CN1459503A - 一种韭莲凝集素蛋白及其编码序列 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在韭莲中表达的新的zg－Lectin蛋白及其编码序列，本发明还提供了该蛋白和核酸序列的制备方法，以及在样品中检测韭莲zg－Lectin核酸序列和多肽的方法。

Description

一种韭莲凝集素蛋白及其编码序列

技术领域

本发明涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本发明涉及一种在韭莲中表达的zg-Lectin(韭莲凝集素蛋白，Zephyranthes grandiflora agglutinin，ZGA)蛋白及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。

背景技术

近20年来凝集素在生物学方面的应用研究发展迅速，它最大的特点在于其能够识别糖和糖类，每一种凝集素具有对某一种特殊的碳水化合物有专一结合的能力(Ann Biochem，1981，50：207～231)。某些凝集素基因则具有较强的抗同翅目类昆虫包括蚜虫和飞虱功能(Entomol Exp Appl，1993，66：119～126；Transgenic Res，1995，4：18～25；EntomolExp Appl，1995，75：51～59)。

本发明中，我们在韭莲中克隆到雪花莲g-Lectin凝集素(GNA)基因的同源基因zg-Lectin。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的韭莲zg-Lectin蛋白序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的韭莲基因zg-Lectin，该基因是一个韭莲zg-Lectin蛋白基因。

本发明的第二目的是提供一种新的韭莲蛋白zg-Lectin。

本发明的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述新的韭莲zg-Lectin蛋白和核酸序列的方法。

本发明还提供了这种韭莲zg-Lectin蛋白多肽和编码序列的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有韭莲zg-Lectin蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第133-708位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第133-708位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第133-708位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离出的韭莲zg-Lectin蛋白质多肽，它包括：具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。

在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是烟草。

在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有韭莲zg-Lectin蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下：

(1)将编码具有韭莲zg-Lectin蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成韭莲zg-Lectin蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第133-708位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成韭莲zg-Lectin蛋白的重组细胞；

(3)在适合表达韭莲zg-Lectin蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有韭莲zg-Lectin蛋白活性的基本纯的多肽。

较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第133-708位的序列。

本发明还提供了与zg-Lectin蛋白多肽特异性结合的抗体，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“韭莲zg-Lectin蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有韭莲zg-Lectin蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第133-708位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第133-708位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第133-708位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第133-708位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第133-708位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的韭莲zg-Lectin相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“韭莲zg-Lectin蛋白或多肽”指具有韭莲zg-Lectin蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与天然韭莲zg-Lectin相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括韭莲zg-Lectin蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的韭莲zg-Lectin多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与韭莲zg-Lectin DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗韭莲zg-Lectin多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含韭莲zg-Lectin多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括韭莲zg-Lectin多肽的可溶性片段。通常，该片段具有韭莲zg-Lectin多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“韭莲zg-Lectin保守性变异多肽”是指与SEQ ID NO.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

                  表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还包括韭莲zg-Lectin蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然韭莲zg-Lectin多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的韭莲zg-Lectin多肽时，可以将韭莲zg-Lectin编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成韭莲zg-Lectin蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括烟草细胞和其它植物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如烟草细胞等。

还可用Northern印迹法技术分析韭莲zg-Lectin基因产物的表达，即分析韭莲zg-Lectin的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

韭莲zg-Lectin RNA的Northern印迹分析和韭莲zg-Lectin特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实韭莲zg-Lectin在生物样本中的表达。

此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有韭莲zg-Lectin核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码韭莲zg-Lectin的核酸分子。

本发明还提供了检测样品中是否存在韭莲zg-Lectin核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于韭莲zg-Lectin核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的韭莲zg-Lectin核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选韭莲zg-Lectin同源基因或同源蛋白。

为了得到与韭莲zg-Lectin基因相关的韭莲cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选韭莲cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用³²P对韭莲zg-Lectin的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自韭莲的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与韭莲zg-Lectin相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的韭莲zg-Lectin核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明韭莲zg-Lectin蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的韭莲zg-Lectin蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与韭莲zg-Lectin发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

