CN1555892A - 植物源性醇溶蛋白三维支架的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种植物源性醇溶蛋白三维支架的制备方法。属于生物技术领域。以植物源性醇溶蛋白为主要成分，与成孔剂按质量比，蛋白质∶成孔剂＝1∶0－1∶10，混合，或者单独用蛋白质，然后在10－95℃、高湿环境下，自然成型，或利用模具压成预定的形状；还含有食盐、碳酸氢胺、乙酸胺、氯化胺、苯甲酸胺已知的孔隙形成剂；还混合聚乳酸、聚羟基乙酸合成高分子，或者与胶原蛋白、壳聚糖、羟基磷灰石已知的生物医用材料进行杂交。本发明在体外细胞培养实验中，均证明该蛋白具有良好的细胞相容性，具备了组织工程所要求的材料特征，从而为组织工程找到了一种来源广泛，可降解，低免疫原性，抗菌性，具有适当机械强度的新型生物医用材料。

Description

植物源性醇溶蛋白三维支架的制备方法

技术领域

本发明涉及一种植物源性蛋白质的制备方法，特别是一种植物源性醇溶蛋白三维支架的制备方法。属于生物技术领域。

背景技术

现代医学的发展，特别是人体组织和器官的修复或移植技术的发展和普及，对生物医用材料的需求成为一大市场。对生物医用材料的要求，除具有良好的生物相容性、无毒、体内可降解外，还要具有一定的机械强度。特别是用于组织工程支架的材料还要求有一定强度的呈微孔结构体，使细胞能够在表面和内部黏附；有利于细胞的生长和繁殖；有利于细胞所需营养物质的交换和代谢废物的排除。目前用于生物医用材料的有机物质可大致分为合成高分子如聚乳酸等和天然高分子。已经有报道的天然高分子有蛋白质，多糖等，例如胶原，壳聚糖。而蛋白质的种类十分有限。合成高分子具有良好的力学加工性能，但其生物相容性不够理想；天然高分子的优点是可降解，生物相容性好，但是机械强度不够，因而它们的应用受到限制。

玉米醇溶蛋白于1897年被鉴定出来，是玉米中的主要蛋白质，占其总蛋白的45％-50％，可加工成树脂，具有韧性，疏水性，可降解性，抗菌性等。目前，玉米醇溶蛋白已得到了商业化应用。在医疗上，有Showa等生产的黏合剂、包扎工具，Mathiowitz等设计的药物载体微球，Cuca发明的口服药物的掩味剂；化妆品方面，有Avalle创制的化妆粉；食品上如OSAK和Wasa等研制的食品包装材料，王等发明的食品抗氧化剂。另外，玉米醇溶蛋白的应用还涉及口香糖、油漆、打印油墨、胶卷、可降解性塑料、染发剂、光纤和纺织品等诸多方面。但未见有关应用于生物医用材料的报道。

我们首先设想了该蛋白质作为生物医用材料的潜在应用价值，对其生物相容性、体内外可降解性、力学加工性能、三维支架加工技术(王瑾晔等，申请号02138761.3)、二维薄膜制备技术(王瑾晔等CN 1401659A)、包容生物活性分子的微球制备技术(王瑾晔等申请号03129639.4)和消毒灭菌技术等进行了系统、深入的研究，均获得满意结果。证明它确实是一种极有发展潜力的新型天然生物医用材料。特别是通过适当的方法可以获得有相当力学强度的支架，优于任何已报道的天然高分子材料，并能满足骨组织工程对力学性能的较高要求。上述方法虽然能够得到数十MPa的具有较高压缩强度的支架材料，但孔隙率较低，制备周期较长。这些正是本发明所要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种植物源性醇溶蛋白三维支架的制备方法。使其以植物源性醇溶蛋白为主要成分制备的生物医用材料用三维多孔支架的孔隙率可以达到70％以上，本发明的方法能在较短的加工时间内得到满足组织工程需要的三维多孔支架。是一种可降解的、具有较高机械强度的、生物相容性优良的材料。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明是以植物源性醇溶蛋白为主要成分，与不同颗粒大小的成孔剂按不同质量比，蛋白质∶成孔剂＝1∶0-1∶10，混合，或者单独用蛋白质，然后在10-95℃、高湿环境下，自然成型，或利用模具压成预定的形状。

所述的自然成型要经过0-60天(推荐时间为5-7天)后再取出样品，利用模具压制的材料则不需如此处理，然后用60-100℃(推荐温度为85-95℃)水煮10分钟-8小时(推荐时间为3-5小时)，使蛋白质之间的交联更加紧密。对于加入成孔剂的样品，在水煮过程中要换水3-5次，以完全去除成孔剂，然后真空冷冻干燥。

