CN1795008A - 用于中性粒细胞介导的疾病的治疗方法的组胺结合化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗中性粒细胞介导的疾病的新方法。该方法包括将组胺结合化合物以治疗有效量给予患有这种疾病的患者。

Description

用于中性粒细胞介导的疾病的治疗方法的组胺结合化合物

本发明涉及一种治疗中性粒细胞介导的疾病的新方法。该方法包括将组胺结合化合物以治疗有效量给予患有这样一种疾病的患者。

所有此处引用的出版物、专利及专利申请均通过引用完全结合到本文中。

许多炎症的及自身免疫性疾病都以中性粒细胞汇聚于疾病部位为特征。在一些情况下这种汇聚并不适当而且损害正常组织。

在中性粒细胞-介导的许多类型疾病中，组织损伤被认为与活化的中性粒细胞释放的氧化自由基有关(Dahlgren C，Karlsson A.Respiratory burst in human neutrophils(人类中性粒细胞中呼吸功能的打断)，J Immunol Methods 1999 Dec 17；232(1-2)：3-14)并且可用组织髓过氧化物酶(MPO)活性对此进行定量。

中性粒细胞介导的疾病的实例包括成人呼吸窘迫综合征(ARDS)；婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)；严重急性呼吸综合征(SARS)；慢性阻塞性气道疾病(COPD)；囊性纤维化；呼吸机诱发的肺损伤(VILI)；毛细血管漏综合征；再灌注损伤，包括血栓性中风、冠状动脉血栓形成、心肺分流术(CPB)、冠状动脉旁路移植术(CABG)、四肢或指(趾)再植术、器官移植术、分流术肠炎、分流术关节炎、热损伤及挤压伤之后的损伤；术后炎症或边缘性浸润，牛皮癣；牛皮癣性关节病；类风湿性关节炎；Crohn’s病；溃疡性结肠炎；免疫性血管炎，包括Wegener’s肉芽肿病及Churg-Strauss病；酒精性肝病；中性粒细胞介导的肾小球肾炎；系统性红斑狼疮；狼疮性肾炎；动脉粥样硬化；系统性硬化病；痛风；牙周病，眼部炎症包括干眼、Sjogren’s综合征、隐形眼镜相关的乳头状结膜炎(CLAPC)、隐形眼镜相关的边缘性浸润，术后炎症包括白内障、青光眼、角膜移植术及激光原位角膜磨镶术(LASIK)的手术后炎症，严重过敏性结膜炎，春季角结膜炎(VKC)，弥漫性片状角膜炎，传染性及非特异性结膜炎，角膜炎及睑炎，及shield ulcers。

虽然已知组胺涉及事实上所有过敏性及炎症性过程，但以前并没有暗示组胺在中性粒细胞介导的疾病中有任何作用。虽然已有某些抗组胺剂被测试用来拮抗这种天然的疾病，但是这些药物的靶位是组胺受体，而不是组胺本身。而且，即使被用于联合其它药物治疗，在内毒素-诱导的肺损害动物模型的测试中这样的药物作用也有限(Byrne K，Sielaff TD，Michna B，Carey PD，Blocher CR，Vasquez A，Sugerman HJ.Crit Care Med.1990 Mar；18(3)：303-8；Byrne K，SielaffTD，Carey PD，Tatum JL，Blocher CR，Vasquez A，Hirsh JI，Sugerman HJ，Circ Shock.1990 Feb；30(2)：117-27；Sielaff TD，Sugerman HJ，Tatum JL，Kellum JM，Blocher CR.，J Trauma.1987 Dec；27(12)：1313-22；SielaffTD，Sugerman HJ，Tatum JL，Blocher CR.，Surgery.1987 Aug；102(2)：350-7)。人类治疗方案不包括用组胺阻断剂治疗这种性质的疾病(Bernard GR，Artigas A，Brigham KL，Carlet J，Falke K，Hudson L，LamyM，Legall JR，Morris A，Spragg R.Am J Respir Crit Care Med 1994 Mar；149(3 Pt 1)：818-24)。

中性粒细胞-介导的疾病是重要的健康问题并且与显著的发病率及死亡率有关。现有的治疗这些疾病的方法不是很有效。现在本发明者发现用直接结合于组胺的药物并逐渐将血管活性胺滴定至系统外可非常有效地治疗这些疾病。

因此，本发明提供治疗患者中性粒细胞介导的疾病的方法，包括将治疗有效量的组胺结合化合物给予病人。

本发明者发现通过将组胺从疾病部位完全清除，就可抵消中性粒细胞-介导的疾病。这种情况只可能发生在用与组胺有高度亲和力的药物结合的时候，这部分解释了为何先前没有识别出这些状态下组胺的作用；这类组胺结合剂只是最近才发现而没有被广泛使用。虽然先前的研究利用结合于组胺受体的药物探讨组胺的潜在作用，但只注意到边缘效应。现回顾分析，没能影响测试状态可能是因为存在不同组胺受体(H1、H2、H3、H4及其它可能尚未发现的受体)。药物的靶位是组胺受体而不是组胺分子本身，因此，药物无效并忽略了组胺在这些疾病中的作用。

