CN1548527A - 产共聚物PHBHHx的重组嗜水气单胞菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产3－羟基丁酸(HB)和3－羟基己酸(HHx)的共聚物PHBHHx的重组嗜水气单胞菌及其构建方法与应用。该重组菌中含有β－酮硫解酶基因phbA和乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB。其构建方法包括以下步骤：1)构建含phbA和phbB基因的重组质粒；2)转化该重组质粒到嗜水气单胞菌中；3)筛选出含有重组质粒的重组嗜水气单胞菌。用该菌生产的PHBHHx，3HHx含量在3－16wt％，3HHx的比例降低，且变化范围较宽，从而使PHBHHx的结晶时间缩短并使其强度增大。并且提高了PHBHHx在细胞中的含量。同时本发明证明了抗生素和诱导物IPTG在生产3HHx含量可以调控的新型聚酯PHBHHx的过程中并不是必须的，因此可降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及产3-羟基丁酸(HB)和3-羟基己酸(HHx)共聚物PHBHHx的重组嗜水气单胞菌及其构建方法与应用，属于应用微生物和发酵工程领域。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的高分子聚酯，其分子量一般由几万至几百万，广泛存在于自然界的多种微生物体内。由于它的某些物理性质与传统的、由石油合成的塑料如聚乙烯、聚丙烯类似，但可以由可再生的能源合成，并且可以完全降解进入自然界的生态循环，因此被认为是一种可能替代不可降解的传统塑料的“生物可降解塑料”而引起世界各国科学界和产业界的广泛重视。
聚-R-3-羟基丁酸酯(poly-R-3-hydroxybutyric acid，PHB)是PHA家族中最简单的成员，也是研究得最多、最透彻的成员。纯化后的PHB在某些性能上相似于热塑性塑料，力学性质与聚丙烯(PP)相似，结晶度为55-80％，性脆，折裂伸长率很低，且在加热温度高于熔点(180℃)10℃时就会裂解，这些性质增加了PHB的后处理加工的难度，大大限制了它的应用范围。共聚物中其他单体的掺入对PHA的物理性能有较大的影响。如3-羟基戊酸HV单体的掺入使羟基丁酸和羟基戊酸共聚物PHBV的结晶结构明显改变，带来硬度下降、强度下降、熔点下降，但分解温度却没有下降；而且随着HV的加入，结晶的晶体规整性下降且呈现不同的结晶形态，这对PHA性能都有改进作用。
3-羟基丁酸(HB)和3-羟基己酸(HHx)的共聚物PHBHHx是近年来发现的新型PHA共聚物。PHBHHx的物理性能随着3HHx含量的变化而有很大的改变，当3HHx由0mol％增加到17mol％时，其拉伸强度由43MPa降低至20MPa，而相应的断裂伸长率由5％增加到850％，其结晶度由60％下降到18％。这表明PHBHHx的柔性和韧性比PHB都有很大的提高。野生型嗜水气单胞菌CGMCC 1816在以月桂酸作为培养基时可以合成PHBHHx，但其3HHx比例较高，且其变化范围较窄，在12～18mol％(15.31-22.54wt％)之间。由于过高的3HHx含量会导致PHBHHx的结晶时间延长并使其强度下降，并且含有不同比例3HHx的PHBHHx具有不同的应用价值。因此，生产3HHx组分比例可以调控的PHBHHx具有重要意义。
许多PHB合成菌，如真养罗氏杆菌、产碱杆菌、伯克霍尔德氏菌、不动杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、生枝动胶菌等，都具有β-酮硫解酶基因(phbA)和乙酰乙酰辅酶A还原酶基因(phbB)，这两个酶催化D-(-)-3-羟基丁酸辅酶A(3HB-CoA)合成。这两个酶的基因首先从真养罗氏杆菌中克隆得到，并鉴定了其产物的功能(Slater S.C.，Voige W.H.，Dennis D.E. Cloning and expression in Escherichia coli of theAlcaligenes eutrophus H16 poly-β-hydroxybutyrate biosynthetic pathway.J.Bacteriol.，1988，170：4431-4436；Schubert P.，Steinbuchel A.，Schlegel H.G.Cloning of the Alcaligenes eutrophus genes for synthesis ofpoly-β-hydroxybutyric acid(PHB)and synthesis of PHB in Escherichia coli.J.Bacteriol.