CN1406125A - 分子材料透皮或皮内输递的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种透皮输递分子材料的方法。该包括将电脉冲同时或相继施加于分子和含有带负电荷脂质体成分的脂类组合物。使用脂质体成分是为了提高供分子输递的靶位点的通透性。

Description

分子材料透皮或皮内输递的方法
本申请要求已在2000年2月25日提交的美国临时申请(申请号为60/184,918)的优先权，在此全文并入本文以供参考。
发明领域
本发明一般涉及分子材料的输递系统领域。更具体的说，本发明提供了一种透皮或皮内输递分子材料的方法，包括对皮肤应用这些分子材料和一种脂质体成分，相应地同时或相继在皮肤上进行电穿孔处理。
相关技术的讨论
与其它输递方法相比，透皮或皮内的药物输递有许多潜在的优点。除了方便和无损害性外，它提供了一种可使引入的分子材料避免被肠胃道或肝脏降解或代谢的输递途径。皮肤同时还提供了一个“储藏库”，可使引入的分子材料的输递保持数天之久(Cullander，1992，Advanced Drug Delivery Reviews 9：119-135)。另外，它提供了多个输递位点以避免局部刺激和中毒，同时，它可以在局部富集药物以避免不适宜的全身性反应。
局部使用的药物有许多用途，包括治疗骨关节炎、软组织风湿症、腱炎、局部发炎、美容药膏、以及各种皮肤癌等。同时，皮肤也是疫苗的输递部位。然而，在目前的情况下，只有很少的药物、药剂、核酸、或其它化学试剂可以药用相关速率进行透皮输递，所以透皮输递的临床应用受到了限制。这是由于对大多数分子材料而言，皮肤是一层有效的屏障，且几乎还没有发现什么无损害性的方法可以明显有助于通过这一层屏障。
哺乳动物的皮肤是由两层构成的，即表皮和真皮。表皮是一种分层的鳞片状的角质化上皮。表皮的最外层叫做角质层(SC)，它由大约20层扁平的、无细胞核的、充满角质素的角质细胞构成，外面包围着平均约8层脂双层薄层。该脂双层主要含有固醇、游离的脂肪酸和神经酰胺。SC总的厚度大约在10微米至40微米之间，平均厚度为20微米(Chizmadzhev等，1995；Biophysical Journal，68：749-765；Bouwstra等，1995，J.Lipid Res.36：685-695；Swartzendruber等，1989，Journal of Investigative Dermatology，92：251-257)。角质层构成了皮肤的主要电阻层，也是和物质传递的一个主要屏障。皮肤电阻值RS的典型值为5-15kOhm/cm2，电容值CS为1-20nF/cm2(DeNuzzio和Berner，1990，Joural ofControlled Release 11：105-112)。皮肤还含有各种附属物，像毛囊、顶泌汗腺、顶外泌汗腺，在人类还有外泌汗腺，所有的这些都是高度脉管化的。这些附属物也是与外界进行物质交换的途径(Scott等，1993，Pharmaceutical Research10：1699-1709)。
目前，大多数的透皮输递都是通过附属物进行的消极扩散，使用皮肤膏药、洗剂、霜剂等。有各种不同的途径可以提高化学药品的透皮输递速率。比方离子电渗法，它采用一个弱而持久的直流电场并通过SC的附属物或细胞间隙来运输分子材料。SC的不通透性限制了扩散和离子电渗在长时间(比如说几十分钟到几天)运输小分子材料(比如小于400道尔顿)方面的运用。
另外一种透皮输递分子材料的途径是通过使用单一或复合的短时持续脉冲(比如几微秒或几毫秒)使膜或皮肤暂时通透。这会穿过非导电性的原生质膜建立一个穿过细胞的占优势的电压梯度，同样的，通过非导电性的SC建立穿过皮肤的电压梯度。如果电压梯度超过了屏障击穿电位，就会形成孔洞，根据所使用的脉冲电场和持续时间孔洞会重新封闭。在孔洞形成时，物质就可以穿过这一屏障进行输递。这一过程通常被称为电穿孔。另外一种透皮输递方法是通过脂质体进行的。脂质体已经被用于局部的透皮给药以产生不同的药效，但其机理仍然有争议。有报道说，当用在组织培养的小鼠皮肤表面时，中性的脂质体会聚集在毛囊通道中(Li等，1992，In Vitro Cell Dev.Biol.28A：679-681；Li等，1993，In Vitro Cell Dev.Biol.29A：258-260)。只含有磷脂酰胆碱，或含有磷脂酰胆碱、磷脂酯酰乙醇胺和胆固醇的混合物的各种脂质体已被用来输递含有lacZ报告基因的质粒，以转染毛囊的上皮组织(Li等，1995，Nature Medicine I(7)：705-706)。Alexander等人(1995，Human Molecular Genetics 4(12)：2279-2285)曾报道在小鼠的皮肤表面使用与pIRV-neo-K5质粒结合的含有阳离子脂类二油酰-三甲胺丙烷(DOTAP)的脂质体，结果发现包括毛囊间的上皮和毛囊在内的皮肤成纤维细胞有广泛的转染。