中性粒细胞在骨髓中产生及发育成熟并从该组织移行到其作用部位。一旦它们到达这一部位，它们的正常作用是破坏入侵的病原体，表现为通过例如调理作用或补体系统等过程的清除。它们通过释放细胞毒性氧化自由基及吞噬作用来完成。它们还清除调亡的损伤组织细胞。只有当它们被数量或质量上不适当的化学引诱剂信号吸引时它们才会攻击正常细胞并引起以中性粒细胞介导疾病为特征的损害。我们所注意到的是组胺在引发这样的不适当化学引诱剂信号发生中可能很重要。

已知中性粒细胞表达组胺受体(Wescott S，Kaliner M.，Inflammation1983 Sep；7(3)：291-300；Burde R，Seifert R，Buschauer A，SchultzG.，Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacoll 989 Dec；340(6)：671-8)。但是，因为这种化合物被代谢及从循环中很快清除，所以组胺不可能在中性粒细胞从它们在骨髓中产生及发育成熟的部位移行中起重要作用(Ferreira SH，Ng KK，Vane JR.，Br J Pharmacol.1973 Nov；49(3)：543-53)。虽然本发明者不希望受任何特殊理论的约束，但认为更可能的是组胺可能通过吸引中性粒细胞至疾病部位的其它不同机制发挥作用，而已知它们本身至少部分是组胺依赖性的。这些机制可包括，特别是：血管内皮细胞粘附分子的表达(Jones DA，Abbassi O，McIntireLV，McEver RP，Smith CW.，Biophys J 1993 Oct；65(4)：1560-9)，对趋化因子细胞因子-诱导的中性粒细胞化学引诱剂的抑制(Harris JG，Flower RJ，Watanabe K，Tsurufuji S，Wolitzky BA，Perretti M.，BiochemBiophys Res Commun 1996 Apr 25；221(3)：692-6)，LTB4的释放(Takeshita K，Sakai K，Bacon KB，Gantner F.J Pharmacol Exp Ther.2003 Dec；307(3)：1072-8)及T淋巴细胞IL-16的释放(Gantner F，SakaiK，Tusche MW，Cruikshank WW，Center DM，Bacon KB，J Pharmacol ExpTher.2002 Oct；303(1)：300-7)。以前已证明这些活化作用通过不同组胺受体介导并存在相当多重叠以致于，例如，IL-16的释放可能由H2和H4受体控制。可能还有更多组胺受体有待鉴别。

此外，现在有证据说明在酵母多糖-诱导的中性粒细胞从骨髓移行过程中，在血管内皮及组胺H4受体上L-选择素粘附分子表达中组胺的重要作用(Takeshita K，Bacon KB，Gantner F.J Pharmacol ExpTher.2004 Mar 2[Epub ahead of print])。这些新近数据共同支持组胺通过许多受体，但最重要的是H4受体，在中性粒细胞募集和活化及它们所涉及的人类疾病不同模式中所发挥的作用。

由于系统的重复和杂乱，所以阻断单一组胺受体类型不可能防止中性粒细胞的募集而这可能是至今为止测试的组胺拮抗剂明显失败的原因之一。相反，清除游离组胺的化合物将防止药物与其任何受体接触，包括那些尚未发现的受体。这一特性使其能作为有用的治疗剂而起效。

许多疾病由中性粒细胞介导，包括过敏性、炎症性及自身免疫性疾病。具体地说，重要的中性粒细胞-介导的疾病包括成人呼吸窘迫综合征(ARDS)；婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)；严重急性呼吸综合征(SARS)；慢性阻塞性气道疾病(COPD)；囊性纤维化；呼吸机诱发的肺损伤(VILI)；毛细血管漏综合征；再灌注损伤，包括但不限于血栓性中风、冠状动脉血栓形成、心肺分流术(CPB)、冠状动脉旁路移植术(CABG)、四肢或指(趾)再植术、器官移植术、分流术肠炎、分流术关节炎、热损伤及挤压伤之后的损伤；术后炎症或边缘性浸润，牛皮癣；牛皮癣性关节病；类风湿性关节炎；Crohn’s病；溃疡性结肠炎；免疫性血管炎，包括但不限于Wegener’s肉芽肿病及Churg-Strauss病；酒精性肝病；中性粒细胞介导的肾小球肾炎；系统性红斑狼疮；狼疮性肾炎；动脉粥样硬化；系统性硬化病；痛风；牙周病，眼部炎症包括干眼、Sjogren’s综合征、隐形眼镜相关的乳头状结膜炎(CLAPC)、隐形眼镜相关的边缘性浸润，术后炎症包括白内障、青光眼、角膜移植术及激光原位角膜磨镶术(LASIK)的手术后炎症，严重过敏性结膜炎，春季角结膜炎(VKC)，弥漫性片状角膜炎，传染性及非特异性结膜炎，角膜炎及睑炎，及shield ulcers。本领域技术人员将了解其它的中性粒细胞-介导的疾病。根据本发明可治疗这些疾病中的任何一种。

