CN118647854A - 用于识别、分选和收集样品流体中分析物（例如细胞）的方法和系统 - Google Patents

Abstract

公开了一种用于表征样品流体中的分析物(例如细胞)的方法，该方法包括：使含有至少第一类型的分析物和第二类型的分析物的样品液体沿着流动路径通过流体通道；在包括流体通道的第一分析单元中分析样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物，从而获得与至少第一类型和第二类型的分析物相关联的至少一个分析物特征的第一参数值，在处理单元中存储至少一个分析物特征的第一参数值；相较于与第二类型的分析物相关联的另一个分析物特征，改变与第一类型的分析物相关联的另一个分析物特征；在包括流体通道的第二分析单元中分析样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物，从而获得与至少第一类型和第二类型的分析物相关联的至少一个分析物特征的第二参数值；在处理单元中存储至少一个分析物特征的第二参数值；在处理单元中，通过将第二参数值与第一参数值进行比较，根据第二型的分析物进行表征第一类型的分析物。

Description

用于识别、分选和收集样品流体中分析物(例如细胞)的方法 和系统

技术领域

本发明涉及一种用于表征(识别)、计数、分类、分选和提取/收集悬浮液中的目标粒子/细胞群的方法和微流体系统平台，例如循环体液(例如血液)的稀有细胞。尽管本发明主要关注循环肿瘤细胞(CTC)，但它也可以用于任何分析物或稀有细胞群，如循环内皮细胞(CEC)、循环黑色素瘤细胞(CMC)、循环混合细胞(CHC)等。

背景技术

根据世界卫生组织，癌症是全球第二大死亡原因，2020年导致约1000万人死亡。在全球范围内，约六分之一的死亡是由于癌症。2020年，全球新增癌症病例约2000万例，预计到2040年，这一数字预期将达到约3000万例，造成1600万人死亡(来源：世界卫生组织IARCGlobocan 2020)。

癌症是一种致命的疾病，但致死的不是原发性肿瘤，而是转移，转移是癌症的扩散。90％的癌症相关死亡是由于转移，因此快速识别这一过程对于癌症治疗至关重要。CTC是转移最敏感的生物标志物。它们与原发性肿瘤分离并进入血液，最终在另一个部位形成继发性肿瘤。由于它们有可能在单独的组织中阻止新的肿瘤形成，因此在血液中检测它们对于评估转移进展、指导治疗以及测试和开发药物至关重要。转移进展的早期诊断对于提高生存率和缩短治疗期至关重要。除了诊断和预后外，通过检测血液中的休眠CTC也可以进行复发监测。

以非侵入性方式对转移性癌症患者常规CTC进行实时评估对于评估治疗效果至关重要。通过液体活检收集CTC是可能的，其中从患者身上抽取几毫升血液，并在血液样品中探测癌症的痕迹。液体活检是微创的，与通过手术取出肿瘤组织的固体活检相比具有许多优势。然而，CTC的检索是一个巨大的挑战。在1毫升血液中，有数十亿个外周血细胞，其中只有1-10个CTC存在。它们的极端稀有性和固有的异质性需要灵敏、靶向特异性和高通量的系统。

本发明提供了一种解决上述问题的技术方案。

发明内容

根据本发明的第一示例，提出了一种用于表征样品流体中的分析物(例如细胞)的方法，该方法包括使含有至少第一类型的分析物和第二类型的分析物的样品液体沿着流动路径通过流体通道；在包括所述流体通道的第一分析单元中分析所述样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物，从而获得与至少第一类型和第二类型的分析物相关联的至少一个分析物特征的第一参数值；以及在处理单元中存储至少一个分析物特征的第一参数值。

一种示例性方法还包括：相较于与第二类型的分析物相关联的另一个分析物特征，改变与第一类型的分析物相关联的另一个分析物特征。然后，可以在包括流体通道的第二分析单元中有利地分析样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物，从而获得与至少第一类型和第二类型的分析物相关联的至少一个分析物特征的第二参数值。

一种示例性方法还包括在处理单元中存储至少一个分析物特征的第二参数值，并在处理单元中将第二参数值与第一参数值进行比较，根据所述第二类型的分析物表征所述第一类型的分析物。

这允许一种能够根据其他分析物中表征分析物的在线方法。特别是，本申请中提到的作为第二类型的分析物的非常罕见的细胞或分析物，可以有效地根据本申请中作为第一类型的分析物提到的外周血细胞鉴定出来。

根据本发明的方法的示例，改变所述另一个分析物特征包括在包括所述流体通道的装置中对所述样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物施加电场的步骤。

在一些实施例中，根据本发明的方法还包括在安装到流体通道的分离单元中，基于处理单元中的表征并使用第一类型的分析物的改变后的所述另一个分析物特征，将第一类型的分析物与第二类型的分析物分离的步骤。因此，通过从样品流体中分离外周细胞(第一类型的分析物)，还可以有效地分离和分析稀有细胞或第二类型的分析物以供进一步研究。

分离第一类型和第二类型的分析物的步骤可以包括向样品流体施加电场，并使用电场将第二类型的分析物从流动路径转移。另外或可替代地，可以使用阀。然后，通过改变阀的位置将流体引导到所期望的出口，可以将第二类型的分析物从流动路径转移。在分离第一类型和第二类型的分析物之后，可以将第二类型的分析物收集在收集储器中。

