CN118613492A - Tfpi结合多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了结合组织因子途径抑制物(TFPI)的多肽，包括TFPI抑制性多肽及其组合物。该多肽可用于抑制TFPI、增强凝血因子缺乏型受试者中的凝血酶形成、增加受试者中的血凝块形成、治疗受试者中的血液凝固病症、纯化TFPI和鉴定TFPI结合性化合物等。

Description

TFPI结合多肽及其用途

交叉引用

本申请要求于2022年1月30日提交的国际专利申请号PCT/CN2022/075170的优先权。该申请的全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经通过电子方式以ASCII格式递交，并且在此通过引用将其整体并入。

技术领域

本发明总体上涉及结合TFPI的多肽、编码该多肽的核酸、包含该多肽的组合物及其用途。

背景技术

组织因子途径抑制物-1(简称为TFPI)是一种43kDa丝氨酸蛋白酶抑制剂，包含三个Kunitz型抑制结构域。它通过对组织因子-VIIa因子复合物的Xa因子依赖性反馈抑制来调节组织因子诱导的凝血。TFPI的Kunitz结构域1结合FVIIa，并且Kunitz结构域2结合FXa，使该抑制物能够形成四元FXa-TFPI-FVIIa-TF复合物，从而阻断TF/FVIIa外在复合物的活性。TFPI与FXa的结合下调凝血级联反应的共同途径，在此途径中FXa将凝血酶原转化为凝血酶(Audu等人,Anesth.Analg.,103(4),841-845(2006))。

TFPI主要由内皮细胞、巨核细胞、单核细胞和平滑肌细胞产生(Maroney和Mast,2015；Wood等人,2014)。在人类肠道中，TFPI在内皮细胞和腺细胞中高表达(Uhlen等人,2015)。TFPI调节血液凝固的组织因子依赖性途径，主要存在于细胞膜上和细胞外间隙中(Broze和Girard,2012；Wood等人,2014)。

对于恢复凝血酶生成，TFPI是一个有前景的靶标。严重的出血性病症，诸如血友病，是由血液凝固级联反应被破坏而造成的。目前，血友病和其他凝血病尚无法治愈。对于血液凝固病症，凝血因子替代疗法是最常见的治疗方法。然而，凝血因子通常在施用后不久就会从血流中清除。另外，在抑制性抗体形成后，凝血因子替代疗法的疗效可能会急剧下降。大约30％的重度甲型血友病患者中形成中和凝血因子VIII(FVIII)的抑制性抗体(Peerlinck和Hermans,Haemophilia,12,579-590(2006))。对于具有抗凝血因子抗体的患者来说，几乎没有治疗选择。

因此，需要用于治疗血液凝固病症的组合物和方法。本发明通过提供一种抗TFPI多肽及其方法和用途满足了这一需求。

发明内容

一方面，本文提供了结合TFPI的分离的多肽，其中该分离的多肽来源于TcdB(诸如TcdB4或TcdB2)。在一些实施方案中，该分离的多肽阻断TFPI对血液凝固级联反应的抑制作用，从而促进凝血酶的形成。

在一些实施方案中，本发明的分离的多肽结合TFPI-1(例如，TFPI-1α)，并且任选地，在不存在FVIII、FIX和/或FXI的情况下提高TFPI调节的凝血酶生成。还提供了包含该分离的多肽的组合物(例如，药物组合物)。

一方面，本文提供了一种结合TFPI的分离的多肽，其中该分离的多肽包含或者是：

(a)保留与TFPI结合的TcdB4蛋白的功能性片段；

(b)保留与TFPI结合的TcdB2蛋白的功能性片段；或者

(c)保留与TFPI结合的(a)或(b)的变体，其中该变体的氨基酸序列与(a)或(b)的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。

在一些实施方案中，所述TcdB4蛋白是天然TcdB4蛋白，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述TcdB2蛋白是天然TcdB2蛋白，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，该分离的多肽包含：

(a)与如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列；

(b)与如SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列；

(c)(a)或(b)的氨基酸序列的N-末端和/或C-末端截短型氨基酸序列，例如，截短100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸；或者