本发明的方法中所用的组胺结合化合物应充当组胺清除剂，结合于组胺分子从而将组胺滴定至系统外。这样的清除剂如此“mopsup”出现在疾病或损伤部位系统的组胺。

优选组胺结合化合物应以至少10^-5M的亲和力结合于组胺，更优选小于10^-6M，小于10^-7M，小于10^-8M，小于10^-9M，小于10^-10M或更小。国际专利申请WO97/44451中给出了允许测试试验化合物对组胺亲和力的合适的组胺结合测定法。

优选组胺结合化合物应对血管活性胺，特别是组胺有特异性。测量特异性的方法将为本领域技术人员所了解并包括竞争测定法等。优选地，组胺结合化合物表现出的对组胺的亲和力与无关化合物所表现出的相比大100倍，更优选大103倍，104倍，105倍，106倍或更大。

本发明用的组胺结合化合物可以是合成化合物，或天然化合物例如蛋白质。已知许多蛋白质对组胺表现出特异性的高亲和力结合。一种可能是用组胺特异性抗体，或抗体片段。优选蛋白质是参考国际专利申请WO97/44451中血管活性胺结合分子的化合物，该专利申请的内容通过引用完全结合到本文中。术语“血管活性胺结合分子”欲包括：

(a)任何以小于10^-7M的解离常数特异结合于组胺、并和国际专利申请号WO97/44451中公开的蛋白MS-HBP1、FS-HBP1及FS-HBP-2属于同一蛋白质家族的血管活性胺结合蛋白，其中如果蛋白质初级的、成熟的单体序列不超过260个氨基酸并且在该蛋白质全序列中至少30个氨基酸被作为同一残基保存在那种蛋白质及蛋白质MS-HBP1、FS-HBP1和FS-HBP-2排列中，那么就认为该蛋白质属于这个蛋白质家族，优选该排列用ClustalW(Thompson等，1994，NAR，22(22)，4673-4680)或类似的序列排列程序获得；

(b)以小于10^-7M的解离常数特异结合于组胺的吸血节肢动物的蛋白质，并且其中包含序列基元D/E AW K/R(优选DAWK，更优选QDAWK)及Y/C E/D L/I/F W(优选Y/C ELW)；

(c)上文(a)或(b)中定义的蛋白质的天然生物变异体，例如等位基因变异体或地理学的变异体；

(d)上文(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质的功能等价物，包括不影响对组胺结合的生物学功能的野生型蛋白质序列中单个或多个氨基酸的取代、添加、插入和/或缺失，和/或化学修饰氨基酸的取代；

(e)上文(a)、(b)、(c)或(d)中定义的蛋白质的活性片段，其中“活性片段”表示保留有对组胺结合的生物学功能的截短的蛋白质；和

(f)含有与肽或其它蛋白质，例如标记物，可以是例如生物活性的、放射性的、酶的或荧光的、或抗体融合的上文(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中定义的蛋白质的融合蛋白质。

特别优选在WO97/44451中提到的蛋白质FS-HBP2(也称为EV131)，或其在上文(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中所叙述的变异体或活性片段。该蛋白质以高亲和力及特异性结合于组胺并且此处显示在中性粒细胞-介导疾病的动物模型中是有效的。

根据上文(e)的活性片段应包含至少n个负责结合于组胺的蛋白质序列的连续氨基酸，并根据具体系列，优选n为7或更多(例如，8，10，12，14，16，18，20，50，100，150，200，250或更多)。这样的片段可以是“独立存在的(free-standing)”，即不是其它氨基酸或多肽的一部分或不与它们融合，或它们可以形成一个部分或区域被包含在更大的多肽内。当被包含在更大的多肽内时，本发明的片段最优选形成单个连续的区域。此外，几个片段可以被包含在单个更大的多肽内。

本发明用的组胺结合蛋白可通过它们的编码核酸分子在宿主细胞内包含的载体的表达制备成重组体的形式。这样的表达方法已为本领域技术人员所了解并且许多方法由Sambrook等(同上)及Fernandez&Hoeffler(1998，eds.“Gene expression systems，Using nature for the artof expression(基因表达系统。表达领域的使用性能)”。Academic出版社，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto)进行了详细描述。国际专利申请WO97/44451中列出上文提及的血管活性胺结合蛋白的编码序列。在该专利申请中还描述生产这些分子，包括合适的载体、宿主细胞的方法及蛋白质的纯化方法。

组胺结合化合物可配制成药用组合物，例如，以在单位-剂量或多-剂量容器中的形式出现。例如，密封的安瓿和小玻璃瓶可贮存在冷冻-干燥的状态中，使用前只需要立即加入无菌液体载体即可。剂量取决于组胺结合化合物的特异性，并很容易通过常规实验法确定。

为了治疗剂的给药，药用组合物还可包含药学上可接受的载体。这样的载体包括抗体及其它多肽、基因及其它治疗剂例如脂质体，前提是载体本身不会引起对接受组合物的个体产生有害抗体，并且给药后毒性不会过大。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的高分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物及无活性的病毒颗粒。

其中可用药学上可接受的盐，例如，无机酸盐例如氢氯酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；及有机酸盐例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中对药学上可接受的载体有充分的讨论。