此外，在根据本发明的方法的另一个示例中，它包括根据分析物大小对至少第一类型和第二类型的分析物进行分选的步骤。这提供了对样品流体中的分析物的预先选择，进一步提高了该方法的表征和分离步骤的效率和准确性。

由于根据本发明的方法处理大量数据，因此优选地使用一种或多种机器学习算法来执行根据第二类型的分析物表征第一类型的分析物的步骤。

此外，根据本发明的一些实施例的方法的一个或多个分析步骤包括电阻抗谱(EIS)，特别是多频电阻抗谱。

根据本发明的一个示例，改变另一个分析物特征的步骤包括改变分析物的细胞膜或引起分析物的细胞机械变形的步骤，并且其中，所述另一个分析物特征是分析物的电阻抗响应。特别地，如果改变步骤包括对外膜充电和/或电穿孔，并且另一个分析物特征是分析物膜的电属性，则可以有效地标记分析物类型之一以进行表征，特别是鉴定。

根据本发明的方法可以有利地包括光学感测流体通道的感测区域的步骤。

根据本发明的另一个实施例，提出了一种用于表征样品流体中的分析物(例如细胞)的方法，该方法包括在多个不同的表征线中同时执行根据本发明的上述方法中的任一项或多项的步骤。在将样品流体中的分析物分选到多条表征线中的不同表征线的初始步骤中，多条表征线可以接收例如已经按大小分选的分析物。

根据本发明的用于表征样品流体中的分析物(例如细胞)的系统的示例包括至少一条表征线，该线至少包括流体通道，该流体通道限定了具有入口和出口的流动路径，并且被构造成允许包含至少第一类型的分析物和第二类型的分析物的样品液体沿着流动路径通过。在流动路径方向上看到的入口和出口之间，可以实施几个单元，这些单元对样品流体，特别是对至少第一类型和第二类型的分析物执行处理步骤。

第一示例性分析单元包括流体通道，其被构造成分析样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物，并且被构造成获得与至少第一类型或第二类型的分析物相关联的至少一个分析物特征的第一参数值。

改变单元还包括流体通道，并且可以位于第一分析单元的下游，该第一分析单元被构造成相较于与第二类型的分析物相关联的另一个分析物特征，改变与第一类型的分析物相关联的另一个分析物特征。在一个实施例中，改变单元包括电场产生单元，其被构造成使样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物受到电场，从而与相较于与第二类型的分析物相关联的另一个分析物特征，改变与第一类型的分析物相关联的另一个分析物特征。特别地，改变单元可以被构造成改变分析物的细胞膜或引起分析物的细胞机械变形，并且其中，所述另一个分析物特征是电阻抗响应。

包括流体通道的第二分析单元可以设置在改变单元的下游。第二分析单元被构造成分析样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物，并且被构造成获得与至少第一类型和第二类型的分析物相关联的至少一个分析物特征的第二参数值。

大量数据由处理单元处理，该处理单元被构造成从第一分析单元和第二分析单元获取和存储第一参数值和第二参数值，并通过将第二参数值与第一参数值进行比较来根据第二类型的分析物表征第一类型的分析物。

这允许一种能够根据其他分析物表征分析物的在线方法。特别是，本申请中提到的作为第二类型的分析物的非常罕见的细胞或分析物，在本申请中被有效地从作为第一类型的分析物提到的外周血细胞中鉴定出来。

此外，在根据本发明的系统的示例中，其包括分离单元，该分离单元包括位于第二分析单元下游的流体通道。分离单元被构造成基于由处理单元生成和输出的表征信号，使用第一类型的分析物的改变后的另一个分析物特征，将第一类型的分析物与第二类型的分析物分离。

通过从样品流体中分离第一类型的分析物，也可以有效地分离和收集第二类型的分析物。例如，分离单元可以包括电场产生单元，该电场产生单元被构造成当样品流体从处理单元接收到激活信号时向样品流体施加电场，以将第二类型的分析物从流动路径转移以进行收集。因此，该系统的示例性实施例可以包括一个或多个收集单元，例如用于收集第二类型的分析物。一些示例性分离单元可以包括阀单元，该阀单元被构造成将第二类型的分析物从流动路径转向。

为了进一步提高表征和分离几种类型的分析物的效率和准确性，通过实施分选单元来获得样品流体中分析物的预先分选，该分选单元包括位于第一分析单元上游的流体通道，其被构造成在不进行任何选择的情况下，根据分析物尺寸对至少第一类型和第二类型的分析物进行分选。

实现了对大量数据的改进处理，如在另一个有益的示例中，处理单元实现了一种或多种机器学习算法，用于根据第二类型的分析物表征第一类型的分析物。

优选地，第一分析单元和第二分析单元包括电阻抗谱(EIS)装置，特别是多频电阻抗谱装置，此外，微流体装置可以被构造成对第一类型的分析物的膜进行充电和/或电穿孔。

本发明的示例性实施例还可以包括光学感测单元，其被构造成光学感测流体通道的感测区域。

本发明的另一个实施例是一种用于在根据本发明的实施例的多个系统中同时表征样品流体中的分析物(例如细胞)的平台。该平台包括与多个系统相关联的多个表征线，每个系统被构造成用于表征样品流体中的分析物，例如细胞。这样的示例性实施例还可以包括设置在多个系统上游的分选装置，其被构造成将样品流体中的分析物分选到多个系统的不同表征线。

