CN1418221A - 用不饱和脂肪酸催化剂生产甾醇5,7－二烯的第尔斯－阿尔德加成物的方法 - Google Patents

用不饱和脂肪酸催化剂生产甾醇5,7－二烯的第尔斯－阿尔德加成物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1418221A
CN1418221A CN01806634A CN01806634A CN1418221A CN 1418221 A CN1418221 A CN 1418221A CN 01806634 A CN01806634 A CN 01806634A CN 01806634 A CN01806634 A CN 01806634A CN 1418221 A CN1418221 A CN 1418221A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dienophile
alkyl group
diels
mixture
low alkyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN01806634A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1192034C (zh
Inventor
M·M·施瓦茨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DSM IP Assets BV
Original Assignee
Roche Vitamins AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Vitamins AG filed Critical Roche Vitamins AG
Publication of CN1418221A publication Critical patent/CN1418221A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1192034C publication Critical patent/CN1192034C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C07J71/0036—Nitrogen-containing hetero ring
    • C07J71/0042—Nitrogen only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了用于从甾醇混合物中分离含5，7－二烯官能团的甾醇的改进方法和组合物，包括在至少催化量的烯属不饱和C12－C24脂肪族羧酸的存在下形成5，7－二烯甾醇的第尔斯－阿尔德反应产物。

