CN1193801C - 一种组织工程细胞支架的制备方法及由该方法得到的产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织工程细胞支架的制备方法，在4～37℃温度下，按如下顺序步骤进行：(1)将分子量为1万～50万的生物降解性脂肪族聚内酯用油性有机溶剂溶解，配制成浓度为5-200毫克/毫升的溶液；(2)在搅拌条件下，将上述的脂肪族聚内酯有机溶液注入含有浓度为0.3～5%w/v乳化剂，以及0.5～10%w/v稳定剂的水溶液中，制得水包油乳液；然后持续搅拌，使溶剂完全蒸发；(3)将上述体系离心分离，用蒸馏水洗涤沉淀的产物后，对所得到的微粒体进行冷冻干燥即可。本发明还公开了由该方法得到的产品，即粉末状脂肪族聚内酯微粒体，是一类骨、软骨、皮肤等各种组织和器官修复重建用的可注射型组织工程细胞支架。
Description
技术领域 本发明涉及一种组织工程细胞支架的制备方法及由该方法得到的产品。
背景技术 组织工程是将工程学原理同细胞学和组织生物学原理结合在一起以替代有缺陷(已老化、受损伤或病态)组织和器官的科学。它是先将自体细胞或干细胞在生物材料所制备、与所需修复的组织或器官具有相同构形的支架上进行体外培养扩增、而后再植入体内的病损部位、使之繁衍、从而最终达到修复重建组织或器官、恢复功能的目的。由于通过组织工程再造的组织和器官不但可以同人工替代物一样进行大批量的生产，而且可同天然的组织和器官一样具有功能、还可防止免疫排斥的产生，因此可以完全解决如今在组织和器官的修复重建临床上所采用的自体移植、异体移植、异种移植和人工器官等方法所存在的免疫排斥、供源不足，和功能不全等问题，被认为是最有望彻底解决组织和器官修复和治疗难题的途径。
组织工程的核心是构建由细胞与细胞支架结合而成的复合体，因此细胞、细胞支架，以及组织和器官的形成和再生是组织工程的三大要素。其中细胞支架的功能是为细胞的增殖、繁衍提供三维空间、提供营养、进行气体交换、排除废物，并且决定新生组织、器官的形状和大小。所以细胞支架必须保证能让细胞很好地贴附、生长和繁衍，因此细胞支架必须具有良好的细胞亲和性；为保证细胞能在整个支架的各部分都得到繁衍生长、可以很好地进行气体交换和排除废物，细胞支架必须具有一定的孔径和互相沟通的三维孔结构；为了保证新生的组织和器官具有与需再生的组织和器官有同相同形状大小，细胞支架还必须具有一定的几何形状；更为重要的是为保证细胞支架能随着细胞的生长而逐渐消失、从而不影响细胞的繁衍，细胞支架还必须具备与细胞繁衍速度相匹配的生物降解速度、能在体内的生理环境下逐渐降解、由大分子变成小分子，以至最终被机体代谢或吸收。从临床应用出发，对于如软骨等形状不规整的组织，不但要求细胞支架具备以上的性能，而且还要求细胞支架具有流动性，这样可以在不需要外科手术、只需采用注射的方法就可把已在体外繁殖了细胞的细胞支架植入体内，因此可注射型细胞支架对于某些组织工程而言，具有特别重要的意义。
Pluronic是一类由聚乙二醇聚醚(PEO)和聚丙二醇聚醚(PPO)组成的PEO-PPO-PEO三嵌段共聚醚，其最低临界溶解温度为约4℃。此材料的特点是在低温下溶于水、而在室温或体温下会由于相分离而形成凝胶，是一类可注射型水凝胶。利用它的温度效应可以在低温下将细胞同Pluronic水溶液混合、并通过注射进入体内、使之充满需修复的不规整组织，再通过Pluronic在体温下的凝胶化，将细胞固定，从而可以避免采用外科手术方法将细胞支架及细胞植入体内的缺陷。因此，作为一种新颖的组织工程材料，在如软骨等形状不规整、强度要求又不高组织工程中具有十分重要的应用(T.Yamaoka等，J Polym Sci.，Polym Chem.37，1513-1521(1999))。然而作为一种细胞支架，Pluronic并不能在体内降解、其力学强度又很差、由于它的水溶性，它并不能在体外进行细胞培养，而且它在体内的溶解速率在很大程度上受到体内部位的影响，因此重复性差。以上的缺陷使它的使用范围非常有限。