附图说明

现在将参照附图讨论本发明，附图示出：

图1是根据本发明的平台或系统的工作流程；

图2根据本发明的平台或系统的工作原理；

图3图示了用于肿瘤细胞鉴别的细胞多频多参数电阻抗测量的物理参数；

图4描绘了肿瘤细胞、白细胞和一簇肿瘤和白细胞的多频测量的原始数据。

图5描述了根据本发明的用于标记外周血细胞的组合电检测和改变的方法，以使检测特异性最大化；

图6示意性地描绘了根据本发明的微流体装置的示例，以及根据本发明的测量方法的图示；

图7a和7b示意性地描绘了根据本发明的微流体装置的其他示例；

图8a和8b图示了下游分离单元的示例。

具体实施方式

为了正确理解本发明，在下面的详细描述中，本发明的相应元件或部分将在附图中用相同的附图标记表示。

根据本发明的技术被设计成用于肿瘤细胞检测、计数、纯化和收集。该设计由多功能微电子流体系统(MEFS)组成，该系统基于快速灵敏的电阻抗测量，并可选择耦合到光学器件以扩展功能，如实时表征。与本申请同时提交的申请人的另一份PCT申请中描述了一种用于实时表征的技术和装置，该PCT申请要求2022年1月31日提交的题为“用于检测和表征样品流体中至少一种分析物(例如细胞)的微流体装置”的荷兰申请no.2030787的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

图1描述了根据本发明的平台示例的系统级设计。在基于尺寸的预分选之前，对血液样品进行芯片稀释。在分拣装置2中执行的这个初始分拣步骤不是为了排除，而是为了基于大小进行分拣以及并行化。分选装置2的输出包括多个流体通道，所述流体通道包含已按尺寸分选的分析物，所述尺寸被指定为最大尺寸、较小尺寸、…、最小尺寸。分选装置2的一个或多个、优选多个输出流体通道的细胞(通常是分析物)被发送到基于尺寸分布并行工作的检测或分析单元。在一个示例性实施例中，一个或多个包含已按尺寸分选的分析物的流体通道，指定为最大尺寸、较小尺寸、…、最小尺寸，被引导到装置1的不同模块化部件，例如传感器1、传感器2、…、传感器n。在那里，可以并行检测、计数和/或分选分析物。调整不同模块化部分(如传感器1、传感器2、…、传感器n)的每个分析单元的尺寸，以确定测量体积的大小，以与分析物的大小相匹配，从而进一步提高灵敏度，避免同时检测多个(重叠)事件。

在传感器1、传感器2、…、传感器n中的两个或更多个中优选地同时识别出第二类型的分析物(如稀有细胞)后，在两个或更多个流体通道1、2、…、n中将其与第一类型的分析物分离，并引导到两个或更多个收集容器1、2，…、n。第一类型的检测物(如外周血细胞)被丢弃。

图1特别描绘了根据本发明的实施例的系统(平台)的工作流程。该平台设计为一个模块化系统，带有可以通过管道连接件分开或完全集成的三个装置。模块化是为了使平台为工业化做好准备，因为一个装置的故障不会迫使一个人更换整个平台，而只会更换有故障的装置。任何装置的进一步设计开发都不会影响其他装置的设计。这可以被认为是产品开发的优势。

图2示出了根据本发明的示例性单元或装置如何在整个系统内工作，该系统用附图标记10表示。在对样品流体或细胞流中的分析物进行基于尺寸的预分选之后(阶段I描绘了图2中的分选单元18)，通过(多个)检测和计数单元，例如检测和计数单元11(第一分析单元：阶段II)，处理，优选地同时处理一个或多个、优选地两个或更多个分支或表征线10a-10b-10c中的细胞。为简单起见，图2中仅更详细地描绘了仅一条分支/表征线10b。其他分支/表征线可以具有相同或相似的构造，并且优选地包括被构造成使得测量体积根据分析物尺寸确定尺寸的部件。

示例性分支/表征线10b围绕流体通道19b组成，该流体通道19b限定了具有入口19b-1和出口19b-2的流动路径。流体通道19b被构造成允许含有至少第一类型20-1的分析物和第二类型20-2的分析物的样品液体沿着入口19b-1之间的流动路径从分选单元18朝向出口19b-2通过。通道分支10a、10b和10c中不同细胞类型的图示具有代表性，任何类型的分析物都可以根据其大小分为10a或10b或10c。第一或第二或任何类型的分析物都可以落入到相同的大小范围，然后共存于相同的通道分支(10a、10b或10c)中。因此，基于尺寸的预分选单元18的操作独立于分析物类型，但取决于分析物尺寸。

