CN1414107A - 一种基因结构和功能研究相关的序列拆解技术 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通用的拆解目标核酸序列的方法，即目标核酸序列中插入一段附加序列，该附加序列除含有必要的进行基因工程意义上的操作所需要的结构外，另外一个重要的特点，就是它的存在，不干扰目标核酸序列在转录或者转译水平上的功能，从而使得对目标序列的遗传工程上的操作变得更为灵活。

Description

一种基因结构和功能研究相关的序列拆解技术

发明领域

本发明提供的，是一种通用的拆解目标核酸序列的方法，具体地说，就是在目标核酸序列中插入一段附加序列，该附加序列除含有必要的进行基因工程意义上的操作所需要的结构外，另外一个重要的特点，就是它的存在，不干扰目标核酸序列在转录或者转译水平上的功能，从而使得对目标序列的遗传工程上的操作变得更为灵活。该方法在后基因组时代，与基因结构和功能相关的多种类型的遗传载体的构建方面，有极为重要的应用。

发明背景

近十几年来，人类在基因测序工作方面取得的进展，为生命科学家提供了更多的关于不同物种的基因组的一级序列的资料，但同时也向生命科学家提出了新的挑战：解读基因组一级序列中所蕴涵基因的功能，以及不同基因在正常和异常的生理状态的作用。为适应这一需要而发展出来的多种研究手段中，都涉及对原有的基因在遗传工程意义上操作，因此，如果能在不破坏基因序列固有编码功能的情况下，增加基因在实验水平上的可操作性，就会给关于基因结构和基因功能的研究带来便利。

增加基因的遗传可操作性，一般包括以下几个方面的意义：一是增加特殊的酶作用位点；二是增加特殊的功能区；三是将相应生物分子的编码基因在功能及结构的意义上拆解。

所以，当待研究的目标基因序列中，符合需要的位点不存在时，就需要通过改变其序列的办法来获得，但一般情况下，大规模的改变基因的编码序列，常常又要导致其功能的改变，例如，编码蛋白的基因，当以cDNA的形式出现时，是一个连续的编码氨基酸的开放阅读框架，由于基因一级DNA序列对它所编码的蛋白功能的决定性关系，因此，留给研究人员的、在遗传工程的水平上修饰该基因但又保持其固有功能的空间非常有限；因此，为达到有关的实验目的，研究人员通常采取以下两个方面的手段：一是利用氨基酸编码序列的简并性，制造所需要的突变；二是在对相关基因的结构和功能的详细研究的基础上，引入较大范围的突变，但尽量把突变对功能的影响，控制在不干扰其实验目的的程度内；虽然这两种方法得到较广的应用，但其局限性是非常明显的。

在人类基因组测序工作取得突破性进展以后，对基因编码产物功能的研究，成了生命科学家面临的全新挑战。在众多与基因功能研究相关的技术手段中，其极为关键的一个步骤，就是需要将一个完整的生物分子的编码基因，如编码蛋白的cDNA，拆解成两个部分，并分别置于不同的表达载体中，然后再通过它们在实验过程中的对接和重新表达，为相关的实验提供观测的窗口。目前所用的拆解基因编码序列的办法，一般都是根据不同的生物分子结构和功能上特点设计的，费时费力，也不具有普遍性。

以生命的基因型和表型研究中极为重要的基因删除实验为例。基因删除实验，常常需要将一个用于标记作用的基因在结构和功能的意义上被拆解成两个部份，并克隆到不同的载体中去，以便在实验的后续阶段，通过这两个部份的编码框架的重新对接以及原来的基因功能的恢复，作为成功进行删除的指针；这里就提出一个如何对基因进行拆解的问题：要在结构和功能的意义上拆解基因序列，同时又要保证被拆解的基因在重新对接后能在转录和转译产物的水平上恢复原有的功能，并不很容易做到，因为拆解过程中加入的外源序列，常常导致在原来的蛋白编码框架内部，增加额外的编码氨基酸的序列，因而该基因所编码的蛋白的功能，也常常受到破坏，为解决这一困扰，到目前为止，研究人员常常通过事先选择合适的插入位点和插入序列、以使得外源的氨基酸不破坏整体蛋白的功能结构，但这个办法，一来费时费力，二来不容易成功；另外一些研究者则通过将蛋白编码基因序列的起始码(一般情况下为ATG)和后续序列分开的办法来解决这个问题，但这只能做到结构上的分离，而无法做到功能上的分离，因为如此形成的下游序列，在和任何一个其它的表达框架融合之后，就可以重新获得原有的功能，因为一般情况下，ATG编码的met的丢失，并不影响蛋白的整体结构和功能；以上两个办法，并不能真正做到同时在结构和功能的意义上拆解基因框架。

