CN1764721A - 官能团与蛋白质的共价束缚 - Google Patents

Abstract

提供一种任选融合目标蛋白的突变水解酶。所述突变水解酶与对应非突变(野生型)水解酶的底物形成键，该键比野生型水解酶和所述底物形成的键更稳定。还提供包含一个或多个官能团的水解酶底物以及本发明突变水解酶和底物的使用方法。还提供能够与底物形成稳定键的融合蛋白以及表达所述融合蛋白的细胞。

Description

官能团与蛋白质的共价束缚

                 相关申请的相互参考

根据美国法典第35章第119条e款，本申请要求2003年1月31日提交的美国专利申请序号60/444,094以及2003年5月30日提交的美国专利申请序号60/474,659的申请日权益，这两个专利申请通过引用结合到本文中。

                      发明领域

本发明涉及生化检测和试剂领域。更具体地说，本发明涉及共价连接(束缚(tethered))一个或多个官能团的突变蛋白及其使用方法。

                      发明背景

分子特异性检测是了解该分子在细胞中作用的关键。例如与目标分子共价连接的标记物使得可以快速检测复杂混合物中的该分子。标记物可以通过体外化学合成添加或通过例如重组技术体内附着。例如，传统上在蛋白纯化后通过体外化学修饰将荧光或其它标记物附着于蛋白上(Hermanson，1996)。至于标记物的体内连接，可将得自维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)与众多宿主蛋白遗传融合，原位产生荧光嵌合体(Tsien，1998；Chalfie等，1998)。但是，尽管基于GFP的指示剂目前用于各种测定，例如检测pH(Kneen等，1998；Llopis等，1998；Miesenb_ck等，1998)、Ca²⁺(Miyawaki等，1997；Rosomer等，1997)和膜电位(Siegel等，1997)，但内源标记蛋白如GFP的荧光受限于蛋白结构特性，例如有限的荧光颜色范围和相对较低的固有亮度(Cubitt等，1995；Orm_等，1996)。

为克服GFP原位标记的缺陷，Griffen等(1998)合成了一对紧密结合的分子组分：由少至6个天然氨基酸组成的小型受体域和可连接至各种光谱探针或交联剂的小型(＜700道尔顿)合成配体。受体域在α螺旋的i、i+1、i+4和i+5位包含4个半胱氨酸，而配体为4′，5′-双(1，3，2-二硫杂砷杂环戊烷-2-基)荧光素(FLASH)。Griffen等公开：所述配体在非转染哺乳动物细胞中的结合位点较少，可透过膜，直至其高亲和且特异性地结合重组蛋白中的四半胱氨酸域才有荧光，从而荧光标记(“FLASH”标记)细胞，其解离常数为纳摩尔或更低。但是，考虑到细胞中的本底结合，Stroffekova等(2001)公开了FLASH-EDT₂非特异性结合内源性富半胱氨酸蛋白。此外，荧光团的可用范围限制了用FLASH标记蛋白。

受体介导的靶向方法使用基因工程编码的靶向序列将荧光团定位于几乎任一细胞位点，前提是靶标蛋白能够正确折叠。例如，Farinas等(1999)公开了使用cDNA转染将单链抗体(sFv)靶向细胞中的特定位点。Farinas等公开了半抗原(4-乙氧基亚甲基-2-苯基-2-噁唑啉-5-酮，phOx)和荧光探针(例如BODIPY F1、四甲基罗丹明和荧光素)的缀合物高亲和性(约5nM)结合活体中国仓鼠卵巢细胞中sFv的亚细胞位点，表明靶向抗体作为可穿透细胞的半抗原-荧光团缀合物的高亲和性受体。不过，功能性sFv表达在还原性条件下非常低。

因此，需要改进标记目的蛋白的方法。

                      发明概述

本发明提供了例如通过共价键或其它稳定键使一个或多个官能团和本发明蛋白或包含本发明蛋白的融合蛋白(嵌合体)束缚(连接)的方法、组合物和试剂盒。本发明的蛋白在结构上与野生型(天然)水解酶相关，但与对应的野生型水解酶相比含有至少一个氨基酸置换，并结合对应的野生型水解酶的底物，但与对应的野生型水解酶相比缺少或降低了催化活性(其突变蛋白在本文称为突变水解酶)。前述束缚发生在例如溶液或悬浮液中、细胞中、固相支持体上或溶液/表面交界面，使用包含反应基并被修饰以包含一个或多个官能团的水解酶底物。本文使用的“底物”包括含反应基和任选具有一个或多个官能团的底物。含一个或多个官能团的的底物在本文一般称为本发明底物。本文使用的“官能团”是可检测或能够检测的分子(例如发色团、荧光团或发光团)，或者是可结合或附着于另一种分子(例如生物素、半抗原或交联基团)的分子，或者是包含一个或多个氨基酸(例如肽或多肽，包括抗体或受体)、一个或多个核苷酸、脂质(包括脂双层)、固相支持体(例如沉降颗粒)等的分子。官能团可具有一种以上的特性，例如可检测和结合另一个分子。本文使用的“反应基”是底物中最少数目的原子，其被特定的野生型水解酶或本发明的突变水解酶特异性识别。底物中的反应基和野生型水解酶相互作用产生产物，并使所述野生型水解酶再生。底物(例如本发明的底物)还可以任选地包含连接基团，例如可裂解的连接基团。

用于本发明的底物特异性结合突变水解酶，优选与突变水解酶的氨基酸如活性残基形成一种键，该键比所述底物和对应的野生型水解酶氨基酸形成的键更稳定。尽管突变水解酶特异性结合可与对应的野生型水解酶特异性结合的底物，但在对应的野生型水解酶和底物反应形成产物的条件下，突变水解酶和底物相互作用没有或基本没有形成产物，例如低2、10、100或100倍。突变水解酶未形成产物或形成的产物量减少的原因是突变水解酶中至少有一个置换，该置换导致突变水解酶与底物形成的键比对应的野生型水解酶和底物形成的键更稳定。在对应的野生型水解酶形成产物的条件下，突变水解酶和本发明底物所形成键的半衰期(即t_1/2)优选是对应的野生型水解酶和底物所形成键的t_1/2的至少2倍，更优选至少4倍甚至10倍，直到100、1000或10,000倍。优选突变水解酶和底物形成的键其t_1/2为至少30分钟，优选至少4小时，直到至少10小时，并抗清洗、蛋白变性和/或高温的破坏，例如该键对在SDS中煮沸稳定。

在一个实施方案中，所述底物为脱卤素酶底物或丝氨酸β-内酰胺酶底物，所述脱卤素酶例如为卤代烷脱卤素酶或裂解脂肪族或芳族卤化底物中碳-卤素键的脱卤素酶，所述脱卤素酶底物例如为红球菌(Rhodococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、伯克氏菌(Burkholderia)、土壤杆菌(Agrobacterium)或黄色杆菌(Xanthobacter)脱卤素酶底物。在一个实施方案中，本发明底物任选包括将底物中一个或多个官能团与反应基物理分隔的连接基团。例如，对于某些突变水解酶，即具有较深催化袋的突变水解酶，本发明底物可包括足够长度和结构的连接基团，以使本发明底物的一个或多个官能团不扰乱水解酶(野生型和突变型)的3-D结构。例如，本发明脱卤素酶底物的一个实例包含如(CH₂)_2-3X(其中X是卤化物)的反应基和如四甲基罗丹明(TAMRA)的官能团，例如TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl。

在一个实施方案中，连接基团优选为12-30个原子长。所述连接基团可以不总是存在于本发明底物中，但在某些实施方案中，可能需要物理分隔反应基和官能团，以使反应基可与突变水解酶中的活性残基相互作用而形成共价键。优选当所述连接基团存在时，相对于对应的没有所述连接基团的底物和野生型或突变水解酶的特异性或反应性，其基本上不改变(例如削弱)具有所述连接基团的底物和野生型或突变水解酶的特异性或反应性。而且，所述连接基团的存在优选基本上不改变(例如削弱)官能团的一种或多种特性(例如功能)。

因此，本发明提供一种式(I)：R-连接基团-A-X的化合物，其中R是一个或多个官能团，其中连接基团是含C、N、S或O的多原子直链或支链，其中A-X为脱卤素酶底物，而其中X为卤素。在一个实施方案中，烷基卤化物共价连接至连接基团L，L是共价连接一个或多个官能团的一个或多个基团，以形成脱卤素酶底物。如本文所述，突变脱卤素酶DhaA.H272F结合DhaA底物，该底物包括5-(和6-)羰基荧光素(FAM)，例如FAM-Cl₄H₂₄O₄-Cl；TAMRA，例如TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl；以及生物素，例如生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl，此结合对FAM或TAMRA荧光或链霉抗生物素蛋白与生物素的结合没有显著的猝灭作用。又如本文所述，突变脱卤素酶，例如DhaA.D106C和DhaA.D106E以及DhaA.D106C：H272F和DhaA.D106E：H272F，结合FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl和/或TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl。在一个实施方案中，所述底物为R-(CH₂)₂O(CH₂)₂O(CH₂)₂O(CH₂)₆Cl，其中R为官能团。为制备这种底物，可将官能团与NH(CH₂)₂O(CH₂)₂O(CH₂)₂O(CH₂)₆Cl这种分子反应。

在一个实施方案中，本发明底物可穿透细胞的质膜。例如，如本文所述，TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl和生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl可穿透原核细胞(大肠杆菌)和真核细胞(CHO-K1)的质膜，在没有突变水解酶的情况下可将这些底物快速有效地输入和洗出细胞。当存在突变水解酶时，可防止至少一部分底物洗出细胞。因此，结合部分的底物可用作标记物或捕获突变水解酶或其融合体的方法。

本发明进一步提供制备水解酶底物的方法，该底物被修饰以包含一个或多个官能团。用于本发明的示例性官能团包括但不限于氨基酸、蛋白质(例如酶、抗体或其它免疫原性蛋白)、放射性核素、核酸分子、药物、脂质、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、磁珠、固相支持体、电子不透明分子、发色团、MRI造影剂、染料，例如呫吨染料、钙敏染料如1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羟基-3-氧基-9-呫吨基)苯氧基]-2-(2′-氨基-5′-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(Fluo-3)，钠敏染料如1，3-苯二甲酸、4，4′-[1，4，10，13-四氧杂-7，16-二氮杂环十八烷-7，16-二基双(5-甲氧基-6，2-苯并呋喃二基)]双(PBFI)，NO敏染料如4-氨基-5-甲基氨基-2′，7′-二荧光素或其它荧光团。在一个实施方案中，所述官能团为免疫原性分子，即与其特异性抗体结合的分子。在一个实施方案中，所述官能团不是放射性核素。

本发明还包括一种突变水解酶，其相比于对应的野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，该置换使所述突变水解酶能够与对应水解酶的底物(例如本发明底物)形成键(例如共价键)，该键比对应的野生型水解酶和底物形成的键更稳定。

在一个实施方案中，本发明的突变水解酶在残基中包含至少一个氨基酸置换，该残基在野生型水解酶中与活化水分子有关，例如催化三联体中的残基或辅助残基，其中活化水分子裂解野生型水解酶中催化残基与水解酶底物形成的键。本文使用的“辅助残基”是改变另一个残基活性的残基，例如其增强活化水分子的残基的活性。属于本发明范围的活化水分子的残基包括但不限于参与酸碱催化作用的残基，例如组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在另一个实施方案中，本发明的突变水解酶在残基中包含至少一个氨基酸置换，该残基在野生型水解酶中通过底物对水解酶的亲核攻击而形成酯中间体。

例如，野生型脱卤素酶DhaA裂解卤代烃(卤代C₃-卤代C₁₀)中的碳-卤素键。DhaA的催化中心是典型的催化三联体，包含亲核残基、酸性残基和组氨酸残基。三联体中的氨基酸位于DhaA催化袋(长约10_，横切面约20_²)内的底部。DhaA卤化底物中的卤素原子，例如Cl-烷烃底物中的氯原子，位于DhaA催化中心附近。DhaA结合底物，可能形成ES复合物，DhaA的Asp106(编号是基于DhaA的蛋白序列)受到底物亲核攻击形成酯中间体(图1)。DhaA的His272随后活化水，活化的水水解中间体，由催化中心释放出产物。如本文所述，突变DhaA，例如可能保持了三维结构(根据计算机建模研究)和野生型DhaA(DhaA.WT)基本物理化学特征的DhaA.H272F突变体，不能水解野生型酶的一种或多种底物，例如就Cl-烷烃而言，不能释放出野生型酶释放的对应醇。如本文进一步描述，突变丝氨酸β-内酰胺酶，例如blaZ.E166D突变体、blaZ.N170Q突变体和blaZ.E166D：N170Q突变体，不能水解野生型丝氨酸β-内酰胺酶的一种或多种底物。

因此，在本发明的一个实施方案中，突变水解酶是含有至少一个氨基酸置换的突变脱卤素酶，所述置换位于野生型脱卤素酶中与活化水分子相关的残基上，例如催化三联体中的残基或辅助残基，其中所述活化的水分子裂解野生型脱卤素酶中催化残基与脱卤素酶底物形成的键。在一个实施方案中，至少一个置换所在的残基对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA的残基272。“对应残基”是指在一种野生型蛋白中相对对照野生型蛋白具有相同活性(功能)的残基，在比对两种蛋白的一级序列时任选在相同的相对位置。例如，在一种酶中形成催化三联体部分并活化水分子的残基可能是该酶的残基272，此残基272对应于另一个酶的残基73，其中残基73形成催化三联体部分并活化水分子。因此，在一个实施方案中，本发明的突变脱卤素酶在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA残基272的位置具有苯丙氨酸残基。在本发明的另一个实施方案中，突变水解酶为在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA残基106的残基中含至少一个氨基酸置换的突变脱卤素酶。例如，本发明的突变脱卤素酶在对应于紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)DhaA残基106的位置具有半胱氨酸或谷氨酸残基。在再一个实施方案中，突变水解酶为含至少两个氨基酸置换的突变脱卤素酶，一个置换位于对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA残基106的残基，一个置换位于对应于紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)DhaA残基272的残基。在再另一个实施方案中，突变水解酶为突变丝氨酸β-内酰胺酶，其在对应于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PCl的丝氨酸β-内酰胺酶残基l66或残基170的残基中含至少一个氨基酸置换。

突变水解酶可以为融合蛋白，例如由编码突变水解酶和至少一种目标蛋白的重组DNA表达的融合蛋白或化学合成形成的融合蛋白。例如，所述融合蛋白可包含突变水解酶和目标酶(例如萤光素酶、RNA酶蛋白抑制剂或RNA酶)和/或通道蛋白、受体、膜蛋白、胞质蛋白、核内蛋白、结构蛋白、磷蛋白、激酶、信号蛋白、代谢蛋白、线粒体蛋白、受体相关蛋白、荧光蛋白、酶底物、转录因子、转运蛋白和/或将突变水解酶(例如融合蛋白)导向特定位置的靶向序列，例如十四烷基化序列、线粒体定位序列或核内定位序列。目标蛋白可融合至突变水解酶的N-末端或C-末端。在一个实施方案中，所述融合蛋白在突变水解酶的N-末端包含目标蛋白，而在突变水解酶的C-末端包含另一种蛋白，例如不同的蛋白。例如，目标蛋白可以为荧光蛋白或抗体。融合体中的蛋白任选由连接序列分隔，例如优选具有至少2个氨基酸残基的连接序列，例如具有13-17个氨基酸残基的连接序列。相比于各个体蛋白的功能，本发明融合蛋白中存在的连接序列未显著改变融合体中任一种蛋白的功能。因此，对于突变脱卤素酶和海肾(Renilla)荧光素酶的融合体，连接序列的存在未显著改变突变脱卤素酶和其底物所形成键的稳定性或荧光素酶的活性。对于融合体中蛋白的任何具体组合，可以使用各种连接序列。在一个实施方案中，所述连接序列为酶识别的序列，例如可裂解的序列。例如，连接序列可为由胱天蛋白酶识别的序列如DEVD(SEQ IDNO：64)，或为可光裂解的序列。

在一个实施方案中，所述融合蛋白可在突变水解酶的N-末端包含目的蛋白，并优选在突变水解酶的C-末端包含不同的目的蛋白。如本文所述，突变DhaA与GST(在N-末端)、Flag序列(在C-末端)和海肾荧光素酶(在N-末端或C-末端)的融合体对突变DhaA和包含官能团的野生型DhaA底物形成的键没有可检测的影响。而且，Flag序列和DhaA.H272F的融合体可通过链霉抗生物素蛋白-生物素-C₁₈H₃₂O₄-DhaA.H272F桥附着于固相支持体(SFlag-ELISA实验)。此外，海肾荧光素酶(R.Luc)和DhaA.H272F的融合体可附着于用包含官能团的野生型DhaA底物包被的Magnesil^TM颗粒上。另外，附着的含R.Luc融合体显示有酶活性。

示例性目的蛋白包括但不限于免疫原性蛋白、荧光蛋白、选择标记蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、核内蛋白、结构蛋白、RNA酶等酶、酶底物、受体蛋白、转运蛋白、转录因子、通道蛋白如离子通道蛋白、磷蛋白、激酶、信号蛋白、代谢蛋白、线粒体蛋白、受体相关蛋白、核酸结合蛋白、胞外基质蛋白、分泌蛋白、受体配体、血清蛋白或具有活性半胱氨酸的蛋白。

本发明还包括组合物和试剂盒，其包括含连接基团的水解酶底物、含一个或多个官能团并任选含连接基团的水解酶底物、具有一个或多个官能团的连接基团、没有一个或多个官能团并任选含连接基团的水解酶底物、连接基团或突变水解酶，或其任意组合。例如，本发明包括含本发明底物的固相支持体、含本发明底物的试剂盒、含本发明脱卤素酶编码载体的试剂盒或含本发明丝氨酸β-内酰胺酶编码载体的试剂盒。

本发明还提供含水解酶编码核酸序列的分离的核酸分子(多核苷酸)。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子包含为在至少一种选择宿主中表达而优化的核酸序列。优化序列包括密码子优化(即在一种生物中比在另一种生物(例如相关远的生物)中更经常使用的密码子)的序列，以及修饰以加入或修饰Kozak序列和/或内含子和/或去除不需要的序列(例如潜在的转录因子结合位点)。在一个实施方案中，所述多核苷酸包括编码脱卤素酶的核酸序列，该核酸序列为在选择的宿主细胞中表达进行了优化。在一个实施方案中，优化多核苷酸不再与对应的非优化序列杂交，例如在中等或高严格条件下不与非优化序列杂交。在另一个实施方案中，所述多核苷酸与对应的非优化序列的核酸序列一致性低于90％，例如低于80％，任选其编码多肽与非优化序列编码多肽的氨基酸序列一致性至少为80％，例如至少85％、90％或更高。本发明还提供构建物(例如表达盒)和包含分离核酸分子的载体以及含分离的核酸分子、构建物或载体的试剂盒。

本发明进一步提供表达本发明突变水解酶的方法。该方法包括将编码本发明突变水解酶的重组核酸分子导入宿主细胞中，以表达突变水解酶。在一个实施方案中，所述突变水解酶可分离自细胞。突变水解酶可瞬时或稳定表达、组成型表达或在组织特异性或药物调节启动子控制下表达等等。本发明还提供含编码本发明突变水解酶的重组核酸分子的分离宿主细胞。

在一个实施方案中，本发明提供检测或测定突变水解酶的存在或量的方法。该方法包括使突变水解酶与含一个或多个官能团的水解酶底物接触。相比于对应的野生型水解酶，所述突变水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致突变水解酶与底物形成的键比对应的野生型水解酶和底物形成的键更稳定，其中所述在突变水解酶中的至少一个氨基酸置换为在对应的野生型水解酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应的野生型水解酶和底物形成的键，或者所述置换为在对应的野生型水解酶中与底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换。检测或测定官能团的存在或量，由此检测或测定突变水解酶的存在或量。在一个实施方案中，所述突变水解酶在细胞中或在细胞表面上。在另一个实施方案中，所述突变水解酶在细胞裂解物中。

本发明还提供突变水解酶和包含一个或多个官能团的对应水解酶底物的使用方法，例如分离分子或检测或测定细胞中某些分子的存在或量、位置(例如胞内、亚细胞或胞外位置)或移动的方法。在一个实施方案中，提供分离样品中目标分子的方法。所述方法包括使具有融合蛋白的样品与含一个或多个官能团的水解酶底物接触，所述融合蛋白含突变水解酶和结合目标分子的蛋白。相比于对应的野生型水解酶，所述突变水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致突变水解酶与底物形成的键比对应的野生型水解酶和底物形成的键更稳定，其中所述在突变水解酶中的至少一个氨基酸置换为在对应的野生型水解酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应的野生型水解酶和底物形成的键，或者所述置换为在对应的野生型水解酶中与底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换。在一个实施方案中，至少一个官能团为固相支持体或结合固相支持体的分子。在一个实施方案中，所述样品含完整的细胞，而在另一个实施方案中，所述样品为细胞裂解物或亚细胞组分。然后分离目标分子。

例如，本发明包括分离目标蛋白的方法。该方法包括使含突变水解酶和目标蛋白的融合蛋白与含至少一个官能团的水解酶底物接触。相比于对应的野生型水解酶，所述突变水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致突变水解酶与底物形成的键比对应的野生型水解酶和底物形成的键更稳定，其中所述在突变水解酶中的至少一个氨基酸置换为在对应的野生型水解酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应的野生型水解酶和底物形成的键，或者所述置换为在对应的野生型水解酶中与底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换。在一个实施方案中，至少一个官能团为固相支持体或结合固相支持体的分子。然后分离目标蛋白。

在另一个实施方案中，本发明包括一种物质鉴定方法，所述物质改变目标蛋白与推测与目标蛋白相互作用的分子的相互作用。该方法包括使至少一种物质与推测与目标蛋白相互作用的分子、含突变水解酶和目标蛋白的融合蛋白以及含一个或多个官能团的水解酶底物接触。相比于对应的野生型水解酶，所述突变水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致突变水解酶与底物形成的键比对应的野生型水解酶和底物形成的键更稳定，其中所述在突变水解酶中的至少一个氨基酸置换为在对应的野生型水解酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应的野生型水解酶和底物形成的键，或者所述置换为在野生型水解酶中与底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换。在一个实施方案中，至少一个官能团为固相支持体或结合固相支持体的分子。然后测定所述物质是否改变目标蛋白与推测与目标蛋白相互作用的分子的相互作用。

而且，结合固相支持体的本发明底物或结合固相支持体的突变水解酶可用于生成蛋白阵列、细胞阵列、囊泡/细胞器阵列和细胞膜阵列。

本发明因此提供监测细胞中蛋白表达、定位和/或移动(运输)以及监测细胞中微环境变化的方法。在一个实施方案中，本发明突变水解酶和底物的应用使得可以对蛋白(例如离子通道)进行功能分析。在另一个实施方案中，两对突变水解酶/底物的应用使得可以进行多重同步检测以及基于FRET-或BRET的测定。例如，在催化三联体不同残基上具有置换的突变脱卤素酶可每个都优选结合本发明的某些底物，但其它酶或突变脱卤素酶不能结合，而可利用突变β-内酰胺酶及其各自的底物，因此允许多重检测。其它应用包括在固体底物上捕获突变水解酶与对应的本发明底物接触产生的稳定复合物，用于分析或工业目的(例如研究束缚酶的动力学参数、生成酶链/阵列、代谢工业组分等)，以检测蛋白-蛋白相互作用、测定不同化合物/药物对含目标蛋白和突变水解酶的融合蛋白与其它分子的相互作用的影响、分离或纯化结合与突变水解酶融合的目标蛋白的分子，或分离或纯化细胞、细胞器或其片段。例如，目标蛋白可与突变水解酶融合，然后通过官能团与存在于固相支持体上的接受基团的特异性相互作用连接至固相支持体，其中所述官能团为接受基团的配体，存在于本发明的底物中。这种底物可与融合蛋白接触，然后与固相支持体接触；可与固相支持体接触，然后与融合蛋白接触；或者同时与融合蛋白和固相支持体接触。这类系统可使获得的复合物用于检测或分离结合目标蛋白的分子。结合分子可以为蛋白，例如结合蛋白和官能团的融合体，所述官能团例如为GFP、萤光素酶、抗体(如缀合辣根过氧化物酶(HRP)的抗体)、碱性磷酸酶(AP)或荧光团。

为分离、分拣或纯化细胞，可在细胞外表面表达突变水解酶(例如通过与质膜蛋白融合)。为分离、纯化或分隔细胞器，在目标细胞器的胞质面上表达突变水解酶。在另一个实施方案中，为创造培养不同细胞的最佳平台，将突变水解酶与胞外基质组分或外膜蛋白融合，并束缚至三维细胞培养物或平台用于组织工程。作为实例，可在所述平台上培养初级神经元或胚胎干细胞，以形成饲养层。

其它应用包括检测或标记细胞。因此，使用本发明突变水解酶和对应的底物可检测细胞，例如检测植入或注射入动物后的体外或体内细胞迁移(例如血管生成/趋化性测定、植入神经元的迁移、植入/注射入动物中的正常、恶性或重组修饰细胞的迁移，等等)，以及活细胞造影后的免疫细胞化学。在另一个实施方案中，本发明提供标记新合成蛋白的方法。例如，含本发明突变水解酶或其融合体表达载体的细胞与没有官能团的水解酶底物接触。然后使细胞与基因表达诱导剂等物质以及含一个或多个官能团的水解酶底物接触。然后检测或测定突变水解酶或其融合体的存在、量或位置。突变水解酶或其融合体的存在、量或位置是由于新合成的突变水解酶或其融合体。或者，含本发明突变水解酶或其融合体表达载体的细胞与具有官能团(例如绿色荧光团)的水解酶底物接触，然后与具有不同官能团(例如红色荧光团)的物质和底物接触。在一个实施方案中，所述突变水解酶与膜定位信号融合，所以可用于监测膜中或膜附近的事件。

因此，本发明提供一种标记细胞的方法。该方法包括使含突变水解酶的细胞与含一个或多个官能团的水解酶底物接触。相比于对应的野生型水解酶，突变水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致突变水解酶与底物形成的键比对应的野生型水解酶和底物形成的键更稳定，其中所述在突变水解酶中的至少一个氨基酸置换为在对应的野生型水解酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应的野生型水解酶和底物形成的键，或者所述置换为在野生型水解酶中与底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换。然后检测或测定官能团的存在或量。

使用表达选择标记蛋白(例如编码新霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性的蛋白质)的细胞稳定转化具外源DNA的细胞。期望观测哪些细胞含选择标记蛋白以及荧光标记分子。例如，优选可用荧光分子标记选择标记蛋白，将其由外部加入到活细胞中。利用此方法，选择标记蛋白仅在需要时通过加入荧光团成为可见的，随后当选择标记蛋白通过细胞代谢自然再生时荧光消失。因此，在一个实施方案中，本发明提供标记表达选择标记蛋白的细胞的方法。该方法包括提供含表达盒的细胞，该表达盒含编码融合蛋白的核酸序列。融合蛋白含一种选择标记蛋白(例如赋予至少一种抗生素抗性的蛋白)和另一种能够稳定和任选不可逆结合底物或其部分的蛋白，所述底物或其部分包含光学可检测分子。例如，所述蛋白可为将烷基和光学可检测分子由底物不可逆转移至其自身的烷基转移酶，由此标记烷基转移酶，例如O⁶-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶等烷基转移酶。用于本发明该实施方案的示例性蛋白包括但不限于烷基转移酶、肽基甘氨酸-α-酰胺化单加氧酶、I型拓扑异构酶、水解酶如丝氨酸和环氧化物水解酶以及本文描述的突变水解酶、氨基转移酶、细胞色素P450单加氧酶、酰基转移酶、脱羧酶、氧化酶如单胺氧化酶、还原酶如核糖核苷酸还原酶、合成酶如环ADP核糖合成酶或胸苷酸合成酶、脱氢酶如醛脱氢酶、合酶如一氧化氮合酶(NOS)、内酰胺酶、胱硫醚γ-裂合酶、肽酶如羧肽酶A、芳香化酶、蛋白酶如丝氨酸蛋白酶、木聚糖酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶和脱甲基酶以及其它蛋白，包括与一种或多种底物形成不可逆或其它稳定键的野生型蛋白，例如能够机制型失活的酶。因此，在此实施方案中，稳定键，即底物和野生型酶或突变酶形成的键，其t_1/2至少为30分钟，优选至少4小时，直到至少10小时，并抗清洗、蛋白变性和/或高温的破坏，例如该键对在SDS中煮沸稳定。

表达融合蛋白的细胞与底物接触，以便标记细胞。在一个实施方案中，所述细胞固定后接触底物。在另一个实施方案中，所述底物和固定剂同时与细胞接触。在再另一个实施方案中，在细胞与底物接触后将固定剂加入到细胞中。在一个实施方案中，融合蛋白与底物形成酯键。在另一个实施方案中，融合蛋白与底物形成硫酯键。本发明还提供编码融合蛋白的融合基因以及表达融合蛋白的细胞。

当对细胞进行图象分析时，期望用通常保持细胞结构大多数特征的防腐剂(固定剂)如多聚甲醛、丙酮或甲醇固定细胞。然后经常通过加入荧光染色剂或荧光标记抗体分析这些固定细胞，以揭示细胞中的特定结构。另一个荧光标记细胞的方法是在固定化前在细胞中表达荧光蛋白如GFP。不幸的是，这些蛋白的有效荧光依赖于可被防腐剂破坏的蛋白结构，因此降低了这些细胞中成象的有效性。