表2为本发明的韭莲zg-Lectin蛋白与雪花莲g-Lectin凝集素(GNA)蛋白的核苷酸序列(GenBank Accession No.M55556)的同源比较(FASTA)表。

表3为本发明的韭莲zg-Lectin蛋白与雪花莲g-Lectin凝集素(GNA)蛋白的氨基酸序列(GenPept Accession No.AAA33346.1)的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

韭莲zg-Lectin基因的克隆

1.组织分离(isolation)

韭莲叶片来源于上海中医药大学，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据雪花莲和其它石蒜科植物凝集素氨基酸保守序列，设计引物，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)3’-RACE

PCR(AP+JL F3)得到JL 3’(0.6kb)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知石蒜科植物凝集素基因的同源性很高，故初步认为它是一个凝集素基因。

(2)5’-RACE

第一轮PCR  (AAP+JLR1)

第二轮PCR  (AUAP+JLR2)得到JLR 5’(0.5kb)(过程同(1))

(3)PCR扩增JL编码区(JL KF1+JL KR1)得到JL编码区(0.57kb)(过程同(1))。

BLAST的结果证明从韭莲中新得到的基因确为一个植物凝集素基因。由于已知的同源凝集素(雪花莲凝集素，GNA)基因具有较强的抗同翅目类昆虫包括蚜虫和飞虱功能(Hilder等，1995；Powell等，1993，1995；)，故推测此基因具有相同的功能。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的韭莲zg-Lectin蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物JLF1：5’-5’-ATCTTTTCTCTCTCTCTCAGT-3’(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸JLR3：5’-ACTGCAGACATACATTACCGT-3’(SEQ ID NO.2)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，R1/R2的PGR条件为94℃ 5分钟，随之以94℃ 1分钟、60℃ 1分钟和72℃ 2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为934bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.3所示的序列。

实施例2

韭莲zg-Lectin基因的序列信息与同源性分析：

本发明新的韭莲zg-Lectin全长cDNA的长度为934bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于133-708位核苷酸。根据全长cDNA推导出韭莲zg-Lectin的氨基酸序列，共191个氨基酸残基，分子量19866.17，pI为9.37。详细序列见SEQ ID NO.4。

将zg-Lectin的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与雪花莲的g-Lectin(GNA)基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它与雪花莲g-Lectin基因的mRNA编码序列(GenBank Accession No.M55556)有44.7％的相同性(见表2)，在氨基酸水平上，它与雪花莲g-Lectin蛋白(GenPept Accession No.AAA33346.1)的第1-158位氨基酸残基有45％的相同性和59％的相似性(见表3)。由上可见，zg-Lectin基因与雪花莲g-Lectin(GNA)基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，可以认为两者在功能上也有很高相似性。

实施例3

韭莲zg-Lectin蛋白的结构和功能研究：

1.韭莲zg-Lectin蛋白的氨基酸序列blocks分析。将韭莲zg-Lectin蛋白的氨基酸序列在blocks数据库(网址为：http：//www.blocks.fhcrc.org)中检索结构域，得到以下结果： 151 LTITAAKLTN NNNVPAAATE KASTSNGSNP TQVPVTTAGK N

(1)在氨基酸序列中，存在以下结构域区：加框区(26-51，66-100，105-126)：Lectin蛋白功能模块(Lectin)。

(2)功能分析在该基因氨基酸序列中存在Lectin蛋白功能模块，因而可预见其的确具有相应功能。

2.韭莲zg-Lectin蛋白的信号肽分析。通过对韭莲zg-Lectin蛋白同其它植物凝集素的核苷酸序列和氨基酸序列的比较分析，发现韭莲zg-Lectin蛋白基因编码一前体蛋白，并含有信号肽序列，按von Heijine(1986)等预测凝集素蛋白信号肽的规则和对韭莲zg-Lectin蛋白同其它植物凝集素如GNA蛋白的比较，鉴定出韭莲zg-Lectin蛋白的信号肽剪切位点在第25氨基酸(A)和第26氨基酸(A)之间，该位置也符合目前已知的大多数甘露糖专一结合的凝集素如雪花莲凝集素(GNA，Van Damme等，1991)、君子兰凝集素(Van Damme等，1994)等的凝集素蛋白的信号肽剪切位点。

