CN1650007A - 胚胎修饰动物及其产生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高效产生可繁殖的动物的方法，所述方法使用具有通过转移或取代而导入其线粒体DNA中的与核DNA相容的线粒体DNA(如野生型DNA)的全能细胞；和由该方法产生的动物。当全能细胞是源自近交品系小鼠的ES细胞时，优选采用的方法是四倍体援救法。在嵌合动物的产生过程中，通过回交法、核取代法等用野生型线粒体DNA取代来自所使用动物的全能细胞的线粒体DNA，然后将其注射到四倍体受精卵中。因此，产生了可繁殖的近交品系嵌合动物，而避免了使得动物在出生后由于立即出现的呼吸障碍等导致的死亡危险性。所获得的可繁殖的近交品系嵌合动物可用于基因功能分析、动物实验等而无需复杂的近交品系操作。
Description
技术领域
本发明涉及从处理的胚胎以高效产生可繁殖的动物的方法，其中胚胎在产生基因修饰动物如基因剔除小鼠时表现出种系传递。更具体来说，当产生全能细胞如胚胎干细胞(ES细胞)时，本发明涉及从全能细胞产生动物的方法，其中全能细胞是通过回交、细胞融合、线粒体注射、前核置换、体细胞核转移等导入所需要类型的线粒体DNA或用所需要类型的线粒体DNA取代而制备的。特别地，当动物品种为小鼠时，本发明涉及高效产生可繁殖的近交种系嵌合小鼠的方法，其改善了出生率和新生儿的存活率。
本发明进一步涉及通过上述任何一种方法产生的可繁殖的小鼠，其中线粒体DNA是适应型线粒体DNA，它是没有核线粒体不相容性发生的基因型，并且全能细胞可传递到种系中。
背景技术
通常认为，产生嵌合小鼠的技术早于产生所谓的靶基因小鼠例如基因除剔小鼠技术。利用ES细胞产生的嵌合小鼠被证实可传递到种质系。同样地下述胚胎干细胞已被证实可传递到种质系，即利用从C57BL/6小鼠和CBA小鼠的杂交种中建立的胚胎干细胞系TT2细胞，和从小鼠的129次代品系中建立的胚胎干细胞系，其中次代品系是非标准品系(有三种标准品系的小鼠：BALB/c，C57BL/6和C3H)。因此，为了在表型分析或基因功能分析中作为实验动物等而使用嵌合小鼠，需要通过回交法将产生的小鼠(基因修饰小鼠)中的靶基因修饰导入到近交小鼠中。特别地，这要求复杂的过程，包括利用杂种品系或非标准品系的胚胎干细胞产生基因修饰胚胎干细胞，用这种细胞产生种系嵌合小鼠，然后获得的异源型基因修饰小鼠(通常使用雄性小鼠)与标准品系近交小鼠反复回交将，产生标准品系的近交小鼠。
相反地，已尝试通过从近交小鼠建立胚胎干细胞来直接产生近交品系的种系嵌合小鼠。然而，尽管有报告称从如上所述的近交鼠例如C57BL/6中得到的胚胎干细胞中获得种系嵌合小鼠，但还没有在实际中应用。目前，已利用了如上所述的杂种品系。因此，为获得种系嵌合小鼠而获取优良的近交小鼠的胚胎干细胞是十分困难的。
另外，据说个体发生仅仅利用胚胎干细胞是根本不可能的。
同时，四倍体援救法已作为从胚胎干细胞选择性产生嵌合小鼠的方法(Nagy A等人，Development 110，815-821，1990)。这种方法的基础是认识到四倍体细胞发育成胎盘，而且当它们被注射进四倍体受精卵时仅仅ES细胞能发育成个体。这种技术称为四倍体援救法。然而，根据关于比较和验证四倍体援救法和核转移技术的最近报道，大多数新生儿出生后死于呼吸障碍，而且当利用BALB/c鼠建立ES细胞时，通过四倍体援救法仅获得一个近交嵌合小鼠(Eggan K等人，PNAS98，6209-6214，2001)。