(d)(a)或(b)的氨基酸序列的N-末端和/或C-末端延伸型氨基酸序列，例如，延伸100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个在SEQ ID NO:1或2的相应位置处的氨基酸。

在一些实施方案中，该分离的多肽包含对应于SEQ ID NO:1的以下残基中的一个或多个：E1433、D1467、D1468、E1469、S1598、L1599、L1434、K1435、M1438、V1492、L1494、I1496、L1489、P1506和Y1510。

在一些实施方案中，该分离的多肽进一步包含对应于SEQ ID NO:1的以下残基中的一个或多个：如SEQ ID NO:1所示的L1434、K1435、M1438、K1597、S1598、L1599和K1600。

在一些实施方案中，该功能性片段包含SEQ ID NO:3-7和13-14中的任一个或由其组成。

在一些实施方案中，该功能性片段的变体与SEQ ID NO:3或4的相应位置相比包含至少一个突变(例如，置换、插入或缺失)，以提高与TFPI的结合。

在一些实施方案中，该分离的多肽与TFPI结合的解离常数小于10μM、小于1μM、小于100nM、小于50nM、小于25nM、小于10nM或小于5nM，如通过生物膜干涉技术(BLI)测定法所测量的。

在一些实施方案中，该分离的多肽与TFPI的K2结构域而非K1结构域特异性结合。

在一些实施方案中，该分离的多肽包含：

(a)与SEQ ID NO:1的位置1285-1834所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:2的位置1285-1834所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；或者

(c)(a)或(b)的氨基酸序列的N-末端和/或C-末端截短型氨基酸序列，例如，截短50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。

在一些实施方案中，该分离的多肽与如SEQ ID NO:1或2所示的相应野生型序列相比包含至少一个突变(例如，置换、插入或缺失)。

在一些实施方案中，如本文公开的分离的多肽抑制TFPI活性，并以小于10μM的解离常数与TFPI结合。

在一些实施方案中，如本文所公开的分离的多肽与增加该分离的多肽的半衰期的部分可操作地连接。举例来说，该分离的多肽缀合至聚乙二醇(PEG)部分、人血清白蛋白(HSA)、抗体或其片段、羟乙基淀粉、包含脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸或其组合的多聚体(PAS化)或者C12-C18脂肪酸。

一方面，本文提供了一种融合蛋白，其包含与异源多肽融合的该分离的多肽。

在一些实施方案中，该异源多肽是IgG Fc部分，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc部分，并且任选地包含铰链区。

一方面，本文提供了一种分离的核酸分子，其包含编码如本文公开的分离的多肽或融合蛋白的核酸序列。

一方面，本文提供了一种包含如本文公开的核酸分子的载体。

一方面，本文提供了一种包含如本文公开的核酸分子或载体的宿主细胞。

一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含如本文公开的分离的多肽和药学上可接受的载剂。

一方面，本文提供了一种抑制TFPI活性的方法，其包括使TFPI蛋白与如本文所述的分离的多肽接触。

一方面，本文提供了使用本发明的分离的多肽或编码本发明的分离的多肽的核酸分子的方法，例如用于治疗TFPI相关或TFPI介导的病症，诸如血液凝固病症。

在一些实施方案中，本文提供了一种在有此需要的受试者(诸如凝血因子缺乏型受试者)中增强凝血酶形成的方法，包括以有效增强凝血酶形成的量向该受试者施用如本文提供的分离的多肽。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于在有此需要的受试者中增加血凝块形成的方法，以及一种在有此需要的受试者中治疗血液凝固病症的方法。所述方法包括以在受试者中有效增强血凝块形成的量或者在受试者中有效治疗血液凝固病症的量向该受试者施用如本文提供的分离的多肽。

在一些实施方案中，在已经确定受试者处于发生血液凝固病症的风险中(例如，检测到凝血因子(如FVIII、FIX或FXI)的缺乏)之后或者在检测到血液凝固病症(例如，甲型血友病、乙型血友病或丙型血友病)之后执行该方法。在一些实施方案中，施用如本文公开的多肽是为了在损伤或手术过程中完全或部分地防止失血过多。

