CN1250097A - 一种新的人基因编码序列、其编码的多肽及制法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地,本发明提供了人HnudC的cDNA序列,该序列的编码蛋白是大鼠RnrdC的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。

Description

一种新的人基因编码序列、其编码的多肽及制法

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人HnudC的cDNA序列，该序列的编码蛋白是大鼠RnudC的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。

nudC、nudA、nudF、RnudC和DnudC是在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)大鼠及果蝇中发现的几个基因，它们被认为与细胞器正确定位、细胞内物质小泡转运及细胞核的运动等作用有关。在高等生物体内，催乳素(PRL)调节着淋巴细胞的增殖、活化及衰亡。而PRL对淋巴细胞的调节作用主要是从激活大量T淋巴细胞的早期表达基因开始的。这些基因包括干扰素调节因子-1、PRL-受体、鸟氨酸脱羧酶、c-myc、nud等。研究发现，nudC、RnudC和DnudC在结构和功能上都高度保守，nudC调节着细胞内物质小泡转运及细胞核运动。细胞内物质的小泡转运对于细胞内蛋白分泌与运输，细胞的分化生长起着重要的作用。nudC在生物体内与动力蛋白及动力蛋白激活蛋白复合物相互作用，从而使得细胞核与微管系统偶联，产生正常的细胞核运动(MolecularEndocrinology，1995，9(3)，312-318)

nudC基因在各种不同的细胞类型与种群中都广泛存在，如在纤维细胞和神经细胞中。nudC最早是从构巢曲霉中发现的一个基因。它是由Osmani A.H.等人于1990年从构巢曲霉cDNA文库中克隆得到的一个基因(J Cell Biol.1990，111：543-551)，它与以后在大鼠及果蝇中分别发现的基因RnudC和DnudC具有较高的同源性并具有相似的功能。DnudC是于1997年由Cunniff J.等人从果蝇中克隆的(Mech De 1997，66(1-2)：55-68)。其后不久，Shelli M等人从大鼠中分离得到了RnudC基因(Exp.Cell.Res 1998，238，23-32)。研究发现，这些基因不仅在结构上高度保守，而且在功能上也高度保守。

本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码人的一种与大鼠RnudC同源的蛋白，本发明的与大鼠RnudC同源的人基因被命名为HnudC。

本发明的另一个目的是提供一种新的蛋白，该蛋白被命名为HnudC蛋白。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人HnudC蛋白的方法。

本发明还提供了这种人HnudC核苷酸序列和蛋白的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸43-1038位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中43-1038位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的HnudC蛋白多肽，它包括：具有SEQ IDNO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有HnudC蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成HnudC蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成HnudC蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达HnudC蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有HnudC蛋白活性的多肽。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为1091个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于43-1038位核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“HnudC蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中43-1038位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框43-1038位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中43-1038位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸43-1038位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸43-1038位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人HnudC相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“HnudC蛋白多肽”指具有HnudC蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与HnudC相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括HnudC蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与HnudC DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗HnudC多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含HnudC多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括HnudC多肽的可溶性片段。通常，该片段具有HnudC多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供HnudC蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然HnudC多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括HnudC多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内HnudC的表达。

本发明还包括一种可用作探针的核苷酸分子，该分子通常具有HnudC核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码HnudC的核酸分子。

本发明还包括检测HnudC核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于HnudC多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对HnudC DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人HnudC基因产物或片段。较佳地，指那些能与HnudC基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制HnudC蛋白的分子，也包括那些并不影响HnudC蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的HnudC基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的HnudC基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达HnudC或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断HnudC功能的抗体以及不影响HnudC功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用HnudC基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与HnudC基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人HnudC核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

在本发明的一个实施例中，人HnudC的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人睾丸λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A1：5′-ACTAGAGTGCAGAGCTCCGGGAC-3′和反向引物A2：5′-AAGTTGGGTGGTTGCAGCTCAGC-3′，进行PCR，获得1100bp(A1/A2)的目的片段。测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。

nudC、nudA、nudF、RnudC和DnudC被认为与细胞器定位、细胞内物质小泡转运及细胞核的运动有关。细胞内物质小泡转运及细胞核运动是真核生物中普遍存在的现象。细胞内物质小泡转运对于细胞内蛋白分泌，细胞的分化生长起着重要的作用。而在淋巴细胞中，细胞核的正确地运动与定位可能在淋巴细胞的增殖、活化及衰亡过程中起着关键的作用。本发明的HnudC与大鼠的RnudC高度同源，同时与nudC、DnudC的同源性也较高，因而我们认为它是RnudC在人中的一个同源基因，并且与RnudC(以及nudC、DnudC)有着相似的生物学功能，这些功能包括细胞器定位、物质小泡转运及细胞核的运动等方面。