在联用合适的电场时，Vutla等人(1996，Journal of Pharmaceutical Sciences85(1)：5-8)用Franz室测量了被荷电的和中性的脂质体包裹的脑啡肽穿过植入的人体皮肤的“离子电渗”运输。他们发现使用带电脂质体并不能提高离子电渗输递，但是却能帮助药物抵制降解作用而保持稳定。Hofmann等人(1995，Bioelectrochemistry & Bioenergetics 38：209-222)，Zhang等人(1996，Biochemical and Biophysical Research Communication 220：633-636)和美国专利第5,464,386号、5,688,233号、5,462,520号都建议使用一个或更多的电脉冲来输递被囊泡或微球体包裹的或是与粒子混合的大分子材料通过SC。在这里将美国专利第5,464,386号、5,688,233号、5,462,520号全文并入，以供参考。
在美国5,318,514、5,968,066、6,009,345、6,132,419各专利号和WO 00/09205、WO 00/02621、WO 00/02620等资料中也有对物质(包括药物，化学物质以及核酸)经电穿孔进入或通过SC和皮肤的描述，所有的这些都属于Genetronics公司，这里列出了所有这些专利的全文以供参考。
除了已经作出的改进以外，现在正需要发展各种能提高所需分子材料透皮输递的方法。
发明概述
本发明提供了一种分子材料透皮或皮内输递的方法。这种方法包括使用各种分子材料和一种含有带负电荷脂质体成分的脂类组合物并同时或相继使用电脉冲。这类脂质体成分被用来提高分子材料输递靶位点的通透性。通过电穿孔法，本发明可使分子材料的运输变得比较容易，这些分子材料包括目前较难输递的大型中性分子材料。在本发明的一个实施方案中，这种脂质体成分包括磷脂类，其中包括(但不局限于)二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。这些脂类组合物可以(但不一定)形成脂质体或其它结构以提供更高的效率。另外，与常规实践相反，在这一发明中，被输递的分子材料没有被任何此类结构包裹。
这项发明的一个实施方案是一种能加快分子材料输递至/或通过个体皮肤上的输递位点的方法，这一方法包括以下几个步骤：
(a)同时或相继使用被输递至皮肤上输递位点的分子材料与含有负电荷脂类的脂质体成分，其中被输递的分子材料不需要被脂质体成分包裹；
(b)在皮肤上的输递位点与(a)项中的分子材料和脂质体组合物分别同时或相继使用至少一次的电脉冲，其中电脉冲要有足够的持续时间和电压，以产生电穿孔并能输递分子材料进入或穿过皮肤，同时，当脂质体成分存在时被输递的分子材料的数量要比脂质体成分不存在时多。
在上述实施方案的一个变化中，被输递的分子材料没有被脂质体成分包裹。
这项发明的另一个实施方案是一种能加快分子材料输递至/或通过皮肤上的输递位点的方法，这一方法包括以下几个步骤：
(a)同时或相继使用被输递至皮肤上输递位点的分子材料与含有负电荷磷脂类的脂质体成分，其中被输递的分子材料不需要被脂质体成分包裹；
(b)在皮肤上的输递位点与(a)项中的分子材料和脂质体成分分别同时或相继使用1至300次电脉冲，其中电脉冲的持续时间约为10微秒至200毫秒，脉冲电压约为80至200V，以产生电穿孔并能输递分子材料进入或穿过皮肤，同时，当脂质体成分存在时被输递的分子材料的数量较脂质体成分不存在时要多。
在上述实施方案的一个变化中，被输递的分子材料没有被脂质体成分包裹。
本发明的另一个方法是一种提高皮肤SC层通透性的方法，包括与含有负电荷脂类的脂质体成分一起对皮肤的SC层同时或相继使用至少一次的电脉冲，其中脂质体成分没有包裹将被输递至SC层的分子材料，其中SC层的通透性是通过孔洞的存在时间来确定的，脂质体成分存在时其通透性要高于没有脂质体成分时。
附图简介
图1显示了在使用DOPG∶DOPC脂质体成分时，亚甲基蓝(MB)通过新鲜剥离的猪角质层时相对运输量的提高。图中显示了在施加10、20、30分钟负脉冲以及10分钟没有脉冲以后MB的相对运输量，其中，(■)表示DOPG∶DOPC脂质体成分存在而(●)表示DOPG∶DOPC脂质体成分不存在。
图2显示了DOPG∶DOPC MLV对MB通过猪的SC层的作用，图中的电穿孔法分别使用了10，20和30分钟负脉冲以及10分钟没有脉冲。图中的数据分别是在脂质类存在(■)与不存在(●)时得到的值。
图3显示了用电穿孔法(负脉冲)在DOPG∶DOPC脂质体成分存在(■)与不存在(●)时原卟啉IX(PP-IX)通过猪SC层时的相对运输量。PP-IX的运输量是在10、20和30分钟脉冲后测得的。最后的一个值是在脉冲结束10分钟以后测得的。