在系统的一个示例性实施例中，有三个子单元11、12和13依次操作：子单元11(第一分析单元)包括检测器或传感器单元并且用于检测一种或多种分析物的特征，例如大小、膜属性、细胞质属性、细胞核属性和基因组含量或核酸，并将信息发送到处理单元14。子单元12(改变单元)被构造成改变WBC的分析物(例如膜)的特征，例如，通过对WBC的外(等离子体)膜充电或电穿孔，同时保持CTC的外(等离子体)膜完好无损。子单元13(第二分析单元)包括检测器或传感器单元，其可以与子单元11相同，并且用于检测一个或多个分析物的特征，例如与子单元11相同的属性，并且识别由于子单元12中的改变的分析物特征(例如由改变的膜引起的WBC)而引起的信号的偏移。子单元13随后将信号发送到处理单元14，用于在子单元13处标记WBC。检测和计数单元生成的数据由处理单元14使用机器学习算法来处理，用于识别每个细胞类型(至少第一类型和第二类型的分析物)，并且该信息用于激活纯化装置15(分选单元15)中的阀15a，以分选和收集收集室(贮存器)16中的肿瘤细胞(第二类型20-2的分析物)，或者经由废物出口17丢弃剩余的细胞(第一类型20-1的分析物)(阶段III)。

如图2所示，根据本发明的方法和系统的工作原理采用了“采样-输入-输出”的方法。本发明的该系统不仅从外周血细胞(第一类型20-1的分析物)中分离和收集肿瘤细胞(第二类型的分析物)，而且还实时识别和计数它们。因此，系统的输出(收集的分析物20-2)的组成是已知的。

所提出的系统旨在检测和组合肿瘤细胞(例如，表示为第二类型20-2的分析物)和外周血细胞(相应地表示为第一类型20-1的分析物)之间的已知物理差异。图3图示了通常用于区分肿瘤细胞的几种物理特征的一些非限制性示例。特别是，图3图示了使用细胞的多频率和多参数电阻抗测量结果来测量的物理参数(至少一个分析物特征的第一参数值)，以用于肿瘤细胞鉴别。被测量的第一属性(第一分析物特征)是质膜的特定面积A。特定面积A表示为由细胞周长归一化的总质膜面积。对于相同的大小，肿瘤细胞质膜的比表面积A₁通常比白细胞的比表膜面积A₂高得多，因此A₁>>A₂。如图3右侧的图表(第(1)节)所示，可以在特定频率范围内测量这种差异。

第二属性(第二分析物特征)是细胞质含量，诸如核质比(N/C)、细胞质电导率、细胞质组成或基因组含量。与白细胞(n₂/c₂)相比，肿瘤细胞通常表现出更高的N/C比(n₁/c₁)。该属性可以通过在特定频率范围内测量细胞来推导(图3右侧图表中的第(2)节)。第三属性(第三分析物特征)是尺寸(直径)d，可以用于识别和/或归一化(不透明度计算)为第一属性和第二属性获得的数据。这是为了提高测量结果的灵敏度和特异性，因为流速的任何干扰或测量体积中细胞位置的微小变化都可能影响信号。归一化清除了来自收集信号的这些影响，并提高信号质量。

为了进一步提高测量的特异性，改变白细胞膜，使其电阻抗响应发生变化，这是用于标记或表征步骤的另一个分析物特征。这允许标记白细胞以进行其准确识别。

通常在任何液体活检应用之前，血液样品在红细胞(RBC)裂解缓冲液中稀释，以从溶液中消除RBC，从而提高信噪比，因为RBC的数量超过了血液中的任何其他细胞群。这一过程也会影响白细胞外膜的(电)属性，同时保持其活力。

红细胞裂解缓冲液通过在白细胞膜上引起可逆的孔形成(如电穿孔)来改变白细胞膜的属性，从而其电响应发生了转变。因此，浸泡在红细胞裂解缓冲液中可以用作为细胞膜充电或电穿孔的替代方案。

作为电穿孔或浸入红细胞裂解缓冲液的替代方案，还可以对白细胞进行机械交替。例如，细胞可以流动通过会聚-发散通道以进行机械改变，诸如细胞核重新定位，这也会导致电响应的变化。肿瘤细胞和白细胞之间变形能力水平的差异导致其电阻抗响应的差异。

在浸入RBC裂解缓冲液后，测量白细胞的电响应的变化。测量后，证实肿瘤细胞保持完整，其电阻抗响应没有变化。

图4描绘了一个典型的数据集，被收集作为电阻抗测量结果(另一个分析物特征)如何清楚地显示这种差异以及能够标记白细胞的证据。特别是，原始数据涉及肿瘤细胞、白细胞和簇(肿瘤细胞和白细胞)的多频测量结果。10MHz和20MHz频率的数据揭示了标签的不同电响应。使用机器学习算法处理整个数据集为区分或表征不同类型的细胞(第一类型和第二类型的分析物)提供了足够的信息。

为了更好地控制该过程并进一步提高特异性，可以对白细胞的外膜(血浆)施加电改变。由于根据本发明的系统可以配备3D电极，例如结合图6、7a和7b描述和示出的那些，用于在幅度和均匀性方面高精度地产生电场，因此可以在肿瘤细胞保持完整的情况下对白细胞进行充电或可逆电穿孔，如在化学情况中那样(浸入RBC裂解溶液)。