因此，本发明提供用官能团如荧光团标记细胞的方法。该方法包括提供表达本发明突变水解酶或其融合体的细胞，使细胞与包含至少一个官能团的水解酶底物接触。在一个实施方案中，所述细胞固定后接触底物。在另一个实施方案中，底物和固定剂同时与细胞接触。在再另一个实施方案中，在细胞与底物接触后将固定剂加入到细胞中。然后检测或测定细胞中突变水解酶或其融合体存在或定位。在一个实施方案中，突变水解酶与底物形成酯键，而在另一个实施方案中，突变水解酶与底物形成硫酯键。

本发明还提供本文公开的用于制备本发明化合物、组合物、核酸、蛋白或其它物质的方法和中间体。

                      附图简述

图1是紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶的催化三联体与卤代烷底物反应的示意图。

图2显示了野生型DhaA紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶和4种突变DhaA(H283Q、G、A或F)的三维模型。青色带是基于该蛋白晶体结构的DhaA.WT 3-D模型(Newman等，1999)(图A)。紫色带为H272Q、H272H和H272A突变体的3-D模型(图2A)或H272F突变体的3-D模型(图2B)。通过计算分子概率密度函数生成三维模型，接着进行几步包括约束模拟退火分子动力学(MD)方法的优化。在使用软件InsightII(USA)的Silicon Graphics计算机工作站上进行3-D建模。

图3显示了野生型和突变DhaA蛋白的纯化。发现GST-DhaA.WT-Flag(奇数泳道)和GST-DhaA.H272F-Flag(偶数泳道)融合蛋白是可溶的，并在GSS-Sepharose 4FF上有效纯化(泳道3和4：粗大肠杆菌上清液；泳道5和6：清洗液；泳道7-10：纯化蛋白)。用Xa因子处理融合蛋白导致形成两种蛋白：GST和DhaA(野生型或突变型；分别为泳道11和12)。而且，在GSS-Sepharose 4FF上有效去除GST(野生型或突变型；分别为泳道13和14)。所有蛋白都具有预计的分子量。

图4图示野生型DhaA和突变DhaA对1-Cl-丁烷的水解。

图5显示了用各种浓度的(NH₄)₂SO₄沉淀DhaA.WT和DhaA.H272F/A/G/Q突变体。泳道1、5和9：0％(NH₄)₂SO₄；泳道2、6和10：10％(NH₄)₂SO₄；泳道3、7和11：10-45％(NH₄)₂SO₄；泳道4、8和12：45-70％(NH₄)₂SO₄。图A：泳道1-4，DhaA.WT；泳道5-8，DhaA.H272G；和泳道9-12，DhaA.H272Q。图B：泳道1-4，DhaA.WT；泳道5-8，DhaA.H272F；和泳道9-12，DhaA.H272A。

图6描述了野生型DhaA的底物特异性。使用基于酚红的测定(E₅₅₈)，在加入酶后的首个60秒以4次15秒读数测定反应初速度。

图7显示了包含官能团(例如5-(和6-)-羧基荧光素(FAM)、Anth(蒽)或生物素)和连接基团的DhaA底物。

图8A显示了野生型DhaA水解FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl的产物的HPLC分离。

图8B显示了野生型DhaA水解FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl随时间变化产生的产物(以底物百分比表示)的HPLC分析。

图9显示了野生型DhaA(图A中的泳道1、3和5以及图B中的泳道1-8)和突变DhaA(DhaA.H272F)(图A中的泳道2、4和6以及图B中的泳道9-14)与TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl(图A中的泳道1和2)、ROX-C₁₄H₂₄O₄-Cl(图A中的泳道3和4)、FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl(图A中的泳道5和6)或生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl(图B)结合的SDS-PAGE分析。图B中生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl的浓度为：0μM(泳道1和8)、125μM(泳道2和9)、25μM(泳道3和10)、5μM(泳道4和11)、1μM(泳道5和12)、0.2μM(泳道6和13)和0.04μM(泳道7和14)。

图10图示用底物生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl预处理突变DhaA阻断与另一种底物的结合。DhaA.WT：泳道1和2；DhaA.H272突变体：F，泳道3和4；G，泳道5和6；A，泳道7和8；Q，泳道9和10。样品2、4、6、8和10用生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl预处理。

图11显示了酶底物复合物的MALDI-TOF分析、与FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl温育的GST-DhaA.WT或GST-DhaA.H272F的质谱。

图12显示了在残基106具有置换的DhaA突变体和在残基106和272具有置换的DhaA突变体与TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl结合特性的SDS-PAGE分析。将2μg蛋白和25μM TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl的32μl溶液于室温温育1小时。将10μl的各反应物加至每个泳道。泳道1：DhaA.D106C；泳道2：DhaA.D106C：H272F；泳道3：DhaA.D106E；泳道4：DhaA.D106E：H272F；泳道5：DhaA.D106Q；泳道6：DhaA.D106Q：H272F；泳道7：DhaA.WT和泳道8：DhaA.H272F。用570nm滤光片对凝胶成像。

图13图示了含荧光素酶和突变DhaA融合体的样品中海肾荧光素酶活性分析，所述融合体束缚至固相支持体(链霉抗生物素蛋白包被平板)。使用DhaA底物(即生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl)实现对融合体的捕获。在具有海肾荧光素酶和野生型DhaA融合体的组分中未测到活性。

图14显示了用生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl(图A)或TAMRA-C₁₂H₂₄O₄-Cl(图B)体内处理的大肠杆菌两倍连续稀释液的SDS-PAGE分析，所述大肠杆菌表达野生型DhaA(DhaA.WT-Flag，各图的泳道1-4)或突变DhaA.H272F(DhaA.H272F-Flag，各图的泳道5-7)。箭头标示蛋白的M_r(相对分子质量)对应于DhaA-Flag的M_r。

图15显示了TAMRA-C₁₂H₂₄O₄-Cl与真核细胞蛋白的体内结合。用TAMRA-C₁₂H₂₄O₄-Cl处理表达DhaA.WT-Flag(泳道1-4)或DhaA.H272F-Flag(泳道5-8)的CHO-K1细胞其蛋白的两倍连续稀释液。箭头标示蛋白的Mr对应于DhaA-Flag的Mr。

图16图示了TAMRA-C₁₂H₂₄O₄-Cl对CHO-K1细胞的透过性。用TAMRA-C₁₂H₂₈O₄-Cl(25μM，37℃，5分钟)处理CHO-K1细胞(A，亮视野图象)，并用PBS快速清洗(图B)。图C显示了清洗步骤后的细胞。

图17显示了GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag或GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag转染细胞的图像。用GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag(图A-C)或GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag(图D-F)编码DNA转染CHO-K1细胞，并用TAMRA-C₁₂H₂₈O₄-Cl处理。图A、D：亮视野；图B、E：GFP滤光片单元；和图C、F：TAMRA滤光片单元。

图18显示了GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag(泳道1-4)或GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag(泳道5-8)转染细胞其蛋白的蛋白质印迹分析。用GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag或GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag转染CHO-K1细胞，然后用TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl(25μM)处理0、5、15或60分钟，用PBS(4×1.0ml)清洗，并用SDS-样品缓冲液收集。用SDS-PAGE分离样品，用荧光成像仪分析。泳道1-4，GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag，分别处理0、5、15或60分钟。泳道5-8，GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag，分别处理0、5、15、60分钟。箭头标示蛋白的M_r对应于GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag的M_r。

图19图示了选择的CHO-K1细胞底物(图A，TAMRA和图B，ROX)的毒性。

图20图示了丝氨酸β-内酰胺酶的反应流程。反应以形成共价前遭遇络合物(precovalent encounter complex)开始(图19A)，经高能酰化四面体中间体(图20B)形成瞬时稳定酰化酶中间体，通过催化残基Ser70形成酯(图19C)。随后，酰化酶受到水解水攻击(图19D)，形成高能脱酰化中间体(图19E)(Minasov等，2002)，其崩溃形成水解产物(图20F)。然后排出产物，再生游离酶。

图21显示了GST-blaZ水解FAP随时间的变化。

图22显示了BOCELLIN与GST和blaZ.E166D、blaZ.N170Q或blaZ.E166D：N170Q的融合体的结合。泳道1：染料/无blaZ；泳道2：blaZ.WT；泳道3：blaZ.E166D；泳道4：blaZ.N170Q；和泳道5：blaZ.E166D：N170Q。

图23显示了CCF2与GST和blaZ.E166D、blaZ.N170Q或blaZ.E166D：N170Q的融合体的结合。泳道1：染料/无blaZ；泳道2：GST-blaZ.WT；泳道3：GST-blaZ.E166D；泳道4：GST-blaZ.N170Q和泳道5：GST-blaZ.E166D：N170Q。

图24提供了用GFP-连接基团-DhaA.H272F-NLS3编码构建物转染并用TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl染色的活CHO-K1细胞的荧光和DIC图像。TAMRA滤光片：顶部左侧；GFP滤光片：顶部右侧；“A”和“B”重叠：底部左侧；图像“C”和细胞DIC图像的重叠：底部右侧。NLS3＝SV40T抗原核定位序列的串联重复。

图25显示了用GFP-β-抑制蛋白2编码构建物转染的活CHO-K1细胞荧光图像(左侧)和用DhaA.H272F-β-抑制蛋白2编码构建物(右侧)转染并用TAMRA-C₁₄H₂₄O₄染色的活CHO-K1细胞荧光图像。

图26显示了在大肠杆菌中表达的DhaA的SDS-PAGE分析。泳道1：分子量标准；2：野生型DhaA粗裂解物；3：野生型DhaA无细胞裂解物；4：DhaA.H272F粗裂解物；5：DhaA.H272F无细胞裂解物；6：载体对照粗裂解物；7：载体对照无细胞裂解物；8：DhaA.E130Q C1突变体粗裂解物；9：DhaA.E130Q C1突变体无细胞裂解物；10：DhaA.E130L A5突变体粗裂解物；11：DhaA.E130L A5突变体无细胞裂解物；12：DhaA.E130A A12突变体粗裂解物；13：DhaA.E130A A12突变体无细胞裂解物；14：分子量标准。箭头表示DhaA蛋白的位置。-s：离心前的裂解物；+s：离心后的裂解物。

图27显示了含DhaA裂解物的免疫印迹分析。泳道1：野生型DhaA粗裂解物；2：野生型DhaA无细胞裂解物；3：DhaA.H272F粗裂解物；4：DhaA.H272F无细胞裂解物；5：载体对照粗裂解物；6：载体对照无细胞裂解物；7：分子量标准；8：DhaA.E130Q C1突变体粗裂解物；9：DhaA.E130Q C1突变体无细胞裂解物；10：DhaA.E130L A5突变体粗裂解物；11：DhaA.E130L A5突变体无细胞裂解物；12：DhaA.E130A A12突变体粗裂解物；13：DhaA.E130AA12突变体无细胞裂解物；14：分子量标准。箭头表示DhaA蛋白的位置。

图28提供了体外共价烷基-酶形成的荧光成像分析。泳道1：荧光分子量标准；2：DhaA野生型；3：DhaA.H272F突变体；4：DhaA-(仅作为对照的载体)；5：DhaA.E130Q突变体；6：DhaA.E130L突变体；7：DhaA.E130A突变体。箭头指示荧光酶-烷基共价中间体的位置。

图29提供了全细胞中共价烷基-酶形成的荧光成像分析。泳道1：荧光分子量标准；2：DhaA野生型；3：DhaA.H272F突变体；4：DhaA-(仅作为对照的载体)；5：DhaA.E130Q突变体；6：DhaA.E130L突变体；7：DhaA.E130A突变体；8：荧光分子量标准。箭头指示荧光酶-烷基共价中间体的位置。

图30A-B显示了链霉抗生物素蛋白(SA)包被珠上捕获的DhaA-Flag的蛋白质印迹分析。用(A)或不用(B)生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl(25μM、0.1％DMSO、60分钟、37℃)处理瞬时表达DhaA.H272F-Flag的CHO-K1细胞。洗去过量的生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl，裂解细胞，将10μl细胞裂解物与5μl SA包被珠(Pierce)于室温(RT)温育60分钟。在SDS-PAGE上分离细胞裂解物(泳道1)、未结合珠的蛋白(泳道2)和结合珠的蛋白(泳道3)，将其转移至硝酸纤维素膜，用抗-Flag抗体(Sigma)探测。

图30C-D图示了SA包被珠上捕获的hR.Luc-DhaA的分析。用或不用生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl(25μM、0.1％DMSO、60分钟、37℃)处理瞬时表达hR.Luc-连接基团-DhaA.H272F-Flag的CHO-K1细胞。裂解细胞，将10μl细胞裂解物与5μl SA包被珠(Pierce)于室温温育60分钟。洗去未结合的物质，使用Promega的“海肾荧光素酶测定系统”(C)测定hR.Luc活性或通过蛋白质印迹(D)分析捕获的hR.Luc。C)柱1：用生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl处理细胞，洗去过量的生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl；柱2：未处理的细胞；柱3：用生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl处理但没有洗去过量生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl的细胞。D)在SDS-PAGE上分离细胞裂解物(泳道1)、未结合珠的蛋白(泳道2)和结合珠的蛋白(泳道3)，将其转移至硝酸纤维素膜，用抗-R.Luc抗体(Chemicon)探测。

                      发明详述

定义

“亲核体”是提供电子的分子。

“选择标记蛋白”编码的酶活性赋予细胞在没有否则是必需营养素的物质的培养基中生长的能力(例如酵母细胞中的TRP1基因)，或在具有抗生素或其它药物的培养基中生长的能力，即在细胞中表达选择标记蛋白编码基因相比于对应的没有该基因的细胞，赋予该细胞对抗生素或药物的抗性。当宿主细胞必须表达选择标记以在选择性培养基中生长时，所述标记称为正选择标记(例如赋予在适当抗生素存在下生长能力的抗生素抗性基因)。选择标记还可用于反选含特定基因的宿主细胞(例如sacB基因，如果其表达，将杀死在含5％蔗糖的培养基中生长的细菌宿主细胞)；以此方式应用的选择标记称为负选择标记或反-选择标记。常用的选择标记基因序列包括抗生素抗性序列，所述抗生素例如为氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、嘌呤霉素、博来霉素、链霉素、潮霉素、新霉素、Zeocin^TM等。选择性营养缺陷型基因序列包括例如在组氨醇存在下允许在无组氨酸培养基中生长的hisD。合适的选择标记基因包括博来霉素抗性基因、金属硫蛋白基因、潮霉素B-磷酸转移酶基因、AURI基因、腺苷脱氨酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因等。

本文使用的“核酸”是共价连接的核苷酸序列，其中一个核苷酸戊糖的3′位通过磷酸二酯基团与下一个核苷酸戊糖的5′位相接，其中核苷酸残基(碱基)以特定的顺序连接，即核苷酸的线性顺序。本文使用的“多核苷酸”是序列长度超过约100个核苷酸的核酸。本文使用的“寡核苷酸”或“引物”是短多核苷酸或多核苷酸的一部分。本文使用的术语“寡核苷酸”或“寡”定义为含2个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于3个、通常超过10个但少于250个、优选少于200个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。所述寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、扩增如聚合酶链反应(PCR)、逆转录(RT)或其组合。“引物”是指在置于启动引物延伸的条件下能够作为核酸合成起点的寡核苷酸。选择引物以在其3′末端具有与靶序列(模板)的特定序列大致互补的区域。为使引物延伸，引物必须互补得足以和靶序列杂交。引物序列不需要反映出靶序列的确切序列。例如，可将非互补的核苷酸片段连接至引物的5′末端，引物序列的剩余部分与靶序列大致互补。可将非互补碱基或长序列散布在引物中，前提是引物序列与靶序列的互补性足够杂交，由此形成复合物用于合成引物的延伸产物。与基因序列匹配或互补的引物可用于扩增反应、RT-PCT等。

一般认为核酸分子具有“5′-末端”和“3′-末端”，因为核酸磷酸二酯键出现在取代单核苷酸戊糖环的5′碳和3′碳上。新键在此应连至5′碳的多核苷酸末端为其5′末端核苷酸。新键在此应连至3′碳的多核苷酸末端为其3′末端核苷酸。本文使用的末端核苷酸为3′-或5′-末端终点位置的核苷酸。

一般认为DNA分子具有“5′末端”和“3′末端”，因为单核苷酸以下述方式反应生成寡核苷酸：一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸通过磷酸二酯键以一个方向连接至其相邻核苷酸的3′氧。因此，如果寡核苷酸末端的5′磷酸未连接至单核苷酸戊糖环的3′氧，则称其为“5′末端”，同样，如果寡核苷酸末端的3′氧未连接至后一单核苷酸戊糖环的5′磷酸，则称其为“3′末端”。

本文使用的核酸序列即使内部达到较大的寡核苷酸或多核苷酸，也可以认为具有5′和3′末端。在线性或环状DNA分子中，不连续元件称为“下游”或3′元件的“上游”或5′。该术语反映出转录沿着DNA链以5′至3′方式进行的事实。通常，控制连锁基因(例如可读框或编码区)转录的启动子和增强子元件一般位于编码区的5′或上游。但是，增强子元件甚至在位于启动子元件和编码区的3′时也可发挥其作用。转录终止和多腺苷酸化信号位于编码区的3′或下游。

本文使用的术语“密码子”是基本遗传编码单位，由三个核苷酸序列组成，指定掺入多肽链的具体氨基酸或起始或终止信号。术语“编码区”当用于结构基因时指核苷酸序列，其编码存在于mRNA分子翻译所得初生多肽中的氨基酸。通常，编码区以编码起始密码子甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”界定5′侧，以终止密码子(例如TAA、TAG、TGA)界定3′侧。在某些情况下，已知编码区还由核苷酸三联体“TTG”开始。

本文使用的术语“分离的和/或纯化的”是指核酸分子、多肽、肽或蛋白的体外制备、分离和/或纯化，使其与体内物质无关。因此，术语“分离的”当用于核酸时，同“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”一样，指鉴定并与在其来源中与其通常关联的至少一种污染物分离的核酸序列。分离的核酸以不同于其天然存在的形式或状态存在。相反，非分离核酸(例如DNA和RNA)被发现为其天然存在的状态。例如，给定的DNA序列(例如基因)发现于宿主细胞染色体上接近于邻近基因的位置；RNA序列(例如编码具体蛋白的具体mRNA序列)作为和编码多种蛋白的众多其它mRNA一起的混合物发现于细胞中。因此，关于“分离的核酸分子”，其包括基因组多核苷酸、cDNA或合成起点或其某些组合，“分离的核酸分子”(1)与“分离的核酸分子”天然发现于其中的多核苷酸的全部或部分无关，(2)有效连接至天然不与其连接的多核苷酸，或(3)不以较大序列的部分天然存在。分离的核酸分子可以单链或双链形式存在。当核酸分子用于表达蛋白时，核酸分子最低要含有义或编码链(即可为单链的核酸)，但可同时含有义和反义链(即可为双链的核酸)。

本文使用的术语“野生型”是指具有分离自天然来源的该基因或基因产物特征的基因或基因产物。野生型基因最常见于群体中，因此人为地命名为“野生型”基因。相反，术语“突变体”是指与野生型基因或基因产物相比，表现出序列和/或功能特性改变(即改变的特征)的基因或基因产物。要注意的是，可分离天然存在的突变体；通过与野生型基因或基因产物相比它们具有改变特征的事实对其进行鉴别。

术语“重组DNA分子”是指含至少两个通常天然不一起发现的核苷酸序列的杂种DNA序列。术语“载体”用于指DNA片段可插入或克隆入其中的核酸分子，其可用于将DNA节段转移入细胞中，并能够在细胞中复制。载体可来源于质粒、噬菌体、病毒、粘粒等。

本文使用的术语“重组载体”、“表达载体”或“构建物”是指DNA或RNA序列，其含所需编码序列，以及在具体宿主生物中表达有效连接的编码序列所必须的合适DNA或RNA序列。原核表达载体包括启动子、核糖体结合位点、在宿主细胞中自主复制的复制起点和可能的其它序列，例如任选的操纵子序列、任选的限制酶位点。启动子定义为指导RNA聚合酶结合DNA和启动RNA合成的DNA序列，真核表达载体包括启动子、任选的聚腺苷酸化信号和任选的增强子序列。

具有“编码肽、蛋白或多肽”的核苷酸序列的多核苷酸是指含基因编码区的核酸序列或其片段，所述片断编码的基因产物与对应的全长肽、蛋白或多肽相比具有大致相同的活性。编码区可以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸可为单链(即有义链)或双链。如果需要使转录正确启动和/或初级RNA转录物正确加工，可将合适的控制元件如增强子/启动子、剪接点、聚腺苷酸化信号等置于接近基因编码区的位置。或者，用于本发明表达载体的编码区可包含内源增强子/启动子、剪接点、间插序列、聚腺苷酸化信号等。在再一个实施方案中，所述编码区可包含内源和外源控制元件的组合。

术语“转录调节元件”或“转录调节序列”是指控制核酸序列表达的某些方面的遗传元件或序列。例如，启动子是促进有效连接的编码区转录开始的调节元件。其它的调节元件包括但不限于转录因子结合位点、剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止信号和增强子元件。

真核细胞中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用的短列DNA序列组成。已从各种真核细胞来源中分离出启动子和增强子元件，包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞基因。还从病毒中分离出启动子和增强子元件，而类似的控制元件如启动子也存在于原核细胞中。具体启动子和增强子的选择取决于用于表达目标蛋白的细胞类型。某些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而另一些则在有限的细胞亚类中有功能。例如，SV40早期基因增强子在许多哺乳动物物种的众多细胞类型中非常有效，并广泛用于在哺乳动物细胞中表达蛋白。在大范围哺乳动物细胞类型中有效的两个其它启动子/增强子元件实例是来自人延伸因子1基因(Uetsuki等，1989；Kim等，1990；和Mizushima和Nagata，1990)和劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(Gorman等，1982)以及人巨细胞病毒(Boshart等，1985)的启动子/增强子元件。

术语“启动子/增强子”表示含能够同时提供启动子和增强子功能(即由上述的启动子元件和增强子元件提供的功能)的序列的DNA节段。例如，逆转录病毒的长末端重复序列同时具有启动子和增强子功能。启动子/增强子可为“内源”或“外源”或“异源”。“内源”启动子/增强子与基因组中的给定基因天然连接。“外源”或“异源”启动子/增强子通过遗传操作方法(即分子生物学技术)与基因并列放置，以使基因转录受控于连接的启动子/增强子。

表达载体上存在“剪接信号”经常使真核宿主细胞中的重组转录物高水平表达。剪接信号介导由初级RNA转录物中去除内含子，由剪接供体和接受位点组成(Sambrook等，1989)。常用的剪接供体和接受位点是SV40 16S RNA的剪接点。

重组DNA序列在真核细胞中有效表达需要控制所获转录物有效终止和聚腺苷酸化的信号表达。转录终止信号一般发现于聚腺苷酸化信号下游，长度为数百个核苷酸。本文使用的术语“聚腺苷酸化位点”或“聚腺苷酸化信号”表示同时控制新生RNA转录物终止和聚腺苷酸化的DNA序列。期望重组转录物有效聚腺苷酸化，因为没有聚腺苷酸尾的转录物不稳定且快速降解。用于表达载体的聚腺苷酸化信号可为“异源”或“内源”。内源聚腺苷酸化信号天然存在于基因组中给定基因编码区的3′末端。异源聚腺苷酸化信号分离自一个基因并定位于另一基因的3′。常用的异源聚腺苷酸化信号是SV40聚腺苷酸化信号。SV40聚腺苷酸化信号包含在237bp的BamHI/BclI限制性片段中，同时控制终止和聚腺苷酸化(Sambrook等，1989)。

真核表达载体也可以含有“病毒复制子”或“病毒复制起点”。病毒复制子是允许载体在表达合适复制因子的宿主细胞中染色体外复制的病毒DNA序列。含SV40或多瘤病毒复制起点的载体在表达合适病毒T抗原的细胞中以高拷贝数(高达10⁴拷贝/细胞)复制。相反，含牛乳头瘤病毒或EB病毒复制子的载体以低拷贝数(约100拷贝/细胞)在染色体外复制。

术语“体外”是指人工环境和人工环境中发生的过程或反应。体外环境包括但不限于试管和细胞裂解物。术语“原位”指细胞培养物。术语“体内”指天然环境(例如动物或细胞)和天然环境中发生的过程或反应。

术语“表达系统”指任何测定(例如检测)目的基因表达的试验或系统。分子生物学领域的技术人员应当理解，可使用各种表达系统中的任一种。大范围的合适哺乳动物细胞可得自广泛来源(例如美国典型培养物保藏中心，Rockland，MD)。转化或转染方法和表达载体的选择取决于选择的宿主系统。转化或转染方法描述于例如Sambrook等，1989。表达系统包括体外基因表达测定，在该测定中目的基因(例如报告基因)连接至调节序列，在用抑制或诱导基因表达的物质处理后监测基因表达。可通过任何合适的方法检测基因表达，这些方法包括但不限于检测表达的mRNA或蛋白(例如可检测的报告基因产物)，或者通过目标基因表达细胞表型的可检测变化检测基因表达。表达系统还可以包含检测裂解事件或其它核酸或细胞变化的测定。

术语“基因”指DNA序列，其含有由该DNA序列生产多肽必须的编码序列和任选的控制序列。所述多肽可由全长编码序列或任何部分编码序列编码，只要所述部分编码的基因产物和全长多肽具有大致相同的活性。

已知核酸包含不同类型的突变。“点”突变是指在核苷酸序列中单个碱基位置上对野生型序列的改变。突变还可以指一个或多个碱基的插入或缺失，以使核酸序列不同于参照序列，例如野生型序列。

本文使用的术语“杂交”是指互补序列与靶核酸的退火，即两种含互补序列的核酸多聚物(多核苷酸)通过碱基配对退火的能力。术语“退火”和“杂交”在全文中可互换使用，包括互补序列和靶核酸之间的任何特异性、可重复的相互作用，包括仅具部分互补性的区域结合。本发明的核酸可包含某些通常不存在于天然核酸中的碱基，包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。核酸技术领域的技术人员可根据经验考虑一系列变量确定双链体的稳定性，这些变量包括例如互补序列长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率。核酸双链体的稳定性可通过解链温度或“T_m”检测。在具体条件下具体核酸双链体的T_m是平均一半的碱基对解离的温度。

术语“严格性”用于指温度、离子强度和存在其它化合物的条件，在该条件下进行核酸杂交。在“高严格性”条件下，核酸碱基配对仅在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间发生。因此，想让互相之间不完全互补的核酸一起杂交或退火，经常要求“中”和“低”严格条件。本领域周知可使用众多等同条件以构成中或低严格条件。杂交条件的选择对本领域技术人员来说一般是显而易见的，通常以杂交目的、杂交类型(DNA-DNA或DNA-RNA)、序列之间期望的相关性水平为指引(例如Sambrook等，1989；Nucleic AcidHybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington D.C.，1985对所述方法的一般性论述)。

已知核酸双链体的稳定性随着错配碱基数的增加而降低，此外，降低程度的大或小取决于在杂种双链体中错配的相对位置。因此，杂交严格性可用于最大化或最小化此类双链体的稳定性。可通过调节杂交温度、调节杂交混合物中螺旋去稳定物质(例如甲酰胺)的百分比以及调节漂洗溶液的温度和/或盐浓度改变杂交严格性。对于滤膜杂交，经常以用于杂交后漂洗的盐浓度和/或温度确定最终的杂交严格性。

“高严格条件”当用于指核酸杂交时，包括等同于以下的条件：当使用的探针长度为约500个核苷酸时，在由5×SSPE(43.8g/lNaCl、6.9g/l NaH₂PO₄ H₂O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中于42℃结合或杂交，接着用含0.1×SSPE、1.0％SDS的溶液于42℃漂洗。

“中严格条件”当用于指核酸杂交时，包括等同于以下的条件：当使用的探针长度为约500个核苷酸时，在由5×SSPE(43.8g/lNaCl、6.9g/l NaH₂PO₄ H₂O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中于42℃结合或杂交，接着用含1.0×SSPE、1.0％SDS的溶液于42℃漂洗。

“低严格条件”包括等同于以下的条件：当使用的探针长度为约500个核苷酸时，在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH₂PO₄H₂O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.1％SDS、5×Denhardt试剂[50×Denhardt每500ml含：5g Ficoll(400型，Pharmacia)、5g BSA(Fraction V；Sigma)]和100g/ml变性鲑精DNA组成的溶液中于42℃结合或杂交，接着用含5×SSPE、0.1％SDS的溶液于42℃漂洗。

“肽”、“蛋白”和“多肽”是指任意氨基酸链，与长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)无关。除非另有说明，否则所述术语可互换使用。本发明的核酸分子编码天然(野生型)蛋白或其片段的变异体(突变体)，所述片断与全长突变蛋白具有大致相同活性。优选这种突变蛋白的氨基酸序列与对应野生型蛋白氨基酸序列的一致性至少85％，优选90％，最优选95％或99％。