Description

用不饱和脂肪酸催化剂生产甾醇5，7-二烯的第尔斯-阿尔德加成物的方法
技术领域
本发明涉及第尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应的活化方法。更具体地说，本发明涉及甾醇5，7-二-烯的第尔斯-阿尔德反应的活化。
本发明的背景
在甾醇的某些工业生产方法中，第尔斯-阿尔德加成用作保护步骤以及用于纯化。第尔斯-阿尔德加成已被证实可用于25-羟基维生素D3的工业生产。在现有技术状态下，工业生产25-羟基维生素D3的经济效益显著受第尔斯-阿尔德反应的收率的影响。因此希望使工业甾醇生产中的第尔斯-阿尔德反应的收率最大化。
第尔斯-阿尔德反应是公知的亲二烯体至二烯的化学加成。活化第尔斯-阿尔德反应的教科书方法使用释电子基团以增强π给体二烯的电子密度。类似地，吸电子基团用于降低π受体的电子密度，因此增强了它的亲电子性。在一些方法中，如工业甾醇生产中，提供官能团以活化第尔斯-阿尔德反应的给电子体是不可能或不实际的。正在寻找在工业甾醇生产中改进第尔斯-阿尔德反应的方法。
在现有技术中，25-羟基维生素D3的半合成工业生产涉及从双重突变型酵母的发酵获得的5，7，24-胆甾三烯基酯的皂化，以形成游离的5，7，24-胆甾三烯醇(还称之为7-脱氢胆甾醇或前维生素D3)。这里突变酵母含有在酵母甾醇-24-甲基转移酶中的erg6突变，以及如在U.S.专利No.5,460,949中所述的在麦角甾烷-5，7，24(28)-三烯醇-22-脱氢酶的表达中的突变(erg5)，该专利的公开内容在这里作为参照引用。
皂化工序在现有技术中是常用的，尤其在需要酯在有机物质中水解的场合。皂化反应涉及用强碱处理，通常同时进行加热。
皂化反应产物还包括角鲨烯，脂肪酸，包括饱和和不饱和脂肪酸，和其它甾醇，它们可以包括非共轭二烯醇和单不饱和甾醇。为了从混合物中分离胆甾三烯醇和包括羊毛甾醇、4，4-二甲基酵母甾醇、4-甲基酵母甾醇、酵母甾醇、胆甾-7，24-二烯-3β-醇的其它甾醇，通常将pH调至大约7-8pH单位，以及皂化物用庚烷萃取，和庚烷萃取物用水洗涤。将洗过的庚烷萃取物浓缩，再与乙酸乙酯混合。这被称为“甾醇萃取物”。
在现有技术的第尔斯-阿尔德保护和/或纯化步骤中，甾醇萃取物与亲二烯体反应以形成胆甾三烯醇的5，7-二烯的第尔斯-阿尔德加成物，同时留下了非共轭二烯醇和其它未反应的胆甾醇。亲二烯体通常是由含水漂白剂(次氯酸钠)与邻苯二甲酰肼的反应就地产生的邻苯二甲肼(phthalhydrazine)。然后用色谱法从未反应的酵母甾醇混合物中分离出第尔斯-阿尔德加成物，使胆甾三烯醇再生，进一步纯化和用于制备25-羟基维生素D3。该反应顺序在U.S.专利No.5,391,777中说明，它的公开内容作为参照引用。
U.S.专利No.5,208,152描述了第尔斯-阿尔德反应的催化剂，其中底物是具有短效离去基团的环状共轭二烯。这些二烯不象甾醇。
U.S.专利No.4,503,195公开了二苯基化和三苯基化阳离子基团聚合物作为第尔斯-阿尔德催化剂的用途，其中阳离子基团是VA族元素(例如氮、磷或砷)。
U.S.专利No.4,413,154和U.S.专利No.4,384,153公开了1，3-丁二烯和4-乙烯基环己烯在分子筛/沸石上的第尔斯-阿尔德反应。
本发明的概述
根据本发明，出人意料地发现，至少催化量的不饱和C12-C24脂肪族羧酸的存在增强了甾族5，7-二烯和亲二烯体(优选从可氧化的亲二烯体前体和氧化剂就地产生)之间的第尔斯-阿尔德加成物的形成。根据本发明，将至少催化量的不饱和C12-C24脂肪族羧酸外源性地提供给第尔斯-阿尔德反应。
甾族5，7-二烯可以是任何这种化合物。当添加至少催化量的C12-C24不饱和羧酸时，已经检验的那些化合物都以提高的加成物收率进行第尔斯-阿尔德反应。麦角甾醇和5，7，24-胆甾三烯醇是优选的甾族5，7-二烯，其中5，7，24-胆甾三烯醇是尤其优选的。
本发明还考虑了包括以下步骤的用5，7-二烯甾醇形成第尔斯-阿尔德加成物的改进方法。将5，7-二烯甾醇与亲二烯体混合以形成反应混合物，从而将5，7-二烯甾醇转化为第尔斯-阿尔德加成物。5，7-二烯甾醇具有以下结构式：
Figure A0180663400091
其中R3选自H和R1CO-，其中R1是5-7个碳原子的单环芳基或低级烷基，R4、R5和R6独立地选自H、羟基和低级烷基，R7是C1-C10烃基。在一个优选实施方案中，5，7-二烯甾族化合物是胆甾-5，7，24-三烯-3-醇。任选使第尔斯-阿尔德加成物进行进一步化学转化，以提供改性第尔斯-阿尔德加成物。从混合物中分离第尔斯-阿尔德加成物或改性第尔斯-阿尔德加成物。
本发明考虑将至少催化量的烯属不饱和C12-C24脂肪酸加到第尔斯-阿尔德反应混合物中。优选，烯属不饱和C12-C24脂肪酸是亚麻酸、亚油酸、油酸或两种或所有三种酸的混合物。
在一个实施方案中，亲二烯体具有结构式X-R＝R-Y，其中R基团均是N或均是C-Q，其中Q基团是H或一起形成第三键，和其中X和Y选自本身独立选自-COOH、-CHO、-NO2、-CN、-COOR8和-COR8中的吸电子基团，其中R8是低级烷基，或其中X和Y连在一起形成-(CO)-Z-(CO)-桥基，其中Z是低级亚烷基，具有至多4个环取代基的含5-7个碳原子的单环亚芳基，或-NR2，其中R2是低级烷基、H或含5-7个碳原子和至多5个环取代基的单环芳基，其中环取代基选自-(CH2)n-NH2、-(CH2)n-COOH、-NO2、卤素和低级烷基，其中n是0-6的整数，包含端值。
在另一实施方案中，亲二烯体从(I)可氧化的亲二烯体前体和(ii)能有效氧化该前体以形成亲二烯体的氧化剂中就地产生，其中亲二烯体前体具有结构式X-NH-NH-Y，其中X和Y选自本身独立选自-COOH、-CHO、-NO2、-CN、-COOR8和-COR8中的吸电子基团，其中R8是低级烷基，或其中X和Y连在一起形成-(CO)-Z-(CO)-桥基，其中Z是低级亚烷基，具有至多4个环取代基的5-7个碳原子的单环亚芳基，或-NR2，其中R2是低级烷基、H或含5-7个碳原子和至多5个环取代基的单环芳基，其中环取代基选自低级烷基、卤素、-NO2、-(CH2)n-NH2和-(CH2)n-COOH，其中n是0-6的整数，包含端值。优选，可氧化的亲二烯体前体是邻苯二甲肼。优选，氧化剂是次氯酸盐(例如NaOCl或次氯酸钠的水溶液)。
本发明进一步考虑了初始包含如上所述的至少催化量的外源添加的烯属不饱和C12-C24脂肪酸、甾族5，7-二烯和亲二烯体的第尔斯-阿尔德反应混合物。
本发明具有许多益处和优点，以下列举了几个。
本发明的一个益处是以提高的收率形成第尔斯-阿尔德加成物。
本发明的优点是与甾族共反应剂的成本相比，催化剂是十分便宜的。
本发明的另一益处是当第尔斯-阿尔德加成反应用于保护共轭二烯官能团时，第尔斯-阿尔德加成物形成的改进使得已经存在的更大比例的含5，7-二烯的甾醇得到保护。
本发明的另一优点是当第尔斯-阿尔德反应用于帮助纯化时，第尔斯-阿尔德加成物形成的改进使得更加容易地分离已经存在的更大比例的含5，7-二烯的甾醇。
本发明的再一益处是皂化反应用酸的中和不需要在半合成甾醇生产中提供外源性不饱和脂肪酸。
在阅读了以下公开内容后，普通技术人员将会清楚其它益处和优点。
本发明的详细描述
本发明部分是对U.S.专利No.5,391,777的方法的改进，其公开内容在这里引用供参考。U.S.专利No.5,391,777描述了第尔斯-阿尔德反应用于从复合甾醇溶液中分离胆甾-5，7-二烯-3β-25-二醇和其它甾族5，7-二烯的用途。含5，7-二烯的甾族化合物与亲二烯体或可氧化的亲二烯体前体与氧化剂反应以提供二烯的第尔斯-阿尔德加成物。
在以下的说明书和权利要求书中，参考如下定义的许多术语。
这里使用的“外源性”或“外源添加”是指单独加到含5，7-二烯的甾醇的适当不饱和脂肪酸中，而非已经与甾醇在一起的适当不饱和脂肪酸。例如，它不是指存在于来自萃取的细胞中的甾醇萃取物中的不饱和脂肪酸。
“烷基”是指支化或非支化的饱和烃基。这里优选的烷基含有1-12个碳原子。“低级烷基”是指含1-6个、更优选1-4个碳原子的烷基。