脂肪族聚内酯(聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL))及其共聚物由于具有良好的生物相容性、从几MPa至数百MPa可调节的力学强度，以及从数周至数年的降解寿命，已经成为一类重要的生物降解高分子材料而被批准用于临床，并已在骨科矫形修复、手术缝合，以及作为药物控制释放载体等方面得到应用，近年来，随着组织工程研究的发展，它又作为一类最为重要的细胞支架材料在组织工程领域被广泛地研究和应用(王身国等，中国创伤骨科杂志2(4)：277-279(2000))。
发明内容 本发明目的在于提供一种组织工程细胞支架的制备方法，本发明的另一目的在于提供由该方法得到的产品。
本发明的可注射型组织工程细胞支架就是以脂肪族聚内酯为材料、采用乳液-溶剂蒸发法制备的一类生物降解性高分子微粒体。
所述的乳液-溶剂蒸发法为先将脂肪族聚内酯溶解于有机溶剂中，在搅拌条件下将聚合物溶液注入含有乳化剂和稳定剂的水溶液中，在持续搅拌下使溶剂完全蒸发，尔后通过离心分离收集、用蒸馏水洗涤，最后冷冻干燥，得到粉末状的脂肪族聚内酯微粒体。
本发明的一种组织工程细胞支架的制备方法，在4～37℃温度下，按如下顺序步骤进行：
(1)将分子量为1万～50万(5万～20万更佳)的生物降解性脂肪族聚内酯用油性有机溶剂溶解，配制成浓度为5-200毫克/毫升(以20-100毫克/毫升为更佳)的溶液。
所述生物降解性脂肪族聚内酯可以是聚丙交酯(PLA)、聚己内酯(PCL)；或内酯间的二元或三元无规或嵌段共聚物：如聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLC)、聚(乙交酯-己内酯)共聚物(PGC)或聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)共聚物(PGLC)；或内酯与聚醚间的二元或三元无规或嵌段共聚物：如聚(丙交酯-聚乙二醇醚)共聚物(PLE)、聚(己内酯-聚乙二醇醚)共聚物(PCE)、聚(丙交酯-乙交酯-聚乙二醇醚)共聚物(PLGE)、聚(丙交酯-己内酯-聚乙二醇醚)共聚物(PCLE)或聚(乙交酯-己内酯-聚乙二醇醚)共聚物(PGCE)(以上所述共聚物在现有文献中皆有报导，具体制法详见王身国等，中国发明专利99105984.0；ZL92 1 13100.3；98102212.X等文献)。
所述油性有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷等。
(2)在搅拌速度为100-10000转/分(以500-3000转/分为更佳)的搅拌条件下，将上述的脂肪族聚内酯有机溶液注入含有浓度为0.3～5％w/v(以0.5～3％w/v为更佳)乳化剂，以及0.5～10％w/v(以1～5％w/v为更佳)稳定剂的水溶液中，制得水包油乳液。然后在50-5000转/分(以300-2000转/分为更佳)搅拌速度下持续搅拌(一般2～10小时即可，以3～6小时为更佳)，使溶剂完全蒸发。
所述乳化剂为司班80，司班60，吐温60，吐温80等小分子表面活性物质。
所述稳定剂为聚乙烯醇(PVA)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等天然或合成的高分子物质。
(3)将上述体系离心分离，用蒸馏水洗涤沉淀的产物后，对所得到的微粒体进行冷冻干燥，得到本发明的目的产物—可注射型组织工程细胞支架。
本发明所述的聚(丙交酯-己内酯)(PLC)中，聚丙交酯的含量可从1～99mol％，最佳比例为10～90mol％；