，1988，170：5837-5847)。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组嗜水气单胞菌，该菌中含有催化D-(-)-3-羟基丁酸辅酶A(3HB-CoA)合成的两个酶的基因，可以生产出3HHx组分比例不同的PHBHHx。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种重组嗜水气单胞菌，该菌中含有β-酮硫解酶基因phbA和乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB。
本发明的第二个目的是提供一种构建重组嗜水气单胞菌的方法。
一种构建重组嗜水气单胞菌的方法，包括以下步骤：
1)构建含phbA和phbB基因的重组质粒；
2)转化该重组质粒到嗜水气单胞菌中；
3)筛选出含有重组质粒的重组嗜水气单胞菌。
所述phbA和phbB基因可以来自于真养罗氏杆菌、产碱杆菌、伯克霍尔德氏菌、不动杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、生枝动胶菌和其他可以合成PHB的细菌。
所述转化重组质粒到嗜水气单胞菌中的方法是，先将重组质粒以电穿孔的方式转化入E.coli S17-1中，并以含重组质粒的E.coli S17-1作为供体菌，以嗜水气单胞菌作为受体菌进行混合培养。
所述嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌。
本发明的第三个目的是提供一种利用上述重组嗜水气单胞菌生产PHBHHx的方法。
一种用重组嗜水气单胞菌生产组分比例可调控的3-羟基丁酸(3HB)和-3-羟基己酸(3HHx)的共聚物PHBHHx的方法，包括以下步骤：
1)摇瓶培养重组嗜水气单胞菌生产PHBHHx；
2)添加辅助碳源，生产含有不同比例3HHx的PHBHHx。
所述辅助碳源，优选为葡萄糖酸钠。
所述培养基中在必要时还加入诱导剂IPTG和卡那霉素。
产物经分离纯化后，用气相色谱检测PHBHHx和3HHx的含量。
本发明的优点和积极效果是：所构建得到的重组嗜水气单胞菌可生产出3HHx含量可以调控的新型聚酯PHBHHx，其3HHx含量为3-16wt％，3HHx的比例降低，且变化范围较宽，从而使PHBHHx的结晶时间缩短并使其强度增大。本发明用所构建得到的重组嗜水气单胞菌生产PHBHHx，可提高PHBHHx在细胞中的含量。本发明还证明了抗生素和诱导物IPTG在生产3HHx含量可以调控的新型聚酯PHBHHx的过程中并不是必须的，因此可降低生产成本。
附图说明
图1为重组质粒pTG01的构建图谱。
图2为PCR的电泳图谱。
具体实施方式
实施例1、重组嗜水气单胞菌QYZ1的制备
供体菌：大肠杆菌E.coli S17-1(中国普通微生物菌种保藏管理中心)
受体菌：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)CGMCC 1816(中国普通微生物菌种保藏管理中心)
外源基因：质粒pUCAB
载体：pBBRlMCS2
LB培养基：蛋白胨 10g/L
酵母浸出粉 5g/L
氯化钠 10g/L
1)质粒pTG01的构建：
如图1所示，质粒pUCAB含有来自从真养罗氏杆菌(美国菌种收藏中心，ATCC17699)的phbA和phbB基因(其在GenBank中的登录号为J04987)。用KpnI和HindIII酶切质粒pUCAB，将其小片段插入到载体pBBR1MCS2的KpnI/HindIII位点处，即得到重组质粒pTG01。
2)用接合的方式将质粒pTG01转化入嗜水气单胞菌CGMCC 1816中：
先将质粒pTG01以电穿孔的方式转化入E.coli S17-1中，再以含pTG01的E.coliS17-1作为供体菌，以嗜水气单胞菌CGMCC 1816作为受体菌，在LB平板上，将两种菌混和在30℃下温育24小时，然后用100mmol/L的磷酸钾缓冲液重悬细胞，将细胞悬液稀释后涂布在含有60mg/L氨苄青霉素和50mg/L卡那霉素的LB平板上，挑选单菌落，即为重组嗜水气单胞菌QYZ1。
3)用PCR方法对重组嗜水气单胞菌QYZ1进行验证：
根据从不同细菌里克隆出来的phbA和phbB的保守序列设计一对引物F-phbA：5’TACCACATGGG(C/T)ATCAC(C/G)GC 3’和R-phbB：3’TTGAT(G/A)AG(G/C)CG(G/C)CGGTTCCG 5’，以重组嗜水气单胞菌QYZ1里提取的质粒作为模板进行扩增，得到一条约1200bp的特异性片段，证明为含有质粒pTG01的重组嗜水气单胞菌QYZ1，如图2所示。