图4显示了使用电穿孔法用(■)和不用(●)DOPG∶DOPC MLVs处理时甲基化PP-IX(MPP-IX)的相对运输量。加在猪SC层上的脉冲时间总共为30分钟，最后的一个值是在脉冲结束10分钟以后测得的。
图5显示了当不同分子量的FITC-葡聚糖通过猪SC层的运输量，图中空心柱与实心柱分别表示在电穿孔时使用与不使用脂质类。
图6显示了中性葡聚糖Texas-Red葡聚糖(3kDa)和罗丹明-葡聚糖(10kDa、40kDa、和70kDa)通过猪SC层的运输量，空心柱与实心柱分别表示在电穿孔时添加与不添加脂质类。
图7显示了在添加(●)和不添加(■)脂类制剂时SC层的初始电阻随负脉冲数量增加的变化曲线。
图8显示了在添加(●)和不添加(■)脂类制剂时，施加180次150V脉冲后SC层阻力的恢复百分值。
图9显示了在不添加脂质类时，分别加60次的80V(◆)、104V(□)、116V(△)、160V(×)、188V(▲)和300V(●)脉冲后SC层电阻的恢复百分值。
图10显示了在添加脂质类时，分别加60次的80V(◆)、120V(□)、128V(△)、156V(×)、188V(▲)和308V(●)脉冲后SC层电阻的恢复百分值。
发明详述
本发明提供了一种分子材料透皮或皮内输递的方法。这个方法包括在皮肤与分子材料和脂质体成分接触的区域在使用分子材料和脂类成分时同时或相继使用电脉冲。这种脂质体成分含有带负电荷的脂质类，优选磷脂类。在一个优选的实施方案中，磷脂类是DOPG和DOPC，比例为1∶1。
脂质类成分不必形成脂质体或其它的结构以提高效率。在一个优选的实施方案中，被输递的分子材料不需要被任何此类结构包裹。相反，脂质体成分无论是否形成固定结构都可用来提高分子材料输递靶位点的通透性。所谓的“不形成包裹”是指分子材料不必被脂质体成分包裹。如果少于10％的脂质体成分含有分子材料，由于在混合或其它处理时不可避免的包裹作用，对本发明而言它仍旧是“不形成包裹”的。
这一发现(指脂质体成分能提高效率与脂质体运送分子材料的能力是分开的)与一般的想法是不同的，一般认为包裹着分子材料的脂质体被完整地运输进皮肤并在靶细胞或组织处释放该分子材料。不必拘泥于任何具体的理论，它显示出脂质类成分可以延长电穿孔时形成的孔洞的寿命，并且正是这个原因使它们可以在电穿孔后提高分子材料的总运输量。当孔洞保持开发的时间较长时不仅可以使更多的分子材料通过SC，而且较长的孔洞寿命也提高了那些较难输递的分子材料穿过SC的能力。较长的孔洞寿命还可以降低产生电穿孔及输递所需的电脉冲的总数量。
用本发明的方法输递中性分子材料得到的提高值通常较高，而中性分子材料一般是较难电穿孔的。若使用的电脉冲极性正确(与分子材料的性质有关)，本发明还有助于带电分子材料输递至/或穿过SC。所以，本发明有助于通过电穿孔法输递分子材料，这些分子材料包括(但不局限于)那些以往比较难以输递的大型中性分子材料。
本方法包括在使用分子材料和一种含有带负电荷脂质体成分的脂类组合物时同时或相继使用电脉冲，对每一种成分都可以同时或相继使用。在一个实施方案中，这种被输递的分子材料可以仅与脂质体成分相混合。这样可以节省时间和开支。
在皮肤上的输递位点使用的分子材料、脂质体成分和至少一次的电脉冲选自下表的输递模式：
输递模式 对皮肤使用的分子材料* 对皮肤使用的脂质体成分 对皮肤使用分子材料-脂质体成分混合物 对皮肤使用至少一次电脉冲
(a) 1  2  na  3
(b) 1  3  na  2，4
(c) 2  3  na  1
(d) 2  4  na  1，3，5
(e) 4  2  na  1，3，5
  (f)   3   2   na   1
  (g)   3   1   na   2，4
  (h)   2   1   na   3
  (i)   2   3   na   1，4
  (j)   3   2   na   1，4
  (k)   na   na   1   2
  (l)   na   na   2   1
  (m)   na   na   2   1，3
  (n)   1   1   na   1
  (o)   Na   Na   1   1
  (p)   3   1   na   2
*数字1、2、3、4、5代表在连续事件中第一、二、三、四、五的顺序。如果每一格中的数字相同(比如(o)格)就表示各事件同时进行。如果每一格中的数字不同(比如(c)、(d)格)就表示各事件相继进行。如果一格中出现了多个数字，则该事件就要多次进行，“na”表示该事件不适用。
上述表格说明可以使用多种不同的模式进行输递。表中缺少的输递模式不能解释为超越了本发明的范围。本发明期望能以任何组合方式同时或相继使用分子材料、脂质体成分和电荷来进行电穿孔技术介导的输递。
通过实施例，下面对前表中的几种输递模式进行了相应的文字描述：
(a)先对皮肤使用分子材料，再对皮肤使用脂质体成分，最后对皮肤使用至少一次电脉冲；
(b)先对皮肤使用分子材料，接着对皮肤使用至少一次电脉冲，再对皮肤使用脂质体成分，最后再对皮肤使用至少一次电脉冲；