治疗组合物中药学上可接受的载体还可包含液体例如水、盐水、甘油及乙醇。此外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可出现在这样的组合物中。这样的载体使药用组合物配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、膏剂、悬浮剂等以便患者摄取。

一旦配制完成，本发明的组合物就可直接给药于患者。被治疗的患者可以是动物；尤其是，可治疗人类患者。

本发明所用的组胺结合化合物或药用组合物可通过任何途径给药，包括但不限于，口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮或透皮应用(例如，见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠的方式。至于组胺结合蛋白，因为蛋白可在胃内被分解，所以最好胃肠外给药(例如，皮下、肌内、静脉内或皮内注射)。适合胃肠外给药的制剂包括可含有抗氧化剂、缓冲液、制菌剂及使制剂和接受者血液等渗的溶质的含水及非水无菌注射溶液，以及可包括悬浮剂或增稠剂的含水及非水无菌悬浮液。

通常由皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射直接传递组合物，或将组合物传递至组织间质腔。还可将组合物给药于损伤部位。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。

本文所用术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防目标中性粒细胞-介导的疾病，或有能被观察到的治疗或预防效果需要的组胺结合化合物的量。对任何化合物，既可在细胞(例如瘤细胞)培养测定，也可在动物模型(通常是小鼠、兔、狗或猪)中估计最初的治疗有效量。还可用动物模型确定合适的浓度范围及给药途径。然后这样的信息就可用于确定给药于人体的有用的剂量及途径。

对人类患者的确切有效量取决于疾病的严重度、患者的一般健康情况、及患者的年龄、体重、性别、饮食、给药时间及频率、联合用药、反应敏感性及对治疗的耐受/反应。这个量由常规实验确定并由临床医师判断。通常，有效的剂量从0.005mg/kg至50mg/kg，优选0.125mg/kg至20mg/kg。例如，血管活性胺结合分子例如本文所提及的EV131及EV504的特别优选剂量为0.1至20mg/kg之间，更优选地，0.5至10mg/kg，而更优选1至2mg/kg。组合物可单独给药于患者或可与其它药剂、药物或激素联合给药。

基因治疗可用于影响患者特殊细胞产生内源性组胺结合蛋白。基因治疗既可发生在体内也可发生在体外。体外基因治疗需要分离及纯化患者细胞、引入治疗基因及将遗传学改变后的细胞再引入回到患者体内。相反，体内基因治疗不需要分离及纯化患者的细胞。

治疗的基因通常被“包装”给药于患者。基因传递的载体可以是非病毒的，例如脂质体，或复制-缺陷病毒，例如Berkner，K.L.，在Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992)描述的腺病毒，或Muzyczka，N.，在Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)及美国专利5,252,479号描述的腺-相关病毒(AAV)载体。例如，编码组胺结合蛋白的核酸分子可对复制-缺陷逆转录病毒载体的表达进行基因工程改造。然后这种表达构成物被分离并引入用含有编码多肽RNA的逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞(packaging cell)中，以便包装细胞产生含有所述基因的传染性病毒颗粒。这些生产细胞可给药于患者，以便在体内对细胞进行基因工程改造及表达多肽(见20章，基因治疗及其它分子遗传学基础上的治疗方法，(并参考引用其中内容)人类分子遗传学(1996)，T Strachan和A P Read，BIOS ScientficPublishers Ltd)。

另一方法是“裸DNA”的给药，其中治疗的组胺结合化合物直接注射入血流或肌肉组织内。

根据本发明，还提供上文描述的本发明任一方面所叙述的组胺结合化合物在制造治疗中性粒细胞介导的疾病的药物中的用途，尤其是本文清楚叙述的那些疾病。

现在本发明将以实施例的方式描述，清楚地提及EV131蛋白在内毒素-诱导的ARDS小鼠实验模型中的使用。应当理解在不脱离本发明范围的前提下可做细节上的修改。

附图简述

图1：内毒素(LPS)诱发支气管狭窄及被EV131抑制。LPS 1mg经鼻内途径给药而EV131为360μg、180μg及90μg。测量PenH值3小时。在3小时时分析对乙酰甲基胆碱的反应。代码S01、S02等各自代表一个小鼠个体(souris)。

图2：EV131抑制BAL中内毒素-诱导的中性粒细胞募集。LPS以1μg经鼻内途径给药而EV131为360μg、180μg及90μg。总细胞数不变，而180μg及90μg EV131降低BAL中的中性粒细胞。

图3：经MPO活性测定，EV131抑制内毒素-诱导的肺内中性粒细胞募集。EV131在180μg及90μg而不在360μg水平抑制肺内MPO活性。

图4：内毒素(LPS)诱发支气管狭窄并被腹膜内注射给予的EV131抑制。LPS 1μg经鼻内途径给药而EV131为182μg。测量PenH值3小时。

图5：当rEV131及布地奈德腹膜内给药时BAL液中募集的细胞总数。

图6：当rEV131及布地奈德腹膜内给药时BAL液中募集的细胞，根据细胞类型区分。

图7：当rEV131及布地奈德腹膜内给药时BAL液中募集的所有细胞。

图8：rEV131腹膜内给药后BAL液中TNF减少。

图9：在背部皮肤皮内注射1-8个位点的示意图。1、2阴性对照(生理盐水)；7、8阳性对照(抗-Ova)；3-6与抗-Ova血清皮内注射同时给药的EV蛋白(浓度逐渐下降)对Ova效应的抑制。