实施例2：利用重组嗜水气单胞菌QYZ1生产含有不同3HHx比例的PHBHHx
菌种：重组嗜水气单胞菌QYZ1
培养条件：30℃培养48小时，摇床转速200转/分
接种量：10％
培养基：Na2HPO4·12H2O 3.5g/L
KH2PO4 0.70g/L
(NH4)2SO4 2.0g/L
KCl 0.5g/L
NaCl 1.0g/L
MgSO4·7H2O 0.8g/L
酵母粉 1.0g/L
月桂酸 4.0g/L
微量元素溶液 1％
IPTG 0.2g/L
卡那霉素 50mg/L
微量元素溶液的组成为：每升溶液含有5g Fe(III)-NH4-Citrate，2g CaCl2·2H2O，10mgZnSO4·7H2O，3mg MnCl2·4H2O，30mg H3BO3，20mg CoCl2·6H2O，1mg CuSO4·5H2O，2mg NiCl2·6H2O，和3mg NaMoO4·2H2O。
将重组嗜水气单胞菌接入上述培养基中，在30℃下摇瓶培养48小时，摇床转速200转/分。分别在12小时和24小时分两次等量加入葡萄糖酸钠作为辅助碳源。培养结束后，离心(10000g，20min)，收集菌体，分别用去离子水和乙醇洗涤菌体，然后冰冻干燥(-35℃)菌体，取30毫克左右的干细胞酯化(He W N，Tian W D，Zhang G，ChenG Q，Zhang Z M.Production of novel polyhydroxyalkanoates by Pseudomonasstutzeri 1317 from glucose and soybean oil.FEMS Microbiol.Lett.，1998，169：45-49)，用气相色谱检测PHBHHx的含量和3HHx的含量，气相色谱的条件为：柱温从80℃始，程序升温到220℃。
实验结果：当添加的葡萄糖酸钠分别为0、4、8、12g/L时，得到的重组嗜水气单胞菌QYZ1的细胞干重分别达到2.20、2.79、2.66、3.09g/L，细胞内PHBHHx的含量分别为41.45％、41.09％、39.71％、37.52％，3HHx的含量分别为15.61wt％、9.94wt％、7.45wt％、3.68wt％。可见，通过改变添加的辅助碳源葡萄糖酸钠的浓度，可以得到一系列含有不同3HHx比例的PHBHHx。
实施例3：IPTG对重组嗜水气单胞菌QYZ1生产的PHBHHx中3HHx比例的影响
菌种：重组嗜水气单胞菌QYZ1
培养条件：30℃培养48小时，摇床转速200转/分
接种量：10％
培养基：Na2HPO4·12H2O 3.5g/L
KH2PO4 0.70g/L
(NH4)2SO4 2.0g/L
KCl 0.5g/L
NaCl 1.0g/L
MgSO4·7H2O 0.8g/L
酵母粉 1.0g/L
月桂酸 4.0g/L
微量元素溶液 1％
IPTG 0g/L或0.2g/L
卡那霉素 50mg/L
微量元素溶液的组成为：每升溶液含有5g Fe(III)-NH4-Citrate，2g CaCl2·2H2O，10mgZnSO4·7H2O，3mg MnCl2·4H2O，30mg H3BO3，20mg CoCl2·6H2O，1mg CuSO4·5H2O，2mg NiCl2·6H2O，和3mg NaMoO4·2H2O。
将重组嗜水气单胞菌接入上述培养基中，在30℃下摇瓶培养48小时，摇床转速200转/分。分别在12小时和24小时分两次等量加入葡萄糖酸钠作为辅助碳源。培养结束后，离心(10000g，20min)，收集菌体，分别用去离子水和乙醇洗涤菌体，然后冰冻干燥(-35℃)菌体，取30毫克左右的干细胞酯化(He WN等，1998)，用气相色谱检测PHBHHx的含量和3HHx的含量，气相色谱的条件为：柱温从80℃始，程序升温到220℃。
实验结果：当在培养基中添加的葡萄糖酸钠为0g/L时，IPTG不添加组和IPTG添加组得到的重组嗜水气单胞菌QYZ1的细胞干重分别达到1.92g/L和2.20g/L，细胞内PHBHHx的含量分别为46.75％和41.45％，3HHx的含量分别为15.66wt％和15.61wt％；当在培养基中添加的葡萄糖酸钠为8g/L时，IPTG不添加组和IPTG添加组得到的重组嗜水气单胞菌QYZ1的细胞干重分别达到2.55g/L和2.66g/L，细胞内PHBHHx的含量分别为50.65％和39.71％，3HHx的含量分别为7.73wt％和7.45wt％。可见，对于从重组嗜水气单胞菌中生产含有不同3HHx比例的PHBHHx来说，IPTG的添加并不是必须的；并且，当不添加IPTG时，还可以提高细胞内PHBHHx的含量。这在工业生产中可以大大节约成本。