一般认为多肽分子具有“氨基末端”(N-末端)和“羧基末端”(C-末端)，因为在第一个氨基酸残基的氨基骨架和第二个氨基酸残基的羧基骨架之间存在肽键。术语“N-末端”和“C-末端”用于多肽序列时分别指包括多肽N-末端和C-末端区域部分的多肽区域。包括多肽N-末端区域部分的序列包括主要来自多肽链N-末端一半的氨基酸，但不限于这种序列。例如，N-末端序列可包括多肽序列内部部分，包括多肽N-末端和C-末端一半的碱基。这同样也适用于C-末端区域。N-末端和C-末端区域可以但不是必须包括分别确定多肽的N-末端和C-末端的氨基酸。

术语“分离的”当用于指多肽时，同“分离的蛋白”或“分离的多肽”一样，是指鉴定并与在其来源中通常与其关联的至少一种污染物分离。因此，分离的多肽(1)与天然发现的蛋白无关，(2)无相同来源的其它蛋白，例如无人类蛋白；(3)由不同物种的细胞表达；或(4)天然不存在。相反，非分离多肽(例如蛋白和酶)以其天然存在的状态发现。术语“分离的多肽”、“分离的肽”或“分离的蛋白”包括由cDNA或重组RNA(包括合成来源)或其某些组合编码的多肽、肽或蛋白。

本文使用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”指由重组DNA分子表达的蛋白分子。相反，本文使用的术语“天然蛋白质”表示分离自天然(例如非重组)来源的蛋白质。可使用分子生物学技术生产重组形式的蛋白，其与天然形式的该蛋白相比具有相同特性。

本文使用的术语“融合多肽”是指含与不同蛋白(例如突变水解酶)相连的目标蛋白(例如荧光素酶、亲和标记或靶向序列)的嵌合蛋白。

本文使用的术语“抗体”是指具有基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽的蛋白。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，它们再分别确定免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

已知基本的免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。每种四聚体都由两对等同的多肽链组成，每对都具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N-末端确定了约100-110或更多氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

抗体可作为完整的免疫球蛋白存在，或者以各种修饰形式存在，包括FabFc₂、Fab、Fv、Fd、(Fab′)₂、例如仅含轻链和重链可变区的Fv片段；含可变区和部分恒定区的Fab或(Fab′)₂片段；单链抗体，例如scFv、CDR-嫁接抗体等。Fv的重链和轻链可得自相同或不同的抗体，由此产生嵌合Fv区。抗体可以为动物(尤其是小鼠或大鼠)或人类来源，或者可以为嵌合或人源化的。本文使用的术语“抗体”包括这些不同形式。

本文使用的术语“细胞”、“细胞系”、“宿主细胞”可互换使用，所有这种名称都包括这些名称的后代或潜在后代。“转化细胞”指已将本发明的核酸分子导入其中(或其祖先中)的细胞。任选可将本发明核酸分子导入合适细胞系中，以产生能够生产所述核酸分子编码蛋白或多肽的稳定转染细胞系。载体、细胞和构建这些细胞系的方法在本领域众所周知。术语“转化体”或“转化细胞”包括衍生自原始转化细胞的初级转化细胞，而不考虑传代数。所有后代在DNA含量方面可能不完全相同，原因是有意或无意的突变。尽管如此，但由原始转化细胞中筛选的具有相同功能的突变后代也包含在转化体定义中。

术语“同源性”是指互补程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即一致性)。同源性经常使用序列分析软件(例如威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机工作组的序列分析软件包，1710University Avenue.Madison，WI53705)检测。该软件通过对各种置换、缺失、插入和其它修饰分配同源性程度，匹配相似序列。保守置换通常包括以下各组内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。

术语“纯化的”或“纯化”指任何由目的组分(例如蛋白或核酸)中去除某些杂质的过程结果。样品中纯化组分的百分比因此增加。

本文使用的术语“有效连接”指核酸序列以下述方式连接，产生能够控制给定基因转录和/或目的蛋白分子合成的核酸分子。该术语还指氨基酸编码序列以下述方式连接，产生功能性(例如酶活性、能够结合结合配偶体、能够抑制等)蛋白或多肽或其前体(例如蛋白或多肽的前-或前原形式)。

本文鉴别的所有氨基酸残基都是天然L-构型。为与标准多肽命名法保持一致，氨基酸残基的缩写如以下的对应表所示。

                 对应表

单字母           三字母            氨基酸

Y                Tyr               L-酪氨酸

G                Gly               L-甘氨酸

F                Phe               L-苯丙氨酸

M                Met               L-甲硫氨酸

A                Ala               L-丙氨酸

S                Ser               L-丝氨酸

I                Ile               L-异亮氨酸

L                Leu               L-亮氨酸

T                Thr               L-苏氨酸

V                Val               L-缬氨酸

P                Pro               L-脯氨酸

K                Lys               L-赖氨酸

H                His               L-组氨酸

Q                Gln               L-谷氨酰胺

E                Glu               L-谷氨酸

W                Trp               L-色氨酸

R                Arg               L-精氨酸

D                Asp               L-天冬氨酸

N                Asn               L-天冬酰胺

C                Cys               L-半胱氨酸

本文使用的术语“聚组氨酸束”或(His标签指含2-10个组氨酸残基的分子，例如5-10个残基的聚组氨酸束。聚组氨酸束使得可以在固定化金属(例如镍、锌、钴或铜)螯合柱上或通过与另一种分子(例如与His标签反应的抗体)的相互作用亲和纯化共价连接的分子。

本文使用的“纯”表示目标种类为主要存在种类(即以摩尔为基准，在组合物中其比任何其它单个种类都更丰富)，优选大致纯的组分是其中目标种类占存在全部大分子种类的至少约50％(以摩尔为基准)的组合物。一般来说，“大致纯”的组合物占组合物中存在的全部大分子种类的约80％以上，更优选约85％、约90％、约95％和约99％以上。最优选目标种类纯化至基本同质(不能通过常规检测方法检测出组合物中的杂质种类)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。

I. 突变水解酶及其融合体

本发明范围内的突变水解酶包括但不限于经重组技术(例如定点诱变或循环诱变(recursive mutagenesis))制备的突变水解酶，其包含一个或多个使突变水解酶能够与对应非突变(野生型)水解酶的底物(例如经修饰含一个或多个官能团的底物)形成稳定(例如共价)键的氨基酸置换。本发明范围内的水解酶包括但不限于肽酶、酯酶(例如胆固醇酯酶)、糖苷酶(例如葡糖淀粉酶(glucosamylase))、磷酸酶(例如碱性磷酸酶)等。例如，水解酶包括但不限于作用于酯键的酶，如羧酸酯水解酶、硫酯水解酶、磷酸单酯水解酶、磷酸二酯水解酶、三磷酸单酯水解酶、硫酸酯水解酶、二磷酸单酯水解酶、磷酸三酯水解酶、产生5′-磷酸单酯的外切脱氧核糖核酸酶、产生5′-磷酸单酯的外切核糖核酸酶、产生3′-磷酸单酯的外切核糖核酸酶、作用于核糖核酸或脱氧核糖核酸的外切核酸酶、产生5′-磷酸单酯的内切脱氧核糖核酸酶、产生非5′-磷酸单酯的内切脱氧核糖核酸酶、改变碱基特异性的位点特异性内切脱氧核糖核酸酶、产生5′-磷酸单酯的内切核糖核酸酶、生产非5′-磷酸单酯的内切核糖核酸酶、作用于核糖核酸或脱氧核糖核酸的内切核酸酶、作用于核糖核酸或脱氧核糖核酸糖基化酶的内切核糖核酸酶；糖苷酶，例如水解O-和S-糖基以及水解N-糖基化合物的酶；作用于醚键的酶如三烷基锍水解酶或醚水解酶；作用于肽键的酶(肽水解酶)，如氨基肽酶、二肽酶、二肽基肽酶和三肽基肽酶、肽基二肽酶、丝氨酸型羧肽酶、金属羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、ω肽酶、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、精氨酸内肽酶、金属内肽酶、苏氨酸内肽酶和未知催化机制的内肽酶；作用于肽键以外的碳-氮键的酶，例如线性酰胺、环酰胺、线性脒、环脒、腈或其它化合物中的碳-氮键；作用于酸酐的酶，如含磷酐和含磺酰酐中的酸酐；作用于酸酐的酶(催化跨膜移动)；作用于酸酐或参与细胞和亚细胞移动的酶；作用于碳-碳键(例如酮物质中的碳-碳键)的酶；作用于卤化物键(例如C-卤化化合物中的卤化物键)的酶；作用于磷-氮键的酶；作用于硫-氮键的酶；作用于碳-磷键的酶；以及作用于硫-硫键的酶。作用于卤化物键的示例性水解酶包括但不限于卤烷酶、2-卤代酸脱卤素酶、卤代乙酰脱卤素酶、甲状腺素脱碘酶、卤代烷脱卤素酶、4-氯苯甲酸脱卤素酶、4-氯苯甲酰-辅酶A脱卤素酶和莠去津氯水解酶。作用于环酰胺中碳-氮键的典型水解酶包括但不限于巴比妥酸酶、二氢嘧啶酶、二氢乳清酸酶、羧甲基乙内酰脲酶、尿囊素酶、β-内酰胺酶、咪唑啉酮丙酸酶、5-氧代脯氨酸酶(ATP-水解)、肌酸酐酶、L-赖氨酸-内酰胺酶、6-氨基已酸-环-二聚体水解酶、2，5-二氧代哌嗪水解酶、N-甲基乙内酰脲酶(ATP-水解)、氰尿酸氨基水解酶、顺丁烯二酰亚胺水解酶。本文使用的“β-内酰胺酶”包括A类、B类、C类和D类β-内酰胺酶，以及D-丙氨酸羧肽酶/转肽酶、酯酶EstB、青霉素结合蛋白2X、青霉素结合蛋白5和D-氨基酸肽酶。所述β-内酰胺酶优选为丝氨酸β-内酰胺酶，例如在对应于金黄色葡萄球菌(S.aureus)PCl丝氨酸β-内酰胺酶残基70的位置上具有催化性丝氨酸残基、在对应于金黄色葡萄球菌(S.aureus)PCl丝氨酸β-内酰胺酶残基166的位置上具有谷氨酸残基、任选在对应于金黄色葡萄球菌(S.aureus)PCl β-内酰胺酶残基73的位置上具有赖氨酸残基以及还任选在对应于金黄色葡萄球菌(S.aureus)PCl β-内酰胺酶残基234的位置上具有赖氨酸残基的丝氨酸β-内酰胺酶。

在一个实施方案中，所述突变水解酶为卤代烷脱卤素酶，例如发现于利用卤代烷的革兰氏阴性(Keuning等，1985)和革兰氏阳性(Keuning等，1985；Yokota等，1987；Scholtz等，1987；Sallis等，1990)细菌中的卤代烷脱卤素酶。卤代烷脱卤素酶，包括自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)GJ10(Janssen等，1988，1989)DhlA和紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA，催化对应的烃水解脱卤素化。经历转化的卤化脂肪烃包括C₂-C₁₀饱和脂肪烃，它们具有一个或多个连接的卤素基团，其中至少两个卤素在相邻碳原子上。这种脂肪烃包括挥发性氯化脂肪(VCA)烃。VCA包括例如二氯乙烷、1，2-二氯丙烷、1，2-二氯丁烷和1，2，3-三氯丙烷等脂肪烃。本文使用的术语“卤化烃”是指卤化脂肪烃。本文使用的术语“卤素”包括氯、溴、碘、氟、砹等。优选的卤素是氯。

如本文所述，本发明包括含突变水解酶和目标蛋白氨基酸序列的融合蛋白，所述氨基酸序列例如为标记蛋白或亲和标记物序列(例如荧光素酶、GFP或聚组氨酸序列)、核酸结合蛋白、胞外基质蛋白、分泌性蛋白、受体配体、血清蛋白、免疫原性蛋白、荧光蛋白、具有活性半胱氨酸的蛋白、受体蛋白(如MDA受体)、通道蛋白(如钠、钾或钙敏性通道蛋白，包括HERG通道蛋白)或转运蛋白(如EAAT1-4谷氨酸转运蛋白)，以及靶向信号(如质粒靶向信号、核定位信号或肉豆蔻酸化序列)。

II. 优化的水解酶序列，以及编码水解酶的载体和宿主细胞

任选优化含水解酶或其融合体编码核酸序列的核酸分子，以在具体宿主细胞中表达，还任选与转录调节序列(例如一个或多个增强子、启动子、转录终止序列或其组合)有效连接，以形成表达盒。

在一个实施方案中，通过用在具体(选择)细胞中优先使用的密码子替换野生型或突变水解酶序列中的密码子，优化编码水解酶或其融合体的核酸序列。优选密码子在选择的细胞中具有较高密码子使用频率，优选其导入导致导入较少选择宿主细胞中存在的转录因子的转录因子结合位点以及较少的其他不需要的结构特征。因此，优化的核酸产物由于提高了密码子使用频率而使表达水平提高，并由于不需要的转录调节序列数量下降而降低了不适宜转录行为的风险。

本发明分离和优化核酸分子的密码子组成与对应野生型核酸序列的密码子组成可有30％、35％、40％以上或45％以上如50％、55％、60％或以上的密码子不同。用于本发明的优选密码子比用于具体生物中相同氨基酸的至少一种其它密码子更经常使用，更优选在该生物和用于克隆或筛选核酸分子表达的生物中也不是使用低的密码子。而且，某些氨基酸(即具有三个或更多密码子的氨基酸)的优选密码子可包括比其它(非优选)密码子更经常使用的两个或更多密码子。所述核酸分子中存在的密码子在一种生物中比在另一种生物中更经常使用，这导致核酸分子在导入更经常使用这些密码子的生物细胞时，其在这些细胞中的表达水平比这些细胞中野生型或父代核酸序列的表达水平高。

在本发明的一个实施方案中，不同的密码子是在哺乳动物中更经常使用的密码子，而在另一个实施方案中，不同的密码子是在植物中更经常使用的密码子。不同生物的优选密码子是本领域已知的，参见例如 www.kazusa.or.jp./codon/。具体类型的哺乳动物，例如人，可具有不同于其它类型哺乳动物的优选密码子组。同样，具体类型的植物可具有不同于其它类型植物的优选密码子组。在本发明的一个实施方案中，大部分不同的密码子是目的宿主细胞中优选的密码子。包括哺乳动物(例如人)和植物的生物的优选密码子是本领域已知的(例如Wada等，1990；Ausubel等，1997)。例如，优选的人密码子包括但不限于CGC(Arg)、CTG(Leu)、TCT(Ser)、AGC(Ser)、ACC(Thr)、CCA(Pro)、CCT(Pro)、GCC(Ala)、GGC(Gly)、GTG(Val)、ATC(Ile)、ATT(Ile)、AAG(Lys)、AAC(Asn)、CAG(Gln)、CAC(His)、GAG(Glu)、GAC(Asp)、TAC(Tyr)、TGC(Cys)和TTC(Phe)(Wada等，1990)。因此，在一个实施方案中，本发明合成核酸分子由于具有增加数量的优选人密码子如CGC、CTG、TCT、AGC、ACC、CCA、CCT、GCC、GGC、GTG、ATC、ATT、AAG、AAC、CAG、CAC、GAG、GAC、TAC、TGC、TTC或其任意组合，而具有不同于野生型核酸序列的密码子组成。例如，相对于野生型核酸序列，本发明的核酸分子可具有增加数量的CTG或TTG亮氨酸编码密码子、GTG或GTC缬氨酸编码密码子、GGC或GGT甘氨酸编码密码子、ATC或ATT异亮氨酸编码密码子、CCA或CCT脯氨酸编码密码子、CGC或CGT精氨酸编码密码子、AGC或TCT丝氨酸编码密码子、ACC或ACT苏氨酸编码密码子、GCC或GCT丙氨酸编码密码子，或其任意组合。在另一个实施方案中，优选的秀丽线虫(C.elegans)密码子包括但不限于UUC(Phe)、UUU(Phe)、CUU(Leu)、UUG(Leu)、AUU(Ile)、GUU(Val)、GUG(Val)、UCA(Ser)、UCU(Ser)、CCA(Pro)、ACA(Thr)、ACU(Thr)、GCU(Ala)、GCA(Ala)、UAU(Tyr)、CAU(His)、CAA(Gln)、AAU(Asn)、AAA(Lys)、GAU(Asp)、GAA(Glu)、UGU(Cys)、AGA(Arg)、CGA(Arg)、CGU(Arg)、GGA(Gly)，或其任意组合。在再另一个实施方案中，优选的果蝇(Drosophilia)密码子包括但不限于UUC(Phe)、CUG(Leu)、CUC(Leu)、AUC(Ile)、AUU(Ile)、GUG(Val)、GUC(Val)、AGC(Ser)、UCC(Ser)、CCC(Pro)、CCG(Pro)、ACC(Thr)、ACG(Thr)、GCC(Ala)、GCU(Ala)、UAC(Tyr)、CAC(His)、CAG(Gln)、AAC(Asn)、AAG(Lys)、GAU(Asp)、GAG(Glu)、UGC(Cys)、CGC(Arg)、GGC(Gly)、GGA(gly)，或其任意组合。优选的酵母密码子包括但不限于UUU(Phe)、UUG(Leu)、UUA(Leu)、CCU(Leu)、AUU(Ile)、GUU(Val)、UCU(Ser)、UCA(Ser)、CCA(Pro)、CCU(Pro)、ACU(Thr)、ACA(Thr)、GCU(Ala)、GCA(Ala)、UAU(Tyr)、UAC(Tyr)、CAU(His)、CAA(Gln)、AAU(Asn)、AAC(Asn)、AAA(Lys)、AAG(Lys)、GAU(Asp)、GAA(Glu)、GAG(Glu)、UGU(Cys)、CGU(Trp)、AGA(Arg)、CGU(Arg)、GGU(Gly)、GGA(Gly)，或其任意组合。同样，具有增加数量的在植物中更经常使用的密码子的核酸分子，由于具有增加数量的植物密码子，而与野生型或父代核酸序列具有不同的密码子组成，所述植物密码子包括但不限于CGC(Arg)、CTT(Leu)、TCT(Ser)、TCC(Ser)、ACC(Thr)、CCA(Pro)、CCT(Pro)、GCT(Ser)、GGA(Gly)、GTG(Val)、ATC(Ile)、ATT(Ile)、AAG(Lys)、AAC(Asn)、CAA(Gln)、CAC(His)、GAG(Glu)、GAC(Asp)、TAC(Tyr)、TGC(Cys)、TTC(Phe)，或其任意组合(Murray等，1989)。不同类型植物的优选密码子可以不同(Wada等，1990)。

在一个实施方案中，编码水解酶或其融合体的优化核酸序列与编码对应水解酶或其融合体的非优化核酸序列的核酸序列一致性低于100％，例如低于90％或低于80％。例如，编码DhaA的优化核酸序列与编码对应DhaA的非优化(野生型)核酸序列的核酸序列一致性低于约80％，由优化核酸序列编码的DhaA与对应野生型DhaA的氨基酸序列一致性任选至少为85％。在一个实施方案中，由优化核酸序列编码的DhaA的活性是非优化序列编码的DhaA活性的至少10％，例如50％或更高，例如，由优化核酸序列编码的突变DhaA结合底物的效力与由非优化核酸序列编码的突变DhaA结合相同底物的效力大致相同，即至少50％、80％、100％或更高。

可将核酸分子或表达盒导入任选包含选择标记基因的载体中，例如质粒或病毒载体，并将载体导入目的细胞中，例如原核细胞，如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)等，以及真核细胞，包括植物(双子叶或单子叶)、真菌、酵母(如毕赤酵母(Pichia)、酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces))或哺乳动物细胞。优选的哺乳动物细胞包括牛、山羊、绵羊、犬、猫、非人灵长类如猿以及人细胞。优选的哺乳动物细胞系包括但不限于CHO、COS、293、Hela、CV-1、SH-SY5Y(人成神经细胞瘤细胞)、HEK293和NIH3T3细胞。

可通过任何能够在原核细胞或真核细胞中表达的启动子控制编码突变水解酶的表达。优选的原核启动子包括但不限于SP6、T7、T5、tac、bla、trp、gal、lac或麦芽糖启动子。优选的真核启动子包括但不限于组成型启动子，例如病毒启动子如CMV、SV40和RSV启动子，以及可调节启动子，例如可诱导或可抑制的启动子，如tet启动子、hsp70启动子和CRE调节的合成启动子。优选的细菌表达载体包括pGEX-5X-3，优选的真核表达载体包括pCIneo-CMV。

本发明的核酸分子、表达盒和/或载体可通过任何方法导入细胞中，所述方法包括但不限于钙介导转化、电穿孔、微注射、脂转染、粒子轰击等。

III. 官能团

用于本发明底物和方法的官能团是可检测或能够检测的分子。本发明范围内的官能团能够共价连接至双功能连接基团或水解酶底物的一个活性取代基，并且作为本发明底物的一部分，与不与天然底物连接的官能团具有大致相同的活性，并能够与突变水解酶形成稳定复合物。因此，官能团具有一种或多种特性，这些特性有利于检测和任选分离具有该官能团的底物和突变水解酶形成的稳定复合物。例如，官能团包括具有以下特性的官能团：电磁光谱特性如发射或吸收、磁力、电子自旋共振、电容、介电常数或电导率，以及包括具铁磁性、顺磁性、反磁性、发光性、电化学发光性、荧光性、磷光性、发色性、抗原性或不同质谱的官能团。官能团包括但不限于核酸分子，即DNA或RNA，例如寡核苷酸或核苷酸；蛋白，例如发光蛋白；肽，例如配体识别的表位，如生物素或链霉抗生物素蛋白；半抗原；氨基酸；脂质；脂质双层；固相支持体；荧光团；发色团；报告分子；放射性核素、电子不透明分子；MRI造影剂，例如锰、钆(III)或氧化铁颗粒；等等。检测具体官能团的方法是本领域已知的。例如，可通过杂交、扩增、结合核酸分子特异性核酸结合蛋白、酶测定(例如如果核酸分子是核酶)检测核酸分子，或者如果核酸分子自身含有可检测或能够检测的分子，例如放射性标记或生物素，则可通过适于该分子的测定对其进行检测。

示例性官能团包括半抗原，例如用于增强匙孔_血蓝蛋白(KLH)免疫原性的分子；可裂解标记物，例如可光裂解生物素；以及荧光标记，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰的香豆素和琥珀酰亚胺或磺酰琥珀酰亚胺修饰的BODIPY(其可通过UV和/或可见光激发的荧光检测测定)、罗丹明如R110、对甲氨基酚、CRG6、Texas Metyl Red(TAMRA)、Rox5、FAM或荧光素、香豆素衍生物如7-氨基香豆素和7-羟基香豆素、2-氨基-4-甲氧基萘、1-羟基芘、试卤灵、phenalenone或benzphenalenone(美国专利第4,812,409号)、吖啶酮(美国专利第4,810,636号)、蒽和α-和β-萘酚衍生物、氟化呫吨衍生物，包括氟化荧光素和对甲氨基酚(例如美国专利第6,612,931号)，以及生物发光分子，例如萤光素酶或GFP。依靠连接至对应野生型水解酶底物而连接至突变水解酶的荧光(或生物发光)官能团，可用于实时感知系统变化，例如磷酸化。而且，本发明底物中的荧光分子，例如金属离子化学传感器，如用于Cu²⁺的9-羰基蒽修饰的甘氨酰-组氨酰-赖氨酸(GHK)，可用于标记结合底物的蛋白。生物发光或荧光官能团如BODIPY、罗丹明绿、GFP或红外染料，也发现可用作官能团，并可例如用于使用例如BRET、FRET、LRET或电泳的相互作用研究。

另一类官能团是与含接受基团的分子相互作用的分子(“亲和”分子)。因此，由于亲和分子和另一种生物或非生物来源的分子(例如接受分子)的选择性相互作用，所以含所述亲和分子的水解酶底物可促进具有所述底物和突变水解酶的复合物分离。例如，与亲和分子相互作用的具体分子(称为接受分子)可以为小有机分子、化学基团如巯基(-SH)或大生物分子如抗体或亲和分子的其它天然配体。结合一般为化学性质，可能涉及共价或非共价键的形成或相互作用，如离子键或氢键键合。接受分子在溶液中可以是游离的，或者其自身结合固体或半固体表面、多聚物基质，或者存在固体或半固体底物的表面上。所述相互作用还可以通过外部因子如光、温度、压力或加入起催化剂作用的化学或生物分子触发。由于亲和分子和接受分子之间的相互作用(一般是一类结合)，所以可检测和/或分离反应混合物中的复合物。

亲和分子的实例包括例如免疫原性分子，如蛋白、肽、糖或脂质表位，即可用于制备该分子特异性抗体的任何分子；生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白及其衍生物；金属结合分子；以及这些分子的片段或组合。典型的亲和分子包括His5(HHHHH)(SEQ IDNO：19)、HisX6(HHHHHH)(SEQ ID NO：20)、C-myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO：21)、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO：22)、SteptTag(WSHPQFEK)(SEQ ID NO：23)、HA Tag(YPYDVPDYA)(SEQ IDNO：24)、硫氧还蛋白、纤维素结合域、几丁质结合域、S-肽、T7肽、钙调蛋白结合肽、C-末端RNA标记物、金属结合域、金属结合反应基、氨基酸反应基、内含肽、生物素、链霉抗生物素蛋白和麦芽糖结合蛋白。例如，使含生物素的水解酶底物与突变水解酶接触。突变水解酶和底物复合物中存在生物素使得该复合物可选择性结合抗生物素蛋白分子，例如包被在如珠、微孔、硝酸纤维素等表面上的链霉抗生物素蛋白分子。合适的表面包括用于色谱分离的树脂、塑料如组织培养表面或结合平板、微量滴定碟和珠、陶瓷和玻璃、颗粒包括磁性颗粒、聚合物和其它基质。用例如磷酸缓冲盐水(PBS)漂洗处理的表面，以去除无生物素的分子，并分离含生物素的复合物。在某些情况下，这些材料可能是生物分子感应装置(例如光学纤维、化学敏感场效应管(chemfet)和胞质基因检测器)的一部分。

亲和分子的另一个实例是丹磺酰赖氨酸。与丹磺酰环相互作用的抗体有市售(Sigma Chemical；St.Louis，MO)，或者可使用如Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow and Lane，1988中描述的已知方法制备。例如，将抗丹磺酰基抗体固定在色谱柱填料上。该亲和柱层析法实现分离的原因是：由于突变水解酶和本发明底物的复合物与固定化抗体相互作用，所以其保留在柱上，而其它分子经过柱。然后，通过破坏抗体-抗原相互作用释放复合物。具体的层析柱填料如离子交换或亲和Sepharose、Sephacryl、Sephadex和其它层析树脂有市售(Sigma Chemical；St.Louis，MO；Pharmacia Biotech；Piscataway，N.J.)。丹磺酰赖氨酸由于其荧光特性而可以方便地检测。

当使用抗体作为接受分子时，可通过其它生化分离方法进行分离，例如免疫沉淀和将抗体固定在滤膜或其它表面上，如珠、平板或树脂。例如，可用亲和分子特异性抗体或水解酶特异性抗体包被的磁珠分离突变水解酶和本发明底物的复合物。可使用磁场反复地将珠由混合物中分离出来。

另一类功能分子包括使用电磁辐射可检测的分子，包括但不限于呫吨荧光团、丹磺酰基荧光团、香豆素和香豆素衍生物、荧光吖啶鎓部分、基于苯并芘的荧光团以及7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑和3-N-(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)-2，3-二氨基-丙酸。所述荧光分子优选在不同于天然氨基酸的波长上具有高量子产率荧光，更优选具有可在光谱的可见光部分或UV和可见光两个部分中激发的高量子产率荧光。在预先选择的波长发射时，所述分子于低浓度即可目测或者使用常规的荧光检测法进行检测。可在飞摩尔或以下范围检测电化学发光分子，如钌螯合物及其衍生物，或氮氧氨基酸(nitroxide aminoacid)及其衍生物。

除了荧光分子以外，可使用各种物理特性基于分子与电磁场和辐射的相互作用和反应的分子检测突变水解酶和本发明底物的复合物。这些特性包括在电磁谱的UV、可见以及红外区域有吸收、存在具Raman活性并可通过共振Raman光谱学进一步增强的发色团、顺磁共振活性和核磁共振以及分子量，例如通过质谱测定。

检测和/或分离具有亲和分子的复合物的方法包括层析技术，包括凝胶过滤层析、中低压(fast-pressure)或高压液相层析、反相层析、亲和层析和离子交换层析。其它的蛋白分离方法也可用于突变水解酶和本发明底物复合物的检测以及随后的分离，例如电泳、等电聚焦和质谱。

IV. 连接基团

术语“连接基团”也用符号‘L’表示，表示将一个或多个官能团共价连接至反应基或含反应基的底物的一个或多个基团。本文使用的连接基团不是单个共价键。连接基团的结构不是至关重要的，只要生成底物可结合其靶酶。在一个实施方案中，所述连接基团可为分隔官能团(R)和反应基约5埃至约1000埃(包含5埃和1000埃)长度的二价基团。其它合适的连接基团包括分隔R和反应基约5埃至约100埃的连接基团，以及分隔R和底物约5埃至约50埃、约5埃至约25埃、约5埃至约500埃或约30埃至约100埃的连接基团。

在一个实施方案中，所述连接基团为氨基酸。

在另一个实施方案中，所述连接基团为肽。

在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约30个碳原子的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键，该链任选由一个或多个(例如2、3或4个)羟基或氧代(＝O)取代，其中所述链上的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选由非过氧化物-O-、-S-或-NH-替换。

