CN1199693C - 高钙血症危象治疗剂 - Google Patents
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Abstract
含有作为活性成分的能抑制副甲状腺激素相关的蛋白与其受体之间结合的物质的高钙血症危象治疗剂。
Description
技术领域
本发明涉及伴有恶性肿瘤的高钙血症危象治疗剂，含有作为活性成分的能抑制副甲状腺激素相关的蛋白与其受体之间结合的物质。
发明背景
与恶性肿瘤有关的高钙血症是在5％到20％的恶性肿瘤病人中发现的严重并发症，它被认为是恶性肿瘤的最终症状，因为如果保留该症状不治疗的话它必然导致死亡。高钙血症的控制极大程度地影响病人的预后和QOL(生命质量)；因此，高钙血症的控制在临床上起重要作用。
通常，恶性肿瘤病人的高钙血症被粗略地分为两类：HHM(恶性体液性高钙血症)，其基于产生肿瘤的体液性骨重吸收因子；和LOH(局部溶骨性高钙血症)，其基于转移或渗透到骨的肿瘤的局部活性。HHM中，认为由骨重吸收或破坏的促进增加钙的排泄从而导致随着降低肾钙排泄能力，产生高钙血症(和田诚基和永田直一，内科69，644-648)。
高钙血症是血清钙值超过12mg/dl就出现的症状，其症状为初期阶段食欲不振、恶心、呕吐等症状对恶性肿瘤患者没有特别。如果高钙血症恶化，因肾远位尿细管的障碍，液体的浓缩力降低，产生多尿，同时因恶心或呕吐，不能充足吸收水分，出现脱水，引起肾、皮肤、血管、肺、心和胃的石灰化。如果高钙血症进一步恶化，出现全身疲倦、好睡、错乱等意识障碍，可能引起昏睡和心脏停止(Harrison的内科学教科书，3427，内科学，1081-1084，朝仓书店)。
Moseley，J.M.等发现，伴随恶性肿瘤的高钙血症中引起HHM的液性因子是类PTH(副甲状腺激素)物质的副甲状腺激素相关的蛋白(以下称PTHrP)(美国国家科学院年报(1987)84，5048-5052)。
之后，分离了编码PTHrP的基因(Suva，L.J.等，科学(1987)237，893)。所述基因的分析说明了根据基因的选择性拼接的方式分别产生具有139、141和173个氨基酸残基的三种人PTHrP，并说明了由于具有完全结构的PTHrP(1-139)的限制性降解所产生的各种片段出现在血液中(Baba，H.，临床钙(1995)5，
229-223)。PTHrP中，假定N末端氨基酸1-13的13个氨基酸中的8个氨基酸与PTH的相应部位等同，并且含有氨基酸14-34的序列具有与PTH类似的三维立体结构；以及PTHrP的N末端区可连接到与PTH共享的PTH/PTHrP受体上(Jueppner，H.等，科学(1991)254，1024-1026；Abou-Samra，A-B.等，美国国家科学院年报(1992)89，2732-2736)。
目前已知PTH/PTHrP受体主要存在于骨和肾中(Chohei Sigeno，临床钙(1995)5，355-359)，通过PTHrP与其受体的结合可以激活多数胞间信号传送系统。胞间信号传送系统之一是腺苷酸环化酶，另一个磷脂酶C。腺苷酸环化酶的激活增加了胞间cAMP的浓度从而激活蛋白激酶A。磷脂酶C分解磷脂酰肌醇4，5-二膦酸酯产生肌醇1，4，5-三膦酸酯和二酯酰甘油。G蛋白也参与这些信号传送系统(Coleman，D.T.等，副甲状腺激素活性的生化机理，“副甲状腺素”(Bilezikian，J.P.等)，Raven Press，New York(1994)239)。PTHrP导致HHM中观察到的高钙血症、低磷酸盐血症、肾的磷重吸收能力的降低、肾cAMP排泄的增加等。
如上所述，PTHrP不仅与恶性肿瘤有关的高钙血症密切相关，而且急剧的血中钙的上升产生包括意识障碍(如全身疲倦、好睡、错乱)和发展为昏睡的高钙血症危象。当恶性肿瘤相关的高钙血症危象恶化时，使用降血钙素、类固醇药物、二膦酸酯、磷酸缓冲液、生理盐水、速尿灵等以改善高钙血症和全身的症状。然而，这些药物连续使用后发现其作用降低，表现出严重副作用或其药理作用的缓慢表达。因此，十分期望使用具有较高治疗作用和较低副作用的药物。
特别是，对高钙血症危象患者，如果急剧的血中钙上升导致死亡的危险，因此有必要尽可能快地降低血中钙。但目前没有安全且效果快的让人满意的高钙血症危象治疗剂。
另一方面，Kukreja，S.C.等报道了一种新的治疗恶性肿瘤相关的高钙血症的方法，当将人的肺或喉癌细胞移植进无胸腺鼠产生高钙血症而以抗PTHrP的中和抗血清给药时，血钙浓度和尿cAMP水平降低(临床研究杂志(1988)82，1798-1802)。Kanji Sato等报道当对移植产生PTHrP的人肿瘤的裸鼠使用抗-PTHrP(1-34)抗体给药时，高钙血症缓解，鼠的存活时间显著延长(J.Bone&
Mine.Res.(1993)8，849-860)。另外，日本未审专利申请(公开号为4-228089)公开了抗人PTHrP(1-34)的鼠/人嵌合抗体。
如上所述，虽然期望人源化抗体对紧急治疗恶性肿瘤相关的高钙血症危象是有用的，但是上述的参考文献中未公开抗PTHrP的人源化抗体，也没有任何建议。另外，在人源化抗体的制备过程中通常没有适用于任何抗体的标准方法，有必要研究与特异抗原显示充分结合力和中和活性的人源化抗体的多种手段和方法(参见，例如，Sato，K.等，癌症研究，53，851-856，1993)。
发明公开
本发明的目的时提供一种高钙血症危象治疗剂，其含有作为活性成分的能抑制副甲状腺激素相关的蛋白(PTHrP)与其受体之间结合的物质。
本发明人在开发这种治疗剂的过程中进行了广泛而周密的研究。
结果，本发明人发现能抑制PTHrP与其受体之间结合的物质可以达到所述目的。该发现导致完成了本发明。
即，本发明涉及一种高钙血症危象治疗剂，含有作为活性成分的能抑制副甲状腺激素相关的蛋白与其受体之间结合的物质。所述物质包括PTHrP受体的对抗剂和抗-PTHrP抗体。所述物质也可以是抗-PTHrP抗体的任何片段和/或其修饰形式。所述抗体(包括单克隆抗体)可举出人源化或嵌合化的物质(例如，人源化抗体为人源化#23-57-137-1抗体)。
本发明还涉及伴随恶性肿瘤的高钙血症危象治疗剂，含有作为活性成分的能抑制PTHrP与其受体之间结合的物质。
下面详细说明本发明。
本发明涉及高钙血症危象治疗剂，含有作为活性成分的能抑制副甲状腺激素相关的蛋白(下面简称为“PTHrP”)与其受体之间结合的物质。
本文中术语“能抑制PTHrP与其受体之间结合的物质”是指能与PTHrP结合，从而抑制PTHrP与其受体之间结合的任何物质，或能与PTHrP受体结合，从而抑制PTHrP与其受体之间结合的任何物质。前者物质的具体例子是抗-PTHrP抗体，后者物质的具体例子是抗PTHrP受体的对抗剂(也称PTHrP的对抗剂)。
PTHrP对抗剂包括多肽和低分子量的物质，例如，对抗性地与PTHrP受体结合抗PTHrP的物质，例如特开平7-165790号公报，Peptides(United States)1995，16(6)1031-1037，Biochemistry(UnitedStates)Apr.28 1992，31(16)4026-4033，特表平5-509098号公报等上记载的多肽，都包括在PTHrP对抗剂中。这些多肽根据肽合成常用方法可化学合成。
所述PTHrP对抗剂是能与本来的PTHrP肽竞争结合于PTHrP受体上，但抑制其后的信息传达，可抑制钙浓度的上升。
所述多肽中可以具有至少一个氨基酸残基的突变(如缺少、取代、加入、插入)，只要其能表现出同等的PTHrP对抗剂活性，这些多肽也包含在本发明的PTHrP对抗剂内。
优选的情况下，本发明的高钙血症危象治疗剂对每个患者使用0.1～10000mg/个体，更优选0.5～1000mg/个体，再更优选1～100mg/个体的剂量后，能迅速降低钙浓度，并且钙浓度长期不再上升或效果显著地持续。具体来讲，本发明的治疗剂在用药后24小时以内，优选6小时以内，最优选4小时以内，可以降低补正的血清钙浓度1mg/dL以上，或使其正常化(补正的血清钙浓度10.4mg/dL以下)或降低补正的血清钙浓度2mg/dL以上。更优选的是，用药后24小时以后，较好是3天以上，最好是5天以上、7天以上，最好是10天以上补正的血清钙浓度保持不再上升的状态，或使用药前后降低2mg/dL以上或保持正常化状态。
在这里，“补正的血清钙浓度”按以下算式根据血清蛋白浓度算出：
1、血清蛋白浓度低于4g/dL时，
补正的血清钙浓度(mg/dL)＝实测补正的血清钙浓度(mg/dL)+[4.0-血清蛋白浓度(g/dL)]
2、血清蛋白浓度为4g/dL或以上时，
补正的血清钙浓度(mg/dL)＝实测补正的血清钙浓度(mg/dL)
实施本发明的最佳方式
下面本发明将以抗-PTHrP抗体作为“能抑制PTHrP与PTHrP受体结合的物质”举例进行详细地说明。
所述抗-PTHrP抗体包括，例如，已知的抗体如人源化抗体、人抗体(WO96/33735)和嵌合抗体(特开平4-228089号公报)以及本发明公开的抗体(#23-57-137-1抗体)。所述抗体可以是多克隆抗体，但最好是单克隆抗体。
1、抗-PTHrP抗体
本发明中使用的抗-PTHrP抗体可以是任何抗体，只要它能够表现出对伴随恶性肿瘤的高钙血症危象具有治疗效果，而不管其来源、种类(单克隆或多克隆)和形状。
本发明中使用的抗-PTHrP抗体可通过已知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式产生。优选的情况下，本发明中使用的抗-PTHrP抗体为从哺乳动物得到的单克隆抗体。哺乳动物的单克隆抗体包括杂交瘤中产生的和以基因工程技术从用载有抗体基因的重组表达载体转化的宿主中产生的抗体。用于本发明的所述抗体是一种可与PTHrP结合以抑制PTHrP与PTH/PTHrP受体结合，从而切断PTHrP的信息传达，并接着成为抑制PTHRP生物学活性的抗体。
这些抗体的具体例子是从杂交瘤克隆#23-57-137-1产生的#23-57-137-1抗体。
记为“鼠-鼠杂交瘤#23-57-137-1”的杂交瘤克隆#23-57-137-1已经按照布达佩斯条约的条款于1996年8月15日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，科学和技术所代理，日本(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，保藏号为FERM BP-5631。
2、产生抗体杂交瘤
产生单克隆抗体的杂交瘤基本上采用已知的方法生产。即，PTHrP作为根据常规免疫方法的免疫抗原使用。所获得的免疫细胞按通常细胞融合方法与已知的亲细胞融合，并以通常筛选法从融合的细胞筛选出产生的单克隆抗体细胞。
更具体地说，产生单克隆抗体的细胞可由按以下步骤进行：
首先，用作产生抗体的敏化抗原的人PTHrP，通过在Suva，L.J.等，科学(1987)237，893中公开的表达PTHrP基因/氨基酸序列得到。即，编码PTHrP的碱基序列在任何已知的表达载体上插入，并且适当的宿主细胞用所述表达载体转化。按任何已知的方法从转化的宿主细胞或转化的宿主细胞培养上清液中分离和纯化目标PTHrP蛋白质。
然后，将纯化的PTHrP蛋白质用作敏化抗原。或者也可以将PTHrP的N末端区的34个氨基酸肽(SEQ ID NO：75)用作敏化抗原，可以化学合成法制备。
以敏化抗原免疫的哺乳动物没有特别限制，但最好考虑与用于细胞融合的亲细胞的适合性选择哺乳动物，一般使用齿类动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠，或兔、猴等。
按已知的方法用敏化抗原对动物进行免疫。例如，腹腔内或皮下对哺乳动物注射敏化抗原。具体来讲，敏化抗原用PBS(磷酸盐缓冲的盐水)或生理盐水等适量稀释或悬浮其中，然后将所得的悬浮液与合适量的助剂(例如弗氏完全助剂)混合得到乳化液。将所述乳化液注射到哺乳动物间隔4-21天注射数次。在免疫中，敏化抗原可以结合到使用适当的载体上。
在免疫后，检测血清抗体的浓度。当所述血清抗体的浓度达到所要求的含量时，从哺乳动物取出免疫细胞，进行细胞融合，最好的免疫细胞是脾细胞。
用于细胞融合的所述亲细胞(即，带有免疫细胞的细胞融合的对应物)是由哺乳动物获得的骨髓瘤细胞。所述骨髓瘤细胞是任何已知的细胞系，并且，例如P3(P3x63Ag8.653)(免疫学杂志，(1979)123：1548-1550)；P3x63Ag8U.1(微生物学和免疫学当前主题(1978)81：1-7)；NS-1(Kohler，G和Milstein，C.欧洲免疫学杂志(1976)6：511-519)；MPC-11(Margulies，D.H.等，细胞(1976)8：405-415)；SP2/0(Shulman，M.等，自然(1978)，276：269-270)；FO(de St.Groth，S.F.等，免疫学方法杂志(1980)35：1-21)；S194(Trowbridge，I.S.，实验医学杂志(1978)148：313-323)；或R210(Galfre，G等，自然(1979)277：131-133)。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合一般按已知的方法，例如Milstein方法(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等进行。
更具体来讲，上述细胞融合，例如，在细胞融合促进剂的存在下在通常的营养培养液中进行。细胞融合促进剂可使用聚乙二醇(PEG)或仙台病毒(日本的使红血球凝聚的病毒：HVJ)。根据要求，为提高融合效率，也可添加使用二甲亚砜等辅助剂。
用于细胞融合的免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可任意设定。例如，免疫细胞的用量可以是骨髓瘤细胞的1-10倍。用于细胞融合的培养液是，例如，适于骨髓瘤细胞系增殖的RPMI1640培养液或MEM培养液，或其常规用于这种细胞培养的培养液。如果需要，血清补液，如牛胎儿血清(FCS)可加入培养液中。
细胞融合是通过上述免疫细胞和骨髓瘤细胞按一定比例在上述培养液中混合均匀，加入事先加温到37℃左右的通常30-60％(w/v)浓度的PEG溶液(例如，平均分子量约为1000-6000)，然后混合所得的溶液形成目标融合细胞(杂交瘤)。然后，依次加入适当的培养液，离心除去上清液，反复几次，除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合促进剂。
由此得到的杂交瘤通过通常选择的培养液，例如，HAT(次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶)培养液培养，进行选择。上述HAT培养液中的培养需要持续足够的时间，通常几天-几周，消除目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)。然后，以通常限定稀释方法，进行产生目标抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
另外，具有抗PTHrP的结合活性的人抗体可以通过敏化的带有PTHrP的人淋巴球在体外制备，然后将敏化的淋巴球与人的能无限生长的骨髓瘤进行细胞融合(特开平1-59878号公报)。也可以，通过注射作为抗原的PTHrP到转基因的动物并无限增殖化所述细胞得到抗PTHrP的人抗体，因此人抗体可以由所述无限增殖化细胞获得，所述转基因的动物具有人抗体基因的所用组成成分以获得产生抗-PTHrP的抗体细胞(国际公开号WO 94/25585、WO 93/12227、WO 92/03918和WO 94/02602)。
如上所述制备的产生单克隆抗体的杂交瘤是在通常培养液中可传代培养，并在液氮中可长期保存。
为从杂交瘤中得到单克隆抗体时，可以使用包括按照通常方法培养杂交瘤，并从培养上清液中收集单克隆抗体的方法，或包括注射杂交瘤到与其适合的哺乳动物以在哺乳动物体内增殖杂交瘤，并从哺乳动物的腹水收集杂交瘤的方法。前一方法适合于得到高纯度抗体，后一方法适合于抗体的大量生产。
3、重组抗体
本发明也可使用重组型单克隆抗体，其可通过从杂交瘤克隆抗体基因，将所述克隆抗体基因在适当载体上整合，将所述载体引入宿主，以常规基因重组技术从宿主生产抗体(例如，Vandamme，A.M.等，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775)。
具体来讲，抗-PTHrP抗体的编码mRNA可变(V)区，从产生抗-PTHrP抗体杂交瘤分离。mRNA分离可以按已知的方法制备总RNA进行，如胍-超离心方法(Chirgwin，J.M.等，生物化学(1979)18，5294-5299)和AGPC法(Chomczynski，P等，分析生化(1987)162，156-159)，然后从总RNA用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等制备目标mRNA。也可以使用快速预备mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)制备目标mRNA。
接着，从得到的mRNA用逆转录酶合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成用AMV逆转录酶cDNA第一链合成试剂盒(生化学工业社制)进行。另外，cDNA的合成和扩增可通过5’-RACE法(Frohman，M.A.等，美国国家科学院年报，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究，17，2919-2932，1989)使用5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(CLONTECH Inc.)结合PCR方法(聚合酶链反应)进行。
从得到的PCR产物分离和纯化目标物DNA片段，然后与载体DNA连接获得重组的载体。将所述的重组载体导入宿主如大肠杆菌中，选择含有所需的重组载体的克隆。在所述重组载体的目标物DNA的碱基序列通过，例如，双脱氧核苷链终止方法确认。
一旦得到DNA编码的抗-PTHrP抗体的V区，将DNA与含有DNA编码的所述抗体恒定区(C区)的表达载体整合。
制备本发明所用抗-PTHrP抗体时，将所述抗体基因与表达载体整合，使抗体基因能在表达控制区(例如增强剂，促进剂)的控制下被表达。然后，由所述表达载体转化宿主细胞以表达抗体。
在抗体基因的表达中，将抗体的DNA编码的重链(H链)或轻链(L链)分别与表达载体整合，并且然后将宿主细胞与所得的重组表达载体一起转化。也可以将抗体的DNA编码的H链和L链与单独的表达载体一起整合，然后将宿主细胞与所得的重组表达载体一起转化(WO 94/11523)。
另外，在重组抗体的制备中，除了上述宿主细胞之外，也可使用转基因动物作为宿主。例如，抗体基因插入到动物乳汁中固有(羊的β-酪蛋白等)的基因编码的蛋白质的预定的位置，从而产生融合基因。将含有插入抗体基因的融合基因的DNA片段注入到羊的胚胎中，并把该胚胎导入到雌性羊中。接受胚胎的雌性羊可出生转基因羊。从转基因羊或其子孙的乳汁得到所需的抗体。为增加含有所需抗体的乳脂量，也可对转基因羊使用适当的激素(Ebert，K.M等，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
4、修饰抗体
本发明中为降低对人体等异性的目的，可以使用人工修饰的重组型抗体，例如，嵌合抗体、人源化抗体。这些修饰的抗体可用已知的方法制备。
可用于本发明的嵌合抗体通过将上述方法得到的DNA编码的抗体V区与DNA编码的人抗体C区连接，将所述连接的产物与表达载体整合，并将所得的重组表达载体导入宿主而得到嵌合抗体。
人源化抗体又称“再构成人抗体”，其中人以外的哺乳动物例如鼠抗体互补决定区(CDRs)被移植到人抗体互补决定区。其一般产生这种人源化抗体的基因重组方法也是已知的(EP 125023，WO96/02576)。