而且，关于利用体细胞核转移技术产生克隆小鼠，也已报道所获得的近交小鼠，大多数新生儿出生后死于呼吸障碍，而且通过利用杂种小鼠的细胞核能够获得可养活的新生克隆小鼠(Wakayama T等人，Nature 394，369-374，1998；Wakayama T等人，PNAS 96，1484-1498，1999；Humpherys D等人，Science 296，95-97，2001)。如上所述，即使没有观察到明显的异常，通过四倍体援救法而仅从近交小鼠的ES细胞产生的嵌合小鼠和从近交小鼠的体细胞核而获得的克隆小鼠，许多情况下都会因为呼吸障碍而死亡。除小鼠之外，当动物品种被改变成哺乳动物时会发生这种问题。
此外，成功产生常规的基因剔除小鼠是利用来源于从杂种品系或小鼠129次代品系、非标准品系的ES细胞获得的种系嵌合体，但不是来自近交小鼠的ES细胞。极少报道利用来源于近交小鼠的ES细胞，可以产生嵌合小鼠。还没有相关的报道。在大多数成功的例子中没有报道种系传递，因此基本上不可能获得种系嵌合小鼠。如上所述，四倍体援救法已被认为是唯一的办法来解决近交嵌合小鼠的产生中的问题。然而，通过这种方法获得的大多数新生儿在出生后立即死于呼吸障碍(Eggan K等人，PNAS 98，6209-6214，2001)。这样，不可能真正获得可繁殖的嵌合小鼠。
发明概述
在上述背景下，我们已集中地研究了来源于处理的胚胎的动物例如可繁殖的嵌合动物的产生。具体地说，我们研究了嵌合小鼠的产生，其中线粒体DNA是适应型(通过线粒体DNA没有核线粒体不相容性，例如野生型线粒体DNA发生)和全能细胞可传递到种质中。
具体地，本发明的目的是高效获得来源于处理的胚胎的动物，如可繁殖嵌合动物，尤其是近交嵌合动物，更为具体的是近交嵌合小鼠个体。特别地，本发明目的是建立产生以下动物的方法：源自全能细胞的近交嵌合动物，其中的全能细胞如ES细胞来自通过四倍体援救法获得的嵌合动物的产生过程中利用的近交动物；及近交嵌合动物，特别是近交嵌合小鼠，而避免近交嵌合小鼠在出生后立即死于呼吸障碍。
具体地，在通过四倍体援救法获得嵌合动物的产生过程中，本发明的目的是提供交效产生以下动物的方法：源自来源于所用近交动物的全能细胞如ES细胞的近交嵌合动物；及可繁殖的近交嵌合动物，特别是近交嵌合小鼠，而尤其避免了近交嵌合小鼠在出生后立即死于呼吸障碍。
本发明的第二个目的是提供可繁殖的近交嵌合小鼠，它来源于处理的胚胎，例如通过如上产生方法获得的嵌合动物，它们在出生后立即由于呼吸障碍的死亡率特别低，其中线粒体DNA是适应型线粒体DNA，而且全能细胞能传递到种系中。
此外，本发明的第三个目的涉及用于产生来源于处理的胚胎的动物的全能细胞，特别是胚胎干细胞。
本发明中的全能细胞意指能够分化成任一种类细胞的未分化细胞，这种细胞的例子包括胚胎干细胞和核转移胚胎。
本发明的特征涉及：产生上述来源于处理的胚胎的可繁殖动物，特别是可繁殖的种系嵌合动物的方法；通过这种方法产生的可繁殖嵌合动物，尤其是嵌合小鼠和可繁殖的近交嵌合小鼠；和用于这种方法的全能细胞。
具体地，本发明为能应用到来源于处理的胚胎的动物，特别是作为基因修饰小鼠如所谓基因剔除小鼠的产生结果而获得的嵌合小鼠的方法。本方法特征在于它包括将适应型线粒体DNA导入到受体细胞中或用适应型线粒体DNA取代受体细胞线位体DNA，或利用其中宿主胚胎的线粒体DNA已被导入或用适应型线粒体DNA取代的细胞。在这种情况中，可以利用其中导入适应型线粒体DNA的全能细胞和未处理的宿主胚胎、未处理的全能细胞和其中导入适应型线粒体DNA的宿主胚胎、其中导入适应型线粒体DNA的全能细胞和其中导入适应型线粒体DNA的宿主胚胎等。这样产生的嵌合动物具有适应型线粒体DNA。这种适应型线粒体DNA的例子包括野生型来源的线粒体DNA和野生型小鼠的Musmusculus musculus型DNA。当来源于全能细胞例如ES细胞的种系嵌合动物产生于近交动物和特别是完全来源于ES细胞的嵌合小鼠产生时，其中线粒体DNA被导入或取代的全能细胞例如近交小鼠的ES细胞被用于注射进四倍体受精卵。通过种方式，可以避免获得的近交嵌合小鼠在出生后由于呼吸障碍而立即死亡等问题，因而能够高效地产生可繁殖的近交嵌合小鼠。
