CN1302905A - 含脱氧核糖核酸类物质防伪识别材料的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于一种含金属离于－脱氧核糖核酸类物质的防伪识别材料,其制作方法是将配位能力强的金属离子的可溶性盐水溶液与DNA溶液混合反应,经乙醇沉淀,制得M－DNA物质,将其溶于水中,加入明胶、糊精、可溶性淀粉的水溶液、或市售普通胶水、或印油、或油墨制成涂布液或印刷材料类的防伪识别材料。本发明方法工艺简单,防伪材料的保密性能强,检测方法多样、快速、准确。
Description
本发明涉及一种特殊材料的制作方法，具体地说是含金属离子—脱氧核糖核酸类物质的防伪识别材料的制作方法。
WO 87/0683介绍了一种基于脱氧核糖核酸(DNA)的防伪方法，其基本过程为在特定商品上加上一段长度为1-10kb的DNA作为信号(Signal)分子，利用DNA的双链互补特性再获得一个探针DNA分子，根据标记探针DNA分子与信号DNA分子杂交信号，证实信号分子的存在，判定商品的真伪。该方法中，虽然DNA具有保密程度高，不易被破译的特点，但缺点在于信号DNA分子的检测手段为分子杂交，不仅繁冗、耗时，且准确性有限，限制了该技术的实际应用。后来，张荃等人又建立了一种利用PCR(聚合酶链式反应)检测的DNA防伪技术(第一届全国防伪技术研讨会论文集，P149)，并进行了实用性研究。它是用已知特定序列(引物序列)的密码标志DNA混于胶水中贴在商品标签上，检测时将其溶解后通过PCR反应及电泳分析，来确定密码标志DNA的存在，从而判定商品的真伪。该方法的特点是特异性好，检测灵敏度高，不改变商品的特性，缺点是检测时间需3-5小时，费时费力。中国专利97120275.3提供了一种光化学信息基因防伪方法，将光化学材料嫁接到DNA上，利用光化学性质进行检测，但由于制备工艺比较复杂，对仪器要求较高，因此目前还没有被广泛应用。
本发明的目的是提供一种利用配位能力强的金属离子与DNA作用，将其引入特定序列的DNA中，得到多重特性的含M-DNA(金属离子-脱氧核糖核酸)类物质的防伪识别材料的制作方法，该方法工艺简单，所制得的材料既可以通过紫外光、核加密检测仪进行快速检测，也可通过PCR手段进行生物检测。
本发明的目的是这样实现的：将配位能力强的金属离子，如Cu2+、Zn2+、Fe3+、Co2+、Ti4+、Cr3+、Mn2+或Ni2+的水溶性盐，如硝酸盐或氯化物，用无菌去离子水(以下文中所说使用的水，均为无菌去离子水)配成浓度为10-4mol/l的溶液，再与浓度为0.1μg/μl的特定序列的DNA水溶液按体积比20∶1-5的比例混合，在35-40℃温浴中反应2-3小时，加入反应混合液体积1/10的4mol/l的NaAc水溶液，2.5倍体积的无水乙醇，冷冻30min.，高速离心，所得沉淀重新溶于5-10倍于反应混合液体积的水中，再分别加入500-1000倍体积的15％的明胶水溶液、15％的糊精水溶液、15％的可溶性淀粉水溶液、市售普通胶水、印油、或油墨中制成涂布液或印刷材料类的防伪识别材料。
将用上述方法制作的防伪识别材料涂或印在约1cm2面积的纸上，晾干后在GD-Ⅱ核加密检测仪上检测，在坐标206处有特征吸收，检测范围在10-7-10-9g；将涂或印有该材料的纸在水中浸泡1-3小时后，离心，取上面清夜，调节到PH值大于4，在电泳测试中进行PCR扩增，将看不到扩增带；将涂或印有该材料的纸溶于水中，定容后测定紫外光谱，在一定波长处的吸收强度将随M-DNA中金属离子含量在一定范围内增高而增高。用纯质粒DNA或用上述金属离子以外的配位能力弱的金属离子制成的M-DNA进行对比检测实验，结果是：在GD-Ⅱ核加密检测仪上检测不到特征吸收；在电泳测试中进行PCR扩增，将看到扩增带；在紫外光谱测试中，吸收强度不随M-DNA中金属离子含量的变化而变化。
