CN1482131A - 一段天花病毒基因组特异的核苷酸序列 - Google Patents
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Abstract
本发明所属技术领域：1.生物技术。2.病毒检测技术。本发明提供一段天花病毒基因组特异的核苷酸序列U160K，该序列长920个碱基，广泛存在于天花病毒基因组中，在普通型和轻型天花病毒中其分布方式不同，但核苷酸同源性大于90％，与天花病毒以外的病毒无明显同源性，是天花病毒特有的遗传物质标志，可用于天花病毒特异的检测技术研究与开发。
Description
技术领域 本发明总的涉及生物技术，特别涉及天花病毒的检测和天花诊断技术。
背景技术 天花是由属于痘病毒科正痘病毒属的天花病毒引起的烈性传染病，可经呼吸道和皮肤粘膜在各年龄人群中传播。历史上曾经大规模流行，病死率高达20％-30％。由于痘苗(天花疫苗)的广泛接种，有效预防了天花的流行，并最终于20世纪70年代在全世界范围消灭了天花。从1980年起，全世界停止了痘苗接种，目前人群中存在大量对天花病毒没有免疫力或免疫力低下的群体，我国22岁以下对天花无免疫力的人群至少有4亿人，而在全世界共有20多亿人。这样，一旦由于生物恐怖、实验室泄漏、考古发掘等因素造成天花病毒重新出现，疾病的扩散将非常迅速。为了应对这样的局面，必须在天花病毒重新出现时迅速发现并尽快采取应急措施，才能最大程度减小损失。在这样的形势下，国内外都很重视天花病毒检测和天花病诊断技术的研究。
目前天花病毒检测主要使用病原电镜负染、病原鸡胚尿囊绒毛膜培养、病毒抗原和抗体检测等技术。世界卫生组织(WHO)推荐使用的主要是病原电镜负染和病原鸡胚尿囊绒毛膜接种技术。病原电镜负染技术能从形态学上准确确定被检样品是否为痘病毒，但不能区别天花病毒与其它痘病毒，如猴痘、牛痘病毒等；病原鸡胚尿囊绒毛膜接种法虽然从痘疱形态的差别可以在一定程度上区别天花病毒和其它痘病毒，但耗时长(2-4天)、操作复杂，结果可靠性有限；病毒抗原和抗体检测技术均不能明确区分天花病毒和其它痘病毒。也就是说，上述常用技术均不能对天花病毒进行特异性检测。目前上述技术仅用于天花病毒和天花病的辅助检测与诊断。
最近几年，国外有人试图利用光循环聚合酶链式反应(Light Cycler PCR)和寡聚核苷酸芯片(Oligonucleotide microchip)的技术来检测天花病毒。但前者仍无法区分天花病毒和其它痘病毒，后者目前还没有实质进展。以上两种方法目前还都处于实验室研究阶段。
发明内容 综上所述，目前还没有一种快速准确的天花病毒特异检测方法。这很大程度因为痘病毒(包括天花病毒)是目前最大和最复杂的一类病毒，其蛋白抗原同源性很高，病毒形态又极为相似，因此很难使用常规技术建立能与其它痘病毒相区别的天花病毒特异检测方法。一切生物的性状都由其基因组决定，病毒也不例外。因此，本发明的目的是：从病毒基因组的差异性出发，寻找能区别于其它病毒的天花病毒特异基因组序列，即这种序列应在所有天花病毒中都存在，而在其它已知病毒，特别是与天花病毒亲缘关系很近的其它痘病毒，如猴痘、牛痘、痘苗等病毒中都不存在，为天花病毒特异检测提供标识基因。
本发明可以通过以下方法和原则实现：①以目前已经公开发表的天花病毒基因组序列为基础；②以痘苗、猴痘病毒等与天花病毒具有相近亲缘关系的病毒和水痘、麻疹病毒等出疹性病毒基因组序列为比对对象；③应用生物信息学手段比对处理序列数据，寻找天花病毒基因组与上述病毒基因组的差别，初步确定天花病毒特异序列；④再将得到的特异序列与欧洲分子生物学实验室(EMBL)数据库记录的所有病毒核苷酸序列进行比对验证，基本确定天花病毒基因组特异序列；⑤人工合成天花病毒这种特异序列，以此序列为聚合酶链式反应(PCR)的模板，与其它病毒基因组核酸模板比较，通过实验验证，最终确定这种特异序列为天花病毒的标识基因。