“亚烷基”是指饱和的支化或非支化烃链的分子片段，例如包括亚乙基(-CH2-CH2-)。“亚链烯基”是指不饱和烃链的分子片段，例如包括亚乙烯基(-CH＝CH-)。
“烃基”是指支化或非支化的、饱和或不饱和的烃基。
“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘基。在卤素中，氯和溴一般是优选的，其中氯一般是更优选的。
“任选”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，以及该描述包括该事件或情况发生的例子和该事件或情况不发生的例子。例如，“任选取代的苯基”是指苯基可以被取代或不被取代和该描述包括未取代的苯基和被取代的苯基。
这里使用的术语“甾醇”是指稠合的还原环体系环戊[α]-菲的不饱和的含羟基的衍生物，包括在菲排列中的三个稠合环己烷环(A、B和C)，和端部环戊烷环(D)。以下示例的甾族化合物说明了这里在描述基团和取代基位置中使用的编号体系。
几种含5，7-二烯的甾醇是用于本发明的改进第尔斯-阿尔德反应的候选物。它们包括天然甾醇的类似物和除了天然的含5，7-二烯的甾醇以外的新型合成的含5，7-二烯的甾醇。有几种已知的天然的含5，7-二烯的甾醇。
事实上，甾醇由复杂的生物合成循环中的乙酸盐衍生而来，它们都途经产生角鲨烯的途径。乙酰辅酶A(CoA)与乙酰乙酰CoA反应，以形成3-羟基-3-甲基戊二酸单酰CoA(HMG-CoA)。HMG-CoA在由酶HMG-CoA还原酶催化的不可逆反应中还原成甲羟戊酸。甲羟戊酸被磷酰化和脱羧为异戊烯基-焦磷酸(IPP)。通过后续的异构化、缩合和脱氢步骤，将IPP转化为焦磷酸香叶酯(GPP)。GPP与IPP结合，形成焦磷酸法呢酯(FP)，它的两个分子还原缩合，形成角鲨烯，即甾醇的含30个碳的前体。
U.S.专利No.5,460,949描述了增加酵母中角鲨烯和特殊甾醇的蓄积量的方法，包括在甾醇生物合成酶的表达中在具有特定单或双缺陷的突变酵母中增加编码具有HMG-CoA还原酶活性的多肽的结构基因的表达水平。
角鲨烯的蓄积往往增强了甾醇的产生。在酵母中，角鲨烯转化为角鲨烯环氧化物，然后环化形成羊毛甾醇。羊毛甾醇在4位上具有两个甲基，在14位上具有1个甲基，在8(9)位上具有双键，以及在17位上具有键接于该碳的式CH3CH(CH2)2CH＝C(CH3)2的8碳侧链。羊毛甾醇随后在14和4位上去甲基，形成酵母甾醇(胆甾-8，24-二烯醇)，再在17位的侧链上甲基化，最后转化为麦角甾醇(麦角甾烷-5，7，22-三烯醇)，它是天然存在的野生型酵母的最丰富的甾醇。这里在实施例1中作为例子利用的双突变erg5-erg6酵母中，因为erg6突变，17位侧链不被甲基化。另外，erg5突变阻止了在C-22上的脱氢，使得没有出现在C-17侧链上的胆甾醇型不饱和。
在动物如哺乳动物(包括人)中，羊毛甾醇也是含5，7-二烯的甾醇的合成中的中间体。在一条途径中，羊毛甾醇转化为24，25-二氢羊毛甾醇，然后转化为4α-甲基-Δ8-胆甾醇、4α-甲基-Δ7-胆甾醇、Δ7-胆甾醇、7-脱氢胆甾醇(一种5，7-二烯)，再转化为胆甾醇。17位侧链在动物的普通甾醇合成中不进一步烷基化。参见 生物原理(Principles of Biochemistry)第6版，Abraham White等编辑，McGraw-Hill Book Company(纽约：1979)，619-630页。
在高级植物如烟草、棉花、大豆、蕃茄和苜蓿中，17位上的侧链在亚甲基羊毛甾烯醇(obtusifoliol)的形成中被甲基化，在随后的一些步骤中在该增加的碳原子上进一步甲基化，最后形成中间体Δ7-燕麦甾醇，它是合成中的分支点。在一条途径中，形成了豆甾烷-5，7，24(28)-三烯-3β-醇，再先后获得豆甾烷-5，7-二烯-3β-醇和谷甾醇或豆甾醇。在另一途径中，Δ7-燕麦甾醇先后形成豆甾烷-7-烯-3β-醇、7-脱氢豆甾醇(一种5，7-二烯)和豆甾醇。例如参阅U.S.专利No.5,589,619和这里的引用文献。
在本发明的方法中进行第尔斯-阿尔德反应和可以根据本发明的另一方法进行分离和纯化的含5，7-二烯的甾醇具有以下通式：
Figure A0180663400131
其中R3是H或R1CO-，其中R1是低级烷基或含5-7个碳原子的单环芳基，以及R4、R5和R6独立选自H、羟基和低级烷基。如果不是H，R3结构部分通常被认为是羟基保护基。典型的R3结构部分是H、CH3CO-和C6H5CO-。如果R4、R5和R6不是H或OH，它们优选是甲基或乙基，更通常是甲基。R7是1-10个碳原子的烃基，可以是直链或支化的和饱和或不饱和的。
以下给出了优选的5，7-二烯甾醇的结构式，包括7-脱氢表甾醇，7-脱氢燕麦甾醇，麦角甾醇，麦角甾烷-5，7，22，24-四烯醇，豆甾烷-5，7，24(28)-三烯-3β-醇，豆甾烷-5，7-二烯-3β-醇，7-脱氢谷甾醇，胆甾-5，7，24-三烯-3β-醇和7-脱氢胆甾醇。7-脱氢表甾醇
Figure A0180663400141
7-脱氢燕麦甾醇
Figure A0180663400142
麦角甾醇麦角甾烷-5，7，22，24-四烯醇
Figure A0180663400144
豆甾烷-5，7，24(28)-三烯-3β-醇
Figure A0180663400151
豆甾烷-5，7-二烯-3β-醇
Figure A0180663400152
7-脱氢谷甾醇
Figure A0180663400153
胆甾-5，7，24-三烯-3β-醇7-脱氢胆甾醇
Figure A0180663400161
本发明的方法特别适用于从可以由突变酵母获得的甾醇的混合物中分离和纯化胆甾-5，7，24-三烯-3β-醇。除了三烯以外，突变酵母萃取物中的甾醇混合物一般还含有酵母代谢产物角鲨烯，羊毛甾醇，4，4-二甲基酵母甾醇等。在酵母萃取溶液中存在的其它二烯，例如具有5，7-二烯的其它甾醇还可以与亲二烯体反应。
还设想，在待从中分离出特定含5，7-二烯的甾醇的组合物中存在的其它甾醇化合物含有两个或多个位置的烯属不饱和，例如在8-10碳原子的侧链R7中以及在A或B甾族环中。那些二烯化合物一般含有非共轭的烯属不饱和，而在所设想的含5，7-二烯的甾醇中5，7-双键是共轭的。所设想的含5，7-二烯的甾醇据说还可以具有α，β-烯属不饱和。
在本发明的一个实施方案中，甾醇的混合物在至少催化量的外源添加的不饱和C12-C24羧酸的存在下与具有结构式X-R＝R-Y的亲二烯体反应，其中R基团均是N或均是C-Q，其中Q基是H或一起形成第三键。因此，该实施方案中的亲二烯体具有结构式X-N＝N-Y，X-(CQ)＝(CQ)-Y，或X-C＝C-Y。取代基X和Y是独立选自-COOH、-CHO、-NO2、-CN、-COOR8和-COR8中的吸电子基团，其中R8是低级烷基，或X和Y可以连在一起形成-(CO)-Z-(CO)-桥基。在后一情况中，即当X和Y连在一起时，“Z”连接基是低级亚烷基，低级亚烯基，具有至多4个环取代基的含5-7个碳原子的单环亚芳基，-S-，或-NR2-，其中R2是低级烷基、H或具有至多5个环取代基的含5-7个碳原子的单环芳基。环取代基选自-(CH2)n-NH2，-(CH2)n-COOH，-NO2，卤素和低级烷基，其中n是0-6的整数，包含端值。亲二烯体与含5，7-二烯的甾醇的这类反应在这里有时被称为反应类型(1)。
在上述组中的亲二烯体可以商购，或可以方便地使用合成有机化学领域中的那些熟练人员已知的起始原料和技术来合成。这里使用的特定亲二烯体的实例包括以下化合物：
Figure A0180663400171
这些亲二烯体可以从许多来源商购，例如Aldrich Chemical Company(威斯康星州密尔沃基市)。如本领域技术人员所清楚的那样，这些亲二烯体还可以使用普通技术来合成。例如参阅S.W.Moje和P.Beak，J.Org.Chem.，39(20)：2951(1974)，以及K.Rufenacht，Helv.Chim.Acta，51：518(1968)。
在另一实施方案中，使用亲二烯体前体，其被适宜的氧化剂就地转化为亲二烯体。这里，含有含5，7-二烯的甾醇的甾醇混合物在至少催化量的C12-C24羧酸的存在下与亲二烯体前体和能将该前体氧化为活性亲二烯体的氧化剂同时反应。使用下面所述的亲二烯体前体和氧化剂与含有含5，7-二烯的甾醇的混合物的反应在这里有时被称为反应类型(2)。