具体来讲，设计为与鼠抗体的CDRs和人抗体的框架区(FRs)连接的DNA序列，通过用几个寡聚核苷作为引物在CDRs和FRs双方末端区上形成重叠部分的PCR方法合成。所得的DNA与DNA编码的人抗体的C区连接，并将所述连接的产物与表达载体整合。将所述重组表达载体引入宿主，产生人源化抗体(EP 239044，WO96/02576)。
选择通过CDRs连接的FRs使得CDRs能形成互相满意的抗原结合部位。如果必要，也可以取代抗体V-区的FRs中的氨基酸，使得再构成人抗体的CDRs形成适当的抗原结合部位(Sato，K.等.，CancerRes.(1993)53，851-856)。
嵌合抗体或人源化抗体的C-区可以是任何人抗体C-区，例如，可在H链使用的Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4，和在L链使用的Ck、Cγ。另外，为改善抗体或其生成稳定性，也可修饰人抗体C区。
嵌合抗体是由人以外哺乳动物抗体的V-区和人抗体的C-区组成。另一方面，人源化抗体是由人以外的哺乳动物抗体的C-区、人抗体的FRs和C-区构成。人源化抗体因降低人体内的抗原性，用作本发明治疗剂的活性成分。
本发明可使用的人源化抗体的具体的例子是人源化#23-57-137-1抗体，其CDRs得自鼠衍生的#23-57-137-1抗体；所述L-链是由通过由人抗体HSU 03868(GEN-BANK，Deftos，M等，Scand.J.Immunol.，39，95-103，1994)获得的三个FR片段(FR1，FR2，FR3)连接的CDRs和由人抗体S25755(NBRF-PDB)获得的FR片段(FR4)组成；所述H链是由通过从人抗体S31679(NBRF-PDB，鉴定Cuisinier A.M，Eur.J.Immunol.，23，110-118，1993)获得的FRs连接的CDRs组成，其中取代FRs中的部分氨基酸残基，使得再构成人抗体具有抗原结合活性。
含有人源化#23-57-137-1抗体的DNA编码的L链或H链质粒的大肠杆菌株，分别定义为大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)(对于H-链)和大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)(对于L-链)。这些菌株已根据布达佩斯条约于1996年8月15日保藏在国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，保藏号为大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)：FERM BP-5629，大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)：FERMBP-5630。
5、抗体的变体
本发明使用的抗体只要是能与PTHrP结合，抑制PTHrP的活性，可以为任何抗体的片段或其修饰物。例如，抗体片段包括：Fab，F(ab’)2，Fv或由H链或L链的Fv片段以适当连接方式连接的单链Fv(scFv)。
具体来讲，这种抗体片段由酶处理，例如木瓜酶、胃蛋白酶处理，裂解抗体生成抗体片段，或通过构筑基因编码的这些抗体片段，并将所述基因导入到表达载体，再将所获得的重组表达载体引入以适当的宿主细胞，从而表达抗体片段(例如，Co，M.S.等，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.&Horwitz，A.H.，Methods inEnzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.，Plueckthum，A.&Skerra，A.，Methods in Enzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.，Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663，Rousseaux，J.等，Methods in Enzymology(1989)121，663-669，Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv通过连接抗体H链V区和L链V区而得到。在这scFv中，H链V区和L链V区的连接最好是介入肽连接(Huston，J.S.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中H链V区和L链V区也是本发明说明书中记载的抗体的所有来源。连接V区的肽链，可用12-19个氨基酸残基的任何单链肽。
DNA编码的scFv可分别用DNA片段编码的包括V-区的整个H链或部分H链和DNA片段编码的包括V-区的整个L链或部分L链为模板和限定所述DNA片段的末端为引物对通过首先以PCR法扩增上述抗体的DNA编码的H-链或L-链V-区；然后用DNA片段编码的肽连接作为模板并限定所述DNA片段的末端为引物，扩增DNA编码的肽连接使其两端连接H链和L链的V-区而得到。
另外，一旦制备DNA编码的scFv，以常规法可得到载有DNA的表达载体和用所述表达载体转化的宿主。所述scFv可从转化的宿主，按任何常规法得到。
用于本发明的所述抗体片段按上述方法通过制备片段基因和在合适的宿主中表达所述基因而制备。本发明中“抗体”也包括这些抗体的片段。
作为上述抗体的修饰形式，例如可以使用与PEG等各种分子结合的抗-PTHrP抗体。本发明中“抗体”也包括这些修饰的抗体。所述修饰的抗体可通过抗体的化学改性方法得到。目前，用于此目的的化学改性方法在此领域中已建立。
6、重组型抗体或修饰抗体的表达和制备
上述方法构筑的抗体基因可按已知的方法表达并取得。对于哺乳类细胞的表达，一种常用的促进剂，表达的抗体基因和其3’侧下游的聚A信号被有机地结合。例如，作为有用的促进剂/扩增剂，可使用人细胞巨化病毒前期促进剂/扩增剂系统。
另外，本发明中使用的抗体表达用促进剂/扩增剂系统，可举出退化病毒、polyomer病毒、腺病毒、猿猴病毒(SV40)等病毒促进剂/扩增剂，或人延长因子1α(HEF1α)等哺乳动物细胞的促进剂/扩增剂。
使用SV40促进剂/扩增剂系统时，以Mulligan方法(Nature(1979)277，108)容易进行基因表达；而使用HEF1α促进剂/扩增剂系统时，以Mizushima方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)，容易进行基因表达。
对于在大肠杆菌中的表达，一种常用的促进剂，一种产生目标抗体的信号序列和抗体基因有机地结合。作为促进剂，可使用lacZ促进剂和araB促进剂。使用lacZ促进剂时，以Ward方法(Nature(1098)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)进行表达，使用araB促进剂时，以Better方法(Science(1988)240，1041-1043)进行表达。
关于抗体分泌的信号序列，当想在大肠杆菌的peliplasm中分泌目标抗体时，可使用peIB信号序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.，(1987)169，4379)。因此，分离在peliplasm中产生的的抗体后，重折叠以使抗体具有适当的结构。
得自SV40、polyoma病毒、腺病毒、牛papilloma病毒(BPV)的复制源等也可使。为了在宿主细胞系扩增基因复制数，表达载体可以额外含有选择性标记的基因如氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因和二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。
为制备本发明使用的抗体，可使用任意表达系统，例如真核细胞或原核细胞系。真核细胞包括建立的哺乳类细胞系、昆虫细胞系、线状菌细胞系和酵母细胞系等动物细胞系。原核细胞包括大肠杆菌细胞等的细菌细胞。
本发明中使用的抗体最好在哺乳类细胞，例如CHO，COS，骨髓瘤细胞、BHK，Vero和HeLa细胞中表达。
然后，通过转化的宿主细胞的体外或体内培养产生抗体。宿主细胞的培养按任何已知的方法进行。用于本发明的培养液可使用DMEM，MEM，RPMI1640或IMDM。所述培养液含有如FCS(牛胎儿血清)等血清补液。
7、抗体的分离和纯化
上述方法表达和产生的抗体可从细胞或宿主动物分离并纯化均匀。用于本发明的抗体的分离和纯化可用亲和柱进行。蛋白质A柱的例子包括Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia制)。此外，也可以使用其他常规用于抗体的分离和纯化的方法；因此，该方法没有特别地限制。例如，通过适当单独或结合上述亲和柱以外的色谱柱、过滤器、超微过滤器、盐析、透析等分离和纯化抗体(Antibodies ALaboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。
8、确认抗体活性
本发明可以通过常规方法测定抗体抗原结合活性(Antibodies ALaboratory Manual，Ed.Harlow，David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)和抗配合受体抑制活性(Harada，A.等，InternationalImmunology(1993)5，681-690)。
对于本发明使用的抗-PTHrP抗体的抗原结合活性的测定方法，可以采用，例如常规免疫方法例如ELISA(酶结合免疫吸附检测法)，EIA(酶免疫测定法)，RIA(放射免疫测定法)或荧光抗体法。例如，用酶免疫测定法时，涂PTHrP(1-34)的平板上，加入含有抗-PTHrP抗体的样品溶液，如抗-PTHrP抗体产生细胞培养上清液或纯化形式的抗-PTHrP抗体本身。向平板进一步添加碱性磷酸酯酶等酶标识二次抗体，并培养和洗净后，加入p-硝基苯基磷酸等酶底物，测定板中的溶液的吸收，由此评价抗原结合的抗体活性。
为确认本发明使用的抗体活性，测定抗-PTHrP抗体的中和活性。
9、给药方法和药物制剂
本发明的治疗剂是用于治疗或改善伴随恶性肿瘤的高钙血症危象。
有效给药剂量可以从每千克体重0.001到1000毫克范围内选择。或者，给药剂量为0.01到100000/个体，优选为0.1到10000/个体，更优选0.5到1000毫克/个体，最优选1～100毫克/个体范围。但本发明的含抗-PTHrP抗体的治疗剂的剂量并不局限于这些给药量。
另外，给药时间可以在任何阶段，包括在伴随恶性肿瘤的高钙血症危象产生前后，或也可以在预测体重减少时给药。
含本发明抗-PTHrP抗体作为活性成分的药剂组合物可以通过常规方法(Remington’s Pharmaceutical Science，latest edition，MarkPublishing Company，Easton，美国)作成制剂。该制剂可以进一步包括可药用载体和/或添加剂。
所述载体和添加剂的例子可以包括水、药物学可接收的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、聚乙而醇、二甘油、甘油、聚丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和可以作为药物添加剂的表面活性剂。
在实际应用中，使用的添加剂可以选择上述之一或组合，但不限于此。例如，作为注射用制剂使用时，可使用纯化的抗-PTHrP抗体用生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等溶剂溶解，并且其中加入吸附防止剂(如Tween80，Tween20，明胶、人血清蛋白)等的物质。或使用前为作为溶解再形成的冷冻干燥剂型。对于制备冷冻干燥的剂型，可以加入赋形剂如甘露醇糖、葡萄糖等糖醇和糖类。
图片的简单说明
图1表示鼠抗-PTHrP抗体对伴随恶性肿瘤的高钙血症危象的治疗效果(血液钙离子浓度的变化)。
图2表示鼠抗-PTHrP抗体对伴随恶性肿瘤的高钙血症危象的治疗效果(体重的变化)。
图3表示人源化抗-PTHrP抗体对伴随恶性肿瘤的高钙血症危象的治疗效果(血液钙离子浓度的变化)。
图4表示人源化抗-PTHrP抗体对伴随恶性肿瘤的高钙血症危象的治疗效果(体重的变化)。
图5表示人源化抗-PTHrP抗体对伴随恶性肿瘤的高钙血症危象的治疗效果(血液钙离子浓度的变化)。
图6表示人源化抗-PTHrP抗体对伴随恶性肿瘤的高钙血症危象的治疗效果(体重的变化)。
实施例
下文将通过参考例和实施例详细描述本发明，这些实施例不应该构成对本发明范围的限制。
实施例1：对伴随恶性肿瘤的高钙血症危象模型动物的药效试验
用高钙血症模型动物(移植了人肿瘤的裸鼠)，研究PTHrP对鼠单克隆抗体和人源化单克隆抗体的高钙血症危象的治疗效果。
模型动物使用移植了人脾脏癌FA-6(东京女子医大、佐藤干二教授捐献)或人肺癌株LC-6-JCK((财)从实验动物中央研究所购买)的裸鼠或裸大鼠。这些移植人脾脏癌的裸鼠或裸大鼠，随着肿瘤的增大，血中钙浓度很快上升，并出现体重的急剧减少、全身状态的恶化、有时达到死亡等所有高钙血症危象症状。该症状由鼠单克隆抗体和人源化单克隆抗体来改善的结果，以体重和血液钙离子浓度指标来评价。
人肿瘤株继续维持和模型动物的制备
人脾脏癌FA-6和人肺癌LC-6的继续用BALB/c-nu/nu裸鼠(日本CLEA公司)体内进行。对鼠的药效评价，购买5周龄雄性裸鼠(BALB/c-nu/nu裸鼠日本CLEA公司)，驯化1周后，得到6周龄的动物。对大鼠的药效评价，购买5周龄雄性裸大鼠(F344/NJcl-rnu日本CLEA公司)，驯化1周后，得到6周龄的动物。
高钙血症模型动物的制备和分组按以下方式进行：
摘除继续的肿瘤，细刻3mm四方块，每一只动物的腋腹皮下移植1个。移植后，确认肿瘤体积充分变大和血液钙离子浓度上升后，按评价指标的肿瘤体积、血液钙离子浓度和体重分组，是各指标平均化，用作高钙血症模型动物。将鼠和大鼠分为三组，一组为评价抗体给药的测试组，一组为给药对照组，另一组为溶剂给药(在该测试中用PBS)对照组。
血液钙离子浓度的测定
抗体给药后，在2小时、4小时、24小时(用鼠的药效试验)或1小时、2小时、4小时、24小时(用大鼠的药效试验)，测定血液钙离子浓度，进行各抗体的药效评价。血液钙离子浓度是用血球体积计取出眼窝(鼠)或尾静脉(大鼠)的血，用643自动Ca/ph分析计(CIBA-CORNING)进行测定。另外，测定抗体给药前和给药24小时后的体重。
肿瘤体积的测定
测定肿瘤的长径(amm)和短径(bmm)，以Galant等式ab2/2，算出肿瘤体积。
对伴随恶性肿瘤的高钙血症危象的治疗效果研究按以下方式进行。
1)鼠单克隆抗体(#23-57-137-1)的药效试验
鼠单克隆抗体(#23-57-137-1)的药效试验是，在上面制备的分组的模型鼠的尾静脉内，一次注射用0.1mlPBS配制的抗体100μg(100μg/0.1ml PBS/鼠)。作为对照药，用已用于高钙血症危象治疗的降钙素制剂(药品名：CALCITOLAN：帝国脏器制药(株)制)100U/kg，在尾静脉内一次注射。作为对照，在尾静脉内一次注射PBS0.1ml/鼠。(参见图1和2)
2)人源化抗体(hMBC(q))药效试验
1、高钙血症模型鼠的药效试验
人源化抗体药效试验是在高钙血症模型鼠的尾静脉内一次注射抗体30μg/0.1ml PBS/鼠。作为对照药，降钙素制剂(药品名：益钙灵：旭化成工业(株)制)100U/kg，在尾静脉内一次注射。作为对照，在尾静脉内一次注射PBS O.1ml/鼠。(图3，图4)
2、高钙血症模型大鼠的药效试验
人源化抗体药效试验是在高钙血症模型大鼠的尾静脉内一次注射抗体0.5mg/1ml PBS/kg。作为对照药，降钙素制剂(药品名：益钙灵：旭化成工业(株)制)1U/kg，在尾静脉内一次注射。作为对照，在尾静脉内一次注射PBS 1ml/kg。(图5，图6)
其结果，鼠单克隆抗体和人液化抗体的伴随高钙血症模型的血液钙离子浓度迅速下降(图1，图3，图5)。相反于降钙素制剂的临时效果，抗体的作用效果快且持续。另外，抗体给药组中也出现降钙素制剂给药组没有的24小时后恢复体重的现象(图2，图4，图6)。
由此，具有抗PTHrP中和活性的鼠单克隆抗体或人源化抗体，作为紧急治疗伴随恶性肿瘤的高钙血症危象的治疗剂是有用的。
参考例1
产生抗-PTHrP(1-34)鼠单克隆抗体的杂交瘤的制备
能够产生抗人PTHrP(1-34)、#23-57-154和#23-57-137-1单克隆抗体的杂交瘤按照Kanji Sato等报道的方法制备(Sato，K.等，BoneMiner.研究杂志，8，849-860，1993)。人PTHrP(1-34)氨基酸序列在SEQ ID NO：75表示。
使用的免疫原是PTHrP(1-34)(Peninsula)，用碳二亚胺(Dojinn)将所述PTHrP键合到载体蛋白甲状腺球蛋白上。透析甲状腺球蛋白键合PTHrP(1-34)获得蛋白浓度为2μg/毫升的溶液。得到的溶液与弗氏助剂(Difco)以1∶1的比例混合得到乳剂。该乳剂以100μg/鼠的剂量分别对16只雌鼠BALB/C背部皮下注射或腹膜内注射以免疫接种鼠，注射11次。对于引发免疫，使用弗氏完全助剂，当促进免疫时使用弗氏不完全助剂。
以下列方式测定每只免疫接种鼠血清中的抗体滴度。从每只鼠尾静脉取血，然后离心该血样获得抗-血清。将抗-血清用RIA缓冲液稀释，并与125I-标记的PTHrP(1-34)混合，测定其结合活性。高抗体滴度的鼠以50μg/鼠的剂量腹膜内注射无载体蛋白的PTHrP(1-34)作为最后免疫接种。
最后免疫接种后三天，处死鼠，切除它们的脾。然后，按照已知的常规方法用50％聚乙二醇4000使脾细胞与鼠骨髓瘤细胞系P3x63Ag8U.1进行细胞融合。如此制备的融合细胞在96孔的平板中以2×104/孔的量在85个孔中培养。感兴趣的杂交瘤通过HAT培养如下述进行筛选。
用固相RIA法确定HAT培养基中观察到细胞生长的孔的培养物上清液中PTHrP-识别抗体的存在来筛选杂交瘤。从明确具有识别PTHrP-抗体结合能力的孔中收集杂交瘤。获得的杂交瘤悬浮于含15％FCS并添加OPI-补充物(Sigma)的RPMI-1640培养基中，随后采用限制稀释法匀化杂交瘤，因此获得两种杂交瘤克隆类型，#23-57-154和#23-57-137-1，均对PTHrP(1-34)表现强结合能力。
记为“鼠-鼠杂交瘤#23-57-137-1”的杂交瘤克隆#23-57-137-1已经按照布达佩斯条约的条款于1996年8月15日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，科学和技术所代理，日本(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，保藏号为FERM BP-5631。
参考例2
编码鼠抗人PTHrP(1-34)单克隆抗体V区DNA的克隆
编码抗人PTHrP(1-34)#23-57-137-1的鼠单克隆抗体V区的DNA，按照下列方式进行克隆。
(1)mRNA的制备
从杂交瘤#23-57-137-1用Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)如下述制备mRNA。上述获得的杂交瘤#23-57-137-1细胞用提取缓冲液完全匀化，用低聚(dT)-纤维素旋转柱按照试剂盒生产商规定的程序从其中分离和提存mRNA。提取溶液用乙醇沉淀获得作为沉淀的mRNA。mRNA沉淀溶解于洗脱缓冲液。
(2)编码鼠H链V区基因的cDNA的制备和扩增
(i)#23-57-137-1抗体H链V区的cDNA的克隆