至今，当通过四倍体援救法利用近交小鼠的ES细胞而选择性产生近交嵌合小鼠时，大多数获得的嵌合小鼠出生后立即死于呼吸障碍。实际上不可能通过四倍体援救法获得可繁殖的嵌合小鼠。有人提出异常DNA甲基化模式的存在是造成通过四倍体援救法获得的大多数新生儿出生后死于呼吸障碍的原因(Dean W等人，Development125，2237-2282，1998)。除这个原因之外，我们首次证实线粒体DNA和核DNA之间的不相容性也是原因之一。因此，通过将来源于近交小鼠的ES细胞的线粒体DNA转换成野生型小鼠的线粒体DNA以便DNA能适应核DNA，这样能够避免出生后的立即死亡。当我们在近交动物(小鼠)中应用这种技术时，能够有效产生种系嵌合小鼠。我们相信如果适应型线粒体DNA被导入到由胚胎处理产生的动物中，在克隆动物和常规的双倍体嵌合动物中也具有这种类似的效果。
本发明提供如下方法、通过这种方法产生的来源于处理的胚胎的动物，特别是嵌合动物以及全能细胞。
1.产生动物的方法，该动物来源于源自全能细胞的处理的胚胎，包括使用其中导入适应于核DNA的适应型线粒体DNA的细胞。
2.如第1项产生动物的方法，其中来源于源自全能细胞的处理的胚胎的动物是嵌合动物。
3.如第2项产生动物的方法，其中嵌合动物是近交嵌合动物。
4.上述第1-3项中任一项的产生动物的方法，包括使用其中导入适应型线粒体DNA的全能细胞和未处理的宿主胚胎、未处理的全能细胞和其中导入适应型线粒体DNA的宿主胚胎、或其中导入适应型线粒体DNA的全能细胞和其中导入适应型线粒体DNA的宿主胚胎。
5.如第4项产生动物的方法，包括使用四倍体受精卵作为动物的宿主胚胎和全能细胞作为其中导入适应型线粒体DNA的细胞。
6.根据四倍体援救法的上述第5项产生动物的方法，包括将其中导入适应型线粒体DNA的全能细胞注射到四倍体受精卵的胚泡中。
7.上述第1-6项中任一项的产生动物的方法，其中具有导入的适应型线粒体DNA细胞是由于到代而具有适应型线粒体DNA的细胞。
8.利用具有与供体细胞的核DNA相适应的适应型线粒体DNA的受体卵母细胞，通过核转移以产生克隆个体的方法。
9.根据上述第1-8项中任一项的产生动物的方法，其中核-线粒体不相容性导致出生后立即出现的呼吸障碍。
10.根据上述第1-9项中任一项的产生动物的方法，其中适应型线粒体DNA是源自野生型的线粒体DNA。
11.上述第1-10中任一项的产生动物的方法，其中所述动物是小鼠。
12.根据上述第1-11项中任一项的产生动物的方法，其中用所需要的线粒体DNA取代线粒体DNA的方法是回交法或前核取代法。
13.根据上述第9-12项中任一项的产生动物的方法，其中所需要的线粒体DNA是野生型小鼠Mus musculus musculus型的线粒体DNA。
14.可繁殖的嵌合动物，所述动物由上述第1-13任一项的方法所产生，其中线粒体DNA被导入适应型DNA或用适应型DNA取代，而且全能细胞可传递到种系中。
15.上述第14项的动物，其中动物是小鼠。
16.用于产生可繁殖的遗传性处理的动物的全能细胞，其中线粒体DNA中已被导入适应型DNA或用适应型DNA取代，适应型DNA，而其特征可传递到种系中。
