CN122080098A - S-腺苷高半胱氨酸类似物、s-腺苷-l-甲硫氨酸类似物及其应用 - Google Patents

S-腺苷高半胱氨酸类似物、s-腺苷-l-甲硫氨酸类似物及其应用

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Abstract

本发明提供了S‑腺苷高半胱氨酸(SAH)类似物、S‑腺苷‑L‑甲硫氨酸(SAM)类似物及其应用，包括SAH类似物、氟烷基SAM类似物的合成，基于氟烷基SAM类似物的HMT‑MT环酶级联反应体系对生物活性分子的氟甲基化修饰，以及构建一锅酶法合成临床药物的氟代衍生物。本发明采用的SAH类似物可有效避免对应SAM类似物自发降解，用于构建基于HMT‑MT环酶级联反应体系，提高氟甲基化产物收率；确认了由MT产生的氟代中间体能被下游生物合成酶接受，从而构建了一锅酶法合成临床药物的氟代衍生物。

Description

S-腺苷高半胱氨酸类似物、S-腺苷-L-甲硫氨酸类似物及其 应用
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，尤其是涉及S-腺苷高半胱氨酸类似物、S-腺苷-L-甲硫氨酸类似物及其应用。
背景技术
氟元素特有的范德华半径、电负性和非极化性区别于其他卤素，碳-氟键替代碳-氢键会对有机分子的母体结构的偶极矩、亲脂性、代谢稳定性、膜透过性和生物利用度等产生微妙的影响。有机氟化物在材料、制药和农业化学工业中占据可观的比例，并且每年都有新的含氟分子被批准上市。含氟化合物的重要性和潜在用途使得人们对氟化反应方法产生了旺盛的需求，这极大地推动了有机氟化学的发展，越来越多的化学合成方法被应用于制备含氟分子。
由于选择性地直接构建碳-氟键较为困难，因此在合成化学中采用氟烷基化作为替代方案在分子结构中引入氟原子。目前大部分的氟烷基化试剂和前体，集中于包含三氟烷基、二氟烷基和氟烷基，以模拟在生物活性分子和药物中常见的甲基、羟甲基等基序。尽管取得了巨大的进展，但大多数试剂仅能将氟烷基转移至杂原子 (N-, O-, S-, P-) 的底物分子上。一些基于过渡金属催化的反应能实现碳-碳键的氟烷基化，但效率较低。这些化学合成方法在化学选择性、区域选择性和立体选择性上仍存在局限性。另外，氟烷基化试剂大多来源于卤代烷烃，其生产带来的环境压力不容忽视。
S-腺苷-L-甲硫氨酸 (S-adenosyl-L-methionine, SAM) 是广泛存在于有机体内甲基供体，其作为SAM依赖的甲基转移酶 (methyltransferase, MT) 的辅因子完成与生命活动相关的多种甲基化修饰，受体包括小分子、核酸、脂质、蛋白质等。典型的反应机理为：具有亲核基团的底物分子进攻SAM的侧链甲基发生SN2亲核反应，生成甲基化产物和S-腺苷高半胱氨酸 (S-adenosylhomocysteine, SAH)。生物催化氟化反应具有高效率、高选择性、高原子经济性等优点，但鲜有报道。近年来利用非天然SAM类似物，在工程化的MT催化下进行氟烷基转移的相关研究，为生产天然产物氟代衍生物提供了新的生物催化技术方案。
2021年Seebeck等人利用卤化物甲基转移酶(halide methyltransferase, HMT)催化SAH 和氟碘甲烷 (FCH2I) 生成了S-腺苷-L-(氟甲基)高半胱氨酸 (F-SAM) (SeebeckF P, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 27178–27183)。但由于该SAM类似物在生理条件下的不稳定性，仅根据分解产物推测了结构。在此基础上，他们将MT与HMT耦合构建环酶级联体系，以原位生成的F-SAM作为氟甲基供体对含N-, O-, C-底物进行氟甲基化。随后HMT回收SAH并再生F-SAM，从而克服F-SAM自发分解造成的辅因子损耗。
先行专利CN119709915A公开了一种氟甲基产物制备的方法，使用HMT与B12依赖的SAM自由基甲基转移酶构成级联反应体系，同样通过SAH与氟碘甲烷原位生成F-SAM完成不活泼碳上的氟烷基修饰。该方法还声明了一种新的氟甲基B12中间体。
先行专利CN118048338A公开了含有氟乙基的SAM类似物，其包含氟乙基侧链和硫鎓或硒鎓中心。其中，氟乙基硒代SAM (FEt-SeAM) 可以避免氟乙基的消除问题，结合来自Aspergillus clavatus的AclHMT突变体与MT突变体构建的环酶级联反应体系，高效地实现了O-、N-、S-、C-等亲核试剂的氟乙基化。其权利要求同时包括SAM依赖型甲基转移酶的突变体。
上述方案均采用HMT-MT级联策略实现SAM类似物的循环再生，该系统的催化效率受到HMT和MT的动力学特性制约，但限制循环次数的关键因素是SAM类似物的稳定性。SAM存在固有的化学不稳定性 (在pH 8下的半衰期约为16小时)，主要通过两条平行途径自发降解：分子内环化导致5'-脱氧-5'-甲硫基腺苷 (MTA) 和高丝氨酸内酯 (HSL) 的形成，而去嘌呤化导致腺嘌呤和S-核糖基甲硫氨酸的生成。F-SAM由于氟原子的引入，加速了分解过程，并且产生的5'-脱氧-5'-氟甲基硫代腺苷 (F-MTA) 进一步分解为5'-脱氧-5'-巯基腺苷、甲醛和氟化物。因此，提高氟烷基转移反应效率的关键在于获得稳定的氟烷基SAM类似物。
为了提高SAM类似物的稳定性，基于电子等排体的官能团替换被广泛采用，并有效甚至完全抑制了自发降解 (Thorson, J. S, et al. ACS Chem. Biol. 2016, 11 (9),2484-2491; Thorson, J. S, et al. ACS Chem. Biol. 2020, 15 (3), 695-705; Höbartner, C., et al. Nature Chem. 2023, 15 (11), 1523-1531)。2023年Booker等人合成了硫鎓被碲元素替换的F-SAM类似物FMeTeSAM (Booker, S. J., et al. ACS Cent.Sci. 2023, 9 (5), 905-914)。该类似物的衰变没有被提及，且能兼容多种MT完成酶促氟甲基转移反应。但一些反应的酶动力学特性显示出Te原子可能干扰了辅因子与酶的结合。并且冗长的化学合成步骤降低了该方案的原子经济性。同年Dong等人设计了脱羧的F-SAM类似物F-dcSAM，可利用脱羧SAH类似物 (dcSAH) 通过化学法和酶法合成 (Dong M., etal. ACS Catal. 2023, 13 (20), 13729-13734)。该SAM类似物相较于F-SAM表现出较强的稳定性，并能接入HMT-MT级联反应体系实现较高的氟烷基转移效率。但羧基的缺失可能干扰了F-dcSAM的结合构象，使其在某些具有严格底物识别的酶反应中发生意外的化学选择性切换。
综上，目前酶催化氟烷基转移反应通常位于生物合成通路的后期阶段，生物活性分子的氟代中间体是否能被下游后修饰酶识别尚不明确。
发明内容
