印记分析等实验的基本用量。如若采用高效方法对提取到的核酸样本加以扩增，则很容易造成假阳性的结果，进一步增加了结果核实的工作量。另外，LCM的专用设备十分昂贵(60-80万元)，它的实验辅助用品和消耗材料也价格不菲，从而明显增加了项目研究的实验成本。所以，该设备虽问世十余年，但研究人员大多“望价却步”，加之所能捕获的样本量较少，致使其应用范围十分有限。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术所存在的操作复杂、耗时长、成本高、样本产出量少等技术问题，提供一种经济实用、简便易行、工作效率高和样本产出量大的组织特定区域的捕获方法和专用设备。

本发明的技术解决方案是：一种组织特定区域的捕获方法，其特征在于有如下步骤：

a.从冰冻组织块上取切片置于显微镜下选定目的区域；

b.用标定笔在冰冻组织切片的正面标定目的区域；

c.在冰冻组织切片的背面涂信息转移膜液体并用水性笔在信息转移膜上镜像标出目的区域；

e.将冰冻组织切片的信息转移膜面与冰冻组织块吻合相贴，然后再将冰冻组织切片取下；

d.用切割刀沿冰冻组织上的目的区域标志进行切割，在冰冻条件下切片分离后收集目的区域。

所述的信息转移膜液体是按下列组分、重量及方法配制而成：椰子油18～22、蓖麻油5～9、牛脂11～15、糖12～14、氢氧化钠20～24、酒精8～12、苏打0.3～0.7、水28～30，将椰子油、蓖麻油、牛脂投入容器中加热至75～85℃，另将氢氧化钠、苏打溶于水后徐徐加入所加热的油料中，搅拌使之皂化，待皂液透明，加入糖和酒精。

一种组织特定区域的捕获方法用标定笔，有笔芯1，笔芯1的上端设有显微镜标准接口2，中部设有弹性染料瓶3，下端是与弹性染料瓶3相接的标定头4，与笔芯1外接有笔套5。

所述的弹性染料瓶3的中部为螺纹状弹性收缩体；所述的标注头4为设有金属芯，金属芯外套有长度略长于金属芯的弹性减压套。

一种组织特定区域的捕获方法用电动切割刀，有笔式壳体6，笔式壳体6内前端置有电机7，电机7的输出轴与置于笔式壳体6外的铣刀8相接，在笔式壳体6内还设有电池9，电池9通过开关10与电机7相接。

所述电机7与电机9之间有弹性线圈11，开关10设置在笔式壳体6的后端，开关10与电池9之间有弹性线圈12。

本发明可实现目的区域的精确定位，采用独特的方法将组织切片上的定位信息可靠地转移到组织块的相应部位，而后使用专用的电动组织切割刀对目的组织区域加以切割，使其在切片的过程中与组织主体分离并在完全冷冻的状态下以手工的方式将其快速收集到试管中进行样本提取。具有如下优点：

1.可避免其它实验方法出现的组织块在常温下长时间操作使标本溶化导致样本变质或降解的现象发生；

2.对母体组织的破坏甚微，在满足从特定组织区域精确地提取到高质量、高产出的核酸和蛋白质样本的同时，剩余组织还可以用于其他研究目的；

3.工作效率高、获取的样本量大，实验成本明显降低；

4.所用设备成本低，经济实用、操作简便、易于推广，既能用在诸如基因组和蛋白质组学等高端领域研究，也可以在日常的科研以及临床分子诊断中应用，提高了科学研究的科学性、可信性、先进性和高效性。

附图说明：

图1为本发明实施例标定笔的结构示意图。

图2为本发明实施例切割刀的结构示意图。

具体实施方式：

下面将结合附图说明本发明的具体实施方式。

实施例1：

一种组织特定区域的捕获方法，其特征在于有如下步骤：

a.在液氮中从冰冻组织块上取切片，组织形态学染色，切片的大小以适合台式显微镜观察为宜。冰冻组织可以是新鲜的冰冻组织，也可以是石蜡包埋组织标本或者多聚甲醛固定的标本；

b.将切片置于显微镜下观察，选定目的点(spot)或目的区域(reqion)；

c.在冰冻组织切片的正面，用笔对目的点(spot)或目的区域(reqion)处着色，即标定目的区域；

d.在冰冻组织切片的背面涂信息转移膜液体，待信息转移膜液体风干(20秒左右)后，用水性笔在信息转移膜上镜像标出目的点或目的区域，信息转移膜液体必须是能在切片上成膜且与冰冻组织相贴时可以转移至冰冻组织上。

e.将冰冻组织切片的信息转移膜面与冰冻组织块(-25～-30℃)吻合相贴，然后再将冰冻组织切片取下；

f.用切割刀沿冰冻组织(-30～-50℃)上的目的区域标志的外缘做宽度小于0.2mm，深度为0.2～0.3mm的切割，约5μm的连续切片，目的区域便与组织主体分离，收集目的区域。可将目的区域置于含样本提取液的离心管中，用常规方法制备核酸(DNA，RNA)和蛋白样本。