除非明确指出相反的情况，否则本文提供的关于一种本发明的分离的多肽或本发明的方法的描述分别适用于每种和各种本发明的分离的多肽和本发明的方法。

一方面，本文提供了本发明的分离的多肽或编码该分离的多肽的核酸分子用作药物。还提供了本发明的分离的多肽或编码该分离的多肽的核酸分子用于在有此需要的受试者中增强凝血酶形成、增加血凝块形成和/或治疗血液凝固病症。

一方面，本文提供了本发明的分离的多肽在制备用于在有此需要的受试者中增强凝血酶形成、增加血凝块形成和/或治疗血液凝固病症的药物中的用途。

一方面，本文提供了一种用于靶向展示TFPI的细胞的方法。

一方面，本文提供了一种用于治疗或诊断患有TFPI相关或TFPI介导的疾病或处于患有TFPI相关或TFPI介导的疾病的风险中的受试者的方法。

一方面，本文提供了一种纯化TFPI的方法。

一方面，本文提供了一种鉴定TFPI结合性化合物的方法。

上述内容是一个概述，因此必然包含对细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将会理解，该概述仅仅是说明性的，而并非意在以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其他方面、特征和有益效果将在本文阐述的教导中变得显而易见。

附图说明

图1.CRISPR-Cas9筛选鉴定针对TcdB4的宿主因子

(A)使用TcdB4对转导了GeCKO v2慢病毒文库的HeLa细胞进行筛选过程的示意图。

(B)对从第三轮筛选(R3)中鉴定出的基因进行排序并作图。X轴显示每个基因的NGS读段的数量。Y轴代表每个靶向基因的独特gRNA的数量。

图2.TFPI是TcdB4的细胞受体

(A)TFPI的两种主要同等型TFPIα和TFPIβ的示意图。

(B)瞬时转染TFPIα或TFPIβ恢复TcdB4进入HeLa CSPG4^–/–/TFPI^–/–细胞(0.14nMTcdB4，3小时)。比例尺，50μm。

(C)对(B)中细胞变圆的定量。误差条(n＝6)表示平均值±SD。

(D)将转染了TFPIα、TFPIβ或模拟转染的HeLa WT或TFPI^-/-细胞与TcdB4(10nM)在冰上孵育10分钟，用PBS洗涤，裂解，并进行免疫印迹分析。通过抗TcdB多克隆抗体检测细胞表面结合的TcdB4。肌动蛋白是上样对照。