本发明的目的在于提供S-腺苷高半胱氨酸类似物、S-腺苷-L-甲硫氨酸类似物及其应用，对氟烷基SAM类似物进行结构改造，使其能克服自发的分解途径，相较于F-SAM和F-dcSAM具备更优的化学稳定性，从而支撑其在MT依赖的氟烷基转移反应中表现出高效率。本发明提供一种SAH类似物用于合成氟烷基SAM类似物，使其可被MT识别，并维持正确的区域选择性和立体选择性对临床药物的生物合成前体进行氟甲基修饰。本发明提供的SAH类似物可用于构建基于氟烷基SAM类似物的HMT-MT环酶级联反应体系，从而进一步减少氟烷基SAM类似物的分解，提高氟甲基化产物收率。本发明需要确认由MT产生的氟代中间体能被下游生物合成酶接受，优化反应条件，从而构建一锅酶法合成临床药物的氟代衍生物。
为实现上述目的，本发明提供了S-腺苷-L-甲硫氨酸类似物，SAM类似物具有式I所示结构：
；
式I
其中，R1为末端酰胺或四氮唑中的一种；
R2为氟取代的C1~C10饱和或不饱和的直链或支链烷烃中的一种；
X为NH，O，S，CH；
Y为N，C；
Z为N，C。
优选的，氟取代的C1~C10饱和或不饱和的直链或支链烷烃为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。
优选的，SAM类似物具有如下任一所示结构：
。
S-腺苷高半胱氨酸类似物，SAH类似物具有式II所示结构：
；
式II
其中，R1为末端酰胺或四氮唑中的一种；
X为NH，O，S，CH；
Y为N，C；
Z为N，C；
n为1或2。
优选的，SAH类似物具有如下任一所示结构：
。
S-腺苷高半胱氨酸的化学合成方法，包括如下步骤：
由式A所示化合物制备中间体：式B所示化合物的步骤；
由式B所示化合物制备中间体：式C所示化合物的步骤；
由式C所示化合物制备中间体：式D所示化合物的步骤；
由式D所示化合物制备中间体：式E所示化合物的步骤；
由式F所示化合物制备中间体：式G所示化合物的步骤；
由式C所示化合物与式G所示化合物制备式II所示化合物的步骤；
由式E所示化合物与式G所示化合物制备式II所示化合物的步骤；
。
由于MT通常只识别(S)-SAM类似物作为底物，本发明实施例中所提供的氟甲基SAM类似物F-amSAM、F-tSAM和F-7dz-tSAM由酶法合成，以控制硫鎓中心的对映体专一性。合成方案具体为使用对应的SAH类似物通过AclHMT催化与氟碘甲烷合成并纯化。
具体的酶法合成方案如下：
将纯化的AclHMT (200 μM)，SAH类似物 (1 mM)，氟碘甲烷 (10 mM) 充分混合于缓冲溶液中，30℃摇床中，90 rpm，反应1小时。对于使用amide-SAH和tet-SAH的反应，缓冲溶液为100 mM 磷酸钠 (pH 6.5)。对于使用7dz-tSAH的反应，缓冲溶液为100 mM Tris-HCl(pH 8.0)。反应结束后向溶液中加入等体积10% (v/v) 三氟乙酸 (TFA) 淬灭反应。淬灭后的样品通过低温高速离心机在4℃、10000 rpm条件下离心10分钟，取出上层清液用PES针式过滤器进行过滤，滤液经制备型高效液相色谱以乙腈/水为流动相进行制备。收集的目标馏分经真空冷冻干燥获得油状产物。
反应式如下：
本发明还提供了基于式I所示的SAM类似物的环酶级联反应，在同一体系中同时进行步骤(1)~(2)：
（1）通过卤素甲基转移酶催化式II所示的SAH类似物与氟烷基碘化物进行反应生成式I所示的SAM类似物；
（2）式I所示的SAM类似物在甲基转移酶作用下对受体底物进行氟烷基化，获得氟烷基化的受体产物和式II所示的SAH类似物；
其中，步骤(2)所获得的式II所示的SAH类似物用于步骤(1)的反应。
优选的，受体底物为生物活性分子，包括但不限于小分子化合物、核酸、脂质或蛋白质，具体为木犀草素、N-乙酰基-O-甲氨基酰基-5-羟基色胺；
卤素甲基转移酶为来自Aspergillus clavatus的AclHMT，包括但不限于来自Arabidopsis thaliana、Paraburkholderia xenovorans、Vibri parhaemolyticus、 Ustilago maydis、Kordia algicida、Synechococcus elongates的同源物。
甲基转移酶为CiCOMT10和PsmD，包括但不限于O-甲基转移酶、N-甲基转移酶、S-甲基转移酶、C-甲基转移酶。
具体的级联反应方案如下：
反应体系组分包括：纯化的AclHMT，7dz-tSAH，受体底物，氟碘甲烷，缓冲溶液和另一种蛋白；另一种蛋白为CiCOMT10或PsmD中的一种。当另一种蛋白为50 μM CiCOMT10时，AclHMT浓度为50 μM，7dz-tSAH浓度为50 μM，氟碘甲烷浓度为10 mM，底物为500 μM木犀草素，缓冲溶液为50 mM Tris-HCl (pH 7.5)，且添加10 mM氯化镁和10% (v/v) 二甲基亚砜；当另一种蛋白为50 μM PsmD时，AclHMT浓度为25 μM，7dz-tSAH浓度为50 μM，氟碘甲烷浓度为15 mM，底物为1 mM N-乙酰基-O-甲氨基酰基-5-羟基色胺，缓冲溶液为100 mM 磷酸钾(pH 7.5)。
级联反应在30℃水浴中进行16小时。反应结束后，包含CiCOMT10的反应向溶液中加入等体积甲醇淬灭，包含PsmD的反应向溶液中加入等体积10% (v/v) 三氟乙酸淬灭。淬灭的样品通过低温高速离心机在4℃、12000 rpm条件下离心30分钟，取出上层清液经高效液相色谱进行分析。
一种一锅酶法制备地奥司明氟代衍生物的方法，基于式II所示的SAH类似物的HMT-CiCOMT10环酶级联反应扩大规模，制备得到氟代中间体1；
以氟代中间体1作为受体底物，在分步添加的CiUGT11和CiRhaT-GD4X级联体系中，顺序反应进行芸香糖基化修饰，生成氟代地奥司明。
具体反应方案如下：
将上述HMT-CiCOMT10环酶级联反应扩大至20 mL规模，反应结束后向溶液中加入等体积甲醇淬灭反应。淬灭后的样品通过低温高速离心机在4℃、10000 rpm条件下离心10分钟，取出上层清液用Nylon 66针式过滤器进行过滤，滤液经制备型高效液相色谱以乙腈/水为流动相进行制备。收集的目标馏分经真空冷冻干燥获得氟代中间体1。将该氟代中间体(1 mM) 加入含有CiUGT11 (44 μM)，UDP-葡萄糖 (2 mM)，氯化镁 (10 mM) 和DL-二硫苏糖醇 (10 mM) 的缓冲溶液中，充分混合后于37℃培养箱中静止反应1.5小时。进一步的，向反应溶液中加入CiRhaT-GD4X(终浓度40 μM)，UDP-鼠李糖 (终浓度1 mM)，充分混合后于37℃培养箱中静止反应4.5小时。反应结束后向溶液中加入等体积甲醇淬灭反应。淬灭后的样品通过上述后处理和纯化过程获得氟代地奥司明。
一种一锅酶法制备毒扁豆碱氟代衍生物的方法，基于式II所示的SAH类似物的HMT-PsmD环酶级联反应扩大规模，制备得到氟代中间体2；
以氟代中间体2作为受体底物，在分步添加的PsmC和PsmB的酶级联体系内进行分步甲基化和去乙酰化，生成氟代毒扁豆碱。
具体反应方案如下：
将上述HMT-PsmD环酶级联反应扩大至20 mL规模，反应结束后向溶液中加入等体积10% (v/v) 三氟乙酸淬灭反应。淬灭后的样品通过低温高速离心机在4℃、10000 rpm条件下离心10分钟，取出上层清液用PES针式过滤器进行过滤，滤液经制备型高效液相色谱以乙腈/水为流动相进行制备。收集的目标馏分经真空冷冻干燥获得氟代中间体2。将该氟代中间体 (2 mM) 加入含有4 mM SAM, 75 μM PsmC, 5% (v/v) 甘油的缓冲溶液中，在37℃培养箱中静止反应6小时。随后加入SAM (终浓度2 mM)，PsmB (终浓度50 μM) 继续反应8小时。反应结束后向溶液中加入三氟乙酸使其终浓度为5% (v/v) 淬灭反应。淬灭后的样品通过上述后处理和纯化过程获得氟代毒扁豆碱。