17.上述第16项的全能细胞，其中与核DNA的适应性降低了出生后立即出现的呼吸障碍。
18.上述第16或17项的全能细胞，其中适应型线粒体DNA已作为线粒体DNA被导入。
19.上述第18项的全能细胞，其中适应型线粒体DNA是野生型小鼠Mus musculus musculus型的线粒体DNA。
20.上述第16-19项中任一项的胚胎干细胞，其中遗传性处理的动物是小鼠。
本发明最佳实施方式
通过本发明方法获得源自处理的胚胎的动物，优选通过用全能细胞例如胚胎干细胞或近交动物的核转移胚胎经四倍体援救法而获得。因此，根据本发明获得的动物基本上是近交动物，其中大多数细胞包括种系细胞是源自所使用的近交动物的全能细胞。而且，由于所使用的近交动物的全能细胞例如胚胎干细胞的线粒体DNA，预先用那些野生型品种的线粒体DNA通过前核取代等方法作了取代，获得的嵌合动物没有立即死于出生后的呼吸障碍而能生长。因此，能够有效地获得可繁殖嵌合动物，而且可用于基因功能分析或作为实验动物的近交动物能够直接从获得的种系嵌合动物中获取。因此，因为无需消耗时间的重复和复杂的杂交来产生近交动物，因而该方法非常有用。这种近交动物可以是任何动物，只要已报道用它们通常能产生嵌合体。特别优选的是近交动物。这种动物优选为哺乳动物，进一步优选为啮齿动物，尤其优选为小鼠。
来源于这些动物的全能细胞例如胚胎干细胞可由公知方法制备，然后用于本发明中。利用来源于小鼠的胚胎干细胞的具体实施方式将在下面阐述。按通常理解，用于本发明的动物品种不仅仅局限于小鼠。
制备源自小鼠的线粒体DNA取代的胚胎干细胞是根据上述常规技术通过线粒体DNA的细胞内替换而获得。近交小鼠的线粒体DNA取代可产生近交小鼠(在许多情况中，近交小鼠属于标准品系例如C57BL/6、C3H或BALB/c)，其中具有所需要类型的线粒体DNA，这是由于通过回交法、核转移法等进行取代，然后建立小鼠的ES细胞，进而获得具有线粒体被取代了的ES细胞，该ES细胞可用于本发明。当C57BL/6近交小鼠与Mus musculus musculus野生型小鼠通过回交法反复杂交12次或更多次时，得到的B6-mtMus近交小鼠中的C57BL/6近交小鼠的线粒体DNA已被那些野生型小鼠的Mus musculus musculus型线粒体DNA所取代。从这种小鼠，可以建立其中适应型鼠的Musmusculus musculus型DNA取代了线粒体DNA的胚胎干细胞。
同时，当，根据标准方法(McGrath J&Solter D，J Exp Zool，228，355-362，1983)使用前核取代法时，mdx近交小鼠的前核阶段受精卵的雄性和雌性前核被移植到具有野生型鼠的Mus musculusmusculus型线粒体的的摘除了细胞核的前核阶段受精卵中。通过电脉冲实现核融合，培育受精卵，然后将受精卵移植到小鼠输卵管中以便个体发生，因而产生了其中线粒体DNA被Mus musculus musculus型的线粒体DNA取代的mdx-mtMus近交小鼠。类似地，其中线粒体DNA被野生型的线粒体DNA取代的胚胎干细胞可用这种小鼠来建立。
为建立ES细胞，通过这种方式从近交小鼠中搜集胚泡阶段的胚胎，如从B6-mtMus或mdx-mtMus中收集，然后通过标准方法就能建立ES细胞(Evans MJ&Kaufman MK，Nature 292，154-156，1981)。
将通过上述方法获得的具有预期特征的ES细胞注射进受精卵的胚胎中，优选为已分裂为两个胚泡阶段的四倍体受精卵的四倍体胚胎，进而产生一种嵌合小鼠。
