CN1526070A - 通过对子宫内膜的月经组织(经期组织)的测试而确定子宫内膜状况的方法 - Google Patents

通过对子宫内膜的月经组织(经期组织)的测试而确定子宫内膜状况的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及子宫内膜检查。通过利用子宫内膜的月经组织(经期组织)的检验来进行分析，收集经期组织的目的正在于此。进行检验以研究淋巴细胞亚群的组成，以便评估子宫内膜是否适合于着床和胎儿的保护。进行此类测试也可研究子宫内膜是否存在微生物以及经期组织的细胞组成。本发明还描述了一种用于收集子宫内膜组织的试管，该试管具有某些有利于经期组织测试的特征。

Description

通过对子宫内膜的月经组织(经期组织)的测试 而确定子宫内膜状况的方法
发明的技术领域
本发明涉及子宫内膜的检查。通过测试子宫内膜的月经组织(经期组织)来进行分析。
领域现状
目前在发达国家普遍遭遇不育，其是一个十分确定的问题。主要归因于目前想要小孩的配偶的年龄。与早些年相比，年龄显著增长，因而，不仅妇女的荷尔蒙系统减弱，男人的精子也随着时间经历变更。
幸运的是，成功受孕的两个重要障碍雄性因素和输卵管因素(输卵管阻塞)已被克服，但这不是因为治疗能改善精子，而是在更高程度上因为spermaterichysis和体外授精技术(IVF)。IVF是克服输卵管阻塞问题的唯一技术。
然而，尽管这类方法在全球范围建立起来，其结果并不如预想的成功。就着床而言，其成功率为5-40％，而IVF辅助怀孕的胎儿排斥率却更高一点。
子宫内膜是实体组织，从其内部覆盖着子宫，受到荷尔蒙的周期性作用的影响。在28天的循环中，由月经的第一天开始，在雌激素作用下，子宫内膜厚度增加，其所包含的腺体增长。子宫内膜的功能层，在每个周期中脱落又重新形成，其发育于子宫内膜基层，位于更深层水平上。
卵巢的排卵发生在月经周期的第14天。然后，黄体即培育卵母细胞的卵泡的剩余部分，产生黄体酮。黄体酮为胎儿着床预备已发育妥当的子宫内膜。在周期的末期，由于黄体的退化，功能停止，子宫内膜的功能层未接受到黄体酮的加强活性而脱落(月经)。由于荷尔蒙的作用，子宫内膜的细胞组成经历周期性的变化，其最终目标是着床和胎儿的保护(一旦受精)。
值得指出的是，月经组织并不象传统上认为的那样是血液。月经物质不凝结，而其所含的白血球细胞的比例与血液完全不同。给人血液印象的大量的红血球细胞着位于脉管外的月经前子宫内膜中，结果随月经组织释放出来，同时伴有子宫内膜细胞的其余部分。因而，“月经组织”的概念对应于周期中最后一天的子宫内膜。
技术观点
为能够受精和保护胎儿，需要一定条件。这些条件致使子宫内膜成为能够保护外源(非自身)抗原的唯一器官，与人类生理学(免疫学)控制外来移植的排斥的规律相反。遗憾的是，还不能理解子宫内膜在此点上是如何成为普遍规律的例外的。然而，感染的存在(尤其是由支原体引起的感染)以及免疫病理学因素已经从各种层次上牵涉到预防着床或胎儿的保护，即如果没有染色体缺陷或其它明显的原因导致胎儿排斥。
通过采用多种技术研究750名有不育病史和500名有流产病史的妇女，我们得出结论，免疫系统的的特定细胞定居在子宫内膜，其在着床过程及胎儿的保护中发挥着关键的作用。更进一步，我们得出结论，迁移到子宫内膜的有毒的白血球细胞可能在试图消灭微生物时，在子宫内膜中形成既不利于着床、也不利于胎儿保护的微环境。
发明描述
作为上述结果，我们认为收集脱落的子宫内膜组织(月经组织)是有目的的和有用的，可利用其来分析子宫内膜的状况。该项检查可在常规基础上进行达到下列目的：