(k)将脂质体成分与分子材料混合并对皮肤使用该混合物，接着再对皮肤使用至少一次电脉冲；
这个方法包括在电穿孔过程中使用电脉冲。电穿孔技术被认为可在SC层上形成孔洞，这样，所需的分子材料便可以经皮内输递通过孔洞或到达皮肤下层的组织中。本发明中，电穿孔技术和皮肤接触脂质体成分相结合可以提高分子材料穿过皮肤的输递能力。提高输递能力是指，电穿孔技术和皮肤接触脂质体成分相结合将使输递至/或通过皮肤的分子材料的数量比没有脂质体成分时要多。电脉冲、分子材料以及脂质体成分可以同时或相继使用。对电穿孔而言，负极脉冲可以用本领域技术人员已知的任何专用的标准设备产生。通常，可在一个选定的皮肤区域至少使用一个正电极和一个负电极。可能的话，皮肤可以被削薄或去除毛发。
在本发明中优选使用的表面电极有(但不局限于)弯曲电极(meanderelectrodes)、微型插接电极(micropatch electrodes)、卡规(caliper)或其它小型板状电极(plate electrodes)。优选使用的侵入式电极(invasive electrode)有微针体阵列(microneedle arrays)。当使用侵入式电极(invasive electrode)时，应尽可能减小损伤。
对本发明有效的脂质体成分含有带负电的脂质类。适用的例子有二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、磷脂酰丝氨酸和二磷脂酰甘油(心磷脂)。此外，各种游离脂肪酸因带有负电荷也可以使用。带有负电荷的脂质类可以单独使用也可以与其它带有负电荷或中性的脂质类结合使用。对发明有效的中性脂质类的例子是二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。脂质体的制备工艺已是本领域众所周知的。其中一种脂质体的制备步骤如下：将溶于三氯甲烷的脂质类溶液按所需比例混合。再在惰性气体流(如氮气)中将溶液干燥。将干燥后的脂质类置于真空中以除去残留的溶剂。在干的脂质类中加入一定量的缓冲液。通过漩涡处理、超声裂解或微孔滤膜抽滤可以使脂质类分散在缓冲液中。当含有脂类化合物的脂质体成分形成MLV时，就可以接着用例1中的步骤来制备脂质体成分了。
值得注意的是，对本发明而言，并不需要分子材料被脂质体包裹，甚至也不需要形成这种脂质体或其它结构。当然，在这里明确一下，当脂质体成分存在时施加电脉冲可以提高SC的通透性，无论分子材料以何种方式输递都是与脂质体成分有关的。
为了规范以及要求权利，我们在此使用的“脂质体成分”，“脂类成分”，“脂质体组分”或“脂质体”等术语，是指一种含带有负电荷脂质类的组合物，无论是形成脂质体、粒子、囊泡、微球体、单层或多层的脂质囊泡还是不形成这些结构。本发明中使用的脂质体成分不需要包裹被输递的分子材料。在一个优选的实施方案中，这种脂质体成分就不包裹被输递的分子材料。
“分子材料”、“药物”、“被输递的分子材料”、“药剂”、“所需的分子材料”等术语和类似的术语是指药物(如，化学治疗药剂)、核酸(如，多核苷酸)、肽和多肽(包括抗体，免疫调节剂和其它的生物反应修饰剂)。被输递的药剂可以为使用这种处理方案的个体提供治疗性、预防性、美容性、基因治疗或其它预期的疗效。
这里使用的“抗体”这一术语包括完整的分子材料，也包括其中的片段，如Fab和F(ab′).sub.2。多核苷酸包括DNA、cDNA以及RNA序列，也包括天然或人工的反义核酸。“生物反应修饰剂”包括能参与改变免疫反应的物质。免疫应答修饰剂的例子包括各种淋巴因子等化合物。淋巴因子包括肿瘤坏死因子，白细胞介素l、2、3，淋巴毒素，巨噬细胞活化因子，移动抑制因子，集落刺激因子和干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ以及它们的亚型。此外，“膜激活”类药剂也可包含在“被输递的分子材料”和类似的术语的定义中。这些药剂也可以是那些主要起着破坏细胞膜作用的物质。膜激活药剂的例子有N-烷基三聚氰胺和对氯苯甲酸汞。
“同时(concurrently)”一词是指两件事情在同一时间发生。“相继(sequentially)”是指两件事情先后发生，而不论这两件事情之间的时间间隔是长是短。
被输递的药剂或分子材料的化学成分将决定药剂施用的最佳时间，这也与电脉冲的施用有关。例如(我们并不希望拘泥于具体理论)，据信，对等电点较低的药物(如新制癌菌素，IEP＝3.78)实施后电穿孔(post-electroporation)将更有效，这样可以避免这一区域内的高电荷药物发生静电反应。另外，如博莱霉素这类药物，有很大的logP值(P是指在辛醇和水之间的分配系数)和很大的尺寸(MW＝1400)，且具有亲水性，它在肿瘤细胞中扩散很慢，通常是先于电脉冲或和电脉冲几乎同时施用。此外，有些药剂通常需要被修饰，以便更有效的进入细胞。例如，紫杉酚这种药剂被修饰后在水中的溶解度会增加，从而能使它更有效的进入细胞。