图3.TcdB4与TFPI的Kunitz-2结构域相互作用

(A)TFPI^K1+K2-Fc、TFPI^K1-Fc和TFPI^K2-Fc的示意图。

(B)TFPI^K1+K2保护HeLa CSPG4^-/-细胞免受TcdB4的侵害，而不能保护这些细胞免受TcdB1的侵害，如通过细胞变圆测定法所测量的。

(C)来自TFPI、TFPI2和AMBP的亲缘关系较近的Kunitz结构域的系统发生树。

(D)异位表达GPI锚定的TFPI^K2(TFPI^K2-GPI)恢复TcdB4进入CSPG4-^/-/TFPI^-/-细胞。

(E)使用BLI测定法表征TcdB4与带Fc标签的TFPI^K1或TFPI^K2的结合(对于K_d分析参见图4)。以人IgG Fc片段作为阴性对照。

图4.TcdB4与TFPI特异性结合。

(A)TFPI^K1+K2-Fc保护HeLa CSPG4^–/–细胞免受TcdB4的侵害，而不能保护这些细胞免受TcdB1的侵害，如通过细胞变圆测定法所测量的。

(B)下拉测定法显示TcdB4而非TcdB1与带Fc标签的TFPI^K1+K2结合。

(C)纯化的TFPI^K2-Fc而非TFPI^K1-Fc保护CSPG4^–/–细胞免受TcdB4的侵害，如通过细胞变圆测定法所测量的。比例尺表示50μm。

图5.TcdB4-TFPI相互作用的动力学分析。

(A)通过BLI测定法检查TcdB4与带Fc标签的人TFPI^K1+K2的代表性结合曲线。

(B)TcdB4与带Fc标签的人TFPI^K2的代表性结合曲线。

(C)TcdB4与带Fc标签的小鼠Tfpi^K2的代表性结合曲线。

图6.TcdB4-TFPI复合物的冷冻电镜结构

(A)用于冷冻电镜结构测定的全长TcdB4和TFPI^K1+K2的结构域组成示意图。

(B)TcdB4-TFPI复合物的冷冻电镜结构。TcdB4的葡糖基转移酶结构域(GTD)、半胱氨酸蛋白酶结构域(CPD)、跨膜递送和受体结合结构域(DRBD)和组合重复寡肽(CROP)结构域分别以小麦色、粉红色、浅蓝色和绿色显示。TFPI通过TFPI的Kunitz-2结构域(青色)与TcdB4的DRBD之间的直接相互作用结合在TcdB4的边缘处。

(C)TcdB4^DRBD(浅紫色)与TFPI^K2(青色)之间相互作用的放大视图。TFPI^K2通过两个表位锚定在TcdB4^DRBD的疏水表面上：环1(残基131-138)和环2(残基155-162)。

(D)对环1-TcdB4(左图)和环2-TcdB4(右图)结合界面的特写视图。

(E)TcdB4^1285-1834中的突变破坏了其与带Fc标签的TFPI^K2的相互作用，这一点已通过下拉测定法得到证实。

(F)将TcdB4^1285-1834预加载至TFPI^K2阻碍了后续与FXa的结合。首先使加载有TFPI^K2-Fc的生物传感器暴露于300nM TcdB4^1285-1834或对照缓冲液，经过平衡，然后再暴露于100nM FXa。

图7.TcdB4和TFPI的纯化及功能表征。

(A)TFPI的尺寸排阻色谱图和插图所示的峰级分的SDS-PAGE。

(B)TcdB4的尺寸排阻色谱图和插图所示的峰级分的SDS-PAGE。

(C)TcdB4-TFPI复合物的尺寸排阻色谱图和插图所示的峰级分的SDS-PAGE。

图8.单颗粒冷冻电镜数据的图像处理。

(A)冷冻电镜数据处理的流程图。有关详细信息，请参见方法部分中的“数据处理”。

(B)代表性冷冻电镜图像。TcdB4-TFPI的一些单颗粒用青色圆圈标出。

(C)TcdB4的冷冻电镜颗粒图像的2D类别平均。

图9.TcdB4的单颗粒冷冻电镜分析。

(A)最终3D重建中包含的颗粒图像的角度分布。

(B)TcdB4的最终冷冻电镜图的局部分辨率。

(C)TcdB4的傅里叶壳层相关(FSC)曲线，显示FSC＝0.5时的分辨率。

(D)原子模型与最终图之间的TcdB4的FSC曲线，显示FSC＝0.5时的分辨率(黑色)；半折密度图1(红色)或半折密度图2(绿色)与根据半折密度图1细化的原子模型之间的FSC曲线。

图10.TcdB4与FXa竞争性结合TFPI。

(A)免疫印迹分析显示，带Fc标签的TFPI^K2与TcdB4^842-1834结合，但不与TcdB4^1-841和TcdB4^1801-2367结合。

(B)TFPI-FXa/胰蛋白酶(PDB：1TFX和1FAX，左图)与TFPI-TcdB4复合物(右图)的结构之间的比较。它们的界面用红色圆圈标出。

(C)将FXa预加载至TFPI^K2阻碍了后续与TcdB4^1285-1834的结合。首先使加载TFPI^K2-Fc的生物传感器暴露于100nM FXa或对照缓冲液，经过平衡，然后再暴露于300nM TcdB4^{1285 -1834}。

图11.TcdB包含两类RBI，其识别FZD或TFPI。

(A)TcdB中RBI的示意图(上图)和涵盖来自已知TcdB序列的RBI的系统发生拆分网络(下图)。

(B)为110个MLST分型构建最大似然树，以区分五种主要的艰难梭菌(C.difficile)进化枝(内环：进化枝1为浅蓝色，进化枝2为紫色，进化枝3为黄色，进化枝4为绿色，进化枝5为橙色，以及其他隐秘进化枝为灰色)。将每个MLST分型中的不同RBI类别标记为外环。