胚泡阶段的四倍体胚胎通过ICR小鼠自然交配获得，其中ICR小鼠已用同品系雄性小鼠进行超数排卵诱导处理，从已证实堵塞的小鼠个体中通过冲冼输卵管而收集后期2-细胞阶段胚胎，进而通过电脉冲法进行融合处理以制备四倍体胚胎，然后在M16培养基或CZB培养基中培养该胚胎。从选定的B6-mtMus或mdx-mtMus近交小鼠制备ES细胞利用微量注射器例如加压微操纵器而将其注射进所获得的胚泡阶段的胚胎中。接下来，将获得的已被注射ES细胞的胚泡阶段胚胎移植进经过杂交和证实堵塞后2.5天的受体ICR小鼠的子宫中。分娩前的晚上(怀孕后18.5天的晚上)，通过剖腹产术取出嵌合小鼠胎儿，进行复苏。确认胎儿能够活动后，按事先准备好的哺育母鼠对它们进行饲养。这样获得的大多数新生儿(嵌合体)能够自发呼吸，且几乎生长正常没有畸形。对如此培育的嵌合小鼠，将来自ES细胞的所有细胞，包括种系细胞，均进行了鉴定，结果表明这种小鼠能再生成预期动物，且能进一步繁殖。
实施例
本发明通过下述实施例进行详细描述。然而这些实施例仅在于阐明本发明，而本发明不受这些实施例所限制。
实施例1
具有取代的线粒体DNA的近交小鼠的产生
(1)通过回交法产生具有由Mus musculus musculus-型线粒体DNA所取代的近交B6-mtMus和B6-GFP-mtMus
通过8周龄雄性C57BL/6J近交小鼠与8周龄雌性Mus musculusmusculus野生型小鼠杂交获得雌鼠(8周龄)。获得的雌鼠又与8周龄雄性C57BL/6J近交小鼠进行回交。通过12次或更多次的重复杂交，产生B6-mtMus近交小鼠，其中线粒体DNA被Mus musculus musculus型的线粒体DNA所取代。此外，通过巢式PCR(Nested-PCR)方法(Kaneda H等人，PNAS 92，4542-4546，1995)分析了其中的线粒体DNA，以证实DNA被Mus musculus musculus型的DNA取代。
此外，雌性B6-mtMus(N18)小鼠与雄性B6-GFP#4小鼠(Ichida等人，)杂交，而产生B6-GFP-mtMus小鼠。
(2)通过前核取代法产生近交疾病模型小鼠C57BL/10J-mdx-mtMus(mdx-mtMus)
对3周龄雌性mdx近交疾病模型小鼠(C57BL/10-mdx)和具有3周龄野生型小鼠的Mus musculus musculus型线粒体DNA的3周龄雌性杂交小鼠(由♀BALB-mtMus+♂C57BL/6产生的杂种小鼠(CBF1-mtMus))进行超数排卵诱导处理(给予每只小鼠5IU/0.05ml的怀孕母驴血清促性腺激素(PMSG)，48小时后给予每只小鼠5IU/0.05ml的人绒毛膜促性腺激素(hCG))。雌性杂种小鼠与8周龄雄性ICR小鼠生活在一起以进行自然交配。在给予hCG之后24小时，搜集卵以制备前核阶段的受精卵。用所获得的前核阶段受精卵，根据标准方法(McGrath J&Solter D，J.Exp.Zool.228，355-362，1983)进行前核取代。具体地，将前核阶段受精卵的雄性和雌性前核(pronuclei)、来源于上述的C57BL/10-mdx近交疾病模型小鼠的供体受精卵导入到被摘除细胞核的前核阶段受精卵中，该受体受精卵来源于上述具有野生型小鼠的Mus musculus musculus型线粒体DNA的CBF1-mtMus杂交小鼠。通过电脉冲进行核融合之后，卵在补充有0.1mM EDTA的M16培养质(94.59mM NaCl，4.78mM KCl，1.71mM CaCl2，1.19mM KH2PO4，1.19mM MgSO4，25.07mM NaHCO3，23.28mM乳酸钠、0.33mM丙酮酸钠，1g/L葡萄糖，4g/L BSA，100IU/mL青霉素和50Hg/mL链霉素)中，于37℃和5％CO2-5％O2-90％N2条件下培养过夜，然后移植到小鼠输卵管中。