在附图中，

图1为本发明的人HnudC与大鼠RnudC的核酸序列的同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。

图2为本发明的人HnudC蛋白与大鼠RnudC蛋白的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似的氨基酸是：A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

HnudC的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人睾丸λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A1：5′-ACTAGAGTGCAGAGCTCCGGGAC-3′(SEQ ID NO：1)正向引物，寡核苷酸A2：5′-AAGTTGGGTGGTTGCAGCTCAGC-3’(SEQ ID NO：2)为反向引物，进行PCR。A1、A2引物对的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、70℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟；电泳检测得到的PCR片断，以A1、A2为引物对扩增出的目的片段长约1100bp。

2.PCR产物的测序

将PCR扩增产物分别与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QLAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiThermEXCEL^TM DNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1091bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于43-1038位核苷酸。

根据得到的全长cDNA序列推导出HnudC的氨基酸序列，共331个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。

实施例2

同源比较和结构分析

用HnudC的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它们与大鼠RnudC基因及其编码蛋白具有极高同源性，在核酸水平上的同一性(identity，又称为相同性)都达到了84％，蛋白水平上的同一性达到95％、相似性达到了97％。所以，可以确定HnudC是RnudC在人中的同系物。

特别是实验证明DnudC、nudC和RnudC的开放阅读框中都含有一个潜在的核定位信号区域，这一区域为酸性区域，有着保守的氨基酸序列，本发明的HnudC蛋白也含有这一保守的氨基酸序列，具体为SEQ ID NO.4的67-75位氨基酸，即LQNFLLHGT。

另外，DnudC、nudC和RnudC这些蛋白的C末端94个氨基酸的相似性和同源性都很高，RnudC与nudC相应区域的同源度达68％(Shelli M.A.等人，MolecularEndocrinology，9(3)：312-8，1995)。这一区域在进化上都是高度保守的，本发明HnudC蛋白的这一区域，具体为SEQ ID NO.4的237-330位氨基酸，即序列：

 AVFLWNMDKYTMIRKLEGHHHDVVACDFSPDGALLATASYDTRVY

IWDPHNGDILMEFGHLFPPPTPIFAGGANDRWVRSVSFSHDGLHVASL，

而且，就这一保守区域而言，本发明HnudC与RnudC仅相差2个氨基酸，而且其中一个氨基酸是相似氨基酸替换(图2)。如此高的保守性进一步暗示，这些基因可能构成一个家族。并且根据结构决定功能，结构相似功能相似的原理，本发明的HnudC应具有与这些基因相同或相似的功能。

nudC是生物体内依赖于PRL(催乳素，一种多肽激素)的T淋巴细胞因子早期表达的基因。DnudC、nudC和RnudC与生物体内的细胞器定位、小泡物质转运、蛋白分泌及细胞核运动等作用有关。

众所周知，细胞内小泡转运及核运动在细胞分化、生长及衰亡的过程中起着重要的作用。因此本发明的HnudC在生物体内起着重要作用。

细胞核的运动主要依赖于微管系统(MTs)。有实验表明，在高等真核生物中，nudC可能是动力蛋白及动力蛋白激活蛋白复合物的组成部分，与正确的细胞器定位，如高尔基体的定位等有关。nudC与动力蛋白及动力蛋白激活蛋白作用，使T细胞中高尔基体正确定位，从而介导细胞核与微管系统偶联，产生正常的核运动。而在淋巴细胞中，细胞核的正常运动及其定位对其活化、增殖及衰亡起着重要的作用。除此之外，从真核生物体内还分离得到了nudA、nudG、nudF等另三个nud基因，它们的蛋白产物，都与细胞核的运动有关。在nudC缺陷型菌株中，细胞核的运动将被明显阻止。这说明nudC对于T细胞细胞核的正确运动与定位有着重要作用(Exp.Cell.Res.1998，238，23-32)，nudC很可能是PRL(催乳素)调节T细胞活性的关键中间调节物。这暗示，本发明的人HnudC在人体细胞细胞核的运动和定位中也发挥着类似的作用。