研究子宫内膜淋巴细胞亚群的组成。
研究子宫内膜中微生物的存在。
研究子宫内膜的细胞组成(用于各种诊断目的)。
同步分析淋巴细胞亚群的组成和检测微生物。
遗憾的是，当今世界对于子宫内膜的敌意(hostility)估计不足，这反映在成功授精后的妊娠机会。
根据我们的观点，不成功尝试很大部分归结于子宫内膜的敌意。维系这一概念基于下列事实，在大多数尝试中着床不成功，即便使用的精子和卵子来自可生育的供体。
目前，研究子宫内膜的方法有下列5种途径：
阴道内超声波检查法。该方法测定子宫内膜的厚度，其反映子宫内膜对雌激素的反应。在设计体外授精方案和确定排卵时间时要考虑这一指征。然而，这一检查在应用时受到限制，因其在炎症存在下、有胎儿排异风险等时不能从子宫内膜的接受物上产生任何信息。
子宫输卵管造影术。该检查方法用来遮蔽子宫腔并描绘输卵管的通透性。也可看到子宫内膜多卵囊(polypodes)。然而，该方法在胎儿着床的子宫内内膜的适应性(作为微环境时)方面不能获得信息。
子宫镜检查术。这是一种检查子宫内膜表面的可视方法。可用来测定子宫内膜的多卵囊、形态缺陷和联合，甚至炎症，只要它们已引起可视的损伤。然而，该方法不能用来研究微环境以确定子宫内膜如何不利于接受和保护(发育)胎儿。该检查方法的特征在于其相对较高的花费和需要麻醉。
子宫内膜活组织切片检查。这是一种特别有用的检查方法，可用来确定月经周期所处的状态、当前周期中的排卵时间、黄体不充分，甚至可通过组织的分子分析确定微生物的存在。因为这是迄今唯一一种能使我们确定子宫内膜的细胞组成和得出有关导致不孕症或胎儿排异因素的结论的方法，因而可从活组织材料的检查中获取有关子宫内膜免疫学状况的重要和有价值的信息。通过针或麻醉后的刮除术取得材料。该方法的缺点在于相对比较疼痛和不能反复进行。除此以外，如果针撮不准确，还存在伤害的危险，因此，取样操作的医生必须高度专业化。另外，用该方法不可能对子宫内膜进行完整的免疫学研究，因为组织已经过福尔马林固定，并在经处理后的组织中，许多淋巴细胞分子发生改变，通过常规方法(免疫组织化学)不能识别，其结果不能得出结论。
宫颈液培养。这是用来诊断生殖道感染的极其重要的常规检查方法。该方法在测定阴道和宫颈感染时高度灵敏，但用于诊断子宫内膜炎症时似乎并不同样灵敏。导致不育的微生物有上升的趋向，显示取向于子宫内膜和输卵管，因此，有增长的可能，事实上十分常见的现象是宫颈液培养结果为阴性，尽管在子宫内膜中存在微生物病因。已有利用取得的宫颈液通过分子DNA测试(聚合酶链反应，PCR)来检测微生物的尝试。两种测定方式(宫颈液培养对月经组织检查)的灵敏度未见差异报道。因而，作为方法培养的灵敏度是毋庸置疑的，然而问题在于取样的部位不适当。应注意的是，用于培养的宫颈液的取样部位离胎儿着床的部位要大于5厘米。
本发明方法陈述
为研究不孕症或胎儿排异风险，检查月经组织样品以确定子宫内膜中微生物的存在和子宫内膜的细胞组成。
实施本发明的方法：
在首次大量月经潮阶段，检查下的妇女将前一个月经周期的100-1000μl脱落的子宫内膜(月经组织)收集在50ml的广口试管中，试管中包含少量的等渗缓冲液(维持pH稳定性和保护细胞的生存能力)。
月经潮是自动和自然发生的，在妇女方面不需要特别的努力，2-15分钟的间隔足够用于材料的收集。
详细方法：妇女取坐势，将无盖试管的管口放在阴户的靠后边缘，液滴自由流入试管中。依月经量，材料将因重力流入管底与缓冲液混合。在有些情况下，由于具有高粘性(存在粘液等)，组织液滴停留在管口或管壁上，只需将管盖盖上上下摇动几次，以便缓冲液将样本吸取向管底。
