CN1780553B - 生产改变含油量的植物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及由于HIO103.1核酸的改变的表达，而显示改变的含油量表型的植物。本发明更进一步涉及生产具有改变的含油量表型的植物的方法。
Description
相关申请
本申请要求2003年4月22日提交的美国临时专利申请60/464,558的优先权，其内容全部引入作为参考。
发明背景
控制农作物种子的组合物，尤其是种子油类的含量和组合物的能力在涉及加工食品油类以及动物饲养油类的农业工业中具有重要的应用价值。农作物的种子含有多种有价值的组分包括油类，蛋白以及淀粉。工业生产过程可以分离若干或所有这些组分用于专门应用的单独销售。例如，几乎60％的美国大豆农作物通过大豆加工工业进行压榨。大豆加工产生高价销售的精炼油，而残余物主要作为低价值的饲料销售(US Soybean Board，2001 Soy Stats)。加拿大油菜(canola)种子被压榨产生油类以及副产品加拿大油菜粗粉(加拿大加拿大油菜协会)。几乎20％的1999/2000年的美国玉米农作物经过工业化精炼，主要用于产生淀粉，乙醇以及油类(玉米精炼业者协会)。因此，常常需要使种子的含油量最大化。例如，对于诸如大豆以及加拿大油菜的加工含油种子而言，提高种子的绝对含油量将提高这种玉米的价值。对于加工的玉米而言，可能需要根据其它主要组分的应用提高或者降低含油量。降低油类可以通过降低与油类氧化相关的不希望的味道改善分离淀粉的质量。或者，在味道不重要的乙醇产生中，提高含油量可以提高总的价值。在许多玉米饲料中，诸如玉米以及小麦，可能希望提高植物含油量，因为油类比诸如碳水化合物的其它种子组分具有较高的能含量。含油种子加工，就像大多数玉米加工业一样是资金密集产业；因此产品从低值组分到高价值油类组分的分布的较小改变可能对于玉米加工者而言就有显著的经济影响。
油类的生物技术处理可以提供组成的改变以及油产量的改进。组成的改变尤其包括高油酸的大豆以及玉米油(美国专利6,229,033以及6,248,939)，以及含有月桂酸酯的种子(美国专利5,639,790)等。组成改变的工作主要集中在加工的含油种子但是已经可以很容易地延伸至非-含油种子农作物包括玉米。虽然对提高含油量具有相当的兴趣，在这一领域目前唯一实践的生物技术是高油类玉米(HOC)技术(杜邦，美国专利5,704,160)。HOC利用通过标准的选择育种连同生产系统中称为顶交的优良品种(不孕雄性)杂交雌性得到的高油类授粉者。顶交高油类系统使玉米收获的玉米含油量从～3.5％提高到～7％，改善了玉米的能含量。
虽然HOC生产系统已经卓有成效，但是其仍然具有固有的局限性。首先，担负全部的土地的种子栽植的低授粉者百分比的系统含有固有风险，尤其是在旱年。第二，当前HOC领域含油量已经平稳在大约9％的油类。最后，高油类玉米主要不是生物化学变化，而是对于提高含油量产生间接结果的解剖学上的突变体(提高胚芽尺寸)。为此，可选择的高油类策略，尤其是来源于改变生化产量的高油类策略将是非常重要的。
操作油市场最明显的目标农作物是大豆以及油菜籽，并且大量商业工作(例如美国专利5,952,544；PCT申请WO9411516)证明拟南芥是这些农作物油类代谢的优良模型。种子油组合物的生物化学筛选已经鉴定了许多关键生物合成酶的拟南芥基因并且导致农业上重要基因的直向同源物被鉴定。例如，利用化学诱变处理群的筛选已经鉴定了其种子显示脂肪酸成份改变的脂类突变体(Lemieux B等1990，James以及Dooner，1990)。检测脂肪酸成份改变的T-DNA诱变筛选(Feldmann等，Science 243：1351-1354，1989)鉴定了ω3脱氢酶(FAD3)以及δ-12脱氢酶(FAD2)基因(美国专利5952544；Yadav等，1993；Okuley等，1994)。集中在含油量而非油类质量的筛选分析化学上诱导的皱缩种子或籽粒密度改变的突变体，据此推断出改变的植物含油量(Focks N以
及Benning C，Plant Physiol 118：91-101，1998)。用来鉴定参与非常长链脂肪酸产生的酶的另一种筛选鉴定了编码负责降低种子中三酰甘油聚集的甘油二酯酰基转移酶(DGAT)的基因的突变(Katavic V等，PlantPhysiol.1995 May；108(1)：399-409)。此外，还显示DGAT cDNA的种子特异性过量表达与提高的植物含油量有关(Jako等，2001)。
植物中的激活标签法，指一种通过插入包含调节序列(例如，增强子)的异源核酸构建体到植物基因组中，而产生随机突变的方法。调节序列可起到增强一个或多个天然植物基因转录的作用；因此，激活标签法是一种用于产生功能获得(gain-of-function)，通常是显性突变体的有效方法(参见，例如，Hayashi等，1992；Weigel D等，2000)。插入的构建体提供了一种分子标签，其用于快速鉴定由于其错表达引起突变表型的天然植物。激活标签法同时可导致功能丧失表型。插入可导致天然植物基因的破坏，在该情况中表型通常是隐性的。
激活标签法已经用于多种物种，包括烟草和拟南芥，以鉴定各种突变表型和与这些表型相关的基因(Wilson，等，1996，Schaffer等，1998，Fridborg等，1999；Kardailsky等，1999；Christensen S等，1998)。
发明概述
本发明提供了具有高油类含量表现型的转基因植物。转基因植物包括含有编码或互补于编码HIO103.1多肽的序列的核苷酸序列的转化载体。在优选的实施方案中，转基因植物选自油菜，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，红花，油棕，椰子，亚麻，蓖麻以及花生。
本发明还提供了产生油类的方法，包括培育转基因植物以及从所述植物回收油类。
本发明的转基因植物通过包括向植物的祖细胞导入含有编码或互补于编码HIO103.1多肽的序列的核苷酸序列的植物转化载体，以及
培育转化的祖细胞产生转基因植物的方法产生，其中HIO103.1多核苷酸序列的表达产生高油类含量表现型。
发明详述
定义
除非另有陈述，这里使用的全部技术以及科学名词具有与本领域技术人员知晓的相同的含义。专业人员尤其是参考Sambrook等，1989，以及Ausubel FM等，1993，的定义以及术语。应该理解本发明不限于所描述的特定方法，流程以及试剂，因为这些可以改变。
此处所述的术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指可以在异源细胞中整合并表达异源DNA片段的载体。许多原核以及真核生物表达载体是可以市售获得的。选择合适的表达载体是本领域述人员所熟知的。
“异源的”核酸构建体或序列具有一部分序列不是植物细胞的野生型序列但是在其中表达。异源的控制序列是指不天然调节目前正在调节的相同基因表达的控制序列(即启动子或增强子)。通常，异源核酸序列不是它们所存在于的细胞或者基因组的一部分所内源产生的，并且已经通过传染，转染，显微注射，电穿孔法等添加到细胞中。“异源的”核酸构建体可以含有控制序列/DNA编码序列组合，其与野生型植物中发现的控制序列/DNA编码序列组合相同或者不同。
此处所述的术语“基因”是指参与多肽链产生的DNA片段，其可能包括或者不包括编码区之前以及之后的区域，例如5′非翻译区(5′UTR)或者“前导”序列以及3′UTR或者“尾部”序列以及单独的编码片段(外显子)以及非-转录调节序列之间的内含子序列(内含子)。
这里使用的“重组体”包括已经通过导入异源的核酸序列进行修饰的细胞或者载体，或者所述细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例
如，重组细胞表达在天然(非-重组体)形式的细胞内没有发现相同形式的基因或者表达在人为干预下完全表达或者完全不表达的异常表达的天然基因。
