CN1639199A - 新型支链状唾液糖分子与使用该糖分子的抗病毒剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供下式(I)表示的新型支链状唾液糖分子，所述唾液糖分子是作为对付流感病毒的宿主范围的变异或抗原性的变异、可阻止来自所有的人与动物的A型流感病毒与B型流感病毒感染的医药品或除去病毒用过滤器等的吸附剂使用的物质。(式中，NeuAc表示该NeuAc的羟基、羧基与酰胺基可以相同或分别不同地被卤素、烷基或酰基化学性修饰的N－乙酰神经氨酸，Hex表示己糖、HexNAc表示乙酰己糖胺，R是选自氢原子、烃链、糖链、脂质、蛋白质、合成高分子的基质，R也可以有取代基。另外，N－乙酰神经氨酸与己糖的结合可以是天然存在的邻位糖苷键，也可以是S－糖苷、Se－糖苷键等的化学性变换的结合。)

Description

新型支链状唾液糖分子 与使用该糖分子的抗病毒剂
技术领域
本申请发明涉及新型支链状唾液糖分子(sialo-sugar)。更详细地讲，本申请发明涉及可适应于流感病毒宿主范围变异或抗原性变异、可阻止所有来自人与动物的A型流感病毒与B型流感病毒的感染、及流感流行的医药品或作为除去病毒用过滤器等的吸附剂使用的新型支链状唾液糖分子。
技术背景
日本的流感感染者每年超过数10万人～100万人。1918年的流行性感冒(通过基因解析判明H1N1型流感毒病导致的感冒)全世界一年至少有2000万人，日本死亡38万人以上，位居人类史上最严重、最大的自然灾害。
另外，近年报道流感尤其是使高龄者中并发支气管炎和肺炎而重症化、小孩则引起脑炎或脑症，因此制止冬季的疾病成为世界性当务之急。
流感病原体是流感病毒，已知流感病毒依据内部蛋白质抗原性的不同有A、B、C型三类。B、C型主要由人中分离出，A型病毒除人以外也从野生水鸟、家禽类、猪、马、海豹、鲸鱼、黑足釉等自然界的许多动物中分离出，其病原性最高，引起世界性流行。
流感病毒以分节状的单链RNA为基因组。已知一般读取一根链RNA配列的RNA聚合酶产生的复制，与通常读取2根链DNA的DNA聚合酶产生的复制相比，特别容易引起“差错”(Steinhauer，D.A.，Holland.J.J.：Annual Reviw of Microbiology，41，409-433(1987)；Gojobori，T.，Yamaguchi，Y.，Ikeo，K.，Mizokami，M.：Japanese Journal ofGenetics，69，481-488(1994))。因此，病毒在宿主细胞内增殖时，同时产生新的变异病毒。病毒蛋白质的抗原性因这样的变异而一点一点地发生变化，故通常的免疫监视机构往往检测不出流感病毒，因此每年流行。
对于流感病毒的变异，除了前述的抗原性连续变异(AntigenicDrift)以外，还有宿主范围的变异(Antigenic Shift)(Suzuki，Y.：Progress in Lipid Research，33，429-457(1994))。流感病毒的基因由于不只与一个有关而是分节状，例如人与鸭的流感病毒同时感染到猪上时，在猪体内产生两种的基因产生再集合，有时产生具有全新型(抗原性)的病毒。而且，由于人完全没有对抗这种病毒的抗体，所以人感染上新病毒时则有世界行大流行的危险。
已知流感病毒的感染是因作为病毒糖蛋白质的血细胞凝集素(HA)与存在于宿主细胞表面的含唾液酸的糖链进行结合而引起(Suzuki，Y.：Progress in Lipid Research，33，429-457(1994)；Paulson，J.C.：The Receptors，Vol.2，Academic Press，Orlando，pp.131-219(1985)；Wiley，D.C.and Skehel，J.J.：Annual Review of Biochemistry，56，365-394(1987))。另外，这去研究了这种含唾液酸的糖链，作为抗流感病毒剂报道了各种的含唾液酸糖链(唾液糖类)化合物(Fujimoto，K.，Hayashida，O.，Aoyama，Y.，Guo.C.T.，Hidari.，K.I.P.J.，and Suzuki，Y.：Chemistry Lettel，1259-1260(1999)；Suzuki，Y.，Sato.K.，Kiso，M.，and Hasegawa，A.：Glycoconj.J.7，349-54(1990))。然而，这些化合物均只是对一种类型病毒呈现抗流感病毒性，对同时流行多种类型病毒的现状来说，实际上限制了这些化合物的有效性。
但迄今还没有开发可对付流感病毒在动物种间传播的宿主范围变异或宿主所具有的流感病毒抗体的抗原性变异的抗流感剂。
因此，本申请发明课题是：解决如上述的问题，提供对付流感病毒的宿主范围变异或抗原性变异，可阻止来自所有的人或动物的A型流感病毒与B型流感病毒的感染及流感流行的医药品，或者作为除去病毒用过滤器等的吸附剂使用的物质。
发明内容
本申请发明作为解决如以上课题的目的的发明，第1提供，一种新型支链状唾液糖分子，其特征是，以下式(I)表示。
(式中，NeuAc表示该NeuAc的羟基、羧基与酰胺基可以相同或分别不同地被卤素、烷基或酰基化学性修饰的N-乙酰神经氨酸，Hex表示己糖，HexNAc表示乙酰己糖胺，R是选自氢原子、烃链、糖链、脂质、蛋白质、合成高分子的基质，R也可以有取代基)
本申请发明第2提供：前述新型支链状唾液糖分子，其中，N-乙酰神经氨酸与己糖采用天然的邻位糖苷键而结合，第3提供：前述新型支链状唾液糖分子，其中，N-乙酰神经氨酸与己糖的结合是化学性变换结合，第4提供：前述新型支链状唾液糖分子，其中，N-乙酰神经氨酸与己糖的结合形态选自S-糖苷键或Se-糖苷键。
本申请发明第5提供下式(II)所示结构为特征的新型支链状唾液糖分子。
(式中，NeuAc表示该NeuAc的羟基、羧基与酰胺基可以相同或分别不同地被卤素、烷基或酰基化学性修饰的N-乙酰神经氨酸，Gal表示半乳糖、GlcNAc表示N-乙酰葡糖胺，R是选自氢原子、烃链、糖链、脂质、蛋白质、合成高分子的基质，R也可以有取代基)
此外，本申请发明第6提供下式(III)所示结构为特征的新型支链状唾液糖分子。
Figure A0380515200063
(式中，NeuAc表示该NeuAc的羟基、羧基与酰胺基可以相同或分别不同地被卤素、烷基或酰基化学性修饰的N-乙酰神经氨酸，Gal表示半乳糖，GalNAc表示N-乙酰半乳糖胺，R是选自氢原子、烃链、糖链、脂质、蛋白质、合成高分子的基质，R也可以有取代基)
本申请发明第7提供：前述任何一种的新型支链状唾液糖分，其中，N-乙酰神经氨酸与半乳糖采用天然的邻位糖苷键；第8提供：前述任何一种的新型支链状唾液糖分，其中，N-乙酰神经氨酸与半乳糖的结合是化学性变换结合；第9提供：前述的新型支链状唾液糖分子，其中，N-乙酰神经氨酸与半乳糖的结合形态是S-糖苷键或Se-糖苷键。
此外，本申请发明第10提供：以至少含有前述任何一种新型支链状唾液糖分子作为有效成分为特征的抗病毒剂。
附图的简单说明
图1是表示本申请发明的实施例中流感A型病毒与流感B型病毒与来自孵化鸡蛋浆尿膜的酸性糖脂质的结合性试验(二次展开)结果的照片。(a：病毒(-)、b：使用苔黑酚-H2SO4试剂显色、c：与A/PR/8/34的结合性、d：与A/Aichi/2/68的结合性、e：与B/Lee/40的结合性、f：与B/Gifu/2/73的结合性；S：标准糖脂质＝牛脑全部神经节苷脂(bovinebrain total gangliosides)、S1：α2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂(sialylparagloboside)、S2：α2-3唾液酰拟红细胞糖苷脂)、1st：一次展开(CHCl3/MeOH/88％HCOOH(65/25/10，v/v/v)、2nd：二次展开(CHCl3/Meoh/5N NH4OH(5/4/1，v/v/v)；箭头：与流感病毒共同反应的糖脂质)