因此，本发明采用上述的S-腺苷高半胱氨酸类似物、S-腺苷-L-甲硫氨酸类似物，应用于酶促氟甲基化反应，技术效果如下：
对于含氟烷基侧链的SAM类似物，氟原子会促进SAM类似物的分解。本发明通过将羧基替换为弱亲核性的生物电子等排体，如伯酰胺和四氮唑，从而削弱氟烷基SAM类似物发生分子内环化带来的降解。生物电子等排体替换保留了与羧基相似的氢键受体原子，能减小官能团替换对酶适配性的影响。另外，一些腺嘌呤类似物与核糖形成的糖苷键更加稳定，可有效减少去嘌呤化带来的降解。
本发明对实施例2中所述氟甲基SAM类似物进行了稳定性测试，结果表明其在酶反应优选的条件下相较于F-dcSAM具备更好的稳定性，具体如图1所示。其中F-7dz-tSAM的半衰期大幅延长至713 min，是一种优选的稳定氟甲基SAM类似物。
具体实施例结果表明，本发明提供的F-7dz-tSAM可作为稳定的氟甲基供体，利用MT对临床药物的生物合成前体进行氟甲基化，并保持与天然反应一致的区域选择性和立体选择性。进一步的，基于7dz-tSAH的HMT-MT环酶级联反应体系可原位再生F-7dz-tSAM，使用催化量的SAH类似物，即可提高氟甲基产物的收率，提高了反应的原子经济性。与现有的化学合成方法相比，该酶促反应条件温和，操作简便，为制备药物氟甲基衍生物提供新的途径。
环酶级联反应产生的氟代中间体，可被生物合成通路中的下游酶接受并完成后修饰，生产临床药物（如地奥司明和毒扁豆碱）的氟代衍生物。本发明提供了一种一锅酶法生产氟代地奥司明和氟代毒扁豆碱的方法，能够模拟生物合成的原生环境，通过多酶级联在同一反应体系内完成多步反应，避免了繁琐的中间体分离步骤，减少了废物的产生，具备高效、绿色、可持续的特征。
体外活性测试表明，氟代中间体2对于丁酰胆碱酯酶 (butyrylcholinesterase,BChE)的IC50值为0.864 μM，相较于阳性参照物毒扁豆碱 ((-)-physostigmine) 的IC50值6.36 μM有较大优势，是潜在的BChE抑制剂。具体结果如图2所示。
附图说明
图1为实施例2中氟甲基SAM类似物在30℃，pH=8的100 mM Tris-HCl缓冲液中稳定性结果图；
图2为实施例7中氟代中间体2和毒扁豆碱抑制AChE和BChE的结果图；图2（A）为氟代中间体2和毒扁豆碱抑制AChE的结果图；图2（B）为氟代中间体2和毒扁豆碱抑制BChE的结果图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
具体实施方式中，hmt基因来源于Aspergillus clavatus(GenBank:EAW10780.1)，comt10基因来源于Chrysanthemum indicum(GenBank: WIF29799.1)，ugt11基因来源于Chrysanthemum indicum(GenBank: WIF29794.1)，rhat基因来源于Chrysanthemum indicum(GenBank: UYE98987.1)，psmb基因来源于Streptomyces griseofuscus(GenBank: AHL44340.1)，psmc基因来源于Streptomyces griseofuscus(GenBank: AHL44341.1)，psmd基因来源于Streptomyces griseofuscus(GenBank:AHL44342.1)。comt10, ugt11, rhat基因分别编码蛋白CiCOMT10，CiUGT11和CiRhaT-GD4X，被构建于pMAL-c5x载体上，构建方法、蛋白表达与纯化均与文献一致(Ma, D., et al.Cell Rep. 2024, 43 (2), 113725)。hmt, psmb, psmc, psmd基因分别编码蛋白AclHMT，PsmC, PsmC和PsmD，经过密码子优化后由供应商合成，被构建于pET-28a(+)和pET-21a(+)载体上，最终得到pET-28a(+)-AclHMT，pET-28a(+)-PsmB，pET-21a(+)-PsmC，pET-21a(+)-PsmD质粒。AclHMT的表达纯化参照文献(Hammer S C, et al. Angew. Chem. Int. Ed.2021, 60, 5554–5560)所述。PsmB, PsmC的表达纯化参照文献 (Zhang, W., et al.Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 53 (1), 136-139) 所述。PsmD的表达纯化参照文献(Pietruszka, J., et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60 (43), 23412-23418) 所述。
实施例1：SAH类似物的合成
（1）N-Fmoc-高胱氨酸（化合物B-1）的合成
在250 mL圆底烧瓶中加入60 mL水，碳酸钠 (1.6 g，10 mmol), L-高胱氨酸 (化合物A-1, 2.8 g, 10 mmol)，剧烈搅拌下加入60 mL二氧六环，9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯 (6.74 g, 20 mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜直到变为澄清液体。旋转蒸发除去大部分二氧六环，水相用60 mL无水乙醚洗涤两次，然后用柠檬酸调节pH至4。用乙酸乙酯萃取 (3 × 60 mL) 固液混合物，合并有机相，依次用水和饱和NaCl洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到6.1 g白色固体产物B-1，产率86%。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.88 (d,J= 7.5 Hz, 4H), 7.73 –7.64 (m,6H), 7.42 (t,J= 7.5 Hz, 4H), 7.33 (t,J= 7.5 Hz, 4H), 4.32 (dd,J= 7.2, 2.3 Hz,4H), 4.24 (t,J= 7.0 Hz, 2H), 4.15 –4.11 (m, 2H), 2.81 –2.73 (m, 4H), 2.19 –2.12 (m, 2H), 2.02 –1.96 (m, 2H).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 173.67, 156.37, 144.01, 143.95, 140.93,140.91, 127.83, 127.25, 125.44, 125.41, 120.27, 120.25, 65.80, 52.67, 46.87,34.32, 30.46.