图10：WB/ReJ C57B1/6j-kitw小鼠(w/w)中rEV131对血管漏的抑制。

图11：免疫复合物介导血管漏的分光光度定量。EV131及EV504抑制效应的剂量依赖。

图12：Arthus反应部位的PMN浸润。在6小时对注射部位的显微镜观察。阴性对照(生理盐水；A)；阳性反应(抗-Ova；B)；EV131总的抑制(抗-Ova+EV131；C)；及EV504的部分抑制(抗-Ova+EV504；D)。

图13：泪液样本的中性粒细胞计数提示未防腐的rEV131在人类患者受到结膜过敏原攻击时或之后立即明显减少募集于眼部的中性粒细胞的数量。

实施例1：过敏性哮喘

重组体，节肢动物衍生的组胺结合蛋白EV131与组胺高亲和力结合(Paesen，G.C.，P.L.Adams，K.Harlos，P.A.Nuttall，和D.I.Stuart.1999，Mol Cell 3：661；Paesen，G.C.，P.L.Adams，P.A.Nuttall，和D.L.Stuart.2000，Biochim Biophys Acta 1482：92)。

最初，进行测试是为了确定EV131能否抑制组胺介导的病理学变化。因此用EV131测试过敏性哮喘。在接种的小鼠接受抗原攻击之前给予EV131，发现可预防70％气道高反应性，消除支气管周的炎症、肺的嗜酸性粒细胞增多、粘液分泌过多及IL-4分泌(Couilllin等提出)。EV131对支气管高反应性的抑制作用可与糖皮质激素相比。这些结果证明组胺是过敏性哮喘的重要介质。

这些测试结果促使我们研究急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，其表现出某些与过敏性哮喘相同的特性。用E.coli(大肠杆菌)内毒素单独给予建立ARDS模型(Lefort，J.，L.Motreff，和B.B.Vargaftig.2001，AmJ Respir Cell Mol Biol 24：345.)。此处显示EV131明显抑制支气管狭窄及中性粒细胞募集。

方法

大肠杆菌内毒素诱发急性支气管狭窄

能产生最大气道反应而又不致死小鼠的内毒素最佳剂量首先通过单独用盐水作为对照来确立。确定最佳剂量为1μg(数据未显示)。使大肠杆菌内毒素(O55:B5，Sigma)溶于盐水并以1μg溶于40μl盐水的剂量经鼻内途径给予静脉注射氯胺酮麻醉(防止咳嗽)的C57BL/6小鼠。经相同途径在给予内毒素之前立即将三种剂量水平(90、180及360μg，4.5-18mg/Kg)rEV131给予不同组别小鼠，对照组只接受盐水。

在采用该模型的第二组实验中，腹膜内注射350μg布地奈德(阳性对照)、盐水(阴性对照)及182μg rEV131，1小时后给予1μg LPS，也是经鼻吸入给予。

气道阻力：体积描记器

内毒素给药后用全身体积描记器评价气道阻力3小时。在恢复期后观察对气雾化乙酰甲胆碱的支气管高反应性(BHR)。首先将接受内毒素及活性或对照药物的不受限制的清醒小鼠放于全身体积描记室中(Buxco Electronic，Sharon，CO，USA)。小鼠被放在两个测定气压的体积描记室中的一个，这些室与抽吸泵相连以保证恒定气流。动物被引入与第二室分离的第一室，其中压力相当于大气压。每一隔室都与一个微分压力捕获器的两部分相连，压力捕获器本身与电子放大器连接并由软件对信号进行分析。该系统允许在连续的呼吸周期过程中对许多参数进行定量。用该系统以增强的呼吸暂停(Penh)为气道阻力指标评估支气管狭窄3小时。

Penh可理解为胸廓气流及鼻气流流量曲线的相移；相移增加与呼吸系统阻力增加相关。Penh通过公式Penh＝(Te/RT-1)×PEF/PIF计算，其中Te为呼气时间，RT为松弛时间，PEF为呼气峰流速，而PIF为吸气峰流速。Penh值相应于在观察期间每5秒11个事件(周期)的平均数。

180分钟后终止实验，在测定残留BHR之前可允许小鼠高浓度氧通气以便恢复。

在实验的这个时期300mM乙酰甲胆碱被气雾化并引入体积描记室20秒，并在一段15分钟的时间(乙酰甲胆碱诱发BHR的持续时间)后获得由Penh测定的平均气道支气管狭窄读数。

经数据分析，内毒素给药后36个时间点及乙酰甲胆碱喷雾后5个时间点的Penh值如图1所示。每一点的Penh值对应于该点之前5分钟及之后3分钟之间的平均Penh值。(NB在图1中恢复期对应于180分钟时Penh的明显下降)。

支气管肺泡灌洗(BAL)

内毒素鼻内给药后3.5小时在大量氯胺酮及赛拉嗪麻醉下进行BAL，将4倍体积0.5ml冰冷却磷酸盐缓冲盐水(PBS)灌洗气道。将灌洗液离心，再悬浮，用血细胞计数仪进行总细胞计数并用Shandon细胞离心仪制备细胞离心标本。在用May-Gruenwald-Giemsa染色区分之后，分析细胞。

肺髓过氧化物酶测定(MPO)

如前所述，为测定肺内中性粒细胞含量我们分析肺内髓过氧化物酶(中性粒细胞主要的酶)的量(也可见Hoy A，Leininger-MullerB，Kutter D，Siest G，Visvikis S.Clin Chem Lab Med 2002；40(1)：2-8.)