本发明的主要内容：本发明以目前公开发表的天花病毒基因组序列(共有三条：包括两株普通型天花病毒，印度株India-1967和孟加拉株bangladesh-1975，其Genbank数据库索取号分别为X69198和L22579；一株轻型天花病毒，加西亚株Garcia-1966，索取号为Y16780)为基础，以痘苗、猴痘病毒等与天花病毒具有相近亲缘关系的病毒和水痘、麻疹等出疹性病毒基因组序列为比对对象，使用美国国家信息中心(NCBI)的网络版共享软件，进行天花病毒特异标识基因的筛选。首先选择印度株天花病毒的基因组序列作为工作序列，使用美国国家生物信息中心的网络版共享软件“成对基本局域联配查找工具”(Pairwise BLAST)逐个比较该序列与上述比对对象病毒的基因组序列的同源性。比对后返回参加比对的两种病毒基因组序列的同源区域，剩下非同源区域。将上述比对对象病毒一一比对完毕后，再将每次比对得到的非同源区域取交集，得到天花病毒基因组上与所有比对对象病毒都不同源的区域，即天花病毒基因组特异序列，该序列长920个核苷酸，命名为U160K。然后，将此序列再经欧洲分子生物学实验室(EMBL)的网络版共享软件FASTA对EMBL数据库记录的所有病毒核苷酸序列(154,696条)进行比对。结果表明，该序列与数据库中天花病毒以外的所有其它病毒核苷酸序列都没有显著的同源性，即进一步确认了序列U160K的特异性。最后，再比对序列U160K和另两株已发表的天花病毒基因组序列，证明它在天花病毒基因组中普遍存在并且保守(序列同源性大于90％)，同时证明U160K在普通型天花病毒中为连续分布，而在弱天花病毒中为间断分布。本发明依据U160K序列，人工合成其同源序列作为模板，以相关病毒为对照，进行聚合酶链式反应(PCR)实验，证明该特异序列可作为天花病毒的标识基因，用于天花病毒特异性检测。
本发明的优点在于：提供的天花病毒基因组标识基因U160K具有很高的特异性。它在已发表的三株天花病毒序列中都存在，而在与其亲缘性较高的猴痘、牛痘、驼痘、痘苗等病毒，以及欧洲分子生物学数据库中天花病毒以外的所有其它病毒基因序列中都不存在。以人工合成的这段序列为模板，与其它痘病毒做聚合酶链式反应(PCR)比较证明，该序列可以作为天花病毒的标识基因，用于天花病毒特异的基因检测。由于该序列在普通型天花病毒和轻型天花病毒基因组序列中排列方式不同，该标识基因还可用于普通型天花病毒和轻型天花病毒的区别检测。
附图说明 图1.使用Pairwise BLAST软件逐个比对天花病毒基因组序列和其他病毒基因组序列的结果。“-”同源区，“*”非同源区(特异区)，阴影部分为天花病毒基因组上唯一一个与所有参加比对的其它病毒基因组都特异的序列U160K。1.天花病毒基因组上与痘苗病毒哥本哈根株基因组同源和非同源的区域，2.天花病毒基因组上与痘苗病毒天坛株基因组同源和非同源的区域，3.天花病毒基因组上与猴痘病毒基因组同源和非同源的区域，4.天花病毒基因组上与牛痘病毒基因组同源和非同源的区域，5.天花病毒基因组上与驼痘病毒基因组同源和非同源的区域，6.天花病毒基因组上与鼠痘病毒基因组同源和非同源的区域，7.天花病毒基因组上与禽痘病毒基因组同源和非同源的区域，8.天花病毒基因组上与羊松皮病病毒基因组同源和非同源的区域，9.天花病毒基因组上与兔纤维瘤病毒基因组同源和非同源的区域，10.天花病毒基因组上与猪痘病毒基因组同源和非同源的区域，11.天花病毒基因组上与亚巴猴样病病毒基因组同源和非同源的区域，12.天花病毒基因组上与人传染性软疣病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒、风疹病毒基因组同源和非同源的区域。天花病毒与这几个病毒基因组同源的区域很少很短，图上未显示相应同源符号。
图2.天花病毒基因组特异序列U160K。共920个核苷酸，阴影部分为U160K序列内两个蛋白编码框。