ESI-MS:m/z711.2 [M-H]-.
（2）化合物C-1的合成
在25 mL圆底烧瓶中加入8 mL吡啶，化合物B-1 (710 mg, 1 mmol)，碳酸氢铵(390 mg, 5 mmol)，翻口塞密封后在搅拌下用注射器加入溶解在2 mL吡啶中的二碳酸二叔丁酯 (590 mg, 2.7 mmol)。密封下室温搅拌反应5小时，TLC监测原料转化，然后用乙酸乙酯稀释。有机相依次用5% H2SO4和饱和NaCl洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到油状粗产物。粗产物用二氯甲烷/石油醚混合溶剂打浆，抽滤，滤饼用石油醚洗涤并在真空下干燥，得到590 mg白色固体产物C-1，产率83%。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.88 (d,J= 7.5 Hz, 4H), 7.75 –7.69 (m,4H), 7.51 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.41 (t,J= 7.5 Hz, 4H), 7.34 –7.31 (m, 6H), 7.08(s, 2H), 4.33 –4.21 (m, 6H), 4.03 (q,J= 8.7 Hz, 2H), 2.71 (q,J= 9.1 Hz, 4H),2.08 –1.86 (m, 4H).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 173.32, 155.97, 143.78, 140.73, 127.65,127.08, 125.33, 120.11, 65.61, 53.53, 46.70, 34.38, 31.65.
ESI-MS:m/z711.2 [M+H]+.
（3）化合物D-1的合成
在25 mL圆底烧瓶中加入5 mL N,N-二甲基甲酰胺，化合物C-1 (710 mg, 1mmol)，溶解后在0℃预冷15分钟。将三氟乙酸酐 (840 mg, 4 mmol)，560 mL吡啶溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，通过滴液漏斗逐滴加入到0℃的反应混合物中，然后在室温反应12小时。TLC监测原料转化，用乙酸乙酯稀释后加入等体积饱和NaHCO3溶液淬灭反应。水相用乙酸乙酯 (3 × 50 mL) 萃取，合并有机相，依次用1N HCl和饱和NaCl洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到粗产物。粗产物经过柱层析分离 (石油醚:二氯甲烷:乙酸乙酯 = 4: 2: 1, v/v)，得到412 mg白色固体产物D-1，产率61%。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.75 (d,J= 7.5 Hz, 4H), 7.57 –7.50 (m, 4H),7.39 (t,J= 7.5 Hz, 4H), 7.30 (t,J= 7.5 Hz, 4H), 4.78 (q,J= 8.7 Hz, 2H), 4.46(s, 4H), 4.16 –4.10 (m, 2H), 2.75 (t,J= 7.0 Hz, 4H), 2.21 (d,J= 7.1 Hz, 4H).
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 155.28, 143.43, 141.48, 141.46, 128.03,127.29, 124.99, 120.23, 120.21, 117.94, 67.58, 47.15, 41.68, 33.65, 32.77.
HRMS计算值C38H36N4NaO5S2 +: 715.2019 [M+H2O+Na]+; 实验值715.1945。
（4）化合物E-1的合成
在50 mL单口瓶中依次加入20 mL乙二醇二甲醚，化合物D-1 (610 mg, 0.9mmol)，二丁基氧化锡 (45 mg, 0.18 mmol)，叠氮基三甲基硅烷 (414 mg, 3.6 mmol)，加热回流反应24小时。TLC监测原料转化，冷却至室温后用饱和NaHCO3溶液淬灭反应。水相用乙酸乙酯洗涤三次，然后用6N HCl酸化至pH=2。用乙酸乙酯 (3 × 50 mL) 再次提取水相，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到548 mg黄色固体产物E-1，产率85%。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 )) δ 8.12 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 7.88 (d,J= 7.5Hz, 4H), 7.70 (dd,J= 10.3, 7.5 Hz, 4H), 7.41 (t,J= 7.4 Hz, 4H), 7.32 (q,J=7.3 Hz, 2H), 5.06 (td,J= 8.5, 5.4 Hz, 2H), 4.39 (dd,J= 10.5, 7.0 Hz, 2H),4.29 (dd,J= 10.4, 6.8 Hz, 2H), 4.23 (t,J= 6.9 Hz, 2H), 2.77 – 2.72 (m, 4H),2.36 – 2.19 (m, 4H).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6 ) δ 172.12, 155.90, 143.72, 140.79, 127.72,127.11, 125.31, 125.26, 120.19, 120.16, 65.78, 46.73, 44.97, 33.61, 32.32.
ESI-MS:m/z759.2 [M-H]-.
（5）5’-脱氧-5’-碘腺苷（化合物G-1）的合成
在50 mL圆底烧瓶中依次加入15 mL无水吡啶，腺苷 (化合物F-1, 160 mg, 0.6mmol)，三苯基膦 (314 mg, 1.2 mmol)，氮气保护，室温反应30 min后，加入溶解在1 mL无水吡啶中的碘单质 (230 mg, 0.9 mmol)。避光反应20 h，TLC监测原料转化。反应结束后用10% Na2S2O3溶液淬灭，旋转蒸发除去大部分吡啶，重新用水溶解残渣。水相用乙醚洗涤两次，然后在真空下蒸发除去水。蒸发过程中多次补加无水乙醇共沸去除残留的水。粗产物通过柱层析(二氯甲烷:甲醇 = 5: 1, v/v) 纯化，得到166 mg白色固体产物G-1，产率74%。
1H NMR (800 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.35 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.35 (s, 2H),5.87 (d,J= 6.2 Hz, 1H), 5.46 – 5.40 (m, 2H), 5.18 (s, 1H), 4.61 (q,J= 5.8 Hz,1H), 4.14 (d,J= 3.5 Hz, 1H), 3.96 (q,J= 3.5 Hz, 1H), 3.67 (dd,J= 12.0, 3.6Hz, 1H), 3.57 – 3.52 (m, 1H).