亲二烯体前体具有结构式X-NH-NH-Y，其中X和Y是独立选自-COOH、-CHO、-NO2、-CN、-COOR8和-COR8中的吸电子基团，其中R8是低级烷基，或X和Y可以连在一起形成-(CO)-Z-(CO)-桥基。在其中X和Y连在一起形成-(CO)-Z-(CO)-桥基的示例性亲二烯体前体中，“Z”连接基是低级亚烷基，低级亚烯基，具有至多4个环取代基的含5-7个碳原子的单环亚芳基，-S-，或-NR2-，其中R2是H、低级烷基或具有至多5个环取代基的含5-7个碳原子的单环芳基。环取代基选自低级烷基、卤素、-NO2、-(CH2)n-NH2和-(CH2)n-COOH，其中n是0-6的整数，包含端值。
在该实施方案中，优选Z是被属于-(CH2)n-NH2或-(CH2)n-COOH的至多2个取代基取代的含5-7个碳原子的单环亚芳基，其中n是0-6的整数，包含端值。上述组内的亲二烯体前体可以商购，或者可以方便地使用合成有机化学领域中的那些熟练人员已知的起始原料和技术来合成(例如参阅H.D.K.Drew和H.H.Hatt，J.Chem.Soc.16(1937))。可在这里使用的特定亲二烯体前体的实例(这些化合物可以商购或可以容易地合成)包括以下化合物：
Figure A0180663400181
和
Figure A0180663400182
在本发明所设计的含5，7-二烯的甾醇的生产方法中，一种或多种不饱和C12-C24羧酸如亚麻酸、亚油酸和油酸外源添加到第尔斯-阿尔德反应溶液中。工业级油酸是便宜的，商品级亚油酸和亚麻酸中存在的杂质在根据本发明的反应中也是活性成分。工业级油酸在本发明的方法中是最优选的不饱和C12-C24羧酸。
痕量例如反应溶液的大约0.02重量％的不饱和酸是有用的。然而，它的有用性不会因它以更大的量存在而下降。优选，使用较低的量，大约0.05-5重量％，最优选大约0.1-0.5重量％。
不饱和酸以变化的量存在于来自酵母发酵的甾醇萃取物中。一般，变化是细胞萃取方法的结果。这种萃取常常除去了正常存在于细胞溶解产物中的大多数不饱和酸。
添加酸以降低苛性皂化/萃取溶液的pH，这可以改变当质子化时可溶于有机相的外源性不饱和酸与在有机相中溶解性低并在萃取的水相中溶解度较高的外源性不饱和酸的离子化形式的相对量。有机相是甾醇萃取物。pH值和用于洗涤有机相的水的温度都会影响保留在甾醇萃取物中的外源性不饱和酸的量。因此，存在于第尔斯-阿尔德反应中的外源性不饱和酸的量可能低于0.02重量％，导致了第尔斯-阿尔德加成物的收率降低。
从实践的观点来看，由于几个原因，降低萃取之前或期间的皂化反应的pH是不妥当的。第一是安全性。浓酸例如硫酸添加到苛性溶液是放热反应，导致过热点以及苛性物质的飞溅和喷洒，还可以导致与反应器有关的结构问题。第二个理由是炭化或黑色物质在溶液中的形成。第三个理由是溶液的凝胶化和皂的形成。后两点导致了在处理和从溶液中成功分离5，7-二烯方面的问题。总之，最佳的做法是在萃取之前或期间在皂化反应中不添加酸。
皂化和从酵母中萃取甾醇可以使用各种各样的溶剂进行，本领域的技术人员知道这些溶剂。目前的技术状况是使用己烷或庚烷、优选庚烷来萃取已经皂化的含5，7-二烯的甾醇，以制备甾醇萃取物。
在根据本发明的方法中，外源性不饱和C12-C24羧酸的添加使不饱和酸在第尔斯-阿尔德反应中存在的量达到最少。由外源提供的不饱和酸改进可得到的含5，7-二烯的甾醇的第尔斯-阿尔德反应因此有助于确保获得第尔斯-阿尔德加成物的高收率，并确保低收率不是因为去除“太多”外源性不饱和酸造成的。
以下举例说明可在这里使用的示例性不饱和C12-C24羧酸。C18不饱和脂肪酸的使用是优选的，工业级油酸是特别优选的。
亚麻酸亚油酸
Figure A0180663400202
油酸
Figure A0180663400203
棕榈油酸芥酸
Figure A0180663400205
肉豆蔻脑酸
Figure A0180663400206
不在短语“不饱和C12-C24羧酸”范围内的示例性化合物包括以下所示的油醇，即不饱和醇，和硬脂酸，即C18饱和脂肪酸。油醇
                        硬脂酸
                    CH3(CH2)16COOH
除了会干扰第尔斯-阿尔德加成物形成或以一些其它方式有害地与甾醇混合物中的任何甾醇相互作用的氧化剂以外，可以使用能将亲二烯体前体氧化为活性亲二烯体的任何氧化剂。示例性氧化剂包括次氯酸钠，过氧一硫酸钾，四乙酸铅，二乙酸亚碘酰苯，N-溴丁二酰亚胺，和次氯酸叔丁基酯。优选使用含水次氯酸钠。
上述反应的每一种，即甾醇混合物与具有结构X-R＝R-Y的亲二烯体的反应(反应1)，或与由结构式X-NH-NH-Y的亲二烯体前体和氧化剂就地形成的亲二烯体的反应(反应2)导致了第尔斯-阿尔德加成物的形成。这些反应用以下路线来说明：
反应1
Figure A0180663400212
反应2
Figure A0180663400213
两种反应在惰性气氛中在非反应性溶剂中进行。极性有机溶剂，例如乙酸乙酯、丙酸甲酯和丁酸乙酯可用于使甾醇保持溶解。已知有许多极性有机溶剂，因此存在选择的问题，有几个因素需要考虑。可以使用卤化溶剂，如氯甲烷，但不太优选，因为在工业装置中存在安全和处理问题。低沸点溶剂因为容易被除去而是优选的。混合溶剂体系也可用于本发明的方法。例如，在设计的制备胆甾5，7，24-三烯-3-醇的半合成方法中，不完全去除用于从皂化反应制备甾醇萃取物的庚烷，使得用于第尔斯-阿尔德加成步骤的反应溶液中除了极性有机溶剂以外还含有庚烷。
在反应2中，优选的是逐渐将氧化剂加到甾族化合物和亲二烯体前体在选定溶剂中的溶液中。反应2在0℃到约25℃的温度，优选在室温下(约20℃)下进行。应该使反应2进行至少约15分钟，优选至少1小时。
在使用反应1或反应2制备第尔斯-阿尔德加成物之后，从反应混合物中脱除加成物并再生，以提供分离形式的含5，7-2烯的甾族化合物。从反应混合物中脱除加成物优选使用例如优先与第尔斯-阿尔德加成物结合的硅胶柱通过色谱法进行。
第尔斯-阿尔德加成物的化学和物理性能可以通过控制存在于亲二烯体上的取代基以及通过改变R3来改变。例如，可以通过使用含碱性取代基(例如-(CH2)n-NH2，其中n是0-6的整数，包含端值)的亲二烯体或类似物赋予第尔斯-阿尔德加成物以碱性性能。加成物然后成为碱性分子，可以使用酸萃取从甾醇混合物中分离出来。类似地，可以通过使用含酸取代基(例如-(CH2)n-COOH，其中n是0-6的整数，包含端值)的亲二烯体或类似物赋予第尔斯-阿尔德加成物以酸性性能。加成物然后成为酸性分子，可以使用碱萃取从甾醇混合物中分离出来。
还有，如以上提及的那样，在制备第尔斯-阿尔德加成物之后，存在于R3的结构部分可以转化为能赋予所希望的结晶和/或沉淀性能的官能团。例如，存在于3位上的羟基可以容易地转化为苯甲酸酯物质，它随后可以制备结晶度更高和更易从甾醇混合物中分离的加成物。
然后通过用还原剂如氢化铝锂(“LAH”)、氢化二异丁基铝(“DiBAL”)、Red-Al(双(2-甲氧基-乙氧基)铝氢化钠在甲苯中的溶液，可从Aldrich Chemical Company，Inc.，Milwaukee，Wis.获得)或类似物处理加成物来实现例如来自利用第尔斯-阿尔德加成反应的保护或纯化步骤中含5，7-二烯的甾族化合物的再生。氢化铝锂是特别优选的。反应最初在低温即10℃或10℃以下(再次可以用冰/水浴来获得)进行，随后，在至少大约30分钟后，加热到至少大约50℃，保持至少几分钟。然后例如通过水解以及用CeliteTM或类似物过滤除去过量的还原剂和它们的任何盐或衍生物。蒸发反应混合物，提供了含5，7-二烯的甾族化合物。
然后可以使用本领域普通技术人员容易得知的许多技术中的任何一种来纯化再生的含5，7-二烯的甾族化合物。例如，纯化可以通过重结晶，例如使用甲醇，乙醇或类似物，或使用沉淀或色谱技术来进行。
如在U.S.专利No.5,391,777(引用它的母专利U.S.专利申请序列号07/869,328，现在已放弃)中所述，在含5，7-二烯的甾族化合物是胆甾5，7，24-三烯-3β-醇的场合，分离的纯化物质可以用于制备胆甾-5，7-二烯-3β，25-二醇。胆甾-5，7-二烯-3β，25-二醇是生物学上重要的羟基化前维生素D3代谢产物，它可以通过阳光或其它成熟的光化学方法转化为25-羟基维生素D3。这种维生素D3衍生物可用于许多方面，例如局部药物制剂(用于治疗皮肤疾病或类似疾病)，口服维生素组合物，和作为牲畜原料添加剂。