图2是表示本申请发明的实施例中采用Iatrobeads柱色谱精制的来自孵化鸡蛋浆尿膜的酸性糖脂质与流感A型病毒及流感B型病毒结合性试验(CHCl3/MeOH/12Mm MgCl25/4/1，v/v/v)结果的照片。(a：病毒(-)、b：用苔黑酚-H2SO4试剂显色、c：与A/Memphis/1/7的结合性、d：与A/PR/8/34的结合性、e：与A/Aichi/2/68的结合性、f：与A/Duck/313/4的结合性；g：与A/Duck/92/1/76的结合性、h：与B/Lee/40的结合性；S：标准糖脂质＝牛脑全部神经节苷脂+GM3、S1：α2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂、S2：α2-3唾液酰拟红细胞糖苷脂；1～7：馏分；箭头：目的糖脂质)
图3是表示本申请发明的实施例中来自孵化鸡蛋浆尿膜的酸性糖脂质的与流感A型病毒的结合性试验(CHCl3/MeOH/12Mm MgCl2/15M NH4OH50/40/7/3，v/v/v)结果的照片。(a：用苔黑酚-H2SO4试剂显色、b：与A/Memphis/1/71的结合性、c：与A/PR/8/34的结合性、S1：α2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂、S2：α2-3唾液酰拟红细胞糖苷脂、AM：来自孵化鸡蛋浆尿膜的精制糖脂质)
图4是表示本申请发明实施例中来自MDCK细胞的酸性糖脂质与流感A型病毒及流感B型病毒的结合性试验(二次展开)结果的照片。(a：病毒(-)、b：用苔黑酚-H2SO4试剂显色、c：与A/PR/8/34的结合性、d：与A/Aichi/2/68的结合性、e：与B/Lee/40的结合性、f：与B/Gifu/2/73的结合性；S：标准糖脂质＝牛脑全部神经节苷脂、S1：α2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂、S2：α2-3唾液酰拟红细胞糖苷脂；1st：一次展开(CHCl3/MeOH/88％HCOOH(65/25/10，v/v/v)、2nd：二次展开(CHCl3/MeOH/5N NH4OH 5/4/1，v/v/v)；箭头：与流感病毒共同反应的糖脂质)。
图5是表示本申请发明的实施例中来自孵化鸡蛋浆尿膜的酸性糖脂质从Iatrobeads柱色谱流出轮廓的照片。(展开溶剂：CHCl3/MeOH/12mMMgCl2(5/4/1，v/v/v)；使用苔黑酚-H2SO4试剂显色)(箭头：表示与流感病毒的共同反应性的糖脂质；1～7：馏分)。
图6是表示本申请发明的实施例中采用Iatrobeads柱色谱精制的来自孵化鸡蛋浆尿膜的酸性糖脂质与流感A型病毒的结合性试验(CHCl3/MeOH/12mM MgCl2)(5/4/1，v/v/v)结晶的照片。(a：病毒(-)、b：用苔黑酚-H2SO4试剂显色、c：与A/Aichi/2/68的结合性、d：与A/Memphis/1/71的结合性、S1：α2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂、S2：α2-3唾液酰拟红细胞糖苷脂；1～7：馏分)。
图7是表示本申请发明的实施例中被贮存的糖脂质从Iatrobeads柱色谱流出轮廓的照片。(展开溶剂：CHCl3/MeOH/12mM MgCl2 5/4/1、v/v/v)；使用苔黑酚-H2SO4试剂显色)(箭头：表示与流感病毒的反应性的糖脂质)。
图8是表示本申请发明的实施例中采用制备用TLC精制的糖脂质的TLC结果的照片。(展开溶剂：CHCl3/MeOH/12mM MgCl2 5/4/1、v/v/v)；使用苔黑酚-H2SO4试剂显色)(S：牛脑全部神经节苷脂)。
图9是表示本申请发明的实施例中，通过制备用TLC精制的来自孵化鸡蛋浆尿膜的糖脂质与流感A型病毒的结合性试验结果的照片；(a：病毒(-)、b：使用苔黑酚-H2SO4试剂显色、c：与A/Aichi/2/68的结合性、d：与A/PR/8/38的结合性、e：与A/Memphis/1/71的结合性、S1：α2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂、S2：α2-3唾液酰拟红细胞糖苷脂；1～5：AM序号；箭头：与任何一种流感病毒进行特异性反应的糖脂质)。
图10是表示本申请发明的实施例中通过制备用TLC精制的来自孵化鸡蛋浆尿膜的糖脂质与B/Gifu/2/73的结合性试验结果的照片。(a：病毒(-)、b：使用苔黑酚-H2SO4试剂显色、c：与B/Gifu/2/73的结合性、S1：α2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂、S2：α2-3唾液酰拟红细胞糖苷脂；1～5：AM序号；箭头：与B/Gifu/2/73进行特异性反应的糖脂质)。
图11是表示本发申请发明的实施例中采用DEAE-Sephadex A-25柱制备的来自孵化鸡蛋浆尿膜的糖脂质(一唾液、二唾液组分)与各流感病毒的结合性试验结果的照片。(a：使用苔黑酚-H2SO4试剂显色、b：使用间苯二酚-HCl试剂的显色、c：病毒(-)(1级抗体＝anti-p-50)、d：病毒(-)(1级抗体＝USA1)、e：与A/PR/8/34(H1N1)的结合性、f：与A/Aichi/2/68(H3N2)的结合性、g：与A/Memphis/1/71(H3N2)的结合性；S1：GSC273(α2-3sialyl paragloboside)、S2：GSC275(α2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂)；#1：一唾液组分，#2：二唾液组分
图12是表示对浆尿膜二唾液组分的各种流感病毒的感染阻碍作用的图。(表示只加病毒液时的LDH活性为100％，添加各浓度的二唾液组分时的相对活性。)(a：与A/PR/8/34的结合性、b：与A/Aichi/2/68的结合性、c：与A/Memphis/1/71的结合性、d：与B/Lee/40的结合性)。
具体实施方式
本申请发明人进行流感病毒的基因解析及对宿主的感染为所必须的病毒受体的唾液糖链的研究，逐渐清楚了流感病毒由人传给其他动物的方式。(Ito，T.，Suznki.Y.，Takada.A.，Kawamoto，A.，Otsu ki，K.，Masuda，H.，Yamada，M.，Suzuki，T.，Kida，H.，and Kawaoka，Y.，Journal of Virology，71，3357-3362(1997)；Suzuki，T.，Horiike，G.，Yamazaki，Y.，Kawabc，K.，Masuda，H.，Miyamoto，M.，Nishimura，S.I.，Yamagata，T.，Ito，T.，Kida，H.，Kawaoka.Y.，and Suzuki.Y.，FEBS Letters，404，192-196(1997)；Ito，T.，Suzuki，Y.，Mitnaul，L.，Vines，A.，Kida，H.，and Kawaoka，Y，：Virology，227，493-499(1997)；Suznki，Y，：Options for the Control ofinfluenza III.(Elsevier Science B.V.，Brown，L，E.，Hampson，A，W.，Webster，R.G.，editors)，4443-4446(1996)。而且，得知由人、猪、鸟、马分离出的流感A型病毒与人流感B型病毒，均特异性地将含唾液酸(Sialic acid，SA)的糖链进行识别结合，尤其是唾液内酯系I型与II型糖链(I型糖链：SAα2-6(3)Galβ1-3G1cNAcβ1-；II型糖链：SAα2-6(3)Gal β1-4G1cNAc β1-)牢固地结合。(Suznki，Y.，Nakao，T.，Ito，T.，Watanabe，N.，Toda，Y.，Xu，G.，Suzuki，T.，Kobayashi，T.，Kimura，Y.，Yamada，A.，et al，：Virology，189，121-131(1992)；铃木康夫；生化学，62，231-260(1990))
此外，发明人还发现即使是有活性的唾液糖链作为游离低聚糖存在时对流感病毒的结合力也弱，但作为唾液糖脂质、唾液糖蛋白质等，作为与脂质或蛋白质结合的糖链存在时，又发现使上述唾液糖链在化学合成聚合物上形成集合簇时，表现出格外高的结合性。