3.韭莲zg-Lectin蛋白的专一结合糖基化分析。通过对韭莲zg-Lectin蛋白同其它植物凝集素蛋白如雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素、水仙凝集素等的专一结合糖基化分析，发现韭莲zg-Lectin蛋白同大多数甘露糖专一结合的凝集素如雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素、水仙凝集素等一样，具有3个典型的甘露糖专一结合位点盒(QDNY)，见下表(表中甘露糖专一结合位点盒QDNY用方框框住)。因此证明韭莲zg-Lectin蛋白也同雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素等一样，为甘露糖专一结合的凝集素蛋白。

1   MATVSINVLL LATTLGLLMT TGARAANVLQ SGQQLGTGGS LDYAAYNFRM

151 LTITAAKLTN  NNNVPAAATE KASTSNGSNP TQVPVTTAGK N

实施例4

韭莲zg-Lectin多肽的制备和提纯

在该实施例中，将全长的韭莲zg-Lectin编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

将韭莲zg-Lectin多肽以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。

原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌

根据韭莲zg-lectin的氨基酸序列，设计扩增出切除信号肽后的蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将韭莲zg-Lectin基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl₂方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-zg-Lectin表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-zg-lectin。

表达Trx-zg-Lectin重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-zg-lectin工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-zg-lectin融合蛋白的工程菌。

Trx-zg-Lectin融合蛋白的提取纯化

按上述方法诱导表达Trx-zg-lectin融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-zg-lectin，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mM CAPS，pH11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mM Tris-HCl，pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole，500mMNaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗脱来收集Trx-zg-Lectin融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20℃酶切16小时后即可分离获的zg-lectin的表达蛋白。

实施例5

韭莲zg-Lectin蛋白或多肽在烟草细胞中进行真核细胞表达

含目的基因(韭莲zg-Lectin基因)表达载体的构建

根据韭莲zg-Lectin的全长编码序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将韭莲zg-Lectin cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121)，在保证阅读框架的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。利用叶盘法转化烟草：

1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2ml YEB液体(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振荡培养24-36小时；

2.室温下4,000g离心10min；

3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD₆₀₀＝0.5左右；

4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；

5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；

7.将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；

8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；

9.等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

利用western blot检测韭莲凝集素蛋白(ZGA)在转基因烟草植株中的表达：

1.蛋白的提取：a)取50mg叶片，加入100ul 1*PBS(KH₂PO₄0.2g/l，Na₂HPO₄ 1.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于1.5ml eppendorf管中研磨；b)13000rpm，4℃离心10分钟；c)取上清，备用。注：以上过程于冰上进行。

2.蛋白的定量：参考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白样品，加入1ml Bradford试剂，混匀后，分光光度计测OD₅₉₅：蛋白含量计算：1 OD₅₉₅＝0.035ug。

3.SDS-PAGE分离蛋白：SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a)加样前，将样品置于含50mmol/L DTT的加样缓冲液(2*加样缓冲液；甘油2.4g，1M Tris-HJLpH6.8 1ml；溴酚兰0.01％，H₂O定容至20ml)，煮沸10分钟；b)室温100V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部。

4.蛋白质向硝酸纤维膜上转移：a)转移之前，用转移缓冲液(39mmol甘氨酸，48mmolTris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；b)室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；

5.膜上蛋白的检测：a)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液：取5g脱脂奶粉溶于100ml 1*PBS(含0.5g叠氮钠))；b)再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；c)加入第一抗体(抗韭莲zg-Lectin或抗雪花莲g-Lectin的抗体)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤三次；d)加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤两次；e)加入底物显色显色观察蛋白条带。