此处所述的术语“基因表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的方法。所述方法包括转录以及翻译；因此“表达”可以是针对多核苷酸或者多肽序列或者两者。有时，多核苷酸序列的表达不会引起蛋白翻译。“过量表达”是指相对于其在野生型(或者其它的参考[例如，非-转基因])植物中的表达，多核苷酸和/或多肽序列表达增加并且可能涉及自然存在或者非-自然存在的序列。“异位表达”是指在未-改变或者野生型植物中不自然发生的，在某时，某地和/或提高水平的表达。“下调表达”是指多核苷酸和/或多肽序列，通常是内源性基因相对于其在野生型植物中表达的降低表达。术语“错误表达”以及“改变表达”包括过量表达，下调表达以及异位表达。
在将核酸序列插入细胞的概念中，术语“引入的”是指“转染”，或者“转化”或者“转导”，并且包括针对核酸序列整合到真核或者原核细胞中，其中核酸序列可以整合入细胞的基因组(例如染色体，质粒，质体或者线粒体DNA)，转化为自主复制子，或者瞬间表达(例如，转染的mRNA)。
本文使用的“植物细胞”是指来源于植物的任意细胞，包括来自未分化的组织(例如愈伤组织)以及植物种子，花粉，繁殖体(progagules)以及胚的细胞。
此处所述的术语“天然的”以及“野生型”相对于给定植物性状或者表现型是指具有在相同种类的植物本身发现的特征或者表现型的形式。
此处所述的术语关于植物特性的“修饰”是指转基因植物相对于
类似的非-转基因植物的表现型的改变。对于转基因植物的“目的表型(性状)”，指通过T1和/或后代植物证明的可观察到的或可测量的表型，相应的非转基因植物不显示该表型(也即，在相似条件下培养或分析的基因型类似植物)。目的表型可表示对植物的改良，或可提供一种在其他植物中产生改良的方法。“改良”是一种通过给植物提供独特的和/或新的品质，而增强植物物种或品种的实用性的特征。“改变含油量表型”指遗传修饰植物的可测量表型，其中与类似的，但是非修饰的植物相比，该植物显示统计上显著增加或减少的总体含油量(即，油类占种子质量的百分比)。高油表型指总体含油量增加。
本文使用的“突变体”多核苷酸序列或者基因与相应的野生型多核苷酸序列或者基因是在序列或者表达上不同，其中的差异导致修饰的植物的表现型或者性状。相对于植物或植物株系，术语“突变体”是指植物或者株系具有修饰的植物表现型或性状，其中修饰的表现型或性状与野生型多核苷酸序列或基因的修饰表达有关。
此处所述的术语“T1”是指来自T0植物的种子的植物子代。T1子代是可通过应用选择性试剂筛选的第一系列转化的植物，所述的选择性试剂为例如抗生素或除草剂，由此转基因植物含有相应的抗性基因。术语“T2”是指通过T1植物的花进行自体受精产生的植物子代，所述T1植物之前被筛选作为转基因植物。T3植物是由T2植物等产生的。这里所述的特定植物的“直系子代”来源于所述植物的种子(或者，有时来自其它的组织)且是紧随的子代；例如，对于特定的家系而言，T2植物是T1植物的直系子代。特定植物的“间接子代”来源于所述植物直系子代的种子(或其它组织)，或来自该家系随后子代的种子(或其它组织)；例如，T3植物是T1植物的间接子代。
此处所述的术语“植物部分”包括任意的植物器官或组织，包括，但不限于种子，胚，分生组织区域，愈伤组织，叶，根，芽，配子体，孢子体，花粉，和小孢子。植物细胞可获自任意的植物器官或组织以
及由其制备的培养物。可用于本发明方法的植物种类通常是广泛的，其可以是可用于转化技术的高等植物，包括单子叶的和双子叶的植物。
在这里所述的“转基因植物”包括在其基因组内含有异源多核苷酸的植物。异源的多核苷酸可以稳定地整合到基因组中，或可以被插入到染色体外。优选地，本发明的多核苷酸被稳定地整合到基因组中从而使多核苷酸被连续传代。植物细胞，组织，器官，或已被导入异源多核苷酸的植物被认为是“转化的”，“转染的”或“转基因的”植物。也含有该异源多核苷酸的转化植物或植物细胞的直系和间接子代也被视为是转基因的。
具有改变的含油量表现型的植物的鉴定
我们使用拟南芥激活标签筛选，来鉴定我们命名为编码核蛋白(又名F21M12.34，GI#15218335)的“HIO103.1”基因(Atlg09950；GI#18391091)与改变的含油量表型(具体地，高油表型)之间的关联。简要地，而且如实施例中进一步描述的，用pSKI015载体对许多拟南芥植物进行了突变，所述载体包含来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA，病毒增强子元件，和选择标记基因(Weigel等，2000)。当T-DNA插入到转化植物的基因组中时，增强子元件可导致附近基因的上调，通常在插入的大约10千碱基(kb)内。把T1植物暴露于选择剂，以便特异性地回收表达选择标记，并因此具有T-DNA插入的转化植物。从转化的T1植物收集大约15-20T2种子的样本，并从所有的种子提取脂类。进行气相色谱(GC)分析，以测定种子样本的脂肪酸含量和组成。
对显示高油表型的拟南芥系进行了鉴定，其中含油量(也即，脂肪酸)相当于植物日平均含油量的35.0％(111％的PDA)为大约39.0％。通过鉴定系中的T-DNA插入片段侧翼的基因组DNA序列分析，发现了HIO103.1基因与高油表型之间的关联。因此，HIO103.1基因和/或多肽可用于开发具有修饰的含油量表型(“HIO103.1表型”)的基因修
饰植物。HIO103.1基因可用于生产含油种子作物，其从含油种子加工提供提高的产油量，和用于生产能提供增加的能量的饲料谷物作物用于动物饲养。HIO103.1基因可进一步用于增加特种油料作物的含油量，以便增加所需稀有脂肪酸的产量。已经进行遗传修饰以表达HIO103.1的转基因植物，可用于生产油，其中利用标准方法培养转基因植物，并从植物部分(例如，种子)获得油。
HIO103.1核酸和多肽
拟南芥HIO103.1核酸(基因组DNA)序列提供于SEQ ID NO：1以及Genbank登录号GI#18391091中。对应的蛋白序列提供于SEQ IDNO：2以及登录号GI#15218335中。拟南芥S0103.1的直系同源物或旁系同源物的核酸和/或蛋白，描述于下面的实施例3中。
如这里使用的术语“HIO103.1多肽”指全长HIO103.1蛋白或其“功能活性”片段，衍生物(变体)，或者直系同源物，指该蛋白片段，衍生物或者直系同源物显示与SEQ ID NO：2的多肽相关的一种或多种功能活性。在一个优选的实施方案中，功能活性HIO103.1多肽，当在植物中错表达时，导致改变的含油量表型。在更进一步优选的实施方案中，HIO103.1多肽在植物中的错表达导致高油表型。在另一个实施方案中，功能活性HIO103.1多肽当在植物或植物细胞中表达时，能拯救缺陷的(包括缺乏的)内源HIO103.1活性；该拯救多肽可来自与具有缺陷的活性的植物相同的或不同的物种。在另一个实施方案中，全长HIO103.1多肽的功能活性片段(也即，具有SEQ ID NO：2的序列的天然多肽或其天然存在的直系同源物)，保留与全长HIO103.1多肽相关的一种或多种生物学特性，例如信号活性，结合活性，催化活性，或细胞或者细胞外定位活性。HIO103.1片段优选包括HIO103.1结构域，例如C-或N-末端或者催化结构域，尤其，优选包括HIO103.1蛋白的至少10，优选至少20，更优选至少25，最优选至少50的连续氨基酸。功能域可使用PFAM程序进行鉴定(Bateman A等，1999NucleicAcids Res 27：260-262；website at pfam.wustl.edu)。全长HIO103.1多
肽的功能活性变体或其片段，包括具有氨基酸插入，缺失，或者置换，但保留与全长HIO103.1多肽相关的一种或多种生物学特性的多肽。有时，产生的变体能改变HIO103.1多肽的翻译后加工。例如，与天然多肽相比，变体可以具有改变的蛋白转运或者蛋白定位特性，或者改变的蛋白的半衰期。
如这里使用的术语“HIO103.1核酸”包含具有SEQ ID NO：1提供的序列，或者与SEQ ID NO：1提供的序列互补的序列的核酸，及其功能活性片段，衍生物或直系同源物。本发明的HIO103.1核酸可以是来源于基因组DNA或者cDNA的DNA，或者RNA。