编码抗人PTHrP鼠单克隆抗体H链V区的基因通过5’-RACE法克隆(Frohman，M.A.等，美国国家科学院年报，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究17，2919-2932，1989)。该方法用5’-AmpliFINDER RACE试剂盒(CLONETECH)按照生产商的程序进行。该方法中，用于合成cDNA的引物是MHC2引物(SEQ ID NO：1)，其可与鼠H链C区杂交。作为cDNA合成模板的2μg上述获得的mRNA与10皮摩尔MHC2引物混合。得到的混合物与逆转录酶在52℃反应30分钟以制备与mRNA互补的cDNA。
产物与6NNaOH混合以水解其中的mRNA(65℃反应30分钟)，然后乙醇沉淀分离纯化作为沉淀的cDNA。如此分离纯化的cDNA与T4 RNA连接酶在37℃反应6小时，并另外室温反应16小时，以使cDNA连接到Ampli FINDER Anchor(SEQ ID NO：42)的5’末端上。使用了锚引物(SEQ ID NO：2)和MHC-G1引物(SEQ ID NO：3)作为PCR法扩增cDNA的引物(S.T.Jones等，生物技术，9，88，1991)。
该方法中使用的PCR溶液50μl中包括10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，0.25mM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1.5mM MgCl2，2.5单位TaKaRa Taq(Takara Shuzo)，10皮摩尔锚引物，和1μl MHC-G1引物和Ampli FINDER Anchor引物连接其上的cDNA反应混合物，并且该混合物用50μl矿物油液封。用热循环仪480J型(Perkin Elmer)进行PCR反应30个循环，循环温度为94℃45秒；60℃45秒；72℃2分钟。
(ii)#23-57-137-1抗体L链V区的cDNA的克隆
编码抗人PTHrP鼠单克隆抗体L链V区的基因通过5’-RACE法克隆(Frohman，M.A.等，美国国家科学院年报，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究17，2919-2932，1989)。该方法用5’-AmpliFINDER RACE试剂盒(Clonetech)按照生产商的程序进行。该方法中，低聚-dT引物用作合成cDNA的引物。2μg上述mRNA(作为cDNA合成模板)与低聚-dT引物混合。得到的混合物与逆转录酶在52℃反应30分钟以制备cDNA。产物与6N NaOH混合以水解其中的RNA(65℃反应30分钟)，得到的混合物用乙醇沉淀，分离纯化作为沉淀的cDNA。如此合成的cDNA与T4 RNA连接酶在37℃反应6小时，并另外室温反应16小时，以使cDNA连接到Ampli FINDER Anchor的5’末端上。
在鼠L链λ链C区保守序列的基础上设计PCR引物ML C(SEQ IDNO：4)，然后用394 DNA/RNA合成仪(ABI)合成。用于合成引物的PCR溶液100μl中包括10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，0.25mM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1.5mM MgCl2，2.5单位AmpliTaq(Perkin Elmer)，50pmoles锚引物(SEQ ID NO：2)，和1μlML C(SEQ ID NO：4)引物和Ampli FINDER锚引物连接其上的cDNA反应混合物，上面覆盖50μl矿物油。用热循环仪480J型(Perkin Elmer)进行PCR反应35循环，温度循环为94℃45秒；60℃45秒；72℃2分钟。
(3)PCR产物的纯化和裂解成片段
上述PCR法扩增的每种DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.产品)通过琼脂糖凝胶电泳分离。分别从凝胶上切下长度约为550碱基对DNA片段的每种H链V区和L链V区的琼脂糖凝胶片段。获得的每种凝胶组份用GENECLEANII试剂盒(BIO 101)按照生产商提供的程序纯化其中的DNA。纯化的DNA用乙醇从溶液中沉淀出来，然后溶解于含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的20μl溶液中。这样制备的DNA溶液1μl用限制性酶XmaI(New EnglandBiolabs)于37℃消化1小时，另外用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)于37℃消化1小时。消化混合物用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀，收集DNA。
按照这种方式使得获得的编码鼠H链V区的DNA和编码鼠L链V区的基因都具有5’末端EcoRI识别序列和3’末端XmaI识别序列。
每一种包含编码鼠H链V区基因和编码鼠L链V区基因的EcoRI-XmaI DNA片段分别与事先用EcoRI和XmaI消化的pUC19载体使用DNA连接试剂盒ver.2(Takara Shuzo)按照生产商推荐的程序于16℃反应1小时，以彼此连接。获得的连接混合物10μl加入100μl含大肠杆菌JM109(Nippon Gene)感受态细胞的溶液。冰上静置细胞混合物15分钟，42℃静置1分钟，然后再于冰上静止1分钟。产物与300μlSOC培养基混合(分子克隆：实验室手册，Sambrook，等，Cold SpringHarbor Laborarory Press，1989)，于37℃保温30分钟。得到的细胞溶液接种到添加100或50μg/毫升氨苄青霉素，0.1mM IPTG和20μg/毫升X-gal的LB或2xYT琼脂培养基上(分子克隆：实验室手册，Sambrook，等，Cold Spring Harbor Laborarory Press，1989)，然后于37℃保温过夜。按照这种方式，即可制备大肠杆菌转化体。
该转化体在含100或50μg/毫升氨苄青霉素的2毫升LB或2xYT培养基上于37℃培养过夜，然后用质粒提取仪PI-100(Kurabou)或QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片制备质粒DNA。确定获得的质粒DNA的序列。
(4)基因编码鼠抗体V区的cDNA序列
承载于质粒上的编码区cDNA的碱基序列用染料终止循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)由DNA测序仪373A(ABI；Perkin-Elmer)确定。这是通过使用M13引物M4(Takara Shuzo)(SEQ ID NO：5)和M13引物RV(Takara Shuzo)(SEQ ID NO：6)确定两个方向上碱基序列的DNA测序方法。
获得的包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区的cDNA和编码鼠L链V区基因的质粒分别被记为“MBC1H04”和“MBC1L24”。编码鼠#23-57-137-1抗体H链V区的碱基序列和L链V区的碱基序列(包括相应的氨基酸序列)，分别承载于质粒MBC1H04和质粒MBC1L24)分别如SEQ ID NO：57和65所示。H链V区和L链V区的多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：46和45所示。
具有质粒MBC1H04的大肠杆菌和具有质粒MBC1L24的大肠杆菌分别被记为“大肠杆菌JM109(MBC1H04)”和“大肠杆菌JM109(MBC1L24)”。这些大肠杆菌株系已经按照布达佩斯条约的条款于1996年8月15日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，科学和技术所代理，日本(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，大肠杆菌JM109(MBC1H04)的保藏号为FERM BP-5628，大肠杆菌JM109(MBC1L24)的保藏号为FERM BP-5627。
(5)抗人PTHrP鼠单克隆抗体#23-57-137-1 CDRs的确定
H链V区和L链V区的一般结构彼此相似。即，两者都有通过三个高可变区(即，互补决定区(CDRs))连接四个框架区(FRs)的结构。框架区的氨基酸序列相对保守，而CDRs区的氨基酸序列表现相当高的诱变性(Kabat，E.A.等，“具有免疫活性的蛋白序列”，美国健康和人服务部门，1983)。
基于上述事实，可以参考Kabat，E.A.等建立的抗体氨基酸序列数据库通过检索鼠单克隆抗体V区氨基酸序列的同源性确定CDRs。
L链V区中CDRs1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：59-61所示，H链V区中CDRs1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：62-64所示。
表1
V区 SEQ ID NO. CDR1 CDR2 CDR3
H链V区 57 31-35 50-66 99-107
L链V区 65 23-34 50-60 93-105
参考例3
嵌合抗体的构建
(1)嵌合抗体H链的构建
(i)H链V区的构建
编码鼠H链V区的克隆cDNA用PCR法修饰，以将其连接到携带人H链C区Cγ1基因组DNA的表达载体上。使用的下游侧端引物MBC1-S1(SEQ ID NO：7)设计为可以与编码的V区引导序列5’-区的DNA杂交，并具有Kozak共有序列(Kozak，M等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)和HindIII识别序列。使用的上游引物MBC1-a(SEQ ID NO：8)设计为可以与编码J区3’-末端区的DNA杂交，并具有接合供体序列和BamHI识别序列。使用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)并添加缓冲液进行PCR反应。使用的PCR溶液50μl包括0.07μg的质粒MBC1H04作为模版DNA，50pmole的MBC1-a和50pmole的MBC1-S1作为引物，添加到缓冲液中2.5U的TaKaRa Ex Taq和0.25mM的dNTP，液面用50μl矿物油覆盖。PCR反应进行30次循环，温度循环为94℃1分钟55℃1分钟；72℃2分钟。PCR反应扩增的DNA片段使用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.产品)通过琼脂糖电泳分离。
然后，除下含长度为437碱基对DNA片段的琼脂糖凝胶片段，用GENECLEANII试剂盒(BIO101)按照试剂盒商介绍的方法纯化DNA片段。纯化的DNA通过乙醇沉淀收集，然后溶解于20μl含10mMTris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。得到的DNA溶液一微升用限制性酶BamHI和HindIII(Takara Shuzo)于37℃消化1小时。消化混合物用苯酚和氯仿提取，然后乙醇沉淀收集DNA。
获得的包含编码鼠H链V区基因的HindIII-BamHI DNA片段亚克隆到用HindIII和BamHI消化过的pUC19载体。得到的质粒使用M13引物M4和M13引物RV作为引物，和染料终止循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测序。包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区的正确碱基序列的DNA和具有5’末端区的HindIII识别序列和Kozak序列以及3’末端区的BamHI识别序列的质粒被记为“MBC1H/pUC19”。
(ii)用于制备鼠-人嵌合H链cDNA型的H链V区的构建
上述步骤构建的编码鼠H链V区的DNA用PCR法修饰，以使其连接到人H链C区Cγ1的cDNA上。设计了用于修饰H链V区的反向引物MBC1HVS2(SEQ ID NO：9)以便用甘氨酸替代编码V区引导序列前面部分序列的第二个氨基酸(即，天冬氨酸)，并具有Kozak共有序列(Kozak，M等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)及HindIII和EcoRI-识别序列。同时设计了用于修饰H链V区的正向引物MBC1HVR2(SEQ ID NO：10)以便可与编码J区3’末端区的DNA序列和编码C区5’末端区的DNA杂交，并具有ApaI-和SmaI-识别序列。
使用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)及所附的缓冲液进行PCR反应。使用的PCR溶液50μl包括0.6μg的质粒MBC1H/pUC19作为模版DNA，50pmole的MBC1HVS2和50pmole的MBC1HVR2作为引物，缓冲液中的2.5U的TaKaRa Ex Taq和0.25mM的dNTP，液面用50μl矿物油覆盖。PCR反应进行30次循环，温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。PCR反应扩增的DNA片段使用1％Sea KemGTG琼脂糖(FMC Bio.产品)通过琼脂糖电泳分离。然后，切下含长度为456碱基对DNA片段的琼脂糖凝胶片段，用GENECLEAN试剂盒(BIO101)按照试剂盒商介绍的方法纯化其中的DNA片段。纯化的DNA用乙醇沉淀收集，然后溶解于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
得到的DNA溶液一微升用限制性酶EcoRI和SmaI(Takara Shuzo)于37℃消化1小时。消化混合溶液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀收集DNA。获得的包含编码鼠H链V区的基因的EcoRI-SmaI DNA片段亚克隆到用EcoRI和SmaI消化过的质粒pUC19载体上。得到的质粒使用M13引物M4和M13引物RV，和染料终止循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测序。包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区的正确碱基序列的DNA并具有5’末端区EcoRI-和HindIII-识别序列和Kozak序列以及3’末端区ApaI和SmaI-识别序列的质粒被记为“MBC1Hv/pUC19”。
(iii)嵌合抗体H链表达载体的构建
包含人抗体H链C区Cγ1的cDNA按照如下方法制备。
从将编码人源化PM1抗体H链V区和人抗体H链C区IgG1的基因组DNA的表达载体DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f(见WO92/19759)和编码人源化PM1抗体L链V区和人抗体L链κ链C区的基因组DNA的表达载体RV1-PM1a(见WO92/19759)导入的CHO细胞中制备mRNA。通过获得的mRNA，用RT-PCR法克隆包含人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA，然后亚克隆到质粒pUC19的HindIII-BamHI位点。确定亚克隆质粒的DNA序列，具有正确碱基序列的质粒被记为“pRVh-PM1f-cDNA”。
制备了具有SV40启动子和DHFR基因之间HindIII位点缺失和EF-1α启动子和人源化PM1抗体H链V区之间EcoRI位点缺失的表达载体，用于构建包含人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1基因的cDNA的表达载体。
获得的质粒pRVh-PM1f-cDNA用BamHI消化，用Klenow片段使末端平齐化，进一步用HindIII消化，从而获得平端HindIII-BamHI片段。这种HindIII-BamHI平端片段分别连接到上述已经用HindIII和BamHI消化的HindIII位点和BamHI位点缺失的表达载体DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f上以构建包含编码人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1cDNA的表达载体RVh-PM1f-cDNA。
包含编码人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA的表达载体RVh-PM1f-cDNA用ApaI和BamHI消化，从其中收集包含H链V区的DNA片段。将得到的DNA片段导入上述用ApaI和BamHI消化过的质粒MBC1Hv/pUC19中。如此制备的质粒被记为“MBC1HcDNA/pUC19”。这种质粒是分别包含cDNA编码的鼠抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的质粒，并具有5’端EcoRI-和HindIII识别序列以及3’端BamHI识别序列。
质粒MBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得碱基序列编码的嵌合抗体H链的DNA片段。得到的DNA片段导入预先用EcoRI和BamHI消化的表达载体pCOS1中。这样获得的嵌合抗体的表达载体记为“MBC1HcDNA/pCOS1”。其中，用EcoRI和SamI消化使HEF-PMh-gγ1(见W092/19759)抗体基因缺失，然后将它连接到EcoRI-NotI-BamHI接合物(Takara Shuzo)上，以构建表达载体pCOS1。
为制备在CHO细胞中表达的质粒，质粒MBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得嵌合抗体H链的DNA片段，然后其被导入预先用EcoRI和BamHI消化的表达质粒pCHO1中。这样获得的嵌合抗体的表达质粒记为“MBC1HcDNA/pCHO1”。其中，用EcoRI和SamI消化使DHFR-ΔE-RVh-PM1-f(见WO92/19759)抗体基因缺失，然后将它连接到EcoRI-NotI-BamHI接合物(Takara Shuzo)上，以构建表达载体pCHO1。
(2)人L链C区的构建
(i)克隆载体的制备
为构建包含人L链C区基因的pUC19载体，制备了HindIII位点缺失的pUC19载体。2μg的pUC19载体用20μl包含20mM Tris-HCl(pH8.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(TakaraShuzo)反应液于37℃消化1小时。得到的消化混合液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀，收集感兴趣的DNA。
收集到的DNA在50μl包含50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，100mM NaCl，0.5mM dNTP和6U Klenow片段(GIBCO BRL)的反应液中室温反应20分钟以钝化DNA末端。这种反应混合物用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀收集载体DNA。