在上述反应的变型中，可以在以第尔斯-阿尔德加成物的形式保护分子的同时，在含5，7-二烯的甾族化合物上的一个或多个部位进行化学转化。例如，Δ24双键可以转化为24-氨基-25-羟基物质，24，25-二羟基物质或类似物。还有，当化合物是加成物形式时，甾族化合物的“A”环可以被氧化。可以在第尔斯-阿尔德加成物上进行的化学转化的例子描述在前面提到的专利申请系列号07/869,328中。
实施例1酵母的制备
酵母菌株ATC1562用来制备在根据本发明的第尔斯-阿尔德反应中使用的胆甾-5，7，24-三烯-3β-醇含量高的组合物。酵母菌株ATC1562由菌株ATC1551衍生而来。在U.S.专利No.5,460,949中论述了双突变型酵母菌株ATC1551的构建，它的公开内容在这里作为参照引用。简单地说，菌株ATC0315rc(ATCC 74090，1991年9月16日保藏)用质粒pARC304S(ATCC40916，1990年11月9日)转化，以产生菌株ATC1551，这导致大量的甾醇蓄积，即使在培养基中具有有限的通气也是如此。ATC1551(meta，erg5，erg6，TRP1+，URA3+)酵母与MC5酵母(matα，ino-，ino-)杂交，形成酵母菌株LS1003-1B(meta，erg5，erg6，TRP1+，URA3+)。ATC1551单独与酵母菌株JGY230(metα，his3-1，erg5)杂交，以形成酵母菌株LS1001-3B。将菌株LS1003-1B和LS1001-3B杂交，以构建菌株ATC1562(meta/meta，erg5/erg5，erg6/erg6，TRP1+/TRP1+，URA3+/URA3-)或(meta/metα，erg5/erg5，TRP1/trp1，URA3/ura3)，它可用于制备胆甾-5，7，24-三烯-3β-醇含量高的酵母甾醇萃取物。
实施例2：在细胞来源的反应溶液中的第尔斯-阿尔德反应
本实施例说明了第尔斯-阿尔德萃取物的收率的变化范围。
甾醇批料6、9、10、11和12来自于实施例1中所述的双突变菌株ATC1562的发酵的产物皂化/萃取试验。
反应使用各甾醇批料的乙酸乙酯/庚烷溶液。将邻苯二甲酰肼和次氯酸盐加到搅拌溶液中，使得邻苯二甲酰肼与次氯酸钠与5，7-二烯(胆甾三烯醇)的比率是4∶2∶1，以形成第尔斯-阿尔德反应溶液。
批料6、9、11和12全部以大约90％收率获得了第尔斯-阿尔德加成物。来自批料10的第尔斯-阿尔德加成物的收率具有不确定性。批料10的初始实验室试验达到100％收率。然而，使用来自批料10的贮藏鼓的汲取样品的后来试验获得了25-41％的第尔斯-阿尔德加成物收率，胆甾三烯醇的转化不完全。
反应 初始三烯醇浓度(％)  第尔斯-阿尔德加成物收率(％)
批料6；试验267     3.95     91
批料9；试验268     3.43     88
批料10；试验271     2.60     100
批料10汲取样品；试验277     4.01     41*
批料10汲取样品；试验278     4.01     25
批料11；试验270     4.30     89
批料12；试验269     4.11     89
*三烯醇的不完全消耗
实施例3：使用酵母甾醇萃取物各级分的麦角甾醇的模型反应
进行用麦角甾醇作为甾醇萃取物中的5，7-二烯的模型化合物的研究，以分离和鉴别来自于erg5和erg6双突变型酵母发酵的甾醇萃取物中的组分，以便大规模生产能提高第尔斯-阿尔德加成物形成的胆甾-5，7，24-三烯-3-醇的第尔斯-阿尔德加成物。
在这些研究中使用实施例2中所述的试验工序。代替甾醇萃取物，这些研究的标准原料一般是19g的麦角甾醇(Aldrich；95％)在由大约50重量％乙酸乙酯和50重量％庚烷组成的溶剂中的2重量％溶液。
用上述麦角甾醇原料(对比实验)的第尔斯-阿尔德加成物的收率低于20％收率，一般低于5％收率，麦角甾醇的转化不完全。第尔斯-阿尔德加成物收率在试验232中是0％，其中有46％未反应的麦角甾醇。
A)添加来源于用典型甾醇萃取物形成第尔斯-阿尔德加成物的总反应产物，这表明各组分仍然存在，促进了与麦角甾醇的反应。
当来自反应G-8(用甾醇萃取物的典型试验)的大约6重量％产物溶液加到试验196中的原料中时，第尔斯-阿尔德加成物收率是68％。当将仅0.8重量％G-8产物溶液加到试验197中的原料时，收率下降到28％，具有30％未反应的麦角甾醇。
B)添加来自甾醇萃取物的第尔斯-阿尔德加成物的色谱纯化的“洗出固体”，表明它们含有能促进与麦角甾醇反应的组分。
在这些研究中，将甾醇萃取物的硅胶色谱级分加到使用麦角甾醇的模型第尔斯-阿尔德加成反应中。
从硅胶柱洗脱的柱洗脱物的合并级分在第尔斯-阿尔德加成物分馏之前用旋转蒸发器浓缩，剩余物质以0.4、0.7、1.5和3重量％加到用麦角甾醇的模型反应中。麦角甾醇第尔斯-阿尔德加成物收率以非线性方式分布在从60％到68％的范围内。
再次浓缩柱洗脱物的单独级分以除去溶剂，这些级分以3重量％加到如上所述的麦角甾醇模型第尔斯-阿尔德加成反应中，达到第尔斯-阿尔德加成物收率为0到大约65％麦角甾醇第尔斯-阿尔德加成物，其中大部分级分的收率为0。在第尔斯-阿尔德加成物收率为0的反应中，消耗了大约50-60％的麦角甾醇。几个级分具有62-65％的麦角甾醇第尔斯-阿尔德加成物收率，麦角甾醇的消耗率为100％。具有62-65％收率的麦角甾醇第尔斯-阿尔德加成物的几个级分是非常粘的，主要由脂肪酸和其它长链化合物组成。
该研究的结论是，脂肪酸或其它长链化合物是提高第尔斯-阿尔德加成反应收率的一些甾醇萃取物的候选组分。第尔斯-阿尔德加成物收率对于在少于0.4重量％阈值以上的活化化合物量是不敏感的。
实施例4：各种化合物对用麦角甾醇的模型反应的影响
将几种第尔斯-阿尔德活化候选化合物加到用麦角甾醇的第尔斯-阿尔德模型反应中。该实施例说明了不饱和有机酸是第尔斯-阿尔德加成反应活化化合物。
用各种外源提供的化合物进行麦角甾醇(19g规模)与上述可氧化的亲二烯体的模型第尔斯-阿尔德加成反应。研究的结果如下所示。
添加的TritonX-100(Rohm&Haas；聚乙二醇对异辛基苯基醚)、硬脂酸和油醇的反应基本上不能活化第尔斯-阿尔德反应。用Tween80(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)和Tween20(聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯)中度活化了第尔斯-阿尔德反应。纯亚麻酸、亚油酸和油酸和工业级油酸全部获得了麦角甾醇完全转化的第尔斯-阿尔德加成物。以下提供数据。
没有添加剂但反应温度为40-50℃的试验229获得了0.04％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为19％。
添加了0.57g的TritonX-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)的试验224获得了0％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为50％。
添加了0.57g硬脂酸的试验250获得了16％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为0％。
添加了0.58g油醇的试验257获得了0％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为54％。
添加了0.57g Tween80(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)的试验233获得了49％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为0％。