在一个实施方案中，功能活性HIO103.1核酸编码或者互补于编码功能活性HIO103.1多肽的核酸。基因组DNA包括在该定义内，其用作原始RNA转录本(也即，mRNA前体)的模板，其在编码功能活性HIO103.1多肽之前需要加工，例如剪接。HIO103.1核酸可包括其他的非编码序列，其可以转录或者不被转录；这种序列包括5’和3’UTRs，聚腺苷酸化信号和尤其是本领域已知的调控基因表达的调节序列。一些多肽需要加工事件，例如蛋白水解剪切，共价修饰，等等，以便完全活化。因此，功能活性核酸可编码成熟的或者预先加工的HIO103.1多肽，或者中间体形式。HIO103.1多核苷酸还可以包括异源编码序列，例如，编码包括的促进融合多肽纯化的标记或者转化标记的序列。
在另一个实施方案中，功能活性HIO103.1核酸可用于例如，通过反义抑制，共抑制等等产生功能丧失的HIO103.1表型。
在一个优选的实施方案中，用于本发明方法的HIO103.1核酸，包括编码或互补于编码HIO103.1多肽的序列的核酸序列，该HIO103.1多肽与SEQ ID NO：2提供的多肽序列具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或以上的序列同一性。
在另一个实施方案中，本发明的HIO103.1多肽包括与SEQ ID NO：2的HIO103.1多肽序列具有至少50％或60％同一性的多肽序列，而且与SEQ ID NO：2的HIO103.1多肽序列可具有至少70％，80％，85％，，90％或95％或以上的序列同一性。在另一个实施方案中，HIO103.1多肽包括与SEQ ID NO：2所示的多肽的功能活性片段具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性的多肽序列。在另一个实施方案中，HIO103.1多肽包括与SEQ ID NO：2的多肽序列的全长具有至少50％，60％，70％，80％或90％的序列同一性的多肽序列。
在另一个方面，HIO103.1多核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的HIO 103.1核酸序列的全长或是与这种HIO103.1序列互补的核酸序列具有至少50％到60％的同一性，而且可包含与SEQ ID NO：1所示的HIO103.1序列或其功能活性片断，或互补序列具有至少70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性。
如这里使用的，对于特定的目标序列或其特定部分，“百分比(％)序列同一性”被定义为如果必要获得最大的百分比序列同一性，如通过WU-BLAST-2.0a19程序(Altschul等，J.Mol.Biol.(1997)215：403-410；website at blast.wustl.edu/blast/README.html)所产生的，其中搜索参数设为缺省值，在进行序列比对和引入缺口之后，候选的衍生序列中核苷酸或氨基酸与目标序列(或其特定部分)中核苷酸或氨基酸相同的百分比。HSP S和HSP S2参数是机动值，而且是通过程序本身取决于特定序列的组成和在其中对感兴趣的序列进行搜索的特定数据库的组成而确定的。“％同一性值”通过把匹配的相同核苷酸或氨基酸的数目除以报告百分比同一性的序列的序列长度而确定。“百分比(％)氨基酸序列相似性”通过进行与确定百分比氨基酸序列同一性相同的计算而确定，但是在计算中除了相同的氨基酸之外还包括保守氨基酸取代。保守氨基酸取代，即其中氨基酸被具有相似特性的另一个氨基酸所取代，而对蛋白的折叠或活性没有显著的影响。可以互
相取代的芳香族氨基酸为苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸；可互换的疏水氨基酸为亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸和缬氨酸；可互换的极性氨基酸为谷氨酰胺和天门冬酰胺；可互换的碱性氨基酸为精氨酸，赖氨酸和组氨酸；可互换的酸性氨基酸为天冬氨酸和谷氨酸；可互换的小氨基酸为丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸和甘氨酸。
目标核酸分子的衍生核酸分子，包括能选择性地与SEQ ID NO：1的核酸序列杂交的序列。杂交的严谨度可通过温度，离子强度，pH，以及杂交和洗涤期间变性剂诸如甲酰胺的存在来进行控制。通常使用的条件是大家所熟知的(参见，例如，Current Protocol in MolecularBiology，Vol.1，Chap.2.10，John Wiley & Sons，Publishers(1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor(1989))。在一些实施方案子中，本发明的核酸分子能在如下的严谨杂交条件下与包含SEQ ID NO：l的核苷酸序列的核酸分子杂交：含有核酸的滤纸，在含有6X单倍浓度的柠檬酸盐(SSC)(1X SSC为0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠；pH 7.0)，5X Denhardt溶液，0.05％焦磷酸钠和100μg/ml的鲱鱼精子DNA的溶液中，65预杂交8小时到过夜；在含有6X SSC，1X Denhardt溶液，100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸钠的溶液中，65杂交18-20小时；在含有0.1X SSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中，65洗涤滤纸1小时。在其他的实施方案中，使用如下的中等严谨杂交条件：包含核酸的滤纸，在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，1％Ficoll，1％BSA和500μg/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中，40预处理6小时；在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑鱼精子DNA和10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯的溶液中，40杂交18-20小时；接着，在含有2X SSC和0.1％SDS的溶液中，55洗涤两次，1小时。或者，可使用如下的低严谨条件：在含有20％甲酰胺，5x SSC，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5X Denhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml变性剪切鲑鱼精子DNA的溶液中，37孵育8小时到过夜；在相同的缓冲液
中杂交18到20小时；在1x SSC中，大约37洗涤滤纸1小时。
由于遗传密码的简并性，可产生许多编码HIO103.1多肽的多核苷酸序列。例如，根据特定宿主显示的最佳密码子使用，可选择密码子以增加多肽在特定的宿主物种中的表达率(参见，例如，Nakamura等，1999)。这种序列变体可用于本发明的方法。