13C NMR (201 MHz, DMSO-d 6 ) δ 156.15, 152.35, 149.05, 139.93, 119.36,87.89, 85.89, 73.42, 70.66, 61.67.
ESI-MS:m/z378.0 [M+H]+.
（6）5’-脱氧-5’-碘-7-脱氮腺苷（化合物G-2）的合成
该化合物合成方法与G-1类似，使用杀结核菌素（化合物F-2）作为原料，产率71%。
1H NMR (800 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.40 (s, 1H), 7.69 (d,J= 3.7 Hz, 1H), 6.99(d,J= 3.7 Hz, 1H), 6.13 (d,J= 6.1 Hz, 1H), 4.52 (t,J= 5.7 Hz, 1H), 4.07 –4.06 (m, 1H), 3.97 – 3.95 (m, 1H), 3.60 (dd,J= 10.5, 5.8 Hz, 1H), 3.43 (dd,J=10.5, 6.5 Hz, 1H).
13C NMR (201 MHz, DMSO-d 6 ) δ 151.75, 147.87, 143.67, 124.76, 102.65,102.16, 87.17, 83.63, 73.63, 73.16, 8.04.
ESI-MS:m/z377.0 [M+H]+.
（7）amide-SAH的合成
在10 mL圆底烧瓶中依次加入2 mL异丙醇，化合物C-1 (36 mg, 0.05 mmol)，硼氢化钠 (30 mg, 0.8 mmol)，混合物在氮气氛围下室温反应1 h。然后将溶解在1 mL异丙醇的化合物G-1 (30 mg, 0.08 mmol) 加入到反应体系，加热至70℃，氮气保护下避光反应2 h。TLC监测原料转化，加入等体积水淬灭反应，用1N HCl酸化至pH=3。旋转蒸发除去溶剂，残留物用水复溶，用PES针式过滤器过滤，滤液经过制备型高效液相色谱进行纯化，使用Shim-pack GIST C18 色谱柱 (20×250 mm, 5 μm)，流动相A为H2O + 1‰ 三氟乙酸，流动相B为CH3CN + 1‰ 三氟乙酸。流速为10 mL/min，单次进样量为5 mL，检测波长为254 mm和215mm，洗脱程序为0 min, 0% B; 5 min, 0% B; 31 min, 19% B; 33 min, 90% B; 37 min,90% B; 37.01 min, 0% B; 44 min, 0% B。合并馏分经真空冷冻干燥得到11 mg白色固体，产率37%。
1H NMR (800 MHz, D2O) δ 8.51 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 6.14 (d,J= 4.7 Hz,1H), 4.85 (t,J= 4.9 Hz, 1H), 4.44 (t,J= 5.1 Hz, 1H), 4.34 (dt,J= 7.2, 4.7 Hz,1H), 4.11 (t,J= 6.6 Hz, 1H), 3.08 (dd,J= 14.3, 4.7 Hz, 1H), 3.01 (dd,J= 14.3,7.0 Hz, 1H), 2.73 – 2.66 (m, 2H), 2.20 – 2.12 (m, 2H).
13C NMR (201 MHz, D2O) δ 171.40, 150.34, 148.34, 145.05, 142.66,118.93, 88.37, 83.45, 73.55, 72.27, 51.98, 33.43, 30.58, 26.87.
HRMS计算值C14H22N7O4S+: 384.1448 [M+H]+; 实验值 384.1439。
（8）tet-SAH的合成
该化合物的合成方法与amide-SAH类似，使用化合物E-1和化合物G-1作为原料，将反应溶剂更换为异丙醇/水 (2: 1, v/v)，得到10 mg白色固体，产率为45%。制备型高效液相色谱洗脱程序为0 min, 0% B; 6 min, 0% B; 31 min, 30% B; 33 min, 90% B; 37min, 90% B; 37.01 min, 0% B; 44 min, 0% B。
1H NMR (800 MHz, D2O) δ 8.45 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 6.08 (d,J= 4.7 Hz,1H), 5.03 – 4.99 (m, 1H), 4.39 (t,J= 5.2 Hz, 1H), 4.29 – 4.25 (m, 1H), 3.01(dd,J= 14.4, 4.4 Hz, 1H), 2.93 (dd,J= 14.4, 6.9 Hz, 1H), 2.61 – 2.52 (m, 2H),2.45 – 2.33 (m, 1H).
13C NMR (201 MHz, D2O) δ 156.42, 149.94, 148.22, 144.47, 142.81,118.89, 88.39, 83.73, 73.47, 72.14, 45.00, 33.19, 31.56, 27.03.
HRMS计算值C14H22N7O4S+: 409.1513 [M+H]+; 实验值 409.1526。
（9）7dz-tSAH的合成
该化合物的合成方法与tet-SAH类似，使用化合物E-1和化合物G-2作为原料。获得10 mg固体，产率36%。
1H NMR (600 MHz, D2O) δ 8.27 (s, 1H), 7.47 (d,J= 3.8 Hz, 1H), 6.84 (d,J= 4.2 Hz, 1H), 6.19 (d,J= 5.4 Hz, 2H), 4.99 (dd,J= 8.5, 6.0 Hz, 1H), 4.65(t,J= 5.5 Hz, 1H), 4.34 (t,J= 5.4 Hz, 1H), 4.24 (dt,J= 6.5, 4.6 Hz, 1H), 3.00(dd,J= 14.5, 4.5 Hz, 1H), 2.89 (dd,J= 14.5, 6.5 Hz, 1H), 2.62 – 2.52 (m, 2H),2.44 – 2.32 (m, 2H).
13C NMR (151 MHz, D2O) δ 156.50, 150.99, 147.48, 142.26, 124.73,102.91, 102.69, 87.26, 83.36, 73.62, 72.19, 45.07, 33.47, 31.61, 27.30.