对于本发明的方法而言，可以在皮肤上的选定区域同时或相继使用分子材料、一种脂质体成分和电脉冲。皮肤上的输递位点可以是适合个体的任何区域，即分子材料被输递且在输递后能被有效找到。手臂、腿、颈部或其它区域都是合适的输递位点。在同时使用时，需要用一个有贮液槽的电极。用在本发明中的优选的表面电极包括(但不局限于)弯曲电极(meander electrodes)、微型插接电极(micropatchelectrodes)、卡规(caliper)或其它小型板状电极(plate electrodes)。优选的侵入式电极(invasive electrode)有微针体阵列(microneedle arrays)。当使用侵入式电极(invasive electrode)时，应尽可能减小损伤。电极的直径可以在0.1至10毫米或更大。比较合适的电极有Ag/AgCl皮肤电极，市场上有这类电极供应(IVM公司，Healdsburg，CA)
含有分子材料的脂质体成分被加在负电极的贮液槽中。正负电极被分别安置在皮肤上选定的区域中并隔开一定的距离。一个标准脉冲发生器(如AVTECH的AVR-G1-C-RPCIB1型或BTX的ECM 830型方波脉冲发生器)被用来在电极之间产生电势。建议加在电极下每一个皮肤通道上的电压降为60-80V。脉冲时间可以是10微秒到200毫秒。优选的脉冲时间为1毫秒。可以使用一次或更多次的脉冲。合适的范围是用1-180次频率为1Hz的脉冲。每次脉冲优选的电场强度约为0.05-5kV/cm。
为确定个别分子材料的通量和输递参数，可以在分离的SC层上采用本发明的方法。此外，也可以在血液中检测该分子材料的含量以便对参数进行标准化处理。
本发明可以用以下的实施例来阐明，列举这些实施例的意图只是进行论述而不是对本发明进行限制。
                             实施例1
这一实施方案证明可使用本发明的方法输递带电荷与不带电荷分子材料。在分离的SC上研究了三种分子材料的输递情况，这三种分子材料是：亚甲基蓝(MB；分子量为374Da)，原卟啉IX(PP-IX；分子量为563Da)和甲基原卟啉IX(MPP-IX；分子量为593Da)。
角质层是用以下的热处理法从猪皮中获得的。将新鲜的猪皮用铝箔包裹并在60℃的水浴中放置5分钟。这样就可将SC从其它组织中轻轻剥离。SC可以直接使用，也可置于显微镜玻璃载玻片中于4℃保存。再将SC置于Hanson垂直扩散室(Hanson Vertical Diffusion chamber)中，这种简单的设备对那些熟悉本技术领域的技术人员而言是研究透皮输递的模式系统。这套装置包括两个充满合适缓冲液(10mM Tris，100mM NaCl，1mM EDTA，pH＝8.0)的小室。其中的一个作为供体另一个作为受体。脂质体和受试分子材料被加到供体室中。皮肤的最外层，SC是生物分子材料输递的一层有效的屏障。上室被当做皮肤的外表面而下室被看成是紧贴着SC的皮肤。将铂丝作为电极，一个放在上室，另一个放在下室。通过脉冲发生器可以在SC上通过电脉冲。
脂质类制剂可以通过以下方法制备。将二油酰磷脂酰甘油和二油酰磷脂酰胆碱以约1∶1的克分子比例混合，并通过强漩涡处理使其分散在缓冲液中，这样可以得到多层脂质囊(MLV)。受检分子材料的分子量分布在200-600之间。样品分子材料是根据它们的电荷以及各自的溶解度来选定的。MB带有正电荷且是水溶性的。PP-IX有两个羧酸基团，在pH8时带有负电荷。PP-IX的溶解度很低。MPP-IX不带电荷且仅在去污剂存在时才可溶。
脂质类制剂被置于上室中并施加10分钟的负脉冲(375V，脉冲持续时间为1毫秒，脉冲重复频率为1Hz)。然后将溶于缓冲液中的样品分子材料加到上室中，再继以10分钟不加脉冲。从下室(受体室)取出一份缓冲液。然后再加10、20和30分钟的脉冲，并在第10、20、30分钟的时候从下室分别取出同样量的缓冲液进行分析，以测定样品分子材料的输递量。脉冲结束后10分钟再从下室取出一份缓冲液。在对照试验中，在仅有缓冲液(没有脂质类)时先对SC加10分钟脉冲，再将样品分子材料加到上室中，并加上三次脉冲，每次均为10分钟。
用荧光光谱学的方法测量不同时间的取出液，可以得到输递至受体室的样品分子材料的数量。MB，PP-IX和MPP-IX都是荧光物质，这种方法要求被测量的样品分子材料浓度较低。图1显示了电穿孔处理后MB通过经脂质类制剂预处理或没有预处理的猪SC的时间过程。在没有脂质类制剂时，即便在加了30分钟的脉冲后受体室中的MB依然很少。当用脂质类制剂预处理SC以后，有大量的MB被运输通过SC。即使在电脉冲停止以后下室中MB的浓度仍旧会持续增加，这说明有MB通过SC扩散。由于MB带有正电荷而使用的脉冲是负极性的，所以不会有MB通过电泳作用穿过SC。这说明MB是经SC上因脉冲产生的孔洞扩散的。这种扩散很可能发生在两次连续的脉冲之间。