本发明的方法可使用拟南芥HIO103.1的直系同源物。鉴定其他植物品种中直系同源物的方法是本领域已知的。一般说来，不同物种中的直系同源物保持相同的功能，由于存在一个或多个蛋白基序和/或三维结构。在进化过程中，当物种形成后发生基因重复事件时，一个物种，例如拟南芥中的单个基因，可能相应于另一个物种中的多个基因(旁系同源物)。如这里使用的，术语“直系同源物”包括旁系同源物。当序列数据可用于特定的植物物种时，通常可通过序列同源性分析，例如BLAST分析，一般使用蛋白饵序列，来鉴定直系同源物。如果来自正向BLAST结果的top hit序列检索到了反向BLAST中原始的查询序列，该序列则为可能的直系同源物(Huynen MA and Bork P，Proc Natl Acad Sci(1998)95：5849-5856；Huynen MA等，GenomeResearch(2000)10：1204-1210)。用于多个序列比对的程序，例如CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 22：4673-4680)，可用于突出直系同源蛋白的保守区域和/或残基，并产生系统树。在表示来自不同物种的多个同源序列(例如，通过BLAST分析检索到的)的系统树中，来自2个物种的直系同源序列，相对于来自者2个物种的所有其他的序列，通常在系统树上显得最靠近。结构串线(threading)或蛋白折叠的其他分析(例如，使用ProCeryon，Biosciences，Salzburg，Austria的软件)也可鉴定可能的直系同源物。核酸杂交方法也可用于寻找直向同源基因，而且当不能获得序列数据是优选的。简并PCR和cDNA或基因组DNA文库筛选，是寻找相关基因序列的常见方法，而且是本领域熟知的(参见，例如，Sambrook，1989；Dieffenbach andDveksler，1995)。例如，Sambrook等中描述了用于从感兴趣的植物物
种产生cDNA文库，和用部分同源基因探针探测文库的方法。拟南芥HIO103.1编码序列的高度保守部分可用作探针。HIO103.1直系同源核酸可在高度，中度或低度严谨条件下与SEQ ID NO：1的核酸杂交。扩增或分离假定的直系同源物的部分之后，可通过标准技术克隆该部分并进行测序，而且用作探针来分离完整的cDNA或基因组克隆。或者，可以启动EST方案来产生感兴趣的植物物种的序列信息数据库。在另一种方法中，能特异性结合已知的HIO103.1多肽的抗体，用于直系同源物分离(参见，例如，Harlow and Lane，1988，1999)。Western印迹分析可确定HIO103.1直系同源物(也即，直系同源蛋白)存在于特定植物物种的粗提取物中。当观察反应性时，可通过筛选显示特定植物物种的表达文库，来分离编码候选直系同源物的序列。如Sambrook等1989中所述，可在各种商业可获得的载体中构建表达文库，包括λgt11。一旦通过任何这些方法鉴定到了候选的直系同源物，候选的直系同源序列可用作饵(“查询”)，用于从其中已经鉴定到HIO103.1核酸和/或多肽序列的拟南芥或其他的物种中对序列进行反向BLAST。
可使用任何可用的方法来获得HIO103.1核酸和多肽。例如，通过如前所述的通过筛选DNA文库或通过使用聚合酶链式反应(PCR)，分离感兴趣的cDNA或基因组DNA序列的技术是本领域熟知的。或者，可合成核酸序列。任何已知的方法，例如位点定向诱变(Kunkel TA等，1991)，可用于将所需的改变引入到克隆的核酸中。
通常，本发明的方法包括把所需形式的HIO103.1核酸整合到用于转化植物细胞的植物表达载体中，并在宿主植物中表达HIO103.1多肽。
分离的HIO103.1核酸分子是不同于天然发现的形式或设置的核酸分子，而且从至少一个杂质核酸分子中鉴定和分离，该杂质核酸分子通常结合在HIO103.1核酸的天然来源中。然而，分离的HIO103.1
核酸分子包括包含在通常表达HIO103.1的细胞中的HIO103.1核酸分子，例如，该核酸分子位于与天然细胞的核酸分子不同的染色体位置。
产生具有改变的含油量表型的遗传修饰的植物
HIO103.1核酸和多肽可用于产生具有修饰的含油量表型的遗传修饰的植物。如这里使用的，“修饰的含油量表型”可指植物任何部分中修饰的含油量；经常在种子中观察到修饰的含油量。在一个优选的实施方案中，植物中HIO103.1基因的0改变表达可用于产生具有高油表型的植物。
这里所述的方法一般适用于所有植物。尽管在拟南芥中进行了激活标签法和基因鉴定，但是HIO103.1基因(或其直系同源物，变体或片段)可在任何植物种类中表达。在一个优选的实施方案中，本发明涉及产油植物，其在特异性器官，主要是在种子中生产和储存三酰基甘油。这些物种包括大豆(Glycine max)，油菜籽和canola(包括甘蓝型油菜(Brassica napus)，B.campestris)，向日葵(Helianthus annus)，棉花(陆地棉)，玉米(Zea maya)，可可(Theobroma cacao)，红花(Carthamustinctorius)，油棕(Elaeis guineensis)，椰子(Cocos nucifera)，亚麻(Linumusitatissimum)，蓖麻(Ricinus communis)和花生(Arachis hypogaea)。本发明还涉及产生果实和蔬菜的植物，产生谷物的植物，产生坚果的植物，快速周期的芸苔品种，紫花苜蓿(Medicago sativa)，烟草(Nicotiana)，草坪草(Poaceae family)，其他的饲料作物，和可能是稀有脂肪酸来源的野生物种。
本领域技术人员应该了解本领域存在的各式各样的转化技术，而且新技术不断地变成可用的。适于靶宿主植物的任何技术可用于本发明的范围内。例如，可引入各种形式的构建体，包括但不限于DNA链，到质粒，或人工染色体中。可通过各种技术将构建体引入到靶植物细胞中，包括但不限于异源核酸的土壤农杆菌介导的转化，电穿孔法，显微注射，微粒轰击，磷酸钙-DNA共沉淀或脂质体介导的转化。
植物转化优选永久的，也即通过使导入的表达构建体整合到宿主植物基因组中，以便该导入的构建体传递给连续的植物世代。根据计划的用途，包含HIO103.1多核苷酸的异源核酸构建体可编码完整的蛋白或其生物学活性部分。
在一个实施方案中，双元Ti载体系统可用于转移多核苷酸。标准的土壤农杆菌双元载体是本领域技术人员已知的，而且许多是可商业获得的(例如，pBI121Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)。
用土壤农杆菌载体转化植物的最佳方法随待转化的植物种类而变化。用于土壤农杆菌介导的转化的示例性方法包括转化来源于无菌籽苗和/或小植株的胚轴，芽，茎或叶组织的外植体。这种转化的植物可有性繁殖，或通过细胞或组织培养繁殖。以前已经描述了土壤农杆菌转化用于许多不同类型的植物，而且可在科学文献中找到这种转化方法。其中特别相关是转化商业上重要的作物，例如油菜籽(De Block等，1989)，向日葵(Everett等，1987)和大豆(Christou等，1989；Kline等，1987)的方法。
根据表达水平，发生表达的组织类型和/或表达的发育阶段，可调节HIO103.1的表达(包括转录和翻译)。许多异源调节序列(例如，启动子和增强因子)可用于调控HIO103.1核酸的表达。这些包括组成型，诱导型和可调节的启动子，以及能以组织或瞬时特异性方式调控表达的启动子和增强因子。示例性的组成型启动子包括树莓E4启动子(美国专利5,783,393和5,783,394)，35S CaMV(Jones JD等，1992)，CsVMV启动子(Verdaguer B等，1998)和甜瓜肌动蛋白启动子(公开的PCT申请WO0056863)。示例性的组织特异性启动子包括番茄E4和E8启动子(美国专利5,859,330)和番茄2AH基因启动子(Van Haaren MJJ等，1993)。
在一个优选的实施方案中，HIO103.1表达在来自其表达与早期