HRMS计算值C15H22N9O3S+: 408.1561 [M+H]+; 实验值408.1561。
实施例2：氟甲基SAM类似物的合成
（1）F-amSAM的合成
如图1所示，氟甲基SAM类似物在30℃，pH=8的100 mM Tris-HCl缓冲液中稳定性，基于此进行以下实验。
将纯化的AclHMT (200 μM)，amide-SAH (1 mM)，氟碘甲烷 (10 mM) 充分混合于100 mM 磷酸钠 (pH 6.5) 缓冲溶液中，总体积8.4 mL。反应混合物在30℃摇床中，90 rpm，反应45 min。加入420 μL三氟乙酸使终浓度为5% (v/v) 淬灭反应。淬灭后的样品通过低温高速离心机在4℃、10000 rpm条件下离心10分钟，取出上层清液用PES针式过滤器进行过滤，滤液经制备型高效液相色谱进行纯化，使用Innoval ODS-2 C18色谱柱 (10×250 mm,5 m)，流动相A为H2O + 1‰ 三氟乙酸，流动相B为CH3CN + 1‰ 三氟乙酸。流速为3 mL/min，单次进样量为5 mL，检测波长为260 mm和215 mm，洗脱程序为0 min, 0% B; 5 min,0% B; 27 min, 16.5% B; 29 min, 90% B; 33 min, 90% B; 33.01 min, 0% B; 40 min,0% B。收集的目标馏分经真空冷冻干燥获得1.9 μmol油状产物。
为了减少F-amSAM的分解，制备反应在pH 6.5下进行。但在pH 6.5下HMT的催化效率较低，所获的产物量较少，仅对产物进行HRMS表征。
HRMS计算值C15H23FN7O4S+: 416.1511 [M]+; found: 416.1487.
（2）F-tSAM的合成
该化合物合成方法与F-amSAM类似，使用tet-SAH作为原料，反应总体积为13.4mL。使用Shim-pack GIST C18 色谱柱 (20×250 mm, 5 μm) 进行纯化，流动相流速为10mL/min，洗脱程序为0 min, 0% B; 6 min, 0% B; 31 min, 30% B; 33 min, 90% B; 37min, 90% B; 37.01 min, 0% B; 44 min, 0% B。获得8.5 μmol油状产物。
1H NMR (600 MHz, D2O) δ 8.41 (d,J= 8.1 Hz, 1H), 8.35 (d,J= 18.0 Hz,1H), 6.27 – 6.11 (m, 2H), 6.09 – 5.99 (m, 1H), 4.99 – 4.96 (m, 1H), 4.62 –4.61 (m, 1H), 4.58 – 4.50 (m, 1H), 4.17- 4.08 (m, 1H), 3.65 (dt,J= 14.2, 2.6Hz, 2H), 3.57 – 3.54 (m, 2H), 2.73 – 2.70 (m, 2H).
19F NMR (753 MHz, D2O) δ -215.51 (dt,J= 130.9, 45.9 Hz).
13C NMR (151 MHz, D2O) δ 157.28, 157.01, 150.00, 149.95, 147.91,147.74, 144.37, 143.51, 143.40, 119.45, 119.30, 90.12, 90.08, 85.13 (dd,J CF=238.0, 67.1 Hz), 79.03, 78.79, 73.09, 73.05, 72.78, 72.70, 62.44, 46.63,44.75 (d,J CF= 4.6 Hz), 40.76, 39.63, 33.72, 33.43, 26.81, 26.46.
HRMS计算值C15H22FN10O3S+: 441.1576 [M]+; 实验值441.1565。
（3）F-7dz-tSAM的合成
该化合物的合成方法与F-tSAM类似，使用7dz-tSAH作为原料，缓冲液使用100 mMTris-HCl (pH 8)，反应总体积为11 mL，反应时间为1 h。获得20.2 μmol油状产物。
1H NMR (800 MHz, D2O) δ 8.27 (d,J= 13.8 Hz, 1H), 7.45 (d,J= 3.7 Hz,1H), 7.37 (d,J= 3.7 Hz, 1H), 6.86 (dd,J= 30.9, 3.7 Hz, 1H), 6.25 – 6.15 (m,2H), 6.14 – 6.00 (m, 1H), 4.84 (dd,J= 9.6, 5.3 Hz, 1H), 4.73 (t,J= 5.0 Hz,1H), 4.68 (t,J= 5.3 Hz, 1H), 4.58 – 4.51 (m, 1H), 4.16 – 4.09 (m, 1H), 4.03 –3.98 (m, 1H), 3.75 – 3.53 (m, 2H), 2.70 (q,J= 7.1 Hz, 2H).
19F NMR (753 MHz, D2O) δ -215.53 (dt,J= 72.9, 45.7 Hz).
13C NMR (201 MHz, D2O) δ 157.36, 156.91, 151.02, 147.19, 146.97,142.14, 142.05, 125.34, 103.22, 103.05, 102.81, 89.31, 85.32 (dd,J CF= 237.5,38.4 Hz), 78.56, 78.44, 73.05, 72.69, 62.44, 45.08 (d,J CF= 4.5 Hz), 41.32,39.74, 34.26, 33.96, 26.82, 26.70.
HRMS计算值C16H23FN9O3S+: 440.1623 [M]+; 实验值440.1623。
实施例3：AclHMT和CiCOMT10级联催化产生氟代香叶木素（氟代中间体1）
将纯化的AclHMT (50 μM)，CiCOMT10 (50 μM)，7dz-SAH (50 μM)，氟碘甲烷 (16mM)，木犀草素 (0.5 mM)，氯化镁 (10 mM)，充分混合于50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 缓冲溶液中，加入10% (v/v) 二甲基亚砜作为共溶剂，总体积100 mL，30℃水浴反应16 h。反应结束后向反应液中加入等体积甲醇淬灭，4℃、12000 rpm下离心30 min后取上层清液使用高效液相色谱分析，使用Shim-pack GIST C18 色谱柱 (4.6×150 mm, 5 μm)。同反应体系扩大至制备规模，总体积30 mL，反应混合物在30℃摇床中，90 rpm，反应16 h。加入等体积甲醇淬灭反应，随后通过低温高速离心机在4℃、10000 rpm条件下离心10分钟，取出上层清液用Nylon 66针式过滤器进行过滤，滤液经制备型高效液相色谱进行纯化，使用InnovalODS-2 C18色谱柱 (10×250 mm, 5 μm)，流动相A为H2O + 1‰ 三氟乙酸，流动相B为CH3CN+ 1‰ 三氟乙酸。流速为3 mL/min，单次进样量为5 mL，检测波长为330 mm和280 mm，洗脱程序为0 min, 10% B; 4 min, 10% B; 42 min, 70% B; 42.01 min, 100% B; 47 min,100% B; 47.01 min, 10% B; 54 min, 10% B。收集的目标馏分经真空冷冻干燥获得2 mg淡黄色固体，产率42%。
1H NMR (800 MHz, DMSO-d 6 ) δ 12.86 (s, 1H), 10.91 (s, 1H), 9.94 (s,1H), 7.55 (dd,J= 8.5, 2.2 Hz, 1H), 7.52 (d,J= 2.3 Hz, 1H), 7.25 (d,J= 8.5 Hz,1H), 6.81 (s, 1H), 6.47 (d,J= 2.1 Hz, 1H), 6.21 (d,J= 2.0 Hz, 1H), 5.89 (d,J=54.1 Hz, 2H).