这样收集到的载体DNA在10μl包含50mM Tris-HCl(pH 7.6)，10mM MgCl2，1mM ATP，1mM DTT，5％(v/v)聚乙二醇-8000，和0.5U T4DNA连接酶(GIBCO BRL)的反应液中16℃反应2小时以使载体DNA自主连接。5μl反应液加入100μl包含感受态大肠杆菌JM109(NipponGene)细胞的溶液中，得到的溶液冰上静置30分钟，42℃反应1分钟，进一步置于冰上1分钟。反应溶液中加入了500微升SOC培养基，37℃培养1小时。得到的溶液在表面添加X-gal和IPTG的2xYT琼脂培养基(包含50μg/毫升的氨苄青霉素)上铺板(分子克隆：实验室手册，Sambrook，等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，然后37℃培养过夜，由此获得转化体。
转化体在包含50μg/毫升的氨苄青霉素的2xYT琼脂培养基中37℃培养过夜。从培养基的细胞碎片用质粒Mini试剂盒(QIAGEN)按照试剂盒上的介绍分离纯化质粒DNA。纯化的质粒用HindIII消化。明确具有HindIII位点缺失的质粒记为“pUC19ΔHindIII”。
(ii)编码人L链λ链C区DNA的构建
已经知道人抗体L链λ链C区具有至少四种同种型包括Mcg+Ke+Oz-，Mcg-Ke-Oz-，Mcg-Ke-Oz+和Mcg-Ke+Oz-(P.Dariavach，等，美国国家科学院年报，84，9074-9078，1987)。基于EMBL数据库检索与#23-57-137-1鼠L链λ链C区同源的人抗体L链λ链C区。结果发现人抗体L链λ链的同种型Mcg+Ke+Oz-(登记号为X57819)(P.Dariavach，等，美国国家科学院年报，84，9074-9078，1987)表现与#23-57-137-1鼠L链λ链C区最高的同源性，氨基酸序列为64.4％的同源性，DNA序列为73.4％的同源性。
然后，用PCR法构建编码人抗体L链λ链C区的DNA。下列使用的每种引物均通过394DNA/RNA合成仪(ABI)合成。合成的引物HLAMB1(SEQ ID NO：11)和HLAMB3(SEQ ID NO：13)均具有有义DNA序列，引物HLAMB2(SEQ ID NO：12)和HLAMB4(SEQID NO：14)均具有反义DNA序列，每种引物的两个末端均包含长度为20-23碱基对的互补序列。
外部引物HLAMBS(SEQ ID NO：15)和HLAMBR(SEQ ID NO：16)分别具有与引物HLAMB1和HLAMB4同源的序列，并分别包含EcoRI-，HindIII-和BlnI-识别序列和EcoRI-识别序列。第一次PCR反应中进行了HLAMB1-HLAMB2和HLAMB3-HLAMB4反应。反应完成后，这两种生成物等量混合，然后进入第二次PCR反应。反应物中加入外部引物HLAMBS和HLAMBR。反应混合物进行第三PCR反应用于扩增全长DNA。
PCR反应用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)按照生产商的程序进行。第一次PCR反应中，使用了100μl包含5pmole HLAMB1，0.5pmoleHLAMB2和5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液或者包含0.5pmole HLAMB3，5pmole HLAMB4和5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液，液面用50μl矿物油覆盖，PCR反应进行5次，温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟。
第二次PCR反应中，使用每种反应液50μl混合，液面用50μl矿物油覆盖，PCR反应的3个循环利用，温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟进行。
第三次PCR反应中，反应液加入外部引物HLAMBS和HLAMBR各50pmole，PCR反应进行30个循环，利用温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟。
第三次PCR反应获得的DNA片段用3％低熔点琼脂糖凝胶(NuSieve GTG Agarose，FMC)进行电泳，用GENECLEANII试剂盒(BIO101)按照试剂盒上介绍的程序从凝胶收集和纯化。
这样获得的DNA片段在20μl包含50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，100mM NaCl，和8U的EcoRI(Takara Shuzo)的反应液中37℃反应1小时。消化液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀由此获得DNA。收集DNA并溶解于8μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
0.8μg的质粒pUC19ΔHindIII用EcoRI按照上述同样方式消化。消化液用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀，获得消化的质粒pUC19ΔHindIII。这样消化获得的质粒在50μl包含50mM Tris-HCl(pH 9.0)，1mM MgCl2，和碱性磷酸酯酶(大肠杆菌C75；Takara Shuzo)的反应液中37℃反应30分钟以使质粒脱磷酸化(即，BAP-处理)。反应液用苯酚和氯仿提取，用乙醇沉淀获得DNA。将这样获得的DNA溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
这样制备的BAP-处理的质粒pUC19ΔHindIII1μl与4μl上述PCR反应获得的DNA混合，利用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)将二者连接起来。得到的质粒导入感受态大肠杆菌JM109细胞形成转化体。转化体在2毫升含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)分离纯化细胞中的质粒。
对于上述质粒，确定了克隆DNA的序列。确定DNA序列时，使用了373A DNA测序仪(ABI)和引物“M13引物M4”和“M13引物RV”(Takara Shuzo)。结果发现克隆DNA中具有长度为12碱基对的缺失部分。包含该DNA的质粒记为“Cλ//pUC19”。然后，为了弥补缺失部分，重新合成了引物HCLMS(SEQ ID NO：17)和HCLMR(SEQ ID NO：18)，并且通过PCR法重新构建了正确的DNA。
用包含缺失DNA的质粒CλΔ/pUC19作为模版以及引物HLAMBS和HCLMS或引物HCLMS和HLAMB4进行了第一次PCR反应。分别纯化每一个PCR反应产物。在第二次PCR反应中，PCR产物彼此混合。产物中加入外部引物HLAMBS和HLAMB4，随后进行第三次PCR反应，以扩增全长DNA。
第一次PCR反应中，使用了100μl包含0.1μg CλΔ/pUC19作为模版，各50pmole引物HLAMBS和HCLMR或者各50pmole引物HCLMS和HLAMB4，以及5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液，液面用50μl矿物油覆盖，PCR反应进行30个循环，其中利用温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟。
PCR产物，HLAMBS-HCLMR(236碱基对)和HCLMS-HLAMB4(147碱基对)用3％低熔点琼脂糖凝胶进行电泳分离DNA片段。然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化DNA片段。第二次PCR反应中，使用了20μl包含40纳克纯化的DNA片段和1U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液，液面用25μl矿物油覆盖，以温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟进行5个循环。
第三次PCR反应中，使用了100μl包含2μl第二次PCR反应得到的反应液，外部引物HLAMBS和HLAMB4各50pmole，以及5UTaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液，液面用50μl矿物油覆盖，PCR反应进行30个循环，其中利用温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟，由此得到长度为357碱基对的DNA片段(第三次PCR产物)。用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。用GENECLEANII试剂盒(BIO101)收集和纯化产生的DNA片段。
0.1μg这样获得的DNA片段用EcoRI消化，然后亚克隆到预先用BAP处理过的质粒pUC19 ΔHindIII中。得到的质粒导入感受态大肠杆菌JM109细胞形成转化体。这样制备的转化体在2毫升含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒。
用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo)在373A DNA测序仪(ABI)确定了如此获得的质粒的DNA序列。明确具有无任何缺失的正确DNA序列的质粒记为“Cλ/pUC19”。
(iii)编码人L链κ链C区基因的构建
用PCR法从质粒HEF-PM1k-gk(WO 92/19759)克隆了编码L链κ链C区的DNA片段。正向引物HKAPS(SEQ ID NO：19)确定含有EcoRI和HindIII-以及BlnI-识别序列，反向引物HKAPA(SEQ ID NO：20)设计为包含EcoRI识别序列，二者均使用394 DNA/RNA合成仪(ABI)合成。
用100μl包含0.1μg质粒HEF-PM1k-gk作为模版，各50pmole引物HKAPS和HKAPA，以及5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反应液进行PCR反应，液面覆盖50μl矿物油。PCR反应进行30个循环，其中利用了温度循环为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟，由此得到长度为360碱基对的DNA片段。DNA片段用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)收集和纯化。
这样获得的DNA片段用EcoRI消化，然后克隆到已经用BAP处理过的质粒pUC19ΔHindIII中。得到的质粒导入感受态大肠杆菌JM109细胞形成转化体。这样制备的转化体在2毫升含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒。
纯化的质粒DNA用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo)在373A DNA测序仪(ABI)测序。明确具有正确碱基序列的质粒记为“Cκ/pUC19”。
(3)嵌合抗体L链表达载体的构建
构建了嵌合#23-57-137-1抗体L链表达载体。编码#23-57-137-1抗体L链V区的基因连接到各个质粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19人抗体C区之前的HindIII和BlnI位点，由此得到包含编码嵌合#23-57-137-1抗体L链V区和L链λ或κ链C区DNA的pUC19载体。然后用EcoRI消化每种得到的载体以便切出编码嵌合抗体L链的基因，该基因亚克隆到HEF表达载体中。
用PCR法从质粒MBC1L24克隆编码#23-57-137-1抗体L链V区的DNA。用394 DNA/RNA合成仪(ABI)用PCR法单独合成引物。使用的反向引物MBCCHL1(SEQ ID NO：21)设计为包含Hind III-识别序列和Kozak序列(Kozak，M等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)，正向引物MBCCHL3(SEQ ID NO：22)设计为包含BglII-和RcoRI-识别序列。
用100μl包含10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mMMgCl2，0.2mM dNTP，0.1μg MBC1L24，引物MBCCHL1和MBCCHL3各50pmole，以及1μl AmpliTaq(PERKIN ELMER)的反应液进行PCR反应，液面覆盖50μl矿物油。PCR反应进行30个循环，其中利用温度循环为94℃45秒；60℃45秒；72℃2分钟。
用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离出长度为444碱基对的DNA片段，然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)收集和纯化。纯化的DNA片段溶解于20μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。1μl PCR产物在20μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和8U EcoRI的反应液中37℃消化1小时。消化液用苯酚/氯仿提取，随后用乙醇沉淀收集沉淀DNA。如此获得的DNA溶解于8μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
1μg的质粒pUC19用HindIII和EcoRI按照上述同样方式消化。然后用苯酚/氯仿提取，随后用乙醇沉淀收集消化的质粒。产物用BAP(即，碱性磷酸酶(大肠杆菌C75；Takara Shuzo))处理，然后用苯酚和氯仿提取，用乙醇沉淀获得DNA。这样获得的DNA溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
BAP-处理的质粒pUC19 1μl与4μl上述PCR产物混合，用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)将二者连接起来。得到的质粒导入感受态大肠杆菌JM109细胞(Nippon Gene)，以上述同样的方式形成转化体。转化体在含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT琼脂培养基上37℃培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)纯化细胞碎片中的质粒。DNA测序后，明确具有正确DNA序列的质粒记为“CHL/pUC19”。
各1μg质粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19分别在20μl包含20mMTris-HCl(pH 8.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和2U BInI(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。消化液用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀，由此获得DNA。DNA用BAP在37℃处理30分钟，然后用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀。产物溶解于10μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
8μg包含编码#23-57-137-1L链V区DNA的质粒CHL/pUC19用HindIII和BInI以上述同样方式消化。利用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳获得长度为409碱基对的DNA片段，然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化该DNA片段。DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
4μl L链V区的DNA分别亚克隆到1μl BAP-处理的质粒Cλ/pUC19或Cκ/pUC19上，然后导入感受态大肠杆菌JM109细胞形成转化体。转化体在3毫升含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)分离和纯化细胞碎片中的质粒。由此制备的质粒分别记为“MBC1L(λ)/pUC19”和“MBC1L(κ)/pUC19”。
质粒MBC1L(λ)/pUC19和MBC1L(κ)/pUC19分别用EcoRI消化，然后用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳。用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中分离和纯化长度743碱基对的DNA片段，并将该DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
2.7μg的表达载体(质粒HEF-PM1k-gk)用EcoRI消化，然后用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀，由此获得DNA片段。DNA片段用BAP处理，然后用1％低熔点琼脂糖凝胶电泳。用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中分离和纯化到长度为6561碱基对的DNA片段。该DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mMEDTA的溶液中。
这样制备的HEF载体用BAP处理，2μl BAP-处理的HEF载体与3μl质粒MBC1L(λ)/pUC19和MBC1L(κ)/pUC19的EcoRI片段混合，以使彼此连接。连接产物导入感受态大肠杆菌，JM109细胞形成转化体。转化体在2毫升含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)纯化细胞碎片中的质粒。
这样纯化的质粒在20μl包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和2UPvuI(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。在这一消化反应中，推测如果上述DNA片段正向插入载体，则得到5104/2195碱基对的消化片段，如果上述DNA片段反向插入载体，则得到4387/2926碱基对的消化片段。基于这种推测，正向插入片段的质粒分别指定对于质粒MBC1L(λ)/pUC19为“MBC1L(λ)/neo”或对于质粒MBC1L(κ)/pUC19为“MBC1L(κ)/neo”。
(4)COS-7细胞的转染
上述制备的表达质粒分别用COS-7细胞短暂表达以便评价嵌合抗体对抗原的结合和中和活性。
通过Gene Pulser(Bio Rad)电穿孔将质粒MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(λ)/neo或者质粒MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(κ)/neo结合进行嵌合抗体的短暂表达以便将这些质粒的组合物共转染到COS-7细胞中。即，共转染到0.8毫升细胞悬浮液中，其中COS-7细胞悬浮于PBS(-)，浓度为1×107个细胞/毫升，并加入每种质粒各10μg。得到的溶液应用1500 V和2μF静电容量的脉冲进行电穿孔。室温恢复10分钟后，电穿孔的细胞悬浮于包含2％Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培养基中，然后用10cm的培养皿在CO2培养箱种培养。培养72小时后，收集培养上清液，离心除去细胞碎片，以此作为ELISA分析的样品。