(Fujimoto，K.，Hayashida，O.，Aoyama，Y.，Guo，C.T.，Hidari，K.I.P.J.，and Suzuki，Y，：Chemistry Letter，1259-1260(1999)；Akiko Tsuchida，Kazukiyo Kobayashi，Noritaka Matsubara，Jsukasa Muramatsu，TakashiSuzuki，Yasuo Suzuki：Glycoconjugate J.，15，1047-1054(1998)
此外，还发现A型、B型流感病毒血细胞凝集素的分子进化呈现为受体唾液糖链末端的唾液酸结合方式(SA-2-3Gal，SA2-6Gal)与唾液酸分子种(Neu5Ac，Neu5Gc)识别的变化。(Suzuki，Y.，Kato，H.，Naeve，C.W.，Webster，R.G.：Virology，63，4298-4302(1989)；Xu，G.，Horiike，G.，Suzuki，T.，Miyamoto，D.，Kuminashi，H.，and Suzuki，Y，：Biochemical andbiophysical research communications，224，815-818(1996)，例如采用MDCK细胞从人分离出的A型(H1、H3亚型)与B型病毒识别SA2-6Gal结合(以下称2-6)，而从鸭或马分离出的病毒对SA2-3Gal结合(以下称2-3)均显示出强的亲合性，对2-6的结合弱。另一方面，从猪分离出的病毒显示对2-6的强亲和性，但也可以与2-3结合。
另外，调查流感病毒接受组织(人、猪、马的上述吸道粘膜细胞、鸭的肠道粘膜细胞)中唾液酸的结合方式与分子种，结果表明猪的上呼吸道细胞存在对人、鸭病毒两者的受体唾液糖链(2，6-、2，3-的两者)。即，在分子水平上得知在自然界中猪成为鸭与人流感病毒的中间宿主。
然而，实际上在宿主细胞表面所表达的唾液糖链(即，特定的受体分子)的存在或结构迄今仍没搞清。此外，本申请发明者通过潜心研究，从流感病毒感染组织中提取各种的唾液糖链，研究了对各种流感病毒的结合性，从而完成了本发明。
即，本申请发明的新型支链状唾液糖分子是下述化学式(I)表示的结构。
Figure A0380515200111
(式中，NeuAc表示该NeuAc的羟基、羧基与酰胺基可以相同或分别不同地被卤素、烷基或酰基化学性修饰的N-乙酰神经氨酸，Hex表示己糖，HexNAc表示乙酰己糖胺，R是选自氢原子、烃链、糖链、脂质、蛋白质、合成高分子的基质，R也可以有取代基)。本申请发明的新型支链状唾液糖分子，即，特征是具有α2，6-结合的NeuAc与Hex-HexNAc和α2，3-结合的NeuAc与Hex-HexNAc两方。
这样的化合物中，Hex与HexNAc的种类没有特殊限定。优选Hex是半乳糖(Gal)、HexNAc是半乳糖胺(GalNAc)或葡糖胺(GlcNAc)。另外，NeuAc其羟基、羧基与酰胺基可以被卤素(F，Cl，Br，I)、烷基(C2～C20)与酰基(C2～C20)进行化学性修饰。
此外，本申请发明的新型支链状唾液糖分子中，N-乙酰神经氨酸与己糖(或半乳糖)的结合，不只是天然存在的邻位糖苷键，也可以进行S-糖苷、Se-糖苷键等化学性变换。
另外，本申请发明的新型支链状唾液糖分子也可以是R是氢原子或可以有取代基的烃基的游离低聚糖或其衍生物，R也可以是糖链、脂质、蛋白质或合成高分子等。如前述，作为R有脂质、蛋白质、合成高分子等，当形成新型支链状唾液糖脂质、新型支链状唾液糖蛋白质、高分子固定化新型支链状唾液糖等时，对流感病毒的结合性高而优选。另外，也可根据本发明的新型支链状唾液糖分子的用途适当地变更R的结构。
本申请发明的新型支链状唾液糖分子可以是采用公知的多糖类的合成方法进行合成的物质，也可以是天然由来的物质。尤其是列举对来自孵化鸡蛋浆尿膜的物质进行分离得到的唾液糖分子。
本申请发明的新型支链状唾液糖分子，对于该分子中所有类型(A型、B型、以及A型流感病毒血细胞凝集素亚型)病毒与宿主细胞受体结合方面，由于同时有所必须的多个唾液糖链，尤其是同时具有α2，6-与α2，3-结合，因此，对A型流感病毒与B型流感病毒的任何一种均有效地进行结合。
所以，本申请发明的新型支链状唾液糖分子适用于防止流感病毒感染及防止流感病毒的流行中的各种手段。例如可列举医药品(抗病毒剂)的有效成分、防护面具或空气净化器等的过滤器中病毒吸附剂等的用途。例如作为抗病毒剂使用的场合，可以成为任意的形态，可列举液剂、片剂、粉末等经口服用的抗病毒药，或作为滴鼻药、口腔喷雾剂等的气溶剂等直接用与鼻腔或咽喉的药，经皮使用的药等。而填充于过滤器等中的场合，可从空气中除去病毒，防止护散。此外，如果把本申请发明的新型支链状唾液糖分子混合或涂布在窗帘、壁纸等的家庭用品上，则可赋予除去病毒、防止扩散的效果。
本发明的新型支链状唾液糖分子对流感病毒具有与过去的直链状糖链组同等或更好的结合性，发挥高的防感染效果。另外，如前述，由于对所有的流感病毒有高的结合性，故即使是同时流行多种的流感，或发生新的流感病毒的变异体，也可维持充分的结合性，在可发挥作为抗病毒剂或病毒吸附剂的性能方面可以说适用性比过去的直链状糖链组高。
以下，列举实施例对本申请发明更详细地进行说明。当然，不用说本申请发明并不限定于以下的实施例。
实施例
实施例1流感病毒受体候补分子的研究
为了研究、鉴定成为流感病毒受体的分子，对于从用于病毒增殖的孵化鸡蛋的浆尿膜及用于病毒分离或感染实验的狗肾小管细胞(MDCK细胞)中分离与A型及B型流感病毒进行反应的脂质分子进行了试验。
I.实验方法
(1)材料
流感病毒株使用示于表1的病毒株。
表1
    病毒种  血清型 对NeuAc的结合特异性
  A/PR/8/34   H1N1     α2-6＜＜α2-3
  A/Aichi/2/68   H3N2     α2-6＞α2-3
  A/Memphis/1/71   H3N2     α2-6＞＞α2-3
  A/Duck/313/4   H5N3     α2-6α2-3
  A/Duck/92/1/76   H8N2     α2-6α2-3
  B/Lee/40     α2-6＞＞α2-3
  B/Gifu/2/73     α2-6α2-3
此外，表中对N-乙酰神经氨酸的结合特性，是基于采用III中后述的TLC/病毒结合分析测定与作为标准糖脂质(唾液酰拟红细胞糖苷脂)的反应性结果的值。而，TLC/病毒结合分析是发明人确立的方法。(Suzuki，Y.，Nakau；T.，Ito，T.，Watanabe，W.，Toda.Y.，Xu，G.Y.，Suzuki，T.，Kobayashi，T.，Kimura，Y.，Yamada，A.，Sugawara，K.，Nishimura，H.，Kitame，F.，Nakamura，K.，Deya，E.，Kiso，M.，and Hasegawa，A.(1992)Virology 189，121-131；Guo，C.-T.，Wong，C.-H.，Hajimoto，T.，Miura，T.，Ida，Y.，Juneja，L.R.，Kim，M.-J.，Masuda，H.，Suzuki.T.，and Suzuki，Y.(1998)Glycoconjugate J.15.1099-1108)
作为抗流感病毒抗体，使用示于以下表2中的抗体。
表2
    病毒种     一级抗体*1     二级抗体*2
  A/PR/8/34   anti-P-50(×1000)     Protein A(×1000)
  A/Aichi/2/68   anti-P-50(×1000)     Protein A(×1000)
  A/Memphis/1/71   USA1(×500)     Protein A(×1000)
  A/Duck/313/4   anti-P-50(×1000)     Protein A(×1000)
  A/Duck/92/1/76   anti-P-50(×1000)     Protein A(×1000)
  B/Lee/40   anti-B/Lee(×4000)     anti-rabbit 1gG-HRP(×2000)
  B/Gifu/2/73   anti-B/Lee(×4000)     anti-rabbit 1gG-HRP(×2000)
*1：一级抗体是本发明者们制作的家兔多克隆抗体。
*2：anti-rabbit IgG-HRP从Santa Cruz Biotechnology公司购入、ProteinA从Cappel公司购入。
(2)流感病毒的精制