19F NMR (753 MHz, DMSO-d 6 ) δ -150.22 (t,J= 53.6 Hz).
13C NMR (201 MHz, DMSO-d 6 ) δ 181.75, 164.36, 162.93, 161.48, 157.36,147.68, 147.11, 126.31, 118.34, 117.00, 114.30, 104.47, 103.85, 100.84 (d,J CF=216.7 Hz), 98.99, 93.96.
HRMS计算值C16H12FO6 +: 319.0612 [M+H]+; 实验值 319.0616。
实施例4：一锅酶法制备氟代地奥司明
将实施例3所述氟代中间体1 (1 mM) 加入含有CiUGT11 (44 μM)，UDP-葡萄糖 (2mM)，氯化镁 (10 mM) 和DL-二硫苏糖醇 (10 mM) 的50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 缓冲溶液中，总体积8 mL，充分混合后于37℃培养箱中静止反应1.5小时。进一步的，向上述反应溶液中加入4 mL包含CiRhaT-GD4X(120 μM)，UDP-鼠李糖 (3 mM) 的混合液，充分混合后于37℃培养箱中静止反应4.5小时。反应结束后向溶液中加入等体积甲醇淬灭反应。淬灭后的样品经过与实施例3类似的后处理和纯化过程，其中高效液相色谱洗脱程序为0 min, 5% B; 4min, 5% B; 30 min, 38% B; 33 min, 95% B; 37 min, 95% B; 37.01 min, 5% B; 44min, 5% B。最终获得氟代地奥司明2 mg，分离产率40%。
1H NMR (800 MHz, DMSO-d 6 ) δ 12.85 (s, 1H), 9.91 (s, 1H), 7.57 (dd,J=8.5, 2.3 Hz, 1H), 7.53 (d,J= 2.2 Hz, 1H), 7.29 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 6.87 (s,1H), 6.76 (d,J= 2.1 Hz, 1H), 6.48 (d,J= 2.1 Hz, 1H), 5.90 (d,J= 54.1 Hz, 2H),5.08 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 4.54 (d,J= 1.6 Hz, 1H), 3.85 (dd,J= 11.4, 1.8 Hz,1H), 3.66 (dd,J= 3.5, 1.6 Hz, 1H), 3.61 – 3.59 (m, 1H), 3.48 – 3.45 (m, 2H),3.42 – 3.40 (m, 2H), 3.27 (dd,J= 9.0, 7.6 Hz, 1H), 3.17 – 3.14 (m, 2H), 1.07(d,J= 6.2 Hz, 3H).
19F NMR (753 MHz, DMSO-d 6 ) δ -150.26 (t,J= 54.2 Hz).
13C NMR (201 MHz, DMSO-d 6 ) δ 182.05, 173.01, 163.66, 163.08, 161.23,157.03, 147.67, 147.30, 126.23, 118.58, 117.01, 114.54, 105.56, 104.82,100.81 (d,J CF= 216.3 Hz), 100.55, 99.90, 99.72, 94.86, 76.26, 75.63, 73.11,72.04, 70.74, 70.33, 69.60, 69.31, 68.36, 66.06, 17.83.
HRMS计算值C28H32FO15 +: 627.1720 [M+H]+; 实验值 627.1723。
实施例5：AclHMT和PsmD级联催化生成氟代中间体2
将纯化的AclHMT (25 μM)，PsmD (50 μM), 7dz-SAH (50 μM)，氟碘甲烷 (16mM)，N-乙酰基-O-甲氨基酰基-5-羟基色胺 (1 mM)，充分混合于100 mM 磷酸钾 (pH 7.5)缓冲溶液中，总体积100 mL，30℃水浴反应16 h。反应结束后向反应液中加入等体积10%TFA淬灭，4℃、12000 rpm下离心30 min后取上层清液使用高效液相色谱分析，使用Shim-pack GIST C18 色谱柱 (4.6×150 mm, 5 μm)。分析结果显示几乎发生定量转化。同反应体系扩大至制备规模，总体积20 mL。反应混合物在30℃摇床中，90 rpm，反应16 h。加入TFA(终浓度5%, v/v) 淬灭反应。淬灭后的样品通过低温高速离心机在4℃、10000 rpm条件下离心10分钟，取出上层清液用PES针式过滤器进行过滤，滤液经制备型高效液相色谱进行纯化，使用Innoval ODS-2 C18色谱柱 (10×250 mm, 5 μm)，流动相A为H2O + 1‰ 三氟乙酸，流动相B为CH3CN + 1‰ 三氟乙酸。流速为3 mL/min，单次进样量为5 mL，检测波长为254 mm和215 mm，洗脱程序为0 min, 0% B; 4 min, 0% B; 15 min, 31.5% B; 33 min,35.5% B; 33.01 min, 90% B; 38 min, 90% B; 38.01 min, 0% B; 46 min, 0% B。收集的目标馏分经真空冷冻干燥获得5.2 mg白色固体，分离产率85%。
1H NMR (800 MHz, CDCl3) δ 6.89 – 6.86 (m, 2H), 6.62 (d,J= 8.4 Hz, 1H),5.52 (s, 1H), 4.49 – 4.37 (m, 2H), 3.39 (td,J= 10.9, 6.6 Hz, 1H), 2.94 (dd,J=65.2, 4.7 Hz, 3H), 2.55 – 2.51 (m, 1H), 2.28 (dd,J= 11.7, 7.7 Hz, 1H), 2.12(s, 3H).
19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -221.73 (t,J= 47.5 Hz).
13C NMR (201 MHz, CDCl3) δ 172.43, 159.16, 146.63, 144.14, 127.28,123.04, 117.74, 110.18, 83.40 (d,J CF= 179.8 Hz), 78.18, 57.49, 47.29, 31.14,27.92, 21.94.
HRMS计算值C15H19FN3O3 +: 308.1405 [M+H]+; 实验值: 308.1431。
[α]D20= –147.05±0.29 (c0.2, CHCl3)
对比例1
使用纯化的F-7dz-tSAM (2 mM) 作为氟甲基供体，加入纯化的AclHMT (25 μM)，PsmD (50 μM), N-乙酰基-O-甲氨基酰基-5-羟基色胺 (1 mM)，充分混合于100 mM 磷酸钾(pH 7.5) 缓冲溶液中，总体积100 mL，30℃水浴反应16 h。使用上述相同色谱分析方法，结果显示转化率为77%。
实施例6：一锅酶法制备氟代毒扁豆碱
将实施例5所述氟代中间体2 (2 mM) 加入含有4 mM SAM, 75 μM PsmC, 5% (v/v) 甘油的100 mM磷酸钾 (pH 7.0) 缓冲溶液中，总体积20 mL，充分混合后在37℃培养箱中静止反应6小时。随后加入5 mL含有SAM (6 mM), PsmB (150 μM) 的混合液，继续反应8小时。反应结束后向溶液中加入三氟乙酸使其终浓度为5% (v/v) 淬灭反应。淬灭后的样品经过与实施例5类似的后处理和纯化过程，其中高效液相色谱洗脱程序为0 min, 0% B; 4min, 0% B; 10 min, 10% B; 32 min, 25% B; 35 min, 90% B, 保持 5 min; 40 min,0% B, 平衡 10 min。最终获得氟代毒扁豆碱4.9 mg，分离产率42%。
1H NMR (800 MHz, CDCl3) δ 7.02 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.63(d,J= 8.7 Hz, 1H), 5.37 (s, 1H), 5.02 (d,J= 7.4 Hz, 1H), 4.61 – 4.50 (m, 2H),3.66 (s, 1H), 3.10 (s, 3H), 2.88 (s, 3H), 2.80 (s, 3H), 2.52 (s, 1H), 2.20(dd,J= 13.9, 5.5 Hz, 1H).