肺组织学

在支气管肺泡灌洗后，致死小鼠。摘除全肺并固定在4％缓冲甲醛中以用H&E染色进行标准显微镜分析。由两个独立的观察者用半定量评分(0-3)评价支气管周浸润及平滑肌异常增生。

结果

内毒素诱发的支气管狭窄被EV131抑制

首先我们建立一种诱发非致死性支气管狭窄的内毒素剂量-反应作用(1-100μg)。发现内毒素在15-30分钟内诱发实质上的支气管狭窄(数据未显示)。我们选择剂量为1μg的内毒素做进一步实验以测定rEV131的作用。

在对照组LPS诱发实质上的支气管狭窄，在约80分钟达到高峰并持续180分钟直到小鼠被允许在高浓度氧中恢复。当鼻内给予剂量为360μg的rEV131时部分抑制这种反应，而90μg和180μg抑制作用更大(图1)。起初这结果使人感到奇怪，但随后认识到给予360μg rEV131的小鼠遭受感染及可能受到中性粒细胞预处理，因此这种情况不认为是典型的。随后的分析不包括该小鼠的结果。

这些数据提示内源性组胺在内毒素诱导的支气管狭窄中有作用，因此用rEV131中和组胺可改善ARDS。

图4显示腹膜内给予rEV131有类似作用，说明rEV131不能直接结合于LSP。这也证明rEV131经这种途径给药是有效的。

支气管高反应性(BHR)被EV131抑制

我们还在内毒素给药及在高浓度氧下恢复后3小时测试乙酰甲胆碱-诱发的BHR。首先我们证明与盐水对照相比在内毒素给药后发生乙酰甲胆碱-介导的BHR(数据未显示)。此后我们观察在给予rEV131及对照小鼠中乙酰甲胆碱的作用。在对照小鼠中乙酰甲胆碱激发支气管狭窄而在用任何剂量水平rEV131处理的小鼠中则没有激发(图1)。因此，该数据提示内毒素-诱发的高反应性是组胺依赖性的并能被rEV131减弱。

BAL及肺内中性粒细胞募集减少

内毒素的给予导致BAL液中中性粒细胞明显募集。内毒素吸入后3小时在对照动物的BAL液中我们回收到约10⁵个白细胞。rEV131的给药没有改变BAL液中总细胞数，但相反，180及90μg的rEV131减少中性粒细胞募集，即使这种减少没达到统计学差异(p＜0.2)。虽然360μg剂量没有效应(图2)；但是，在该剂量只有一个动物接受评价并且如上文所说，该动物随后被认定罹患感染。

我们还观察肺内活化中性粒细胞的募集是否改变。为定量中性粒细胞募集，我们测试新鲜肺组织匀浆的MPO活性。显示180μgrEV131(p＜0.05)及90μg rEV131(p＜0.01)明显降低中性粒细胞活性(图3)。在感染的小鼠中，给药360μg没有效应。

图5、6及7都是在腹膜内给予rEV131及布地奈德时为评价BAL液中细胞募集所进行的等同实验。从这些图中明显看出，rEV131明显减少BAL中总细胞数，尤其是中性粒细胞。而且，rEV131还减少BAL液中TNF的量(见图8)。

肺组织病理学：

接受内毒素小鼠的肺脏显示支气管周显著浸润大量中性粒细胞(数据未显示)。rEV131基本上在180μg及90μg剂量减少中性粒细胞募集(数据未显示)。

结论

本数据证明在ARDS鼠科模型中组胺结合蛋白rEV131明显抑制内毒素-诱发的支气管狭窄、BHR及中性粒细胞募集。这种作用在鼻内给药及腹膜内给药时都很明显。

实施例2：反向被动阿图斯氏反应(Arthus reaction)

方法

经典的反向被动阿图斯氏反应(局部过敏反应)在小鼠中进行，表示经皮肤内注射抗血清，然后静脉内注射抗原诱发的局部免疫复合物病理学。所用方法如下：

被动Arthus反应的诱发

C57/BL6(129或FVB)小鼠(6-8周龄，雄性或雌性)背部备皮。首先，在异氟烷麻醉下将25μl小鸡抗-卵清蛋白IgG(抗-Ova)(12.5-200μg)或盐水皮内注射于背部皮肤。其后立即将100μl卵清蛋白(Ova)(1mg含有0.2％伊凡斯蓝)注射于尾部静脉内。对照小鼠接受皮内注射盐水或小牛血清白蛋白或静脉内注射BSA盐水(0.2％伊凡斯蓝)。