当使用的脉冲极性为正时，所得结果与使用负脉冲时恰好相反(图2)。在适合MB电泳的条件下，脂质类制剂的存在可抑制MB的输送(■)，其数据近似于脂质类制剂不存在时的结果(●)。
当使用带有负电荷的PP-IX模式分子材料时，其结果(图3)显示当脂质类制剂不存在时，PP-IX穿过SC的输送十分明显。而在添加脂质类制剂后其输送量仍有增加。这是由于PP-IX所带电荷使其在施加脉冲时可以发生电泳，这种在脂质类制剂存在时获得的增量很可能来自于两次脉冲之间发生的扩散。以至30分钟后看到的饱和现象是一种假象，因为在30分钟的脉冲处理时间内上室中的溶液已经空了。
当用脂质类制剂预处理SC时，MPP-IX样品(即PP-IX的不带电荷的类似物)的输送量有所增加，若仅用缓冲液(不含脂质类制剂)预处理SC，所得结果就要低的多(图4)。这是由于不带电荷的MPP-IX不能进行电泳，所观察到的MPP-IX的输送很可能是经SC上因电脉冲产生的孔洞而扩散的。所以当用脂质类制剂处理SC后，MPP-IX通过孔洞的扩散量较高。
用含有中性或正电荷脂质类的脂质体作类似的试验，当脂质体存在时，通过SC的输递量没有增加。
这些数据说明，先用脂质类制剂预处理SC再添加样品分子材料可以使分子材料的输送量有明显的增加。在所有受检的样品分子材料中都可以看到这种增加，而不论样品分子材料的带电性及水溶性如何。当用脂质类制剂处理SC后所见到的输送量增加的原因可能来自以下几个方面：(1)电穿孔数量的增加；(2)产生了较大的孔洞；(3)孔洞的开放时间延长。不必局限于任何具体的理论，这种脂质类诱导性增量(lipid-induced enhancement)的机制可能是：带有负电荷的脂质类与SC的脂质薄层区域相结合。这种脂质类的结合很可能会增加SC脂质类的流动性。
                             实施例2
这一实施方案证明了脂质类制剂在输送带及不带电荷的不同分子量的葡聚糖方面的作用。为说明这一实施方案，我们用例1中所用的Hanson垂直扩散室(HansonVertical Diffusion chamber)来测量分子量分别为3,900、9,000和154,200的FITC-葡聚糖的输送情况。脂质类制剂(DOPG∶DOPC 1∶1，10mg/ml)和一定量不同分子量的FITC-葡聚糖一起被加到上室中。对上室(供体室)加1ms的负脉冲，下面的受体室接地即可。加脉冲后15分钟内两室保持不受干扰，再用注射器从下室(受体室)中取出含有通过SC的葡聚糖的缓冲液，将全部缓冲液用真空离心浓缩机浓缩至3ml，再测量其荧光强度以便得知缓冲液中FITC-葡聚糖的量。将测得的荧光强度与用已知量的FITC-葡聚糖在相同的荧光分光装置下测得的值相比较。再根据SC的截面积就可计算出FITC-葡聚糖的总流通量。如图5和图6中所示，只有一种葡聚糖(即分子量为3,900的那种)在电穿孔后添加脂质类的情况下能明显地透过猪SC。对于大型葡聚糖(MW＞9,000)，在该试验条件下没有观察到明显的可重现的输送。
                              实施例3
这一实施方案证明，脂质类制剂的存在能影响皮肤SC层上因电穿孔而产生的孔洞的寿命。为阐明这一实施方案，通过测量电脉冲后SC的电阻恢复情况可以确定孔洞的寿命。可以使用例2中的Hanson垂直扩散室(Hanson Vertical Diffusionchamber)来进行测量。可以用低压直流脉冲测量SC的电阻。首先，在脂质类制剂(DOPG∶DOPC 1∶1)存在与不存在两种情况下加1至180次150V的脉冲，然后测量SC的电阻。结果显示在图7中。在最先的几次脉冲之后，SC的电阻下降得最快。随后的脉冲只使电阻另有一点降低。在脂质类存在时SC电阻的下降值比没有脂质类时要大。施加180次脉冲后的30分钟内没有再加任何脉冲，以便测量SC的电阻的恢复率(图8)。无论是否添加脂质类SC的电阻都有所恢复。然而，脂质类存在时的电阻恢复较没有脂质类时要少。即没有脂质类时SC恢复较快。
还测定了在脂质类存在与不存在时，脉冲电压对脉冲处理后SC恢复的作用。我们在猪SC上总共加了60次1毫秒，频率为1Hz的脉冲，并于脉冲处理前后测量SC的电阻。脉冲处理停止后用20分钟让电阻恢复。图9和图10显示了脂质类存在与不存在时的结果。不添加脂质类时，若脉冲电压小于200V则SC的电阻可以完全恢复。当电压超过200V时无法测出SC电阻的恢复，这说明SC的结构有严重破坏。当在SC中添加脂质类制剂后，脉冲电压最大为80V时SC的电阻可以完全恢复。当电压超过80V并低于200V时在测量时间内SC的电阻能部分恢复。当脉冲电压为200V或更高时，SC的电阻无法恢复。
这些结果说明，只有在少数几个脉冲之后SC是明显可透的。恢复时间决定于所使用的脉冲电压和脉冲次数。脂质类制剂的使用可以分别减少使SC可透所需的脉冲数目并延长恢复时间。