除植物源性醇溶蛋白为主要成分之外，还含有不同颗粒大小及比例的如食盐、碳酸氢胺、乙酸胺、氯化胺、苯甲酸胺等已知的孔隙形成剂。

除植物源性醇溶蛋白为主要成分之外，还混合聚乳酸、聚羟基乙酸等合成高分子，或者与胶原蛋白、壳聚糖、羟基磷灰石已知的生物医用材料进行杂交。

所述的植物源性蛋白是一种来源于如玉米、小麦、大麦、裸麦、燕麦的醇溶性蛋白。

本发明具有实质性的特点和显著的进步，经过本发明方法进行成型处理后，可得到具有较高机械强度，孔径和孔隙率可调，可降解的三维多孔支架。在体外细胞培养实验中，通过细胞形态学观察、细胞活力、黏附力的测定均证明该蛋白具有良好的细胞相容性，具备了组织工程所要求的材料特征，从而为组织工程找到了一种来源广泛，可降解，低免疫原性，抗菌性，具有适当机械强度的新型生物医用材料。植物源性醇溶蛋白基质不仅有利于细胞的贴壁、伸展和生长，而且可以加工成三维多孔支架，并在模仿体液环境下能够降解，更为重要的是能够满足组织工程，甚至象骨组织工程材料所要求的力学强度。其原料易得，制备方法简便，是一种大有前途的新型生物医用材料。

附图说明

图1.NIH3T3在不同材料上的生长速率(MTT法)。

图2.在pH2.2的citric acid-Na2HP04缓冲液中玉米醇溶蛋白支架的降解曲线(n＝4)。

图3.本发明所制备的支架的扫描电镜图(a是b的放大图，食盐颗粒的直径为76-150微米)。

具体实施方案

本发明的植物源性醇溶蛋白支架，有利于细胞的贴壁、伸展和生长，如用NIH3T3鼠成纤维细胞接种在三维支架上2小时后，几乎全部黏附到支架上，细胞活力(90％)与对照组(75％)相比大大增加，在以后的增殖生长中，细胞的成纤维特征特别明显(见附图1)。该支架在模仿体液环境下能够降解，而且降解速度可通过成孔条件进行调节(见附图2)。用本发明所述方法可以得到力学压缩模量在数百KPa-40Mpa范围的三维支架；孔径在数十微米-700微米；孔隙率在50％-98％，并且可以调节。

实施例一

将玉米醇溶蛋白单独或者与成孔剂(食盐)按照1∶1(重量比)混合，混合前将食盐用不同目数的筛子筛选，选择70-100目的筛子得到直径在76-150微米的食盐颗粒。然后将该混合物放入10ml小烧杯中(2g/烧杯)，经过紫外灭菌后放置在80℃湿盒内温育，在烧杯口盖上吸水纸，防止水滴直接进入烧杯内。第5天取出，用40℃水浸泡48小时，然后60℃水煮1小时，在水煮过程中换2-3次预先加热到预定温度的去离子水，以保证食盐完全溶解出来。然后冷冻真空干燥，测定压缩模量为11MPa，孔隙率68.6％。扫描电镜超微结构观察显示孔径分布为140-200微米。

实施例二

将玉米醇溶蛋白与成孔剂按上述方法混合后，按照每个样品1克蛋白的量装入圆柱形模具中，用约800N的压力压缩成型后取出，每个样品单独放在一个盛有60℃去离子水的小烧杯中，以防止样品在水中互相粘连，然后直接在恒温水浴锅内水煮1个小时，在水煮过程中换2-3次预先加热的去离子水，以保证食盐完全溶解出来。然后冷冻真空干燥，测定压缩模量模量为10MPa。扫描电镜超微结构观察显示孔径分布为300微米左右(图3)。

Claims (3)

1、一种植物源性醇溶蛋白三维支架的制备方法，其特征在于，以植物源性醇溶蛋白为主要成分，与成孔剂按质量比，蛋白质∶成孔剂＝1∶0-1∶10，混合，或者单独用蛋白质，然后在10-95℃、高湿环境下，自然成型，或利用模具压成预定的形状；还含有食盐、碳酸氢胺、乙酸胺、氯化胺、苯甲酸胺已知的孔隙形成剂；还混合聚乳酸、聚羟基乙酸合成高分子，或者与胶原蛋白、壳聚糖、羟基磷灰石已知的生物医用材料进行杂交。

2、根据权利要求1所述的植物源性醇溶蛋白三维支架的制备方法，所述的植物源性蛋白是一种来源于：玉米、小麦、大麦、裸麦或者燕麦的醇溶性蛋白。

3、根据权利要求1所述的植物源性醇溶蛋白三维支架的制备方法，其特征是，所述的自然成型要经过0-60天后再取出样品，利用模具压制的材料用60-100℃水煮10分钟-8小时，使蛋白质之间的交联更加紧密，并完全除去成孔剂，然后真空冷冻干燥。