把用PBS稀释(A型流感病毒：2-3～4；B型流感病毒：2-1～0)的病毒悬浮液植入11日龄发育鸡蛋浆尿腔内0.2ml、34℃下培养48小时。
回收浆尿液后在4℃、4000rpm(HITACHI SCI 20B，RPRG旋转器)下离心分离10分钟，除去夹杂物。再在4℃、8000rpm条件下将上清液离心分离3小时，用PBS使颗粒悬浮成为粗病毒液。然后，在50％甘油(WAKO)-PBS中进行粗病毒复层，在4℃、38000rpm(HITACHI CP65β，P40ST旋转器)下离心分离2小时。再用PBS将得到的颗粒悬浮，在4℃、20000rpm条件下进行90分钟(HITACHI CP65β，P28S旋转器)10-40％(W/V)蔗糖连续密度梯度离心分离。
回收病毒层，通过在4℃、8000rpm(HITACHI SCR 20B，RPR18旋转器)条件下离心分离3小时得到精制病毒。得到的病毒用PBS悬浮，在-80℃下进行保存。
(3)红细胞凝集活性(HAU)的测定
在微型板(96U-bottom Wells，Falcon)上用0.01％明胶(nacalaitesque，Inc)-PBS50ml把稀释210倍的精制流感病毒50μl进行加倍稀释。加0.5％(V/V)豚鼠红细胞-PBS 50μl，在4℃静置2小时后，观察红细胞的凝集。由于豚鼠红细胞凝集，HAU采用所需的病毒的最高稀释倍数表示。
(4)浆尿膜由来的反应性脂质的研究
回收40个11日龄发育鸡蛋的浆尿膜，用PBS洗涤后，进行冷冻干燥(EYELA FDU-830)。在干燥重量1.81g的浆尿膜上加MilliQ水15ml，进行均匀化。再加CHCl3/MeOH 60ml、提取1小时后，过滤提取液，用蒸发器馏去溶剂。加MeOH 60ml，使用バス式超声波处理器(SILENTSONIC，SHARP)进行超声波处理后，用0.1N NaOH在37℃下进行一夜水解。馏去溶剂后，加MilliQ水20ml，进行超声波处理，进行透析(透析膜：VLSKASESALES CORP)。
透析后，使冷冻干燥的样品溶解在CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)20ml中，进行超声波处理，制成DEAE-Sephadex A-25柱色谱的样品。DEAE-Sephadex A-25(Pharmacia Biotech)使用利用CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)预活化后，用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)平衡化的谱柱。把样品导入床容积(Bed volume)10ml的DEAE-Sephadex A-25中，用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)100ml使中性脂质组分溶出后，用CHCl3/MeOH/0.8MNaOAc(30/60/8，v/v/v)100ml使酸性脂质组分溶出。从溶剂中除去这些组分，进行超声波处理后，进行透析。
透析后，再把冷冻干燥的样品中酸性脂质组分的一半溶解在CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)0.75ml中，首先用CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)平衡化，导入Iatrobeads(床容积3ml)(Iatron Laboratories，Inc)中。
首先，边通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)15ml、边每1ml地收集组分。然后通入CHCl3/MeOH/Milli Q水(30/60/8，v/v/v)15ml、MeOH 15ml。收集这些组分中含目的糖脂质的组分，溶解在CHCl3/MeOH(1/1，v/v)1ml中，通过后述的II(a)与III的TLC板的二次展开进行分析。
首先在用CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/5/1，v/v/v)平衡化的Iatrobeads(床容积25ml)中投入用CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)溶解的样品2.5ml。采用对从125ml CHCl3/MeOH/MilliQ水(5∶4∶1，v/v/v)形成125mlCHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)梯度的溶剂溶出，按每2.5ml馏分收集器(ADVAMTEC、SF-3120)进行分取。对这些馏分采用后述的II(b)与III的分析方法测定A型(人、鸟)与B型病毒的反应性。
对确认结果的馏分，为了再进行精制，把全部量投到HPTLC(MERCK、HPTLC-Fertigplatten Kieselgel 60)板上，用CHCl3/MeOH/12mmMgCl2/15M NH4OH(50/40/7/3，v/v/v/v)展开。用外科用小刀(KEISEIMEDICAL INDUSTRIAL CO.，LTD)刮取得到的4条带。把刮取的带分别加到CHCl3/MeOH/Milli Q水(5/4/1，v/v/v)1ml中进行5分钟超声波处理后，采用过滤器进行棉栓过滤。再向棉栓中通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)2ml与原来的滤液合并。馏去该溶剂后，加入CHCl3/MeOH(1/1，v/v)100μl，采用后述的II(c)与III的方法用TLC板进行分析。
(5)来自MDCK细胞的反应性脂质的研究
把MDCK细胞(10cm盘25张)培养汇合，进行收集。把得到的细胞颗粒进行冷冻干燥(干燥重量0.06g)，加MilliQ水600μl。再加CHCl3/MeOH(1/1，v/v)6ml，采用1500rpm(TOMY，LC-100)离心分离5分钟，馏去所得上清液的溶剂。加MeOH 3ml，进行超声波处理后，用0.1N NaOH在37℃下进行一夜水解。馏去溶剂后，加MilliQ水2.5ml，进行超声波处理，进行透析。
透析后，使冷冻干燥的样品溶解在CHCl3/MeOH/Milli Q水(30/60/8，v/v/v)20ml中，进行超声波处理，制成DEAE-Sephadex A-25柱色谱的样品。DEAE-Sephadex A-25使用利用CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)预活化后，在CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)中进行置换的谱柱。向床容积10ml的DEAE-Sepbadex A-25中投入样品，用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)100ml溶出中性脂质组分。
然后用CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)100ml溶出酸性脂质组分。馏去这些组分的溶剂，加MilliQ水2.5ml进行超声波处理后，进行透析。透析后，将冷冻干燥的酸性脂质组分溶解在CHCl3/MeOH(1/1，v/v)100μl中，采用II(a)与III的TLC板的二次展开进行分析。
II.TLC采用化学显色试剂的检测
(a)二次展开：塑料TLC板(MERCHEREY-NAGEL，Polygram Sil G)用丙酮展开后，投与得到的酸性脂质组分和标准糖脂质(牛脑全部神经节苷脂)。将该TLC板用CHCl3/MeOH/88％HCOOH(65/25/10，v/v/v)一次展开后充分风干，用CHCl3/MeOH/5N NH4OH进行二次展开。将板风干后，进行苔黑酚-H2SO4试剂(1％(w/v)苔黑酚/2N H2SO4)喷雾，加热到110℃、进行糖的检测。
二次展开的结果，对已确认与病毒的反应性的馏分，为了再进行精制，将上述Iatrobeads柱色谱得到的组分与酸性脂质组分其余的一半量合并再进行Iatrobeads柱色谱精制。