共16个受精卵(每个子宫8个卵)被移植到假怀孕0.5天的雌性ICR小鼠输卵管中(雌性小鼠与输精管被结扎的雄性小鼠杂交，在第二天，确认堵塞，这天的中午被定为假怀孕0.5天)。结果，获得了3只雌性和2只雄性幼鼠。所获得的3只雌性小鼠(8周龄或更大)作为起始与雄性mdx(C57BL/10-mdx)小鼠生活在一起，由此获得第二代小鼠。类似地，第二代雌性小鼠与雄性mdx小鼠杂交，由此获得第三代小鼠。通过PCR-RFLP方法对所获得的第三代小鼠的线粒体DNA加以验证。在D-环内设计通用探针(探针产生查阅Kaneda H等人，PNAS 92，4542-4546，1995)：5’-AATTATTTTCCCCAAGC-3’(序列表中的SEQ ID NO：1)和5’-AGAAGAGGGGCA TTG-3’(序列表中的SEQ IDNO：2)。通过扩增获得262bp片段，用Dral限制性酶处理，然后验证非裂解的Mus musculus驯化型DNA和Mus musculus musculus型DNA裂解成122-bp的片段和140-bp的片段。证实了所获得第三代小鼠的线粒体DNA已被Mus musculus musculus型的线粒体DNA所取代，因此产生了近交疾病模型小鼠C57BL/10J-mdx-mtMus(mdx-mtMus)。
实施例2
来自具有取代的Mus musculus musculus型线粒体DNA的近交小鼠的ES细胞的产生
实施例1(1)获得的具有取代的Mus musculus musculus型线粒体DNA的近交雌性B6-mtMus(N15)小鼠与雄性C57BL/6小鼠自然杂交。每只小鼠个体的子宫在证实发生堵塞后第3天，向其中灌注M2培养基，然后收集20个胚泡阶段的胚胎。利用获得的胚胎，根据标准方法建立ES细胞(Evans MJ&Kaufman MK，Nature 292，154-156，1981)。具体地，将先前获得的胚胎逐个地转移到4孔板中的饲养细胞上，该4孔板上分配有ES培养基(80％(v/v DMEM，20％(w/v)FCS、1％(v/v)100mM丙酮酸盐溶液(Gibco Cat.11360-370)、1％(v/v)100×非必需氨基酸溶液(Gibco Cat.11140-027)、1mM巯基乙醇(Sigma，Cat.No.M-6250)和103U/mL LIF)。胚胎然后在37℃和5％CO2-5％O2-90％N2条件下培养。在培养的第5天，挑选已生长的ICM细胞聚集体。用0.125％胰蛋白酶/0.1mM EDTA进行处理以分散细胞，然后将这些细胞在新制备的4孔板上的饲养细胞上进行接种和培养。在第二代，仅仅挑选出类似ES细胞的集落，然后通过相同于第一次的方法在新的4孔板上进行接种和培养。在第3代，整个孔用胰蛋白酶/EDTA处理，然后这些细胞在新的3.5cm培养平板上进行接种，由此获得能生长较好的2个品系。能够到达这个阶段的细胞可稳定地生长，所以这些细胞作为细胞系于低温贮藏。
进而，通过类似操作，利用从实施例1(2)获得的近交疾病模型小鼠mdx-mtMus所获得的6个胚泡阶段的胚胎而建立了4个品系的ES细胞，它们具有取代的Mus musculus musculus型线粒体DNA。
对从上述2个小鼠品系建立的ES细胞的线粒体DNA进行鉴定，确证属于Mus musculus musculus型。
实施例3
四倍体胚泡阶段胚胎的制备