图5进一步图示了细胞联合检测和改变的步骤。特别地，图5描述了根据本发明的用于组合电检测和改变以标记白细胞以进一步提高检测特异性的方法。用于给细胞膜充电和/或电穿孔的电场(例如，使用图2中的微流体装置12的图5的步骤2)保持在肿瘤细胞的电穿孔极限以下，因此，它不会改变它们的膜属性(另一个分析物特征)，在这种情况下，它会超出白细胞的电穿极限，并最终使它们穿孔。这种穿孔过程是可逆的。换句话说，膜愈合快并且孔闭合。比较来自用于感测完整细胞(第一类型和第二类型的分析物)的方法步骤1的信号和用于感测完好细胞(第二类型的分析物)和处理过的细胞(第一类型的分析物)的方法步骤3的信号提供了识别处理过的细胞的电阻抗响应差异的可能性，并用于区分或表征。

能够以高水平的控制对细胞进行电穿孔允许其他应用，诸如增强(内容物/药物)向细胞/生物体的递送。一个引人注目的示例将是用于生物生产的基因组递送的细胞的受控电穿孔。如果处理后不需要净化，这项技术将取代昂贵的化学技术，这些技术也会产生副产品，例如生物负载成为问题，净化成为必要。此外，通过将电感测与电穿孔相结合，可以在线监测核酸的递送效率和复制过程。这可以应用于任何具有外膜(例如哺乳动物细胞)和/或壁(例如细菌、酵母细胞)的细胞或生物体。

本发明允许在单细胞水平上进行分析，并防止任何细胞(分析物)在完全检查之前被丢弃或送往废物。目前已知的现有技术系统通过处理大量体积，仅提供基于特定目标属性的盲分离程序。与现有解决方案不同，本发明实现了传感器单元而不是盲分割方法，并使该传感器单元能够采取主动决策方法来收集样品内的肿瘤细胞或任何目标组/分析物。本发明中概述的肿瘤细胞的检测和分离可选地是无标记的，这允许进一步的下游分析，例如评估药物反应以指导治疗，或者在细胞保持完整的情况下进行药物开发的分子分析。根据本发明的平台将允许利用耦合光学传感器或利用集成光学器件在移动中实时利用此类分析，例如，如参考图6、7a和7b所述。

通过使用人工智能(AI)和/或机器/深度学习技术，通过集成微处理器来取代计算机，已经可以在设备级别实现检测和分离肿瘤细胞的决策。因此，根据本发明的装置平台和方法是通用的，因为所使用的传感器可以根据所需的应用模式进行调谐、激活或停用。

该系统只需要稀释血液样品作为样品制备。因此，与提供许多基于抗体和/或多步骤方法的大多数最先进的系统相比，总分析时间将非常短，成本也将很低。

为了进一步扩展系统的功能(例如细胞的动态表征)，可以结合光学检测。本发明的一个示例包括光学感测单元，其被构造成光学感测流体通道的感测区域，优选地，在至少一对电极之间。这使得系统能够对分析物(诸如电解质溶液中的粒子或细胞)进行电学和光学检测。例如，全光谱光谱仪和高速相机以及集成光波导可以用于收集无标签和/或荧光测量结果的光学数据。通过光谱仪提供快速光学数据，并可以通过高速CMOS相机进行按需成像，以可视化最终用户感兴趣的事件。

图6图示了可以用于一个或多个示例性分析单元和/或改变单元(例如11、12、13)的微流体装置的示例性配置。一些示例性实施例还结合了光学感测单元。根据本发明的微流体装置100允许使用一对三维弯曲的第一电极120a和第二电极120b对通过具有纵向通道轴线110z的流体通道110的分析物1、2、3(诸如血细胞)进行多频电阻抗测量，所述第一电极120a和第二电极120b围绕纵向通道轴线110定位。如图所示，第一电极120a和第二电极120b具有围绕纵向通道轴线110z定位的三维结构化电极表面，从而至少部分地包围流体通道110。

微流体装置100可以包括第一基板130a和第二基板130b。适用于制造一个或多个基板130a-130b的材料包括透明材料，其优选地与微细加工和薄膜处理技术兼容。示例可能包括玻璃和二氧化硅。流体通道110的壁的至少一部分可以由第一基板130a中的第一凹部131a形成。另外或可替代地，流体通道110的壁的至少一部分可以由第二基板130b中的第二凹部131b形成。优选地，第一凹部131a具有与第二凹部131b相同的形状，这大大简化了微流体装置的制造。最优选地，第一凹部131a和第二凹部131b相对于流体通道110的中间平面或中心平面160c(如图7所示)对称。

电极120a-120b可以彼此面对地放置在流体通道110的不同侧，优选相对侧。第一电极120a可以放置在第一基板130a的凹部131a中，第二电极120b可以放置在第二基板130b的凹部131b中。替代地，本发明的一个或多个三维弯曲电极，例如电极120a-120b，可以放置在另一个选定的位置处，使得电极彼此面对并且以其它方式根据本发明的原理。可以用于放置电极的工艺的示例包括但不限于金属的蒸发、溅射或直接印刷。在本发明中，术语“放置”应被解释为包括以与本发明一致的任何其他方式沉积、布置、安装、集成或以其他方式提供一个或多个电极的任何类型。

附图标记140示意性地描绘了电场产生单元的已知配置，该电场产生单元与两个电极120a-120b连接，并且能够在两个电极120a至120b之间的通道110中施加电场分布。两个电极120a-120b之间的流体通道110中的电场分布由示意性电场线141示出。