本发明与现有技术相比，具有的优点是：DNA结构中具有很多负电子基团，如磷酸氧、碱基氮等，因此能与配位能力强的金属离子发生作用。通过大量艰苦的实验证明，配位能力弱的金属离子不能与DNA发生此类的作用或作用很弱。配位能力强的金属离子可以插入到DNA双链问，引起DNA构象发生变化或与DNA的磷酸酯氧和碱基发生络合作用，从而引起DNA电子吸收光谱的变化。由于将配位能力强的金属离子引入到DNA中，利用其特征光谱和核加密检测性质，可以特征定量快速检测，从而大大缩短了检测时间；进行电泳测试时，由于配位能力强的金属离子结合到DNA上，本身得不到扩增结果，只有在水溶液PH值小于4的特殊处理条件下，金属离子与DNA作用大大降低，才能扩增出来，这样就加强了防伪的保密程度，使其很难被破译，也就很难被仿制；本发明的防伪材料制作简单，不需复杂工艺；检测方便快捷，可用紫外吸收、核加密检测仪或PCR检测；直接涂布或粘在商品标签上，或印制成商品标签均可达到安全可靠的防伪目的。
实施例1
取浓度为0.1μg/μlpBR322的质粒DNA20μl，分别加入浓度为10-4mol/l的Co2+(CoCl2)水溶液1μl,2μl,3μl,4μl,5μl，再分别加水至总体积100μl，35-40℃温浴2-3小时，加入10μl的4mol/l的NaAc水溶液，250μl的无水乙醇，冷冻30min，高速离心，沉淀用70％乙醇和无水乙醇充分洗涤，得含不同钴离子含量的Co-DNA淡粉色沉淀，将其分别重新溶于100μl水中，取其中20μl分别溶于10ml 15％的明胶水溶液、10ml 15％糊精水溶液、10ml 15％可溶性淀粉水溶液、1g市售普通胶水、0.1ml印油、1g油墨(天津戈德公司提供)中，制成含Co-DNA的涂布液或印刷材料型的防伪识别材料。将该材料涂或印在纸上(1cm2面积)，晾干，制得含Co-DNA的防伪标签。
将含不同金属离子含量的Co-DNA定容后测定紫外光谱，随着Co-DNA中Co2+含量的增加，在260nm处的吸收峰不变化，而在210nm处吸收峰呈梯度增高，当Co2+加到一定量时，吸收峰不再变化，即经达到饱和。证明该防伪物质的存在。
将含Co-DNA的防伪标签在GD-Ⅱ型核加密检测仪上检测，Co-DNA在坐标206处有特征吸收，检测范围在10-7-10-9g。
将含Co-DNA的防伪标签在水中浸泡1-3小时，离心，取上清夜各30μl，分别调PH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，反应30min.后加入无水乙醇沉淀，所得产物进行PCR扩增，再取30μl没有处理的进行扩增，并与纯质粒DNA相比较，不能看到扩增带，说明该防伪物质的存在，这是因为Co2+键合到了DNA的碱基上，影响了配对能力，从而无法扩增；再取上述清夜，调到PH＜4，进行PCR扩增，并与纯质粒DNA比较，可以看到扩增带，这是因为在PH＜4的情况下，Co2+与DNA作用大大降低，不再影响碱基配对能力，故可以扩增出来。
实施例2
取浓度为0.1μg/μl pUC19的质粒DNA 20μl，分别加入浓度为10-4mol/l的Cu2+(CuCl2)水溶液1μl,2μl,3μl,4μl,5μl，再分别1加水至总体积100μl，35-40℃温浴2-3小时，加入10μl4mol/l的NaAc水溶液，250μl无水乙醇，冷冻30min，高速离心，沉淀用70％乙醇和无水乙醇充分洗涤，得含不同铜离子含量的Cu-DNA淡蓝色沉淀，将其分别重新溶于100μl水中，取其中20μl分别溶于10ml 15％的明胶水溶液、10ml 15％糊精水溶液、10ml 15％可溶性淀粉水溶液、1g市售普通胶水、0.1ml印油、1g油墨(天津戈德公司提供)中，制成含Cu-DNA的涂布液或印刷材料型的防伪识别材料。将该材料涂或印在纸上(1cm2面积)，晾干，制得含Cu-DNA的防伪标签。
将含不同金属离子含量的Cu-DNA定容后测定紫外光谱，随着Cu-DNA中Cu2+含量的增加，在210nm和260nm处的吸收峰呈梯度增高，当Cu2+加到一定量时，在200-320nm形成一个宽的吸收峰，而且强度不再变化，即经达到饱和。证明该防伪物质的存在。
将含Cu-DNA的防伪标签在GD-Ⅱ型核加密检测仪上检测，Zn-DNA在坐标212处有特征吸收，检测范围在10-7-10-9g。