在另一个实施方案中，所述连接基团为式-W-F-W-的二价基团，其中F是(C₁-C₃₀)烷基、(C₂-C₃₀)烯基、(C₂-C₃₀)炔基、(C₃-C₈)环烷基或(C₆-C₁₀)芳基，其中W是-N(Q)C(＝O)-、-C(＝O)N(Q)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(Q)-、-C(＝O)-或直接键；其中每个Q都独立地为H或(C₁-C₆)烷基。

在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约30个碳原子的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键，该链任选由一个或多个(例如2、3或4个)羟基或氧代(＝O)取代。

在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约30个碳原子的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键。

在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约30个碳原子的二价直链或支链碳链。

在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约20个碳原子的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键，并且该链任选由一个或多个(例如2、3或4个)羟基或氧代(＝O)取代。

在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约20个碳原子的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键。

在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约20个碳原子的二价直链或支链碳链。

在另一个实施方案中，所述连接基团为-(CH₂CH₂O)-_1-10。

在另一个实施方案中，所述连接基团为-C(＝O)NH(CH₂)₃-、-C(＝O)NH(CH₂)₅C(＝O)NH(CH₂)-、-CH₂OC(＝O)NH(CH₂)₂O(CH₂)₂O(CH₂)-、-C(＝O)NH(CH₂)₂O(CH₂)₂O(CH₂)₃-、-CH₂OC(＝O)NH(CH₂)₂O(CH₂)₂O(CH₂)₃-、-(CH₂)₄C(＝O)NH(CH₂)₂O(CH₂)₂O(CH₂)₃-、-C(＝O)NH(CH₂)₅C(＝O)NH(CH₂)₂O(CH₂)₂O(CH₂)₃-；

具体地说，(C₁-C₃₀)烷基可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基、3-戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基；(C₃-C₈)环烷基可以是环丙基、环丁基、环戊基或环己基；(C₂-C₃₀)烯基可以是乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基或癸烯基；(C₂-C₃₀)炔基可以是乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基或癸炔基；而(C₆-C₃₀)芳基可以是苯基、茚基或萘基。

术语“氨基酸”当用于指连接基团时，包含D或L型天然氨基酸(例如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)，以及非天然氨基酸(例如磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-甲酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(statine)、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酸、青霉胺、鸟氨酸、瓜氨酸、α-甲基-丙氨酸、对苯甲酰苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸和四丁基甘氨酸)。该术语还包括携带常规氨基保护基(例如乙酰基或苄氧基羰基)的天然和非天然氨基酸，以及在羧基末端保护(例如为(C₁-C₆)烷基、苯基或苄基酯或酰胺)的天然和非天然氨基酸。其它合适的氨基和羧基保护基是本领域技术人员已知的(参见例如Greene，Protecting Groups In Organic Synthesis；Wiley：New York，1981以及其中引用的参考文献)。氨基酸可通过羧基末端、氨基末端或任何其它方便的连接点(例如通过半胱氨酸的硫)连接至另一个分子。

术语“肽”当用于指连接基团时，描述的是2-25个氨基酸(例如以上定义的氨基酸)或肽基残基的序列。所述序列可为线性或环状。例如，可制备环状肽，或者可由序列中两个半胱氨酸形成二硫键获得环状肽。肽可通过羧基末端、氨基末端或任何其它方便的连接点(例如通过半胱氨酸的硫)连接至另一个分子。肽优选含有3-25或5-21个氨基酸。可根据美国专利号4,612,302、4,853,371和4,684,620的公开内容制备肽衍生物。对于本文具体提出的肽序列，氨基末端写在左侧，而羧基末端写在右侧。

在一个实施方案中，本发明的脱卤素酶底物具有式(I)的连接基团：

R-连接基团-A-X         (I)其中，R是一个或多个官能团(例如荧光团、生物素、发光团，或荧光或发光分子，或者是固相支持体，包括微球、膜、玻璃珠等)，其中所述连接基团是含C、N、S或O的多原子直链或支链，其中A-X是脱卤素酶底物，其中X是卤素。在一个实施方案中，A-X是脱卤素酶的卤代脂肪族底物或卤代芳香族底物。在一个实施方案中，所述连接基团是含约12至约30个碳原子的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键，并且该链任选由一个或多个(例如2、3或4个)羟基或氧代(＝O)取代，其中所述链上的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选由非过氧化物-O-、-S-或-NH-替换。在一个实施方案中，A是CH₂CH₂或CH₂CH₂CH₂。在一个实施方案中，脱卤素酶如紫红红球菌(Rhodococcus)脱卤素酶底物中的连接基团是含C、N、S或O的多原子直链或支链，当官能团R含芳环体系或是固相支持体时，优选连接基团含11-30个原子。

在另一个实施方案中，本发明的脱卤素酶底物具有式(II)的连接基团：

R-连接基团-CH₂-CH₂-CH₂-X      (II)其中X是卤素，优选为氯。在一个实施方案中，R是一个或多个官能团，例如荧光团、生物素、发光团，或荧光或发光分子，或者是固相支持体，包括微球、膜、玻璃珠等。当R为放射性标记物或可检测小原子如光谱活性同位素时，所述连接基团可为0-30个原子。

V. 示例性底物的合成

[2-(2-羟基-乙氧基)-乙基]-氨基甲酸蒽-9-基甲酯。

向9-蒽甲醇(10g，48mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(13.6g，67.5mmol)的200ml CH₂Cl₂搅拌淤浆中加入三乙胺(6.7ml，0.19mol)。于室温搅拌获得的金色溶液16小时。此时加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(14.4ml，0.144mol)，再继续搅拌24小时。然后用2％氢氧化钠(重量)溶液清洗CH₂Cl₂反应混合物，直至在有机层观测不到对硝基苯酚。用硫酸钠干燥二氯甲烷，过滤，减压蒸发。

用硅胶60通过柱层析进一步纯化粗产物，用含1％-3％甲醇的二氯甲烷溶液渐进梯度洗脱。分离出7.6g(58％收率)黄色固体：¹H NMR(CDCl₃)δ8.38(s，H-10)，8.28(d，H-1，8)，7.94(d，H-4，5)，7.44(m，H-2，3，6，7)，6.06(s，CH₂-anth)，5.47(t，可交换，NH)，3.53(bs，CH₂-OH)3.33(m，3-CH₂-)。质谱：m/e C₂₀H₂₂NO₄ ⁺理论值：340.15。实测值：340.23。C₂₀H₂₁NNaO₄ ⁺理论值：340.15。实测值：340.23。

式III的化合物

{2-[2-(6-氯-己氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸蒽-9-基甲酯。

在惰性气氛下，向100ml圆底烧瓶中装入[2-(2-羟基-乙氧基)-乙基]-氨基甲酸蒽-9-基甲酯(1.12g，3mmol)和新鲜氢化钠的60％矿物油分散液(360mg，9mmol)。加入20ml无水THF，搅拌反应物30分钟。然后通过冰/NaCl浴将烧瓶冷却至-10至-20℃。达到温度时通过注射器加入1-氯-6-碘己烷(1ml，6mmol)。将反应物保持在冰/NaCl温度2小时，然后缓慢温至室温过夜。此时将硅胶60共吸附到反应混合物上，减压去除溶剂。首先用庚烷作为洗脱剂，接着用10％、20％和25％乙酸乙酯，开始硅胶层析。由合适级分中分离出总共0.57g产物(41％收率)：¹H NMR(CDCl₃)δ8.48(s，H-10)，8.38(d，H-1，8)，8.01(d，H-4，5)，7.52(dt，H-2，3，6，7)，6.13(s，CH₂-anth)，5.29(bs，可交换，NH)，3.74(m，4H)，3.55-3.15(m，8H)，1.84(m，4H)，1.61(m，1H)，1.43(m，1H)，1.25(m，2H)。质谱：m/e C₂₆H₃₂ClNO₄·H₂O理论值：475.21(100％)、476.22(29.6％)。实测值：475.21、476.52。

式IV的化合物

三氟乙酸2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基-铵。

将{2-[2-(6-氯-己氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸蒽-9-基甲酯(0.56g，1.2mmol)溶解在4ml二氯甲烷中，向其中加入2滴苯甲醚。用冰/NaCl浴冷却反应混合物。10分钟后加入三氟乙酸(2ml)。一加入反应混合物就转为黑褐色，对其搅拌30分钟。在减压下去除所有挥发物。残余物再溶解在CH₂Cl₂中，用水清洗两次。冷冻水性组分，并过夜冻干。保留油性残余物，并溶解在无水DMF中，在下一步反应中用作母液。质谱：m/e C₁₀H₂₃ClNO₂ ⁺理论值：224.14(100％)、226.14(32％)。实测值：224.2、226.2。

式V的化合物

报告基团缀合2-[2-(6-氯-己氧基)-乙氧基]-乙胺的一般方法学。

向1当量报告基团琥珀酰亚胺酯的DMF溶液中加入3当量三氟乙酸2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基-铵母液，接着加入二异丙基乙胺。于室温搅拌反应物8-16小时。以制备规模HPLC或硅胶层析完成纯化。

N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-荧光素-5-酰胺。

使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。质谱：m/e C₃₁H₃₁ClNO₈ ^-理论值：580.17(100％)、581.18(32％)。实测值：580.18、581.31。

式VI的化合物

N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-生物素-酰胺。

使用以上方法学制备标题化合物。用硅胶层析完成纯化(2％-5％甲醇的二氯甲烷溶液)。质谱：m/e C₂₀H₃₇ClN₃O₄S⁺理论值：450.22(100％)、452.22(32％)。实测值：449.95、451.89。

式VII的化合物

N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-四甲基罗丹明-5-(和-6)-酰胺。

使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。实现了对结构异构体的分离。质谱：m/e C₃₅H₄₃ClN₃O₆ ⁺理论值：636.28(100％)、637.29(39.8％)、638.28(32.4％)。实测值：636.14、637.15、638.14。

式VIII的化合物                 式IX的化合物

N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-罗丹明R110-5-(和-6)-酰胺。

使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。实现了结构异构体的分离。质谱：m/e C₃₁H₃₅ClN₃O₆ ⁺理论值：580.2(100％)、581.2(35.6％)、582.2(32.4％)。实测值：580.4、581.4、582.2。

式X的化合物                 式XI的化合物

6-({4-[4，4二氟-5-(噻吩-2-基)-4-硼杂-3a-4a-二氮杂-s-引达省-3-基]-苯氧基}-乙酰氨基)-己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-酰胺。

使用以上方法学制备标题化合物。用硅胶层析完成纯化(3％-5％甲醇的二氯甲烷溶液)。质谱：m/e C₃₇H₄₇BClF₂N₄O₅S⁺理论值：743.3(100％)。实测值：743.4。

式XII的化合物

6-({4-[4，4二氟-5-(噻吩-2-基)-4-硼杂-3a-4a-二氮杂-s-引达省-3-基]-苯乙烯基氧基}-乙酰氨基)-己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-酰胺。

使用以上方法学制备标题化合物。用硅胶层析完成纯化(3％甲醇的二氯甲烷溶液)。质谱：m/e C₃₉H₄₈BClF₂N₄NaO₅S⁺理论值：791.3(100％)。实测值：791.3。

式XIII的化合物三乙铵3-[5-[2-(4-叔丁基-7-二乙基氨基-色烯-2-亚基)-亚乙基]-3-(5-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基氨甲酰基}-戊基-2，4，6-三氧代-四氢-嘧啶-1-基}-丙烷-1-磺酸阴离子。

使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。质谱：m/e C₄₂H₆₂ClN₄O₁₀S^-理论值：849.4(100％)、850.4(48.8％)、851.4(36.4％)。实测值：849.6、850.5、851.5。

式XIV的化合物

2-叔丁基-4-{3-[1-(5-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基氨甲酰基}-戊基)-3，3-二甲基-5-磺酸根-1，3-二氢-吲哚-2-亚基]-丙基}-7-二乙基氨基-色烯鎓氯。

使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。质谱：m/e C₄₆H₆₇ClN₃O₇S^-理论值：840.4(100％)、841.4(54.4％)。实测值：840.5、841.5。

式XV的化合物

N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-3-{4-[5-(4-二甲基氨基-苯基)-噁唑-2-基]-苯磺酰基氨基}-丙酰胺。

使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。质谱：m/e C₃₀H₄₀ClN₄O₆S^-理论值：619.2(100％)、620.2(35％)。实测值：619.5、620.7。

式XVI的化合物

N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-9′-氯半萘并荧光素-5-(和-6)-酰胺。

使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。实现了结构异构体的分离。质谱：m/e C₃₅H₃₄Cl₂NO₈ ⁺理论值：666.17(100％)、668.16(64％)、667.17(39.8％)。实测值：666.46、668.44、667.51。

式XVII的化合物                     式XVIII的化合物

N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-半萘并二甲基罗丹明-5-(和-6)-酰胺。

使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。质谱：m/e C₃₇H₃₈ClN₂O₇ ^-理论值：657.24(100％)、658.24(42％)、659.23(32％)。实测值：657.46、658.47、659.45。

式XIX的化合物                 式XX的化合物

6-(3′，6′-二新戊酰荧光素-5-(和6-)-酰胺基)己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-酰胺。

向含6-(3′，6′-二新戊酰荧光素-5-(和6-)-酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(0.195g，0.26mmol)的100ml圆底烧瓶中加入2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙胺(约0.44mmol)的25ml Et₂O溶液，接着加入2ml吡啶。将反应混合物搅拌过夜。减压蒸发后，将残余物上硅胶60柱层析，使用2％-5％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗脱剂渐进梯度洗脱。收集合适的级分，真空干燥(0.186g，0.216mmol，84％收率)。质谱：m/eC₄₇H₆₀ClN₂O₁₁ ⁺理论值：863.39(100％)、864.39(54.4％)、865.39(34.6％)。实测值：862.94、864.07、864.94。

式XXI的化合物                  式XXII的化合物

6-(荧光素-5-(和6-)-酰胺基)己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-酰胺。

将6-(3′，6′-二新戊酰荧光素-5-(和6-)-酰胺基)己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-酰胺(0.186g，0.216mmol)溶解在5ml甲醇中，并加入0.5ml 2M碳酸钠(水溶液)。反应混合物搅拌16小时，然后过滤。使用制备规模HPLC完成纯化。实现了结构异构体的分离。质谱：m/e C₃₇H₄₄ClN₂O₉ ⁺理论值：695.27(100.0％)、696.28(42.2％)、697.27(32.3％)。实测值：

式XXIII的化合物           式XXIV的化合物

{2-[2-(4-氯丁氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸蒽-9-基甲酯。

在惰性气氛下，用50ml圆底烧瓶盛装[2-(2-羟基乙氧基)-乙基]-氨基甲酸蒽-9-基甲酯(0.25g，0.74mmol)和新鲜氢化钠的60％矿物油分散液(150mg，3.75mmol)。加入10ml无水THF，搅拌反应物5分钟。此时用注射器加入1-氯-4-碘丁烷(180μl，1.5mmol)。将反应物于室温搅拌24小时。此时将硅胶60共吸附到反应混合物上，减压去除溶剂。首先用庚烷作为洗脱剂，接着用10％、20％和30％乙酸乙酯，开始硅胶柱层析。由合适级分中分离出总共0.1g产物(32％收率)：¹H NMR(CDCl₃)δ8.50(s，H-10)，8.40(d，H-1，8)，8.03(d，H-4，5)，7.53(dt，H-2，3，6，7)，6.15(s，CH₂-anth)，5.19(m，可交换，NH)，3.93-3.32(m，12H)1.69-1.25(m，4H)。质谱：m/e C₂₄H₂₈ClNO₄·H₂O理论值：447.18(100.0％)、448.18(27.1％)。实测值：447.17、448.41。

式XXV的化合物

2-(2-{2-[2-(2-氯乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-异吲哚-1，3-二酮。

用Nielsen，J.和Janda，K.D.(Methods：A Companion to Methods inEnzymology 6，361-371(1994))的方法制备2-(2-{2-[2-(2-羟基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-异吲哚-1，3-二酮。向配有回流冷凝器的25ml圆底烧瓶中加入该试剂，并加入约3mmol P/g(0.67g，2mmol)聚苯乙烯载的三苯基膦和6ml四氯化碳。用氩气对反应体系鼓泡，然后加热回流2小时。冷却时，再加入聚苯乙烯载的三苯基膦(0.1g，0.3mmol)，反应物再回流1小时。过滤冷却的溶液，再用四氯化碳清洗树脂。蒸发溶剂，获得0.4g(75.5％收率)的纯标题化合物：¹H NMR(CDCl₃)δ7.82(dd，2H)，7.69(dd，2H)，3.88(t，2H)，3.71(q，4H)，3.63-3.56(m，12H)。质谱：m/e C₁₆H₂₁ClNO₅ ⁺理论值：342.11(100.0％)、344.11(32.0％)。实测值：341.65、343.64。

式XXVI的化合物

2-[2-(2-{2-[2-(2-氯乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基]-异吲哚-1，3-二酮。

按照前述实例制备标题化合物，收率89％：¹H NMR(CDCl₃)δ7.77(dd，2H)，δ7.64(dd，2H)，3.83(t，2H)，3.67(m，4H)，3.60-3.52(m，14H)。质谱：m/e C₁₈H₂₅ClNO₆ ⁺理论值：386.14(100.0％)、388.13(32.0％)。实测值：385.88、387.83。

式XXVII的化合物

2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氯乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-异吲哚-1，3-二酮。

按照2-(2-{2-[2-(2-氯-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-异吲哚-1，3-二酮的合成制备标题化合物，收率92％：¹H NMR(CDCl₃)δ7.84(dd，2H)，7.71(dd，2H)，3.90(t，2H)，3.74(q，4H)，3.67-3.58(m，18H)。质谱：m/e C₂₀H₂₉ClNO₇ ⁺理论值：430.16(100.0％)。实测值：429.85。

式XXVIII的化合物

VI. 典型应用方法

本发明提供监测细胞中分子表达、定位和/或运输以及监测细胞内微环境变化的方法。在一个实施方案中，使用突变水解酶和对应的含官能团底物标记细胞(例如生物体或细胞培养物中的细胞)或细胞组分。例如，使细胞与突变水解酶编码载体，如编码突变水解酶和核定位信号融合体的载体接触。所述载体在细胞中的表达可为瞬时表达或稳定表达。然后所述细胞与突变水解酶识别的本发明底物接触。或者，细胞与载体和底物同时接触。然后检测或测定底物官能团在细胞、其裂解物或其亚细胞级分中的存在和定位。

本发明底物优选可溶于水性或大体水性的溶液，包括水和pH约大于或等于6的水性溶液。但是，本发明底物的母液在稀释入水溶液或缓冲液之前可溶解在有机溶剂中。优选的有机溶剂为非质子极性有机溶剂，例如DMSO、DMF、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙腈、二噁烷、四氢呋喃和其它可与水完全混溶的非羟基溶剂。一般来说，本发明底物的使用量是在合理时间内，在最小背景或非所需标记的情况下，检测含突变水解酶或其融合体的样品中官能团存在所需的最小量。所使用的本发明底物和对应突变水解酶的确切浓度取决于实验条件和需要的结果。本发明底物的浓度通常在纳摩尔至微摩尔的范围内。通过底物的系统变化测定本发明底物和对应突变水解酶所需要的浓度，直至实现令人满意的标记。根据本领域已知方法容意测定起始范围。

在一个实施方案中，使用含光学特性官能团的底物和突变水解酶标记样品。所述底物与含突变水解酶的目的样品混合一段时间，使突变水解酶足以结合底物，此后样品用选择用于激发官能团光学反应的波长的光照射。任选清洗样品，以去除残余、过量或未结合的底物。在一个实施方案中，通过进一步与标准品或预期反应比较光学反应，使用所述标记测定样品的具体特征。例如，使用突变水解酶结合底物监测样品具体组分在样品中的空间和时间分布。或者，使用突变水解酶结合底物检测或测定某些分子存在或量。在另一个实施方案中，使用突变水解酶结合底物分析样品中特异性响应官能团的分子的存在。

可检测的光学反应是指测试系统中通过直接观察或借助仪器能够感知的参数变化或出现。这种可检测反应包括颜色、荧光、反射率、化学发光、光偏振、光散射、X-射线散射的变化或出现。可检测的反应通常是荧光变化，例如荧光强度、激发或散射波长分布、荧光寿命、荧光极性或其组合的变化。可检测的光学反应可发生在含突变水解酶或其融合体的样品的所有部分，或者发生在含突变水解酶或其融合体的样品的局部部分。与标准反应或预期反应对比光学反应程度，运用该对比测定含突变水解酶或其融合体的样品是否具有已知特征以及达到何种程度。

在另一个实施方案中，官能团是接受分子的配体。通常，底物包含的官能团是特异性结合对的一员(配体)，互补成员(接受体)固定在固体或半固体表面上，例如聚合物、聚合膜或聚合颗粒(例如聚合珠)。代表性的特异性结合对包括生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白或抗生物素)、IgG和A蛋白或G蛋白、药物和药物受体、毒素和毒素受体、糖和凝集素或糖受体、肽和肽受体、蛋白和蛋白受体、酶底物和酶、有义DNA或RNA和反义(互补)DNA或RNA、激素和激素受体，以及离子和螯合剂。存在天然受体的配体包括天然和合成蛋白，包括抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白、抗体、酶和激素；核苷酸和天然或合成寡核苷酸，包括RNA以及单链和双链DNA的引物；脂质；多糖和糖；以及各种药物，包括治疗性药物及滥用药物和杀虫剂。当官能团为钙、钠、镁、钾或其它生物学重要的金属离子的螯合剂时，含这种官能团的底物起离子指示剂作用。或者，这种底物可起pH指示剂作用。离子指示剂的可检测光学反应是荧光变化。

含突变水解酶或其融合体的样品通常以被动方法标记，即与底物温育。但是，任何将底物引入到含突变水解酶或其融合体的样品中的方法，例如将底物微注射入细胞或细胞器中，都可用于将底物引入到含突变水解酶或其融合体的样品中。本发明底物在使用浓度中一般来说对活细胞或其它生物组分无毒。

含突变水解酶或其融合体的样品在与本发明底物接触后可立即观测。含突变水解酶或其融合体的样品在标记过程中任选与其它溶液混合，包括清洗溶液、透化和/或固定化溶液以及其它含另外的检测试剂的溶液。在与底物接触后进行清洗一般可改善对光学反应的检测，因为在清洗后非特异性本底下降。使用低标记浓度而不清洗有可能获得令人满意的影像。许多固定剂和固定化条件是本领域已知的，包括甲醛、多聚甲醛、福尔马林、戊二醛、冷甲醇和3∶1的甲醇：乙酸。固定化通常用于保存细胞形态学，并在使用病原样品的工作中降低生物危害。所选实施方案的底物完好地保留在细胞中。按照本领域周知的方法，固定化任选在透化之后或和透化一起，所述透化例如用丙酮、乙醇、DMSO或其它变性剂，以使大量本发明底物穿越细胞膜。底物的使用任选与其它检测试剂的使用组合，所述其它检测试剂由于在含突变水解酶或其融合体的样品中存在特定细胞组分、胞内物质或细胞环境而产生可检测反应。在所述其它检测试剂和底物的光谱特性不同时，有可能应用多色性。

在与含光学特性官能团的底物接触之后或过程中的任何时间，用产生可检测光学反应的波长的光照射含突变水解酶或其融合体的样品，并用检测光学反应的方法观测。尽管某些底物可使用环境光以比色法检测，但其它底物通过母体荧光团的荧光特性检测。在用例如紫外或可见波长发射灯、弧光灯、激光乃至日光或普通室内光照射时，包括结合互补性特异性结合对成员的底物在内的底物，表现出强烈的可见吸收以及荧光发射。选择用于照射本发明底物的设备包括但不限于手持式紫外灯、汞弧光灯、氙灯、氩激光器、激光器二极管和YAG激光器。这些发光源任选整合到激光扫描器、荧光微量培养板读数器、标准或小型荧光计或色谱检测器中。任选通过目测、或应用任一种以下设备：CCD照相机、摄影机、感光胶片、激光扫描仪、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞器、荧光微量培养板读数器、或通过放大信号如光电倍增管，检测该比色吸收或荧光发射。在使用流式细胞器、荧光显微镜或荧光计检测含突变水解酶或其融合体的样品时，这些设备任选用于辨别和区分含官能团(为荧光团)的底物和具有可检测的不同光学特征的第二荧光团，通常通过辨别底物和第二荧光团的荧光反应。在使用流式细胞器检测含突变水解酶或其融合体的样品时，含突变水解酶或其融合体的样品的检测任选包括使用分选仪，根据底物荧光反应分离含突变水解酶或其融合体的样品中的颗粒。

在一个实施方案中，可使用本发明突变水解酶的融合体监测胞内移动。例如，β-抑制蛋白是G蛋白偶联受体的调节剂，其激活时由胞质向细胞膜移动。含突变水解酶和β-抑制蛋白融合体的细胞和本发明底物使得可以检测β-抑制蛋白由胞质向细胞膜的移动，因为其与活化的G蛋白偶联受体相关。

在另一个实施方案中，FRET可与突变水解酶和荧光蛋白(例如GFP)的融合体一起使用，或与结合荧光分子的蛋白(例如O-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT))的融合体(Keppler等，2003)一起使用。或者，可使用突变水解酶和目标蛋白的融合体以及荧光蛋白和推测与目标蛋白相互作用的分子的第二种融合体研究目标蛋白与所述分子的相互作用，例如使用FRET。一种细胞可包含突变水解酶和目标蛋白的融合体，而另一种细胞可包含荧光蛋白和推测与目标蛋白相互作用的分子的第二种融合体。具有这两种细胞的群体可与底物和物质(例如药物)接触，此后监测细胞，以检测物质给予对两个群的影响。

在再另一个实施方案中，突变水解酶与荧光蛋白融合。因此可通过检测荧光蛋白或通过将细胞与本发明底物接触并检测底物中的官能团，检测细胞中的融合蛋白。荧光蛋白的检测可在官能团检测之前进行。或者，官能团的检测可在荧光蛋白检测之前进行。而且，这些细胞可与其它底物接触，例如具有不同官能团的底物，并检测细胞中的不同官能团，所述官能团共价连接至第一种底物先前未结合的突变水解酶。

在再另一个实施方案中，可使用突变水解酶和转录因子的融合体监测转录激活途径的激活。例如，突变水解酶与以失活形式存在于胞质中但激活时可转运至细胞核的转录因子(例如NFκβ)融合，可监测转录激活途径。

在另一个实施方案中，使用生物素作为底物中的官能团，融合体包含融合至推测与细胞中另一种分子(例如蛋白)相互作用的目标蛋白的突变水解酶。使用这种反应物使得可以捕获与细胞中融合至突变水解酶的蛋白相互作用的其它分子，由此鉴定和/或捕获(分离)相互作用分子。

在一个实施方案中，突变水解酶融合至分泌性蛋白。使用该融合体和本发明底物可检测和/或监测所述分泌性蛋白。同样，当突变水解酶融合至在不同囊泡腔之间转运的膜蛋白时，在底物存在的情况下，可检测这些腔体中的蛋白加工。在再另一个实施方案中，当突变水解酶融合至离子通道或转运蛋白或紧密结合通道或转运蛋白的蛋白时，在含离子敏感型荧光团的本发明底物存在的情况下，可监测离子穿越细胞膜或细胞器膜的移动。同样，当突变水解酶融合至与囊泡或细胞骨架结合的蛋白时，在底物存在的情况下，可容易地检测蛋白或囊泡沿着细胞骨架结构的转运。

在另一个实施方案中，所述官能团为药物或毒素。通过组合具有所述官能团的底物和突变水解酶与靶向分子(如抗体，例如结合具体肿瘤细胞相关抗原的抗体)的融合体，可将药物或毒素靶向细胞或动物中。或者，所述官能团可以为荧光团，当其存在于底物中并与突变水解酶和靶向分子(如单链抗体)的融合体混合时，标记靶向分子，例如用于体外应用如ELISA的标记抗体。

在再另一个实施方案中，细胞表面上的突变水解酶与细胞表面上表达的蛋白融合，当其与本发明底物(例如含荧光团的底物)混合时，可使用其监测体内或体外的细胞迁移(例如癌细胞迁移)。在一个实施方案中，本发明底物对细胞膜的透过性低甚至没有。或者，可使用这种体系监测不同物质(例如药物)对不同细胞群的作用。在再另一个实施方案中，突变水解酶融合至HERG通道。在含K⁺敏感型荧光团的本发明底物存在时，可使用表达这种融合体的细胞监测HERG通道活性，例如监测药物毒性。

在另一个实施方案中，本发明底物包含用于监测细胞或生物体中疏水区的官能团，例如Nile Red。

因此，所述突变水解酶和本发明底物可用于各种测定，例如噬菌体展示、淘选、ELISA、蛋白质印迹、荧光计微量测定技术(FMAT)以及细胞和亚细胞染色。

本发明将通过以下的非限制性实施例进一步描述。

实施例I

一般方法学

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科技术语都和分子生物学以及细胞信号转导和建模领域一般技术人员通常理解的含义相同。一般来说，本文使用的术语和下述光谱学、药物开发、细胞培养、分子遗传、塑料生产、聚合物化学、诊断学、氨基酸和核酸化学以及烷烃化学中的步骤在本领域众所周知并经常使用。标准技术通常用于塑料制备、信号检测、重组核酸方法、多核苷酸合成以及微生物培养和转化(例如电穿孔、脂转染)。