(b)一次展开：在塑料TLC板上投与制得的酸性脂组分与标准糖脂质(GSC-275、GSC-273、牛脑全部神经节苷酯)用丙酮将该TLC板展开后，用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(5/4/1，v/v/v)进行展开。将板风干后，进行苔黑酚-H2SO4试剂喷雾，加热到110℃、进行糖的检测。
此外，GSC-275是以下[1]所示合成品的α2，6-唾液酰拟红细胞苷脂、GSC-273是[2]所示的合成品的α2，3-唾液酰拟红细胞苷脂。
Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4G1cβ1-OCH(C14H29)2
                                             ····〔1〕
Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-OCH(C14H29)2
                                             ····〔2〕
(c)一次展开：在塑料TLC板上投与制得的糖脂质组分与标准糖脂质(前述苔黑酚-H2SO试剂)。用丙酮将该TLC展开后，用CHCl3/MeOH/12mMMgCl2/15M NH4OH(50/40/7/3，v/v/v)进行展开。将板风干后，喷雾苔黑酚-H2SO4试剂，加热到110℃，进行糖的检测。
III.TLC/病毒结合分析(virus-binding assay)
使用1％卵清蛋白、1％聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)(东京化成)-PBS溶液(以下称A液)在室温下将与II(a)～(c)同样地展开的TLC板振荡1小时。用PBS在4℃、5分钟、洗涤3次后，加入用PBS稀释成HAU＝27的流感病毒悬浮液3ml，在4℃振荡1夜。此外在Virus(-)中加入PBS代替病毒悬浮液。
将该溶液用PBS在4℃、5分钟洗涤3次，加入用3％PVP-PBS溶液(以下称B液)稀释的一级抗体溶液3ml，在4℃振荡2小时。用PBS将该板在4℃、5分钟洗涤3次后，加用B液稀释的二级抗体溶液3ml，在4℃振荡2小时。然后，用PBS在4℃、5分钟洗涤3次，加显色基质溶液(0.1M柠檬酸盐缓冲剂pH6.0、0.5ml；在CH3CN中的0.11mM4-氯萘酚、100μl；在CH3CN中的0.06M DEPDA 100μl；100μl；30％H2O2，5μl)在室温下进行振荡。显色后，用精制水洗涤，进行风干。
IV.结果
从孵化鸡蛋的浆尿膜中提取脂质，用TLC将酸性脂质组分二次展开后，用作糖检测试剂的苔黑酚-H2SO4试剂使之显色(图1c)。使同样展开的板与A/PR/8/34(图1d)、A/Aichi/2/68(图1e)、B/Lee/40(图1f)、B/Gifu/2/73(图1g)反应，确认与病毒共同进行反应的地方。(图中用箭头表示)
由移动度暗示出这种共同反应的组分是与唾液酰拟红细胞糖苷脂不同的分子，是具有更长糖链结构的物质。
此外，为了进一步精制该馏分，进行Iatrobeads柱色谱精制。把得到图形示于图2a。
对1～7组分，A型使用A/Memphis/1/71(图2c)、A/PR/8/34(图2d)、A/Aichi/2/68(图2e)、A/Duck/313/4(图2f)、A/Duck/92/1/76(图2g)研究了反应性，B型用B/Lee/40(图2h)研究了反应性。
与Neu5Acα2-6Gal结合的糖链结构强烈进行反应的A/Memphis/1/71(图2c)与组分2～6反应，与用组分2的箭头表示的带非常窄。与Neu5Acα2-6Gal结合的糖链结构同程度地进行结合的A/Aichi/2/68(图2e)也与A/Memphis/1/71同样，用组分2的箭头所示的带强烈进行反应。表明该带也对A/Duck/313/4(图2f)、A/Duck/92/1/76(图2g)、B/Lee/40(图2h)进行反应，不仅与人A型与B型流感病毒进行反应，而且也与H5、H9的鸟病毒进行反应。
此外，为了进一步精制该反应性脂质，用HPTLC对组分2进行刮取，结果得到如图3a所示的图。确认该带与A/Memphis/1/71(图3b)、A/PR/8/34(图3c)进行反应。
另一方面，同样地也从MDCK细胞中提出脂质，用TLC将酸性脂质组分进行二次展开后，用苔黑酚-H2SO4试剂使之显色，结果得到如图4a的图。同样地使展开的板与A/PR/8/34(图4c)、A/Aichi/2/68(图4d)、B/Lee/40(图4e)、B/Gifu/2/73(图4f)进行反应，结果看出箭头表示的部分与全部的病毒共同地进行反应。
表明该反应性脂质是与浆尿膜上反应的组分(图1)同样的移动度。
实施例2
由实施例1确认含在孵化鸡蛋浆尿膜、MDCK细胞中的特定脂质性分子与A型及B型流感病毒进行反应。为了研究该脂质性分子的结构或结合特异性，又大规模地进行单独分离、精制。最后将分离的脂质性分子与流感病毒的结合特异性与作为过去所报道与病毒的结合性的标准糖酯质的唾液酰拟红细胞苷脂进行了对比研究。
I.实验方法
(1)材料
流感病毒株使用示于表3的病毒种。
表3
    病毒种   血清型 对NeuAc的结合特异性
    A/PR/8/34     H1N1     α2-6＜＜α2-3
    A/Aichi/2/68     H3N2     α2-6＞α2-3
    A/Memphis/1/71     H3N2     α2-6＞＞α2-3
    B/Lee/40     α2-6＞＞α2-3
    B/Gifu/2/73     α2-6α2-3
此外，表中对N-乙酰神经氨酸的结合特性，是基于与采用实施例1所示的TLC/病毒结合分析测定的作为标准糖脂质的唾液基帕拉红细胞糖苷酯反应性结果的值。
此外，作为抗流感病毒抗体，使用示于以下表4所示的抗体。
表4
    病毒种     一级抗体     二级抗体
  A/PR/8/34   anti-P-50(×1000)     Protein A(×1000)
  A/Aichi/2/68   anti-P-50(×1000)     Protein A(×1000)
  A/Memphis/1/71   USA1(×500)     Protein A(×1000)
  B/Lee/40   anti-B/Lee(×4000)     anti-rabbit 1gG-HRP(×2000)
  B/Gifu/2/73   anti-B/Lee(×4000)     anti-rabbit 1gG-HRP(×2000)
(2)从浆尿膜中精制目的脂质
从1150个11日龄发育鸡蛋中采集浆尿膜，用PBS洗涤后进行冷冻干燥。在干燥重量67.7g的浆尿膜上加丙酮800ml，进行10分钟超声波处理。用均化器粉碎后在室温下搅拌3小时。过滤提取液，在干燥的残渣中加入CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/5/1，v/v/v)2750ml，进行10分钟超声波处理。搅拌一夜后，在过滤的残渣中加入CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)1200ml，搅拌2小时。
进一步把滤液与先前的滤液合并，用蒸发器馏去溶剂。加MeOH300ml，进行超声波处理后，使最终浓度为0.1N NaOH地调制，在37℃进行3.5小时水解，再在室温下进行一夜水解。采用制成最终浓度为0.1N的AcOH进行中和后，馏去溶剂。加MilliQ水80ml，进行超声波处理后，进行透析。透析后，把冷冻干燥的样品溶解在CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)100ml中进行超声波处理后，进行过滤。再在残渣中加入CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)100ml，进行2次同样的操作。把3次的滤液合并作为DEAE-Sephadex A-25柱色谱的样品。DEAE-Sephadex A-25使用通过CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)预活化后，用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)进行平衡化的柱。