随着后基因组时代的到来，对基因功能和结构的研究，越来越需要一个通用的方法，它的应用，既能增加基因的遗传可操作性，同时又不改变目标基因本身的编码功能。本发明提供的，就是满足这一后基因组时代特殊要求的增加基因可操作性的方法。

发明概述

本发明提供的是一种在实验层次上更灵活地操作编码蛋白或者其它生物分子的基因序列的方法，其具体做法是：在目标基因序列中，以实验的手段，例如突变等，插入一段附加序列，该附加序列具备以下的特征和功能的一项或者多项中：(1)附加序列的插入，在转录和转译的水平上，不改变目标基因的编码功能；(2)由于该附加序列的插入，目标基因序列在结构和/或功能上被分成上游和下游两个部分，在物理的意义上，这两个部份可以被分离并被克隆到不同的载体中去；目标基因的编码序列，也可以被附加序列分离，即拆解后形成的两个部份，它们都不能独立编码原有的基因功能，但是，它们在重新对接后，其功能将被恢复；(3)利用附加序列在目标基因中引入不同的具备不同功能的遗传操作位点，以便不同目的的遗传工程意义上的操作；(4)在同一目标基因中，引入一个或者多个的附加序列。本发明利用的原理虽然并不复杂，但正如PCR技术的原理同样并不复杂一样，本发明在基因组时代的基因结构、基因功能的研究，以及多种遗传载体的构建等方面，对有极为重要的应用前景。

附图简述

图1为基因序列中外显子和内含子的结构示意图；

图2为本发明设计的删除子的结构示意图；

图3a显示删除子插入EGFP编码基因中的插入位点；

图3b为插入了删除子的CMV-EGFP载体的结构示意图；

图4为插入EGFP编码基因中的删除子的序列和结构。

发明详述

本发明提供的是一种在实验层次上更灵活地操作编码蛋白或者其它生物分子的基因序列的方法，其基本设计原则是：在目标基因的序列中，通过实验手段，插入一段附加序列，其中含有用于对该基因进行不同的操作目的的位点和次级序列等；由于该附加序列的插入，目标基因被分成上游和下游两个部份，但附加序列的插入，并不在转录和/或转译的水平上改变目标基因的功能。

本发明提及的目标基因，可以是任何形式的可被转录为RNA的基因序列，为描述方便，以目标基因是对一种蛋白的编码框架为例，对本发明作详细说明，但本发明的应用，并不受这一具体例子的限制。

本发明提供的方法，如前所言，是在目标基因的编码区，插入一段附加序列，而附加序列的特点之一，就是不影响原来基因的转录和转译产品的功能，本发明实现这一目的的办法，就是设法让附加的序列在转录或者转译的过程中，在不影响插入位置外周序列的情况下，被完全删除掉。

一般情况下，真核生物的由外显子(exon)和内含子(intron)组成的基因，其内含子部分，在RNA的水平上就被删除了，但决定这种删除过程的序列信号，同时被外显子和内含子序列共同决定。如图一所示，一个内含子(intron)的上游和下游的与邻近外显子(exon)的交界处，分别有一段被称为SD(splicing donor)以及SA(splicing acceptor)的区域，在转录后形成的早期mRNA链上，与SA和SD对应的序列，则包含了剪切的信号。以剪切的位点为界，这里将SD序列中，与决定上游剪切位点相关的部分，位于外显子部分的，称为A1，位于内含子部分的，称为B1；与之类似，这里将SA序列中，与决定下游剪切位点相关的部分，位于外显子部分的，称为A2，位于内含子部分的，称为B2；这样，目标基因转录后，最终形成的信号RNA，在剪切的交界处，就留下与A1A2相对应的序列。