                        表2

            44.7％identity in 758 nt overlapZGA.seq：94 ccact-cttggagttggaggtaccaatatattcaaaaacaatgaccaccg  142

        |.||||           |:||:.|||:||:.|:||::|||..   |:||GnA.seq：1  caactac----------aagttacaaaatg-gctaaggcaagt--ctcc-  36ZGA.seq：143 tcagcatcaatgtcctccttctggctactacgttgggccttctgatgaca    192

             |||::||.||.||.|     ||:|  |.|.|.|.|:||     ||GNA.seq：37  ---tcat-tttggccgccat----cttc--cttggtgtcatc-----ac-    70ZGA.seq：193 accggc--gccagggccgcca----acgtgctgcagtcgggccagcagct    236

         |||:.|  |||:|:|..:|.|    :.||:||.|:||.:|:|  .|: ||GNA.seq：71  accatcttgcctgagtgacaatattttgtactccggtgagac--tct-ct    117ZGA.seq：237 cggcaccggcggctccctcgactacgccgcctacaacttcaggatgcagg    286

         |.:||  ||.|:.|..|||:||||||..:..|:|::.||.|..|||||:|GNA.seq：118 ctaca--ggggaatttctcaactacggaagtttcgtttttatcatgcaag    165ZGA.seq：287 ccgactgcaacctcgtgctgtacgacaacggcaatgccgtg-tgggcgtc    335

         ..||||||||.||.||..||||||||::.|:||| |||::. |||||::|GNA.seq：166 aggactgcaatctggtcttgtacgacgtggacaa-gccaatctgggcaac    214ZGA.seq：336 cggcaccaacggccgcgggtcc---ggctgcacgtgcc---ggatgcagt    379

         .::|||.：:.||.|.|  |||   :|||||   |.||   |.||||||:GNA.seq：215 aaacacaggtggtctc---tcccgtagctgc---ttcctcagcatgcaga    258ZGA.seq：380 acgacggcaacctggtggtctac-accaacgccaaccgggccg-tgtggg    427

         ..||.||.|||||.|||||.|||  ||| |:.|:|.|:::||| |.||||GNA.seq：259 ctgatgggaacctcgtggtgtacaacc--catcgaacaaaccgatttggg    306ZGA.seq：428 cgagcaacaccaaccgtggcacc-----gggagctaccagctgatcctcc    472

         |:||||||||.:   |:||  ||     ||||:.|||.:|...|||||.|GNA.seq：307 caagcaacactg---gagg--ccaaaatgggaattacgtgtgcatcctac    351ZGA.seq：473 agcgcgaccgcaatgtcgtgatttatgatccctcgg-gcagggccatctg    521

         ||.:.||..|.|||||.|||||        |.:||| :|:|:.|  ..||GNA.seq：352 agaaggataggaatgttgtgat--------ctacggaactgatc--gttg    391ZGA.seq：522 ggccaccggaaccaacgtggccgccgccaacgtcaccctttccgccgccc    571

         |||.||.|||||  :|:    |:|||  :||.|     .||..:...|||GNA.seq：392 ggctactggaac--tca----caccg--gactt-----gttggaattccc    428ZGA.seq：572 gccctaccaacctcaccatcaccgccgctaaacttaccaataataataat    621

         |                ||||:||:||     ||   ||:::|:|:::GNA.seq：429 g---------------catcgccacc------ct---cagagaaatat--    452ZGA.seq：622 gtcccggcggccgctaccgaaaaagcgtcgacctccaatggaagtaaccc    671

            ||.:|.||.|.|..||:|||||.|GNA.seq：453 ---cctactgctg-gaaagataaagctt----------------------    476ZGA.seq：672 aacgcaagtcccggtgacgactgctggtaaaaattaatcctacccaccga    721

                      ||||||:|:  ::||||::             ||||:GNA.seq：477 -------------gtgacggca--aagtaatg-------------accgg    498ZGA.seq：722 taaccttgattatataacgtacgtcgtctaatttttatgtgtgaatgcaa    771

         |:|.||      |:||||.|:|          :|.||||||.|||.GNA.seq：499 tgatct------tttaacttgc----------atgtatgtgggaag----    528ZGA.seq：772 ctgcgcggcggtaatatatatccggcaattgtaactgttggagcaaataa    821