在床容积440ml的DEAE-Sephadex A-25中投入样品，CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)201溶出中性脂质组分。然后通入CHCl3/MeOH/0.05M NaOAc(30/60/8，v/v/v)91，制成一唾液酸性脂质组分(Suzuki，Y.，Nakao，T.，Ito，T.，Watanabe，N.，Toda，Y，Xu，G.，Suzuki，T.，Kabayashi，T.，Kimura，Y.，Yamada，A.，etal，：Virology，189，121-131(1992))。
一唾液、二唾液以上的组分加MilliQ水150ml进行透析。透析后，将冷冻干燥的二唾液以上的组分溶解在CHCl3/MeOH/MilliQ水(65/25/4，v/v/v)10ml中。为了进一步精制二唾液以上的组分，采用Iatroheads柱色谱进行分离。Iatrobeads使用通过CHCl3/MeOH/MilliQ水(65/25/4，v/v/v)预活化的谱柱。把样品投入床容积120ml的Iatrobeads中，通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(65/25/4，v/v/v)250ml。此时，使用馏分收集器收集100个各2.5ml的馏分，用HPTLC板进行溶出组分的确认。HPTLC板的展开溶剂使用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(5/4/1，v/v/v)进行展开确认。另外，采用与前述实施例1同样的方法考察与病毒的反应性，只收集有反应性的组分。
把这些组分溶解在CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)1ml中，为了进一步精制进行再次Iatrobeads柱色谱分离。Iatrobeads使用通过CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)预活化的谱柱。
在床容积25ml的Iatrobeads中投入样品，通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)75ml。此时用馏分收集器收集300个各0.25ml的组分。把这些组分投给HPTLC板，用CHCl3/MeOH/12Mm MgCl12(5/4/1，v/v/v)进行展开映象(mapping)。
结果，由于CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)不溶出目的脂质性分子，故继续通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(40/50/9，v/v/v)25ml，收集100个各0.25ml的组分。
把这些组分投给HPTLC板，用CHCl3/MeOH/12mM MgCl12(5/4/1，v/v/v)展开20cm，用外科用小刀刮取出现的5个谱带。把各个谱带分别用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)40ml进行提取，进行5分钟超声波处理。然后为了除去硅胶，进行棉栓过滤，馏去溶剂。溶解在CHCl3/MeOH(8/2，v/v)1ml中，进行Iatrodesds柱色谱分离。Iatrobeads使用CHCl3/MeOH(8/2，v/v)进行活化，形成床容积1ml。投入样品后，通入CHCl3/MeOH(8/2，v/v)15ml、继续通入CHCl3/MeOH/Milli Q水(30/60/8，v/v/v)20ml。馏去用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)溶出的馏分的溶剂，溶解在CHCl3/MeOH(1/1，v/v)200μl中。把得到的馏分投给HPTLC板，使用展开溶剂CHCl3/MeOH/12mM MgCl12(5/4/1，v/v/v)展开，用苔黑酚-H2SO4试剂使之显色。
把这些组分命名为AM1～5作为最终精制样品。对AM1～5，把与A型及B型流感病毒的结合特异性、和作为标准糖脂质的唾液酰拟红细胞糖苷脂进行比较。
II.结果
把对二唾液以上的馏分进行第1次Iatrobeads柱色谱分离的结果示于图5。
在TLC板上将溶出组分展开，使用作为检测糖试剂的苔黑酚-H2SO4试剂使之显色。对得到的1～7馏分，考察与病毒的反应性，把结果示于图6。A/Aichi/2/68(图6c)与馏分4与5强烈进行反应，A/Memphis/1/71(图6d)与馏分4、5、6反应最强。由于图5的箭头表示的部分表明反应特别强烈，故将大量含有该部分的馏分4～6贮存，进行第2次的Iatrobeads柱色谱分离。
把得到的图示于图7。由于箭头表示的部分含有目的糖脂质特别多，故收集馏分5和6再进行精制。
此外，馏分5和6分别进行精制，以下只对馏分6用HPTLC板展开20cm。结果扩展面上出现的谱带表示是至少5种糖脂质的混合物。此外，刮取这5种谱带，除去硅胶后，考察糖的显色。把得到的图示于图8。把这5种馏分命名为AM1～5，作为最终精制样品，将与A型及B型流感病毒的结合特异性，和作为标准糖脂质的唾液酰基拟红细胞糖苷脂进行比较。
对于AM1～5，A型使用A/Aichi/2/68，A/PR/8/34，A/Memphis/1/71进行了研究。与Neu5Acα2-3Gal和Neu5Acα2-6Gal结合的糖链结构同程度结合的A/Aichi2/6，与AM1～5所有的脂质性分子反应，与AM1的箭头移动度中所观察的谱带、及AM3、4强烈地反应(图9c)。
此外，图9可以采用实施例3中后述的方法进行质量分析。对于AM1、3、4，与投入作为标准糖脂质的α2-3唾液酰拟红细胞糖苷脂、α2-6唾液帕拉细胞糖苷脂的量相同。若与标准糖脂质进行比较，则AM1箭头的谱带比α2-3唾液酰拟红细胞糖苷脂反应稍强。AM3、4大致与α2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂同等强度地进行结合。
另一方面，只与Neu5Acα2-3Gal结合的糖链结构进行结合的A/PR/8/34(图9d)与A/Aichi/2/68(图9c)同样地与AM1的箭头的谱带强烈地进行反应。因此，这显示出比α2-3唾液酰拟红细胞糖苷脂具有非常强的流感病毒结合性。另外，与A/Aichi/2/68(图9c)不同，与自AM1到5的上方的移动度所观察的谱带不进行反应。此外，只与Neu5Acα2-6Gal结合的糖链结构进行结合的A/Memphis/1/71(图9e)显示出与A/Aichi/2/68(图9c)相似的图。
AM1类似与Aichi/2/68、A/PR/8/34相同地反应，该反应性比α2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂稍弱。AM3、4与α2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂同程度地、或更强地进行反应。这些结果说明AM1的箭头谱带共同地与3种病毒强烈地进行反应，该反应性与标准糖脂质同程度或比该程度强。
另外，对于AM1～5，把测定与B型流感病毒反应性的结果示于图10。与Neu5Ac2～3Gal及Neu5Acα2-6Gal结合的糖链结构同程度地进行结合的B/Gifu/2/23(图10c)与1～5所有的馏分进行反应。并看出AM1的箭头的谱带也与A型的3种病毒同样地进行反应。AM1比标准糖脂质的α2-3Rα2-6唾液酰拟红细胞糖苷脂反应强。另外，与AM1～3上方的移动度中观察的谱带不反应。
实施例3  采用质量分析法解析AM1、3、4的结构
为了解析AM1～5中可质量分析的AM1、3、4的结构，进行ESI(eletrospray ionization)-FTMS(Fourier transform ion resonancemass spectrometer)测定与SIMS(Secondary ion mass spectroscopy)-FTMS测定(均用BioAPEX(Bruker instruments)。
I.实验
(1)ESI-FIMS