实施例4：卡那霉素对重组嗜水气单胞菌QYZ1生产的PHBHHx中3HHx比例的影响
菌种：重组嗜水气单胞菌QYZ1
培养条件：30℃培养48小时，摇床转速200转/分
接种量：10％
培养基：Na2HPO4·12H2O 3.5g/L
KH2PO4 0.70g/L
(NH4)2SO4 2.0g/L
KCl 0.5g/L
NaCl 1.0g/L
MgSO4·7H2O 0.8g/L
酵母粉 1.0g/L
月桂酸 4.0g/L
微量元素溶液 1％
卡那霉素 分别为0mg/L，25mg/L，50mg/L
微量元素溶液的组成为：每升溶液含有5g Fe(III)-NH4-Citrate，2g CaCl2·2H2O，10mgZnSO4·7H2O，3mg MnCl2·4H2O，30mg H3BO3，20mg CoCl2·6H2O，1mg CuSO4·5H2O，2mg NiCl2·6H2O，和3mg NaMoO4·2H2O。
将重组嗜水气单胞菌接入上述培养基中，在30℃下摇瓶培养48小时，摇床转速200转/分。分别在12小时和24小时分两次等量加入8g/L葡萄糖酸钠作为辅助碳源。培养结束后，离心(10000g，20min)，收集菌体，分别用去离子水和乙醇洗涤菌体，然后冰冻干燥(-35℃)菌体，取30毫克左右的干细胞酯化(He WN等，1998)，用气相色谱检测PHBHHx的含量和3HHx的含量，气相色谱的条件为：柱温从80℃始，程序升温到220℃。
实验结果：当在培养基中添加的卡那霉素分别为0mg/L，25mg/L，50mg/L时，所得到的重组嗜水气单胞菌QYZ1的细胞干重分别达到2.52g/L，2.43g/L和2.43g/L，细胞内PHBHHx的含量分别为47.13％，48.90％和52.12％，3HHx的含量分别为9.03wt％，9.44wt％和9.28wt％。可见，对于从重组嗜水气单胞菌中生产含有不同3HHx比例的PHBHHx来说，抗生素的添加并不是必须的。这在工业生产中可以大大节约成本。
Claims (10)
1、一种重组嗜水气单胞菌，其特征在于：该菌中含有β-酮硫解酶基因phbA和乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB。
2、一种构建重组嗜水气单胞菌的方法，包括以下步骤：
1)构建含phbA和phbB基因的重组质粒；
2)转化该重组质粒到嗜水气单胞菌中；
3)筛选出含有重组质粒的重组嗜水气单胞菌。
3、根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述phbA和phbB基因来自于可以合成PHB的细菌。
4、根据权利要求3所述方法，其特征在于：所述可以合成PHB的细菌为真养罗氏杆菌、产碱杆菌、伯克霍尔德氏菌、不动杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌或生枝动胶菌。
5、根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述转化重组质粒到嗜水气单胞菌中的方法是，先将重组质粒以电穿孔的方式转化入E.coli S17-1中，并以含重组质粒的E.coli S17-1作为供体菌，以嗜水气单胞菌作为受体菌进行混和培养。
6、根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌CGMCC1816。
7、一种用重组嗜水气单胞菌生产组分比例可调控的3-羟基丁酸(3HB)和-3-羟基己酸(3HHx)的共聚物PHBHHx的方法，包括以下步骤：
1)摇瓶培养重组嗜水气单胞菌生产PHBHHx；
2)添加辅助碳源，生产含有不同比例3HHx的PHBHHx。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述辅助碳源为葡萄糖酸钠。
9、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：用在培养基中添加或不添加诱导剂IPTG来控制PHBHHx中3HHx的比例。
10、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：用在培养基中添加或不添加抗生素来控制PHBHHx中3HHx的比例；所述抗生素优选的是卡那霉素。
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