添加了0.57gTween20(聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯)的试验234获得了36％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为0％。
添加了0.57g亚油酸(Aldrich；99％)的试验249获得了62％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为0％。
添加了0.044g亚油酸(Aldrich；99％)的试验251获得了59％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为0％。亚油酸是总反应加料的大约0.2重量％。亚油酸与麦角甾醇的摩尔比是0.16∶1，表明活化不需要添加化学计量的不饱和酸。
添加了0.034g亚麻酸(Aldrich；99％)的试验252获得了53％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为0％。
添加了0.376g的油酸(Aldrich；99％)的试验254获得了63％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为0％。
添加了0.14g油酸(Aldrich；99％)的试验256获得了58％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为0％。
添加了0.14g工业级油酸(Aldrich；90％)的试验255获得了59％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇为0％。
添加了0.14g工业级油酸(Aldrich；90％)、但搅拌速度比试验255快的试验273获得了收率65％的第尔斯-阿尔德加成物，未反应的麦角甾醇为0％。在本试验和所有后续试验中的搅拌器设置均为“4”，除非另有说明。
添加了0.14g工业级油酸(Aldrich；90％)和用声处理代替搅拌的试验274获得了46％的第尔斯-阿尔德加成物收率，未反应的麦角甾醇是0％。邻苯二甲酰肼开始是微细悬浮液，但在漂白剂添加过程中在烧瓶的底部可见到凝块。
为了从本实施例中总结结论，在没有添加剂活化第尔斯-阿尔德反应的情况下，基本没有从麦角甾醇与反应性亲二烯体形成第尔斯-阿尔德加成物。表面活性剂TritonX-100(Rohm&Haas；聚乙二醇对异丙基苯基醚)也不能活化第尔斯-阿尔德反应。饱和硬脂酸和不饱和醇油醇也不能活化反应。亚油酸、亚麻酸和油酸都改进了第尔斯-阿尔德反应，包括工业级油酸。
当不饱和酸的浓度从0.2重量％增加到2重量％时，用不饱和酸的活化有轻微改进，从这显然可以看出，不需要化学计算量，而是更符合催化量。快速搅拌产生了轻微的改进，这可能是因为与不饱和酸的接触得到了改进，然而声处理相对于机械混合抑制了活化。
应该注意，60-65％的模型反应中最好的第尔斯-阿尔德加成物收率仍然低于当油酸存在时的用麦角甾醇的典型第尔斯-阿尔德加成物收率，其中当油酸存在时，用甾醇的细胞萃取物批料的收率大于90％。然而，这些60-65％收率与实施例3中获得的那些一致，其中酵母甾醇萃取物级分用于活化用麦角甾醇的模型反应。
实施例5：不同量的油酸对用麦角甾醇的第尔斯-阿尔德反应的效果
在装有磁力搅拌棒的50mL Erlenmeyer烧瓶中，将不同量的工业级油酸(90％纯)加到麦角甾醇的乙酸乙酯(19g；ACS试剂级，99.5％纯)溶液中。在环境温度下按照4∶2∶1的邻苯二甲酰肼与次氯酸钠与麦角甾醇的摩尔比加入邻苯二甲酰肼(2，3-二氢-1，4-(2，3-二氮杂萘二酮)；170.17g/mol；购自Aldrich，Milwaukee，Wisconsin的99％纯邻苯二甲酰肼)和次氯酸钠(74.44g/mol，在15-16％NaOCl水溶液中)。
工业级油酸的重量％ 麦角甾醇第尔斯-阿尔德加成物收率
    0.1     60％
    0.05     59％
    0.035     55％
    0.0275     56％
    0.020     0.03％
本实施例说明了明显改进第尔斯-阿尔德加成反应所需的不饱和脂肪酸的最低有效量高于0.02重量％且小于0.027重量％。在更高量的不饱和脂肪酸下，收率的提高平稳，在该重量百分数范围内没有发现下降。
实施例6：外源性脂肪酸对酵母的第尔斯-阿尔德加成物收率的影响
使用由酵母细胞萃取物固体获得的甾醇批料进行实施例试验204-223。
用批料27甾醇的试验210和试验214各自获得了91％的第尔斯-阿尔德加成物收率。来样批料27具有以下性能：3.50％三烯醇；31.9mg/mL总脂肪酸含量。
用批料28甾醇的试验213获得了78％的第尔斯-阿尔德收率。来样批料28具有以下性能：3.56％三烯醇；和6mg/ml总脂肪酸含量。
用批料29甾醇的试验219获得了75％的第尔斯-阿尔德加成物收率。来样批料29具有以下性能：3.85％三烯醇；和4mg/ml的总脂肪酸含量。
用批料1甾醇的试验218获得了90％的第尔斯-阿尔德加成物收率。来样批料1具有以下性能：3.67％三烯醇和80mg/mL总脂肪酸含量。
用批料2甾醇的试验220和试验221获得了90％的第尔斯-阿尔德加成物收率。来样批料2具有以下性能：4.79％三烯醇和8.6mg/mL总脂肪酸含量。
用批料3甾醇的试验217获得了80％的第尔斯-阿尔德加成物收率。来样批料3具有以下性能：4.02％三烯醇和5.0mg/mL总脂肪酸含量。
以下是前面评价的批料22-26的脂肪酸含量分析：批料22：22.6mg/mL。批料23：0.5mg/mL。批料24：34.4mg/mL。批料25：0.9mg/mL。批料26：22.3mg/mL。
根据现有技术中已知的方法进行在第尔斯-阿尔德反应之前脱除的批料或批料样品的脂肪酸分析。
第尔斯-阿尔德收率随脂肪酸含量的增加而增加。这些结果的保守性解释是，低脂肪酸含量对于高第尔斯-阿尔德加成物收率不是必要的。
实施例7：添加油酸与不添加油酸的第尔斯-阿尔德胆甾三烯醇加成物收率的直接对比
以上的实施例报道了添加外源性不饱和酸对由麦角甾醇形成第尔斯-阿尔德加成物的影响。在本实施例中，监测了添加外源性不饱和酸对由来自双突变体的酵母甾醇萃取物的胆甾-5，7，24-三烯-3β-醇形成第尔斯-阿尔德加成物的影响。
如在实施例2中所述，当没有外源性不饱和酸时，批料10汲取样品获得了25-41％的第尔斯-阿尔德加成物收率，其中三烯醇的转化不完全。工业级油酸的添加使第尔斯-阿尔德加成物收率超过82％，其中三烯醇的转化完全。
添加1重量％工业级油酸的试验279从批料10汲取样品获得了83％第尔斯-阿尔德加成物收率。
添加了大约0.2重量％工业级油酸的试验282从批料10汲取样品获得了82％第尔斯-阿尔德加成物收率。
类似地，所收到的来自储备批料3、6、7、8、9和11的汲取样品获得了21-56％的胆甾三烯醇第尔斯-阿尔德加成物，其中试验286-296中的胆甾三烯醇的转化不完全。在批料3、6、7、8、9和11中，外源性C16和C18不饱和脂肪酸在那些接收样品中的浓度是38-85ppm(0.0038-0.0085重量％)。
在试验297中，使用具有0.2重量％外源性工业级油酸的上述批料7汲取样品获得了74％的第尔斯-阿尔德加成物收率。
在试验300中，使用具有0.2重量％外源性工业级油酸的上述批料9汲取样品获得了68％的第尔斯-阿尔德加成物收率。
添加油酸消除了由洗涤工序中的变化所导致的第尔斯-阿尔德加成物形成对甾醇萃取物中的不饱和酸含量的敏感性。外源性添加消除了在酵母细胞固体萃取和洗涤过程中控制特定不饱和酸浓度的需要。直接添加油酸消除了由于在去除“太多”的正常存在的不饱和酸的上游处理中的变化所导致的低第尔斯-阿尔德加成物收率的可能性。例如，将大约0.2重量％油酸添加到典型试验中。优选，使用所需油酸的最少量，以使对后续洗涤和色谱法步骤的任何可能的不利影响减至最小。
从前面的叙述可以发现，在不偏离本发明的真实精神和范围的情况下可以做出许多修改和变化。应当理解的是，本发明不局限于所提供的具体实施例，或者应该可以推断出来。本公开物的意图是要覆盖落在权利要求书范围内的所附权利要求书的变化。