(C)TcdB1-FZD2复合物(PDB：6C0B，左图)与TcdB4-TFPI复合物(右图)之间的结构比较。仅显示了TcdB1(灰色)和TcdB4(浅紫色)的DRBD(残基1285-1804)。

(D)对TcdB1-FZD2(左图)和TcdB4-TFPI(右图)界面的特写视图。将PAM分子插入由来自FZD2和TcdB1的残基形成的疏水通道中，从而稳定TcdB1-FZD2相互作用。关键残基和PAM显示为棒状模型。

(E)TcdB1中的F1597稳定PAM的中间部分，而TcdB4中的S1598(相应的残基)与来自TFPI的R140形成紧密氢键。

(F)来自TcdB2的RBI(绿色，PDB：6OQ5)与来自TcdB4-TFPI复合物的RBI(浅紫色)的叠加。

(G)使用细胞变圆测定法测量HeLa CSPG4^–/–和CSPG4^–/–/TFPI^–/–细胞对TcdB2的敏感性，并将它们的CR50绘制成柱状图(***P<0.001)。

(H)异位表达GPI锚定的Tfpi^K2(Tfpi^K2-GPI)恢复TcdB2进入CSPG4^–/–/TFPI^–/–细胞。比例尺表示50μm。

(I)通过随时间变化的细胞病变细胞变圆测定法量化使用小鼠Tfpi^K2-Fc保护HeLaCSPG4^–/–细胞免受TcdB2的侵害。数据(n＝6)表示为均值±SD。

(J)使用TFPI^K2-Fc作为诱饵，在下拉测定法中检查TcdB4^1285-1834上的点突变。使用蛋白A树脂将结合的TcdB4^1285-1834突变体与TFPI^K2-Fc共沉淀，并通过免疫印迹分析进行检测。

图12.TcdB2与TFPI^K2结合。

(A)在含有或不含带Fc标签的小鼠Tfpi^K2的情况下，将HeLa CSPG4^–/–细胞暴露于100pM TcdB2。然后将细胞在37℃孵育，并检查细胞变圆的百分比。显示了暴露于毒素后4小时细胞变圆的代表性明场图像。比例尺代表100μm。

(B)使用BLI测定法表征TcdB2与带Fc标签的TFPI^K1或TFPI^K2的结合。

(C)TcdB2^1285-1834与带Fc标签的人TFPI^K2的代表性结合曲线。

(D)TcdB2^1285-1834与带Fc标签的小鼠Tfpi^K2的代表性结合曲线。

图13.S1496是影响TcdB2-TFPI相互作用的重要残基。

(A)TcdB2和TcdB4的RBI之间的序列比对。非保守性残基标记为红色，相似残基标记为蓝色。有助于TFPI结合的残基用绿色三角形指示。

(B)TcdB2^1285-1834 S1496I突变体与带Fc标签的小鼠Tfpi的代表性结合曲线。

(C)TcdB2^1285-1834 S1496I突变体与带Fc标签的人TFPI的代表性结合曲线。

发明详述

本说明书中引用的所有出版物均通过引用并入本文，如同完整阐述一样。如果本文引用的参考文献的某些内容与本公开内容矛盾或不一致，则以本公开内容为准。

为了增进对本公开内容原理的理解，现在将参考附图中所示的实施方案，并将使用特定的语言对其进行描述。然而，应当理解的是，这并非意在由此限制本公开的范围。

在本公开中，除非另有说明，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可用于本公开的实践中，但本文描述了优选的方法和材料。因此，本文定义的术语通过参考整个说明书进行更全面的描述。

如本文所用的，除非上下文另有明确规定，否则单数术语“一种/个(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代。

应当理解的是，本公开不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些方法、方案和试剂可能会有所不同，这取决于本领域技术人员使用这些方法、方案和试剂的具体情况。

除非上下文另有要求，否则术语“包含/包括(comprise)”、“包含/包括(comprises)”和“包含/包括(comprising)”或类似术语意在表示非排他性包含，使得所列举的要素或特征列表并非只包括那些规定或列出的要素，而是可以包括未列出或规定的其他要素或特征。

定义

如本文所用的，术语“TFPI”指的是组织因子途径抑制物，这是一种多价Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，其通过对组织因子-凝血因子VIIa复合物的凝血因子Xa依赖性反馈抑制来调节组织因子诱导的凝血。在人类中，TFPI有两种主要的同等型，TFPIα和TFPIβ，它们也由所有哺乳动物产生(Wood等人,2014)。TFPIα含有三个串联的Kunitz型蛋白酶抑制(Kunitz-1、Kunitz-2和Kunitz-3，或者K1、K2和K3)结构域，后跟碱性羧基末端(C末端)区域。TFPIβ缺乏TFPIα的K3和碱性C末端结构域。相反，它含有C末端信号肽，可以指导GPI锚的切割和附着(Broze和Girard,2012；Girard等人,2012；Maroney和Mast,2015；Zhang等人,2003)。小鼠TFPIβ的示例性序列如SEQ ID NO:10所示。人TFPIα和TFPIβ的示例性序列分别示于SEQ ID NO:11和12中。

如本文所用的，术语“TcdB”或“艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素B”是一种由致病性艰难梭菌产生的外毒素。TcdB是大梭菌毒素(LCT)家族的成员，它通过受体介导的胞吞作用进入靶细胞，并使小GTP酶蛋白葡糖基化，导致细胞骨架功能障碍并最终导致细胞死亡(Aktories等人,2017；Chandrasekaran和Lacy,2017；Voth和Ballard,2005)。TcdB有三个主要结构域：具有催化活性的N-末端结构域、位于中心的转运结构域和C-末端受体结合结构域。TcdB有4种变体，TcdB1、TcdB2、TcdB3和TcdB4，其中TcdB2和TcdB4不识别卷曲蛋白(FZD)，但如本文所表征的，识别TFPI。

如本文所用的术语“特异性的结合”或“特异性地结合”指的是两个分子之间，例如TcdB4和TFPI之间的非随机结合反应。如本文所用的术语“高亲和力”指的是解离常数(Kd)为1x 10^-7M或更小、更优选5x 10^-8M或更小、还更优选1x10^-8 M或更小、甚至更优选5x 10^-9M的相互作用，例如，如通过生物膜干涉技术(BLI)测定法所测量的。

如本文所用的，与全长TcdB4或TcdB2相关的术语“功能性片段”指的是野生型TcdB4或TcdB2中保留与TFPI结合功能的片段。与全长野生型TcdB4或TcdB2与TFPI之间的结合相比，功能性片段与TFPI之间的结合可能大致更低、相等或更高，优选地，与全长野生型TcdB2相比，结合更高。

术语“多肽”和“肽”在本文中可以互换使用，并指的是至少2个氨基酸，且通常超过10个氨基酸的氨基酸序列。还包括具有多于一条链的多肽复合物。

如本文所用的，与全长野生型TcdB4或TcdB2相关的术语“对应于”意指分别如SEQID NO:1或2所示的全长野生型TcdB4或TcdB2的相应编号位置处的残基。举例来说，包含对应于SEQ ID NO:1的E1433的残基的功能性片段意指源自SEQ ID NO:1的功能性片段，其在对应于SEQ ID NO:1的1433的位置处包含Glu(E)氨基酸残基。在一些实施方案中，功能性片段还可以包含在SEQ ID NO:1中与E1433接近处的相同残基，例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸1431-1606。在一些其他实施方案中，包含E1433氨基酸残基的功能性片段可以在接近E1433的位置处发生突变，例如，功能性片段中接近E1433的一个或多个残基不同于SEQ IDNO:1中的残基。在整个说明书中，当涉及氨基酸的编号时，它指的是根据SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的编号，具体取决于上下文。