这种含有内含子及其外围部分外显子序列的结构，常常被放进一些分子生物学研究常用的载体中，但一般并不能被整合进编码序列中去，而是被置于某个激活子后面的可转录区，以用来增加基因的表达效率；其中的原因很简单：这样的含有内含子的结构，如果被置于表达框架之中，就无法在转录水平上被彻底删除，因为外源插入的结构，至少必须含有A1B1和A2B2两个部分，才能为细胞内的剪切机制识别，但由于精确的删除位点，并不在插入序列和目标基因序列的接点上，而是在插入序列中间的位置上，决定这个删除过程的两侧的部分附加序列A1和A2，将被继续保留在目标基因的序列中，因此，设计一种删除位点和附加序列的插入位点精确重合的附加序列，是最理想的解决问题的办法。

本发明提供的途经，是先制造一个被称为删除子(splicon)的序列。该删除子序列的结构特征是：其上游和下游两侧，分别含有B1和B2或者具有类似功能的序列，同时B1和B2之间，加入另一段可以帮助引导细胞剪切机制精确识别所设计的剪切位点的C序列，在这几个基本的因素确定后，在删除子的中间，就可以加上研究者希望引入的其它特定的序列，例如：限制性内切酶位点(RE)，对转录过程起作用的序列(element)，转译终止码(SC)，重组酶的识别位点(IS)，某些特殊的遗传序列的定点整合位点，其它的两端含有SA和SD的人工引入的外显子序列(sa-exon-sd)，以及其它的序列(other)。删除子结构可以提供定点突变插入或者其它的常规方法导入目标基因。

本发明设计的删除子，将图一所示的SD及SA结构中的B1和B2序列，分别置于删除子的两端，但由此带来的另一个问题是：由于丢失了A1和A2序列，B1和B2序列本身并不能被细胞的剪切机制识别，这个问题如何解决呢？在对真核细胞的RNA的剪切过程的详细分析之后，就可以发现，野生型的(wild type)SD和SA序列，通常具备一定的统计特征，对Genebank中收集的相关序列的分析，发现在许多基因的内含子和外显子的交接处的结构一般都具有一定的保守性.

较为常见的SD序列，即5′剪切位点的统计特征是：5′(A/C)AGGA(A/G)AGT 3′，此处的A1序列是5′(A/C)AG 3′，B1序列是5′GA(A/G)AGT 3′。

较为常见的SA序列，即3′剪切位点：5′(T/C)(T/C)TT(T/C)(T/C)(T/C)(T/C)(T/C)(T/C)N CAGG 3′，这里的N代表该位置可以是A、G、C、T中的任何一个核苷酸。此处的B2序列是，5′(T/C)(T/C)TT(T/C)(T/C)(T/C)(T/C)(T/C)(T/C)N CAG3′；此处的A2序列是：5′G 3′。

对应于以上的SD和SA的保守序列，其相应的A1A2的序列特征即是5′AAGG3′或者5′CAGG3′或者AGG。不过，值得强调的是：

一，以上的A1B1，A2B2仅是通过对大量的SD和SA序列的分析，得出的具有统计学意义的保守序列，虽然这样的保守序列亦已经被实验证明是有效的剪切位点，但事实上野生型的SD和SA序列变化很大，其和上述统计意义上的保守序列之间，一般只具有一定程度的相似性；此外，野生型的SD和SA序列，也有一些是不属于以上保守序列的范围的；但这些变化显然不构成对本发明的限制，因为无论序列特征如何，只要在功能的意义上可以被细胞的RNA剪切机制识别，所有的SD和SA序列，都可以精确的剪切位点分界，被为A1B1和A2B2，因而其A1A2序列就可以被确定。

二，对细胞的RNA编辑机制而言，除了在SD和SA中精确的剪切位点两侧的序列外，其它的一些序列，有时也对剪切的效率等产生影响，其中比较重要的就是位于SA剪切位点上游的分枝序列(branch sitesequence)，分枝序列通常也具有一定的保守性，例如，在酵母体系中的5′TACTAAC3′，或者哺乳体系中的5′Y N Y TRAY 3′。由于分枝序列位于SD剪切位点的下游和SA剪切位点的上游，因此，其可以被方便地设计到人工合成的删除子序列中去，因而不会给本发明的应用造成限制。由于分枝序列通常位于SA剪切位点上游非常接近的位置，所以，在本发明的具体描述中，就将分枝序列归到B2序列中。