收集的试管为标准试管。既然迄今为止还没有作为研究月经组织的常规检查，所以尚无可商业购得的特殊试管。
优选的是收集试管应透明，有圆锥或圆形的管底，在管壁及圆锥形管底必须有显示体积的刻度，因为只采集很少体积的的组织。优选的是试管的圆锥形或圆形管底起始于5ml刻度处，其直径逐渐减小并每隔0.25ml做刻度标记。此类试管可由使用的妇女购得，灭菌并包含由等渗缓冲液(即等渗液，其维持pH稳定性和保护细胞的生存能力)。
在研究不育和胎儿排异风险的情形下，根据该发明的一种应用，子宫内膜检查可要求采用专门的免疫表型分析来进行子宫内膜淋巴细胞的研究。如果这样，遵循明确已制定的方法，从样本中分离淋巴细胞更加容易，并且此点的研究可根据方法进行，这些方法已描述为对来自不同体液(血液、胸膜液等)的其他对应细胞群的检查。
更具体而言，如图1左部所显示，从样本中提取淋巴细胞，用双层Ficoll(第一层为100％Ficoll，第二层75％RPMI)进行。样本用三倍体积的正常的灭菌盐溶液(09％NaCl)稀释，放置在双层Ficoll的顶部，形成层。接着在900rpm离心45分钟，然后如图1左部所示分离下部的细胞层。再用磷酸盐缓冲的盐水洗两(2)次。最后，标记淋巴细胞并通过细胞计数仪来分析。
子宫内膜组织的收集可在妇女家中方便地进行，但必须自收集5-6个小时内带到。应明确的是样本一定要在月经最初的30个小时内收集，因为进行上述检查要求有足够量的淋巴细胞。
为检查子宫内膜，本发明的另一项应用可包括研究是否存在微生物(即支原体、衣原体等)或其它微生物。在此情形下，样本收集可在月经期的任一阶段进行。每位妇女可在家中收集材料并在更长的时间内(长达1周)带来，通过DNA测试检测微生物。换言之，即使月经开始于公共假期，待检查的妇女用试管收集材料并通过邮件寄出，因此这对于居住在离实验室很远的地方(省、岛屿等)的人也十分方便。这种检测引起妇科问题的微生物的方法不仅可用来研究研究胎儿着床的微环境以及鉴定鉴定问题，而且可在尝试要小孩前进行测试，以避免将来的任何生殖失败。其重要性在于年轻时的微生物感染，如衣原体或支原体感染可能导致输卵管阻塞或输卵管积水。下列详细描述将显示本发明检查微生物存在的方法是至今为止比阴道液培养或一般宫颈液研究方法更灵敏。更进一步，本发明的检查微生物的方法，其优点对处女更明显。
图2显示建议的检查方法对于检测与子宫内膜相关的微生物感染的灵敏度。作为常规方法宫颈液检测子宫内膜微生物的灵敏度为30-60％。作为备选方法宫颈液分子检测(例如PCR)子宫内膜微生物的灵敏度为45-60％。月经组织的培养不用于筛选子宫内膜的微生物，其灵敏度低于5％。另一方面，本发明建议的分子检测月经组织的方法(PCR)筛选子宫内膜的微生物的灵敏度为100％。
本发明的另一项应用是检查子宫内膜的细胞组成，其可用于诊断目的(即未排卵周期)。
在本发明的其他应用中，从子宫内膜组织分离淋巴细胞并培养。这些淋巴细胞经初始检查有足够比例(即达到全部淋巴细胞群的70％以上)的子宫内膜NK型(天然杀伤细胞)淋巴细胞(CD56+CD16-CD3-)，然后进行培养。细胞上清液(培养液)可用于淋巴细胞源自同一身体或不同身体中研究对同种异体移植物排斥(外源移植)的抑制。同样的淋巴细胞上清液也可用于淋巴细胞源自同一妇女或另一妇女的胎儿排异终止。
本发明方法的优点
就利用天然状态下的月经组织物种测定不育状况的优点而言，下列几点需要强调：