种子和/或胚胎发育相关的基因的调节序列的调控下。其启动子与早期种子和胚胎发育相关的豆科植物基因包括V.faba豆球蛋白(Baumlein等，1991，Mol Gen Genet 225：121-8；Baumlein等，1992，Plant J 2：233-9)，V.faba usp(Fiedler等，1993，Plant Mol Biol 22：669-79)，豌豆convicilin(Bown等，1988，Biochem J 251：717-26)，豌豆凝集素(dePater等，1993，Plant Cell 5：877-86)，P.vulgaris β菜豆蛋白(Bustos等，1991，EMBO J 10：1469-79)，P.vulgaris DLEC2和PHS[β](Bobb等，1997，Nucleic Acids Res 25：641-7)和大豆β-conglycinin，7S贮藏蛋白(Chamberland等，1992，Plant Mol Biol 19：937-49)。其启动子与早期种子和胚胎发育相关的谷类基因包括水稻谷蛋白(″GluA-3，″Yoshihara and Takaiwa，1996，Plant Cell Physiol 37：107-11；″GluB-1，″Takaiwa等，1996，Plant Mol Biol 30：1207-21；Washida等，1999，Plant Mol Biol 40：1-12；″Gt3，″Leisy等，1990，Plant Mol Biol 14：41-50)，水稻醇溶谷蛋白(Zhou & Fan，1993，Transgenic Res 2：141-6)，小麦醇溶谷蛋白(Hammond-Kosack等，1993，EMBO J 12：545-54)，玉米醇溶蛋白(Z4，Matzke等，1990，Plant Mol Biol 14：323-32)和大麦B-hordein(Entwistle等，1991，Plant Mol Biol 17：1217-31)。其他的其启动子与早期种子和胚胎发育相关的基因，包括油棕GL07A(7S球蛋白，Morcillo等，2001，Physiol Plant 112：233-243)，甘蓝型油菜napin，2S贮藏蛋白和napA基因(Josefsson等，1987，J Biol Chem 262：12196-201；Stalberg等，1993，Plant Mol Biol 199323：671-83；Ellerstrom等，1996，Plant Mol Biol 32：1019-27)，甘蓝型油菜油质蛋白(Keddie等，1994，Plant Mol Biol 24：327-40)，拟南芥油质蛋白(Plant等，1994，Plant Mol Biol 25：193-205)，拟南芥FAE1(Rossak等，2001，Plant Mol Biol 46：717-25)，刀豆conA(Yamamoto等，1995，Plant Mol Biol 27：729-41)和长春花异胡豆苷合成酶(Str，Ouwerkerkand Memelink，1999，Mol Gen Genet 261：635-43)。在另一个优选的实施方案中，使用来自在油生物合成期间表达的基因的调节序列(参见，例如，美国专利5,952,544)。可选择的启动子来自于植物贮藏蛋白基因(Bevan等，1993，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 342：209-15)。
在另一个方面，有时可能需要抑制宿主细胞中内源HIO103.1的表达。用于实施本发明该方面的示例性方法包括，但不限于反义抑制(Smith等，1988；van der Krol等，1988)；共抑制(Napoli，等，1990)；核酶(PCT公开WO 97/10328)；和正义与反义的组合(Waterhouse，等，1998)。抑制宿主细胞内源序列的方法，一般使用待抑制序列的至少一部分的转录或转录和翻译。这种序列可以与内源序列的编码以及非编码区同源。反义抑制可使用完整的cDNA序列(Sheehy等，1988)，部分cDNA序列包括5’编码序列(Cannon等，1990)或3’非编码序列(Ch′ng等，1989)的片段。共抑制技术可使用完整的cDNA序列(Napoli等，1990；van der Krol等，1990)或部分cDNA序列(Smith等，1990)。
可进行标准的分子和遗传试验，以更进一步分析基因与观察到的表型之间的关联。示例性技术描述如下。
1.DNA/RNA分析
例如，通过原位杂交，可在突变体中对比野生型系确定阶段-与组织特异性基因表达模式。可进行基因，尤其是侧翼调节区甲基化状况分析。其他的适用技术包括过量表达，异位表达，在其他植物物种中的表达和基因敲除反向遗传学，靶向敲除，病毒诱导的基因沉默[VIGS，参见Baulcombe D，1999])。
在优选的应用中，通过微阵列分析的表达分布被用于同时测量许多不同基因表达中的差异或诱导的改变。用于微阵列分析的技术是本领域熟知的(Schena M等，Science(1995)270：467-470；Baldwin D等，1999；Dangond F，Physiol Genomics(2000)2：53-58；van Hal NL等，J Biotechnol(2000)78：271-280；Richmond T and Somerville S，CurrOpin Plant Biol(2000)3：108-116)。可以进行单独标签的株系的表达分布分析。这种分析可鉴定由于感兴趣基因的过量表达而协调调节的其它基因，其可有助于把未知基因置于特定的途径。
2.基因产物分析
基因产物分析可包括重组蛋白表达，抗血清产生，免疫定位，催化或其他的活性的生物化学分析，磷酸化状况分析，和通过酵母双杂交分析进行与其他蛋白之间的相互作用分析。
3.途径分析
途径分析可包括，基于它的错表达表型或通过与相关基因的序列同源性，把基因或基因产物置于特定的生物化学，新陈代谢或信号途径中。或者，分析可包括与野生型系和其它突变系的遗传杂交(产生双突变体)，以把基因指定于途径中，或确定在途径中突变对下游“报告”基因的作用。
用改变的含油量表型产生突变植物
本发明更进一步提供了鉴定在内源HIO103.1中具有能赋予改变的含油量的突变的植物，和产生这些没有遗传修饰的植物的改变的含油量后代的方法。在一种称为“TILLING”的方法中(用于在基因组中靶向诱导的局部病变)，例如，使用EMS处理，在感兴趣植物的种子中诱导突变。生长得到的植物，并且自体受精，该后代用于制备DNA样品。HIO103.1-特异性PCR被用于鉴定突变的植物是否具有HIO103.1突变。然后测试具有HIO103.1突变的植物的改变的含油量，或者，测试植物的改变的含油量，然后HIO103.1-特异性PCR被用于确定具有改变的含油量的植物是否具有突变的HIO103.1基因。TILLING可鉴定能改变特异性基因的表达或这些基因编码的蛋白的活性的突变(参见Colbert等(2001)Plant Physiol 126：480-484；McCallum等(2000)Nature Biotechnology 18：455-457)。
在另一种方法中，候选基因/数量性状基因座(QTL)方法可用于标记辅助的育种项目，以鉴定HIO103.1基因或HIO103.1直系同源物中的等位基因或突变，其能赋予改变的含油量(参见Bert等，Theor Appl
Genet.2003 Jun；107(1)：181-9；以及Lionneton等，Genome.2002 Dec；45(6)：1203-15)。因此，在本发明更进一步的方面中，HIO103.1核酸被用于鉴定具有改变的含油量的植物是否在内源HIO103.1中具有突变，或具有能导致改变的含油量的特定等位基因。
虽然参考特定的方法和实施方案已经描述了本发明，应当理解只要不背离本发明可以进行各种修饰和改变。这里引用的所有出版物都明确地引入这里作为参考，用于描述和公开与本发明一起使用的组合物和方法的目的。所有引用的专利，专利申请，和参考网址与公共数据库中的序列信息也引入作为参考。
实施例
实施例1
利用激活标签构建体进行转化产生具有HIO103.1表型的植物
使用激活标签“ACTTAG”载体，pSKI015产生突变体(GI#6537289；Weigel D等，2000)。使用标准方法产生拟南芥转基因植物，基本上如公开的申请PCT WO0183697中所述。简要地，T0拟南芥(Col-0)植物用携带有pSKI015载体的土壤农杆菌进行转化，该载体包括来源于土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA，除草剂抗性选择性标记基因，和4X CaMV 35S增强子元件。根据除草剂抗性，在T1世代选择转基因植物。