同时，RnudC还参与细胞内物质小泡转运过程。小泡运输是细胞内物质运输的一种方法，nudC就是参与细胞膜组织产生的小泡与其他蛋白融合，并将这些蛋白运送到生物生长点，以促进这些组织的生长(Exp.Cell.Res.1998，238，23-32)。这暗示，本发明的人HnudC也可能参与物质小泡的转运过程。

本发明的人HnudC除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人HnudC还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人HnudC的N端与大鼠或果蝇或构巢曲霉的HnudC的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。

针对本发明人HnudC的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。

此外，本发明人HnudC核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人HnudC的表达水平或者抑制人HnudC的过度表达。由于人HnudC在细胞中具有重要的功能，因此该基因的缺失或异常表达会造成多种病症。本发明的人HnudC核苷酸序列和多肽能用于这些相关疾病的治疗。本发明的人HnudC蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人HnudC缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

实施例3

HnudC在大肠杆菌中的表达

在该实施例中，将编码HnudC的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得HnudC cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为：

5′-GAACGGATCCATGGGCGGAGAGCAGGAGG-3′(SEQ ID NO.5)，

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的HnudC编码序列的19个核苷酸；

3′端引物序列为：

5’-GCAGGTCGACCTAGTTGAATTTAGCCTTG-3’(SEQ ID NO.6)，

该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和HnudC的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用BamHI、SalI消化pQE-9载体以及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证HnudC的cDNA片段已正确插入了载体。

在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞34小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的HnudC。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱HnudC。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约40KDa。

此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。

实施例4

HnudC在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

在该实施例中，将编码HnudC的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得HnudC cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为：

5′-GAACGGATCCATGGGCGGAGAGCAGGAGG-3′(SEQ ID NO.7)

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的HnudC编码序列的19个核苷酸；

3′端引物序列为：

5’-GCAGCGGCCGCTAGTTGAATTTAGCCTTG-3’(SEQ ID NO.8)

该引物含有XmaIII限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和HnudC的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用BamHI、XmaIII消化pcDNA3载体以及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用EcoRI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证HnudC的cDNA片段已正确插入了载体。

质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为40KDa。

此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。

实施例5

制备抗体

将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀HnudC基因翻译产物的能力加以评估。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                       序列表(1)一般信息：(i)申请人：上海新黄浦复旦基因工程有限公司(ii)发明名称：(iii)序列数目：8(2)SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征

(A)长度：23碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ACTAGAGTGC AGAGCTCCGG GAC                   23(2)SEQ ID NO：2的信息(i)序列特征

(A)长度：23碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：2AAGTTGGGTG GTTGCAGCTC AGC                   23(2)SEQ ID NO.3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1091bp