易于提取足够量的材料：在这方面，本方法优于其它技术。妇女避免了妇科检查的压力，可以独自在家中收集样本，如果第一次尝试失败，可重复收集。此外，借助试管底部的刻度，妇女可以监控所收集样本的量。采集的量(100-1000μl)足够用于下述所有的检查。考虑到有关检查或甚至预防不育的信息，该方法与子宫内膜活组织切片检查相比，特别有优势。
低花费：包含缓冲液的特殊的收集试管价格极其低廉，只相当于子宫内膜活组织切片检查花费的1％-0.5％。
检验的灵敏度(结果的有效性)：已经检查近200名有不育和/或流产病史的妇女(在雅典的LOCUS MEDICUS Ltd.实验室)，通过筛查月经组织样本中的支原体和衣原体，我们观察到：
在最近已经过宫颈液检查未检测到前述微生物的共140名妇女中，有44％人型支原体(Mycoplasma hominis)(MH)呈阳性结果，32％解脲尿支原体(Ureaplesma urealyticum)(UU)为阳性，而46％砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(CT)为阳性。这意味着，用宫颈液培养方法检测MH呈阴性的妇女，实际上携带微生物，因为采用本发明建议的检验方法(月经组织液滴)，44％的妇女检查结果为阳性。同样地，在用宫颈液检查UU为阴性的妇女中，32％的妇女用本发明中的方法检查结果为阳性。
考虑到这些微生物在不育的病理生理学上有十分重要的作用，它们是导致流产的基本因素，月经组织检查具有明显的决定性的价值，因为该项检查可清楚地指出胎儿着床部位是否被危险的微生物所感染。
就衣原体感染而言，在用常规检验方法检查为阴性的例子中，用月经组织检查检测到感染的百分率为46％。
衣原体的存在直接与输卵管阻塞相关，这类感染在20-25岁的妇女中尤为常见，即便在妇女决定怀孕前，为防患与未然，检查子宫内膜有无衣原体是十分必要的。
与用分子方法检测细针获取的生物活体样本中的同种微生物相比，用分子方法检测月经样本中的微生物更加灵敏。其优点在于这样的事实，月经组织由子宫内膜的全部物质的代表性材料组成，当然不同于仅采集局部一点的生物活体检查材料。
此外，在通过细胞计数仪的免疫表型分析过程中，由于分离过程能使得目的细胞保持完全的生存能力，因而淋巴细胞中的分子能保持不变并可用于检测。
就这一点而言，本发明方法远优于固定的活组织检查材料的免疫表型分析。其原因在于，用于保存活组织检查材料的固定化合物福尔马林，即使能保护被固定材料的结构不被分解，也会改变其分子结构。换言之，人们通过活组织检查获得的仅仅是观察的材料，不能应用于大范围的测试。活组织检查材料的另一个用处是提取DNA以进行微生物研究。代替活组织检查材料，本发明方法可利用取自子宫内膜材料进行功能分析，而不仅限于观察之用。
本方法的再现性：本方法的一个重要优点在于其可重复因而能监测治疗效果。免疫治疗，其志在减少子宫内膜中有毒细胞供应，以及抗生素治疗，其旨在消灭微生物，两者均可在待检妇女中得到监测。本方法特别重要的特征在于其灵敏性和专业性，其能够分别使假阴性和假阳性的结果最小化。简言之，在抗生素治疗后，进行重新检查确认没有微生物，可确切地认定为阴性结果。
子宫内膜的同期性：使用本发明的方法可安全进行月经周期最后一天的细胞成分的研究。妇女有时月经不规则，其它方法的检验结果不能与妇女体内状况同步。当进行子宫内膜活组织检查时，由于月经周期的最后一天不能确定，去除的子宫内膜的程度不能评价。