实施例2：

本发明实施例2所用标定笔如图1所示：有笔芯1，笔芯1的上端设有显微镜标准接口2，中部设有弹性染料瓶3，下端是与弹性染料瓶3相接的标定头4，与笔芯1外接有笔套5。弹性染料瓶3可以用弹性材料制成，也可以将中部加工成螺纹状弹性收缩体，标注头4为设有金属芯，金属芯外套有直径为0.5mm、长度比金属芯略长的弹性减压套，如硬质塑料套，起缓冲减压的作用。本发明实施力所用电动切割刀如图2所示：有笔式壳体6，笔式壳体6内前端置有电机7，电机7的输出轴与置于笔式壳体6外的铣刀8相接，在笔式壳体6内还设有电池9，电池9通过开关10与电机7相接。可以是在电机7与电机9之间有弹性线圈11，开关10设置在笔式壳体6的后端，开关10与电池9之间有弹性线圈12。

方法具体步骤如下：

a.制备信息转移膜，待用。按重量比取椰子油18～22、蓖麻油5～9、牛脂11～15、糖12～14、氢氧化钠20～24、酒精8～12、苏打0.3～0.7、水28～30；将椰子油、蓖麻油、牛脂投入容器中加热至75～85℃，再将氢氧化钠、苏打溶于水后徐徐加入所加热的油料中，搅拌使之皂化，待皂液透明，加入糖和酒精，搅拌均匀，置入软质的挤压容器中待用；

b.从液氮中取出冰冻组织制成切片，组织形态学染色，切片的大小以适合台式显微镜观察为宜。冰冻组织可以是新鲜的冰冻组织，也可以是石蜡包埋组织标本或者多聚甲醛固定的标本；

c.将切片置于显微镜下观察，选定目的点(spot)或目的区域(reqion)；

d.在冰冻组织切片的正面，用安装在显微镜上的标定笔对准目的点(spot)或目的区域(reqion)处，使标定笔的标定头4与目的点或目的区域相接触，压迫弹性染料瓶3，弹性染料瓶3中的染料便在目的点或目的区域着色，即标定目的区域；

e.在冰冻组织切片的背面涂信息转移膜液体并用刮刀刮平，待信息转移膜液体风干(20秒左右)后，用水性笔在信息转移膜上镜像标出目的点或目的区域；

f.将冰冻组织切片的信息转移膜面与冰冻组织块(-25～-30℃)吻合相贴，然后再将冰冻组织切片取下，此时，信息转移膜贴在冰冻组织块上，明显地显示出目的点或目的区域；

g.按动电动切割刀开关，电机与电源相接，铣刀转动，用电动切割刀沿冰冻组织上的目的区域标志进行切割，切割深度可以通过调节铣刀的长度来控制。目的区域组织在连续切片时便与组织主体自动分离，收集目的区域。可将目的区域置于含样本提取液的离心管仲，用常规方法制备核酸((DNA，RNA)和蛋白样本。

Claims

1.一种组织特定区域的捕获方法，其特征在于有如下步骤：

a.从冰冻组织块上取切片置于显微镜下选定目的区域；

b.用标定笔在冰冻组织切片的正面标定目的区域；

d.将冰冻组织切片的信息转移膜面与冰冻组织块吻合相贴，然后再将冰冻组织切片取下；

e.用切割刀沿冰冻组织上的目的区域标志进行切割，在冰冻条件下切片分离后收集目的区域。

2.根据权利要求1所述的组织特定区域的捕获方法，其特征在于所述的信息转移膜液体是按下列组分、重量及方法配制而成：椰子油18～22、蓖麻油5～9、牛脂11～15、糖12～14、氢氧化钠20～24、酒精8～12、苏打0.3～0.7、水28～30，将椰子油、蓖麻油、牛脂投入容器中加热至75～85℃，另将氢氧化钠、苏打溶于水后徐徐加入所加热的油料中，搅拌使之皂化，待皂液透明，加入糖和酒精。

3.一种权利要求1所述方法用标定笔，其特征在于：有笔芯(1)，笔芯(1)的上端设有显微镜标准接口(2)，中部设有弹性染料瓶(3)，下端是与弹性染料瓶(3)相接的标定头(4)，与笔芯(1)外接有笔套(5)。

4.根据权利要求3所述的标定笔，其特征在于：所述的弹性染料瓶(3)的中部为螺纹状弹性收缩体，所述的标注头(4)为设有金属芯，金属芯外套有长度略长于金属芯的弹性减压套。

5.一种权利要求1所述方法用电动切割刀，其特征在于：有笔式壳体(6)，笔式壳体(6)内前端置有电机(7)，电机(7)的输出轴与置于笔式壳体(6)外的铣刀(8)相接，在笔式壳体(6)内还设有电池(9)，电池(9)通过开关(10)与电机(7)相接。

6.根据权利要求5所述方法用电动切割刀，其特征在于：所述电机(7)与电机(9)之间有弹性线圈(11)，开关(10)设置在笔式壳体(6)的后端，开关(10)与电池(9)之间有弹性线圈(12)。