该程序中，嵌合抗体从COS-7细胞培养上清液中的纯化通过用AffiGel Protein A MAPSII试剂盒(Bio Rad)按照试剂盒上介绍的方法进行。
(5)ELISA分析
(i)抗体浓度的确定
确定抗体浓度的ELISA平板如下制备。用于ELISA(Maxisorp，NUNC)的96孔平板的每个孔都用100μl包含包被缓冲液(0.1MNaHCO3，0.02％NaN3)并补以浓度为1μg/毫升的山羊抗人IgG抗体(TAGO)的溶液，然后用200μl稀释缓冲液[50mM Tris-HCl，1mMMgCl2，0.1M NaCl，0.05％Tween 20，0.02％NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)；pH 7.2]隔断。每孔加入其中嵌合抗体得以表达的COS-7细胞培养上清液的逐步稀释液或纯化嵌合抗体的逐步稀释液。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μl碱性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗体(TAGO)。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的基质溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(Bio Rad)于405nm测量溶液的吸收值。纯化的Hu IgG1λ(结合位点)用作该测定的标准品。
(ii)抗原结合能力的确定
确定抗原结合能力的ELISA平板如下制备。用于ELISA分析的96孔平板的每个孔都用100μl补以浓度为1μg/毫升的人PTHrP(1-34)(肽研究所)包被缓冲液中制备的溶液包被，然后用200μl稀释缓冲液隔断。每孔加入其中嵌合抗体得以表达的COS-7细胞培养上清液或者逐步稀释的纯化嵌合抗体。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μl碱性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗体(TAGO)溶液。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的基质溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(BioRad)于405nm测量溶液的吸收值。
结果发现嵌合抗体具有对人PTHrP(1-34)的结合能力，也具有克隆的鼠抗体V区(图4)的正确结构。还发现L链C区有λ链的嵌合抗体和L链C区有κ链的嵌合抗体对PTHrP(1-34)的结合能力没有差异。因此，通过人源化抗体L链λ链构建了人源化抗体L链C区。
(6)能稳定产生嵌合抗体的CHO细胞系的建立
为了建立能稳定产生嵌合抗体的细胞系，将上述表达质粒导入CHO细胞(DXB11)。
能稳定产生嵌合抗体的细胞系的建立通过CHO细胞的表达质粒、质粒MBC1HcDNA/pCHO1和MBC1L(λ)/neo结合或者CHO细胞的表达质粒、MBC1HcDNA/pCHO1和MBC1L(κ)/neo结合实现。这些质粒组合体通过Gene Pulser(Bio Rad)电穿孔分别共转染到CHO细胞中。每种表达载体用限制性酶PvuI切开成为线型DNA。得到的DNA用苯酚和氯仿提取并用乙醇沉淀收集。这样制备的质粒DNA分别电穿孔。质粒DNA各10μg加入0.8毫升包含CHO细胞(浓度为1×107个细胞/毫升)的PBS(-)细胞悬浮液中。得到的混合液应用静电容量为1500V和2μF的脉冲进行电穿孔。室温恢复10分钟后，电穿孔的细胞悬浮于含有10％胎牛血清(GIBCO)的MEM-α培养基中。得到的悬浮液用三个96孔平板(Falcon)在CO2培养箱中培养。培养当天，培养基用选择性培养基[含有10％胎牛血清(GIBCO)和500毫克/毫升GENETICIN(G418Sulfate；GIBCO)无核糖核苷或脱氧核糖核苷的MEM-α培养基]替换。从培养基中选择导入抗体基因的细胞。新鲜培养基替换选择性培养基后，显微镜下观察开始培养之前的细胞和培养2周后的细胞。当观察到细胞生长时，用上述ELISA分析法确定产生的抗体量。选择性收集产生大量抗体的细胞。
已建立的能稳定产生抗体的细胞系在摇瓶中用添加2％Ultra LowIgG胎牛血清的无核糖核苷或脱氧核糖核苷的MEM培养基大规模培养。培养第3到4天，收集培养基上清液，然后用孔径为0.2μm(Millipore)的滤器过滤以除去其中的细胞碎片。
随后，用POROS Protein A柱(PerSeptive Biosystems)在ConSepLC100(Millipore)上按照其上介绍的方法纯化CHO细胞培养上清液中的嵌合抗体。纯化的嵌合抗体作为确定中和活性和检验对高钙血症模型动物的治疗效能的样品。纯化嵌合抗体的浓度和结合抗原的活性用同样的ELISA系统确定。
参考例4人源化抗体的构建
(1)人源化抗体H链的构建
(i)人源化H链V区的构建
通过PCR法用CDRs-移植技术制备人源化#23-57-137-1抗体H链。为制备具有来源于人抗体S31679(NBRF-PDB；Cuisinier，A.M.等，欧洲免疫杂志，23，110-118，1993)FRs的人源化#23-57-137-1抗体H链(“a”型)使用了下列六种类型PCR引物：CDRs-移植引物：MBC1HGP1(SEQ ID NO：23)和MBC1HGP3(SEQ ID NO：24)(均包含有义DNA序列)以及MBCHGP2(SEQ ID NO：25)和MBC1HGP4(SEQ ID NO：26)(均包含反义DNA序列)，它们的每个末端均包含长度为15-21个碱基对的互补序列；以及外部引物：MBC1HVS1(SEQ ID NO：27)和MBC1HVR1(SEQ ID NO：28)，它们分别具有与CDRs-移植引物MBC1HGP1和MBC1HGP4的同源性。
CDRs-移植引物MBC1HGP1、MBCHGP2、MBC1HGP3和MBC1HGP4按照下列方式用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶(分子克隆：实验室手册，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)分离，并用压碎浸泡法(分子克隆：实验室手册，Sambrook等，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)从凝胶片段中提取。
每种CDRs-移植引物各1nmole用6％变性聚丙烯酰胺凝胶分离得到DNA片段。用UV照射硅胶薄层平板从产物DNA片段中鉴定需要长度的DNA片段，然后用压碎浸泡法收集。产物溶解于20μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)进行PCR反应。用于PCR反应的反应液100μl包含上述CDRs-移植引物MBC1HGP1、MBCHGP2、MBC1HGP3和MBC1HGP4各1μl，0.25mM dNTP和2.5U TaKaRa Ex Taq的缓冲液。PCR反应进行5个循环，其中利用温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。外部引物MBC1HVS1和MBC1HVR1各50pmole加入反应混合物。利用这种反应混合物再用同样的温度循环进行PCR反应另外30个循环。这样扩增得到的DNA片段用4％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶电泳分离。
切下包含长度为421碱基对DNA片段的琼脂糖片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法纯化DNA片段。纯化的DNA片段用乙醇沉淀，然后溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。获得的PCR反应混合物用于将DNA片段亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化的质粒pUC19上；随后确定得到质粒的碱基序列。具有正确序列的质粒记为“hMBCHv/pUC19”。
(ii)用于人源化H链cDNA的H链V区的构建
为了连接到人源化H链C区Cγ1的cDNA上，上述步骤构建的人源化H链V区的DNA用PCR法修饰。该方法中，使用的反向引物MBC1HVS2设计为可以与编码V区引导序列5’-末端区的序列杂交并携带Kozak共有序列(Kozak等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)以及HindIII-和EcoRI-识别序列。正向引物MBC1HVR2设计为可以与编码J区3’-末端区的DNA序列和编码C区5’-末端区的DNA序列杂交并携带ApaI-和SamI-识别序列。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)进行PCR反应，随其应用了缓冲液。用于PCR反应的反应液为包含0.4μghMBCHv/pUC19作为DNA模版，MBC1HVS2和MBC1HVR2各50pmole作为引物，2.5U TaKaRaEx Taq和0.25mM dNTP的缓冲液中。PCR反应进行30个循环，其中利用温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。这样由PCR法扩增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶电泳分离。
切下长度为456碱基对的DNA片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法从中纯化DNA片段。纯化的DNA片段用乙醇沉淀，然后溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。获得的PCR反应混合物用于DNA片段亚克隆到预先用EcoRI和SamI消化的质粒pUC19上；随后确定得到质粒的碱基序列。由此制备的包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区的DNA和也包含5’-末端区HindIII-和EcoRI-识别序列和Kozak序列以及3’-末端区ApaI-和SamI-识别序列的质粒记为“hMBC1Hv/pUC19”。
(2)人源化抗体H链表达载体的构建
包含hPM1抗体H链的cDNA序列的质粒RVh-PM1f-cDNA用ApaI和BamHI消化以获得包含编码H链C区碱基序列的DNA片段。该DNA片段导入预先用ApaI和BamHI消化过的质粒hMBC1Hv/pUC19上。由此制备的质粒记为“hMBC1HcDNA/ pUC19”。该质粒包含编码人源化#23-57-137-1抗体H链V区的DNA和编码人H链C区Cγ1的DNA并具有5’-末端区HindIII-和EcoRI-识别序列以及3’-末端区BamHI-识别序列。质粒hMBC1HcDNA/ pUC19中包含的人源化H链“a”型的碱基序列和对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：56所示。
质粒hMBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得包含编码H链碱基序列的DNA片段。将该DNA片段导入预先用EcoRI和BamHI消化过的表达质粒pCOS1上。获得的人源化抗体的表达质粒记为“hMBC1HcDNA/pCOS1”。
为制备在CHO细胞中表达的质粒，质粒hMBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得包含编码H链DNA的DNA片段。该DNA片段导入预先用EcoRI和BamHI消化过的表达载体pCHO1上。由此获得的人源化抗体的表达质粒记为“hMBC1HcDNA/pCHO1”。
(3)L链杂合可变区的构建
(i)FR1、2/FR3、4杂合抗体的制备
构建了编码其中FR区与人源化抗体和鼠(嵌合)抗体FR区杂合的L链的基因，并评价了该区人源化作用的适宜性。该步骤中，包含来源于人抗体的FR1和FR2以及来源于鼠抗体的FR3和FR4的抗体利用存在于CDRs2中的Afl II限制性位点制备。
质粒MBC1L(λ)/neo和hMBC1L(λ)/neo各10μg在100μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，0.01％(w/v)BSA和10U Afl II(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。反应液用2％低熔点琼脂糖凝胶电泳，用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化长度为6282碱基对的DNA片段(称为“c1”)和长度为1022碱基对的DNA片段(称为“h1”)。
获得的c1和h1片段各1μg用BAP处理。用苯酚和氯仿提取，用乙醇沉淀收集DNA片段，然后溶于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
BAP-处理的c1和h1 DNA片段各1μl分别与4μl h2和c2 DNA片段混合，以使彼此连接(4℃过夜)。连接产物导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。转化体在2毫升包含50μg/毫升胺苄青霉素的2xYT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒。
纯化的质粒DNA在20μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，2U ApaLI(Takara Shuzo)，和8U BamHI(TakaraShuzo)或HindIII(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。该步骤中，基于这样的设想鉴定了质粒，即如果c1-h2片段正确连接到质粒上，该连接获得5560/124/498碱基对的ApaLI消化片段或者7134/269碱基对的BamHI/HindIII消化片段。
编码人FR1、2/鼠FR3、4杂合抗体L链的表达载体记为“h/mMBC1L(λ)/neo”。另一方面，没有获得h1-c1的克隆。因此，在pUC载体上进行了重组，随后克隆到HEF载体上。其中，用作模版的是包含编码无氨基酸替换的人源化抗体L链V区DNA的质粒hMBC1Laλ/pUC19，和包含编码FR3中第91位(即，按照Kabat定义的87号氨基酸)酪氨酸由异亮氨酸取代的人源化抗体L链V区DNA的质粒hMBC1Ldλ/pUC19。
质粒MBC1L(λ)/pUC19、hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19各10微升在30μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，0.01％(w/v)BSA，16U HindIII和4U Afl II的反应液中37℃消化1小时。反应液用2％低熔点琼脂糖凝胶电泳，然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从质粒MBC1L(λ)/pUC19中收集和纯化下面DNA片段：长度为215碱基对的DNA片段(称为“c2”)或者分别从质粒hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19中收集和纯化长度为3218碱基对的DNA片段(分别称为“ha1”和“hd1”)。
每种ha1’和hd1’片段分别连接到c2’片段上，然后导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。转化体在2毫升包含50μg/毫升胺苄青霉素的2xYT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒。得到的包含ha1’片段和hd1’片段的质粒DNA分别记为“m/hMBC1Laλ/pUC19”和“m/hMBC1Ldλ/pUC 19”。
质粒m/hMBC1Laλ/pUC19和m/hMBC1Ldλ/pUC19分别用EcoRI消化。2％低熔点琼脂糖凝胶电泳，然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化长度为743碱基对的DNA片段。产物溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
获得的DNA片段4μl与上述BAP-处理的HEF载体1μl混合以彼此连接。连接产物导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。转化体在2毫升包含50μg/毫升胺苄青霉素的2xYT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒DNA。
纯化的质粒DNA在20μl包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和2UPvuI(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。该步骤中，基于这样的设想鉴定了质粒DNA，即如果DNA片段正向插入质粒，该连接反应得到5104/2195碱基对的消化片段，而如果DNA片段反向插入质粒，该连接反应得到4378/2926碱基对的消化片段。由此获得的质粒是编码鼠FR1、2/人FR3、4杂合抗体L链的表达载体分别记为表达载体“m/hMBC1Laλ/neo”和“m/hMBC1Ldλ/neo”。
(ii)FR1/FR2杂合抗体的制备
按照上述同样的方式利用存在于CDRs1中SnaBI限制性位点制备FR1/FR2杂合抗体。
质粒MBC1L(λ)/neo和mMBC1L(λ)/neo各10μg在20μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.9)，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，0.01％(w/v)BSA，和6U SnaBI(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。得到反应液进一步在50μl包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，100mM KCl，0.01％(w/v)BSA，和6U PvuI的反应液中37℃消化1小时。
得到的反应液用1.5％低熔点琼脂糖凝胶电泳，然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化长度为4955碱基对(m1)和2349碱基对(m2)的DNA片段。从质粒MBC1L(λ)/neo中获得的DNA片段记为“hm1”(4955碱基对)，从质粒h/mMBC1L(λ)/neo中获得的DNA片段记为“hm2”(2349碱基对)。获得的每种DNA片段均溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mMEDTA的溶液中。