本方法的本质即本发明的目的，是提出研究不育的新途径并对治疗结果作出评价，该方法基于月经周期最后阶段的淋巴细胞群的组成。没有其它方法可解决这一问题，很明显，本方法的检验结果包括妇女能以高的成功率进行体外授精的重要标准。
本方法的应用实施例
图3显示根据其体积(垂直轴)和粒度(水平轴)得出得子宫内膜组织中淋巴细胞的分布，分别采集自能生育的妇女(图3A)和不育的妇女(图3B)。
图3A和图3B中箭头所指的圆圈内的细胞对妇女接纳和保护胎儿是至关重要的。这些称为NK(天然杀伤细胞)的淋巴细胞(CD56+CD16-CD3-)维持子宫内膜对胎儿的“友善”，其数量必须达到全部淋巴细胞的60％以上。淋巴细胞的总量在图3A和图3B中为圆圈中所显示的细胞。
很明显，存在于不育妇女子宫内膜中的这类细胞显著减少。根据我们自己所做未出版的观察，经过持续至少2个月经周期的合适治疗后(如抗生素治疗)，这类细胞所占的百分率增高，妇女可提高胎儿着床和保护的机会。
这类细胞在不育妇女的外周血中也减少。然而，在子宫内膜中，这类细胞的比例似乎不受其它因素的影响，此类因素如生殖道感染、尿道感染等。图3A和图3B中小圆圈内的细胞为与血球细胞相似的淋巴细胞。它们包括有毒群体，其虽然能够保护子宫内膜免于感染，但(其中的部分，大约近一半)对胎儿也是有毒的。图3A和图3B描绘的是本方法的全球第一例的特定应用，其构成了本发明的目的。
月经组织样本检查后，我们认为只有当其样本成像与正常的样本相似时，如图3A所示，即有足够的子宫内膜NK型淋巴细胞，图中箭头所显示，妇女尝试体外授精或spematerichysis才是有意义的。

Claims (10)

1.一种检查子宫内膜的方法，其通过收集和分析子宫内膜的月经组织(经期组织)进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中对月经组织的检查涉及淋巴细胞亚群组成的研究以评估子宫内膜是否适合着床和胎儿保护。
3.根据权利要求1所述的方法，其中对月经组织的检查涉及有性活动的妇女以及处女的子宫内膜是否存在微生物的研究。
4.根据权利要求1所述的方法，其中对月经组织的检查涉及月经组织的细胞组成的研究。
5.根据权利要求1所述的方法，其中对月经组织的检查涉及淋巴细胞亚群组成和是否存在微生物的同步研究。
6.根据权利要求1所述的方法，其中对子宫内膜的检查用来监测免疫治疗或抗生素治疗的结果。
7.根据权利要求1和2所述的方法，其中100至1000μl量的月经组织采集自月经潮的前30个小时阶段，收集后马上与等渗缓冲液混合以保持pH的稳定性和细胞的生存能力，以及其中样本研究最迟应在提取样本后5-6小时内进行。
8.根据权利要求1和3所述的方法，其中100至1000μl量的月经组织采集自月经潮的任何阶段，收集后马上与等渗缓冲液混合以保持pH的稳定性和细胞的生存能力，并且其中样本检查可在提取样本后的1周内进行。
9.淋巴细胞的上清液(培养液)，其源自并已分离自月经组织，所述月经组织由占总淋巴细胞70％以上的子宫内膜NK型所组成，该淋巴细胞的上清液用于研究对外源移植物排斥的阻塞或抑制，所述外源移植物与淋巴细胞源自同体或异体，以及用于研究预防淋巴细胞源自同一妇女或另一妇女的胎儿流产。
10.用来收集月经组织的试管，其特征在于质地透明、具起始于5-ml刻度处的圆锥形或圆形的管底、自刻度5-ml的位置直径开始变小，在管壁和圆锥形或圆形管底具有细分的体积刻度，每隔0.25ml可见到细分的刻度。
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