                 :||||||:|                   :|::|:|||GNA.seq：529 ---------agtaataaa------------------ataagtgca-----    546ZGA.seq：822 tgttgtaaggtgttgtccacctacagtacg    851

              |::|:.:|::||.|||| |:..:||GNA.seq：547 -----tttgagataatcgacct-cgtcgcg    570ZGA.seq为韭莲zg-Lectin蛋白的核酸序列GNA.seq为雪花莲g-Lect in蛋白的核酸序列(GenBank ACCESSION No.M55556)

                                   表345％ identity in 158 aa overlap，59％ similarity in 158 aa overlapZGA.pep：1   MATVSINVLLLATTLGLLMTTGARAANVLQSGQQLGTGGSLDYAAYNFRMQADCNLVLYD 60

         MA  S+ ++L A  LG++T     +N+L  SG+L  TG  L+Y ++F  MQ DCNLVLYDGNA.pep：1   MAKASL-LILAAIFLGVI-TPSCLSDNILYSGETLSTGEFLNYGSFVFIMQEDCNLVLYD 58ZGA.pep：61  NGNAVWASGTNGRGSGCTCRMQYDGNLVVYTNANRAVWASNTNRGTGSYQLILQRDRNVV 120

             +WA+ T G    C   MQ DGNLVVY  +N+ +WASNT    G+Y  ILQ+DRNVVGNA.pep：59  VDKPIWATNTGGLSRSCFLSMQTDGNLVVYNPSNKPIWASNTGGQNGNYVCILQKDRNVV 118ZGA.pep：121 IYDPSGRAIWATGTNVAAANVTLSAARPTNLTITAAKL 158

         IY   G   WATGT+     V+A+P+       TA K+GNA.pep：119 IY---GTDRWATGTHTGL--VGIPASPPSEKYPTAGKI 151

                          序列表<110>复旦大学<120>一种韭莲凝集素蛋白及其编码序列<130>33<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>934<212>核苷酸<213>韭莲<220><221>编码序列<222>(133)..(708)<223><400>1atcttttctc tctctctcag tactgctcta gtactataaa tagaaggccc aacgcttgag    60gttagtacac cacaccacca ctagctaatt aagccactct tggagttgga ggtaccaata    120tattcaaaaa ca atg acc acc gtc agc atc aat gtc ctc ctt ctg gct act    171

          Met Thr Thr Val Ser Ile Asn Val Leu Leu Leu Ala Thr

          1               5                   10acg ttg ggc ctt ctg atg aca acc ggc gcc agg gcc gcc aac gtg ctg      219Thr Leu Gly Leu Leu Met Thr Thr Gly Ala Arg Ala Ala Asn Val Leu

15                  20                      25cag tcg ggc cag cag ctc ggc acc ggc ggc tcc ctc gac tac gcc gcc      267Gln Ser Gly Gln Gln Leu Gly Thr Gly Gly Ser Leu Asp Tyr Ala Ala30                  35                  40                  45tac aac ttc agg atg cag gcc gac tgc aac ctc gtg ctg tac gac aac      315Tyr Asn Phe Arg Met Gln Ala Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asp Asn

            50                  55                  60ggc aat gcc gtg tgg gcg tcc ggc acc aac ggc cgc ggg tcc ggc tgc      363Gly Asn Ala Val Trp Ala Ser Gly Thr Asn Gly Arg Gly Ser Gly Cys

        65                  70                  75acg tgc cgg atg cag tac gac ggc aac ctg gtg gtc tac acc aac gcc      411Thr Cys Arg Met Gln Tyr Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Asn Ala

    80                  85                  90aac cgg gcc gtg tgg gcg agc aac acc aac cgt ggc acc ggg agc tac      459Asn Arg Ala Val Trp Ala Ser Asn Thr Asn Arg Gly Thr Gly Ser Tyr