m1和hm1片段各1μl分别连接到hm2和m2片段各4μl上，然后导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。获得的转化体在2毫升包含50μg/毫升氨苄青霉素的2xYT培养基中培养。用QIAprepSpin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒DNA。
纯化的质粒在20μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，和8U ApaI(Takara Shuzo)或者2U ApalI(Takara Shuzo)的反应液中37℃消化1小时。
基于下述设想鉴定了由此制备的质粒(m1-hm2和hm1-m2)，即如果每种DNA片段以正确方向连接到质粒上，用ApaI和ApaLI消化的质粒(m1-hm2)将分别得到7304碱基对的消化片段和5560/1246/498碱基对的消化片段，用ApaI和ApaLI消化的质粒(hm1-m2)将分别得到6538/766碱基对的片段和3535/2025/1246/498碱基对的片段。结果编码人FR1/鼠FR2、3、4杂合抗体L链的表达载体记为“hmmMBC1L(λ)/neo”，编码鼠FR1/人FR2/鼠FR3、4杂合抗体L链的表达载体记为“mhmMBC1L(λ)/neo”。
(4)人源化抗体L链的构建
通过PCR法用CDRs-移植技术制备了人源化#23-57-137-1抗体L链。即，包含来源于人抗体HSU03868的FR1、FR2、FR3(GEN-BANK，Deftos M.等，Scand.免疫学杂志，39，95-103，1994)以及来源于人抗体S25755(NBRF-PDB)的FR4的人源化#23-57-137-1抗体L链(“a”型)用六种类型的PCR引物制备。
该六种引物如下：具有有义DNA序列的CDRs-移植引物MBC1LGP1(SEQ ID NO：29)和MBC1LGP3(SEQ ID NO：30)，具有反义DNA序列的CDRs-移植引物MBC1LGP2(SEQ ID NO：31)和MBC1LGP4(SEQ ID NO：32)，所有这些CDRs-移植引物的每个末端都具有15-21碱基对的互补序列；以及分别与CDRs-移植引物MBC1LGP1和MBC1LGP4同源的外部引物MBC1LVS1(SEQ ID NO：33)和MBC1LVR1(SEQ ID NO：34)。
CDRs-移植引物MBC1LGP1、MBCLGP2、MBC1LGP3和MBC1LGP4用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶分离(分子克隆：实验室手册，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，并用压碎浸泡法从凝胶片段中提取(分子克隆：实验室手册，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
每种CDRs-移植引物(1nmole)用6％变性聚丙烯酰胺凝胶分离。在UV射线照射的硅胶薄层平板上鉴定需要长度的DNA片段，然后用压碎浸泡法从中收集。收集的DNA片段溶解于20μl含10mMTris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo公司)和其所带的缓冲液进行PCR反应。用于PCR反应的反应液每100μl包含CDRs-移植引物MBC1LGP1、MBCLGP2、MBC1LGP3和MBC1LGP4各1μl，0.25mMdNTP，缓冲液中的2.5U TaKaRa Ex Taq。PCR反应进行5个循环，条件为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。所得反应混合物中加入外部引物MBC1LVS1和MBC1LVR1各50pmole。利用这种反应混合物再用同样的条件进行PCR反应另外30个循环。这样扩增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶电泳分离。
切下包含长度为421碱基对的DNA片段的琼脂糖片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法纯化该DNA片段。由此获得的PCR反应混合物用于DNA片段亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化的质粒pUC19上。确定得到质粒的DNA序列。由此制备的质粒记为“hMBCL/pUC19”。然而发现该质粒CDRs4的第104位氨基酸(按照Kabat确定的96号氨基酸)由精氨酸取代。为了将这个氨基酸校正为酪氨酸，设计和合成了引物MBC1LGP10R(SEQ ID NO：35)。然后用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo公司)和其所带的缓冲液进行PCR反应。用于PCR反应的反应液每100μl包含0.6μg的质粒hMBCL/pUC19为模版DNA，引物MBC1LVS1和MBC1LVR1各50pmole，2.5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)，和缓冲液中的0.25mM dNTP，液面覆盖矿物油(50μl)。PCR反应进行30个循环，条件为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。这样扩增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶电泳分离。
切下长度为421碱基对的DNA片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法纯化该DNA片段。由此制备的PCR反应混合物用于该DNA片段亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化的质粒pUC19上。
用M13引物M4和M13引物RV确定该质粒的DNA序列。结果确定该质粒具有正确的序列。然后该质粒用HindIII和BlnI消化，用1％的琼脂糖凝胶电泳从中分离到416碱基对的DNA片段。该DNA片段用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法纯化。然后导入预先用HindIII和BlnI消化的质粒Cλ/pUC19上。得到的质粒记为“hMBC1Laλ/pUC19”。该质粒用EcoRI消化，得到编码人源化L链的DNA片段。该DNA片段导入质粒pCOS1以至人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。这样获得的质粒记为“hMBC1Laλ/pCOS1”。人源化L链“a”型的DNA序列(包括对应氨基酸序列)如SEQ ID NO：66所示。“a”型的氨基酸序列如SEQ ID NO：47所示。
“b”型人源化L链通过PCR法用诱变导入技术制备。设计“b”型是为了用“a”型中的脯氨酸替换43位的甘氨酸(Kabat定义的43号氨基酸)并用天冬氨酸替换49位的赖氨酸(Kabat定义的49号氨基酸)。用质粒hMBC1Laλ/pUC19作模版，用突变引物MBC1LGP5R(SEQ ID NO：36)和引物MBC1LVS1进行PCR反应。获得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，消化片段亚克隆到pUC19的BamHI-HindIII位点。测序后，获得的质粒DNA用HindIII和AflII消化，产生的消化片段连接到预先用HindIII和AflII消化过的质粒hMBC1Laλ/pUC19上。
由此获得的质粒记为“hMBC1Lbλ/pUC19”。该质粒DNA用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链DNA的DNA片段。该DNA片段导入质粒pCOS1以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒记为“hMBC1Lbλ/pCOS1”。
“c”型人源化L链通过PCR法用诱变导入技术制备。设计“c”型是为了用脯氨酸替换84位的丝氨酸(Kabat定义的80号氨基酸)。用质粒hMBC1Laλ/pUC19作模版，用突变引物MBC1LGP6S(SEQ IDNO：37)和引物M13引物RV进行PCR反应。获得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，然后亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化过的pUC19上。测序后，获得的质粒DNA用BstPI和Aor51HI消化，产生的DNA片段连接到预先用BstPI和Aor51HI消化过的质粒hMBC1Laλ/pUC19上。由此获得的质粒记为“hMBC1Lcλ/pUC19”。该质粒DNA用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链序列的DNA片段。该序列导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒记为“hMBC1Lcλ/pCOS1”
“d”、“e”、“f”型人源化L链也通过PCR法用诱变导入技术制备。设计“d”、“e”、“f”型是为了在91位分别使“a”、“b”、“c”型的异亮氨酸替换酪氨酸(Kabat定义的87号氨基酸)。分别用质粒hMBC1Laλ/pCOS1作为“d”型的模版，质粒hMBC1Lbλ/pUC19作为“e”型的模版，质粒hMBC1Lcλ/pUC19作为“f”型的模版，用突变引物MBC1LGP11R(SEQ ID NO：38)和引物M-S1(SEQID NO：44)分别进行“d”、“e”、“f”各型的PCR反应。获得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，然后亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化过的pUC19上。测序后，质粒用HindIII和BlnI消化，产生的消化片段连接到预先用HindIII和BlnI消化过的质粒Cλ/pUC19上。
由此获得的质粒分别记为“hMBClLdλ/pUC19”、“hMBC1Leλ/pUC19”和“hMBC1Lfλ/pUC19”。每种质粒用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链DNA的DNA片段。该DNA片段导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于该质粒EF1α启动子的下游。由此获得的质粒分别记为“hMBC1Ldλ/pCOS1”，“hMBC1Leλ/pCOS1”和“hMBC1Lfλ/pCOS1”。
“g”、“h”型人源化L链也通过PCR法用诱变导入技术制备。设计“g”、“h”型是为了在36位分别使“a”和“d”型的酪氨酸替换组氨酸(Kabat定义的36号氨基酸)。用突变引物MBC1LGP9R(SEQID NO：39)和引物M13引物RV，并用质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模版进行PCR反应。用这样获得的PCR产物和M13引物M4作为引物以及质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模版再次进行另一个PCR反应。获得的DNA片段用HindIII和BlnI消化，然后继代克隆到预先用HindIII和BlnI消化过的质粒Cλ/pUC19上。用该质粒作为模版，用引物MBC1LGP13R(SEQ ID NO：40)和MBC1LVS1再次进行PCR反应。获得的PCR片段用ApaI和HindIII消化，然后分别导入预先用ApaI和HindIII消化过的质粒hMBC1Laλ/pUC19或hMBC1Ldλ/pUC19上。确定获得的质粒的DNA序列。明确含有正确序列的质粒分别记为“hMBC1Lgλ/pUC19(对“g”型)”和“hMBC1Lhλ/pUC19(对“h”型)”。每种质粒用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链DNA的DNA序列。该DNA序列导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒分别记为“hMBC1Lgλ/pCOS1(对“g”型)”和“hMBC1Lhλ/pCOS1(对“h”型)”。
“i”、“j”、“k”、“l”、“m”、“n”、“o”型人源化L链也通过PCR法用诱变导入技术制备。用突变引物MBC1LGP14S(SEQID NO：41)和引物V1RV(λ)(SEQ ID NO：43)，并用质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模版进行PCR反应。产生的DNA片段用ApaI和BlnI消化，然后亚克隆到预先用ApaI和BlnI消化过的质粒hMBC1Lgλ/pUC19上。确定获得的质粒的碱基序列，对应每种类型导入突变的克隆。由此获得的质粒记为“hMBC1Lxλ/pUC19(x＝i，j，k，l，m，n或o)”。该质粒用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链DNA的DNA序列。该DNA序列导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒记为“hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝i，j，k，l，m，n或o)”。“j”、“l”、“m”、和“o”型的DNA序列(包括对应的氨基酸序列)分别如SEQ ID NO：67、68、69和70所示。这些类型的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：48、49、50和51所示。
“p”、“q”、“r”、“s”和“t”型人源化L链分别是“i”、“j”、“m”、“l”和“o”型的87位酪氨酸被异亮氨酸替代的修饰型。这些类型按照下列方式利用FR3中的Aor51MI限制性位点用“i”、“j”、“m”、“l”或“o”型替换“h”型制备。从表达质粒hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝i，j，m，l，或o)中除去包含CDRs3、部分FR3和全部FR4的Aor51 HI限制性片段(514碱基对)。将包含CDRs3、部分FR3和全部FR4的表达质粒hMBCLhλ/pCOS的Aor51HI限制性片段(514碱基对)连接到该缺失部分上，从而用异亮氨酸替换了91位的酪氨酸(Kabat定义的87号氨基酸)。确定产生的质粒的DNA序列，选择91位酪氨酸(Kabat定义的87号氨基酸)被异亮氨酸替换的各种“i”、“j”、“m”、“l”或“o”型克隆。对应于“i”、“j”、“m”、“l”或“o”型的类型分别记为“p”、“q”、“r”、“s”和“t”型，这些类型的质粒记为“hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝p，q，s，r或t)”。“q”、“r”、“s”和“t”型的DNA序列(包括对应的氨基酸序列)分别如SEQ ID NO：71、72、73、74所示。这些类型的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：52、53、54、55所示。
质粒hMBC1Lqλ/pCOS1用HindIII和EcoRI消化，然后亚克隆到预先用HindIII和EcoRI消化的质粒pUC19上。获得的质粒记为“hMBC1Lqλ/pUC19”。
每种人源化L链类型中取代氨基酸的位置如表2所示。
表2
序列表中取代氨基酸的位置
(按照Kabat定义的氨基酸编号)
型 36 43 45 47 49 80 87
a
b P D
c P
d I
e P D I
f P I
g Y
h Y I
i Y K
j Y K D
k Y K V
l Y K V D
m Y D
n Y V
o Y V D
p Y K I
q Y K D I
r Y D I
s Y K V D I
t Y V D I
上表2中，大写字母代表下列氨基酸：Y：酪氨酸；P：脯氨酸；K：赖氨酸；V：缬氨酸；D：天冬氨酸；I：异亮氨酸。
包含质粒hMBC1HcDNA/pUC19的大肠杆菌株系和包含质粒hMBC1Lqλ/pUC19的大肠杆菌株系分别记为“大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)”和“大肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)”，它们已经按照布达佩斯条约的条款于1996年8月15日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，科学和技术所代理，日本(1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)的保藏号为FERM BP-5629，大肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)的保藏号为FERM BP-5630。
(5)转染到COS-7细胞
为确定杂合抗体和人源化#23-57-137-1抗体的抗原结合活性和中和活性，上述表达质粒短暂表达为COS-7细胞。为短暂表达杂合抗体L链，下列各质粒的组合用Gene Pulser(Bio Rad)通过电穿孔共转染COS-7细胞：hMBC1HcDNA/pCOS1和h/mMBC1L(λ)/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Laλ/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Ldλ/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和hmmMBC1L(λ)/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和mhmMBC1L(λ)/neo。即，各质粒DNA 10微克加入0.8毫升COS-7细胞悬浮于PBS(-)浓度为1×107个细胞/毫升的细胞悬浮液。得到的溶液应用静电容量为1500V和25μF的脉冲。室温恢复10分钟后，电穿孔处理的细胞悬浮于添加2％Ultra LowIgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培养基中，然后用10cm的培养皿在CO2培养箱中培养。培养72小时后，收集培养上清液，并离心除去细胞碎片。产物作为ELISA分析的样品。
为实现人源化#23-57-137-1抗体的短暂表达，各质粒组合hMBC1HcDNA/pCOS1或hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝a-t)以上述杂合抗体同样的方式用Gene Pulser(Bio Rad)转染到COS-7细胞中。获得的培养上清液作为ELISA分析的样品。
其中，COS-7细胞培养上清液中的杂合抗体或人源化抗体用AffiGel Protein A MAPSII试剂盒(Bio Rad)按照试剂盒上指示的方法进行纯化。
(6)ELISA分析
(i)抗体浓度的确定