Claims (24)

1、一种第尔斯-阿尔德反应方法，包括以下步骤：
(a)将5，7-二烯甾醇、亲二烯体和催化量的外源性烯属不饱和C12-C24脂肪族羧酸混合，其中5，7-二烯甾醇具有以下结构式：
Figure A0180663400021
其中R3选自H和R1CO-，其中R1是含5-7个碳原子的单环芳基或低级烷基；R4、R5和R6独立地选自H、羟基和低级烷基；和R7是含1-10个碳原子的烃基；
(b)使混合物保持足以形成5，7-二烯甾醇的第尔斯-阿尔德加成物的时间。
2、根据权利要求1的方法，其中烯属不饱和C12-C24羧酸是亚麻酸、亚油酸、油酸或它们的混合物。
3、根据权利要求2的方法，其中烯属不饱和C12-C24羧酸是油酸。
4、根据权利要求1的方法，其中5，7-二烯甾族化合物是胆甾-5，7，24-三烯-3-醇。
5、根据权利要求1的方法，其中亲二烯体具有结构式X-R＝R-Y，其中R都是N或都是C-Q，其中Q是H或一起形成第三键，和其中X和Y选自本身独立选自-COOH、-CHO、-NO2、-CN、-COOR8和-COR8中的吸电子基团，其中R8是低级烷基，或其中X和Y连在一起形成-(CO)-Z-(CO)-桥基，其中Z是低级亚烷基，具有至多4个环取代基的含5-7个碳原子的单环亚芳基，或-NR2，其中R2是H，含5-7个碳原子或低级烷基和至多5个环取代基的单环芳基，其中环取代基选自-(CH2)n、-NH2、-COOH、-NO2、卤素和低级烷基，其中n是0-6的整数，包含端值。
6、根据权利要求1的方法，其中亲二烯体从(i)可氧化的亲二烯体前体和(ii)能有效氧化该前体以形成亲二烯体的氧化剂中就地产生，其中亲二烯体前体具有结构式X-NH-NH-Y，其中X和Y选自本身独立选自-COOH、-CHO、-NO2、-CN、-COOR8和-COR8中的吸电子基团，其中R8是低级烷基，或其中X和Y连在一起形成-(CO)-Z-(CO)-桥基，其中Z是具有至多4个环取代基的含5-7个碳原子的单环亚芳基，低级亚烷基，或-NR2，其中R2是低级烷基、H或含5-7个碳原子的单环芳基和至多5个环取代基，其中环取代基选自-(CH2)n-NH2、-(CH2)n-COOH、-NO2、卤素和低级烷基，其中n是0-6的整数，包含端值。
7、根据权利要求6的混合物，其中可氧化的亲二烯体是邻苯二甲酰肼。
8、根据权利要求6的混合物，其中氧化剂是次氯酸盐。
9、一种第尔斯-阿尔德反应混合物，包含以下组分：
(a)具有以下结构式的5，7-二烯甾醇：
其中R3选自H和R1CO-，其中R1是含5-7个碳原子的单环芳基或低级烷基；R4、R5和R6独立地选自H、羟基和低级烷基；和R7是含1-10个碳原子的烃基；
(b)亲二烯体；和
(c)催化量的外源性烯属不饱和C12-C24脂肪族羧酸。
10、根据权利要求9的混合物，其中烯属不饱和C12-C24脂肪酸是亚麻酸、亚油酸、油酸或它们的混合物。
11、根据权利要求9的混合物，其中烯属不饱和C12-C24脂肪酸是油酸。
12、根据权利要求9的混合物，其中5，7-二烯甾族化合物是胆甾-5，7，24-三烯-3-醇。
13、根据权利要求9的方法，其中亲二烯体具有结构式X-R＝R-Y，其中R均是N或均是C-Q，其中Q是H或一起形成第三键，和其中X和Y选自本身独立选自-COOH、-CHO、-NO2、-CN、-COOR8和-COR8中的吸电子基团，其中R8是低级烷基，或其中X和Y连在一起形成-(CO)-Z-(CO)-桥基，其中Z是低级亚烷基，具有至多4个环取代基的含5-7个碳原子的单环亚芳基，或-NR2，其中R2是H、含5-7个碳原子的单环芳基或低级烷基和至多5个环取代基，其中环取代基选自-(CH2)n、-NH2、-COOH、-NO2、卤素和低级烷基，其中n是0-6的整数，包含端值。
14、根据权利要求9的方法，其中亲二烯体从(i)可氧化的亲二烯体前体和(ii)能有效氧化该前体以形成亲二烯体的氧化剂中就地产生，其中亲二烯体前体具有结构式X-NH-NH-Y，其中X和Y选自本身独立选自-COOH、-CHO、-NO2、-CN、-COOR8和-COR8中的吸电子基团，其中R8是低级烷基，或其中X和Y连在一起形成-(CO)-Z-(CO)-桥基，其中Z是具有至多4个环取代基的含5-7个碳原子的单环亚芳基，低级亚烷基，或-NR2，其中R2是低级烷基、H或含5-7个碳原子和至多5个环取代基的单环芳基，其中环取代基选自-(CH2)n-NH2、-(CH2)n-COOH、-NO2、卤素和低级烷基，其中n是0-6的整数，包含端值。
15、根据权利要求14的混合物，其中可氧化的亲二烯体是邻苯二甲酰肼。
16、根据权利要求14的混合物，其中氧化剂是次氯酸盐。
17、从甾醇的混合物中分离5，7-二烯甾醇的改进方法，包括以下步骤：
(a)使包含5，7-二烯甾醇的甾醇混合物与亲二烯体反应，以便将5，7-二烯甾醇转化为第尔斯-阿尔德加成物，
其中5，7-二烯甾醇具有以下结构式：
Figure A0180663400051
其中R3选自H和R1CO-，其中R1是含5-7个碳原子的单环芳基或低级烷基；R4、R5和R6独立地选自H、羟基和低级烷基；和R7是含1-10个碳原子的烃基；和
(b)从混合物中分离第尔斯-阿尔德加成物或改性第尔斯-阿尔德加成物；
所述改进包括将至少催化量的烯属不饱和C12-C24脂肪族羧酸加到所述混合物中。
18、根据权利要求17的混合物，其中烯属不饱和C12-C24脂肪酸是亚麻酸、亚油酸、油酸或它们的混合物。
19、根据权利要求17的混合物，其中烯属不饱和C12-C24脂肪酸是油酸。
20、根据权利要求17的混合物，其中5，7-二烯甾族化合物是胆甾-5，7，24-三烯-3-醇。
21、根据权利要求17的方法，其中亲二烯体具有结构式X-R＝R-Y，其中R均是N或均是C-Q，其中Q是H或一起形成第三键，和其中X和Y选自本身独立选自-COOH、-CHO、-NO2、-CN、-COOR8和-COR8中的吸电子基团，其中R8是低级烷基，或其中X和Y连在一起形成-(CO)-Z-(CO)-桥基，其中Z是低级亚烷基，具有至多4个环取代基的含5-7个碳原子的单环亚芳基，或-NR2，其中R2是H、含5-7个碳原子的单环芳基或低级烷基和至多5个环取代基，其中环取代基选自-(CH2)n、-NH2、-COOH、-NO2、卤素和低级烷基，其中n是0-6的整数，包含端值。
22、根据权利要求17的方法，其中亲二烯体从(i)可氧化的亲二烯体前体和(ii)能有效氧化该前体以形成亲二烯体的氧化剂中就地产生，其中亲二烯体前体具有结构式X-NH-NH-Y，其中X和Y选自本身独立选自-COOH、-CHO、-NO2、-CN、-COOR8和-COR8中的吸电子基团，其中R8是低级烷基，或其中X和Y连在一起形成-(CO)-Z-(CO)-桥基，其中Z是具有至多4个环取代基的含5-7个碳原子的单环亚芳基，低级亚烷基，或-NR2，其中R2是低级烷基、H或含5-7个碳原子和至多5个环取代基的单环芳基，其中环取代基选自-(CH2)n-NH2、-(CH2)n-COOH、-NO2、卤素和低级烷基，其中n是0-6的整数，包含端值。
23、根据权利要求21的混合物，其中可氧化的亲二烯体是邻苯二甲酰肼。
24、根据权利要求21的混合物，其中氧化剂是次氯酸盐。
CNB018066348A 2000-03-17 2001-03-16 用不饱和脂肪酸催化剂生产甾醇5,7－二烯的第尔斯－阿尔德加成物的方法 Expired - Fee Related CN1192034C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19036500P 2000-03-17 2000-03-17
US60/190,365 2000-03-17
US09/809,673 2001-03-15
US09/809,673 US6399796B2 (en) 2000-03-17 2001-03-15 Activation of a Diels-Alder reaction of a sterol 5,7-diene