把AM1、3、4的各样品溶解于甲醇(3pmol/μl)中，使用微量注射泵、按1μl/分的流速进行喷雾。调制圆筒、内板、毛细管等的ESI高电压控制器或喷嘴后，采用阴离子型进行测定。
(2)SIMS-FTMS
把样品溶解在CHCl3/MeOH(2/1，v/v)中，取出其中一定的量(300pmol)与基质(三乙醇胺)混合后，采用加速电压10kv、阴离子型进行测定。
II.结果
确认可认为与分子量相关离子峰的m/z 2195[M+Na-2H]-和从中脱掉1个唾液酸[-NeuAc-Na]的m/z 1882[M-NeuAc-H]-。此外，确认作为与唾液酸相关峰的m/z 290[NeuAc]-、m/z 308[NeuAc]-在低分子域。另外，确认m/z 1086[M-2H]2-在2价离子域，由于由此计算的分子量与先前所述的与分子量相关离子峰的质量数一致，故暗示可含二个唾液酸。
有关这2个唾液酸的结合，解析GD1a与GD1b的谱图作为参考，结果在具有GD1b的NeuAc-NeuAc中所确认的m/z 581、m/z 603在AM1中没有，因此可认为这些唾液酸分别单独地与中性糖进行结合。另外，与分子量相关的离子峰m/z2195表明是神经酰胺(LCB18：1-FA16：0)、中性糖6个(己糖4个、己糖胺2个)、唾液酸2个、1个Na的付加组合。
此外，由SIMS-FTMS测定也确认出相当于神经酰胺的m/z 536(LCB18：1-FA16：0)。另外，还确认出相当于对该神经酰胺一个一个地付加1个己糖的峰m/z 698、m/z 860，又确认出相当于付加己糖胺的峰m/z1063，相当于付加己糖的峰m/z 1225。因此表明AM1有乳糖胺骨架。
由以上，从成为流感病毒宿主的孵化鸡蛋浆尿膜中成功地分离成为受体候补的分子。另外，由结构解析确认该受体分子是下式(1)表示的结构。
Figure A0380515200241
(式中，NeuAc表示该NeuAc的羟基、羧基与酰胺基可以相同或分别不同地被卤素、烷基或酰基化学性修饰的N-乙酰神经氨酸，Hex表示己糖、GexNAc表示乙酰己糖胺，R是选自氧原子、烃链、糖链、脂质、蛋白质、合成高分子的基质，R也可以有取代基)。
实施例4  对各种流感病毒的结合性的讨论
I.实验方法
(1)材料
流感病毒株使用示于表5的病毒种。
表5
    病毒种   血清型 对NeuAc的结合特异性
  A/PR/8/34     H1N1     α2-6＜＜α2-3
  A/Aichi/2/68     H3N2     α2-6＞α2-3
  A/Memphis/1/71     H3N2     α2-6＞＞α2-3
此外，对NeuAc的结合特异性，是基于利用本发明人确立的前述TLC/病毒结合分析，考察各病毒株对作为标准糖脂质的唾液酰拟红细胞糖苷脂的反应性的结果。
另外，作为标准糖脂质，使用以下所示的物质。
·GM3
Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ1-1’Cer
·GSC-273(合成物)
Neu 5Acα2-3 Gal β1-4G1c NAcβ1-3Galβ1-4G1cβ1-OCH(C14H29)2
·GSC-275(合成物)
Neu5Acα2-6 Galβ1-4G1cNAcβ1-3Galβ1-4G1cβ1-OCH(C14H29)2
此外，作为抗流感病毒抗体，使用示于下述表6的抗体。
表6
  病毒种(血清型)     一级抗体*1     二级抗体*2
  A/PR/8/34(H1M1)     anti-P-50(×1000)*3     Protein A(×1000)
  A/Aichi/2/68(H3N2)     anti-P-50(×1000)     Protein A(×1000)
  A/Memphis/1/71(H3N2)     USA1(×500)     Protein A(×1000)
*1：一级抗体是本发明人制作的家兔多克隆抗体。
*2：anti-fabbit IgG-HRP从Santa Cruz Biotechnology公司购入、Protein A从Cappel公司购入。
*3：括号内表示实验使用的稀释倍率
(2)流感病毒的精制
把用灭菌PBS稀释的病毒悬浮液(A型流感病毒稀释成红细胞凝集活性(HAU)＝2-3～-4，B型流感病毒稀释成红细胞凝集活性(HAV)＝2-1～0)0.2ml植入11日龄发育鸡蛋浆尿腔内、在34℃下培养48小时。
回收浆尿液后，在40℃、4000rpm(HITACHI SCR 20B，RPR9旋转器)下离心分离10分钟，除去夹杂物。再将上清液在4℃、8000rpm下离心分离3小时，用PBS将颗粒悬浮成为粗病毒液。然后，把粗病毒液复层在50％甘油-PBS溶液中，在4℃、38000rpm(HITACHI CP65β，p40ST旋转器)下离心分离2小时。
用PBS将得到的颗粒悬浮，在4℃、15000rpm条件下进行离心分离1小时，再用PBS将得到颗粒悬浮后，在4℃、20000rpm下进行90分钟(HITACHI CP65β，p28S旋转器)10-40％(W/V)蔗糖连续密度梯度离心分离。回收病毒谱带，在4℃、8000rpm(HITACHI SCR 20B，RPR18旋转器)离心分离3小时制得精制病毒。
得到的病毒用PBS悬浮，在-80℃下保存。
(3)HAU测定
用0.01％明胶(nacalai tesque，Inc)-PBS50μl把稀释210倍的精制流感病毒50μl在微型板(96U-bottom wells，Falcon)上加倍稀释，加0.5％(V/V)豚鼠红细胞-PBS 50μl，在4℃静置2小时后，观察红细胞的凝集。HAU用为了豚鼠红细胞凝集所需要的病毒的最高稀释倍数表示。
(4)从孵化鸡蛋浆尿膜中制备二唾液糖脂质组分
从120个11日龄孵化鸡蛋中采集浆尿膜，用PBS洗涤后，进行冷冻干燥。在干燥浆尿膜中加入丙酮100ml，进行超声波处理10分钟。用均化器粉碎后，在室温下搅拌3小时，过滤得到的提取液使残渣干燥后，向该残渣中加660ml CHCl3/MeOH/MilliQ水(5∶5∶1，v/v/v)，进行10分钟超声波处理。
搅拌一夜后过滤，向残渣中加CHCl3/MeOH/MilliQ水(30∶60∶8，v/v/v)300ml搅拌2小时。把滤液与先前的滤液合并，用蒸发器馏去溶剂。向干燥物中加MeOH50ml进行超声波处理充分悬浮后，加NaOH溶液使最终浓度为0.1N，在37℃水解3.5小时，再在室温下水解一夜。加AcOH使最终浓度为0.1N后，馏去溶剂。向干固物中加MilliQ水25ml进行超声波处理后，进行透析。透析后，把冷冻干燥的样品溶解在50ml CHCl3/MeOH/MilliQ水(30∶60∶8，v/v/v)中进行超声波处理后，进行过滤。
再向残渣中加CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)20ml进行同样的操作，把2次的滤液合并，作为DEAE-Sephadex A-25柱色谱用的样品。DEAE-Sephadex A-25使用通过CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)预活化后，用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)平衡化的谱柱。把样品供给床容积100ml的DEAE-Sephadex A-25柱。然后向柱中通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)3L溶出中性脂质组分。
然后，向柱中通入CHCl3/MeOH/0.05M NaOAc(30/60/8，v/v/v)3.5L，溶出一唾液酸性脂质组分。再向柱中通入CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)2L，溶出二唾液以上的酸性脂质组分。一唾液与二唾液以上的组分分别用蒸发器馏去溶剂。分别在一唾液成分中加MilliQ水20ml、在二唾液以上的组分中加MilliQ水20ml，进行透析。透析后，把冷冻干燥的各组分溶解于CHCl3/MeOH(1∶1，v/v)1000μl中。对两组分采用TLC/病毒结合分析研究与流感病毒的结合性。
(5)TLC/病毒结合分析(virus binding assay)