所述技术和步骤一般按照本领域的常规方法和各种一般参考文献(一般参见Sambrook等，Molecular Cloning：A laboratory manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，和用于荧光技术的Lakowicz，J.R.Principles of FluorescenceSpectroscopy，New York：Plenum Press(1983)，这些文献通过引用结合到本文中)以及本文中提供的参考文献进行。标准技术用于化学合成、化学分析和生物测定。

材料

所有的寡核苷酸都由Promega公司(Madison，WI)或衣阿华大学DNA实验室(Iowa City，Iowa)合成、纯化和测序。限制酶和DNA修饰酶得自Promega公司(Madison，WI)、New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)或Stratagene Cloning Systems(La Jolla，CA)，并按照生产商的方法使用。感受态大肠杆菌JM109由Promega公司提供，或购自Stratagene Cloning Systems。使用Qiagen Plasmid Mini Kit(QiagenInc.，Chatsworth，CA)进行小规模的质粒DNA分离。用购自StratageneCloning Systems的预试验试剂盒进行DNA连接。用购自Qiagen Inc的QIAquick凝胶提取试剂盒或QIAquick PCR纯化试剂盒纯化DNA片段。

用于产生DhaA突变体及其融合体的载体如下：pET21(Invitrogen，Carlsbad，CA)、pRL-null(Promega，Madison，WI)、pGEX-5x-3(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)以及EGFP和DsRED2(都得自CLONTECH，Palo Alto，CA)。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶和相关的缓冲液和染色剂，以及电印迹转移缓冲液，都得自BioWhittaker Molecular Applications(Rockland，ME)。蛋白分子量标准品购自Invitrogen。

Anti Flag^R单克隆抗体抗体(抗FLAG^R M2单克隆抗体(小鼠)(F3165))、Anti Flag^R M2 HRP缀合物和Anti Flag^R M2 FITC缀合物(分别为A8592和F4049)来自Sigma-Aldrich。单克隆抗-海肾荧光素酶抗体(MAB4410)来自Chemicon(Temecula，CA)。HRP-缀合的山羊抗-小鼠IgG和HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白(分别为W4021和G714)来自Promega公司。

1-Cl-丁烷、1-Cl-己烷、1-Cl-辛烷、1-Cl-癸烷、1-Cl-丁醇、1-Cl-己醇、1-Cl-辛醇和1-Cl-癸醇得自Aldrich或Fluka(USA)。所有的盐、磷酸二氢钾、磷酸一氢钾、咪唑、HEPES、EDTA钠、硫酸铵和Tris游离碱得自Fisher(Biotech Grade)。

谷胱甘肽Sepharose 4FF、谷胱甘肽、MonoQ和Sephadex G-25预填装柱得自Amersham Biosciences。

Luria-Broth (“LB”)由Promega公司提供。

方法

PCR反应。使用Promega公司提供的标准聚合酶链反应缓冲液进行DNA扩增。通常，50μl反应物包含1×浓度的生产商提供的缓冲液、1.5mM MgCl₂、125μM dATP、125μM dCTP、125μM dGTP、125μM dTTP、0.10-1.0μM正向和反向引物、5U AmpliTaq_ DNA聚合酶和＜1ng靶DNA。除非另有说明，否则DNA扩增的热程序是：94℃ 0.5分钟；55℃ 1分钟以及72℃ 1分钟，35个循环。

DNA测序。使用双脱氧末端循环测序法(Sanger等，1977)和Perkin-Elmer 310型DNA测序仪(Foster City，CA)，通过DNA测序验证所有克隆。

SDS-PAGE。将蛋白溶解在样品缓冲液(1％SDS、10％甘油和1.0mM β-巯基乙醇，pH 6.8；Promega公司)中，煮沸5分钟，并在SDS-PAGE(4-20％梯度凝胶；BioWhittaker Molecular Applications)上分离。用考马斯蓝(Promega公司)染色凝胶以进行蛋白质印迹分析，或者用荧光成像仪(Hitachi，Japan)以适于每种待评价荧光团的E_ex/E_em分析凝胶。

蛋白质印迹分析。用Xcell II Blot模块(Invitrogen)，以80mA恒定电流(于4℃)持续2.0小时，在25mM Tris碱/188mM甘氨酸(pH8.3)、20％(体积)甲醇中将蛋白电泳转移至硝酸纤维素膜(0.2μm，Scheicher & Schuell，Germany)上。用TBST缓冲液(10mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH7.6，含0.05％ Tween20)淋洗所述膜，并于室温30分钟或4℃过夜在封闭溶液(3％奶粉或1％BSA的TBST缓冲液)中温育。然后用50ml TBST缓冲液漂洗膜，并与Anti Flag^R单克隆抗体M2(稀释度1∶5,000)、抗海肾荧光素酶单克隆抗体(稀释度1∶5,000)或HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白(稀释度1∶1,000)于室温温育45分钟。接着用TBST缓冲液(50ml，5分钟，3次)漂洗膜。然后，将用抗体探测的膜与HRP-缀合的驴抗小鼠IgG温育(30分钟，室温)，接着重复漂洗步骤。用增强的化学发光(ECL)系统(Pharmacia-Amersham)按照生产商的说明显示蛋白。使用计算机辅助光密度分析法定量蛋白水平。

蛋白浓度。通过Pierce BCA蛋白测定(Pierce，Rockford，IL)的微量滴定方法，使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，检测蛋白。

统计分析。以一式四份进行的实验的平均值+/-S.E.M值表示数据，代表至少3个具有相似结果的独立实验。通过t检验评价统计显著性，当p＜0.05时认为显著。

细菌细胞。含带有紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)(DhaA)的pET-3a的Dh5α细胞原液由Clifford J.Unkefer博士(Los Alamos国家实验室，Los Alamos，NM)惠赠(Schindler等，1999；Newman等，1999)。使用Promega公司提供的预混合试剂在LB中培养细菌。使用大肠杆菌BL21(λDE3)pET-3a的冷冻母液(储存在10％甘油中，-80℃)接种补加氨苄青霉素(50μg/ml)的Luria-Bertani琼脂平板(Sambrook等，1989)。选择单一菌落，用其接种两个10ml含50μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基。于37℃振荡(220rpm)培养细胞8小时，此后各使用2ml接种两个50ml含50μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基，于37℃过夜振荡培养。使用各10ml该培养物接种两个0.5L含氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基。当培养物的A₆₀₀达到0.6时，加入异丙基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM，将培养物于30℃再振荡保持4小时。然后离心收集细胞，用10mM Tris-SO₄、1mM EDTA、pH7.5清洗。在裂解细胞之前将细胞沉淀储存于-70℃。

哺乳动物细胞。用Ham F12营养物和补加10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的Dulbecco改良型极限必须培养基的1∶1混合物，在95％空气和5％CO₂气氛下于37℃培养CHO-K1细胞(ATCC-CCL61)。

如下所述分离大鼠海马(E18)初级神经元。简而言之，分离得自Brewer博士(Southem Illinois University)的在Hibernate^TM E培养基(GIBCO，Invitrogen，Carlsbad，CA)中的胚胎(E18)大鼠海马碎片，将其接种在聚-D-溶素包被(0.28mg/cm²；Sigma)的玻璃/塑料器皿上，用具有B27添加物的无血清Neurobasal^TM培养基(NB27，GIBCO)培养。每2-3天更换全部培养基。

转染。为研究不同蛋白的瞬时表达，将细胞接种在35mm培养碟或24孔板上。约80-90％铺满时，按照生产商(GIBCO)的说明使细胞接触脂转染胺试剂/DNA/无抗生素培养基的混合物。第二天，用新鲜培养基更换培养基，使细胞生长不同的时间长度。

荧光。用荧光平板读数器CytoFluorII(Beckman)，以适于具体荧光团的E_ex/E_em(例如TAMRA的E_ex/E_em为540/575nm)检测96孔板中细胞的荧光。

                      实施例II

                   DhaA型束缚体系

A.野生型和突变DhaA蛋白及其融合体

紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)的卤代烷脱卤素酶是DhaA基因产物(分子量约33kDa)。该酶裂解脂肪族和芳族卤化化合物(例如卤代C₃-卤代C₁₀)中的碳-卤素键。DhaA的催化中心是典型的“催化三联体”，包含亲核残基、酸性残基和组氨酸残基。很可能是底物结合DhaA形成E.S复合物，此后亲核攻击Asp106，形成酯中间体，然后His272活化水解所述中间体的H₂O，由催化中心释放出产物。为测定催化性His272残基的点突变是否损害酶的酶活性，以便能够将官能团(FG)共价束缚至该蛋白，制备突变DhaA。

材料和方法

为制备突变DhaA载体，使用基于四引物重叠-延伸法的Promega体外诱变试剂盒(Ho等，1989)生产F、A、G或H突变的DhaA。外部引物是寡核苷酸5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAG-TCA-3′(SEQ ID NO：1)和5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGT-AGTCA-3′(SEQ ID NO：2)，内部诱变引物如下：H272F(5′-CCGGGATTG TTCTACCTCCAGGAAGAC-3′)，SEQ ID NO：3)、H272A(5′-CCGGGATTG GCCTACCTCCAGGAAGAC-3′；SEQ ID NO：4)、H272G  (5′-CCGGGATTG CAGTACCTCCAGGAAGAC-3′；SEQ IDNO：5)和H272Q(5′-CCGGGATTG GGCTACCTCCAGGAAGAC-3′；SEQ ID NO：6)(突变密码子加下划线)。将突变脱卤素酶基因亚克隆入pET-3a载体。为过表达突变脱卤素酶，将pET-3a载体转化入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中。通过DNA测序验证克隆中的DhaA序列。

通过将合适的DhaA编码区克隆入pGEX5x3载体的SalI/NotI位点，构建GST-DhaA(野生型或H272F/A/G/H突变体)融合表达盒。设计两种引物(5′-ACGCGTCGACGCCGCCATGTCAGAAATCGGT-ACAGGC-3′和5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCAAGCGCTTCAACCG-GTGAGTGCGGGGAGCCAGCGCGC-3′；分别为SEQ ID NO：7和8)，以将SalI位点和Kozak共有序列加入到DhaA的5′编码区，将NotI、EcoR47III和AgeI限制性位点和终止密码子加入到DhaA的3′编码区，并由DhaA(野生型或突变型)模板扩增897bp片段。将获得的片段插入到pGEX5X-3的SalI/NotI位点中，pGEX5X3载体含谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因、Xa因子裂解位点编码序列和多克隆位点(MCS)，后接终止密码子。

然后将Flag编码序列插入到pGEX5X-3载体中的AgeI/EcoR47III限制位点。与6个核苷酸AgeI位点读框相符的是11个氨基酸肽的序列，其最后的八肽对应于Flag肽(Kodak Imaging Systems，Rochester，NY)。编码Flag肽(Kodak Imaging Systems，Rochester，NY)的两种互补寡核苷酸(5′-CCGGTGACTACAAGGACGATGACGACAAGTGAA-GC-3′，有义，SEQ ID NO：9，和5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTC-CTTGTAGTCA3′，反义，SEQ ID NO：10)退火。退火DNA在5′末端具有AgeI位点，在3′末端具有EcoR47III位点。用AGgeI和EcoR47III消化退火DNA，然后将其亚克隆入GST-DhaA.WT或GST-DhaA.H272F突变体构建物的AgeI和EcoR47III位点。通过DNA测序检验所有的基因融合构建物。

为生产GST-DhaA融合蛋白，当培养物600nm光密度达到0.6时加入异丙基-β-D-半乳吡喃糖苷(终浓度为0.5mM)诱导酶表达。将细胞收集在缓冲液A(10mM Tris-SO₄、1mM EDTA、1mM β-巯基乙醇和10％甘油，pH7.5)中，并使用Vibra Cell^TM超声波仪(Sonics&Materials，Danbury，CT，USA)超声破碎。以19,800×g离心1小时去除细胞碎片。用GSS-Sepharose 4快速柱(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)按照生产商的说明对粗提物进一步纯化。合并含GST-DhaA融合蛋白的洗脱级分，对10mM Tris-SO₄缓冲液(含20mMNa₂SO₄和1mM EDTA-Na₂)于4℃过夜透析，并储存于-20℃，直至使用。为生产DhaA(野生型或突变型)，用Xa因子由融合蛋白上切下GST，用GSS-Sepharose 4(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)按照生产商的说明纯化产物。蛋白的均一性通过SDS-PAGE检验。在某些实验中，如Newman等(1999)所述使用45-70％饱和硫酸铵分级分离无细胞提取物。

结果

图3显示的浓条带为IPTG诱导产生的GST-DhaA.WT-Flag(泳道1)和GST-DhaA.H272F-Flag(泳道2)融合蛋白。而且，所述蛋白是可溶的，可用GSS-Sepharose 4FF有效纯化(泳道5-10，单数泳道对应于GST-DhaA.WT-Flag，而双数泳道对应于GST-DhaA.H272F-Flag)。用Xa因子处理融合蛋白导致形成两种蛋白GST和DhaA(野生型或突变型，分别为泳道11和12)，用GSS-Sepharose 4FF有效去除GST(野生型或突变型，分别为泳道13和14)。另外，所有蛋白都具有预计分子量。

B.H272突变对DhaA水解Cl-烷能力的损害

酶不能将酶反应产物释放到周围介质中是束缚系统必须的。可通过酶水解能力的显著降低检测此无能力。

为研究点突变对DhaA(野生型或突变型)水解Cl-烷能力的影响，使用Holloway等(1998)所述的pH-指示剂染料系统。

材料和方法

pH-指示剂染料系统的反应缓冲液由1mM HEPES-SO₄(pH8.2)、20mM Na₂SO₄和1mM EDTA组成。加入酚红至终浓度为25μg/ml。加入卤化化合物至表观浓度可确保溶解的底物组分足以满足脱卤素反应的最大速度。通过涡旋剧烈混合底物-缓冲溶液30秒，封盖以防止底物显著挥发，在1-2小时内使用。在每个动力学测定之前，用标准HCl溶液滴定酚红，以获得表观消除系数。于室温用BeckmanDu640分光光度计(Beckman Coulter，Fullerton，CA)以558nm测定DhaA的稳态动力学常数。使用计算机程序SigmaPlot由初速度计算动力学常数。1单位酶活性定义为在特定条件下1.0mM底物/分钟脱卤素化所需要的量。

结果

如图4所示，使用pH7.0-8.2的0.1mg/ml酶和10mM底物，用4种突变体中的任一种都没有发现催化活性。在这些条件下，野生型酶对1-Cl-丁烷的活性为5单位/mg蛋白。因此，突变体的活性至少降低700倍。

用浓度递增的(NH₄)₂SO₄处理得自表达DhaA(野生型或其中一种突变体)的大肠杆菌的等份上清液。使蛋白与各种浓度的(NH₄)₂SO₄接触2小时(4℃)，离心获得沉淀，对缓冲液A过夜透析，并用SDS-PAGE分离。

如图5所示，45-70％的(NH₄)₂SO₄沉淀了大部分的DhaA.WT和DhaA.H272F突变体级分。在低(NH₄)₂SO₄浓度时未观测到这些蛋白沉淀。相反，DhaA.H272Q、DhaA.H272G和DhaA.H272A突变体可被10％的(NH₄)₂SO₄沉淀。这强有力地表明，DhaA.H272Q、DhaA.H272G和DhaA.H272A突变体的物理化学特性明显改变。同时，DhaA.H272F突变对这些参数没有明显影响。这些数据与突变对DhaA 3-D结构影响的计算机建模结果良好吻合，表明在所测试的全部突变体中，只有DhaA.H272F突变对预测的三维模型没有显著影响(参见图2)。根据这些结果，选择DhaA.H272F进行下一步的实验。

为形成共价加合物，Cl-烷的氯原子很可能定位在DhaA(野生型或突变体)的催化氨基酸附近(图2)。DhaA的晶体结构(Newman等，1999)表明，这些氨基酸位于DhaA催化袋的较深底部(约10_长，横截面约20_²)。为使含官能团的DhaA底物中的反应基进入DhaA催化袋内部，设计连接基团连接具有官能团的含氯底物，以使官能团位于催化袋外部，即不扰乱/损坏DhaA的3-D结构。

为测定DhaA是否能够水解长疏水碳链的Cl-烷，使DhaA.WT接触各种Cl-烷醇。如图6所示，DhaA.WT可水解4-10个碳原子的1-Cl-烷醇。而且，Cl-烷的水解初速度(IRH)与碳链长度反相关，尽管长链Cl-烷在水性缓冲液中的溶解性差可能影响酶-底物相互作用的效力。实际上，如图6所示，1-Cl-烷-10-癸醇的IRH远高于1-Cl-癸烷的IRH。更重要的是，这些数据表明，DhaA可水解含相对极性基团(例如HO-基团)的Cl-烷。

制备具有不同长度和/或疏水性连接基团的FAM修饰Cl-烷(图7)。如果连接基团为12个或更多个原子长，则DhaA.WT有效水解具有大体积官能团(FAM)的Cl-烷。用任一种测试的Cl-烷都未检测到DhaA.H272F/A/G/Q突变体的活性(未列出数据)。另外，修饰临近Cl-原子的(CH₂)₆区导致DhaA.WT对14个原子连接基团的IRH显著降低。尽管如此，如果连接基团的长度和结构与水解酶催化位点相匹配，那么在本发明底物中存在的连接基团对反应基本没有影响。

用自动化HPLC(Hewlett-Packard 1050型)系统分析某些样品。设置DAD检测器来记录200-600nm范围内的UV-可见光谱。对于FAM-和TAMTA-修饰底物以分别等于480/520nm和540/575nm的E_ex/E_em检测荧光。使用分析型反相C₁₈柱(Adsorbosphere HS，5μ，150×4.6mm；Hewlett-Packard，Clifton，NJ)，在30分钟内用10mM乙酸铵(pH7.0)∶ACN(乙腈)由25∶75至1∶99(体积)的线性梯度，以1.0ml/分钟分析Cl-烷或Cl-烷水解产物的乙醇提取物。根据收集峰的积分面积定量分离的化合物。

图8A显示了底物和反应产物完全分离。图8B表明野生型DhaA非常有效地水解FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl。使用TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl或ROX.5-C₁₄H₂₄O₄-Cl作为底物时获得相似的结果(未列出数据)。总之，这些数据证实了基于pH-指示剂染料测定的结果，结果显示DhaA.H272F突变使DhaA完全失活。

C.官能团与DhaA突变体在体外的共价束缚

材料和方法

在威斯康星大学生物技术中心使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪Bruker Biflex III(Bruker，USA)对蛋白进行MALDI分析。为制备样品，在有或没有底物(FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl，1.0mM终浓度)时，将100μg纯化DhaA(野生型或H272F突变体)或GST-DhaA(野生型或H272F突变体)融合蛋白(纯化至约90％均一度)的200μl缓冲液(1mM HEPES-SO₄(pH7.4)、20mM Na₂SO₄和1mM EDTA)于室温温育15分钟。然后将反应混合物对20mM CH₃COONH₄(pH7.0)于4℃过夜透析，测定蛋白和蛋白底物复合物的M/Z值。

用于制备DhaA.D106突变体的寡核苷酸包括：用于DhaA.D106C的寡核苷酸：5′-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCACTGCTGGGGC-3′(SEQ ID NO：13)和5′-TGAGCCCCA GCAGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ ID NO：14)；用于DhaA.D106Q的寡核苷酸：5′-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCAC CAGTGGGGC-3′(SEQ ID NO：34)和5′-TGAGCCCCA CT GGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ IDNO：35)；用于DhaA.D106E的寡核苷酸：5′-CTTGGGTTTGGAAGA-GGTCGTCCTGGTCATCCAC GAATGGGGC-3′(SEQ ID NO：52)和5′-TGAGCCCCA TTCGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ ID NO：53)；以及用于DhaA.D106Y的寡核苷酸：5′-CTTGGGTTTGGAAG AGGTCGTCCTGGTCATCCAC TACTGGGGC-3′(SEQ ID NO：54)和5′-TGAGCCCCA GTAGTGGATGACCAG-GACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ ID NO：55)。退火寡核苷酸在5′末端含StyI位点，在3′末端含BlpI位点。用StyI和BlpI消化退火的寡核苷酸，将其亚克隆入GST-DhaA.WT或GST-DhaA.H272F的StyI和BlpI位点。通过DNA测序检验所有突变体。

结果

为证实DhaA.H272突变体能够结合具官能团的Cl-烷，将这些突变体或其GST-融合体以及对应的野生型蛋白或融合体与FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl、TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl、ROX.5-C₁₄H₂₄O₄-Cl或生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl于室温下接触15分钟。然后用SDS-PAGE分离蛋白。将含蛋白的凝胶与FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl、TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl或ROX.5-C₁₄H₂₄O₄-Cl温育，用荧光成像仪(Hitachi，Japan)以适于各个荧光团的E_ex/E_em进行分析。将与生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl温育的含蛋白凝胶转移至硝酸纤维素膜，用缀合HRP的链霉抗生物素蛋白探测。

如图9所示，TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl(图A中的泳道1和2)、FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl(图A中的泳道3和4)和ROX.5-C₁₄H₂₄O₄-Cl(图A中的泳道5和6)结合DhaA.H272F(图A中的泳道2、4和6)，但不结合DhaA.WT(图A中的泳道1、3和5)。生物素-C₁₈H₃₄O₄-Cl结合DhaA.H272F(图B中的泳道9-14)，但不结合DhaA.WT(图B中的泳道1-8)。而且，生物素-C₁₈H₃₄O₄-Cl与DhaA.H272F的结合(图B中的泳道9-14)是剂量依赖性的，可在0.2μM时检测到。另外，底物和DhaA.H272F之间的键非常强，因为用SDS煮沸没有破坏该键。

所有测试的DhaA.H272突变体，即H272F/G/A/Q，都结合TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl(图10)。此外，DhaA.H272突变体以高度特异性方式结合底物，因为用其中一种底物(生物素-C₁₈H₃₄O₄-Cl)预处理突变体完全封闭了与另一种底物(TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl)的结合(图10)。

为测定Cl-烷和DhaA.H272F突变体(或GST-DhaA.H272F突变体融合蛋白)之间键的特性，在有和没有FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl时温育这些蛋白，并用MALDI分析。如图11所示，DhaA.H272F突变体和FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl之间的键很强。而且，对E^*S复合物的分析表明，底物(例如FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl)和DhaA.H272F之间的键为共价性质。MALDI-TOF分析也证实，底物/蛋白加合物以1∶1的关系形成。

制备在催化三联体中的另一个残基—残基106突变的DhaA。野生型DhaA的106位残基为D，D是已知的亲核氨基酸残基之一。用非D亲核氨基酸残基如C、Y和E置换DhaA中残基106的D，它们可与底物形成的键比野生型DhaA和底物形成的键更稳定。具体地说，半胱氨酸在基于半胱氨酸的酶中是已知的亲核残基，这些酶已知不活化水。

分析对照突变体DhaA.D106Q、单突变体DhaA.D106C、DhaA.D106Y和DhaA.D106E以及双突变体DhaA.D106C：H272F、DhaA.D106E：H272F、DhaA.D106Q：H272F和DhaA.D106Y：H272F结合TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl的情况(图12)。如图12所示，TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl结合DhaA.D106C、DhaA.D106C：H272F、DhaA.D106E和DhaA.H272F。因此，TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl和突变体DhaA残基106的半胱氨酸或谷氨酸形成的键比TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl和野生型DhaA形成的键稳定。单独或与DhaA中其它残基置换组合的DhaA106位其它置换可获得相似的结果。此外，单独或与DhaA中其它残基置换组合的DhaA106位某些置换可导致突变DhaA仅与某些底物形成键。

                      实施例III

   荧光素酶经突变DhaA和本发明底物束缚至固相支持体

材料和方法

通过将phRLuc编码区克隆入含豆蔻酸附着肽编码序列(MAS)的pCIneo载体的NheI/SalI位点，构建phRLuc-连接基团-DhaA.WT-Flag和phRLuc-连接基团-DhaA.H272F-Flag融合表达盒。设计两种引物(5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3′；SEQ ID NO：11和5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3′；SEQ  IDNO：12)，以分别将NheI和SalI位点加入到phRLuc的5′和3′编码区，并由phRLuc模板(pGL3载体，Promega)扩增900bp的片段。然后，用NheI和SalI限制酶切去豆蔻酸附着肽编码序列，将含phRLuc的扩增片段插入到pCIneo.DhaA.(野生型或H272F)-Flag载体的NheI/SalI限制位点。通过DNA测序检验每种构建物的序列。然后使用Promega的TNT_T7Quick系统体外生产融合蛋白。

结果

为证明蛋白经DhaA.H272F-Cl-烷桥束缚至固相支持体，制备编码海肾荧光素酶(hRLuc，融合体的N-末端)、蛋白连接基团(17个氨基酸，参见表I)和DhaA(野生型或H272F突变体)融合蛋白的载体。然后将Flag表位融合至DhaA的C-末端。

                                    表I

融合体	序列	肽连接基团
			GST-DhaAGFP-DhaADhaA-RlucRluc-DhaADhaA-Flag	atcgaaggtcgtgggatccccaggaattcccgggtcgacgccgcc(SEQ ID NO：26)tccggatcaagcttgggcgacgaggtggacggcgggccctctagagccacc(SEQ ID NO：28)accggttccggatcaagcttgcggtaccgcgggccctctagagcc(SEQ ID NO：30)tccggatcaagcttgcggtaccgcgggccctctagagccgtcgacgccgcc(SEQ ID NO：32)Accggt	iegrgiprnsrvdaa(SEQ ID NO：27)sgsslgdevdggpsrat(SEQ ID NO：29)tgsgsslryrgpsra(SEQ ID NO：31)sgsslryrgpsravdaa(SEQ ID NO：33)Tg

SDS-PAGE后蛋白质印迹分析的结果显示，蛋白具有其预测分子量，被抗-R.Luc和抗Flag^R M2抗体识别。另外，所有的融合蛋白都具有海肾荧光素酶活性(用Promega的海肾荧光素酶测定系统在PBS pH7.4缓冲液中测定)。

使用生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl作为底物，链霉抗生物素蛋白(SA)包被的96孔平板(Pierce，USA)作为固相支持体，显示蛋白经DhaA.H272F-Cl-烷桥束缚至固相支持体。翻译蛋白与25μM(终浓度)的生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl底物于室温接触60分钟。用Sephadex G-25预填装柱(Amersham Biosciences)通过凝胶过滤去除未结合的生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl。将收集的R.Luc-连接基团-DhaA融合体级分在SA-包被的96孔平板上于室温放置1小时，洗去未结合的蛋白，检测荧光素酶活性。

图13A显示了捕获在平板上的海肾荧光素酶活性。分析这些数据表明，仅捕获了含突变DhaA的融合体。捕获的效力非常高(加到板上的海肾荧光素酶活性捕获了50％以上)。相反，对含野生型DhaA以及海肾荧光素酶的融合体的捕获效力小得可以忽略不计(＜0.1％)。用非生物素化底物(TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl)预处理R.Luc-连接基团-DhaA.H272F降低捕获效力约80％。而且，非生物素化底物预处理对捕获R.Lue-连接基团-DhaA.WT或海肾荧光素酶没有影响。

总之，这些数据证明，活性酶(例如海肾荧光素酶)可束缚至构成本发明底物(Cl-烷-DhaA.H272F-桥)部分的固相支持体，并保持酶活性。

                      实施例IV

               体内突变DhaA和底物系统

A.官能团与DhaA突变体的体内共价束缚：原核生物和真核生物中

材料和方法

为研究本发明底物与在原核生物中表达的突变水解酶的结合，用pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag或pGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag转化大肠杆菌细胞BL21(λDE3)pLys65，在液体培养基中生长，用IPTG诱导。向诱导细胞中加入TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl或生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl(终浓度25μM)。1小时后收获细胞，用冷PBS(pH7.3)清洗，超声破碎，以19,800×g离心1小时分离。可溶性组分进行SDS-PAGE。用荧光成像仪分析具有分离自TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl处理细胞的蛋白的凝胶，而将生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl处理细胞的蛋白转移至硝酸纤维素膜，用HRP缀合的链霉抗生物素蛋白探测。

为研究TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl在哺乳动物细胞中的结合，分别从pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag或pGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag切下DhaA.WT-Flag和DhaA.H272F-Flag编码区，凝胶过滤，并插入至pCIneo.CMV载体(Promega)的SalI/NotI限制性位点。通过DNA测序验证所述构建物。

将CHO-K1细胞放置在24孔板(Labsystems)上，用pCIneo-CMV.DhaA.WT-Flag或pCIneo-CMV.DhaA.H272F-Flag载体转染。24小时后，用含25μM TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl的新鲜培养基置换培养基，将细胞放置于CO₂培养箱中60分钟。温育后，去除培养基，用PBS(pH7.4；4次连续清洗：1.0ml/cm²；每次5秒)快速清洗细胞，用相同缓冲液(1％SDS、10％甘油等；250μl/孔)溶解细胞。用SDS-PAGE(4-20％梯度凝胶)分离蛋白(10μl/泳道)，用荧光成像仪(Hitachi，Japan)以等于540/575nm的E_ex/E_em检测TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl的结合。

结果

图14A和B显示生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl(A)和TAMRA-C₁₂H₂₄O₄-Cl(B)与大肠杆菌蛋白的体内结合。图14A上的低分子量条带是HRP-SA识别的大肠杆菌蛋白，而图B底部检测的荧光是游离TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl的荧光。图15显示TAMRA-C₁₂H₂₄O₄-Cl与真核细胞蛋白的体内结合。

图14和图15的分析显示，是DhaA.H272F-Flag突变体而不是DhaA.WT-Flag体内结合TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl或生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl。而且，DhaA.H272F-Flag和底物之间的键非常强(可能是共价键)，因为与SDS煮沸接着SDS-PAGE没有破坏突变酶和底物之间的键。

B.细胞膜对本发明底物的通透性

材料和方法

以Ham F12营养物和补加10％胎牛血清(FBS)、100U/ml苄青霉素和100mg/ml链霉素的Dulbecco改良型极限必须培养基的1∶1混合物，在95％空气和5％CO₂气氛下于37℃培养CHO-K1细胞(ATCC-CCL61)。

为研究不同底物的摄取，将细胞以30,000细胞/cm²的密度放置在LT-II室(Nunc)或96孔板(Labsystems)中。第二天，用含不同浓度底物的培养基置换培养基，将细胞放置回CO₂培养箱中2、5或15分钟。在温育结束时，去除含底物的培养基，用PBS(pH7.4；4次连续清洗：1.0ml/cm²；每次5秒)快速清洗细胞。然后向细胞中加入新鲜培养基，将细胞放回37℃的CO₂培养箱中。用荧光板读数器CytoFluor II(Beckman)以等于480/520nm和540/575nm的E_ex/E_em(分别用于FAM-和TAMRA-修饰的底物)检测96孔板中的细胞荧光水平。用配有适于检测FITC和TAMRA的滤光片单元的倒置落射荧光显微镜Axiovert-100(Carl Zeiss)获取细胞的荧光图像。

结果

如图16所示，TAMRA-C₁₄H₂₈O₄-Cl(25μM，37℃，5分钟)处理的CHO-K1细胞可快速有效地加载TAMRA-C₁₄H₂₈O₄-Cl。图像分析表明，荧光染料穿透了细胞膜。图16还显示TAMRA-C₁₄H₂₈O₄-Cl可被有效地洗出细胞。总之，这些数据表明，TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl可穿透CHO-K1细胞的质膜。

相反，即使细胞用高浓度(即100μM)的FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl和更长的时间(60分钟)预处理(未列出数据)，FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl也不能穿透CHO-K1细胞的质膜。因此，细胞质膜对本发明各种底物(例如TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl和FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl)的不同通透性提供了用不同荧光团标记细胞表面和细胞内部所表达蛋白的独特机会，由此使得可以双线程检测(biplexing)。

                      实施例V

         用于体内细胞成像的基于DhaA的束缚

A.GFP和TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl在活体哺乳动物细胞中的共定位

材料和方法

通过用DhaA.WT-Flag或DhaA.H272F-Flag编码区置换编码GFP-DEVD-Rluc(h)的Packard载体(Packard #6310066)中的海肾荧光素酶编码区，构建GFP-连接基团-DhaA融合表达盒。设计两种引物(5′-GGAAT GGGCCCTCTAGAGCGACGATGTCA-3′；SEQ ID NO：15和5′-CAGTCAGTCACGAT GGATCCGCTCAA-3′；SEQ ID NO：16)，以分别将ApaI和BamHI位点(加下划线)加入到DhaA的5′和3′编码区，并由pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag或pGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag模板扩增980bp的片段。用ApaI和BamHI限制酶切出R.Luc编码区。然后将含DhaA的980bp片段插入到GFP-DEVE-Rluc(h)编码载体的ApaI/BamHI位点。基因融合构建物的序列通过DNA测序检验。

将瞬时表达GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag或GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag融合蛋白的细胞以30,000细胞/cm²的密度置于LT-II室(Nunc)中。第二天，用含25μM TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl的新鲜培养基置换培养基，将细胞放置回CO₂培养箱中60分钟。在温育结束时，去除含底物的培养基，用PBS(pH7.4；4次连续清洗：1.0ml/cm²；每次5秒)快速清洗细胞，然后向细胞中加入新培养基。将细胞放回CO₂培养箱中，60分钟后用PBS(pH7.4；4次连续清洗：1.0ml/cm²；每次5秒)快速清洗细胞。用配有适于检测GFP和TAMRA的滤光片单元的倒置落射荧光显微镜Axiovert-100(Carl Zeiss)获取细胞的荧光图像。

结果

如图17的图象所示，用GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag或GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag转染的细胞显示出具有GFP光发射特征的蛋白强烈表达。分析用TAMRA-滤光片单元获取的相同细胞图象显示，表达GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag的细胞是黑色的，无法与不表达该融合蛋白的细胞区分开来。相反，表达GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag的细胞非常明亮，可清楚识别。

对从用GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag或GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag载体转染的CHO-K1细胞分离的蛋白进行蛋白质印迹分析，结果显示这些细胞表达的蛋白可由抗-Flag抗体识别，具有融合蛋白的预测分子量(未列出数据)。对含这些蛋白的SDS-PAGE凝胶进行荧光扫描显示，TAMRA与GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag强/共价结合，但不与GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag结合(图18)。

B.DhaA.WT-Flag和DhaA.H272F-Flag中的DhaA融合部分有功能

为测定两种蛋白的融合体是否导致一种或两种蛋白活性丢失，制备了几种在融合体的C-末端或N-末端具有DhaA、并在两种蛋白之间具有连接基团序列(如具有13-17个氨基酸的连接基团序列)的基于DhaA的融合蛋白(参见表II)。数据显示融合体中两种蛋白的功能活性都得到保存。

                                表II

N-末端蛋白	连接基团	C-末端蛋白	蛋白#1的功能	蛋白#2的功能
					GST	+	DhaA.H272F	结合GSS柱	结合
GFP	+	DhaA.H272F	绿色荧光	结合
					R.Luc	+	DhaA.H272F	水解腔肠素(coelenterazine)	结合
DhaA.H272F	+	R.Luc	结合	水解腔肠素
					DhaA.H272F	+	Flag	结合	被抗体识别

C.Cl-烷的毒性

材料和方法

为研究Cl-烷的毒性，将CHO-K1细胞以5,000细胞/孔的密度置于96孔板中。第二天，用含0-100μM浓度Cl-烷的新鲜培养基更换培养基，将细胞放回CO₂培养箱中放置不同的时间段。用CellTiter-Glo^TM发光细胞活力测定(Promega)按照生产商的方法检测细胞存活率。一般来说，将100μl CellTiter-Glo^TM试剂直接加入细胞中，使用DYNEX MLX微量滴定板发光计以10分钟间隔记录发光。在某些实验中，为防止荧光/发光干扰，去除含荧光Cl-烷的培养基，用PBS(pH7.4；4次连续清洗：1.0ml/cm²；每次5秒)快速清洗细胞，然后加入CellTiter-Glo^TM试剂。对照实验表明，该步骤对CellTiter-Glo^TM测定的敏感性和精确度没有影响。

结果

如图19所示，TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl即使在以100μM浓度(最高测试浓度)处理4小时后也显示出对CHO-K1细胞无毒。处理24小时后，于6.25μM浓度(“最大无毒浓度”)未检测出毒性。浓度大于6.25μM时，CHO-K1细胞的相对发光以剂量依赖方式降低，IC₅₀约为100μM。即使在以100μM处理24小时后也没有观测到生物素-C₁₈H₃₄O₄-Cl的毒性。相反，ROX5-C₁₄H₂₄O₄-Cl具有显著的毒性作用，因为在处理1小时后可检测出CHO-K1细胞中RLU降低。该作用的IC₅₀值约为75μM，25μM浓度时ATP无明显降低。ROX5-C₁₄H₂₄O₄-Cl毒性的IC₅₀值和ROX5-C₁₄H₂₄O₄-Cl的“最大无毒浓度”以时间依赖方式降低，分别达到12.5μM和6.25μM。

D.检测与含TAMRA-或DiAc-FAM-底物和固定剂接触的CHO细胞 中的DhaA.D106C

将CHO细胞(ATCC，第4代)以低密度接种到8孔室形载玻片(German coverglass system)的DMEM：F12培养基(Gibco)中，该培养基含10％FBS和1mM谷氨酰胺(生长培养基)，没有抗生素。2天后，使用倒置相差显徽镜观察细胞。在应用转染试剂前确认两种视觉基准：1)每个室的细胞融合水平约为60-80％；2)＞90％的细胞粘附，并显示出扁平形态。用150μl新鲜预温生长培养基置换培养基，温育细胞约1小时。

使用TransIt TKO系统(Miris)转染细胞。通过每100μl无血清DMEM：F12培养基加入7μl脂质稀释TKO脂质，然后每100μl含脂质培养基加入1.2μg转染级DhaA.D106C DNA。将混合物于室温温育15分钟，然后将25μl等份转移入单个培养室中(0.3μg DNA)。将细胞放回培养箱中5-6小时，用生长培养基清洗两次，加入300μl新鲜生长培养基，然后再温育细胞24小时。

将转染或未转染的对照细胞与12.5μM TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl或12.5μM DiAc-FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl的10％FBS/DMEM溶液在37℃和5％CO₂中温育30分钟。用温生长培养基清洗细胞3次，加入300μl新鲜培养基，然后温育细胞1小时。

用温PBS置换生长培养基，用配有罗丹明滤光片单元(激发滤光片＝540，发射滤光片＝560LP)和荧光滤光片单元(激发滤光片＝490，发射滤光片＝520)以及Spot CCD照相机的Zeiss Axiovert 100倒置显微镜显示活细胞。以曝光时间0.15-0.60秒、增益调整4或16捕获图像。

分散的和特异性标记的转染细胞在TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl和DiAc-FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl标记细胞中都很明显。大部分细胞是非转染细胞，它们没有保留标记。

去除PBS，用3.7％多聚甲醛/0.1％Triton的PBS溶液固定细胞15分钟。去除固定剂，加入PBS，捕获TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl和DiAc-FAM-C₁₄H₂₄O₄-Cl标记细胞的第二组图像。

用50％甲醇的PBS溶液置换PBS，温育细胞15分钟，接着在95％甲醇中温育15分钟。捕获第三组图像，然后将等体积的甲醇和丙酮混合物涂抹在细胞上，温育15分钟。用PBS置换培养基，获得第四组图像。

结果表明底物与DhaA.D106C突变体的结合在用多聚甲醛固定以及随后以甲醇和丙酮处理固定细胞样品后稳定。而且，TAMRA或FAM荧光的亮度在这些条件下没有改变。

                      实施例VI

            基于突变β-内酰胺酶(blaZ)的束缚

丝氨酸-β-内酰胺酶赋予细菌对β-内酰胺抗生素的抗性，其可能使用丝氨酸残基(Ambler等(1991)A类公认编号体系中的Ser70)上的羟基降解多种β-内酰胺化合物。反应由形成前共价遭遇络合物(图20A)开始，经高能酰化四面体中间体(图20B)形成瞬时稳定酰化酶中间体，通过催化残基Ser70形成酯(图20C)。随后，酰化酶受到水解水攻击(图20D)，形成高能脱酰化中间体(图20E)(Minasov等，2002)，其崩解形成水解产物(图20F)。然后排出产物，再生游离酶。如同在丝氨酸蛋白酶中一样，该机制需要催化碱基以活化丝氨酸亲核体，攻击底物的酰胺键，在形成酰化酶中间体后活化水解水攻击加合物的酯中心。

A.突变β-内酰胺酶及其融合体

材料和方法

携带质粒pTS32的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PClblaZ基因(Zawadzke等，1995)由O.Herzberg博士(University ofMaryland Biotechnology Institute)惠赠。blaZ基因序列如下：

AGCTTACTAT GCCATTATTA ATAACTTAGC CATTTCAACA

CCTTCTTTCA AATATTTATAATAAACTATT GACACCGATA

TTACAATTGT AATATTATTG ATTTATAAAA

ATTACAACTGTAATATCGGA GGGTTTATTT TGAAAAAGTT

AATATTTTTA ATTGTAATTG CTTTAGTTTTAAGTGCATGT

AATTCAAACA GTTCACATGC CAAAGAGTTA AATGATTTAG

AAAAAAAATATAATGCTCAT ATTGGTGTTT ATGCTTTAGA

TACTAAAAGT GGTAAGGAAG TAAAATTTAATTCAGATAAG

AGATTTGCCT ATGCTTCAAC TTCAAAAGCG ATAAATAGTG

CTATTTTGTTAGAACAAGTA CCTTATAATA AGTTAAATAA

AAAAGTACAT ATTAACAAAG ATGATATAGTTGCTTATTCT

CCTATTTTAG AAAAATATGT AGGAAAAGAT ATCACTTTAA

AAGCACTTATTGAGGCTTCA ATGACATATA GTGATAATAC

AGCAAACAAT AAAATTATAA AAGAAATCGGTGGAATCAAA

AAAGTTAAAC AACGTCTAAA AGAACTAGGA GATAAAGTAA

CAAATCCAGTTAGATATGAG ATAGAATTAA ATTACTATTC

ACCAAAGAGC AAAAAAGATA CTTCAACACCTGCTGCCTTC

GGTAAGACCC TTAATAAACT TATCGCCAAT GGAAAATTAA

GCAAAGAAAACAAAAAATTC TTACTTGATT TAATGTTAAA

TAATAAAAGC GGAGATACTT TAATTAAAGACGGTGTTCCA

AAAGACTATA AGGTTGCTGA TAAAAGTGGT CAAGCAATAA

CATATGCTTCTAGAAATGAT GTTGCTTTTG TTTATCCTAA

GGGCCAATCT GAACCTATTG TTTTAGTCATTTTTACGAAT

AAAGACAATA AAAGTGATAA GCCAAATGAT AAGTTGATAA

GTGAAACCGCCAAGAGTGTA ATGAAGGAAT TTTAATATTC

TAAATGCATA ATAAATACTG ATAACATCTTATATTTTGTA

TTATATTTTG TATTATCGTT GAC(SEQ ID NO：36).

通过将点突变导入balZ基因，并将balZ编码区克隆入pGEX5x3载体的SalI/AgeI位点，构建GST-blaZ(野生型和E166D、N170Q或E166D：N170Q突变体)融合表达盒。内部诱变引物如下：E166D(5′-CCAGTTAGATATGACATAGAATTAAATTACTATTCACC-3′，SEQID NO：56；5′-GGTGAATAGTAATTTAATTCTATGTCATATCTAACTGG-3′，SEQ ID NO：57)；N170Q(5′-CCAGTTAGATATGAGATAGAATTACAGTACTATTCACC-3′，SEQ ID NO：58；和5′-GGTGAATAGTACTGTAATTCTATCTCATATCTAACTGG-3′，SEQ ID NO：59)；E166D：N170Q(5′CCAGTTAGATATGACATAGAATTACAGTACTATTCACC-3′；SEQ ID NO：60和5′-GGTGAATAGTACTGTAATTCTATGTCATATCTAACTGG-3；SEQ ID NO：61)。设计两种外部引物(5′-CAACAGGTCGACGCCGCCATGAAAGAGTTAAATGATTTAG-3′，SEQ ID NO：62；和5′-GTAGTCACCGGTAAATTCCTTCATTACACTCTTGGC-3′，SEQ ID NO：63)，以将N-末端SalI位点和Kozak序列加入到blaZ的5′编码区，将AgeI位点加入到blaZ的3′编码区，并由blaZ.WT模板扩增806bp的片段。将获得的片段插入到载体pGEX-5X-3的SalI/AgeI位点中，载体pGEX-5X-3含谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因、Xa因子切割位点编码序列和多克隆位点(MCS)，后接Flag编码序列和终止密码子。这些基因融合构建物通过DNA测序确认。

在感受态大肠杆菌BL21(λDE3)细胞中过表达GST-blaZ(野生型或突变体)融合蛋白，基本如对DhaA和GST-DhaA融合蛋白的描述进行纯化(除了使用磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 6.8)代替缓冲液A)。蛋白均一性通过SDS-PAGE验证。

发色底物6-β-[(呋喃基丙烯酰氨基]青霉烷酸三乙胺盐(FAP)购自Calbiochem(La Jolla，CA)。用Beckman Du640分光光度计(BeckmanCoulter，Fullerton，CA)根据344nm吸光度的损失(ΔE＝1330M^-1cm^-1)监测FAP水解。全部检测都在25℃于pH6.8的0.1M磷酸钾缓冲液中进行。

在CCF2中，头孢菌素内核将7-羟基香豆素连接至荧光素。对于完整分子，激发香豆素(E_ex-409nm)导致FRET至荧光素，发射绿光(E_em-520nm)。用β-内酰胺酶裂解CCF2导致两种染料空间分离，破坏了FRET，使得现在激发香豆素产生蓝色荧光(E_ex-477nm)。CCF2购自Aurora Biosciences Corporation(San Diego，CA)。使用荧光多孔板读数器CytoFluorII(PerSeptive Biosystems，Framingham，MA，USA)检测FRET信号的减少和蓝色荧光的增加。

结果

所有的β-内酰胺酶，包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PCl的β-内酰胺酶，都水解不同化学结构的β-内酰胺。水解效力取决于酶的类型和底物化学结构。青霉素被认为是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PCl β-内酰胺酶的优选底物。

如Zawadzke等(1995)所述研究了点突变对β-内酰胺酶水解青霉素能力的影响。如图20所示，GST-β-内酰胺酶PCl融合蛋白有效水解FAP。即使在共温育60分钟后也没有检测到blaZ.E166D、blaZ.N170Q或blaZ.E166D：N170Q blaZ突变体水解FAP。因此，这些突变导致blaZ显著失活。

为显示blaZ.E166D、blaZ.N170Q或blaZ.E166D：N170Q突变体结合β-内酰胺，由此可将不同的官能团经β-内酰胺束缚至这些蛋白，将这些突变体的GST融合体与荧光青霉素BOCELLIN^TM FL(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR)温育。用SDS-PAGE分离蛋白，用荧光成像仪(Hitachi，Japan)以适于具体荧光团的E_ex/E_em分析。图22的数据显示所有的blaZ突变体都结合BOCELLIN。而且，blaZ突变体和荧光底物之间的键非常强，可能是共价的，因为与SDS煮沸接着SDS-PAGE没有破坏该键。此外，双突变体blaZ.E166D：N170Q的结合效力(根据蛋白-结合荧光团的荧光信号强度判断)远高于任一种单突变体的结合效力，而blaZ.N170Q的结合效力高于blaZ.E166D的结合效力。这些数据结合目前理解的单个氨基酸在β-内酰胺水解中的作用表明，额外的突变(例如辅助氨基酸的突变)可提高官能团与突变蛋白束缚的效力。

还使用Zlokarnik等(1998)描述的基于FRET的底物CCF2研究了点突变对β-内酰胺酶水解头孢菌素能力的影响。如图23所示，GST-β-内酰胺酶PCl融合蛋白有效水解CCF2(泳道2)。单点突变(即E166D或N170Q)降低了融合蛋白水解CCF2的能力(泳道3和4)。替换两个氨基酸(blaZ.E166D：N170Q突变体，泳道5)甚至更显著地影响CCF2水解。但是，所有的blaZ突变体都能够水解CCF2。

因此，在166或170位的氨基酸置换，例如Glu166Asp或Asn170Gly，能使突变β-内酰胺酶捕获底物，因此将底物官能团经稳定(例如共价)键束缚至突变β-内酰胺酶。而且，对H₂O活化具有辅助作用的氨基酸的突变增加了束缚效力。

                      实施例VII

将DhaA.H272F靶向活细胞的胞核和胞质

材料和方法

通过将NLS3编码序列(猿猴病毒大T抗原核定位信号(NLS)的三个串联重复)插入到pCIneo.GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag载体的AgeI/BamHI位点，构建GFP-连接基团-DhaA.H272F-NLS3融合表达盒。退火两种编码NLS3肽的互补寡核苷酸(5′-CCGGTGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTATGAG-3′，有义，SEQ ID NO：37，和5′-GATCCTCATACCTTTCTCTTCTTT-TTTGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCA-3′，反义，SEQ ID NO：38)。退火DNA在5′末端具有AgeI位点，在3′末端具有BamHI位点。将退火DNA亚克隆入GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag构建物的AgeI/BamHI位点。基因融合构建物的序列通过DNA测序确认。

通过用DhaA.H272F-Flag编码区替换编码GFP²-β-抑制蛋白2的Packard载体(Packard#6310176-1F1)中的pGFP²编码区，构建DhaA.H272F-β-抑制蛋白2融合表达盒。设计两种引物(5′-ATTATGCTGAGTGATATCCC-3′；SEQ ID NO：39和5′-CTCGGTACCAAGCTCCTTGTAGTCA-3′；SEQ ID NO：40)，以将KpnI位点插入到DhaA的3′编码区，并由pGEX5X-3.DhaA.H272F-Flag模板扩增930bp的片段。用NheI和KpnI限制酶切除pGFP²编码区，然后将含编码DhaA.H272F的片段插入到GFP²-β-抑制蛋白2编码载体的NheI和KpnI位点。融合构建物的序列通过DNA测序确认。

将瞬时表达GFP-连接基团-DhaA.H272F-NLS3、GFP²-β-抑制蛋白2或DhaA.H272F-β-抑制蛋白2融合蛋白的CHO-K1细胞或3T3细胞以30,000细胞/cm²的密度置于LT-II室(Nunc)中。第二天，用含25μM TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl的新鲜培养基置换培养基，将细胞放置回CO₂培养箱中60分钟。在温育结束时，去除底物培养基，用PBS(pH7.4；4次连续清洗：1.0ml/cm²；每次5秒)快速清洗细胞，然后向细胞中加入新培养基。将细胞放回CO₂培养箱中，60分钟后用PBS(pH7.4；1.0ml/cm²)快速清洗细胞。用配有适于检测GFP和TAMRA的滤光片单元的聚焦显微镜Pascal-5(Carl Zeiss)获得细胞的荧光图像。

结果

如图24的图像所示，GFP和TAMRA共定位于GFP-连接基团-DhaA.H272F-NLS3表达细胞的细胞核中，并与TAMRA-C₁₄H₂₄O₄-Cl相连。

如图25的图像所示，GFP-β-抑制蛋白2表达细胞具有典型的β-抑制蛋白2胞质定位。DhaA.H272F-β-抑制蛋白2的SDS-PAGE凝胶的荧光扫描显示，含DhaA底物的TAMRA与表达DhaA.H272F-β-抑制蛋白2的细胞强结合。

实施例VIII

定点诱变DhaA催化残基130

卤代烷脱卤素酶使用三步机制裂解碳-卤素键。该反应由亲核残基、碱性残基和酸性残基组成的氨基酸残基三联体催化，对于自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)卤代烷脱卤素酶(DhlA)而言，所述残基分别是残基Asp124、His289和Asp260(Franken等，1991)，对于红球菌(Rhodococcus)脱卤素酶(DhaA)而言，所述残基分别是残基Asp106、His272和Glu130(Newman等，1999)。

与卤代烷脱卤素酶亲核残基和碱性残基不同，催化三联体第三个成员的作用迄今还不完全了解。催化酸性残基与催化His残基氢键键合，可能通过增加咪唑环中氮的碱性有助于His残基的功能。Krooshof等(1997)使用定点诱变研究DhlA催化酸性Asp260的作用，证明D260N突变体催化失活。而且，该残基显然具有重要的结构作用，因为突变蛋白主要累积在包含体中。少动鞘氨醇单胞菌(Sphinogomonas pauciynobilis)卤代烷脱卤素酶(LinB)参与γ-六氯环己烷降解(Nagata等，1997)。Hynkova等(1999)用谷氨酰胺(Q)残基替换了LinB的推定催化残基(Glu-132)。但是，即使以非常高的底物浓度也没有观测到E132Q突变体的活性。

为检测DhaA催化三联体酸性残基Glu130在蛋白生产中的作用和突变体蛋白与荧光标记的卤代烷底物形成共价烷基-酶中间体的能力，使用定点诱变以谷氨酰胺、亮氨酸和丙氨酸替换130位的DhaA谷氨酸(E)残基。

材料和方法

菌株和质粒。在定点诱变反应的转化中使用超感受态大肠杆菌XL10 Gold(Stratagene；Tet^r Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endAl supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte[F′proAB lacI^qZΔM15Tn10(Tet^r)Amy Cam^r])作为宿主。使用大肠杆菌菌株JM109(e14-(McrA-)recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK-mK+)supE44 relA1Δ(lac-proAB)[F′traD36 proAB lacI^qZΔM15])作为宿主进行基因表达和全细胞酶标记研究。将GST-DhaA-FLAG基因融合体克隆入质粒pGEX5X3中，称为pGEX5X3DhaAWT.FLAG，使用其作为E130诱变的起始模板。在DhaA中含H272F突变的突变质粒称为pGEX5X3DhaAH272F-FLAG，将其作为标记研究中的阳性对照，使用克隆载体pGEX5X3作为阴性对照。

定点诱变DhaA E130残基。用于诱变的寡核苷酸序列示于下文。标下划线的核苷酸表示改变密码子的位置。用Integrated DNATechnologies(Coralville，IA)以100nmol规模合成寡核苷酸，并通过在5′末端磷酸化进行修饰。DhaA E130Q 5′CAAAGGTATTGCATGTATG CAGTTCATCCGGCCTATCCCG3′(SEQ IDNO：41)DhaA E130L 5′GTCAAAGGTATTGCATGTATG CTGTTCATCCGGCCTATCCCGAC3′(SEQ ID NO：42)DhaA E130A 5′AGGTATTGCATGTATG GCGTTCATCCGGCCTATCCC3′(SEQ ID NO：43)

使用QuikChange Multi试剂盒按照生产商的说明(Stratagene，LaJolla，CA)进行定点诱变。将诱变反应物导入到感受态大肠杆菌XL10Gold细胞中，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂培养基平板上选择转化体。由于替换了谷氨酸密码子(GAAttc)，最初筛选由单个转化体分离的质粒DNA以获得缺失EcoRI位点的质粒。选择推测含各反应所需密码子改变的克隆，对其进行DNA序列分析(SeqWright，Houston，TX)。用于验证pGEX5X3载体中突变体序列的引物如下：5′GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 3′(SEQ ID NO：44)。

DhaA突变体分析。将三种DhaA E130置换突变体与以下构建物对比：野生型DhaA、DhaA.H272F和DhaA阴性对照(仅有pGEX5X3载体)。在2ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB中于30℃振荡过夜培养每个克隆。将过夜培养物以1∶50稀释入含50ml新鲜LB培养基和氨苄青霉素(100μg/ml)的无菌烧瓶中。将培养物于25℃振荡温育，以使产生的不溶性蛋白种类最少。当培养至对数中期(OD₆₀₀＝0.6)时，加入IPTG(0.1mM)，再将培养物于25℃振荡温育22小时。为了用四甲基罗丹明(TAMRA)卤代烷缀合的底物标记全细胞，将每种培养物的细胞密度调节至OD₆₀₀＝1，然后加入底物至浓度为15μM。在温和搅拌的情况下于4℃温育细胞大约18小时。温育后，将20μl每种标记反应的细胞加入到6μl加载染料的4×SDS中，将样品煮沸约3分钟，然后上样到4-20％丙烯酰胺凝胶(Tris甘氨酸)。为进行体外标记研究，通过收集3mL细胞(OD₆₀₀＝1)，并将所获得的沉淀再悬浮在75μL RBS中，制备IPTG诱导培养物的粗裂解物。冻/融步骤后，加入含1.25mg/mL溶菌酶的225μL1×细胞培养物裂解试剂(PromegaCorp.，Madison，WI)以促进细胞裂解。将每种裂解物的20μL样品与25μL 1×PBS混合。加入TAMRA标记的卤代烷底物至终浓度为25μM。于室温温育标记反应物2小时。将25μl各种标记反应物样品加入至6μl加载染料的4×SDS中，将样品煮沸约3分钟，然后上4-20％丙烯酰胺凝胶(Tris甘氨酸)。使用Fluorhnager SI设备(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)，设定在570nm检测发射，将凝胶成像。

以14,000RPM离心粗裂解物15分钟，产生无细胞裂解物。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析监测蛋白产生。将转移至PVDF膜的蛋白与缀合碱性磷酸酶(AP)(Sigma，St.Louis，MO)的抗-FLAG^R抗体温育。用Western Blue稳定的碱性磷酸酶底物(Promega Corp.，Madison，WI)显色印迹。

结果

通过定点诱变考察DhaA催化酸性残基在烷基-酶中间体水解中的作用。用谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)密码子替换DhaA密码子E130，因为这些置换可能对酶结构的破坏最小。诱变后，使用限制性内切核酸酶筛选和DNA序列分析确认需要的密码子改变。确认为DhaA.E130Q、DhaA.E130L和DhaA.E130A克隆的序列分别称为Cl、A5和A12，选择它们进行下一步分析。分析E130突变体的蛋白表达及其与TAMRA标记的卤代烷底物形成共价烷基-酶中间体的能力。在用IPTG诱导后大肠杆菌JM109细胞过表达三种E130基因变异体。粗细胞裂解物的SDS-PAGE分析结果显示，表达野生型和突变dhaA基因的培养物以大约相同的水平累积蛋白(图26；泳道2、4、6、8、10和12)。而且，野生型和H272F构建物生产的DhaA蛋白大部分可溶，因为蛋白量在离心后没有明显变化(图26；泳道3和5)。出现在仅有载体的泳道的大量22kDa蛋白条带代表GST蛋白(图26；泳道6和7)。但是，这些结果与DhaA.E130Q、DhaA.E130L和DhaA.E130A突变体完全相反，所述突变体似乎主要累积不溶性DhaA蛋白。此结论是基于以下观察结果，即离心后存在于无细胞裂解物中的DhaA蛋白量有显著损失(图26；泳道9、11和13)。尽管如此，在离心(+s)后的每个DhaA.E130突变体泳道中都能清楚观测到与DhaA共迁移的蛋白条带，这提示存在可溶性酶。因此使用蛋白质印迹分析测定离心后在DhaA.E130突变体中观测到的蛋白条带是否代表可溶性DhaA物质。图27显示的免疫印迹证实，在每种DhaA.E130突变体无细胞裂解物中都存在可溶性DhaA蛋白(泳道9、11和13)。

还检测了DhaA.E130突变体产生烷基-酶共价中间体的能力。在TAMRA标记底物存在时，温育由各种构建物的IPTG诱导培养物制备的粗裂解物。图28显示DhaA.H272F突变体(泳道3)生产该中间体非常有效。用野生型DhaA或阴性对照裂解物未检测到该产物。在开始检测时，DhaA.E130突变体似乎没有产生可检测水平的共价产物。但是，在更严格检查荧光图像时，观测到极微弱的条带，可能表示微量的共价中间体(图28；泳道5-7)。基于这些结果，研究了全细胞生产荧光烷基-酶共价中间体的能力。

图29显示了对比每种DhaA.E130突变体和阳性(DhaA.H272F突变体)以及阴性(DhaA-)对照的体内标记实验的结果。正如所料，由接近GST-DhaA-Flag融合体预测分子量的单荧光条带(图29，泳道3)证实，DhaA.H272F突变体能够产生共价烷基-酶中间体。正如先前体外标记结果所观测到的一样，野生型或阴性对照培养物(图29，泳道2和3)都不能检测到该产物，但全部三种DhaA.E130置换突变体都再一次检测到迁移到正确位置的非常微弱的荧光条带(图29，泳道5-7)。这些结果指出，DhaA.E130Q、L和A突变体可能具有捕获共价烷基-酶中间体的能力。但是，与DhaA.H272F突变体酶相比，该反应效率似乎急剧降低。

此诱变研究的结果提示，DhaA催化酸性残基DhaA.E130对酶正确折叠起重要的结构作用。DhaA蛋白明显对该氨基酸位置的置换敏感，证据是在DhaA.E130Q、DhaA.E130L和DhaA.E130A粗裂解物中存在大量不溶性蛋白复合物。尽管如此，基于SDS-PAGE和免疫印迹分析，在全部三种DhaA.E130突变体的无细胞裂接物中都检测到显著量的可溶性DhaA蛋白。

实施例IX

捕获活哺乳动物细胞中表达的

DhaA.H272F-Flag和DhaA.H272F-Flag海肾荧光素酶融合蛋白

材料和方法

以30,000细胞/cm²的密度将CHO-K1细胞放置在24孔板(Labsystems)中，用pCIneo.DhaA.WT-Flag或pCIneo.hRLuc-连接基团-DhaA.H272F-Flag载体转染。24小时后，用含25μM生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl和0.1％DMSO的新鲜培养基或仅含0.1％DMSO的新鲜培养基置换培养基，将细胞放置于CO₂培养箱中60分钟。温育结束时，去除培养基，用PBS(pH7.4；4次连续清洗：1.0ml/cm²；每次5秒)快速清洗细胞，将新培养基加入到细胞中。在某些实验中，没有改变培养基。将细胞放置回CO₂培养箱中。

60分钟后，去除培养基，将细胞收集在含蛋白酶抑制剂(Sigma#P8340)的PBS(pH＝7.4，200μl/孔，室温)中。通过用针(IM1 23GTW)研磨裂解细胞。然后，将细胞裂解物与MagnaBind链霉抗生物素蛋白包被的珠(Pierce #21344)按照生产商的方法温育。简而言之，使用转盘将细胞裂解物与珠于室温温育60分钟。收集未结合的物质；用PBS(3×500μl，pH＝7.4，室温)清洗珠，并重悬浮在SDS-样品缓冲液(用于SDS-PAGE分析)或PBS(pH＝7.4，用于测定R.Luc活性)中。用SDS-PAGE分离蛋白，转移至硝酸纤维素膜，用抗-Flag-Ab或抗-R.Luc-Ab分析，通过增强型化学发光(ECL)系统(Pharmacia-Amersham)检测结合抗体。使用Promega的“海肾荧光素酶测定系统”按照生产商的方法测定结合珠的hR.Luc活性。

结果

捕获活细胞中表达的蛋白使得可以用各种分析方法/技术分析这些蛋白。可利用的捕获工具有很多，但这些工具大部分需要生产高度特异性的抗体或需要将目标蛋白和特异性标记肽/蛋白遗传融合(Jarvik和Telmer，1998；Ragaut等，1999)。然而，用于活细胞成像的这些标记物很有限。为捕获DhaA.H272F和融合至DhaA.H272F的功能蛋白，使用SA-包被的珠(Savage等，1992)。

野生型DhaA有效水解生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl，生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl与DhaA.H272F和DhaA.H272F融合蛋白在体内和体外共价结合。而且，在大肠杆菌和哺乳动物细胞中都观测到结合。对照实验表明，处理60分钟后CHO-K1细胞中表达的DhaA.H272F-Flag蛋白的约80％被标记。

用生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl处理瞬时表达DhaA.H272F-Flag的CHO-K1细胞。裂解生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl处理的细胞，细胞裂解物与SA-包被珠温育。使用抗-Flag^R抗体通过蛋白质印迹分析DhaA.H272F与珠的结合。如图30D所示，未用生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl处理时没有检测到DhaA.H272F-Flag捕获。同时，如果细胞用生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl处理，则细胞中表达的DhaA.H272F-Flag有50％以上捕获在SA包被珠上。

为显示融合至DhaA.H272F-Flag的功能活性蛋白的捕获，用编码hR.Luc-连接基团-DhaA.H272F-Flag的载体转染细胞，检测捕获在珠上的荧光素酶活性。如图30C所示，在与生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl处理细胞裂解物温育的珠上检测到显著的荧光素酶活性。同时，在与生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl未处理细胞裂解物温育的珠上没有检测到荧光素酶活性。而且，在未洗出游离生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl时，在与生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl处理细胞裂解物温育的珠上没有检测到hR.Luc活性。

总之，这些数据显示，使用生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl和SA-包被珠可有效捕获融合至DhaA.H272F的功能活性蛋白(hR.Luc)。该捕获是生物素依赖性的，并且可由过量生物素-C₁₈H₃₂O₄-Cl竞争消除(competed-off)。由于观测到所述珠对hR.Luc活性的显著抑制作用(未列出数据)，所以使用SDS-PAGE和使用抗-R.Luc抗体的蛋白质印迹分析评价捕获hR.Luc-连接基团-DhaA.H272F-Flag融合蛋白的效力。如图30D所示，以生物素依赖性方式可捕获50％以上的hR.Luc-连接基团-DhaA.H272F-Flag融合蛋白。这与DhaA.H272F-Flag的捕获效力良好吻合(参见图30A)。

实施例X

优化DhaA基因

DhaA通用序列设计

制备合成DhaA.H272F基因，其具有人类密码子偏倚、低CG含量、选择的限制酶识别位点和数量减少的转录调节位点。相比于没有信号序列(SEQ ID NO：51)的野生型DhaA基因编码的氨基酸序列和/或DhaA.H272F，密码子优化的DhaA基因的氨基酸序列和侧翼序列包括：1)由于导入改良型Kozak序列(GCCACCATGG；SEQ IDNO：45)和BamHI位点而在2位插入Gly(因此在具有Gly插入的DhaA突变体中H272F活性位点突变是在273位置)；2)由于导入SmaI/XmaI/AvaI位点获得的A292G置换，该置换在具有Gly插入的DhaA突变体中处于293位；3)由于导入NaeI(NgoMIV)位点而在C-末端加入Ala-Gly；4)在5′侧翼序列加入NheI、PvuII、EcoRV和NcoI位点；5)在5′侧翼序列加入NNNN，以消除末端检索算法误差并保持ORF1(即NNN-NGC-TAG-CCA-GCT-GGC-GAT-ATC-GCC-ACC-ATG-GGA；SEQ ID NO：46)；6)在NotI位点3′末端加入消除末端检索算法误差的NNNN、具有ORF Leu-Ile-Lys的PacI位点和两个终止密码子，其中至少一个是TAA(即TAATAGTTAATTAAGTAA-GCGGCCGCNNNN；SEQ ID NO：47)。

SEQ ID NO：51具有以下序列：atgtcagaaatcggtacaggcttccccttcgacccccattatgtggaagtcctgggcgagcgtatgcactacgtcgatgttggaccgcgggatggcacgcctgtgctgttcctgcacggtaacccgacctcgtcctacctgtggcgcaacatcatcccgcatgtagcaccgagtcatcggtgcattgctccagacctgatcgggatgggaaaatcggacaaaccagacctcgattatttcttcgacgaccacgtccgctacctcgatgccttcatcgaagccttgggtttggaagaggtcgtcctggtcatccacgactggggctcagctctcggattccactgggccaagcgcaatccggaacgggtcaaaggtattgcatgtatggaattcatccggcctatcccgacgtgggacgaatggccggaattcgcccgtgagaccttccaggccttccggaccgccgacgtcggccgagagttgatcatcgatcagaacgctttcatcgagggtgcgctcccgaaatgcgtcgtccgtccgcttacggaggtcgagatggaccactatcgcgagcccttcctcaagcctgttgaccgagagccactgtggcgattccccaacgagctgcccatcgccggtgagcccgcgaacatcgtcgcgctcgtcgaggcatacatgaactggctgcaccagtcacctgtcccgaagttgttgttctggggcacacccggcgtactgatccccccggccgaagccgcgagacttgccgaaagcctccccaactgcaagacagtggacatcggcccgggattgcactacctccaggaagacaacccggaccttatcggcagtgagatcgcgcgctggctccccgcactctag

密码子选择

由基于2002年8月15日的GenBank Release 131.0(参见Nakamura等，2000)密码子选择数据库( http：//www.kazusa.or.jp/codon/)获得密码子选择数据。下载用于以下的密码子选择表：HS：人(Homosapiens)[gbpri]50,031 CDS(21,930,294个密码子)；MM：小鼠(Musmusculus)[gbrod]23,113 CDS(10,345,401个密码子)；EC：大肠杆菌(Escherichia coli)[gbbct]11,985 CDS(3,688,954个密码子)和EC K12：大肠杆菌(Escherichia coli)K12[gbbct]4,291 CDS(1,363,716个密码子)。对比HS和MM，发现非常相似，因此使用HS表。对比EC和EC K12，发现非常相似，因此使用EC K12表。

选择密码子的整体策略是采用的密码子选择对在哺乳动物细胞中表达最佳，同时避免低选择大肠杆菌密码子。针对每个氨基酸选择一个“最佳”密码子，使用其反翻译需要的蛋白序列，产生起始基因序列。另一个选择标准是避免高频率使用含CG二核苷酸的HS密码子，因为CG甲基化涉及转录基因调节，可引起稳定细胞系中基因表达下调。因此，排除所有含CG(8个人密码子)和TA(4个人密码子，除Tyr密码子以外)的密码子。还要避免密码子终止在C，因为它们可与下游密码子形成CG。在保留的密码子中，选择在HS中具有最高选择的密码子，除非是具有稍微低选择但在大肠杆菌中具有很高选择的密码子。

DhaA基因序列

为产生起始DhaA序列，使用Vector NTI 8.0(Informax)中的密码子选择表。反翻译DhaA.v2.1蛋白序列(SEQ ID NO：48)，产生起始基因序列hDhaA.v2.1-0，然后如上所述加入侧翼序列，产生hDhaA.v2.1-0F(SEQ ID NO：49)。DhaA.v2.1：MGSEIGTGFPFDPHYVEVLGERMHYVDVGPRDGTPVLFLHGNPTSSYLWRNIIPHVAPSHRCIAPDLIGMGKSDKPDLDYFFDDHVRYLDAFIEALGLEEVVLVIHDWGSALGFHWAKRNPERVKGLACMEFIRPIPTWDEWPEFARETFQAFRTADVGRELIIDQNAFIEGALPKCVVRPLTEVEMDHYREPFLKPVDREPLWREPNELPIAGEPANIVALVEAYMNWLHQSPVPKLLFWGTPGVLIPPAEAARLAESLPNCKTVDIGPGLFYLQEDNPDLIGSEIARWLPGLAG(SEQ ID NO：48)hDhaA.v2.1-0F：NNNNGCTAGCCAGCTGGCGATATCGCCACCATGGGATCCGAGATTGGGACAGGGTTTCCTTTTGATCCTCATTATGTGGAGGTGCTGGGGGAGAGAATGCATTATGTGGATGTGGGGCCTAGAGATGGGACACCTGTGCTGTTTCTGCATGGGAATCCTACATCTTCTTATCTGTGGAGAAATATTATTCCTCATGTGGCTCCTTCTCATAGATGTATTGCTCCTGATCTGATTGGGATGGGGAAGTCTGATAAGCCTGATCTGGATTATTTTTTTGATGATCATGTGAGATATCTGGATGCTTTTATTGAGGCTCTGGGGCTGGAGGAGGTGGTGCTGGTGATTCATGATTGGGGGTCTGCTCTGGGGTTTCATTGGGCTAAGAGAAATCCTGAGAGAGTGAAGGGGATTGCTTGTATGGAGTTTATTAGACCTATTCCTACATGGGATGAGTGGCCTGAGTTTGCTAGAGAGACATTTCAGGCTTTTAGAACAGCTGATGTGGGGAGAGAGCTGATTATTGATCAGAATGCTTTTATTGAGGGGGCTCTGCCTAAGTGTGTGGTGAGACCTCTGACAGAGGTGGAGATGGATCATTATAGAGAGCCTTTTCTGAAGCCTGTGGATAGAGAGCCTCTGTGGAGATTTCCTAATGAGCTGCCTATTGCTGGGGAGCCTGCTAATATTGTGGCTCTGGTGGAGGCTTATATGAATTGGCTGCATCAGTCTCCTGTGCCTAAGCTGCTGTTTTGGGGGACACCTGGGGTGCTGATTCCTCCTGCTGAGGCTGCTAGACTGGCTGAGTCTCTGCCTAATTGTAAGACAGTGGATATTGGGCCTGGGCTGTTTTATCTGCAGGAGGATAATCCTGATCTGATTGGGTCTGAGATTGCTAGATGGCTGCCCGGGCTGGCCGGCTAATAGTTAATTAAGTAAGCGGCCGCNNNN(SEQ ID NO：49)

进一步优化

用于鉴别和去除序列模式(motif)的程序和数据库得自GenomatixSoftware GmbH(Munich，Germany， http：//www.genomatix.de)：GEMSLauncher Release 3.5.1(2003年4月)、MatInspector professional Release6.1(2003年1月)、Matrix Family Library Ver 3.1.1(2003年4月，包括128个家族中318种脊椎动物矩阵)、ModelInspector professionalRelease 4.8(2002年10月)、Model Library Ver 3.1(2003年3月，226个模块)、SequenceShaper工具和User Defined Matrices。以优先顺序在起始基因序列中去除的序列模式是：列于以下的限制酶识别序列；转录因子结合序列，包括具有默认记分或更高记分启动子模块(即具有确定方向的2个转录因子结合位点)，以及最小记分＝0.75/基质＝优化的脊椎动物转录因子结合序列；真核转录调节位点，包括Kozak序列、剪接供体/受体序列和聚腺苷酸化添加序列；以及原核转录调节序列，包括含大肠杆菌启动子和大肠杆菌RBS(如果在Met密码子上游少于20bp)。

用户定义的矩阵

DhaA子集

形式：矩阵名称(核心相似阈/矩阵相似阈)：optimized，优化

U$AatII(0.75/1.00)，U$BamHI(0.75/1.00)，U$BglI(0.75/1.00)，U$BglII(0.75/1.00)，U$BsaI(0.75/1.00)，U$BsmAI(0.75/1.00)，U$BsmBI(0.75/1.00)，U$BstEII(0.75/1.00)，U$BstXI(0.75/1.00)，U$Csp45I(0.75/1.00)，U$CspI(0.75/1.00)，U$DraI(0.75/1.00)，U$EC-P-10(1.00/Optimized)，U$EC-P-35(1.00/Optimized)，U$EC-Prom(1.00/Optimized)，U$EC-RBS(0.75/1.00)，U$EcoRI(0.75/1.00)，U$EcoRV(0.75/1.00)，U$HindIII(0.75/1.00)，U$Kozak(0.75/Optimized)，U$KpnI(0.75/1.00)，U$MluI(0.75/1.00)，U$NaeI(0.75/1.00)，U$NcoI(0.75/1.00)，U$NdeI(0.75/1.00)，U$NheI(0.75/1.00)，U$NotI(0.75/1.00)，U$NsiI(0.75/1.00)，U$PacI(0.75/1.00)，U$PflMI(0.75/1.00)，U$PmeI(0.75/1.00)，U$PolyAsig(0.75/1.00)，U$PstI(0.75/1.00)，U$PvuII(0.75/1.00)，U$SacI(0.75/1.00)，U$SacII(0.75/1.00)，U$SaII(0.75/1.00)，U$SfiI(0.75/1.00)，U$SgfI(0.75/1.00)，U$SmaI(0.75/1.00)，U$SnaBI(0.75/1.00)，U$SpeI(0.75/1.00)，U$Splice-A(0.75/Optimized)，U$Splice-D(0.75/Optimized)，U$XbaI(0.75/1.00)，U$XcmI(0.75/1.00)，U$XhoI(0.75/1.00)，

以及所有vertebrates.lib。

DhaA-EC子集

没有大肠杆菌特异性序列：optimized，优化

U$AatII(0.75/1.00)，U$BamHI(0.75/1.00)，U$BglI(0.75/1.00)，U$BglII(0.75/1.00)，U$BsaI(0.75/1.00)，U$BsmAI(0.75/1.00)，U$BsmBI(0.75/1.00)，U$BstEII(0.75/1.00)，U$BstXI(0.75/1.00)，U$Csp45I(0.75/1.00)，U$CspI(0.75/1.00)，U$DraI(0.75/1.00)，U$EcoRI(0.75/1.00)，U$EcoRV(0.75/1.00)，U$HindIII(0.75/1.00)，U$Kozak(0.75/Optimized)，U$KpnI(0.75/1.00)，U$MluI(0.75/1.00)，U$NaeI(0.75/1.00)，U$NcoI(0.75/1.00)，U$NdeI(0.75/1.00)，U$NheI(0.75/1.00)，U$NotI(0.75/1.00)，U$NsiI(0.75/1.00)，U$PacI(0.75/1.00)，U$PflMI(0.75/1.00)，U$PmeI(0.75/1.00)，U$PolyAsig(0.75/1.00)，U$PstI(0.75/1.00)，U$PvuII(0.75/1.00)，U$SacI(0.75/1.00)，U$SacII(0.75/1.00)，U$SalI(0.75/1.00)，U$SfiI(0.75/1.00)，U$SgfI(0.75/1.00)，U$SmaI(0.75/1.00)，U$SnaBI(0.75/1.00)，U$SpeI(0.75/1.00)，U$Splice-A(0.75/Optimized)，U$Splice-D(0.75/Optimized)，U$XbaI(0.75/1.00)，U$XcmI(0.75/1.00)，U$XhoI(0.75/1.00)，

以及所有ALL vertebrates.lib。

去除序列模式的策略

通过选择可保留具体蛋白和侧翼序列的可替代密码子，由起始基因序列去除以上列举的不需要序列模式。以尽可能和整体密码子选择策略一致的方式选择可替代密码子。

A. 一般步骤

-通过使用矩阵家族子集“DhaA”或“DhaA-EC”的MatInspector和使用默认设置的ModelInspector鉴别不需要的序列配对。

-用SequenceShaper(保持ORF)鉴别可能替换的密码子，以去除不需要的序列配对。

-将所有改变加入新版合成基因序列中，用MatInspector和ModelInspector再分析。

B. 具体步骤

-使用子集“DhaA-EC”和SequenceShaper默认保留阈(0.70/Opt-0.20)去除不需要的序列配对。

-对于使用该方法不能去除的序列配对，使用较低的SequenceShaper保留阈(例如0.70/Opt-0.05)。

-对于仍不能去除的序列配对，尝试人工选择替换密码子的不同组合(尤其是如果需要改变3个以上的碱基时)。如果引入新序列配对，则尝试使用以上步骤去除(不同的起始序列有时可以有不同的去除方案)。

-使用子集“DhaA”检查是否引入了有问题的大肠杆菌序列模式，如果是这种情况，则尝试使用类似于以上用于非大肠杆菌序列的方法去除它们。

对侧翼(非读框)序列使用类似的策略。

C. 鉴别和去除推定的CpG岛

使用的软件：EMBOSS CpGPlot/CpGReport  http：//www.ebi.ac.uk/ emboss/cpgplot/index.html)(参见Gardiner-Garden等，1987)。

参数：默认(修饰)：Window：100；Step：1；Obs/Exp：0.6；MinPC：50；Length：100；Reverse：无；Complement：无。去除不需要的序列模式后，使用上述软件检查基因序列中至少100个碱基的推定CpG岛。如果鉴别出CpG岛，则通过在某些CG二核苷酸位选择可保留具体蛋白和侧翼序列但不导入新的不需要序列模式的可替代密码子而去除它们。

D. 限制位点

导入独特的MunI/MfeI(C′AATTG)位点，使得可以去除C-末端34个氨基酸，包括C末端附近的推定肉豆蔻化位点(GSEIAR)。导入另一个独特的NruI位点，使得可以去除C-末端80-100个氨基酸。

hDhaA.v2.1-6F(最终序列，具有侧翼序列)NNNNGCTAGCCAGCTGGCgcgGATATCGCCACCATGGGATCCGAGATTGGGACAGGGTTcCCTTTTGATCCTCAcTATGTtGAaGTGCTGGGgGAaAGAATGCAcTAcGTGGATGTGGGGCCTAGAGATGGGACcCCaGTGCTGTTcCTcCAcGGGAAcCCTACATCTagcTAcCTGTGGAGaAAtATTATaCCTCATGTtGCTCCTagtCATAGgTGcATTGCTCCTGATCTGATcGGGATGGGGAAGTCTGATAAGCCTGActtaGAcTAcTTTTTTGATGAtCATGTtcGATActTGGATGCTTTcATTGAGGCTCTGGGGCTGGAGGAGGTGGTGCTGGTGATaCAcGAcTGGGGGTCTGCTCTGGGGTTTCAcTGGGCTAAaAGgAATCCgGAGAGAGTGAAGGGGATTGCTTGcATGGAgTTTATTcGACCTATTCCTACtTGGGAtGAaTGGCCaGAGTTTGCcAGAGAGACATTTCAaGCcTTTAGAACtGCcGATGTGGGcAGgGAGCTGATTATaGAcCAGAATGCTTTcATcGAGGGGGCTCTGCCTAAaTGTGTaGTcAGACCTCTcACtGAaGTaGAGATGGAcCATTATAGAGAGCCcTTTCTGAAGCCTGTGGATcGcGAGCCTCTGTGGAGgTTtCCaAATGAGCTGCCTATTGCTGGGGAGCCTGCTAATATTGTGGCTCTGGTGGAaGCcTATATGAAcTGGCTGCATCAGagTCCaGTGCCcAAGCTaCTcTTTTGGGGGACtCCgGGaGTtCTGATTCCTCCTGCcGAGGCTGCTAGACTGGCTGAaTCcCTGCCcAAtTGTAAGACcGTGGAcATcGGcCCtGGgCTGTTTTAcCTcCAaGAGGAcAAcCCTGATCTcATcGGGTCTGAGATcGCacGgTGGCTGCCCGGGCTGGCCGGCTAATAGTTAATTAAGTAgGCGGCCGCNNNN(SEQ ID NO：50)

表III显示了不同DhaA基因(没有侧翼序列)的核酸序列一致性的对比。

表III

	DhaA	DhaA.v2.1	DhaA.v2.1-0	DhaA.v2.1-6
					DhaA	100	98	72	75
DhaA.v2.1a		100	74	76
					DhaA.v2.1-0b			100	88
DhaA.v2.1-6				100

^a2位加入Gly，H272F、A292G、Ala-Gly加入到C-末端

^b密码子优化

表IV提供了不同DhaA基因(没有侧翼序列)的GC含量。

表IV

	GC含量	CG二核苷酸
			人	53％
DhaA	60％	85
			DhaA.v2.1	60％	87
DhaA.v2.1-0	49％	3
			DhaA.v2.1-6	52％	21

表V显示了发现于不同DhaA基因中的脊椎动物转录因子结合序列家族(核心相似性：0.75/矩阵相似性：opt)和启动子模块(默认参数：优化阈或80％最大分值)。

表V

基因名称	TF结合序列5′F/ORF/3′F	启动子模块5′F/ORF/3′F
			DhaA	--/82/--	--/5/--
DhaA.v2.1-F	3/82/12	0/5/0
			DhaA.v2.1-0F	3/87/12	0/0/0
DhaA.v2.1-6F	1/3/8	0/0/0

备注：在DhaA.v2.1-0F和DhaA.v2.1-6F中EcoRV之前插入3bp片段以去除3′侧翼区的5′结合序列配对。

DhaA.v2.1-6F中保留的转录因子结合序列配对包括：

在5′侧翼区：家族： V$NEUR(NeuroD，β2，HLH域)，最佳匹配：NEUROD1的DNA结合位点(β-2/E47二聚体)(MEDLINE  9108015)；在可读框中：家族： V$GATA(GATA结合因子)，最佳匹配：GATA-结合因子1(MEDLINE  94085373)，家族： V$PCAT(启动子CCAAT结合因子)，最佳匹配：细胞和病毒CCAAT盒，(MEDLINE  90230299)，家族： V$RXRF(RXR异二聚体结合位点)，最佳匹配：Farnesoid X-活化受体(RXR/FXR二聚体)(MEDLINE  11792716)；在3′侧翼区：家族：V$HNF1(肝核因子1)，最佳匹配：肝核因子1(MEDLINE  95194383)，家族： V$BRNF(Brn POU域因子)，最佳匹配：POU转录因子Brn-3(MEDLINE  9111308)，家族： V$RBIT(B细胞IgH转录调节物)，最佳匹配：Bright，B细胞IgH转录调节物(MEDLINE  96127903)，家族：V$CREB(Camp-响应元件结合蛋白)，最佳匹配：E4BP4，bZIP域，转录抑制剂(MEDLINE  92318924)，家族： V$HOMS(同源域亚家族S8)，最佳匹配：S8型同源域结合位点(MEDLINE  94051593)，家族：V$NKXH(NKX/DLX-同源域位点)，最佳匹配：DLX-1、-2和-5结合位点(MEDLINE  11798166)，家族： V$TBPF(Tata-结合蛋白因子)，最佳匹配：鸟C型LTR TATA盒(MEDLINE  6322120)和家族： V$NKXH(NKX/DLX-同源域位点)，最佳匹配：前列腺特异性同源域蛋白NKX3.1(MEDLINE  10871372)。

其它保留在hDhaA.v2.1-6F可读框中的序列模式是Met密码子上游11b的大肠杆菌RBS(AAGG)和BsmAI限制位点(GTCTC)，大肠杆菌RBS由于保留蛋白序列(Lys-Gly：AA(A/G)-GGN)而没有去除，BsmAI限制位点由于导入转录因子结合位点序列而没有去除。

如采用默认参数的EMBOSS CpGPlot/CpGReport中，分析每种DhaA基因编码序列中的推定CpG岛，结果示于表VI。

表VI

基因名称	CpG岛＞100bp	长度bp(ORF中的定位)
			DhaA	1	775bp(49..823)
DhaA.v2.1	1	784bp(49..832)
			DhaA.v2.1-0	0	--
DhaA.v2.1-6	0	--

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所有的出版物、专利和专利申请都通过引用结合到本文中。尽管在本发明前述说明书中已关于其某些优选实施方案描述了本发明，并为了说明目的阐述了很多细节，但对本领域技术人员显而易见的是，本发明允许其它的实施方案，本文描述的某些细节可在不背离本发明基本原则的情况下进行相当程度的改变。

序列表

<110>Wood，Keith V.

Los，Georgyi V.

Bulleit，Robert F.

Klaubert，Dieter

McDougall，Mark

Zimprich，Chad

Promega Corporation

<120>官能团与蛋白质的共价束缚

<130>341.020WO1

<150>US 60/444,094

<151>2003-01-31

<150>US 60/474,659

<151>2003-05-30

<160>64

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)

<400>1

gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a                                  31

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)

<400>2

gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a                                  31

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>3

ccgggattgt tctacctcca ggaagac                                    27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>4

ccgggattgg cctacctcca ggaagac                                    27

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>5

ccgggattgc agtacctcca ggaagac                                    27

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>6

ccgggattgg gctacctcca ggaagac                                            27

<210>7

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>7

acgcgtcgac gccgccatgt  cagaaatcgg tacaggc                                37

<210>8

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>8

ataagaatgc ggccgctcaa gcgcttcaac cggtgagtgc ggggagccag cgcgc             55

<210>9

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>9

ccggtgacta caaggacgat gacgacaagt gaagc                                   35

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>10

 gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a                                      31

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>11

gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a                                      31

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>12

gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a                                      31

<210>13

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>13

cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccactgctgg ggc                         43

<210>14

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>14

tgagccccag cagtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc                          42

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>15

ggaatgggcc ctctagagcg  acgatgtca                                        29

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>16

cagtcagtca cgatggatcc gctcaa                                            26

<210>17

<400>17

 000

<210>18

<400>18

 000

<210>19

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成亲和分子

<400>19

His His His His His

 1               5

<210>20

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成亲和分子

<400>20

His His His His His His

 1               5

<210>21

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成亲和分子

<400>21

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

 1               5                  10

<210>22

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成亲和分子

<400>22

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

 1               5

<210>23

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成亲和分子

<400>23

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

 1               5

<210>24

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成亲和分子

<400>24

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

 1               5

<210>25

<400>25

 000

<210>26

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>26

atcgaaggtc gtgggatccc caggaattcc cgggtcgacg ccgcc                       45

<210>27

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>27

Ile Glu Gly Arg Gly Ile Pro Arg Asn Ser Arg Val Asp Ala Ala

 1               5                  10                  15

<210>28

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>28

tccggatcaa gcttgggcga cgaggtggac ggcgggccct ctagagccac c                51

<210>29

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>29

Ser Gly Ser Ser Leu Gly Asp Glu Val Asp Gly Gly Pro Ser Arg Ala

 1               5                  10                  15

Thr

<210>30

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>30

accggttccg gatcaagctt gcggtaccgc gggccctcta gagcc                        45

<210>31

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>31

Thr Gly Ser Gly Ser Ser Leu Arg Tyr Arg Gly Pro Ser Arg Ala

 1               5                  10                  15

<210>32

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>32

tccggatcaa gcttgcggta ccgcgggccc tctagagccg tcgacgccgc c                51

<210>33

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>33

Ser Gly Ser Ser Leu Arg Tyr Arg Gly Pro Ser Arg Ala Val Asp Ala

 1               5                  10                  15

Ala

<210>34

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>34

cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccaccagtgg ggc                         43

<210>35

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>35

tgagccccac tggtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc                          42

<210>36

<211>1053

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400>36

agcttactat gccattatta ataacttagc catttcaaca ccttctttca aatatttata       60

ataaactatt gacaccgata ttacaattgt aatattattg atttataaaa attacaactg      120

taatatcgga gggtttattt tgaaaaagtt aatattttta attgtaattg ctttagtttt      180

aagtgcatgt aattcaaaca gttcacatgc caaagagtta aatgatttag aaaaaaaata      240

taatgctcat attggtgttt atgctttaga tactaaaagt ggtaaggaag taaaatttaa      300

ttcagataag agatttgcct atgcttcaac ttcaaaagcg ataaatagtg ctattttgtt      360

agaacaagta ccttataata agttaaataa aaaagtacat attaacaaag atgatatagt      420

tgcttattct cctattttag aaaaatatgt aggaaaagat atcactttaa aagcacttat      480

tgaggcttca atgacatata gtgataatac agcaaacaat aaaattataa aagaaatcgg      540

tggaatcaaa aaagttaaac aacgtctaaa agaactagga gataaagtaa caaatccagt      600

tagatatgag atagaattaa attactattc accaaagagc aaaaaagata cttcaacacc      660

tgctgccttc ggtaagaccc ttaataaact tatcgccaat ggaaaattaa gcaaagaaaa      720

caaaaaattc ttacttgatt taatgttaaa taataaaagc ggagatactt taattaaaga      780

cggtgttcca aaagactata aggttgctga taaaagtggt caagcaataa catatgcttc      840

tagaaatgat gttgcttttg tttatcctaa gggccaatct gaacctattg ttttagtcat      900

ttttacgaat aaagacaata aaagtgataa gccaaatgat aagttgataa gtgaaaccgc      960

caagagtgta atgaaggaat tttaatattc taaatgcata ataaatactg ataacatctt     1020

atattttgta ttatattttg tattatcgtt gac                                  1053

<210>37

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>37

ccggtgatcc aaaaaagaag agaaaggtag atccaaaaaa gaagagaaag gtagatccaa       60

aaaagaagag aaaggtatga g                                                 81

<210>38

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>38

gatcctcata cctttctctt cttttttgga tctacctttc tcttcttttt tggatctacc       60

tttctcttct tttttggatc a                                                 81

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>39

attatgctga gtgatatccc                                                   20

<210>40

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>40

ctcggtacca agctccttgt agtca                                             25

<210>41

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>41

caaaggtatt gcatgtatgc agttcatccg gcctatcccg                             40

<210>42

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>42

gtcaaaggta ttgcatgtat gctgttcatc cggcctatcc cgac                        44

<210>43

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>43

aggtattgca tgtatggcgt tcatccggcc tatccc                                 36

<210>44

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>44

gggctggcaa gccacgtttg gtg                                               23

<210>45

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的改进Kozak序列

<400>45

gccaccatgg                                                              10

<210>46

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>1-36

<223>n＝A，T，G，or C

<400>46

nnnngctagc cagctggcga tatcgccacc atggga                                 36

<210>47

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>1-34

<223>n＝A，T，G，or C

<400>47

taatagttaa ttaagtaagc ggccgcnnnn                                        30

<210>48

<211>296

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>48

Met Gly Ser Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val

 1               5                  10                  15

Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp

            20                  25                  30

Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser  Ser Tyr Leu

        35                  40                  45

Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Ser His Arg Cys Ile Ala

    50                  55                  60

Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Asp Tyr

65                  70                  75                  80

Phe Phe Asp Asp His Val Arg Tyr Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu

                85                  90                  95

Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu

        100                     105                 110

Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala

        115                 120                 125

Cys Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu

   130                 135                 140

Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Ala Asp Val Gly Arg

145                 150                 155                 160

Glu Leu Ile Ile Asp Gln Asn Ala Phe Ile Glu Gly Ala Leu Pro Lys

                165                 170                 175

Cys Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu

            180                 185                 190

Pro Phe Leu Lys Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn

        195                 200                 205

Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu

    210                 215                 220

Ala Tyr Met Asn Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe

225                 230                 235                 240

Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu

                245                 250                 255

Ala Glu Ser Leu Pro Asn Cys Lys Thr Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu

            260                 265                 270

Phe Tyr Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala

        275                 280                 285

Arg Trp Leu Pro Gly Leu Ala Gly

    290                 295

<210>49

<211>948

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>1-948

<223>n＝A，C，T，or G

<400>49

nnnngctagc cagctggcga tatcgccacc atgggatccg agattgggac agggtttcct       60

tttgatcctc attatgtgga ggtgctgggg gagagaatgc attatgtgga tgtggggcct      120

agagatggga cacctgtgct gtttctgcat gggaatccta catcttctta tctgtggaga      180

aatattattc ctcatgtggc tccttctcat agatgtattg ctcctgatct gattgggatg      240

gggaagtctg ataagcctga tctggattat ttttttgatg atcatgtgag atatctggat      300

gcttttattg aggctctggg gctggaggag gtggtgctgg tgattcatga ttgggggtct      360

gctctggggt ttcattgggc taagagaaat cctgagagag tgaaggggat tgcttgtatg      420

gagtttatta gacctattcc tacatgggat gagtggcctg agtttgctag agagacattt      480

caggctttta gaacagctga tgtggggaga gagctgatta ttgatcagaa tgcttttatt      540

gagggggctc tgcctaagtg tgtggtgaga cctctgacag aggtggagat ggatcattat      600

agagagcctt ttctgaagcc tgtggataga gagcctctgt ggagatttcc taatgagctg      660

cctattgctg gggagcctgc taatattgtg gctctggtgg aggcttatat gaattggctg      720

catcagtctc ctgtgcctaa gctgctgttt tgggggacac ctggggtgct gattcctcct      780

gctgaggctg ctagactggc tgagtctctg cctaattgta agacagtgga tattgggcct      840

gggctgtttt atctgcagga ggataatcct gatctgattg ggtctgagat tgctagatgg      900

ctgcccgggc tggccggcta atagttaatt aagtaagcgg ccgcnnnn                   948

<210>50

<211>951

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>1-951

<223>n＝A，T，G，or C

<400>50

nnnngctagc cagctggcgc ggatatcgcc accatgggat ccgagattgg gacagggttc       60

ccttttgatc ctcactatgt tgaagtgctg ggggaaagaa tgcactacgt ggatgtgggg      120

cctagagatg ggaccccagt gctgttcctc cacgggaacc ctacatctag ctacctgtgg      180

agaaatatta tacctcatgt tgctcctagt cataggtgca ttgctcctga tctgatcggg      240

atggggaagt ctgataagcc tgacttagac tacttttttg atgatcatgt tcgatacttg      300

gatgctttca ttgaggctct ggggctggag gaggtggtgc tggtgataca cgactggggg      360

tctgctctgg ggtttcactg ggctaaaagg aatccggaga gagtgaaggg gattgcttgc      420

atggagttta ttcgacctat tcctacttgg gatgaatggc cagagtttgc cagagagaca      480

tttcaagcct ttagaactgc cgatgtgggc agggagctga ttatagacca gaatgctttc      540

atcgaggggg ctctgcctaa atgtgtagtc agacctctca ctgaagtaga gatggaccat      600

tatagagagc cctttctgaa gcctgtggat cgcgagcctc tgtggaggtt tccaaatgag      660

ctgcctattg ctggggagcc tgctaatatt gtggctctgg tggaagccta tatgaactgg      720

ctgcatcaga gtccagtgcc caagctactc ttttggggga ctccgggagt tctgattcct      780

cctgccgagg ctgctagact ggctgaatcc ctgcccaatt gtaagaccgt ggacatcggc      840

cctgggctgt tttacctcca agaggacaac cctgatctca tcgggtctga gatcgcacgg      900

tggctgcccg ggctggccgg ctaatagtta attaagtagg cggccgcnnn n               951

<210>51

<211>882

<212>DNA

<213>紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)

<400>51

atgtcagaaa tcggtacagg cttccccttc gacccccatt atgtggaagt cctgggcgag       60

cgtatgcact acgtcgatgt tggaccgcgg gatggcacgc ctgtgctgtt cctgcacggt      120

aacccgacct cgtcctacct gtggcgcaac atcatcccgc atgtagcacc gagtcatcgg      180

tgcattgctc cagacctgat cgggatggga aaatcggaca aaccagacct cgattatttc      240

ttcgacgacc acgtccgcta cctcgatgcc ttcatcgaag ccttgggttt ggaagaggtc      300

gtcctggtca tccacgactg gggctcagct ctcggattcc actgggccaa gcgcaatccg      360

gaacgggtca aaggtattgc atgtatggaa ttcatccggc ctatcccgac gtgggacgaa      420

tggccggaat tcgcccgtga gaccttccag gccttccgga ccgccgacgt cggccgagag      480

ttgatcatcg atcagaacgc tttcatcgag ggtgcgctcc cgaaatgcgt cgtccgtccg      540

cttacggagg tcgagatgga ccactatcgc gagcccttcc tcaagcctgt tgaccgagag      600

ccactgtggc gattccccaa cgagctgccc atcgccggtg agcccgcgaa catcgtcgcg      660

ctcgtcgagg catacatgaa ctggctgcac cagtcacctg tcccgaagtt gttgttctgg      720

ggcacacccg gcgtactgat ccccccggcc gaagccgcga gacttgccga aagcctcccc      780

aactgcaaga cagtggacat cggcccggga ttgcactacc tccaggaaga caacccggac      840

cttatcggca gtgagatcgc gcgctggctc cccgcactct ag                         882

<210>52

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>52

cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccacgaatgg ggc                         43

<210>53

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>53

tgagccccat tcgtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc                          42

<210>54

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>54

cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccactactgg ggc                         43

<210>55

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>55

tgagccccag tagtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc                          42

<210>56

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>56

ccagttagat atgacataga attaaattac tattcacc                               38

<210>57

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>57

ggtgaatagt aatttaattc tatgtcatat ctaactgg                               38

<210>58

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>58

ccagttagat atgagataga attacagtac tattcacc                               38

<210>59

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>59

ggtgaatagt actgtaattc tatctcatat ctaactgg                               38

<210>60

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>60

ccagttagat atgacataga attacagtac tattcacc                               38

<210>61

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>61

ggtgaatagt actgtaattc tatgtcatat ctaactgg                               38

<210>62

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>62

caacaggtcg acgccgccat gaaagagtta aatgatttag                             40

<210>63

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>63

gtagtcaccg gtaaattcct tcattacact cttggc                                 36

<210>64

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>64

Asp Glu Val Asp

 1

Claims (109)

1.一种式(I)的化合物：R-连接基团-A-X，其中R是一个或多个官能团，其中所述连接基团是含C、N、S或O的多原子直链或支链，其中A-X为脱卤素酶底物，其中X为卤素。

2.权利要求1的化合物，所述化合物为红球菌(Rhodococcus)脱卤素酶底物。

3.权利要求1的化合物，其中X为Cl或Br。

4.权利要求1的化合物，其中A为(CH₂)_n，n＝4-10。

5.权利要求1的化合物，其中所述连接基团包含(CH₂CH₂O)_y，y＝2-8。

6.权利要求1的化合物，其中所述连接基团分隔R和A至少12个原子。

7.权利要求1的化合物，其中所述连接基团含3-30个原子。

8.权利要求1的化合物，其中所述连接基团具有11-30个原子。

9.权利要求1的化合物，所述化合物为

10.权利要求1的化合物，其中至少一个官能团为氨基酸、蛋白、糖蛋白、核酸分子、药物、脂质、生物素或固相支持体。

11.权利要求1的化合物，其中至少一个官能团为光学可检测分子。

12.权利要求11的化合物，其中至少一个官能团为荧光团。

13.权利要求1的化合物，其中R是以下的一种：

其中R₁为C₁-C₈。

14.权利要求1的化合物，所述化合物包含两个官能团。

15.权利要求1的化合物，其中至少一个官能团结合Ca²⁺、结合K⁺、结合Na⁺、pH敏感、为放射性核素、电子不透明、为发色团、为MRI造影剂、在NO存在时有荧光或对活性氧敏感。

16.一种突变脱卤素酶，所述酶相比于对应的野生型脱卤素酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述突变脱卤素酶与含有一个或多个官能团的脱卤素酶底物形成键，所述键比对应的野生型脱卤素酶和所述底物形成的键更稳定，其中所述在突变脱卤素酶中的至少一个氨基酸置换为在对应野生型脱卤素酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应野生型脱卤素酶和所述底物形成的键，或者所述置换为在对应野生型脱卤素酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换，其中在与活化水分子相关残基上置换后的氨基酸不是谷氨酰胺或天冬酰胺。

17.权利要求16的突变脱卤素酶，其中所述置换在野生型脱卤素酶中活化水分子的残基上。

18.权利要求17的突变脱卤素酶，其中所述在野生型脱卤素酶中活化水分子的残基为组氨酸。

19.权利要求16的突变脱卤素酶，其中所述置换在野生型脱卤素酶中与所述底物形成酯中间体的残基上。

20.权利要求19的突变脱卤素酶，其中所述在野生型脱卤素酶中形成酯中间体的残基为天冬氨酸。

21.权利要求16的突变脱卤素酶，其中至少一个所述置换在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶氨基酸残基272的位置上。

22.权利要求21的突变脱卤素酶，其中所述在对应于氨基酸残基272位置上的置换后氨基酸是苯丙氨酸、甘氨酸或丙氨酸。

23.权利要求16的突变脱卤素酶，其中至少一个所述置换在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶氨基酸残基106的位置上。

24.权利要求23突变脱卤素酶，其中所述在对应于氨基酸残基106位置上的置换后氨基酸是半胱氨酸或谷氨酸。

25.权利要求16的突变脱卤素酶，所述酶还含有目标蛋白，由此形成融合蛋白。

26.权利要求25的突变脱卤素酶，其中所述目标蛋白为选择标记蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、核内蛋白、结构蛋白、酶、酶底物、受体蛋白、转运蛋白、转录因子、通道蛋白、磷蛋白、激酶、信号蛋白、代谢蛋白、线粒体蛋白、受体相关蛋白、核酸结合蛋白、胞外基质蛋白、分泌性蛋白、受体配体、血清蛋白、免疫原性蛋白、荧光蛋白或具有活性半胱氨酸的蛋白。

27.权利要求16的突变脱卤素酶，所述酶与对应野生型脱卤素酶的氨基酸序列一致性至少为85％。

28.一种突变丝氨酸β-内酰胺酶，所述酶相比于对应的野生型丝氨酸β-内酰胺酶包含至少两个氨基酸置换，其中所述突变丝氨酸β-内酰胺酶与含有一个或多个官能团的丝氨酸β-内酰胺酶底物形成键，所述键比对应野生型丝氨酸β-内酰胺酶和所述底物形成的键以及具有一种置换的突变β-内酰胺酶和所述底物形成的键更稳定，其中所述突变丝氨酸β-内酰胺酶中的至少两个氨基酸置换为在对应野生型丝氨酸β-内酰胺酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应野生型丝氨酸β-内酰胺酶和所述底物形成的键，并且其中所述突变丝氨酸β-内酰胺酶中的至少两个氨基酸置换与突变丝氨酸β-内酰胺酶和所述底物形成的键的稳定性相关。

29.权利要求28的突变β-内酰胺酶，其中所述置换在对应于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)丝氨酸β-内酰胺酶的氨基酸残基166和氨基酸残基170的位置上。

30.权利要求29的突变β-内酰胺酶，其中所述在对应于突变β-内酰胺酶氨基酸残基166位置上的置换后氨基酸为天冬氨酸。

31.权利要求28的突变β-内酰胺酶，其中所述在对应于突变β-内酰胺酶氨基酸残基170位置上的置换后氨基酸为谷氨酰胺。

32.权利要求31的突变β-内酰胺酶，其中所述在对应于突变β-内酰胺酶氨基酸残基166位置上的置换后氨基酸为天冬氨酸，并且所述在对应于突变β-内酰胺酶氨基酸残基170位置上的置换后氨基酸为谷氨酰胺。

33.权利要求28的突变β-内酰胺酶，所述酶还含有目标蛋白，由此形成融合蛋白。

34.权利要求33的突变β-内酰胺酶，其中所述目标蛋白为选择标记蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、核内蛋白、结构蛋白、酶、酶底物、受体蛋白、转运蛋白、转录因子、通道蛋白、磷蛋白、激酶、信号蛋白、代谢蛋白、线粒体蛋白、受体相关蛋白、核酸结合蛋白、胞外基质蛋白、分泌性蛋白、受体配体、血清蛋白、免疫原性蛋白、荧光蛋白或具有活性半胱氨酸的蛋白。

35.一种检测或测定突变水解酶存在或量的方法，所述方法包括：

a)使突变水解酶和包含一个或多个官能团的水解酶底物接触，其中所述突变水解酶相比于对应的野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所述底物形成的键比对应野生型水解酶和所述底物形成的键更稳定，其中所述突变水解酶中的至少一个氨基酸置换为对应野生型水解酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换为对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换；

b)检测或测定所述官能团的存在或量，由此检测或测定所述突变水解酶的存在或量。

36.权利要求35的方法，其中所述置换在野生型水解酶中活化水分子的残基上。

37.权利要求36的方法，其中所述野生型水解酶中活化水分子的残基为组氨酸。

38.权利要求35的方法，其中所述置换在野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的残基上。

39.权利要求38的方法，其中所述野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的残基为天冬氨酸。

40.一种分离样品中目标分子、细胞或亚细胞器的方法，所述方法包括：

a)使样品与含突变水解酶的融合蛋白以及包含一个或多个官能团的水解酶底物接触，其中所述突变水解酶相比于对应的野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所述底物形成的键比对应野生型水解酶和所述底物形成的键更稳定，其中所述突变水解酶中的至少一个氨基酸置换为对应野生型水解酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换为对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换，其中所述融合蛋白包含结合目标分子、细胞或亚细胞器的蛋白；

b)分离所述目标分子、细胞或亚细胞器。

41.权利要求40的方法，其中所述置换在野生型水解酶中活化水分子的残基上。

42.权利要求41的方法，其中所述野生型水解酶中活化水分子的残基为组氨酸。

43.权利要求40的方法，其中所述置换在野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的残基上。

44.权利要求43的方法，其中所述野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的残基为天冬氨酸。

45.权利要求40的方法，其中至少一个官能团为固相支持体或结合固相支持体的分子。

46.权利要求40的方法，其中所述目标分子为蛋白。

47.一种标记细胞的方法，所述方法包括：

a)使含突变水解酶的细胞与包含一个或多个官能团的水解酶底物接触，其中所述突变水解酶相比于对应的野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所述底物形成的键比对应野生型水解酶和所述底物形成的键更稳定，其中所述突变水解酶中的至少一个氨基酸置换为对应野生型水解酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换为对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换；

b)检测或测定所述官能团的存在或量。

48.权利要求47的方法，其中所述置换在野生型水解酶中活化水分子的残基上。

49.权利要求48的方法，其中所述野生型水解酶中活化水分子的残基为组氨酸。

50.权利要求47的方法，其中所述置换在野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的残基上。

51.权利要求50的方法，其中所述野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的残基为天冬氨酸。

52.权利要求35、40或47任一项的方法，其中所述野生型水解酶为脱卤素酶。

53.权利要求52的方法，其中所述底物包含R-连接基团-A-X，其中R是一个或多个官能团，其中所述连接基团是含C、N、S或O的多原子直链或支链，其中A-X为脱卤素酶底物，其中X为卤素。

54.权利要求53的方法，其中所述A为(CH₂)_n，n＝4-10。

55.权利要求53的方法，其中所述连接基团包含(CH₂CH₂)_y，y＝2-8。

56.权利要求53的方法，其中所述连接基团分隔R和A至少12个原子。

57.权利要求35、40或47任一项的方法，其中所述野生型水解酶为丝氨酸β-内酰胺酶。

58.权利要求35、40或47任一项的方法，其中所述突变水解酶存在于细胞中或细胞表面上。

59.权利要求35、40或47任一项的方法，其中至少一个官能团为氨基酸、蛋白、糖蛋白、核酸分子、药物、脂质、生物素或固相支持体。

60.权利要求35、40或47任一项的方法，其中至少一个官能团为光学可检测分子。

61.权利要求60的方法，其中至少一个官能团为荧光团。

62.权利要求35、40或47任一项的方法，其中所述底物包含两个官能团。

63.权利要求35、40或47任一项的方法，其中至少一个官能团结合Ca²⁺、结合K⁺、结合Na⁺、pH敏感、电子不透明、为发色团、为MRI造影剂、为放射性核素、在NO存在时有荧光或对活性氧敏感。

64.权利要求35、40或47任一项的方法，其中细胞中至少一个官能团的存在与所述突变水解酶的亚细胞定位相关。

65.权利要求35、40或47任一项的方法，其中所述突变水解酶还含有目标蛋白，由此形成融合蛋白。

66.权利要求65的方法，其中所述目标蛋白为选择标记蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、核内蛋白、结构蛋白、酶、酶底物、受体蛋白、转运蛋白、转录因子、通道蛋白、磷蛋白、激酶、信号蛋白、代谢蛋白、线粒体蛋白、受体相关蛋白、核酸结合蛋白、胞外基质蛋白、分泌性蛋白、受体配体、血清蛋白、免疫原性蛋白、荧光蛋白或具有活性半胱氨酸的蛋白。

67.权利要求47的方法，其中所述突变水解酶还含有选择标记蛋白。

68.权利要求67的方法，其中所述底物中的至少一个官能团为荧光团。

69.权利要求68的方法，其中所述突变水解酶与所述底物形成酯键。

70.权利要求68的方法，其中所述突变水解酶与所述底物形成硫酯键。

71.权利要求47的方法，所述方法还包括在使所述细胞与所述底物接触之前或之后使所述细胞与固定剂接触。

72.权利要求47的方法，所述方法还包括在使所述细胞与所述底物接触的同时使所述细胞与固定剂接触。

73.权利要求71或72的方法，其中所述细胞用甲醇、丙酮和/或多聚甲醛固定。

74.权利要求67的方法，所述方法还包括在使所述细胞与所述底物接触之前或之后使所述细胞与固定剂接触。

75.权利要求67的方法，所述方法还包括在使所述细胞与所述底物接触的同时使所述细胞与固定剂接触。

76.权利要求74或75的方法，其中所述细胞用甲醇、丙酮和/或多聚甲醛固定。

77.权利要求52的方法，其中所述突变脱卤素酶由优化用于在选择宿主细胞中表达的核酸序列编码。

78.一种化合物，所述化合物为式II-XXVIII的任一种。

79.一种分离多核苷酸，所述多核苷酸包含编码脱卤素酶的核酸序列，其中所述脱卤素酶的核酸序列被优化用于在选择的宿主细胞中表达。

80.权利要求79的分离多核苷酸，其中所述脱卤素酶为相比于对应的野生型脱卤素酶包含至少一个氨基酸置换的突变脱卤素酶，其中所述突变脱卤素酶与脱卤素酶底物形成键，所述键比对应野生型脱卤素酶和所述底物形成的键更稳定，其中所述突变脱卤素酶中的至少一个氨基酸置换为对应野生型脱卤素酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应野生型脱卤素酶和所述底物形成的键，或者所述置换为对应野生型脱卤素酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换。

81.权利要求79的分离多核苷酸，其中所述核酸序列在中等严格条件下与SEQ ID NO：50或其互补序列杂交。

82.权利要求81的分离多核苷酸，其中所述核酸序列在高严格条件下与SEQ ID NO：50或其互补序列杂交。

83.权利要求79的分离多核苷酸，其中所述核酸序列编码的突变脱卤素酶和对应野生型脱卤素酶的氨基酸序列一致性至少为85％。

84.权利要求83的分离多核苷酸，其中所述对应的脱卤素酶由SEQ ID NO：51编码。

85.权利要求79的分离多核苷酸，其中所述核酸序列与SEQ IDNO：51的核酸序列一致性低于90％。

86.权利要求79的分离多核苷酸，其中所述核酸序列与SEQ IDNO：50的核酸序列一致性至少为90％。

87.一种分离细胞，所述细胞含有融合蛋白编码多核苷酸，其中所述融合蛋白包含选择标记蛋白和能够不可逆或稳定结合含官能团底物或其部分的蛋白。

88.权利要求87的细胞，其中所述官能团为荧光团。

89.权利要求87的分离细胞，其中所述能够稳定结合含官能团底物的蛋白是突变水解酶，所述酶相比于对应的野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述突变水解酶与包含荧光团的水解酶底物形成键，所述键比对应野生型水解酶和所述底物形成的键更稳定，其中所述突变水解酶中的至少一个氨基酸置换为对应野生型水解酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应野生型水解酶和底物形成的键，或者所述置换为对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换。

90.权利要求87的分离细胞，其中所述蛋白不可逆地结合含官能团底物的至少一部分。

91.一种标记细胞的方法，所述方法包括：

使含融合蛋白的细胞和含官能团的底物接触，所述融合蛋白包含选择标记蛋白和第二种能够不可逆或稳定结合所述底物或其一部分的蛋白。

92.权利要求91的方法，其中选择表达选择标记蛋白的细胞后使所述细胞与所述底物接触。

93.权利要求91的方法，其中在使所述细胞与所述底物接触之后选择表达选择标记蛋白的细胞。

94.权利要求91的方法，其中所述官能团为荧光团。

95.权利要求91的方法，所述方法还包括在使所述细胞与所述底物接触之前或之后使所述细胞与固定剂接触。

96.权利要求91的方法，所述方法还包括在使所述细胞与所述底物接触的同时使所述细胞与固定剂接触。

97.一种突变水解酶，所述酶相比于对应的野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述突变水解酶与含有一个或多个官能团的水解酶底物形成键，该键比对应的野生型水解酶和所述底物形成的键更稳定，其中所述在突变水解酶中的至少一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与活化水分子相关的氨基酸残基上的置换，所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换为在对应的野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换，其中在与活化水分子相关的残基上的置换后氨基酸不是谷氨酰胺或天冬酰胺。

98.权利要求97的突变水解酶，其中所述置换在野生型水解酶中活化水分子的残基上。

99.权利要求98的突变水解酶，其中所述野生型水解酶中活化水分子的残基为组氨酸。

100.权利要求97的突变水解酶，其中所述置换在野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的残基上。

101.权利要求100的突变水解酶，其中所述野生型水解酶中形成酯中间体的残基为天冬氨酸。

102.权利要求97的突变水解酶，其中至少一个所述置换在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶氨基酸残基272的位置上。

103.权利要求102的突变水解酶，其中所述在对应于氨基酸残基272位置上的置换后氨基酸是苯丙氨酸或甘氨酸。

104.权利要求97的突变水解酶，其中至少一个所述置换在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶氨基酸残基106的位置上。

105.权利要求104的突变水解酶，其中所述在对应于氨基酸残基106位置上的置换后氨基酸是半胱氨酸或谷氨酸。

106.权利要求97的突变水解酶，其中所述在与活化水分子相关残基上的置换后氨基酸不是甲硫氨酸、天冬氨酸或丙氨酸。

107.一种制备式R-连接基团-A-X化合物的方法，所述方法包括偶联式R-Y的化合物和式Z-连接基团-A-X的化合物，其中Y和Z是可反应以将R-与-连接基团-A-X连接的基团。

108.权利要求107的方法，其中R-Y是式R化合物的活化酯，其中Z是适于和所述活化酯反应形成酰胺键的胺。

109.一种制备式R-连接基团-A-X化合物的方法，其中所述连接基团含酰胺键，所述方法包括偶联对应的活化酯和对应的胺，以提供式R-连接基团-A-X的化合物。

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