19F NMR (470 MHz, CDCl3) δ -220.26 (t,J= 46.5 Hz).
13C NMR (201 MHz, CDCl3) δ 155.74, 148.70, 145.68, 129.46, 123.50,117.37, 109.68, 91.64, 84.58 (d,J CF= 179.0 Hz), 58.42, 52.21, 38.37, 34.07,32.97, 27.88.
HRMS计算值C15H21FN3O2 +: 294.1612 [M+H]+; 实验值 294.1617。
[α]D20= –36.17±0.01 (c1.0, CHCl3).
实施例7：氟代中间体2及氟代毒扁豆碱的体外活性
将氟代中间体2，氟代毒扁豆碱和毒扁豆碱用二甲基亚砜配制成50 mM储液，用100mM磷酸钾 (pH 8.0) 缓冲溶液等比例稀释为从25 mM到0.512 nM的12个浓度。使用Ellman测定法，利用酶标仪在96孔板中测定不同浓度的上述化合物抑制AChE和BChE分别水解硫代乙酰胆碱和硫代丁酰胆碱的活性。绘制剂量-效应曲线，读出各化合物对于AChE和BChE的IC50值，见表1。具体结果见图2所示。
表1 毒扁豆碱、氟代中间体2、氟代毒扁豆碱对于AChE和BChE的IC50值
因此，本发明采用上述S-腺苷高半胱氨酸类似物、S-腺苷-L-甲硫氨酸类似物及其应用，本发明设计并合成了3种新的SAM类似物，F-amSAM、F-tSAM和F-7dz-tSAM，通过对羧基和碱基的生物电子等排替换，抑制了SAM类似物分解的两条主要途径，提高了它们的化学稳定性。其中，优选的F-7dz-tSAM半衰期大于12小时，可有效减少其作为氟甲基供体在酶促反应中的降解副反应。
本发明证明了AclHMT识别SAH类似物合成氟甲基SAM类似物的能力，以及CiCOMT10和PsmD以F-7dz-tSAM作为氟甲基供体，对临床药物生物合成前体进行酶促的区域选择性和立体选择性氟甲基修饰的能力。
本发明构建的基于7dz-tSAH的HMT-MT环酶级联反应，可实现F-7dz-tSAM原位再生，以催化量的7dz-tSAH完成酶促氟甲基化反应，提高反应效率和原子经济性。
本发明提供的氟代中间体，可被生物合成通路下游酶接受，通过一锅酶法生产氟代地奥司明和氟代毒扁豆碱，避免了复杂的中间体纯化步骤，减少了废物的产生和能源消耗。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (11)

1.S-腺苷-L-甲硫氨酸类似物，其特征在于，SAM类似物具有式I所示结构：
；
式I
其中，R1为末端酰胺或四氮唑中的一种；
R2为氟取代的C1~C10饱和或不饱和的直链或支链烷烃中的一种；
X为NH，O，S，CH；
Y为N，C；
Z为N，C。
2.根据权利要求1所述的S-腺苷-L-甲硫氨酸类似物，其特征在于，氟取代的C1~C10饱和或不饱和的直链或支链烷烃为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。
3.根据权利要求1所述的S-腺苷-L-甲硫氨酸类似物，其特征在于，SAM类似物具有如下任一所示结构：
。
4.S-腺苷高半胱氨酸类似物，其特征在于，SAH类似物具有式II所示结构：
；
式II
其中，R1为末端酰胺或四氮唑中的一种；
X为NH，O，S，CH；
Y为N，C；
Z为N，C；
n为1或2。
5.根据权利要求4所述的S-腺苷高半胱氨酸类似物，其特征在于，SAH类似物具有如下任一所示结构：
。
6.SAM类似物和SAH类似物的应用，其特征在于，式I所示的SAM类似物和式II所示的SAH类似物的环酶级联反应，在同一体系中同时进行步骤(1)~(2)：
（1）通过卤素甲基转移酶催化式II所示的SAH类似物与氟烷基碘化物进行反应生成式I所示的SAM类似物；
（2）式I所示的SAM类似物在甲基转移酶作用下对受体底物进行氟烷基化，获得氟烷基化的受体产物和式II所示的SAH类似物；
其中，步骤(2)所获得的式II所示的SAH类似物循环用于步骤(1)的反应；
所述氟烷基碘化物中的烷基为C1~C10的直链或直链烷基。
7.根据权利要求6所述的SAM类似物和SAH类似物的应用，其特征在于，受体底物为生物活性分子，包括但不限于小分子化合物、核酸、脂质或蛋白质，具体为木犀草素、N-乙酰基-O-甲氨基酰基-5-羟基色胺；
卤素甲基转移酶为来自Aspergillus clavatus的AclHMT，包括但不限于来自Arabidopsis thaliana、Paraburkholderia xenovorans、Vibri parhaemolyticus、 Ustilago maydis、Kordia algicida、Synechococcus elongates的同源物；
甲基转移酶为CiCOMT10和PsmD，包括但不限于O-甲基转移酶、N-甲基转移酶、S-甲基转移酶、C-甲基转移酶。
8.氟代中间体1合成方法，其特征在于，基于式II所示的SAH类似物的HMT-CiCOMT10环酶级联反应扩大规模，制备得到氟代中间体1。
9.氟代中间体2合成方法，其特征在于，基于式II所示的SAH类似物的HMT-PsmD环酶级联反应扩大规模，制备得到氟代中间体2。
10.一种一锅酶法制备地奥司明氟代衍生物的方法，其特征在于，以氟代中间体1作为受体底物，在分步添加的CiUGT11和CiRhaT-GD4X级联体系中，顺序反应进行芸香糖基化修饰，生成氟代地奥司明。
11.一种一锅酶法制备毒扁豆碱氟代衍生物的方法，其特征在于，以氟代中间体2作为受体底物，在分步添加的PsmC和PsmB的酶级联体系内进行分步甲基化和去乙酰化，生成氟代毒扁豆碱。
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