图3.应用FASTA软件确认序列U160K的特异性。使用FASTA软件比对病毒序列同源性的E值变化曲线时，E值越小，同源度越高。图中前7个点代表7个显著同源序列的病毒的E值，E值均少于0.01，此后的点代表EMBL数据库记录的其它病毒序列比较的E值，E值较高，均无显著同源性。图中前7个点对应的是FASTA软件在EMBL数据库记录的所有病毒核苷酸序列(共计154,696条)中找到的与U160K显著同源的序列，共7个，均为天花病毒序列，编号及名称为：1.EM_VI：VVCGAA X69198.1 Variola virus DNA comple(185578)[f]，2.EM_VI：VVXHOIFOH X67117.1 Variola virus(XhoI-F 25344)[f]，3.EM_VI：VV18341U18341.1 Variola virus Somalia-1(30869)[f]，4.EM_VI：PXVARCG L22579.1 Variola majorvirus(st 186103)[f]，5.EM_VI：VV18339 U18339.1 Variola virus Garcia-19(31562)[f]，6.EM_VI：VMVY16780 Y16780.1 variola minor virus c(186986)[f]，7.EM_VI：VMVGENX72086.1 Variola minor virus comp(20259)[f]。
图4.天花病毒特异序列U160K在三株天花病毒基因组上的排列分布。
为U160K片段，该片段位于印度株第160681至161600核苷酸处，位于孟加拉株第160713至161680核苷酸处，位于加西亚株161745至162261和162889至163261核苷酸处。
图5a.克隆人工合成U160K同源序列的质粒图。使用pMD18T商品质粒为载体，将U160K同源序列插至SalI和XbaI酶切点之间。
图5b.聚合酶链式反应(PCR)检验U160K序列特异性的琼脂糖电泳结果。1.DL2000DNA分子量标记，单位为碱基对(bp)，2.痘苗天坛株特异引物在痘苗天坛株基因组DNA模板上PCR，做为阳性技术对照(→)，3.天花病毒特异引物在合成天花病毒特异序列U160K模板上PCR，做为天花病毒阳性指示(→)，4.天花特异引物在空白模板(纯水)上PCR，做为阴性技术对照，5.和6.都是天花特异引物在痘苗天坛株基因组DNA模板上PCR，做为天花病毒阴性对照。
表1.使用Pairwise BLAST软件与天花病毒基因组比对的其它病毒名称与基因组序列来源。选择三类病毒，①所有感染人的痘病毒：包括痘苗病毒(天坛株和哥本哈根株)、牛痘病毒、猴痘病毒、人传染性软疣病毒；②其它重要的痘病毒(脊椎动物痘病毒，每个属取一到二种为代表)：包括驼痘病毒、鼠痘病毒、禽痘病毒、羊松皮病病毒、兔纤维瘤病毒、猪痘病毒、亚巴猴样病病毒；③感染人并引起出疹性疾病的病毒：单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、水痘-带状疱疹病毒(即人疱疹病毒3型)、麻疹病毒、风疹病毒。共选16种病毒，其中除痘苗病毒选两株外，其余每种病毒选一株，共计17株病毒。各病毒基因组序列来源与编号详见上表。
具体实施方式 下面结合附图对本发明进行详细说明：例1.比对天花病毒基因组和其它病毒基因组寻找天花病毒基因组特异序列
使用Pairwise BLAST软件逐个比对天花病毒基因组序列和其它病毒(详见附表1)基因组序列的同源性。结果表明天花病毒基因组上只有一个区域与所有参加比对的其它病毒基因组都特异，命名为天花病毒特异序列U160K(结果见附图1)。该序列长920个核苷酸，含有两个蛋白编码框，分别位于序列的5’-末端起第207位核苷酸到第500位核苷酸和第516位核苷酸到第713位核苷酸(见附图2)。例2.使用FASTA软件进一步确认天花病毒基因组特异序列U160K的特异性
应用FASTA软件将天花病毒特异序列U160K和EMBL数据库中记录的(至2002年10月止)所有发表的病毒核苷酸序列(共计154,696条)进行比对。结果表明，除天花病毒的核苷酸序列外，没有任何病毒与U160K序列显著同源(结果见附图3)，从而确认了该序列的特异性。例3.序列U160K在天花病毒中都存在并且保守