                              实施例4
这一实施方案描述了本发明方法在现场中应用的方法。将被输递的分子材料与含有(比如)DOPG∶DOPC(1∶1，10mg/ml)的脂质体成分在普通的缓冲液中混合。加到脂质体成分中的分子材料的数量将由被输递分子材料的所需浓度所决定。分子材料/脂质类混合物被加到(比如)有表面型电极(surface-type electrodes)的板状电极装置(electrical patch electrode device)的贮液槽中。制备人体材料，将合适的皮肤位置(如手臂)上的毛发除去。将片状电极(patch electrode)置于输递位点并将分子材料/脂质类混合物放在该皮肤上。用单一的或多个周期的电穿孔处理(约1-300个脉冲)，电压约为50-100V，频率为1Hz，脉冲时间1-20毫秒。在脉冲周期之间或每一周期的各个脉冲之间可以形成被动扩散作用，分子材料就被输递。
这里列出的数据可以证明用本发明的方法可以提高分子材料的透皮输递。前面所描述的具体的实施方案只是为了证明而不是限定。从本发明的教导中，那些熟悉本技术领域的技术人员应该承认，本发明中所使用的装置以及提到的特定条件，在不背离该发明精神的条件下是可以修改的。

Claims (44)

1.一种提高分子材料输递至/穿过个体皮肤上输递位点的方法，它包括以下步骤：
(a)同时或相继使用被输递至皮肤上输递位点的分子材料与含有负电荷脂质类的脂质体成分；
(b)在皮肤上的输递位点与(a)项中的分子材料和脂质体组合物分别同时或相继至少使用一次的电脉冲，其中电脉冲要有足够的持续时间和电压，以产生电穿孔并能输递分子材料进入或穿过皮肤，同时，当脂质体成分存在时被输递的分子材料的数量要比脂质体成分不存在时多。
2.根据权利要求1所述的方法，其中被输递的分子材料没有被脂质体成分包裹。
3.根据权利要求1所述的方法，其中带有负电荷的脂质类是磷脂类。
4.根据权利要求3所述的方法，其中磷脂类选自DOPC与DOPG。
5.根据权利要求4所述的方法，其中DOPG与DOPC的比例为1∶1。
6.根据权利要求1所述的方法，其中至少使用一次的电脉冲的持续时间约为10微秒至200毫秒。
7.根据权利要求6所述的方法，其中电脉冲的持续时间为1毫秒。
8.根据权利要求1所述的方法，其中每一个脉冲的电场强度约为0.05至5kV/cm。
9.根据权利要求1所述的方法，其中电脉冲的电压约为80至200V。
10.根据权利要求9所述的方法，其中电脉冲的数目约为1至300。
11.根据权利要求1所述的方法，其中分子材料选自药物、核酸、肽、多肽、抗体、免疫调节剂以及生物反应修饰剂。
12.根据权利要求1所述的方法，其中被输递的有效的分子材料选自治疗剂、预防剂、化妆品、基因治疗剂和预防用药。
13.根据权利要求11所述的方法，其中被输递的有效的分子材料选自治疗剂、预防剂、化妆品、基因治疗剂和预防用药。
14.根据权利要求1所述的方法，其中在皮肤上的输递位点使用的分子材料、脂质体成分和至少一次的电脉冲选自下表(a)至(p)的一系列输递模式： 输递模式 对皮肤使用的分子材料 对皮肤使用的脂质体成分 对皮肤使用的分子材料-脂质体成分混合物 对皮肤使用至少一次电脉冲 (a) 1  2  Na  3 (b) 1  3  Na  2.4 (c) 2  3  Na  1 (d) 2  4  Na  1，3，5 (e) 4  2  Na  1，3，5 (f) 3  2  Na  1 (g) 3  1  Na  2，4 (h) 2  1  Na  3 (i) 2  3  Na  1，4 (j) 3  2  Na  1，4 (k) na  na  1  2 (l) na  na  2  1 (m) na  na  2  1，3 (n) 1  1  Na  1 (o) na  na  1  1 (p) 3  1  na  2
表中，(i)数字1、2、3、4、5表示相继事件中第一、二、三、四、五的顺序，(ii)每一格中出现的数字相同就表示各事件同时进行，(iii)每一格中出现的数字不同就表示各事件相继进行，(iv)在一种输递模式中一个事件可以多次发生，(v)“na”表示该事件不适用。
15.根据权利要求1所述的方法，其中至少一次的电脉冲通过表面电极输递。
16.根据权利要求14所述的方法，其中表面电极选自弯曲电极(meanderelectrodes)、微型插接电极(micropatch electrodes)、卡规(caliper)或其它小型板状电极(plate electrodes)。
17.根据权利要求1所述的方法，其中至少一次的电脉冲通过侵入式电极(invasive electrode)输递。
18.根据权利要求16所述的方法，其中侵入式电极(invasive electrode)是一种微针体阵列。
19.根据权利要求1所述的方法，其中脂质体成分选自脂质体、粒子、囊泡、微球体、单层和多层的脂质囊泡结构。
20.根据权利要求1所述的方法，其中脂质体成分没有形成选自脂质体、粒子、囊泡、微球体、单层和多层的脂质囊泡的结构。
21.根据权利要求14所述的方法，其中脂质体成分选自脂质体、粒子、囊泡、微球体、单层和多层的脂质囊泡。
22.根据权利要求14所述的方法，其中脂质体成分没有形成选自脂质体、粒子、囊泡、微球体、单层和多层的脂质囊泡的结构。
23.一种提高分子材料输递进入或穿过个体皮肤上输递位点的方法，它包括以下步骤：
(a)同时或相继使用被输递至皮肤上输递位点的分子材料与含有负电荷脂质类的脂质体成分；
(b)在皮肤上的输递位点与(a)项中的分子材料和脂质体成分分别同时或相继使用1至60次电脉冲，其中电脉冲的持续时间约为10微秒至200毫秒，脉冲电压约为80至200V，以产生电穿孔并能输递分子材料进入或穿过皮肤，同时，当脂质体成分存在时被输递的分子材料的数量较脂质体成分不存在时要多。
24.根据权利要求23所述的方法，其中被输递的分子材料没有被脂质体成分包裹。
25.根据权利要求23所述的方法，其中分子材料选自药物、核酸、肽、多肽、抗体、免疫调节剂以及生物反应修饰剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中被输递的有效的分子材料选自治疗剂、预防剂、化妆品、基因治疗剂和预防用药。
27.根据权利要求23所述的方法，其中在皮肤上的输递位点使用的分子材料、脂质体成分和至少一次的电脉冲选自下表(a)至(p)的一系列输递模式： 输递模式 对皮肤使用的分子材料 对皮肤使用的脂质体成分 对皮肤使用的分子材料-脂质体成分混合物 对皮肤使用至少一次电脉冲 (a) 1  2  Na  3 (b) 1  3  Na  2，4 (c) 2  3  Na  1 (d) 2  4  Na  1，3，5 (e) 4  2  Na  1，3，5 (f) 3  2  Na  1 (g) 3  1  Na  2，4 (h) 2  1  Na  3 (i) 2  3  Na  1，4 (j) 3  2  Na  1，4 (k) na  Na  1  2 (l) na  Na  2  1 (m) na  Na  2  1，3 (n) 1  1  Na  1 (o) na  Na  1  1 (p) 3  1  na  2
表中，(i)数字1、2、3、4、5表示相继事件中第一、二、三、四、五的顺序，(ii)每一格中出现的数字相同就表示各事件同时进行，(iii)每一格中出现的数字不同就表示各事件相继进行，(iv)在一种输递模式中一个事件可以多次发生，(v)“na”表示该事件不适用。
28.根据权利要求23所述的方法，其中至少一次的电脉冲通过表面电极输递。
29.根据权利要求28所述的方法，其中表面电极选自弯曲电极(meanderelectrodes)，微型插接电极(micropatch electrodes)，卡规(caliper)或其它小型板状电极(plate electrodes)。
30.根据权利要求23所述的方法，其中至少一次的电脉冲通过侵入式电极(invasive electrode)输递。
31.根据权利要求30所述的方法，其中侵入式电极(invasive electrode)是一种微针体阵列。
32.根据权利要求23所述的方法，其中脂质体成分选自脂质体、粒子、囊泡、微球体、单层和多层的脂质囊泡结构。
33.根据权利要求23所述的方法，其中脂质体成分没有形成选自脂质体、粒子、囊泡、微球体、单层和多层的脂质囊泡的结构。
34.一种提高皮肤SC层通透性的方法，它包括将至少一次的加在皮肤SC层的电脉冲与含带负电荷脂质类的脂质体成分同时或相继使用，其中脂质体成分没有包裹将被输递至SC层的分子材料，SC层的通透性是由孔洞形成的时间测定的，且这个值要高于不含脂质体成分时的值。
35.根据权利要求34所述的方法，其中电场强度约为0.05至5kV/cm。
36.根据权利要求35所述的方法，其中电脉冲的持续时间约为10微秒至200毫秒。
37.根据权利要求34所述的方法，其中带有负电荷的脂质类是磷脂类。
38.根据权利要求37所述的方法，其中磷脂类选自DOPC和DOPPOG。
39.根据权利要求38所述的方法，其中DOPG与DOPC的比例为1∶1。
40.根据权利要求34所述的方法，其中脂质体成分选自脂质体、粒子、囊泡、微球体、单层和多层的脂质囊泡结构。
41.根据权利要求34所述的方法，其中脂质体成分没有形成选自脂质体、粒子、囊泡、微球体、单层和多层的脂质囊泡的结构。
42.根据权利要求1所述的方法，其中带有负电荷的脂质类是游离脂肪酸。
43.根据权利要求23所述的方法，其中带有负电荷的脂质类是游离脂肪酸。
44.根据权利要求34所述的方法，其中带有负电荷的脂质类是游离脂肪酸。
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