通过近红外光谱法(NIR)，在收获时分析T3种子库。使用Bruker22N/F捕获NIR红外光谱。使用来自NIR分析的数据，和根据制造商的说明，Bruker软件用于评估总的种子油和总的种子蛋白含量。通过我们的标准预测的含油量(PDX Oil 3，Predicts hexane Extracted Oil)与40,000个单独的ACTTAG系进行了比较。为了鉴定高油系，把NIR油结果与在同一天种植的所有ACTTAG系的平均油结果进行了比较(相对含油量)。在种子组成分析之后，确定了ACTTAG侧翼序列。在该分析中分析了22,000个具有回收的侧翼序列的系。从22,000评定
的ACTTAG系中，819(～4％)具有高油(定义为含油量)＝种植日平均含油量的107％)。对高油ACTTAG系的该亚型中基因组的协同作用进行了评估，鉴定了具有2或多个独立的ACTTAG插入的系，其也显示高油，以及通过PCR和测序证实了其侧翼序列。
W000130481系(IN040467)，相对于35.0％的种植日平均含油量(PDA为111％)具有NIR确定的39.0％的含油量。W000151561系(INO53303)相对于34.4％的种植日平均含油量，具有NIR确定的38.3％的含油量。
W000130481系(IN040467)在1号染色体的3244182bp处具有确认的ACTTAG插入。
W000151561系(IN053303)在1号染色体的3251749bp处具有确认的ACTTAG插入。
基于在超过一个的显示高油表型的独立突变系中，候选基因附近存在包含增强因子的T-DNA插入序列，我们作出结论插入序列与性状相关。这些突变系的实际插入数量是未知的。
实施例2
显示改变的含油量表型的植物中T-DNA插入的表征
我们进行了基本上如专利申请PCT WO0183697中所示的标准分子分析，以确定与改变的含油量表型相关的T-DNA插入位点。简而言之，从显示改变的含油量表型的植物提取基因组DNA。使用pSKI015载体的特异性引物进行的PCR，确认了来自IN040467和IN053303系的植物中存在35S增强子，Southern印迹分析证实了ACTTAG T-DNA的基因组整合，并表明了在每个转基因系中都存在T-DNA插入。
反向PCR被用于回收T-DNA插入序列侧翼的基因组DNA，然
后使用基础的BLASTN搜索和/或拟南芥信息资源(TAIR)数据库搜索(在arabidopsis.org网址上可获得)进行序列分析。对于ACTTAG系IN040467，与拟南芥基因组BAC克隆F21M12的1号染色体上的131064-131227核苷酸(GI#_2160155)存在序列同一性，左侧边界连接处位于131227(GI#_2160155)的下游。该插入序列的异侧侧翼(预测的右侧边界连接处)没有确定。IN040467 T-DNA的左侧边界位于翻译起始位点5’端的～2637bp处。
对于ACTTAG系IN053303而言，与拟南芥基因组BAC克隆F21M12的1号染色体上的138824-139118核苷酸(GI#_2160155)存在序列同一性，左侧边界连接处位于138824(GI#_2160155)的下游。该插入序列的异侧侧翼(预测的右侧边界连接处)没有确定。IN053303 T-DNA的左侧边界位于翻译起始位点5’端的～10204bp处。
实施例3
拟南芥HIO 103.1序列的分析
利用BLAST(Altschul等，1997，J.Mol.Biol.215：403-410)，PFAM(Bateman等，1999，Nucleic Acids Res 27：260-262)PSORT(Nakai K和Horton P，1999，Trends Biochem Sci 24：34-6)和/或CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 22：4673-4680)进行序列分析。
针对EST的BLASTN：
存在5个与该序列匹配的拟南芥EST。
-gi：19876633
-gi：9785424
-gi：9785476
-gi：9785503
-gi：19743182
有许多来自各种植物物种的EST显示与Atlg09950具有相似性。如有可能，制备每个物种的EST重叠群。以下每个物种的top hit列于如下，并包括于“直系同系物表”中：小麦，陆地棉，玉米，大豆，欧洲山杨，水稻，番茄，马铃薯，甘蓝型油菜和大麦。
1.来自小麦的1个EST
＞gi|21634 HBP-1b(亮氨酸拉链类型转录因子)的小麦1b-c38基因
2.来自棉花的1个EST重叠群
没有鉴定到Atlg09950同系物
3.来自玉米的1个EST重叠群
重叠群序列如下面的SEQ ID NO.：3所示。
4.来自大豆的1个EST重叠群
重叠群序列如下面的SEQ ID NO.：4所示。
5.来自白杨的1个EST重叠群
重叠群序列如下面的SEQ ID NO.：5所示。
6.来自水稻的1个EST
＞gi|10423526|dbj|AU1O8122.1|AU108122 AU108122 Rice callusOryza sativa(japonica栽培品种-组)cDNA克隆C30623
7.来自番茄的1个EST
＞gi|4384471 EST247439番茄子房，TAMU番茄cDNA克隆cLED18D7
8.来自马铃薯的1个EST重叠群
重叠群序列如下面的SEQ ID NO.：6所示。
针对所有氨基酸的BLASTP结果：
蛋白Atlg09950与已知起转录因子作用的其他植物蛋白具有高度的同源性。前10个BLAST结果列于如下，并包括于“直系同源物表”中。
1.本身(3个冗余登录项)
＞gi|15218335|ref|NP_172466.1|推测的蛋白；蛋白id：Atlg09950.1
[拟南芥]
＞gi|25372756|pir‖H86233推测的蛋白[输入]-拟南芥
＞gi|2160187|gb|AAB60750.1|与烟草肿瘤-相关蛋白(gb|26453)相似。
[拟南芥]
分值＝1092(389.5比特)，期望值＝5.2e-110，P＝5.2e-110
2.来自拟南芥的Atlg58330(4个冗余登录项)
＞gi|18406255|ref|NP_564730，1|表达的蛋白；蛋白id：Atlg58330.1，cDNA支持的：gi_6520153提供的[拟南芥]
＞gi|25372755|pir|T52443推测的蛋白ZW2[输入]-拟南芥
＞gi|6520154|dbj|BAA87938.1|ZW2[拟南芥]＞gi|8979941|gb|AAF82255.1|AC008051_6与来自拟南芥的 gb|AB028196的基因ZW2相同
分值＝632(227.5比特)，期望值＝2.9e-61，P＝2.9e-61
3.来自拟南芥的At4g18650(4个冗余登录项)
＞gi|15233970|ref|NP_193600.1|推测的蛋白；蛋白id：
At4g18650.1[拟南芥]
＞gi|7486277|pir|T04857推测的蛋白F28A21.60-拟南芥
＞gi|4539384|emb|CAB37450.1|推测的蛋白[拟南芥]
＞gi|7268659|emb|CAB78867.1|推测的蛋白[拟南芥]
分值＝218(81.8比特)，期望值＝2.2e-17，P＝2.2e-17
以下序列是At4g18650其他冗余登录项。不过，它们有几个核苷酸不同于上面所列的序列。这可能是测序误差，或单核苷酸多态性的结果，对活性很少或没有影响。
＞gi|28393021|gb|AAO41945.1|未知蛋白[拟南芥]
＞gi|28827732|gb|AAO50710.1|未知蛋白[拟南芥]
分值＝218(81.8比特)，期望值＝2.2e-17，P＝2.2e-17
4.来自水稻的1个基因(japonica栽培品种-组)(2个冗余登录项)
＞gi|15408613|dbi|BAB64034.1|P0552C05.19[水稻(japonica栽培品种-组)]
＞gi|21104797|dbj|BAB93383.1|OSJNBb0022N24.3[水稻(japonica栽培品种-组)]
分值＝204(76.9比特)，期望值＝6.6e-16，P＝6.6e-16