根据本发明的微流体装置100还可以包括光学感测单元150，其被布置成光学检测或感测流体通道110的在至少一对第一电极120a和第二电极120b之间的区域。光学感测/检测单元150可以被构造为或包括光波导、激光装置和/或光学传感器。在另一个有益的示例中，光学传感器可以是电荷耦合器件(CCD)、CMOS器件等。在本发明的一个实施例中，使用光学感测单元150的光学测量与电测量同时进行，优选地同步进行，例如使用电极120a和120b。由于电极120a-120b仅设置在流体通道110的内表面壁110’的一部分上，因此它们不会阻碍或妨碍光学感测单元150的光学感测轴线150a。因此，无标签(LED照明、多焦点或多深度排列、透射或反射光、无透镜成像、波导集成、PMT集成等)或荧光(使用特定的生物标志物进行染色)测量是可能的。在一个示例性微流体装置100中，光学感测轴线150a可以垂直于通过流体通道110的流动方向，但在其他示例性实施例中，它可以是水平的。通常，光学感测轴线150a可以与通过流体通道110的流动方向形成任何角度，以允许通过(多个)第一基板130a和/或第二基板130b的未被(多个)电极120a和120b阻挡的(多个)部分进行光学测量。

图7a和7b进一步图示了可以用于一个或多个示例性分析单元和/或改变单元(例如11、12、13)的微流体装置的示例性配置。这些示例性实施例还可以结合光学感测单元。

描绘示例100’的图7a图示了利用波导单元160a和160b的集成光学器件的示例性实施例。一个或多个波导单元，例如160a-160b，可以设置在基板130a和130b之间的中间区域处或中，由中间平面或中心平面160c示意性地表示。在该示例性实施例中，波导单元160a-160b设置在第一基板130a和第二基板130b之间，优选地，基板130a和130b彼此附接或结合。波导材料的选择基于其与预期应用相关的基板材料相比所需的折射率差异。这种差异定义了光是如何被限制和引导的。例如，可以通过沉积/涂覆材料(例如二氧化硅或聚合物材料)并使用类似于用于制造基板的微细加工技术的微细加工技术在基板130a和130b上对其进行图案化来创建适用于本发明的实施例的波导单元。作为一个或多个集成波导单元的替代方案，来自激光装置180的聚焦激光束可以与平面160c对准，作为用于相同目的的外部部件，从而导致性能较低，但制造更简单、更便宜。

图7b示出了用附图标记100”表示的替代配置，其中，波导单元160a和160b可以分别设置在通道110的底面110b和顶面110a处。波导单元可以设置在基板130a和130b处或中。在一个实施例中，一个或多个波导单元160a和160b的光轴沿着平面160d设置。平面160d以非零角度定向，并且优选地，相对于中间平面或中心平面160c大致正交。这种配置要求在基板130a和130b上形成凹部131a和131b之后集成波导。

制造工艺和材料选项可以与结合图7a所示的先前配置描述的那些制造工艺和材料选项相同。材料可以沉积到模板上，或者沉积然后图案化以形成波导，由于波导的厚度比流体通道110的深度小两个数量级左右，因此波导可以设置在流体通道110表面上。因此，流路不受波导的干扰。对于浅通道，其中波导的厚度导致流场中的扰动，可以通过在设置波导后从基板上去除材料来创建凹部，以获得通道110的平整表面。

作为集成波导的替代方案，远场光学器件可以用于这种配置。光学部件，如聚焦光的光源和用于收集和感测散射光的图像传感器，可以放置在设备外部(外侧)的顶部和底部处。图7a和7b的示例100’和100”的波导单元160a和160b光学耦合到至少两个电极120a和120b之间的流体通道的感测区域，以提供额外的集成光路，其使得能够用(聚焦)光源照射分析物1、2、3(粒子或细胞)，并在不同平面上以几个角度收集散射光，可选地与用于分析分析物的检测器170结合使用。检测器170可以位于偏离波导单元160a-160b的光路160c或160d的位置。在本发明的这些实施例中，检测器的光轴与波导的光轴形成非零角度。使用外部光学部件作为替代或与集成波导结合可以为系统增加更多功能并降低总成本。

在第一个示例中，如图7a所示，从波导160a或放置在通道110的平面160c中的聚焦(激光)束180出射的光照射分析物(细胞或粒子)1、2、3，产生正向(FSC)和侧向(SSC)散射，这些散射可以分别用包括波导160b和检测器170的光学感测/检测单元150读取、检测或感测。检测器170可以位于偏离波导单元160a和160b的光路160c的位置。检测器170可以直接附接到设备100’-100”，或者基于光学感测应用或光学设置或外围部件的布置的需求放置一定距离。

在第二个示例中，如图7b所示，波导单元160a和160b集成在通道110的顶面110a和/或底面110b处，用于照明和收集前向和后向散射光。波导单元160a照射分析物1、2、3并收集后向散射光，而波导单元160b收集前向散射光。第二种选择更适合于浅流体通道110。在本发明的一些实施例中，第一波导单元160a和/或第二波导单元160b集成在第一基板130a和/或第二基板130b处。