所述的聚(乙交酯-己内酯)(PGC)中，聚乙交酯的含量可从1～30mol％，最佳比例为3～20mol％；
所述的聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)(PGLC)中，聚乙交酯的含量可从1至30mol％，最佳比例为3～20mol％；聚己内酯的含量最佳比例为3～75mol％。
所述的聚乙二醇醚的分子量为200～20000，优选聚乙二醇醚的分子量为800～8000范围；在聚乙二醇醚同脂肪族聚内酯的共聚物中聚乙二醇醚含量为1～50mol％，最佳用量为10～40mol％。
由本发明所制备方法所得到的产品，即粉末状脂肪族聚内酯微粒体，该微粒体随制备条件的变化，粒径可在1～500微米之间调节。
本发明所制备的粉末状脂肪族聚内酯微粒体，对骨、软骨、皮肤等各种细胞都具有很好地贴附性、可以在体外进行细胞培养，并且细胞的生长状态良好。
本发明所制备的粉末状脂肪族聚内酯微粒体，在进行细胞培养前、后都可以用生理盐水等配成悬浊液，并且用注射器注入体内，可以充满形状不规整的组织空腔，以进行组织的修复和重建。
本发明所制备的粉末状脂肪族聚内酯微粒体，是一类骨、软骨、皮肤等各种组织和器官修复重建用的可注射型组织工程细胞支架。
具体实施方式 实施例一
在30℃，将分子量为50000的聚丙交酯0.50g溶解于10ml三氯甲烷中，在1000rpm搅拌速度，将聚合物溶液注入含有2ml吐温80溶液的200ml明胶水溶液(1％w/v)中，持续搅拌5小时，而后进行离心分离，得到的沉淀物用蒸馏水洗涤3次，最后冷冻干燥。得到粒径为10～30微米、表面光滑的聚丙交酯微球。
聚丙交酯微球的细胞培养效果是通过在96孔培养板中通过静态培养方法进行测试的。测试前先将聚丙交酯微球用75％的乙醇溶液浸泡30分钟，取出后用磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次除去残余的乙醇后，再用DMEM培养基浸泡过夜、并且在超净工作台内风干1～2小时。
在96孔培养板的孔中各加入100μl聚丙交酯微球含量为30mg/ml的悬液，使培养板的孔底能被聚丙交酯微球铺满。然而将100微升经5代培养、细胞浓度为3×106/ml的成骨细胞悬液种植到孔中，在温度为37℃的5％CO2培养箱内静止培养，3小时后再加2mlDMEM培养基，每48小时换培养液一次，以测定细胞的生长曲线。结果表明：在接种细胞7天后，聚丙交酯微球表面已粘附大量的细胞，并有大量细胞外基质分泌，说明聚丙交酯微球可以很好地贴附细胞、在体外进行细胞培养，并且细胞的生长状态良好。
实施例二
在15℃，将分子量为40000的聚(丙交酯-乙交酯)无规共聚物PLGA，丙交酯/乙交酯＝70/30(mol％))0.6g溶解于10ml二氯甲烷中，在800rpm搅拌速度，将聚合物溶液注入含有2ml吐温60溶液的200ml聚乙烯醇水溶液(1％w/v)中，持续搅拌5小时，而后进行离心分离，得到的沉淀物用蒸馏水洗涤3次，最后冷冻干燥。得到粒径为40～200微米、表面光滑的聚(丙交酯-乙交酯)无规共聚物微球。
同实施例一的细胞培养效果测试方法，但是采用人皮成纤维细胞进行细胞培养试验。结果表明：在接种细胞7天后，聚丙交酯微球表面已粘附大量的细胞，并有大量细胞外基质分泌，说明聚(丙交酯-乙交酯)无规共聚物微球可以很好地贴附细胞、在体外进行细胞培养，并且细胞的生长状态良好。
实施例三
在20℃，将分子量为65000的聚(丙交酯-己内酯-聚乙二醇醚)三元共聚物(PCEL，丙交酯/己内酯/乙二醇＝9/74/17(mol％)，其中聚乙二醇醚分子量为4000)用二氯乙烷溶解，以实施例一相同的条件制备，得到粒径为20～100微米、呈多孔结构的聚(丙交酯-己内酯-聚乙二醇醚)三元共聚物微球。