在本发明的描述中，虽然只要以保守型的A1，A2，B1，B2为例加以说明，但很显然，这并不构成对本发明的限制，事实上，对任何一种类型的SD和SA序列，就会有相应的A1B1和A2B2序列，因此，也会有相应的A1A2序列，以及和该A1A2序列相对应的B1B2序列结构；其中，除A1A2序列需要目标基因提供外，B1，B2序列则可以被设计到合成的删除子序列中去。另一方面，也可以通过对目标序列的修饰来人为制造所需要的内源位点，这样的修饰可以利用遗传编码的简并性，甚至在目标基因中制造突变，只要这种突变不对研究者的实验结果构成影响．

对细胞RNA编辑机制而言，一般情况下，以上描述的A1B1和A2B2序列已经提供了足够的识别和剪切信号，但在有些情况下，其它的一些序列，也会对剪切效率等产生影响，因而也可以有选择地被设计进删除子序列中去，在本发明的描述中，将这一类序列，统称为C序列，但由于C序列通常不是必需序列，所以，为描述的简洁和方便，此处以及本发明的实施例中，仍然以对细胞的RNA编辑机制必需的A1B1和A2B2序列为主进行描述，但这也不意味作对本发明的限制。

从以上的分析可以知道，在删除后形成的对应于A1A2序列的结构，一般情况下，都不复杂，研究表明，供体和受体序列中精确的剪切位点外围的序列，具有一定的规律，比较常见的A1---A2序列的特征为：AAG-----G和CAG-----G，就是说，在剪切后，形成的A1A2序列的结构特征为：AAGG或者CAGG，在某些野生型的A1A2序列中，甚至AGG前面的核甘酸对剪切识别所起的作用很小，因此，对任意一段DNA序列，随机出现以上特征的A1A2序列的概率在1/256至1/64之间，也就是说，在每一段长度在64bp至256bp的DNA片段中，就可以出现一个满足要求的A1A2序列。如果考虑到真核细胞中，还存在其它类型的野生型的SD和SA序列及其相应的A1A2序列，事实上，对任意一段DNA序列，找到合适的具备A1A2特征序列的概率，远大于1/64；必要的情况下，还可利用氨基酸编码子的简并特点，即某些氨基酸的编码，存在多种选择，因而是可变的，这为人工制造删除子的特征结构提供了条件；此外，在某些特殊的情况下，目标基因内部的某些序列，例如氨基酸编码序列，其所编码的氨基酸，在功能上是可以被置换或者删除的；总之，无论是内源固有的还是人工制造的，删除后特征结构是一旦被发现或者形成，就可以为删除子提供极佳的插入位点。一般情况下，由于这些具备A1A2特征的序列，可以出现包括基因组序列的任何目标基因序列中，它们的出现，即使在目标基因是cDNA情况下，多数也并非是剪切后遗留下来的，所以，为示区别，图二将这样的结构，标为a1和a2，而a1和a2的分解，就是人工删除子序列精确的插入位点。但这仅仅是为区别来源的不同，从序列特征上讲，本发明的描述中，A1，A2，B1，B2和a1，a2，b1，b2可以互用，在意义上也可以互相取代。

其后的实验过程，以A1A2或者a1a2的序列特征是AAGG为例加以说明。首先在目标基因的序列内，寻找内源性的AAGG位点，然后将含有满足研究者特殊需要的序列结构的删除子，通过定点突变或者其它的方法，插入两个G之间，形成AAG(splicon)G的结构，最终形成一个人工制造的可以被细胞的剪切机制删除的仿真结构，其精确的删除位点，就是外源的删除子的插入界面，即当其转录产物被细胞的剪切机制识别并剪切后，和删除子对应的部分，将被完全删除，当然，当研究者在删除子中设计了合成的其它外显子时，就是另一回事情了。

这里需要指出的是，决定精确的删除位点的，除了SD和SA以外，还有其它一些序列可以影响到删除的效率，这里统称为C序列，本这些相关的序列，都可以设计到删除子序列中去。此外，除了特征性的A1A2序列外，删除子插入位点周围的其它序列，在某些情况下，也会对删除实验构成一点影响，但由于目标基因中，可以选用的插入位点比较丰富，遇到此类特殊的情况，一般都选择不同的位点的办法加以规避。