将序列U160K与普通型天花病毒印度株和孟加拉株，以及轻型天花病毒加西亚株这三株天花病毒基因组进行比对。结果表明(详见图4)：该序列与印度株基因组记录链5’-末端第160681位核苷酸到第161600位核苷酸区域同源且连续排列，同源比为100％；与孟加拉株基因组记录链5’-末端第160713位核苷酸到第161680位核苷酸区域同源且连续排列，同源比为94.0％；与加西亚株基因组记录链5’-末端第161745位核苷酸到第163261位核苷酸区域同源但呈间断排列，同源比为94.7％。例4.序列U160K特异性的实验证据
人工合成U160K同源序列，插入商品载体质粒pMD18-T中，获得的带有U160K同源序列的质粒命名为pMD18TSU160K(见附图5a)。以此质粒为天花病毒阳性模板，以痘苗病毒天坛株基因组脱氧核糖核酸(DNA)为阴性对照，依据U160K序列合成天花病毒特异引物，进行聚合酶链式反应(PCR)。结果：使用天花病毒特异引物在U160K序列模板上有阳性条带，而在阴性对照上没有(见附图5b)。本实验证明，U160K序列可以做为标识基因进行天花病毒特异性检测。
本发明提供一段天花病毒基因组特异的核苷酸序列U160K，该序列长920个碱基，广泛存在于天花病毒基因组中，在普通型和轻型天花病毒中其分布方式不同，但核苷酸同源性大于90％，与天花病毒以外的病毒无明显同源性，是天花病毒特有的遗传物质标志，可用于天花病毒特异的检测技术研究与开发。
参考文献1.Sergei N.Shchelkunov，Robert F.Massung，Joseph J.Esposito.Comparison of the genome DNAsequences of Bangladesh-1975 and India-1967 variola viruses.Virus Research 36(1995)107-1182.Shchelkunov SN，Totmenin AV，Loparev VN，Safronov PF，Gutorov VV，Chizhikov VE，KnightJC，Parsons JM，Massung RF，Esposito JJ.Alastrim smallpox variola minor virus genome DNAsequences.Virology.2000 Jan 20；266(2)：361-86.3.Massung RF，Liu LI，Qi J，Knight JC，Yuran TE，Kerlavage AR，Parsons JM，Venter JC，EspositoJJ.Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain Bangladesh-1975.Virology.1994 Jun；201(2)：215-40.4.EMBL Nucleotide Sequence Database Release 71(established in 28-MAY-2002，worked inSeptember-2002).5.Espy MJ，Cockerill III FR，Meyer RF，Bowen MD，Poland GA，Hadfield TL，Smith TF.Detection of smallpox virus DNA by LightCycler PCR.J Clin Microbiol.2002 Jun；40(6)：1985-8.6.Shchelkunov SN，Resenchuk SM，Totmenin AV，Blinov VM，Marennikova SS，Sandakhchiev LS.Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses.FEBS Lett.1993；327(3)：321-4.7.Shchelkunov SN，Blinov VM，Resenchuk SM，Totmenin AV，Olenina LV，Chirikova GB，Sandakhchiev LS.Analysis of the nucleotide sequence of 53 kbp from the right terminus of thegenome of variola major virus