上述示例性微流体装置可以有利地包括在示例性改变单元中，以对受试者分析物进行充电或可逆电穿孔。因此，除了用作传感器外，微流体装置的一些实施例还可以用于改变，例如电处理和操纵分析物，例如悬浮液中的细胞和粒子。通过限定凹形电极的覆盖角来控制与电解质接触的电极面积的能力提供了对应用于电治疗和操纵的参数的高水平控制。粒子或细胞的改变或处理可以是但不限于细胞的电穿孔，用于内容物递送或在例如生物生产后提取内部细胞内容物。电穿孔过程中的孔形成可以是可逆的或不可逆的，因为该过程(电极面积、施加电压等)在所提出的配置下得到了很好的控制并且有效。对粒子或细胞的改变或操纵可以但不限于通过在这些粒子/细胞上产生介电泳力来引导它们。这些力可以通过靶向特定属性(如尺寸、形态或表型)以及基于所选属性调整激励电压的频率和幅度来产生。然后，介电泳力可以用于导向或引导流中的粒子或细胞，或将它们收集/集中在装置中的特定区域上，以进行后续的下游分析。

通过光学感测单元获得的额外光学数据提供了有关物理属性的信息，例如内部和外部形态、大小、形状和表型。通过结合这些电学和光学数据集，根据本发明的系统和方法可以用作流式细胞仪，用于检测、计数、表征和/或分类悬浮液中的目标分析物或目标粒子，如血液中的生物细胞。根据本发明的系统和方法也可以用作用于血细胞分类和计数的血液分析仪。

处理单元14实现用于处理由各种测量通道收集的大量数据的机器/深度学习算法。对从传感器收集的读数进行处理，并决定使用开/关阀(介电泳、磁性、夹紧等)将肿瘤细胞引导到检测区下游的收集池。图8a和8b分别图示了介电泳阀和双向阀的示例操作。

对于介电泳阀(图8a)，液体连续流向收集储器16和废物储器17。在步骤(i)中，细胞接近阀单元15，此时介电泳阀15a关闭。在步骤(ii)中，肿瘤细胞(第二类型20-2的分析物)通过阀单元15，此时阀15a打开，并使肿瘤细胞20-2转向连接到收集储器16的流动管线，而液体流动不受影响。在步骤(iii)中，其他细胞(或第一类型20-1的分析物)通过阀单元15，在该步骤中，阀15a关闭，并且它们向废物储器17迁移。该“关闭”状态是介电泳阀15a的默认状态，并且仅在从感测单元接收到用于收集的信号时才被激活。一旦肿瘤细胞20-2离开阀单元15，阀15a就被设置回其默认状态。这种阀单元15的优点在于，它可以集成到装置，因此可以是在线单元，因为在感测单元的制造过程中已经处理了电极集成。因此，集成这种介电泳阀单元不需要额外的努力。

对于图8b中的双向阀150a，液体流要么被导向废物储器17，要么被导向收集储器16。在步骤(i)中，细胞接近阀150a，此时阀处于位置1，流体被导向废物储器。在步骤(ii)中，肿瘤细胞(第二类型20-2的分析物)通过阀，此时阀处于位置2，流被引导向收集储器16。在步骤(iii)中，其他细胞(或第一类型的分析物)通过阀，在该步骤中，阀150a处于位置1，并且流被引导向废物储器17。位置1是双向阀150a的默认位置，并且仅在从感测单元接收到收集信号时才设置为位置2。一旦肿瘤细胞离开该阀，阀就被设置回到其默认位置。这种类型的阀的优点是，市场上有许多替代品，可以很容易地安装到系统。此选项不会增加装置的复杂性，并且易于操作。

通过使用基于模块化尺寸的预分选单元对分析单元进行多路复用，可以满足高吞吐量要求，预分选单元还将负责去除多余的载液。这种方法不仅能够达到所需的吞吐量水平，而且随着测量体积与预分选细胞的大小相匹配，信噪比也会显著提高。

结合这些元素，本发明将提供第一种能够纯化和收集肿瘤细胞而不损失单个细胞的肿瘤细胞分析系统。完整和活的肿瘤细胞将准备好进行下游分析。该系统的在线计数、数字化和自动化操作是关键优势。

Claims (24)

1.一种用于表征样品流体中的分析物例如细胞的方法，所述方法包括：

a)使含有至少第一类型的分析物和第二类型的分析物的样品液体沿着流动路径通过流体通道；

b)在包括所述流体通道的第一分析单元中分析所述样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物，从而获得与至少第一类型和第二类型的分析物相关联的至少一个分析物特征的第一参数值，

c)在处理单元中存储所述至少一个分析物特征的第一参数值；

d)相较于所述第二类型的分析物相关联的另一个分析物特征，改变与所述第一类型的分析物相关联的所述另一个分析物特征；

e)在包括所述流体通道的第二分析单元中分析所述样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物，从而获得与至少第一类型和第二类型的分析物相关联的所述至少一个分析物特征的第二参数值；

f)在所述处理单元中存储所述至少一个分析物特征的第二参数值；

g)在所述处理单元中，通过将所述第二参数值与所述第一参数值进行比较，根据所述第二类型的分析物表征所述第一类型的分析物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，改变所述另一个分析物特征的步骤d)包括以下步骤：在包括所述流体通道的装置中对所述样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物施加电场。