总之，本发明提供的方法，在应用上，并不依赖目标基因的特殊性质，因而应用范围极广，具体地讲，至少包括以下几个方面的一个或者多个：一，在结构和功能的双重意义上，将编码基因例如cDNA进行分离；二，在目标基因或者基因组中，引入新的供分子操作的位点，例如限制性内切酶位点，特殊因子的识别位点等；三，利用删除子序列，在目标基因中引入一段外源的外显子区等等；具体应用的不同，也使得实验的对象：目标基因序列的来源有所不同，它们可以是一段cDNA，也可以是一段基因组序列，或者是一段人工合成的序列，在某些特殊的情况下，甚至是RNA序列等。但本发明提供的方法，既包含了所有的满足要求的位点序列，即使对于那些cDNA中经自然的剪切过程遗留的位点，本发明也提供了全新的利用途经，即(1)不必要知道与该互补DNA相应的基因组结构；(2)即使在相应的基因组的结构完全清楚的情况下，也不必要完全恢复所有的基因组序列；(3)其它用于不同研究目的的位点或者序列，可以方便地引入目标基因而不会影响其原有的编码功能。所以，本发明的涵盖范围，实际上也包括了对野生型内含子中的一个或者几个的部分恢复，不论这种恢复是否同时也加进了其它的序列结构。

本发明提供的，是一种通用的在遗传物质例如DNA或者RNA中增添附加序列的方法，利用本发明的删除子加入的序列，可以精确地按照研究人员的意愿，一，在转录的水平上，将外源序列完全剪除，以使原来的目标基因的序列在转录和转译的意义上被恢复；或者二，将另一个外显子序列，在转录和转译的水平上，精确地整合进原来的表达框架中。  当然，本发明的应用，还包括了对本发明进行的一些常规分子生物学意义上的修饰所形成的方法，例如，可以将A1A2上的部分或者全部序列，设计到B1或者B2的两端，或者相反，将B1B2上的部分或者全部序列，设计到A1或者A2的之间．例如，如果A1A2序列是AAGG，那么，可以将其中的两个G分别置于B1和B2两端，删除子序列因而就成为G-B1----------B2-G，相应的，只要在目标序列中找到连续两个A，就可以用作插入位点了。通过这样的办法，研究者可以在增强目标基因的遗传可操作性的同时，在目标序列中制造插入或者缺失突变。

原则上，本发明的目标基因，可以是任何DNA序列或者可以转化为DNA序列的其它生物分子；即使对野生型的基因组序列，也可以利用本发明提供的方法，则可在加入另外的结构序列同时不影响该基因在转录和转翻译水平上的编码功能，或者按人工设计的方法，精确地加入外源的外显子。本发明也可以用于对一些编码蛋白以外的其它生物分子的基因序列上，比如对一些具有RNA酶活性的基因等。利用本发明的方法所修饰的目标序列，可以被放置进任意的系统中去，如常规的分子生物学克隆载体和应相的用于载体扩增细菌，病毒体系，细胞体系甚至人工制备的体外实验体系等．

本发明使研究人员获得一种简便的在目标基因中引入需要的各种位点或者序列，以方便地诸如拆解目标基因或者其它遗传工程意义上的操作。

以下实施例，是为了说明本发明，但不构成对本发明的限制。

实施例一

在绿色荧光蛋白(EGFP，enhanced green fluorence protein)的基因编码序列中插入splicon序列及其功能测定。

本应用实例在实验方法上并不复杂，对其涉及的常规的实验技术，如分子克隆，PCR反，细菌转染，培养细胞基因转染，DNA测序，荧光显微镜观察等，均为非常成熟的细胞和分子生物学技术，具体的反应条件，可以通过对冷泉港实验室的分子生物手册方便地查出，故不详细描述。但对实验关键的部分，如引物的设计，删除子的结构等，本应用实例均将一一详细加以说明。

选定EGFP的编码基因作为目标序列，是因为对EGFP基因和蛋白序列的极小的改变，都将导致该蛋白空间结构的变化，从而使得EGFP失去发散荧光的功能，这就给删除子的插入对EGFP蛋白功能影响的研究，提供了一个非常方便的观察指标。