将含Cu-DNA的防伪标签在水中浸泡1-3小时，离心，取上清夜各30μl，分别调PH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，反应30min.后加入无水乙醇沉淀，所得产物进行PCR扩增，再取30μl没有处理的进行扩增，并与纯质粒DNA相比较，不能看到扩增带，说明该防伪物质的存在，这是因为Cu2+键合到了DNA的碱基上，影响了配对能力，从而无法扩增；再取上述清夜，调到PH＜4，进行PCR扩增，并与纯质粒DNA比较，可以看到扩增带，这是因为在PH＜4的情况下，Cu2+与DNA作用大大降低，不再影响碱基配对能力，故可以扩增出来。
实施例3
取浓度为0.1μg/μl pBR322的质粒DNA 20μl，分别加入浓度为10-4mol/l的Mg2+(MgCl2)水溶液1μl,2μl,3μl,4μl,5μl，再分别加水至总体积100μl，35-40℃温浴2-3小时，加入10μl4mol/l的NaAc水溶液，250μl无水乙醇，冷冻30min，高速离心，沉淀用70％乙醇和无水乙醇充分洗涤，得含不同镁离子含量的白色沉淀，将其分别重新溶于100μl水中；取10μl进行琼脂糖凝胶电泳，将DNA部分切下，晾干，制成薄膜，在GD-Ⅱ型核加密检测仪上检测，不能检测到Mg的特征吸收；取10μl进行PCR扩增，并与纯质粒DNA相比较，可以看到扩增带。这些检测结果说明Mg2+配位能力弱，并未与DNA发生化学键合作用。
实施例4
取浓度为0.1μg/μl0.1μg/μl pUC19的质粒DNA20μl，分别加入浓度为10-4mol/l的Ca2+(CaCl2)水溶液1μl,2μl,3μl,4μl,5μl，再分别加水至总体积100μl，35-40℃温浴2-3小时，加入10μl4mol/l的NaAc水溶液，250μl无水乙醇，冷冻30min，高速离心，沉淀用70％乙醇和无水乙醇充分洗涤，得含不同钙离子含量的白色沉淀，重新溶于100μl水中；取10μl进行琼脂糖凝胶电泳，将DNA部分切下，晾干，制成薄膜，在GD-Ⅱ型核加密检测仪上检测，不能检测到Ca的特征吸收；取10μl进行PCR扩增，并与纯质粒DNA相比较，可以看到扩增带。这些检测结果说明Ca2+的配位能力弱，并未与DNA发生化学键合作用。
实施例5
取浓度为0.1μg/μl的Lambda DNA20μl，分别加入浓度为10-4mol/l的Zn2+(Zn(NO3)2)水溶液1μl,2μl,3μl,4μl,5μl，再分别加水至总体积100μl，35-40℃温浴2-3小时，加入10μl4mol/l的NaAc水溶液，250μl无水乙醇，冷冻30min，高速离心，沉淀用70％乙醇和无水乙醇充分洗涤，得含不同锌离子含量的Zn-DNA白色沉淀，将其分别重新溶于100μl水中，取其中20μl分别溶于10ml 15％的明胶水溶液、10ml 15％糊精水溶液、10ml 15％可溶性淀粉水溶液、1g市售普通胶水、0.1ml印油、1g油墨(天津戈德公司提供)中，制成含Zn-DNA的涂布液或印刷材料型防伪识别材料。将该材料涂或印在纸上(1cm2面积)，晾干，制得含Zn-DNA的防伪标签。
将含不同金属离子浓度的产物定容后测定紫外光谱，随着Zn-DNA中Zn2+含量的增加，在260nm处的吸收峰不变化，而在210nm处吸收峰呈梯度增高，当Zn2+加到一定量时，吸收峰不再变化，即经达到饱和。证明该防伪物质的存在。
将含Zn-DNA的防伪标签在GD-Ⅱ型核加密检测仪上检测，Zn-DNA在坐标222处有特征吸收，检测范围在10-7-10-9g。
将含Zn-DNA的防伪标签在水中浸泡1-3小时，离心，取上清夜各30μl，分别调PH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，反应30min.后加入无水乙醇沉淀，所得产物进行PCR扩增，再取30μl没有处理的进行扩增，并与纯质粒DNA相比较，不能看到扩增带，说明该防伪物质的存在，这是因为Zn2+键合到了DNA的碱基上，影响了配对能力，从而无法扩增；再取上述清夜，调到PH＜4，进行PCR扩增，并与纯质粒DNA比较，可以看到扩增带，这是因为在PH＜4的情况下，Zn2+与DNA作用大大降低，不再影响碱基配对能力，故可以扩增出来。
实施例6