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO.31 ACTAGAGTGCAGAGCTCCGGGACGTGGATCGGAGCCGGCGCGATGGGCGGAGAGCAGGAG61 GAGGAGCGGTTCGACGGCATGTTGCTGGCCATGGCTCAGCAGCACGAGGGCGGCGTGCAG121 GAGCTTGTGAACACCTTCTTCAGCTTCCTTCGACGCAAAACAGACTTTTTCATTGGAGGA181 GAAGAAGGGATGGCAGAGAAGCTTATCACACAGACTTTCAGCCACCACAATCAGCTGGCA241 CAGAAGACCCGGCGGGAGAAGAGAGCCCGGCAGGAGGCCGAGCGGCGGGAGAAGGCGGAG301 CGGGCGGCCAGACTGGCCAAGGAAGCCAAGTCAGAGACCTCAGGGCCCCAGATCAAGGAG361 CTAACTGATGAAGAGGCAGAGAGGCTGCAGCTAGAGATTGACCAGAAAAAGGATGCAGAG421 AATCATGAGGCCCAGCTCAAGAACGGCAGCCTTGACTCCCCAGGGAAGCAGGATACTGAG481 GAAGATGAGGAGGAAGATGAGAAGGACAAAGGAAAACTGAAGCCCAACCTAGGCAACGGG541 GCAGACCTGCCCAATTACCGCTGGACCCAGACCCTGTCGGAGCTGGACCTGGCGGTCCCT601 TTCTGTGTGAACTTCCGGCTGAAAGGGAAGGACATGGTGGTGGACATCCAGCGGCGGCAC661 CTCCGGGTGGGGCTCAAGGGGCAGCCAGCGATCATTGATGGGGAGCTCTACAATGAAGTG721 AAGGTGGAGGAGAGCTCGTGGCTCATTGAGGACGGCAAGGTGGTGACTGTGCATCTGGAG781 AAGATCAATAAGATGGAGTGGTGGAGCCGCTTGGTGTCCAGTGACCCTGAGATCAACACC841 AAGAAGATTAACCCTGAGAATTCCAAGCTGTCAGACCTGGACAGTGAGACTCGCAGCATG901 GTGGAAAAGATGATGTATGACCAGCGACAGAAGTCCATGGGGCTGCCAACTTCAGACGAA961 CAGAAGAAACAGGAGATTCTGAAGAAGTTCATGGATCAACATCCGGAGATGGATTTTTCC1021 AAGGCTAAATTCAACTAGCCCCTGTTTTTTCCTCCCTGAACTCTTGGGGCTGAGCTGCAA1081 CCACCCAACTT(2)SEQ ID NO.4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：331个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：多肽  (xi)序列描述：SEQ ID NO.41 Met Gly Gly Glu Gln Glu Glu Glu Arg Phe Asp Gly Met Leu Leu16 Ala Met Ala Gln Gln His Glu Gly Gly Val Gln Glu Leu Val Asn31 Thr Phe Phe Ser Phe Leu Arg Arg Lys Thr Asp Phe Phe Ile Gly46 Gly Glu Glu Gly Met Ala Glu Lys Leu Ile Thr Gln Thr Phe Ser61 His His Asn Gln Leu Ala Gln Lys Thr Arg Arg Glu Lys Arg Ala76 Arg Gln Glu Ala Glu Arg Arg Glu Lys Ala Glu Arg Ala Ala Arg91 Leu Ala Lys Glu Ala Lys Ser Glu Thr Ser Gly Pro Gln Ile Lys106 Glu Leu Thr Asp Glu Glu Ala Glu Arg Leu Gln Leu Glu Ile Asp121 Gln Lys Lys Asp Ala Glu Asn His Glu Ala Gln Leu Lys Asn Gly136 Ser Leu Asp Ser Pro Gly Lys Gln Asp Thr Glu Glu Asp Glu Glu151 Glu Asp Glu Lys Asp Lys Gly Lys Leu Lys Pro Asn Leu Gly Asn166 Gly Ala Asp Leu Pro Asn Tyr Arg Trp Thr Gln Thr Leu Ser Glu181 Leu Asp Leu Ala Val Pro Phe Cys Val Ash Phe Arg Leu Lys Gly196 Lys Asp Met Val Val Asp Ile Gln Arg Arg His Leu Arg Val Gly211 Leu Lys Gly Gln Pro Ala Ile Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Asn Glu226 Val Lys Val Glu Glu Ser Ser Trp Leu Ile Glu Asp Gly Lys Val241 Val Thr Val His Leu Glu Lys Ile Asn Lys Met Glu Trp Trp Ser256 Arg Leu Val Ser Ser Asp Pro Glu Ile Asn Thr Lys Lys Ile Asn271 Pro Glu Asn Ser Lys Leu Ser Asp Leu Asp Ser Glu Thr Arg Ser286 Met Val Glu Lys Met Met Tyr Asp Gln Arg Gln Lys Ser Met Gly301 Leu Pro Thr Ser Asp Glu Gln Lys Lys Gln Glu Ile Leu Lys Lys316 Phe Met Asp Gln His Pro Glu Met Asp Phe Ser Lys Ala Lys Phe331 Asn(2)SEQ ID NO：5的信息(i)序列特征

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：寡核苷酸  (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GAACGGATCC ATGGGCGGAG AGCAGGAGG                        29(2)SEQ ID NO：6的信息(i)序列特征

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GCAGGTCGAC CTAGTTGAAT TTAGCCTTG                        29(2)SEQ ID NO：7的信息(i)序列特征

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GAACGGATCC ATGGGCGGAG AGCAGGAGG                        29(2)SEQ ID NO：8的信息(i)序列特征

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：GCAGCGGCCG CTAGTTGAAT TTAGCCTTG                        29

Claims (14)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ IDNO.3中从核苷酸43-1038位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中43-1038位的核苷酸序列。

4.一种分离的HnudC蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。

9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。

10.一种产生具有HnudC蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成HnudC蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成HnudC蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达HnudC蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有HnudC蛋白活性的多肽。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸43-1038位。

12.一种能与权利要求4所述的HnudC蛋白多肽特异性结合的抗体。

13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。

14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。

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