在图9中描述的图叙述了用于测试EV蛋白对被动Arthus反应抑制作用的方案：将最佳数量的用于被动Arthus抑制的抗-卵清蛋白IgG(25μg)或盐水伴或不伴测试蛋白进行皮内注射。

血管漏的定量

免疫复合物的形成及局部沉淀诱发急性炎症反应。作为与血管舒张及内皮损害相连续的血浆蛋白渗出的征候，15分钟内在接受静脉注射含有0.2％伊凡斯蓝的Ova小鼠的皮内注射抗-Ova血清部位可看到蓝色褪色。用数码相机记录褪色情况(图10)。

30分钟时切除注射部位，剪刀绞碎并在甲酰胺中消化过夜，并用ELISA读数平板测量在OD 610nm的吸收值。

显微镜评价注射部位细胞的反应

在注射后6小时切除注射部位，固定在4％缓冲甲醛中，植入石蜡中，在Leica切片机上作5μm切片，用H&E染色并用显微镜以评分系统(0，无浸润，1，最轻度，2，中度及3多形核中性粒细胞(PMN)重度浸润)进行半定量分析。

结果

血管漏

阳性对照。在缺乏测试蛋白的情况下皮肤注射部位15分钟内染成深蓝色说明存在血管漏(结果未显示)。

阴性对照。静脉内注射含有0.2％伊凡斯蓝的盐水(无抗原)不引起任何血管漏，例如没有蓝色褪色(结果未显示)。

EV131及EV504对血管漏的抑制

将测试蛋白单独或与抗-Ova抗体(每部位12.5μg)一起注射于皮肤。当与抗-Ova抗体一起注射时，几乎全部保护作用都由EV131产生，而只有一部分保护作用由EV504产生(未显示)。估计EV131及EV504的IC₅₀各自为16及31μg范围。这些实验结果的重复性很高。相反，单独皮内注射测试蛋白，没有导致任何血管漏(数据未显示)。

EV131及EV504的剂量依赖性抑制

抑制作用的剂量依赖由切除及消化皮肤的分光光度测定来定量。EV131及EV504的IC₅₀各自为20μg及60μg范围(图11)。

中性粒细胞浸润

在抗-Ova注射后6小时切除皮肤注射部位并作组织学处理。注射抗-Ova的对照小鼠真皮显示明显外周血管中性粒细胞浸润。注射盐水的对照小鼠没有发现浸润(图12)。EV131及EV504明显减少免疫复合物诱发的PMN皮肤内募集(62.5μg)，其中EV504作用程度较小。为精确定量，由于在皮肤取样过程中出现一些技术失败需要重复进行实验。该实验结果总结在以下表1中。

因此，两种测试蛋白对反向Arthus反应早期血管漏均有抑制作用。EV131看来在这种免疫复合物小鼠模型中比EV504更有效。EV131及EV504抑制血管漏的IC₅₀各自为20μg及60μg(图11)。在高剂量时PMN浸润几乎消失。

               表1：PMN浸润(反向Arthus反应)

注射				PMN浸润
					n0	产品	定量		评分
		EV蛋白(μg/点)	抗-Ova(μg/点)
10	Nacl	0	0	-
10	a-Ova+Nacl	0	25	++
4	a-Ova+EV131	85	25	-
4	a-Ova+EV504	150	25	-
2	a-Ova+EV504	75	25	+
4	a-Ova+对照蛋白	62	25	++

实施例3：过敏性结膜炎

有研究评估FS-HBP2(rEV131)在预防结膜过敏原刺激模型诱发过敏性结膜炎的先兆及症状中的安全性及有效性(Abelson MB，Chambers WA和LM Smith；眼科学，1990；108：84-88)。应用4种治疗方法，包括将rEV131溶媒与3种浓度rEV131(0.06％、0.12％及0.24％眼科用溶液)比较。本研究包括60名患者。

测量的初级有效性变量包括眼痒及发红。测定中性粒细胞计数作为次级有效性变量的一部分。收集23名参与本研究的患者的泪液标本。在那些标本中，19名患者有可检测的中性粒细胞计数。在一侧眼接受浓度为0.12％(N＝3)及0.24％(N＝7)rEV131而另一侧眼接受安慰剂的患者中，药物治疗的眼的中性粒细胞计数明显减少(见图13)。然而，在一侧眼接受0.06％rEV131而另一侧眼接受安慰剂的组中，接受药物的眼中的中性粒细胞计数明显增加。在双侧接受溶媒的眼睛(N＝5)中，中性粒细胞计数没有发现显著差异。