确定抗体浓度的ELISA平板如下制备。用于ELISA(Maxisorp，NUNC)的96孔平板的每个孔都用100μl添加1μg/毫升的山羊抗人IgG抗体(TAGO)的包被缓冲液(0.1M NaHCO3，0.02％NaN3)包被，然后用200μl稀释缓冲液[50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1M NaCl，0.05％Tween20，0.02％NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)；pH 7.2]隔断。每孔加入表达杂合抗体或人源化抗体的COS-7细胞培养上清液或者逐步稀释的纯化杂合抗体或人源化抗体溶液。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μl碱性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗体(TAGO)。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的基质溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(Bio Rad)于405 nm测量溶液的吸收值。纯化的Hu IgG1λ(结合位点)用作抗体浓度测定的标准样。
(ii)抗原结合能力的确定
确定抗原结合能力的ELISA平板如下制备。用于ELISA(Maxisorp，NUNC)的96孔平板的每个孔均用100μl添加1μg/毫升人PTHrP(1-34)的包被缓冲液包被，然后用200μl稀释缓冲液隔断。每孔加入杂合抗体或人源化抗体得以表达的COS-7细胞培养上清液或者逐步稀释的纯化杂合抗体或人源化抗体溶液。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μl碱性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗体(TAGO)。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的基质溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(BioRad)于405nm测量溶液的吸收值。
(7)活性的确定
(i)人源化H链的评价
发现具有人源化H链“a”型和嵌合L链的抗体表现出与嵌合抗体(见图5)同样水平的PTHrP结合活性。该结果表明“a”型成功地实现了H链V区的人源化。因此，人源化H链“a”型用做下列实验中的人源化抗体H链。
(ii)杂合抗体的活性
(ii-a)FR1、2/FR3、4杂合抗体
当L链为h/mMBC1L(λ)时，抗体不表现抗原结合活性。然而，当杂合抗体的L链为m/hMBC1Laλ或m/hMBC1Ldλ时，抗体表现与嵌合#23-57-137-1抗体同样水平的抗原结合活性。这些结果表明FR3和FR4适于人源化抗体，但FR1和FR2存在需要的一些氨基酸残基被替换。
(ii-b)FR1/FR2杂合抗体
当杂合抗体的L链为mhmMBC1L(λ)时，抗体不表现抗原结合活性。然而，当杂合抗体的L链为hmmMBC1L(λ)时，抗体表现与嵌合#23-57-137-1抗体同样水平的抗原结合活性。这些结果表明FR1适于人源化抗体，但FR2存在需要的一些氨基酸残基被替换。
(iii)人源化抗体的活性
确定了每种“a”型到“t”型用做L链的人源化抗体的抗原结合活性。结果发现，具有“j”，“l”，“m”，“o”，“q”，“r”，“s”和“t”型L链的人源化抗体表现出与嵌合抗体同样水平的PTHrP-结合活性。
(8)能稳定生产抗体的CHO细胞系的建立
为建立能稳定生产人源化抗体的细胞系，上述表达质粒导入CHO细胞(DXB11)。
采用下列质粒的组合作为CHO细胞的表达载体建立了人源化抗体的稳定转化体：hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lmλ/pCOS1；hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lqλ/pCOS1；hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lrλ/pCOS1。质粒用Gene Pulser(Bio Rad)通过电穿孔共转染到CHO细胞中。随后，每种表达载体用限制性酶PvuI裂解获得线型DNA。得到的DNA用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀。制备的DNA分别如下述进行电穿孔。即，每种质粒DNA各10微克加入0.8毫升包括COS-7细胞悬浮于PBS(-)浓度为1×107个细胞/毫升的细胞悬浮液。得到的混合物应用静电容量为1500V和25μF的脉冲。恢复室温10分钟后，电穿孔处理的细胞悬浮于添加10％胎牛血清(GIBCO)的MEM-α培养基(GIBCO)中，然后用96孔平板(Falcon)在CO2培养箱中培养。培养当天，用添加10％胎牛血清(GIBCO)和500毫克/毫升GENETICIN(硫酸G418；GIBCO)但无核糖核苷和脱氧核糖核苷的MEM-α选择培养基替换原培养基。从培养基中筛选导入抗体基因的细胞。用新鲜培养基替换原培养基后，培养之前和之后两周，显微观察细胞。当观察到满意的细胞生长后，用如上述确定抗体浓度的常规ELISA分析法确定细胞产生的抗体量。选择性收集大量产生抗体的那些细胞。
用添加2％Ultra Low IgG胎牛血清，无核糖核苷或脱氧核糖核苷的MEM-α培养基在摇瓶中大规模培养这样建立的抗体的稳定转化体。培养后第3天和第4天收集培养基上清液，并用0.2μm的滤器(Millipore)过滤以除去其中的细胞碎片。CHO细胞培养上清液中的人源化抗体用POROS Protein A柱(PerSeptive Biosystems)在ConSepLC100(Millopore)上按照包括于其中的指导进行纯化。该人源化抗体用做确定中和活性和检查对高钙血症模型动物药理效能的样品。用上述ELISA系统确定纯化的人源化抗体的浓度和抗原结合活性。
参考例5
中和活性的确定
鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体的中和活性的测定通过大鼠骨髓瘤细胞系ROS17/2.8-5细胞进行。在CO2培养箱中，将ROS17/2.8-5细胞培养在添加10％胎牛血清(GIBCO)的Ham’s F-12培养基中，细胞浓度为104个细胞/100μl/孔，将ROS17/2.8-5细胞接种到用96孔平板的每孔中培养1天。培养基用添加4mM氢化可的松和10％胎牛血清的Ham’s F-12培养基(GIBCO)更换。培养三到四天后，培养细胞用260μl Ham’s F-12培养基(GIBCO)冲洗，然后其中加入80μl添加1mM异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，SIGMA)、10％胎牛血清和10mM HEPES的Ham’s F-12培养基。得到的混合物于37℃保温30分钟。
用于检测中和活性的鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体预先按照下列各组逐步稀释：[10μg/毫升，3.3μg/毫升，1.1μg/毫升和0.37μg/毫升]，[10μg/毫升，2μg/毫升，0.5μg/毫升和0.01μg/毫升]和[10μg/毫升，5μg/毫升，1.25μg/毫升，0.63μg/毫升和0.31μg/毫升]。每种稀释的抗体样品溶液与等量4纳克/毫升PTHrP(1-34)混合。将80μl得到的混合溶液加入各孔。每种抗体的终浓度为上述抗体浓度的四分之一，因此PTHrP(1-34)的浓度成为1纳克/毫升。室温处理十分钟后，除去培养上清液，残留物用PBS冲洗三次。从产物中用10μl 0.3％HCl-95％乙醇提取细胞中的cAMP，然后用水蒸汽吸收器蒸发除去HCl-乙醇。残留物溶解于120μl吸附到cAMP EIA试剂盒(CAYMANCHEMICAL’S)的EIA缓冲液中以提取其中的cAMP。用cAMP EIA试剂盒(CAYMAN CHEMICAL’S)按照其中指示的方法确定cAMP的水平。结果发现，在具有与嵌合抗体表现同样水平抗原结合活性的L链型的人源化抗体中，具有在91位酪氨酸被异亮氨酸取代的“q”，“r”，“s”和“t”型L链人源化抗体表现出与嵌合抗体最接近的中和活性，尤其L链为“q”型的人源化抗体表现最强的中和活性。
本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请平10-180143中的说明书和/或附图记载的内容。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请，全部结合到本说明书中作为参考。
工业实用性
本发明提供伴随恶性肿瘤的高钙血症危象治疗剂，它含有能抑制副甲状腺激素相关肽和受体之间的结合的物质作为活性成分的物质。
上述物质在伴随恶性肿瘤的高钙血症模型动物的药效试验中，与血中钙浓度的对照用药组或用溶剂的对照组相比，得到即效且持续的作用，因此，可用作紧急处置伴随恶性肿瘤的高钙血症危象的治疗剂。
说明书以外的序列表：
SEQ ID NO：1：合成DNA
SEQ ID NO：2：合成DNA
SEQ ID NO：3：合成DNA
SEQ ID NO：4：合成DNA
SEQ ID NO：5：合成DNA
SEQ ID NO：6：合成DNA
SEQ ID NO：7：合成DNA
SEQ ID NO：8：合成DNA
SEQ ID NO：9：合成DNA
SEQ ID NO：10：合成DNA
SEQ ID NO：12：合成DNA
SEQ ID NO：13：合成DNA
SEQ ID NO：14：合成DNA
SEQ ID NO：15：合成DNA
SEQ ID NO：16：合成DNA
SEQ ID NO：16：合成DNA
SEQ ID NO：18：合成DNA
SEQ ID NO：19：合成DNA
SEQ ID NO：20：合成DNA
SEQ ID NO：21：合成DNA
SEQ ID NO：22：合成DNA
SEQ ID NO：23：合成DNA
SEQ ID NO：24：合成DNA
SEQ ID NO：25：合成DNA
SEQ ID NO：26：合成DNA
SEQ ID NO：27：合成DNA
SEQ ID NO：28：合成DNA
SEQ ID NO：29：合成DNA
SEQ ID NO：30：合成DNA
SEQ ID NO：31：合成DNA
SEQ ID NO：32：合成DNA
SEQ ID NO：33：合成DNA
SEQ ID NO：34：合成DNA
SEQ ID NO：35：合成DNA
SEQ ID NO：36：合成DNA
SEQ ID NO：37：合成DNA
SEQ ID NO：38：合成DNA
SEQ ID NO：39：合成DNA
SEQ ID NO：40：合成DNA
SEQ ID NO：41：合成DNA
SEQ ID NO：42：合成DNA
SEQ ID NO：43：合成DNA
SEQ ID NO：44：合成DNA
序列表
<110>中外制药株式会社
<120>用于治疗高血钙症的药物制剂
<130>PH-652-PCT
<150>JP98/180143
<151>1998-06-26
<160>75
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>1
aaatagccct tgaccaggc 20
<210>2
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>2
ctggttcggc ccacctctga aggttccaga atcgatag 38
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>3
ggatcccggg ccagtggata gacagatg 28
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>4
ggatcccggg tcagrggaag gtggraaca 29
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>5
gttttcccag tcacgac 17
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>6
caggaaacag ctatgac 17
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>7
gtctaagctt ccaccatgaa acttcgggct c 31
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>8
tgttggatcc ctgcagagac agtgaccaga 30
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>9
gtctgaattc aagcttccac catggggttt gggctg 36
<210>10
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>10
tttcccgggc ccttggtgga ggctgaggag acggtgacca g 41
<210>11
<211>109
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>11
gtctgaattc aagcttagta cttggccagc ccaaggccaa ccccacggtc accctgttcc 60
cgccctcctc tgaggagctc caagccaaca aggccacact agtgtgtct 109
<210>12
<211>110
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>12
ggtttggtgg tctccactcc cgccttgacg gggctgccat ctgccttcca ggccactgtc 60
acagctcccg ggtagaagtc actgatcaga cacactagtg tggccttgtt 110
<210>13
<211>98
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>13
ggagtggaga ccaccaaacc ctccaaacag agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 60
ctgagcctga cgcccgagca gtggaagtcc cacagaag 98
<210>14
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>14
tgttgaattc ttactatgaa cattctgtag gggccactgt cttctccacg gtgctccct t 60
catgcgtgac ctggcagctg tagcttctgt gggacttcca ctgctc 106
<210>15
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>15
gtctgaattc aagcttagta cttggccagc ccaaggccaa ccc 43
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>16
tgttgaattc ttactatgaa 20
<210>17
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>17
caacaagtac gcggccagca gctacctgag cctgacgcc 39
<210>18
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>18
gtagctgctg gccgcgtact tgttgttgct ctgtttgga 39
<210>19
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>19
gtctgaattc aagcttagtc ctaggtcgaa ctgtggctgc accatc 46
<210>20
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>20
tgttgaattc ttactaacac tctcccctgt tgaa 34
<210>21
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>21
gtctaagctt ccaccatggc ctggactcct ctctt 35
<210>22
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>22
tgttgaattc agatctaact acttacctag gacagtgacc ttggtccc 48
<210>23
<211>128
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>23
gtctaagctt ccaccatggg gtttgggctg agctgggttt tcctcgttgc tcttttaaga 60
ggtgtccagt gtcaggtgca gctggtggag tctgggggag gcgtggtcca gcctgggagg 120
tccctgag 128
<210>24
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>24
accattagta gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg gcgattcacc 60
atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagctgag 120
gacac 125
<210>25
<211>132
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>25
ctaccaccac tactaatggt tgccacccac tccagcccct tgcctggagc ctggcggacc 60
caagacatgc catagctact gaaggtgaat ccagaggctg cacaggagag tctcagggac 120
ctcccaggct gg 132
<210>26
<211>110
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>26
tgttggatcc ctgaggagac ggtgaccagg gttccctggc cccagtaagc aaagtaagtc 60
atagtagtct gtctcgcaca gtaatacaca gccgtgtcct cagctctcag 110
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>27
gtctaagctt ccaccatggg gtttgggctg 30
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>28
tgttggatcc ctgaggagac ggtgaccagg 30
<210>29
<211>133
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>29