strain India-1967.Virus Res.1994 Dec；34(3)：207-36.8.Lapa S，Mikheev M，Shchelkunov S，Mikhailovich V，Sobolev A，Blinov V，Babkin I，Guskov A，Sokunova E，Zasedatelev A，Sandakhchiev L，Mirzabekov A.Species-level identification oforthopoxviruses with an oligonucleotide microchip.J Clin Microbiol.2002 Mar；40(3)：753-7.9.Derrick Baxby.Human poxvirus infection after the eradication of smallpox.Epidem.Inf.(1988)，100，321-334.10.Shchelkunov SN，Totmenin AV，Babkin IV，Safronov PF，Ryazankina OI，Petrov NA，GutorovVV，Uvarova EA，Mikheev MV，Sisler JR，Esposito JJ，Jahrling PB，Moss B，Sandakhchiev LS.Human monkeypox and smallpox viruses：genomic comparison.FEBS Lett.2001 Nov 30；509(1)：66-70.表1.使用Pairwise BLAST软件与天花病毒基因组比对的其它病毒名称与基因组序列来源
| 病毒名称 | GenBank数据库中的序列识别号 |
| 驼痘病毒 | GI18640237 |
| 痘苗病毒哥本哈根株 | GI335317 |
| 痘苗病毒天坛株 | GI6969640 |
| 牛痘病毒 | GI20178370 |
| 猴痘病毒 | GI17529780 |
| 人传染性软疣病毒1型 | GI1491943 |
| 鼠痘病毒 | GI22123748 |
| 禽痘病毒 | GI9634679 |
| 羊松皮病病毒 | GI22595533 |
| 兔纤维瘤病毒 | GI9633809 |
| 猪痘病毒 | GI18640086 |
| 亚巴猴样病病毒 | GI12084983 |
| 单纯疱疹病毒1型 | GI1944536 |
| 单纯疱疹病毒2型 | GI6572414 |
| 水痘-带状疱疹病毒 | GI9625875 |
| 麻疹病毒 | GI9181912 |
| 风疹病毒 | GI16923736 |
Claims (5)
1.一段天花病毒基因组特异的核苷酸序列U160K。其特征是：U160K来源于普通型天花病毒印度株(India-1967)，位于该毒株基因组5’-末端起第160681位核苷酸到第161600位核苷酸，共920个核苷酸；U160K含有两个蛋白编码框，分别位于U160K的5’-末端起第207位核苷酸到第500位核苷酸和第516位核苷酸到第713位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的天花病毒基因组特异的核苷酸序列U160K，其特征是：U160K以一段连续分布的序列存在于普通型天花病毒孟加拉株(bangladesh-1975)的基因组中，同源性大于90％。
3.根据权利要求1所述的天花病毒基因组特异的核酸序列U160K，其特征是：U160K以非连续的间断分布方式存在于轻型天花病毒加西亚株(Garcia-1966)的基因组中，同源性大于90％。
4.根据权利要求1所述的天花病毒基因组特异的核苷酸序列U160K，其特征是：U160K与天花病毒以外的其它病毒基因组没有显著的同源性。
5.根据权利要求1所述的天花病毒基因组特异的核苷酸序列U160K和权利要求2、3、4描述的U160K特征产生的天花病毒特异检测、治疗和预防技术。
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