5.来自烟草的肿瘤相关蛋白
＞gi|688423|dbj|BAA05470.1|肿瘤-相关蛋白[粘毛烟草×蓝格斯多夫烟草]
分值＝177(67.4比特)，期望值＝6.7e-13，P＝6.7e-13
6.来自拟南芥的At4g18690(4个冗余登录项)
＞gi|5233979|ref|NP_193604.1|推测的蛋白；蛋白id：
At4g18690.1[拟南芥]
＞gi|7486266|pir|T04861推测的蛋白F28A21.100-拟南芥
＞gi|4539388|emb|CAB37454.1|推测的蛋白[拟南芥]＞gi|7268663|emb|CAB78871.1|推测的蛋白[拟南芥]
分值＝158(60.7比特)，期望值＝2.3e-10，P＝2.3e-10
7.来自水稻的未命名的蛋白(japonica栽培品种-组)(2个冗余登录项)
＞gi|8570052|dbj|BAA96757.1|未命名的蛋白产物[水稻(japonica栽培品种-组)]
＞gi|9757677|dbj|BAB08196.1|ESTs AU057825(S21823)，AU057072(S21123)对应于预测基因的一个区域。～与粘毛烟草×蓝格斯多夫烟草肿瘤-相关蛋白的mRNA相似(D26453)[水稻(japonica栽培品种-组)]
分值＝155(59.6比特)，期望值＝8.9e-10，P＝8.9e-10
8.来自拟南芥的At4g18660(4个冗余登录项)
＞gi|15233972|ref|NP_193601.1|推测的蛋白；蛋白id：At4g18660.1[拟南芥]
＞gi|7486278|pir|T04858假定的蛋白F28A21.70-拟南芥
＞gi|4539385|emb|CAB37451.1|推测的蛋白[拟南芥]
＞gi|7268660|emb|CAB78868.1|推测的蛋白[拟南芥]
分值＝129(50.5比特)，期望值＝3.1e-09，Sum P(2)＝3.1e-09
8.小麦的转录因子HBP-1b(3个冗余登录项)
＞gi|122772|sp|P23923|HBPB WHEAT转录因子HBP-1b
＞gi|100809|pir|S15347转录因子HBP-1b-小麦
＞gi|21635|emb|CAA40102.1|HBP-1b[小麦]
分值＝151(58.2比特)，期望值＝1.1e-08，P＝1.1e-08
10.来自水稻的未命名蛋白(japonica栽培品种-组)(3个冗余登录项)
＞gi|6498432|dbj|BAA87835.1|未命名的蛋白产物[水稻(japonica栽培品种-组)]
＞gi|11138060-|bdj|BAB17733.1|推测的转录因子HBP-1b-小麦[水稻(japonica栽培品种-组)]
＞gi|13873003|dbj|BAB44107.1|推测的转录因子HBP-1b-小麦[水稻(japonica栽培品种-组)]
分值＝146(56.5比特)，期望值＝3.3e-08，P＝3.3e-08
| 直系同源基因名称 | 物种 | ＞GI# | 与HIO103.1的％ID | 分值(BLAST， Clustal，等等) |
| 来自水稻的蛋白 | 水稻(japonica栽 培品种-组) | ＞gi|15408613| ＞gi|21104797| | 长度＝277 同一性＝64/205 (31％)， 阳性率＝ 95/205(46％) | BLASTP 分值＝204(76.9 比特)， 期望值＝6.6e-16， P＝6.6e-16 |
| 来自烟草的肿瘤相 关蛋白 | 粘毛烟草×蓝格斯 多夫烟草 | ＞gi|688423 | 长度＝287 同一性＝63/241(26％)， 阳性率＝ 112/241(46％) | BLASTP 分值＝177 (67.4比特)， 期望值＝6.7e-13， P＝6.7e-13 |
| 来自水稻的未命名 蛋白 | 水稻(japonica栽 培品种-组) | ＞gi|8570052| ＞gi|9757677| | 长度＝269 同一性＝67/232(28％)， 阳性率＝98/232 (42％) | BLASTP 分值＝155(59.6比 特)，期望值＝8.9e- 10，P＝8.9e-10 |
| 来自小麦的HBP- 1b转录因子 | 小麦 | ＞gi|122772 ＞gi|100809 ＞gi|21635| | 长度＝332 同一性＝51/200(25％) 阳性率＝91/200(45％) | BLASTP 分值＝151(58.2比 特)，期望值＝1.1 e-08，P＝1.1e-08 |
| 来自水稻的未命名 蛋白 | 水稻(japonica栽 培品种-组) | ＞gi|6498432| ＞gi|11138060| ＞gi|13873003| | 长度＝264 同一性＝ 50/201(24％)， 阳性率＝92/201(45％) | BLASTP 分值＝146(56.5比 特)期望值＝3.3e- 08，P＝3.3e-08 |
| 来自小麦的1个 EST | 小麦 | gi|21634 | 长度＝2204 同一性＝ 51/200(25％)，阳性率 ＝91/200(45％)帧 (Frame)＝+2 | TLASTPN 分值＝151(58.2比 特)期望值＝7.1e- 09，P＝7.1e-09 |
| 来自玉米的1个 EST重叠群 | 玉米 | gi|422028 gi|422029 | 长度＝1163 同一性＝ 51/201(25％)，阳性率 ＝91/201(45％)帧 (Frame)＝+1 | TLASTPN 分值＝139(54.0比 特)期望值＝7.6e- 08，P＝7.6e-08 |
| 来自大豆的1个 EST重叠群 | 大豆 | gi|7685470 gi|22930307 | 长度＝1022 同一性＝ 41/129(31％)，阳性率 ＝67/129(51％)帧 (Frame)＝+3 | TLASTPN 分值＝169(64.5比 特)期望值＝24e- 12 ，P＝24e-12 |
| 来自白杨的1个 EST重叠群 | 白杨 | gi|18004849 gi|24060736 gi|24063323 gi|24063961 gi|24061283 gi|24064370 gi|24061976 gi|24063658 gi|24065989 gi|24060893 gi|24061066 gi|24061169 gi|24062091 gi|24061232 gi|24064452 gi|24065387 gi|24064857 gi|24064628 gi|24063100 gi|24065142 gi|24062202 gi|24063141 gi|24066218 gi|24063168 gi|23979309 gi|23979991 gi|23979824 gi|22552422 gi|24016600 gi|24049533 gi|24050145 gi|24056785 gi|24048644 | 长度＝1250 同一性＝ 45/178(25％)，阳性率 ＝79/178(44％)帧 (Frame)＝+3 | TLASTPN 分值＝109(43.4比 特)期望值＝ 0.00036，P＝ 0.00036 |
| 来自水稻的1个 EST | 水稻(japonica栽 培品种-组) | ＞gi|10423526 | 长度＝759 同一性＝ 39/160(24％)，阳性率 ＝67/160(41％)帧 (Frame)＝+3 | TLASTPN 分值＝98(39.6比 特)期望值＝ 0.70，P＝0.51 |
| 来自番茄的1个 EST | 番茄 | gi|4384471 | 长度＝608 同一性＝ 53/209(25％)，阳性率 ＝105/209(50％)帧 (Frame)＝+3 | TLASTPN 分值＝193(73.0比 特)期望值＝2.2e- 15，P＝2.2e-15 |