3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括以下步骤：

h)在步骤g)之后，在安装到所述流体通道的分离单元中，基于所述处理单元中的表征并使用所述第一类型的分析物的改变后的所述另一个分析物特征，将所述第一类型的分析物与所述第二类型的分析物分离。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤h)包括以下步骤：

h1)向样品流体施加电场或使用阀，以及

h2)通过激活所述电场或通过改变所述阀的位置而将流引导到期望的出口，使所述第二类型的分析物从所述流动路径转向。

5.根据权利要求4所述的方法，还包括在收集储器中收集所述第二类型的分析物的步骤。

6.根据权利要求1-5中的一项或多项所述的方法，其中，使用一种或多种机器学习算法来执行根据所述第二类型的分析物表征所述第一类型的分析物的步骤g)。

7.根据权利要求1-6中的一项或多项所述的方法，其中，步骤b)和e)包括电阻抗谱(EIS)，特别是多频电阻抗谱。

8.根据权利要求1-7中的一项或多项所述的方法，其中，步骤d)包括以下步骤：改变分析物的细胞膜或引起分析物的细胞机械变形，并且其中，所述另一个分析物特征是所述分析物的电阻抗响应。

9.根据前述权利要求中的任一项或多项所述的方法，还包括光学感测所述流体通道的感测区域的步骤。

10.一种用于表征样品流体中的分析物例如细胞的方法，所述方法包括在多个不同的表征线中同时执行前述权利要求中的任一项或多项的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，还包括以下步骤：在步骤a)之前，将所述样品流体中的分析物分选到所述多个表征线中的不同表征线。

12.一种用于表征样品流体中的分析物例如细胞的系统，所述系统包括至少一条表征线，所述表征线由以下各项组成：

流体通道，其限定具有入口和出口的流动路径，并且被构造成允许包含至少第一类型的分析物和第二类型的分析物的样品液体沿着所述流动路径以及在所述流动路径的方向上看到的所述入口和所述出口之间通过，

第一分析单元，其包括所述流体通道，并且被构造成分析所述样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物并且被构造成获得与至少第一类型和第二类型的分析物相关联的至少一个分析物特征的第一参数值，

改变单元，其包括位于所述第一分析单元下游的所述流体通道，并被构造成：相较于所述第二类型的分析物相关联的另一个分析物特征，改变与所述第一类型的分析物相关联的所述另一个分析物特征；

第二分析单元，其包括位于微流体装置下游的所述流体通道，并且被构造成分析所述样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物并且被构造成获得与至少第一类型和第二类型的分析物相关联的所述至少一个分析物特征的第二参数值，

处理单元，其被构造成从所述第一分析单元和所述第二分析单元获取和存储所述第一参数值和所述第二参数值，并通过将所述第二参数值与所述第一参数值进行比较来根据所述第二类型的分析物表征所述第一类型的分析物。

13.根据权利要求12所述的系统，其中，所述改变单元包括电场产生单元，所述电场产生单元被构造成向所述样品液体中的至少第一类型和第二类型的分析物施加电场，从而相较于与所述第二类型的分析物相关联的所述另一个分析物特征，改变与所述第一类型的分析物相关联的所述另一个分析物特征。

14.根据权利要求12所述的系统，还包括分离单元，所述分离单元包括位于所述第二分析单元下游的所述流体通道，所述分离单元被构造成基于由所述处理单元生成和输出的表征信号，使用所述第一类型的分析物的改变后的所述另一个分析物特征，将所述第一类型的分析物与所述第二类型的分析物分离。

15.根据权利要求14所述的系统，还包括收集单元，所述收集单元位于所述分离单元下游，以用于收集所述第二类型的分析物。

16.根据权利要求14或15所述的系统，其中，所述分离单元包括电场产生单元，所述分离单元的电场产生单元被构造成向所述样品流体施加电场，以使所述第二类型的分析物从所述流动路径转向。

17.根据权利要求14或15所述的系统，其中，所述分离单元包括阀单元，所述阀单元被构造成使所述第二类型的分析物从所述流动路径转向。

18.根据权利要求12-16中的任一项或多项所述的系统，还包括分选单元，所述分选单元包括位于所述第一分析单元上游的所述流体通道，并且被构造成根据分析物尺寸对至少第一类型和第二类型的分析物进行分选。

19.根据权利要求12-17中的任一项或多项所述的系统，其中，所述处理单元实现用于根据所述第二类型的分析物表征所述第一类型的分析物的一种或多种机器学习算法。

20.根据权利要求12-18中的任一项或多项所述的系统，其中，所述第一分析单元和第二分析单元包括电阻抗谱(EIS)装置，特别是多频电阻抗谱装置。

21.根据权利要求12-19中的任一项或多项所述的系统，其中，所述改变单元被构造成改变分析物的细胞膜或引起分析物的细胞机械变形，并且其中，所述另一个分析物特征是电阻抗响应。

22.根据权利要求12-21中的任一项或多项所述的系统，还包括光学感测单元，所述光学感测单元被构造成以光学方式感测所述流体通道的感测区域。

23.一种用于表征样品流体中的分析物例如细胞的平台，所述平台包括多个根据前述权利要求中的任一项或多项所述的系统，每个系统包括不同的表征线。

24.根据权利要求23所述的平台，还包括分选装置，所述分选装置设置在所述多个系统的上游，并且被构造成将所述样品流体中的分析物分选到所述多个系统的不同表征线。