95                  100                 105cag ctg atc ctc cag cgc gac cgc aat gtc gtg att tat gat ccc tcg      507Gln Leu Ile Leu Gln Arg Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Asp Pro Ser110                 115                 120                 125ggc agg gcc atc tgg gcc acc gga acc aac gtg gcc gcc gcc aac gtc      555Gly Arg Ala Ile Trp Ala Thr Gly Thr Asn Val Ala Ala Ala Asn Val

            130                 135                 140acc ctt tcc gcc gcc cgc cct acc aac ctc acc atc acc gcc gct aaa      603Thr Leu Ser Ala Ala Arg Pro Thr Asn Leu Thr Ile Thr Ala Ala Lys

        145                 150                 155ctt acc aat aat aat aat gtc ccg gcg gcc gct acc gaa aaa gcg tcg      651Leu Thr Asn Asn Asn Asn Val Pro Ala Ala Ala Thr Glu Lys Ala Ser

    160                 165                 170acc tcc aat gga agt aac cca acg caa gtc ccg gtg acg act gct ggt      699Thr Ser Asn Gly Ser Asn Pro Thr Gln Val Pro Val Thr Thr Ala Gly

175                 180                 185aaa aat taa tcctacccac cgataacctt gattatataa cgtacgtcgt              748Lys Asn190ctaattttta tgtgtgaatg caactgcgcg gcggtaatat atatccggca attgtaactg    808ttggagcaaa taatgttgta aggtgttgtc cacctacagt acgtacaagt ctttgtcttt    868atcaagcagc tgcactgtat taatatggtg taatgaataa attttacggt aatgtatgtc    928tgcagt                                                               934<210>2<211>191<212>蛋白质<213>韭莲<400>2Met Thr Thr Val Ser Ile Asn Val Leu Leu Leu Ala Thr Thr Leu Gly1               5                   10                  15Leu Leu Met Thr Thr Gly Ala Arg Ala Ala Asn Val Leu Gln Ser Gly

        20                  25                  30Gln Gln Leu Gly Thr Gly Gly Ser Leu Asp Tyr Ala Ala Tyr Asn Phe

       35                 40                 45Arg Met Gln Ala Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asp Asn Gly Asn Ala

50                  55                  60Val Trp Ala Ser Gly Thr Asn Gly Arg Gly Ser Gly Cys Thr Cys Arg65                  70                  75                  80Met Gln Tyr Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Asn Ala Asn Arg Ala

            85                  90                  95Val Trp Ala Ser Asn Thr Asn Arg Gly Thr Gly Ser Tyr Gln Leu Ile

        100                 105                 110Leu Gln Arg Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Asp Pro Ser Gly Arg Ala

    115                 120                 125Ile Trp Ala Thr Gly Thr Asn Val Ala Ala Ala Asn Val Thr Leu Ser

130                 135                 140Ala Ala Arg Pro Thr Asn Leu Thr Ile Thr Ala Ala Lys Leu Thr Asn145                 150                 155                 160Asn Asn Asn Val Pro Ala Ala Ala Thr Glu Lys Ala Ser Thr Ser Asn

            165                 170                 175Gly Ser Asn Pro Thr Gln Val Pro Val Thr Thr Ala Gly Lys Asn

        180                 185                 190

Claims (11)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有韭莲zg-Lectin蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第133-708位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ IDNO.3中从核苷酸第133-708位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第133-708位的核苷酸序列。

4.一种分离出的韭莲zg-Lectin蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。

7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞，其特征在于它是真核细胞。

8.一种产生具有韭莲zg-Lectin蛋白质活性的多肽的方法，特征在于其步骤如下：

(1)将编码具有韭莲zg-Lectin蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成韭莲zg-Lectin蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第133-708位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成韭莲zg-Lectin蛋白的重组细胞；

(3)在适合表达韭莲zg-Lectin蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有韭莲zg-Lectin蛋白活性的基本纯的多肽。

9.一种能与权利要求7所述的韭莲zg-Lectin蛋白多肽特异性结合的抗体，其特征在于它包括多克隆抗体和单克隆抗体。

10.一种核酸分子，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

11.一种用于检测样品中是否存在韭莲zg-Lectin核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用权利要求10所述探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于韭莲zg-Lectin核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度为15～50个核苷酸。