在塑料TLC板上，涂布从孵化鸡蛋浆尿膜中采用DEAE-Sephadex A-25柱色谱制备的一唾液、二唾液组分与标准糖脂质后，将该板用丙酮展开，风干，沿相同方向用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(5/4/1，v/v/v)连续地展开。风干。将该板在含有1％卵清蛋白、1％聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)(东京化成)的PBS溶液(以下，称溶液A)中在室温下振荡1小时，用冷PBS在4℃、5分钟条件下洗涤3次。然后添加用PBS稀释的流感病毒悬浮液4ml使HAU＝27，在4℃下振荡一夜。此外，对virus(-)加PBS代替病毒悬浮液。在4℃、5分钟下用冷PBS洗涤3次后，加入用含有3％PVP的PBS溶液(以下称溶液(B)稀释的一级抗体溶液4ml，在4℃振荡2小时，用冷PBS在4℃、5分钟洗涤3次后，加入用溶液B稀释的二级抗体溶液4ml，在4℃振荡2小时。反应后，用冷PBS在4℃、5分钟，洗涤3次，加显色基质溶液(0.1M柠檬酸盐缓冲剂pH6.0、5mL；CH3CN中0.11M4-氯萘酚、100μl；CH3CN中0.06M DEPDA 100μl；30％H2O2，5μl)，在室温下进行振荡。显色后，用精制水洗涤板，进行风干。
在另外展开、风干的板上喷雾苔黑酚-H2SO4试剂，加热到110℃，进行糖的检测。同样地，在另外的板上喷雾间苯二酚-HCl试剂进行加热，进行唾液酸的检测，用密度计(SHIMADZU)定量各谱带成分的含量。
II.实验结果
把由孵化鸡蛋的浆尿膜得到的酸性糖脂质组分(一唾液与二唾液组分)涂在TLC上展开，用间苯二酚-HCl试剂使之显色，测定含在各种组分中的成分存在量。观察示于图11a与图11b中的TLC图形。利用密度计定量，算出各成分的存在比(示于图11b板的两侧)。同样地，使点样展开各组分的板分别与A/PR/8/34(HIN1)、A/Aichi/2/68(H3N2)、A/Memphis/1/71(H3N2)的病毒株进行反应(图11e～g)。
结果说明图中箭头所示部分存在的高极性糖脂质与全部的病毒进行反应。
本发明人已从二唾液组分中分离出受体候补分子，通过以上，箭头所表示的物质由于其移动度极接近候补分子，因此暗示是受体候补分子成分。
此外，由采用间苯二酚-HCl试剂的板经密度计定量看出，这次制备的二唾液组分中所含的受体候补分子是1％以下(唾液酸量比)。
实施例5对各种流感病毒的感染阻碍活性
I.实验方法  采用LDH试验法测定流感病毒感染阻碍活性
在96孔培养用微型板(Nunc)上加入MDCK细胞使之为2×104cells/孔，在含有10％FCS的MEM培养基100μl中，37℃、5％CO2存在下培养20～24小时。
然后，把孵化鸡蛋的浆尿膜制得的二唾液组分分别用无血清MEM培养基稀释成50μl，使最终浓度的总唾液酸量分别为0.1，0.3，1，3，10μM，同样地加无血清MEM培养基稀释的流感病毒液和作为对照物加不含病毒液的无血清MEM培养基50μl，在4℃进行预培养1小时。
确认细胞变成汇合的单层后，用无血清培养基100μl将细胞洗涤3次，加预培养的病毒液与无血清培养基100μl，在34.5℃、5％CO2存在下静置4小时感染病毒。
感染后，除去上清液，用无血清MEM培养基100μl洗涤1次后加入含5％FCS MEM培养基100μl，在34.5℃、5％CO2存在下培养20～24小时。在新的微型板上(96Flat-Bottom Maxisorp，Nunc)加入(5X)PBS10μl，加20～24小时培养的细胞上清液40μl进行混合，在37℃培养5分钟后，加LDH测定试剂(シノテスト公司制)50μl混合在37℃反应10分钟。
加0.5N HCl 100μl使反应停止，通过微量反应板读数器(MTP-32，corona公司)按测定波长550nm、对照波长415nm测定各孔的吸光度。由于病毒感染产生细胞障碍性，结果，培养上清液中放出细胞内酶LDH。通过对LDH进行测定可评价病毒的感染性。
把对照样品(只是不含任何试验样品的病毒)的上清液中的LHD活性为100％时，各浓度的含二唾液组分样品上清液中LDH活性的相对值作为阻碍活性的指标。
II.实验结果
把由浆尿膜得到的二唾液组分预培养成病毒液，通过LDH活性测定研究对MDCK细胞的病毒感染性的影响。只加病毒液时的LDH活性为100％，把添加各浓度的二唾液组分时的相对活性示于图12。
二唾液组分对A/PR/8/34(H1N1)、A/Aichi/2/68(H3N2)的TCID50(组织培养感染剂量的50％、50％阻碍浓度)是1μM(唾液酸浓度)，A/Memphis/1/71(H3N2)、B/Lee/40的TCID50是3μM(唾液酸浓度)。
这里，如果与前述的TLC/病毒结合分析的结果(图11)进行比较来看，可认为是对各病毒一样有结合性的糖脂质，即受体物质为实际的二唾液组分中的阻碍活性物质，该量表明是二唾液组分中总唾液酸量的1～10％以下。
由以上暗示，支链状唾液糖链受体糖脂质实际上是0.1～0.3μM以下的微量，表明可以发挥阻碍病毒对MDCK细胞感染的效果。
迄今报道的有病毒结合活性的化合物的流感病毒感染阻碍效果(TCID50)是10μM数量级，相比之下，说明含在孵化鸡蛋浆尿膜中二唾液组分的支链状唾液糖链受体糖脂质显示出相当高的抗流感病毒活性。
产业上利用的可能性
如以上详细地说明，本申请发明提供新型支链状唾液糖分子。该化合物由于可以与来自所有的人与动物的A型流感病毒与B型流感病毒结合，因此可以对付流感病毒宿主范围的变异或抗原性的变异，作为可阻止所有流感病毒感染的医药品或除去病毒用过滤器等的吸附剂的使用性高。

Claims (10)

1.新型支链状唾液糖分子，其特征在于，其是下式(I)所示的结构，
式中，NeuAc表示该NeuAc的羟基、羧基与酰胺基可以相同或分别不同地被卤素、烷基或酰基化学性修饰的N-乙酰神经氨酸，Hex表示己糖，HexNAc表示N-乙酰己糖胺，R是选自氢原子、烃链、糖链、脂质、蛋白质、合成高分子的基质，R也可以有取代基。
2.权利要求1的新型支链状唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神经氨酸与己糖通过天然的邻位糖苷键进行结合。
3.权利要求1的新型支链状唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神经氨酸与己糖的结合是化学性变换的结合。
4.权利要求3的新型支链状唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神经氨酸与己糖的结合形态是S-糖苷键或Se-糖苷键。
5.新型支链状唾液糖分子，其特征在于，其是下述(II)所示的结构，
Figure A038051520002C2
式中，NeuAc表示该NeuAc的羟基、羧基与酰胺基可以相同或分别不同地被卤素、烷基或酰基化学性修饰的N-乙酰神经氨酸，Gal表示半乳糖，GlcNAc表示乙酰葡糖胺，R是选自氢原子、烃链、糖链、脂质、蛋白质、合成高分子的基质，R也可以有取代基。
6.新型支链状唾液糖分子，其特征在于，其是下式(III)所示的结构，
式中，NeuAc表示该NeuAc的羟基、羧基与酰胺基可以相同或分别不同地被卤素、烷基或酰基化学性修饰的N-乙酰神经氨酸，Gal表示半乳糖，GalNAc表示N-乙酰半乳糖胺，R是选自氢原子、烃链、糖链、脂质、蛋白质、合成高分子的基质，R也可以有取代基。
7.权利要求5或6的任何一项的新型支链状唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神经氨酸与半乳糖通过天然的邻位糖苷键进行结合。
8.权利要求5或6的任何一项的新型支链状唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神经氨酸与半乳糖的结合是化学性变换的结合。
9.权利要求8的新型支链状唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神经氨酸与半乳糖的结合形态是S-糖苷键或Se-糖苷键。
10.抗病毒剂，其特征在于，至少含有权利要求1～9的任何一项的新型支链状唾液糖分子作为有效成分。
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