施以超数排卵诱导处理的ICR小鼠与相同品系的雄性小鼠自然交配。给予人绒毛膜促性腺激素(hCG)44-46小时后证实小鼠个体发生堵塞，通过试管灌注法收集晚期2-细胞阶段的胚胎。这样获得的晚期2-细胞阶段的胚胎在0.3M甘露醇中通过直接电流脉冲进行融合处理(用由FUJIHIRA生产的Goku，脉冲条件为：18V，50和999μsec为间隔，分别进行3次)，由此制备成四倍体胚胎。挑选四倍体胚胎，然后在37℃，5％CO2的空气条件下于M16培养基中培养2天，因而得到四倍体胚泡阶段的胚胎。
实施例4
通过四倍体援救法产生嵌合小鼠(1)
从所述B6-mtMus近交小鼠中制备的ES细胞(性别：雄性)，利用加压微操纵器将其注射到实施例3获得的四倍体胚泡阶段的胚胎中。一个四倍体胚泡阶段的胚胎中注射大约10至15个ES细胞。共对76个四倍体胚泡阶段的胚胎进行了注射。ES细胞成功注射的71个四倍体胚泡阶段的胚胎在堵塞被确证后2.5天，移植到4个ICR小鼠受体的子宫中。在分娩前的晚上(怀孕后18.5天的晚上)，通过剖腹产术取出嵌合小鼠胎儿，然后进行复苏。在确认胎儿能够活动后，按事先准备好的哺育母鼠对它们进行饲养。13个由此获得的雄性新生儿没有表现出畸形并能自发进行呼吸，其中4只小鼠生长正常。
实施例5
通过四倍体援救法产生嵌合小鼠(2)
从选好的mdx-mtMus近交疾病模型小鼠中制备ES细胞(性别：雄性)，通过加压微操纵器注射到实施例3制备的四倍体胚泡阶段的胚胎中。每个四倍体胚泡阶段的胚胎中注射大约10至15个ES细胞。共对108个四倍体胚泡阶段的胚胎进行了注射。ES细胞成功注射的89个四倍体胚泡阶段的胚胎在堵塞被确证后2.5天，移植到5个ICR小鼠受体的子宫中。在分娩前的晚上(怀孕后18.5天的晚上)，通过剖腹产术取出嵌合小鼠胎儿，然后进行复苏。在确认胎儿能够活动后，按事先准备好的哺育母鼠对它们进行饲养。19个由此获得的雄性新生儿几乎没有表现出畸形并能自发进行呼吸，其中11只小鼠生长正常。
实施例6
通过四倍体援救法产生嵌合小鼠(3)
从选好的mdx-mtMus近交疾病模型小鼠中制备ES细胞(性别：雌性)，通过加压微操纵器注射到实施例3制备的四倍体胚泡阶段的胚胎中。每个四倍体胚泡阶段的胚胎中注射大约10至15个ES细胞。共对75个四倍体胚泡阶段的胚胎进行了注射。ES细胞成功注射的75个四倍体胚泡阶段的胚胎在堵塞被确证后2.5天，移植到3个ICR小鼠受体的子宫中。在分娩前的晚上(怀孕后18.5天的晚上)，通过剖腹产术取出嵌合小鼠胎儿，然后进行复苏。在确认胎儿能够活动后，按事先准备好的哺育母鼠对它们进行饲养。12个雌性新生儿当中的8个没有表现出畸形并自发进行呼吸。7只小鼠由于饲养不当而死亡或被受体鼠杀死。剩余的1只幼鼠生长正常。
实施例7
通过四倍体援救法产生的嵌合小鼠繁殖性能的确证
从得自实施例1中制得的近交疾病模型mdx-mtMus的ES细胞制备的两个雄性嵌合小鼠与2个正常的雌性mdx-小鼠进行杂交，因此获得38个新生儿。这些小鼠没有表现出畸形并且生长平稳。而且，所有这些小鼠的每一个体均表现出典型的mdx(C57BL/10-mdx)近交疾病模型小鼠的特性。因此，可以确证按本发明方法获得的嵌合小鼠在未来子代中能繁殖生产正常幼鼠。
工业实用性
实施本发明可以得到可繁殖的嵌合动物，特别是近交嵌合动物，进而尤其是能够有效获得近交嵌合小鼠个体。尤其是，实施本发明能有效的产生近交动物而避免了由于在分娩后近交动物呼吸障碍导致的死亡，尤其在来源于全能细胞如ES细胞的嵌合小鼠或来源于近交动物的核转移胚胎，该近交动物是用于通过四倍体援救法获得的嵌合动物的产生过程中。因此获得的嵌合小鼠是可繁殖的近交小鼠，它具有适应于核DNA的线粒体DNA，而且全能细胞可被传递到种系中。