绿色荧光蛋白的基因序列，根据已发表的序列，通过DNA合成仪合成不同长度的DNA双链，然后拼接而成，部份序列则通过插入突变的方式加入。

完整的EGFP基因序列，被克隆进被pCMV。pCMV是由pUC19改造而来，即在pUC19的多克隆位点区插入一个CMV激活子，再于CMV激活子下游加入一个来自SV40病毒的转录终止序列(transcriptiontermination signal or poly A signal)，经改造的pUC 19被称为pCMV。

合成的EGFP基因序列被克隆进CMV和polyA信号之间，含有EGFP基因的pCMV载体被称为CMV-EGFP，后续splicon插入实验，就以CMV-EGFP的基础上进行，EGFP的基因编码序列，即是本例中的目标基因序列，本实验的目的，就是要在目标基因序列中插入一段splicon(即删除序列)的同时又能保证EGFP基因表达产物的结构和功能不受插入的splicon序列的影响。

如图3a和3b所示，Splicon序列，被通过插入突变的方法，引入EGFP的编码区；其准确的插入位点，在EGFP第95和96位置的氨基酸的编码序列对应的caggag之间，此处的cagg序列，就是一个理想的A1A2或者a1a2序列，splicon序列被通过定点突变的方法插入caggag的两个g之间，定点插入突变所用的引物序列如下：Primer 1:5′-3′:ggata acttc gtata atgta tgcta tacga acggt actcg agtta gtcac ttacctggac gtagccttcg ggcat ggcgg acttg(SEQ ID NO.1)primer 2:5′-3′:ctgat atcct attgg tctta ctaac atcca ctttg ccttt ctctc cacag gagcgcacca ctttc ttcaaggacg acg(SEQ ID NO.2)

定点插入突变是通过Taq polymerase和14轮链聚合反应完成的，所得的反应溶液，然后被转入HB101受体态细菌，阳性克隆首先被通过脢切进行初步鉴定。这样，在EGFP第95和96位置的氨基酸的编码序列间，插入了一个外源的删除子序列。最后在以上选定的位点插入的splicon的序列是：5′-3′gtaag tgact aactc gagta ccgtt cgtat agcat acatt atacg aagtt atccc tgata tccta ttggtcttac taacatccac tttgc ctttc tctcc acag(SEQ ID NO.3)

含有以上删除子序列的EGFP基因的载体，被称为pCMV-splicon，新插入的片段，通过序列测定，证明是正确的。

为证实splicon能否在转录的水平上被精确删除，我们将pCMV-splicon经瞬时转染的办法，导入Hela细胞，在CMV激活子控制下转录的EGFP编码基因信息RNA，如果其中对应于splicon的序列能被精确删除，那么，细胞中就应该表达绿色荧光，荧光显微镜下的观察证实了这一结果。为进一步证实删除的精确性，转染细胞的信息RNA被用反转PCR的办法扩增，并对所得到的PCR产物进行了序列分析，RT-PCR所用引物如下：primer 3:5′-3′:acc ctc gtg acc acc ctg acc；(SEQ ID NO.4)promer 4:5’-3’:gtc gcc ctc gaa ctt cac ctc；(SEQ ID NO.5)

对PCR产物的序列分析的结果，证明被整合进EGFP基因的splicon序列，已经按预期的位点被精确的删除。由于在splicon中设计了许多新的位点，如多克隆位点，定点整合位点等，因此，在遗传工程的水平上诸如酶切，外源序列的插入，基因编码序列的拆解等操作，就有了更多的选择，操作的灵活性被增加。

虽然以上通过具体的实施方案对本发明进行了具体描述，但本领域技术人员可以理解，在不背离本发明的原则和精神的情况下可以对本发明作出各种改变和改进。因此，所有这些改变和改进都应包括在本说明书和所附的权利要求书的范围之内。

Claims (17)

1.一种通用的增强目标核酸分子遗传可操作性的方法，该方法包括下列步骤：

A.首先在目标序列中，寻找或者通过遗传工程的办法制造合适的内源位点；

B.通过遗传工程的方法，在(A)所说的内源位点中插入外源的删除子序列；

C.根据需要对所获得的整合有外源删除子序列的目标序列进行各种遗传操作；

以上方法的特征是：在外源的删除子序列插入内源位点之后，新形成的整合有外源删除序列的目标序列，在转录成RNA后，可以被真核细胞或者类似真核细胞的系统的RNA编辑机制识别和剪切，以上形成的RNA分子中与删除子序列对应的序列将被完全切除，原来的目标序列在成熟mRNA的水平上，其结构和功能不因目标序列中删除子的插入而改变。