这些结果提示未防腐的rEV131可在结膜过敏原攻击时或之后立即明显减少中性粒细胞募集于眼部的数量。

结合在实施例1及2中出现的结果，这些结果提示未防腐的rEV131(即不包含可能有合成蛋白质的防腐剂苯扎氯铵的rEV131溶液)可能在眼部急性过敏反应中，在减轻炎症及随后的与更多具体中性粒细胞-介导的疾病相关的组织损伤中发挥重要作用。晚期过敏反应由白细胞通过肥大细胞在急性反应早期释放的趋化因子浸润进入组织来介导。在眼部，虽然可能存在细胞浸润生理学晚期，但多数过敏性结膜炎病例并没有相应的临床晚期。在眼部，只有重度、慢性过敏性反应包括晚期反应，其达到某一阈值并诱发临床先兆及症状，例如在春季角结膜炎中看到的角膜炎及shield ulcers。但是，鼻及肺显示临床晚期反应比眼更明显。这可以解释先前一个临床研究在结膜过敏原攻击(CAC)诱发鼻症状中所看到的rEV131的作用。在CAC之后鼻内的过敏反应，及滴入眼部药剂对鼻症状的作用均是意料不到的，因为过敏原、调节剂及活性药物都可从眼表面，通过鼻泪管，进入鼻腔的下鼻甲，在此其可对鼻组织发挥作用。

以后的研究将集中在组胺结合分子例如rEV131减少特别是中性粒细胞-介导的反应例如术后炎症或边缘性浸润的效能。

Claims (10)

1.一种在患者中治疗由中性粒细胞介导的疾病的方法，它包括给予患者治疗有效量的组胺结合化合物。

2.一种根据权利要求1的方法，其中所述疾病是过敏性疾病、炎性疾病或自身免疫性疾病。

3.一种根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述疾病选自成人呼吸窘迫综合征(ARDS)；婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)；严重急性呼吸综合征(SARS)；慢性阻塞性气道疾病(COPD)；囊性纤维化；呼吸机诱发的肺损伤(VILI)；毛细血管漏综合征；再灌注损伤，包括血栓性中风、冠状动脉血栓形成、心肺分流术(CPB)、冠状动脉旁路移植术(CABG)、四肢或指(趾)再植术、器官移植术、术后炎症或边缘性浸润、分流术肠炎、分流术关节炎、热损伤及挤压伤之后的损伤；牛皮癣；牛皮癣性关节病；类风湿性关节炎；Crohn’s病；溃疡性结肠炎；免疫性血管炎，包括Wegener’s肉芽肿病及Churg-Strauss病；酒精性肝病；中性粒细胞介导的肾小球肾炎；系统性红斑狼疮；狼疮性肾炎；动脉粥样硬化；系统性硬化病；痛风；牙周病，眼部炎症包括干眼、Sjogren’s综合征、隐形眼镜相关的乳头状结膜炎(CLAPC)、隐形眼镜相关的边缘性浸润，术后炎症包括白内障、青光眼、角膜移植术及激光原位角膜磨镶术(LASIK)的手术后炎症，严重过敏性结膜炎，春季角结膜炎(VKC)，弥漫性片状角膜炎，传染性及非特异性结膜炎，角膜炎及睑炎、shield ulcers。

4.一种根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述组胺结合化合物是组胺清除剂。

5.一种根据权利要求4的方法，其中所述组胺清除剂以大于10^-7/M的解离常数与组胺结合。

6.一种根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述组胺结合化合物是蛋白质。

7.一种根据权利要求6的方法，其中所述组胺结合蛋白是血管活性胺结合蛋白。

8.一种根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述血管活性胺结合蛋白是：

(a)任何以小于10^-7M的解离常数特异性结合于组胺、并和国际专利申请号WO97/44451中公开的蛋白MS-HBP1、FS-HBP1及FS-HBP-2属于同一蛋白质家族的血管活性胺结合蛋白，其中如果所述蛋白质初级的、成熟的单体序列不超过260个氨基酸并且在该蛋白质全序列中的至少30，优选至少40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸被作为同一残基保存在该蛋白质及蛋白质MS-HBP1、FS-HBP1和FS-HBP-2的排列中，那么就认为该蛋白质属于这个蛋白质家族，优选该排列用ClustalW(Thompson等，1994，NAR，22(22)，4673-4680)获得；

(b)以小于10^-7M的解离常数特异性结合于组胺，并且包含序列基元D/E A W K/R(优选DAWK，更优选QDAWK)及Y/C E/D L/I/F W(优选Y/C ELW)的来自吸血节肢动物的蛋白质；

(c)如在上文(a)或(b)中所定义的蛋白质的天然生物变异体，例如等位基因变异体或地理上的变异体；

(d)如在上文(a)、(b)或(c)中所定义的蛋白质的功能等价物，其包含不影响对组胺结合的生物学功能的野生型蛋白质序列中单个或多个氨基酸的取代、添加、插入和/或缺失，和/或化学修饰氨基酸的取代；

(e)如在上文(a)、(b)、(c)或(d)中所定义的蛋白质的活性片段，其中“活性片段”表示保留有对组胺结合的生物学功能的截短的蛋白质；和

(f)含有与肽或其它蛋白质，或抗体融合的如在上文(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中定义的蛋白质的融合蛋白质，所述蛋白质，例如标记物，可以是例如生物活性的、放射性的、酶的或荧光的。

9.一种根据权利要求7或权利要求8的方法，其中所述血管活性胺结合蛋白是EV131或其片段。

10.前述权利要求中任一项所述的组胺结合化合物在制备治疗由中性粒细胞介导的疾病的药物中的用途。

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