同实施例一的细胞培养效果测试方法，但是采用人皮成纤维细胞进行细胞培养试验。结果表明：在接种细胞7天后，在聚(丙交酯-己内酯-聚乙二醇醚)三元共聚物微球表面粘附的细胞量和所分泌的细胞外基质量，都比实施例一和实施例二多。说明聚(丙交酯-己内酯-聚乙二醇醚)三元共聚微球不但可以在体外进行细胞培养，而且具有比聚丙交酯微球和聚(丙交酯-乙交酯)无规共聚物微球更好的细胞贴附和细胞生长性能。
实施例四
在10℃，将分子量为55000的聚(己内酯-聚乙二醇醚)三嵌段共聚物(PCE，己内酯/乙二醇＝60/40(mol％)，其中聚乙二醇醚分子量为4000)用三氯甲烷溶解，以实施例一相同的条件制备，得到粒径为10～200微米、呈多孔结构的聚(己内酯-聚乙二醇醚)三嵌段共聚物微球。同实施例三采用人皮成纤维细胞进行细胞培养试验。结果表明：在接种细胞7天后，聚(己内酯-聚乙二醇醚)三嵌段共聚物微球表面粘附大量的细胞，并有大量细胞外基质分泌，聚(己内酯-聚乙二醇醚)三嵌段共聚物微球可以很好地贴附细胞、在体外进行细胞培养，并且细胞的生长状态良好。
实施例五
在23℃，将分子量为40000的聚(丙交酯-聚乙二醇醚)共聚物(PLE，丙交酯/乙二醇＝84/16(mol％)，其中聚乙二醇醚分子量为6000)用二氯甲烷溶解，以实施例一相同的条件制备，得到粒径为10～150微米、呈微多孔结构的聚(丙交酯-聚乙二醇醚)共聚物微球。同实施例三采用人皮成纤维细胞进行细胞培养试验。结果表明：在接种细胞7天后，聚(丙交酯-聚乙二醇醚)共聚物微球表面粘附大量的细胞，并有大量细胞外基质分泌，表明聚(丙交酯-聚乙二醇醚)共聚物微球可以很好地贴附细胞、在体外进行细胞培养，并且细胞的生长状态良好。
实施例六
在10℃，将分子量为80000的聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)三元共聚物(PGLC，丙交酯/己内酯/乙二醇＝45/45/10(mol％))用二氯甲烷溶解，以实施例一相同的条件制备，得到粒径为20～100微米、表面光滑的聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)三元共聚物微球。
同实施例一的细胞培养效果测试方法，但是采用软骨细胞进行培养试验。结果表明：在接种细胞5天后，在聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)三元共聚物微球表面粘附大量的细胞量，并且分泌大量的细胞外基质量。说明聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)三元共聚物微球可以在体外进行细胞培养，而且有良好的细胞生长性能。
实施例七
同实施例一方法，用聚己内酯(分子量55000)制备得到的粒径为40～150微米、表面光滑的微球，对成骨细胞表现良好的细胞贴附和生长性能。
实施例八
将由实施例一～六所制备的聚丙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)无规共聚物、聚(丙交酯-己内酯-聚乙二醇醚)三元共聚物、聚(己内酯-聚乙二醇醚)三嵌段共聚物、聚(丙交酯-聚乙二醇醚)共聚物、聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)三元共聚物和聚己内酯微球，在用生理盐水配成0.02g/ml的悬浊液后，分别用带有0.5mm针头的注射器在大鼠背部皮下注射1ml。尔后定期将大鼠处死，取样切片观察皮下注射的微球情况。结果表明：微球周围均无发现有炎症等不良反应发生，并且聚丙交酯微球在半年后消失、聚(丙交酯-乙交酯)无规共聚物微球在一个半月后消失、聚(丙交酯-己内酯-聚乙二醇醚)三元共聚物微球在三个月后消失、聚(己内酯-聚乙二醇醚)三嵌段共聚物微球在四个月后消失、聚(丙交酯-聚乙二醇醚)共聚物微球在两个月后消失、聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)三元共聚物微球在一个月后消失，聚己内酯微球在一年后消失。表明各种微球都具有可注射性、良好的生物相容性和生物降解性。