2.根据权利要求1的方法，其中所说的目标序列，是任意来源的核酸序列，包括：a)基因组序列或者生物分子的基因序列；b)编码蛋白或者其它生物活性分子的eDNA序列；c)对a)或者b)所说的目标序列加以修饰形成的序列；d)其它的人工制备的核酸序列。

3.根据权利要求1所说的方法，该内源位点具备A1A2或者a1a2的序列特征，删除子序列的插入位置在A1和A2或者a1和a2之间。

4.根据权利要求3的方法，其中所说的内源位点的A1序列是：5′AAG3′或者5′CAG3′或者5′AG3′，而A2的序列是5′G3′。

5.根据权利要求1的方法，其中所说的删除子序列的结构特征是：其上游和下游两侧，分别含有B1和B2或者具有类似功能和特征的序列，同时B1和B2之间引入了用于不同遗传操作目的的特定的序列。

6.根据权利要求5所说的方法，其中所说的B1或者b1的序列是：5′GAAAGT3′或者5′GAGAGT3′；其中所说的B2或者b2的序列含有两段特征序列，其中一段特征序列是位于B1或者b1的下游端即3′端，特征是：5′(T/C)(T/C)TT(T/C)(T/C)(T/C)(T/C)(T/C)(T/C)NCAG 3′，另一段特征序列是分枝位点序列，特征是：5′TACTAAC3′，或者5′YN Y TRAY 3′。

7.根据权利要求5所说的方法，其B2或者b2序列是5′tactaacatc cactt tgcct ttctc tccac ag 3′。

8.根据权利要求6的方法，其中所说的特定的序列包括限制性内切酶位点(RE)，对转录过程起作用的序列(element)，转译终止码(SC)，重组酶的识别位点(RBE)，不同的遗传序列整合位点(IS)，以及其它的序列(other)。

9.根据权利要求6的方法，其中所说的删除子序列如下：(5’-3’)：gtaag tgact aactc gagta ccgtt cgtat agcat acatt atacg aagtt atccc tgatatccta ttggt cttac taaca tccac tttgc ctttc tctcc acag(SEQ ID NO3)。

10.根据权利要求1的方法，其中在同一目标序列中，同时在一个以上的内源位点插入删除子序列。

11.根据权利要求1所说的方法，其目标序列是某个基因的Cdna；内源位点是对应于该cDNA序列的基因组序列在转录成RNA后的剪切过程中因内含子的删除而留下来的A1A2结构；而删除子则对应于RNA编辑过程中被剪切的部分，或者对应于RNA编辑过程中被剪切的部分加以修饰所形成的序列。

12.根据权利要求1到11的任一项方法，其特征是：在删除子序列两端的B1和B2或者类似的结构之间，引入一段上游和下游两端分别由SA和SD组成的外显子序列(sa-exon-sd)。

13.根据权利要求1到12的任一项方法，其特征是：将A1或者A2上的部分或者全部序列，设计到B1或者B2的两端，或者相反，将B1或者B2上的部分或者全部序列，设计到A1和A2之间；与此相应的删除子中的B1和/或B2序列，将比权利要求1到11的方法中的删除子序列，核苷酸数目有所增加或者减少，相应地，删除子序列在目标序列上合适的整合位点的序列，也在原来的A1A2的基础上，有所减少或者增加。

14.利用权利要求1至13中任一项的方法将一段基因序列或者一个编码蛋白或者其它生物分子的基因序列在结构及功能上拆解成不同的部份，并被克隆到不同的载体中去。

15.利用权利要求1至13中任一项的方法将一段核酸序列分解成可用于不同的实验目的的几个部份。

16.含有权利要求1至13中任一项的方法中所说的全部或者部份删除子序列的单链或双链核酸序列。

17.含有权利要求1至13中任一项的方法中所说的全部或者部份删除子序列的单链或双链核酸序列的分子生物学载体，细菌细胞，病毒体系，细胞体系或者人工制备的体外实验体系。

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