| 来自马铃薯的1个 EST重叠群 | 马铃薯 | gi|21376875 gi|21376876 gi|18256330 | 长度＝1083 同一性＝27/96(28％)， 阳性率＝48/96(50％)帧 (Frame)＝+2 | TLASTPN 分值＝124(48.7比 特)期望值＝1.6e- 12，Sum P(2)＝ 1.6e-12 |
最接近的拟南芥同系物
| Atlg58330 | 拟南芥 | ＞gi|18406255 ＞gi|25372755 ＞gi|6520154 ＞gi|8979941 | 长度＝225 同一性＝ 121/213(56％)， 阳性率＝ 162/213(76％) | BLASTP 分值＝ 632(227.5比特) 期望值＝2.9e- 61，P＝2.9e-61 |
| At4g18650 | 拟南芥 | ＞gi|15233970 ＞gi|7486277 ＞gi|4539384 ＞gi|7268659 | 长度＝229 同一性＝ 58/209(27％)， 阳性率＝ 107/209(51％) | BLASTP 分值＝218(81.8 比特)期望值＝ 2.2e-17，P＝ 2.2e-17 |
| At4g18690 | 拟南芥 | ＞gi|15233979 ＞gi|7486266| ＞gi|4539388 ＞gi|7268663| | 长度＝368 同一性＝ 51/194(27％)， 阳性率＝ 99/194(51％) | BLASTP 分值＝158(67.0 比特)期望值＝ 2.3e-10，P＝ 2.3e-10 |
| At4g18660 | 拟南芥 | ＞gi|15233972| ＞gi|7486278| ＞gi|4539385| ＞gi|7268660| | 长度＝281 同一性＝ 34/105(32％)， 阳性率＝ 57/105(54％) | BLASTP 分值＝129(50.5 比特)期望值＝ 3.1e-09，Sum P(2)＝3.1e-09 |
Atlg09950是非分泌性蛋白，而且缺乏信号肽(signalP)。通过TMHMM，没有检测到Atlg09950的跨膜结构域。Atlg09950可能定位于细胞核(通过PORT2，40％核，28％细胞质，16％线粒体)。Pfam分
析显示Atlg09950与已知的蛋白结构域具有有限的同源性。
由于Atlg09950可能是核蛋白，而且与它们的DNA结合结构域外已知的转录因子具有较低程度的同源性的事实，可以得出结论，Atlg09950调节基因在细胞核中的表达。
实施例4
产生具有HIO103.1表型的突变植物
本发明更进一步地提供了鉴定能赋予HIO103.1表型的内源HIO103.1或其等位基因中具有突变的植物，而且产生也具有HIO103.1表型并且没有遗传修改的这些植物的后代的方法。在一种称为“TILLING”的方法中(用于在基因组中靶向诱导的局部病变)，例如，使用EMS处理，在感兴趣植物的种子中诱导突变。生长得到的植物，并且自体受精，该后代用于制备DNA样品。HIO103.1-特异性PCR被用于鉴定突变的植物是否具有HIO103.1突变。然后测试具有HIO103.1突变的植物的HIO103.1表型，或者，测试植物的HIO103.1表型，然后HIO103.1-特异性PCR被用于确定具有HIO103.1表型的植物是否具有突变的HIO103.1基因。TILLING可鉴定能改变特异性基因的表达或这些基因编码的蛋白的活性的突变(参见Colbert等(2001)PlantPhysiol 126：480-484；McCallum等(2000)Nature Biotechnology 18：455-457)。
在另一种方法中，候选基因/数量性状基因座(QTL)法可用于标记辅助的育种项目，以鉴定HIO103.1基因或HIO103.1直系同源物的等位基因或突变，其能赋予HIO103.1表型(参见Foolad等，Theor ApplGenet.(2002)104(6-7)：945-958；Rothan等，Theor Appl Genet(2002)105(1)：145-159)；Dekkers and Hospital，Nat Rev Genet.(2002)Jan；3(1)：22-32)。
因此，在本发明更进一步的方面中，HIO103.1核酸被用于鉴定
具有HIO103.1表型的植物在内源HIO103.1中是否具有突变，或与缺乏突变或等位基因的植物相比，是否具有能导致HIO 103.1表型的特定等位基因，并产生鉴定的具有遗传的HIO103.1突变或等位基因和具有HIO103.1表型的植物的后代。
实施例5
为了证实Atlg09950的过表达导致高含油种子表型HIO103.1，把该基因克隆到了过表达载体中，所述基因位于强组成型CsVMV启动子后面，并转化到拟南芥植物中。该转化载体含有能提供对卡那霉素抗性的npmII基因，作为选择标记。通过在含有卡那霉素的培养基中萌发种子，在T1世代选择转化体。把对抗生素具有抗性的植物移植到32细胞平板的土壤中并生长到成熟。在琼脂培养基上萌发的野生型非转基因Col-0植物移植到相同的平面上作为实验对照。从转基因和对照植物收获种子，通过如上所述的NIR评估种子的含油量。来自由于CsVMV启动子过表达Atlg09950的植物的种子的含油量高于来自野生型植物的种子的含油量。来自过表达Atlg09950的植物的种子，在第一个实验中显示增加7％的种子含油量(34.8％的油，相比于对照的32.5％的油)，在第二个实验中显示增加6％(35.6％的油，相比于对照的33.5％的油)。这些结果证明，Atlg09950的过表达导致了种子含油量的增加。
参考文献
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Claims (15)
1.产生油类的方法，包括：
培育转基因植物以及从所述植物回收油类，其中的转基因植物包括植物转化载体，该植物转化载体含有编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的HIO103.1多肽的核苷酸序列，由此，该转基因植物相对于对照植物为高油表现型。
2.产生高油表现型植物的方法，所述方法包括：
a)向植物的祖细胞引入植物转化载体，该植物转化载体含有编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的HIO103.1多肽的核苷酸序列，以及
b)培育该转化的祖细胞来产生转基因植物，其中所述多核苷酸序列在所述转基因植物中表达，并且所述转基因植物相对于对照植物表现改变的含油量表现型。
3.产生具有高油表型的植物的方法，其包括：
鉴定具有HIO103.1突变的植物，所述具有HIO103.1突变的植物引起与缺少HIO103.1突变的植物相比含油量的增加，其中HIO103.1由SEQ ID NO：1的核酸序列组成；以及
产生所述鉴定的植物的子代，其中产生的子代遗传HIO103.1突变并且为高油表型。
4.权利要求3的方法，其使用候选基因/QTL法。
5.权利要求3的方法，其使用TILLING法。
6.由权利要求2的产生高油表现型植物的方法产生的高油表现型植物的种子生产的粗粉。
7.由权利要求2的产生高油表现型植物的方法产生的高油表现型植物的种子生产的饲料。
8.由权利要求2的产生高油表现型植物的方法产生的高油表现型植物的种子生产的食物。
9.权利要求1的方法，其中的油类回收自所述植物的种子。
10.饲料，包含由SEQ ID NO：1的核酸序列编码的多肽。
11.粗粉，包含由SEQ ID NO：1的核酸序列编码的多肽。
12.食物，包含由SEQ ID NO：1的核酸序列编码的多肽。
13.饲料，包括含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。
14.粗粉，包括含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。
15.食物，包括含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120718 Termination date: 20150419 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |