CN1369707A - 一种生物膜色谱介质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种生物膜色谱介质是以硅胶作为基质再固载化脂质体而得到的。这种介质所填充的生物膜色谱柱可与液相色谱仪匹配用于药物的细胞膜通透能力的测定,所得结果与药物的小肠吸收系数有很好的线性相关性,线性相关系数可达0.9365。由于这种新型生物膜色谱柱同时有较好的分离功能,因而可用于多种药物的混合样品(包括肽类药物)的分离分析,所得结果能够显示各组分在体内吸收及分布的大致趋势。它还可用于蛋白、核酸的分离纯化等领域。

Description

一种生物膜色谱介质及其制备方法

本发明涉及一种新型的生物膜色谱介质及其制备方法。这种介质填充的液相色谱柱或毛细管柱可以与高效液相色谱仪或电泳仪配套使用，可以用于建立药物(包括肽类药物)在人体内的吸收及分布的可能状况进行体外检测的模型，也可从成分复杂的样品中提取和制备一种或几种活性组分。

通过活性筛选指导新药物的开发已经有几十年的历史了，一种新药物的诞生往往是人们在筛选了8,000～10,000种化合物后才得到的，如此低的成功率是使得制药公司非常关注新的更有效的药物快速筛选方法和技术的主要原因。以往的药物筛选只能在动物模型上进行，但这种方法劳动密集，耗时间长，而且只能是小规模筛选。为克服动物模型的种种不利因素，人们试图建立各种高效、快速、准确的体外药物筛选方法。

从模拟人体细胞膜对药物的吸收的角度进行药物活性的评价，是近几年药物分析研究工作的新亮点。现在大多数的药物学家相信一种化合物细胞膜的通透性对于它的活性起关键作用，因为绝大多数的药物必须进入细胞才能表现它的活性而且内用药物还必须能透过目标细胞的细胞膜才能起作用。而且药物的活性、毒性、在体内的分布及其它生理过程都与药物在膜上的分配状况相关。因而考察化合物的细胞膜的通透性是药物活性筛选和评价的关键步骤之一。

常用的检测药物细胞膜的通透性的模型有：有机溶剂—水系统如辛醇-水，ODS(十八烷基硅胶)为固定相的反相液相色谱系统以及人工培养的单层小肠绒毛细胞模型。前两种模式都只能模拟药物在膜上的疏水作用，而无法模拟膜磷脂的极性头部与药物的相互作用，而后一种则显得繁琐、费时。

生物膜色谱模型是用于考察药物的细胞膜通透性的一种新的方法。通过药物在生物细胞膜或细胞模拟膜固定相上的色谱保留的强弱，判断药物在细胞膜上通透能力的大小。由于固定相的组成及结构与人体内的细胞膜相同或非常类似，因而实验结果能够与药物的体内吸收及分布的实际情况基本吻合。

目前，已经研制成功的生物膜色谱介质有以下两大类：一类是以硅胶为固定化载体，采用共价键合的方法，在硅胶表面接上单层磷脂类似物，如：磷脂酰胆碱类似物、磷脂酰丝氨酸类似物、磷脂酰乙醇胺类似物、磷脂酰甘油类似物等。另一类是以凝胶类基质为载体，将卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、脑磷脂等形成的脂质体，通过冻融法、疏水吸附等方法固载到凝胶基质表面。两类介质各有明显的优缺点，第一类介质由于以硅胶为基质因而能够耐受较高的柱压，可在较高流速下进行分离，而且由于采用了共价键合的方法，因而流动相中可以使用有机溶剂改善混合组分的分离效果；但最大的缺点是，硅胶表面为单磷脂层，且无流动性，与生物细胞膜的实际组成与结构都存在一定的差别，因而所得结果的生物相关性往往不很令人满意。第二类介质以凝胶类基质为载体，其生物相容性好，不可逆吸附效应小；固载对象为脂质体，脂质体的脂双层能够很好的模拟生物细胞的细胞膜；但缺点也显而易见，凝胶类基质不能耐受较高的柱压，因而分析过程中不能使用高的流速，分析速度也因此受到限制；且比表面积小，磷脂固载量低等。

本发明的目的在于提供一种既能耐受较高流速，能够实现快速分析，而且又有较好的生物相关性的生物膜色谱分离介质及其制备方法。由这种方法制备的生物膜色谱介质可以与液相色谱仪或电泳仪匹配直接对药物在生物细胞膜上的通透情况进行测定，比直接用小鼠小肠模型更加简便、省时，比辛醇—水系统模型的结果更可靠。

本发明提供的适合于检测药物膜通透性的生物膜分离介质，其特征是以活化硅胶为基质，再固载化脂质体而得到的生物膜色谱基质。所固载的脂质体可根据需要，调整不同的组成。

在上述本发明的生物膜色谱介质中，其特征是以硅胶为基质，并固载化脂质体。所述的固载化脂质体为卵磷脂或磷脂混合物。而磷脂混合物是指卵磷脂与组成生物细胞膜的天然磷脂的混合物。

另外，所述硅胶的孔径为100-300，粒径为5-20μm。所述固载化脂质体的固载量为150-300μmol/g硅胶。

本发明的生物膜色谱介质的制备包以下述步骤：

1.活化硅胶；

2.用溶解卵磷脂或磷脂混合物涂敷的有机溶剂浸泡活化硅胶；

3.除去有机溶剂，干燥硅胶用含盐的缓冲液中溶胀，然后洗去未固载的磷脂。

在上述的制备方法中，所述磷脂混合物为含上述含卵磷脂与天然磷脂的混合物，脂质体的固载量为150-300μmol/g硅胶。

在上述的制备方法中，所述硅胶活化是将硅胶用盐酸进行回流不少于1小时后，用水洗至中性。

另外，所述磷脂混合物是指卵磷脂与组成生物细胞膜的天然磷脂的混合物。所述硅胶为孔径100-300，粒径为5-20μm的硅胶，而所述有机溶剂最好为氯仿。

另外，在上述的制备方法中，有机溶剂可采用真空蒸发的方法除去。所述含盐缓冲液为含100-200mmol的NaCl溶液。

具体地说生物膜色谱介质的制备过程中首先要进行硅胶的活化，将硅胶置于15～25％(v/v)盐酸中回流3～5h，大量水洗至中性，真空干燥箱中，于10～130℃下真空干燥过夜。将活化后的硅胶置于磷脂或磷脂混合物的氯仿溶液中震20～40min，然后在30～50℃，真空条件下旋转蒸发除去有机溶剂，使磷脂与磷脂混合物涂敷在硅胶表面。使用前，用含100～200mmol NaCl的pH7.4的缓冲液浸泡2～4小时，使涂敷的卵磷脂或其混合物溶胀形成脂质体。然后多次洗涤洗去未固载的磷脂。按上述方法制备的生物膜色谱介质，磷脂的固载量可达150-300μmol/g硅胶。且由于以硅胶为基质，因而能够耐受较快流速，可在0.1～1ml/min的流速范围内进行分离与分析。下面通过实施例对本发明的色谱柱的应用作进一步的说明。

实例1：

将硅胶(天津试剂二厂制，粒径：10μm，孔径100-300)置于25％(v/v)盐酸中回流5h，用大量水洗至中性，在真空干燥箱中，于120℃下真空干燥过夜。将活化后的硅胶置于磷脂或磷脂混合物的氯仿溶液中震40分，然后在40℃，真空条件下旋转蒸发除去有机溶剂，使磷脂与磷脂混合物涂敷在硅胶表面。使用前，用含100～200mmol NaCl的pH7.4的缓冲液浸泡4小时，使涂敷的卵磷脂或其混合物溶胀形成脂质体。然后多次洗涤洗去未固载的磷脂。经检测按上述方法制得的固定相的磷脂固载量在160-200μmol/g硅胶。

实例2：用实施例1所制备的生物膜色谱柱对聚乙二醇、甘露糖、氢化可的松、皮质甾酮、水杨酸、华法令等六种样品分别在pH5.4，pH7.0，pH7.4三种含150mM NaCl的磷酸盐缓冲液为流动相的条件下进行分离分析。图1显示pH7.4时的分离谱图。

对三组分离结果进行分析，取这六种样品的保留时间与分子量的比值的对数值，并对三种pH下的对数值进行平均计算后，与六种样品的小肠吸收常数进行拟合，结果显示，拟合线性方程为y＝0.032x-3.01，线性相关系数为0.9365。

实例3，用实施例1所制备的50×4.6mm i.d.的生物膜色谱柱对中药当归的甲醇提取液进行分离分析，流动相为含150mM NaCl的pH7.4的磷酸盐缓冲液，分离结果如图2所示。

由上述实例的结果可知，本发明的生物膜色谱介质的制备过程简便。这种介质所填充的生物膜色谱柱可与液相色谱仪匹配用于药物的细胞膜通透能力的测定，所得结果与药物的小肠吸收系数有很好的线性相关性。

对附图的简单说明。

图1为混合样品的拆分谱图。图中，1-水杨酸，2-甘露醇，3-华法令，4-聚乙二醇，5-氢化可的松，6-皮质甾酮。谱图为200nm下的检测结果。

图2为当归的甲醇提取液在生物膜色谱柱上的分离谱图。谱图为200nm下的检测结果。

Claims (10)

1.一种生物膜色谱介质，其特征是以硅胶为基质，并固载化脂质体。

2.按照权利要求1所述的生物膜色谱介质，其特征在于所固载化脂质体为卵磷脂或磷脂混合物，而磷脂混合物是指卵磷脂与组成生物细胞膜的天然磷脂的混合物。

3.按照权利要求1所述的生物膜色谱介质，其特征在于所述硅胶的孔径为100-300，粒径为5-20μm。

4.按照权利要求1、2或3所述的生物膜色谱介质，其特征在于所述固载化脂质体的固载量为150-300μmol/g硅胶。

5.一种按权利要求1所述生物膜介质的制备方法，包括硅胶活化，用溶解卵磷脂或磷脂混合物的有机溶剂浸泡活化硅胶，除去有机溶剂，干燥硅胶用含盐缓冲液浸泡，然后洗去未固载的磷脂。

6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述硅胶活化是将硅胶用盐酸进行回流不少于1小时后，用水洗至中性。

7.按权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述硅胶为孔径100-300，粒径为5-20μm，所述磷脂混合物是指卵磷脂与组成生物细胞膜的天然磷脂的混合物。

8.按权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为氯仿。

9.按权利要求5所述的制备方法，其特征在于有机溶剂采用真空蒸发的方法除去。

10.按权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述含盐缓冲液为含100-200mmolNaCl缓冲液。

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