序列表
<110>Nagao，Yasumitsu；Imai，Hiroshi；Horii，Takuro
Totsuka，Yoshikazu
<120>源自处理的胚胎的动物及其产生方法
<130>PH-2203-PCT
<150>JP 2002-51302
<151>2002-2-27
<160>2
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aattattttc cccaagc 17
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
agaagagggg cattg 15
Claims (20)
1.产生动物的方法，该动物来源于源自全能细胞的处理的胚胎，包括使用其中导入适应于核DNA的适应型线粒体DNA的细胞。
2.权利要求1的产生动物的方法，其中来源于源自全能细胞的处理的胚胎的动物是嵌合动物。
3.权利要求2的产生动物的方法，其中嵌合动物是近交嵌合动物。
4.权利要求1-3中任一项的产生嵌合动物的方法，包括使用其中导入适应型线粒体DNA的全能细胞和未处理的宿主胚胎、未处理的全能细胞和其中导入适应型线粒体DNA的宿主胚胎、或其中导入适应型线粒体DNA的全能细胞和其中导入适应型线粒体DNA的宿主胚胎。
5.权利要求4的产生动物的方法，包括使用四倍体受精卵作为动物的宿主胚胎和全能细胞作为其中导入适应型线粒体DNA的细胞。
6.根据四倍体援救法的权利要求5的产生动物的方法，包括将其中导入适应型线粒体DNA的全能细胞注射到四倍体受精卵的胚泡中。
7.权利要求1-6中任一项的产生嵌合动物的方法，其中具有导入的适应型线粒体DNA的细胞是由于取代而具有适应型线粒体DNA的细胞。
8.利用具有与供体细胞的核DNA相适应的适应型线粒体DNA的受体母卵细胞，通过核转移以产生克隆个体的方法。
9.权利要求1-8中任一项的产生动物的方法，其中核-线粒体不相容性导致出生后立即出现的呼吸障碍。
10.权利要求1-9中任一项的产生动物的方法，其中适应型线粒体DNA是源自野生型的线粒体DNA。
11.权利要求1-10中任一项的产生动物的方法，其中所述动物是小鼠。
12.权利要求1-11中任一项的产生动物的方法，其中用所需要的线粒体DNA取代线粒体DNA的方法是回交法或前核取代法。
13.权利要求9-12中任一项的产生动物的方法，其中所需要的线粒体DNA是野生型小鼠Mus musculus musculus型的线粒体DNA。
14.可繁殖的嵌合动物，所述动物由权利要求1-13任一项的方法所产生，其中线粒体DNA被导入适应型DNA或用适应型DNA取代，而且全能细胞可传递到种系中。
15.权利要求14的动物，其中所述动物是小鼠。
16.用于产生可繁殖的遗传性处理的动物的全能细胞，其中线粒体DNA是适应型线粒体DNA，而其特征可传递到种系中。
17.权利要求16的全能细胞，其中与核DNA的适应性降低了出生后立即出现的呼吸障碍。
18.权利要求16或17的全能细胞，其中适应型线粒体DNA已作为线粒体DNA被导入。
19.权利要求18的全能细胞，其中适应型线粒体DNA是野生型小鼠Mus musculus musculus型的线粒体DNA。
20.权利要求16-19中任一项的胚胎干细胞，其中遗传性处理的动物是小鼠。
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2003
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