acaaagcttc caccatggcc tggactcctc tcttcttctt ctttgttctt cattgctcag 60
gttctttctc ccagcttgtg ctgactcaat cgccctctgc ctctgcctcc ctgggagcct 120
cggtcaagct cac 133
<210>30
<211>118
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>30
agcaagatgg aagccacagc acaggtgatg ggattcctga tcgcttctca ggctccagct 60
ctggggctga gcgctacctc accatctcca gcctccagtc tgaggatgag gctgacta 118
<210>31
<211>128
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>31
ctgtggcttc catcttgctt aagtttcatc aagtaccgag ggcccttctc tggctgctgc 60
tgatgccatt caatggtgta cgtactgtgc tgactactca aggtgcaggt gagcttgacc 120
gaggctcc 128
<210>32
<211>114
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>32
cttggatccg ggctgaccta ggacggtcag tttggtccct ccgccgaaca ccctcacaaa 60
ttgttcctta attgtatcac ccacaccaca gtaatagtca gcctcatcct caga 114
<210>33
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>33
acaaagcttc caccatg 17
<210>34
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>34
cttggatccg ggctgacct 19
<210>35
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>35
cttggatccg ggctgaccta ggacggtcag tttggtccct ccgccgaaca cgtacacaaa 60
ttgttcctta attgt 75
<210>36
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>36
aaaggatcct taagatccat caagtaccga gggggcttct ctg 43
<210>37
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>37
acaaagctta gcgctacctc accatctcca gcctccagcc tgagga 46
<210>38
<211>111
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>38
cttggatccg ggctgaccta ggacggtcag tttggtccct ccgccgaaca cgtacacaaa 60
ttgttcctta attgtatcac ccacaccaca gatatagtca gcctcatcct c 111
<210>39
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>39
cttctctggc tgctgctgat accattcaat ggtgtacgta ct 42
<210>40
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>40
cgagggccct tctctggctg ctgctg 26
<210>41
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>41
gagaagggcc ctargtacst gatgrawctt aagca 35
<210>42
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>42
cacgaattca ctatcgattc tggaaccttc agagg 35
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>43
ggcttggagc tcctcaga 18
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>44
gacagtggtt caaagttttt 20
<210>45
<211>118
<212>PRT
<213>小鼠
<400>45
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met
35 40 45
Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser
65 70 75 80
Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
Thr Val Leu Gly Gln Pro
115
<210>46
<211>118
<212>PRT
<213>小鼠
<400>46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210>47
<211>116
<212>PRT
<213>人类
<400>47
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Leu Gly
115
<210>48
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>48
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met
35 40 45
Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Leu Gly Gln Pro
115
<210>49
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>49
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met
35 40 45
Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Leu Gly Gln Pro
115
<210>50
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>50
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Leu Gly Gln Pro
115
<210>51
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>51
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met
35 40 45
Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Leu Gly Gln Pro
115
<210>52
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>52
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met
35 40 45
Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Leu Gly Gln Pro
115
<210>53
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>53
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Leu Gly Gln Pro
115
<210>54
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>54
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met
35 40 45
Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Leu Gly Gln Pro
115
<210>55
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>55
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met
35 40 45
Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp
85 90 95
Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Leu Gly Gln Pro
115
<210>56
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>56
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>57
<211>411
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(411)
<220>
<221>mat_肽
<222>(58)..(411)
<400>57
atg aac ttc ggg ctc agc ttg att ttc ctt gcc ctc att tta aaa ggt 48
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
-15 -10 -5
gtc cag tgt gag gtg caa ctg gtg gag tct ggg gga gac tta gtg aag 96
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
-1 1 5 10
cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc 144
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
agt agc tat ggc atg tct tgg att cgc cag act cca gac aag agg ctg 192
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
30 35 40 45
gag tgg gtc gca acc att agt agt ggt ggt agt tac acc tac tat cca 240
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
50 55 60
gac agt gtg aag ggg cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac 288
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
65 70 75
acc cta tac ctg caa atg agc agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg 336
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
80 85 90
ttt tac tgt gca aga cag act act atg act tac ttt gct tac tgg ggc 384
Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly
95 100 105
caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca 411
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
110 115
<210>58
<211>411
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(411)
<220>
<221>mat_肽
<222>(58)..(411)
<400>58
atg ggg ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt tta aga ggt 48
Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
-15 -10 -5
gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag 96
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
-1 1 5 10
cct ggg agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc 144
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
agt agc tat ggc atg tct tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg 192
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
30 35 40 45
gag tgg gtg gca acc att agt agt ggt ggt agt tac acc tac tat cca 240
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
50 55 60
gac agt gtg aag ggg cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac 288
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
65 70 75
acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg gct gtg 336
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
80 85 90
tat tac tgt gcg aga cag act act atg act tac ttt gct tac tgg ggc 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly
95 100 105
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 411
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210>59
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>59
Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210>60
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>60
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210>61
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>61
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1 5
<210>62
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>62
Pro Tyr Trp Met Gln
1 5
<210>63
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<212>PRT
<213>人类
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Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly
1 5 10 15
<210>64
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>64
Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210>65
<211>411
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(411)
<220>
<221>mat_肽
<222>(58)..(411)
<400>65
atg gcc tgg act cct ctc ttc ttc ttc ttt gtt ctt cat tgc tca ggt 48
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser Gly
-15 -10 -5
tct ttc tcc caa ctt gtg ctc act cag tca tct tca gcc tct ttc tcc 96
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-1 1 5 10
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1 5 10 15
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20 25 30
Thr Ala
Claims (9)
1.抗PTHrP抗体在制备用于预防或治疗高钙血症危象的药物中的应用。
2.权利要求1的应用，其中所述抗体为一种抗-PTHrP抗体的片段和/或一种所述片段的修饰形式。
3.权利要求1或2的应用，其中所述抗体为人源化或嵌合化抗体。
4.权利要求3的应用，其中所述人源化抗体为人源化#23-57-137-1抗体。
5.权利要求1的应用，其中所述抗体为单克隆抗体。
6.权利要求1的应用，其中所述高钙血症危象为伴随恶性肿瘤的高钙血症危象。
7.权利要求1的应用，其中所述药物在24小时以内使血钙水平降低至少1mg/dL从而有效地预防或治疗患者并保持所述低血钙水平。
8.权利要求7的应用，其中所述药物在给药后3天内保持所述低血钙水平。
9.权利要求7的应用，其中所述血钙水平降低到15mg/dL以下。
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