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1418221A true CN1418221A (zh) 2003-05-14
CN1192034C CN1192034C (zh) 2005-03-09

Family

ID=26886033

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB018066348A Expired - Fee Related CN1192034C (zh) 2000-03-17 2001-03-16 用不饱和脂肪酸催化剂生产甾醇5,7－二烯的第尔斯－阿尔德加成物的方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US6399796B2 (zh)
EP (1) EP1268511B1 (zh)
JP (1) JP3816004B2 (zh)
KR (1) KR100802874B1 (zh)
CN (1) CN1192034C (zh)
AT (1) ATE397009T1 (zh)
AU (1) AU2001245829A1 (zh)
DE (1) DE60134218D1 (zh)
WO (1) WO2001070760A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUP0103188A2 (hu) * 1998-08-07 2001-12-28 Emisphere Technologies, Inc. Vegyületek és készítmények hatóanyagok célbajuttatására
US7794965B2 (en) 2002-03-13 2010-09-14 Signum Biosciences, Inc. Method of identifying modulators of PP2A methylase
US20040077703A1 (en) * 2002-10-02 2004-04-22 Soll Mark D. Nodulisporic acid derivative spot-on formulations for combating parasites
US20050037946A1 (en) * 2003-01-13 2005-02-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cardiovascular disease using 1722, 10280, 59917, 85553, 10653, 9235, 21668, 17794, 2210, 6169, 10102, 21061, 17662, 1468, 12282, 6350, 9035, 1820, 23652, 7301, 8925, 8701, 3533, 9462, 9123, 12788, 17729, 65552, 1261, 21476, 33770, 9380, 2569654, 33556, 53656, 44143, 32612, 10671, 261, 44570, 41922, 2552, 2417, 19319, 43969, 8921, 8993, 955, 32345, 966, 1920, 17318, 1510, 14180, 26005, 554, 16408, 42028, 112091, 13886, 13942, 1673, 54946 or 2419
EP1843734A4 (en) 2005-02-03 2008-09-10 Signum Biosciences Inc COMPOSITIONS AND METHOD FOR INTENSIFYING COGNITIVE FUNCTIONS
US7923041B2 (en) 2005-02-03 2011-04-12 Signum Biosciences, Inc. Compositions and methods for enhancing cognitive function
US7649121B2 (en) * 2007-04-18 2010-01-19 International Isotopes Inc. Processes for producing halogenated hydrocarbon compounds using inorganic fluoride
EP2237774B1 (en) 2007-12-21 2016-06-22 Merial Limited THE USE OF 6-HALOGENO-(1,2,4)-TRIAZOLO-(1,5-a)-PYRIMIDINE COMPOUNDS FOR COMBATING PESTS IN AND ON ANIMALS
ES2545738T3 (es) 2009-07-30 2015-09-15 Merial, Inc. Compuestos insecticidas a base de 4-amino-tieno[2,3-d]-pirimidina y procedimientos para su uso
CN103619818A (zh) 2011-06-20 2014-03-05 纳幕尔杜邦公司 用于治疗蠕虫感染的杂环化合物
AU2012346433A1 (en) 2011-11-28 2014-05-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company N- (4 -quinolinylmethyl) sulfonamide derivatives and their use as anthelmintics
WO2014099837A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sulfonamide anthelmintics

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4503195A (en) 1981-11-02 1985-03-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Di- and triphenylated cation radical polymers and their use as Diels-Alder catalysts
US4552928A (en) 1981-11-02 1985-11-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Di- and triphenylated cation radical polymers and their use as Diels-Alder catalysts
US4384153A (en) 1982-03-18 1983-05-17 Mobil Oil Corporation Diels-Alder Cyclization over low acidity large-pore zeolites
US4413154A (en) 1982-09-27 1983-11-01 Mobil Oil Corporation Diels-Alder cyclodimerization over a carbon molecular sieve catalyst
US4677072A (en) * 1985-02-28 1987-06-30 Westvaco Corporation Rhodotorula having desaturase enzymes
JPH0276871A (ja) 1987-07-10 1990-03-16 New Japan Chem Co Ltd メチルテトラヒドロ無水フタル酸の製造方法
WO1991005804A1 (en) 1989-10-17 1991-05-02 Scripps Clinic And Research Foundation Catalysis of diels-alder reactions, methods and catalysts therefor
US5460949A (en) 1990-11-15 1995-10-24 Amoco Corporation Method and composition for increasing the accumulation of squalene and specific sterols in yeast
WO1993021205A1 (en) 1992-04-15 1993-10-28 Sri International Isolation of steroids containing a 5,7-diene functionality from a sterol mixture

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003528110A (ja) 2003-09-24
ATE397009T1 (de) 2008-06-15
US20010047093A1 (en) 2001-11-29
KR20030028456A (ko) 2003-04-08
EP1268511A1 (en) 2003-01-02
KR100802874B1 (ko) 2008-02-13
WO2001070760A1 (en) 2001-09-27
EP1268511B1 (en) 2008-05-28
DE60134218D1 (de) 2008-07-10
CN1192034C (zh) 2005-03-09
JP3816004B2 (ja) 2006-08-30
AU2001245829A1 (en) 2001-10-03
US6399796B2 (en) 2002-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1192034C (zh) 用不饱和脂肪酸催化剂生产甾醇5,7－二烯的第尔斯－阿尔德加成物的方法
CN1458918A (zh) 一种制备脂肪族酯的方法及其在制药、化妆品或食品工业中的应用
JP3746292B2 (ja) トコフェロールおよびステロールの回収
CN101065396A (zh) 屈螺酮的制备方法
EP1173464B1 (en) Process for preparing a phytosterol composition
CN1073557C (zh) 维生素d酰胺衍生物
CN1948283A (zh) 维生素d衍生物的制备方法
US4022768A (en) Process for preparation of 1α,25-dihydroxycholecalciferol
EP0574317B1 (fr) Nouveau procédé de préparation de composés stéroides 20-céto 21alpha-hydroxy et intermédiaires
CN1070196A (zh) 制备氢化可的松的新方法和新中间体
US20130023681A1 (en) Stabilized doxercalciferol and process for manufacturing the same
US5391777A (en) Isolation of steroids containing a 5,7-diene functionality from a sterol mixture
Zhang et al. Stereoselective construction of a steroid 5α, 7α-oxymethylene derivative and its use in the synthesis of eplerenone
EP0087359A2 (fr) Nouveau réactif de nitrométhylation, son application à la préparation de composés nitrométhylénés et de certains de leurs dérivés et les composés nouveaux obtenus
CN1036580C (zh) 生产n-烷基乙酰胺类化合物的方法
CA1181389A (fr) Agents de deshydrogenation a base de derives organiques du selenium et leur utilisation a la deshydrogenation en 1,4 de steroides
US6673951B1 (en) Process for catalytically hydrogenating phytosterols
CN1031508C (zh) 合成表油菜内酯及其类似物的方法
CN1152045C (zh) 制备4,4-二甲基-3β-羟基孕-8,14-二烯-21-羧酸酯的方法及中间体
WO1993021204A1 (en) Method for preparing cholesta-5,7-diene-3-beta,25-diol and analogs thereof
EP1631580A2 (fr) Procedes de preparation de derives de la dhea
CN1078237A (zh) 甾体青蒿素
Fernández et al. OCT analogues part 2. Acetylene in the synthesis of useful building blocks for analogues of OCT modified at C-20, C-21, and the D-ring
CN1084856A (zh) 氨基胆固醇的制法
CN1072182A (zh) 新的制备孕烷的20-氧代-17α，21-二羟基化衍生物的方法和新中间体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: DSMIP ASSET CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: ROCHE VITAMINE S.A.

Effective date: 20040827

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20040827

Address after: Holland Heerlen

Applicant after: DSMIP N. V.

Address before: Basel

Applicant before: Roche Vitamin S.A.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20050309

Termination date: 20160316