对照例一
在5℃，将人皮成纤维细胞种植到涂有Pluronic凝胶的培养皿上后，在温度为37℃的5％CO2培养箱内静止培养，3小时后加入2mlDMEM培养基，且每48小时换培养液一次。结果表明：在接种细胞7天后，培养皿上的细胞数量极少、并且基本呈圆型，说明Pluronic凝胶不能很好地贴附细胞、且不能在体外培养细胞。
对照例二
同对照例一方法，但是采用成骨细胞，结果与对照例一相同。
对照例三
同对照例一方法，但是采用软骨细胞，结果与对照例一相同。
Claims (4)
1.一种组织工程细胞支架的制备方法，在4～37℃温度下，按如下顺序步骤进行：
(1)将分子量为1万～50万的生物降解性脂肪族聚内酯用油性有机溶剂溶解，配制成浓度为5-200毫克/毫升的溶液；
(2)在搅拌速度为100-10000转/分的搅拌条件下， 将上述的脂肪族聚内酯有机溶液注入含有浓度为0.3～5％w/v乳化剂，以及0.5～10％w/v稳定剂的水溶液中，制得水包油乳液；然后在50-5000转/分搅拌速度下持续搅拌，使溶剂完全蒸发；
(3)将上述体系离心分离，用蒸馏水洗涤沉淀的产物后，对所得到的微粒体进行冷冻干燥即可；
所述生物降解性脂肪族聚内酯是聚丙交酯、聚己内酯、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物、聚(丙交酯-己内酯)共聚物、聚(乙交酯-己内酯)共聚物、聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)共聚物、聚(丙交酯-聚乙二醇醚)共聚物、聚(己内酯-聚乙二醇醚)共聚物、聚(丙交酯-乙交酯-聚乙二醇醚)共聚物、聚(丙交酯-己内酯-聚乙二醇醚)共聚物或聚(乙交酯-己内酯-聚乙二醇醚)共聚物；
所述油性有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷；
所述乳化剂为司班80，司班60，吐温60，吐温80；
所述稳定剂为聚乙烯醇、明胶、聚乙烯吡咯烷酮。
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：所述聚(丙交酯-己内酯)中，聚丙交酯的含量为1～99mol％；所述聚(乙交酯-己内酯)中，聚乙交酯的含量为1～30mol％；所述的聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)中，聚乙交酯的含量为1至30mol％，聚己内酯的含量为3～75mol％；所述聚乙二醇醚的分子量为200～20000，在聚乙二醇醚同脂肪族聚内酯的共聚物中聚乙二醇醚含量为1～50mol％。
3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于：所述聚(丙交酯-己内酯)中，聚丙交酯的含量为10～90mol％；所述聚(乙交酯-己内酯)中，聚乙交酯的含量为3～20mol％；所述的聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)中，聚乙交酯的含量为3～20mol％，；所述聚乙二醇醚的分子量为800～8000，在聚乙二醇醚同脂肪族聚内酯的共聚物中聚乙二醇醚含量为10～40mol％。
4.根据权利要求1-3任一制备方法得到的产品。
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