取浓度为0.1μg/μl的φX174 DNA20μl，分别加入浓度为10-4mol/l的Fe3+(FeCl3)水溶液1μl,2μl,3μl,4μl,5μl，再分别加水至总体积100μl,35-40℃温浴2-3小时，加入10μl4mol/l的NaAc水溶液，250μl无水乙醇，冷冻30min，高速离心，沉淀用70％乙醇和无水乙醇充分洗涤，得含不同铁离子含量的Fe-DNA淡黄色沉淀，将其分别重新溶于100μl水中。取其中20μl分别溶于10ml 15％的明胶水溶液、10ml 15％糊精水溶液、10ml 15％可溶性淀粉水溶液、1g市售普通胶水、0.1ml印油、1g油墨(天津戈德公司提供)中，制成含Fe-DNA的涂布液或印刷材料型防伪识别材料。将该材料涂或印在纸上(1cm2面积)，晾干，制得含Fe-DNA的防伪标签。
将含不同金属离子含量的Fe-DNA定容后测定紫外光谱，随着Fe-DNA中Fe3+含量的增加，在260nm处的吸收峰不变化，而在210nm处吸收峰呈梯度增高，当Fe3+加到一定量时，吸收峰不再变化，即经达到饱和。证明该防伪物质的存在。
将含Fe-DNA的防伪标签在GD-Ⅱ型核加密检测仪上检测，Zn-DNA在坐标202处有特征吸收，检测范围在10-7-10-9g。
将含Fe-DNA的防伪标签在水中浸泡1-3小时，离心，取上清夜各30μl，分别调PH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，反应30min.后加入无水乙醇沉淀，所得产物进行PCR扩增，再取30μl没有处理的进行扩增，并与纯质粒DNA相比较，不能看到扩增带，说明该防伪物质的存在，这是因为Fe3+键合到了DNA的碱基上，影响了配对能力，从而无法扩增；再取上述清夜，调到PH＜4，进行PCR扩增，并与纯质粒DNA比较，可以看到扩增带，这是因为在PH＜4的情况下，Fe3+与DNA作用大大降低，不再影响碱基配对能力，故可以扩增出来。
Claims (3)
1．一种含脱氧核糖核酸类物质防伪识别材料的制作方法，其特征在于：具体操作步骤如下，将Cu2+、Zn2+、Fe3+、Co2+、Ti4+、Cr3+、Mn2+或Ni2+的硝酸盐或氯化物用无菌去离子水(以下文中所说使用的水，均为无菌去离子水)配成浓度为10-4mol/l的溶液，再与浓度为0.1μg/μl的特定序列DNA水溶液按体积比20∶1-5的比例混合，在35-40℃温浴中反应2-3小时，加入反应混合液体积1/10的4mol/l的NaAc水溶液，2.5倍体积的无水乙醇，冷冻30min.，高速离心，所得沉淀重新溶于5-10倍于反应混合液体积的水中，再分别加入500-1000倍体积的15％的明胶水溶液、15％的糊精水溶液、15％的可溶性淀粉水溶液、市售普通胶水、印油、油墨中制成涂布液或印刷材料类的防伪识别材料。
2．根据权利要求1所述的一种含脱氧核糖核酸类物质防伪识别材料的制作方法，其特征在于：所用的金属盐是氯化铜、硝酸铜、氯化锌、硝酸锌、氯化钴、硝酸钴、氯化铁、硝酸铁。
3．根据权利要求1所述的一种含脱氧核糖核酸类物质防伪识别材料的制作方法，其特征在于：所用的特征序列DNA为质粒DNA和Lambda DNA。
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| WO2014019099A1 (es) | 2012-07-31 | 2014-02-06 | Juan Carlos Jaime | Procedimiento para obtener y detectar un marcador de objetos a identificar, el marcador, método para la autenticación y método para la verificación |
| WO2016134680A1 (en) | 2015-02-26 | 2016-09-01 | Univerzita Palackeho V Olomouci | System and method for verification of product authenticity |
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Legal Events
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