如本文所用的，“治疗”和“处理”指的是与TFPI相关或TFPI介导的病症如血液凝固病症有关的症状的严重程度和/或发作的任何降低。因此，“治疗”和“处理”包括治疗性和预防性措施。本领域普通技术人员将理解，针对血液凝固病症或与其相关的症状的任何程度的保护或改善对于受试者例如人类患者都是有益的。患者的生活质量通过在任何程度上降低受试者中症状的严重程度和/或延迟症状的出现得以改善。

包含TcdB的功能性片段或其变体的多肽

在某些实施方案中，本文公开的多肽保留与TFPI的结合和/或具有抑制TFPI功能的能力(称为TFPI抑制性多肽)，其中该多肽包含TcdB(尤其是TcdB4)的功能性片段或这些片段的高度同源序列或者由其组成。举例来说，多肽可以包含TcdB2或TcdB4的受体结合结构域(DRBD)。

在一些实施方案中，该多肽包含TcdB4受体结合结构域(DRBD)的N末端截短型片段，具体而言，从TcdB4或TcdB2受体结合结构域(DRBD)的N末端截短1-400个氨基酸，例如，不超过400个氨基酸、不超过350个氨基酸、不超过300个氨基酸、不超过250个氨基酸、不超过200个氨基酸、不超过150个氨基酸、不超过100个氨基酸、不超过50个氨基酸或不超过10个氨基酸。另外地或备选地，该多肽包含TcdB4受体结合结构域(DRBD)的C末端截短型片段，具体而言，从TcdB4或TcdB2受体结合结构域(DRBD)的C末端截短1-400个氨基酸，例如，不超过400个氨基酸、不超过350个氨基酸、不超过300个氨基酸、不超过250个氨基酸、不超过200个氨基酸、不超过150个氨基酸、不超过100个氨基酸、不超过50个氨基酸或不超过10个氨基酸。如本领域技术人员将理解的，如上所述的N末端和/或C末端截短型片段可以保留与TFPI的结合或具有抑制TFPI功能的能力。

术语“保留与TFPI的结合”是指与全长TcdB和TFPI之间的结合相比，功能性片段(或其变体)和TFPI之间的结合基本上相同、更高或略低。在一些实施方案中，如本文公开的多肽包含TcdB2的功能性片段，其通过包含S1496I置换而提高了与TFPI的结合。

具体而言，所述多肽可以包含：

如SEQ ID NO:1所示的TcdB4蛋白或如SEQ ID NO:2所示的TcdB2蛋白的功能性片段，其保留与TFPI的结合；或者

该功能性片段的变体，其保留与TFPI的结合，其中该变体的氨基酸序列与该功能性片段的氨基酸序列具有至少80％同一性。

在一些实施方案中，所述功能性片段源自TcdB4，并包含与SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列。举例来说，该功能性片段包含SEQ ID NO:1的位置841-1834、1285-1834或1431-1606或者由其组成。在一些另外的实施方案中，该功能性片段包含SEQ ID NO:1的位置841-1834、1285-1834或1431-1606的N末端和/或C末端截短型氨基酸序列或由其组成，例如，截短100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。例如，该功能性片段包含来自SEQ IDNO:1或2的位置842-1834的氨基酸序列或由其组成(即，分别为SEQ ID NO:13或14)。在一些另外的实施方案中，该功能性片段包含来自SEQ ID NO:1的位置841-1834、1285-1834或1431-1606的N末端和/或C末端延长的氨基酸序列或由其组成，例如，延伸100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。延长的氨基酸可以与SEQ ID NO:1中的相应位置基本上相同。

在一些实施方案中，所述功能性片段源自TcdB2，并包含与SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列。举例来说，该功能性片段包含SEQ ID NO:2的位置841-1834、1285-1834或1431-1606或者由其组成。在一些另外的实施方案中，该功能性片段包含SEQ ID NO:2的位置841-1834、1285-1834或1431-1606的N末端和/或C末端截短型氨基酸序列或由其组成，例如，截短100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在一些另外的实施方案中，该功能性片段包含SEQ ID NO:2的位置841-1834、1285-1834或1431-1606的N末端和/或C末端延伸型氨基酸序列或由其组成，例如，延伸100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。延伸的氨基酸可以与SEQ ID NO:2中的相应位置基本上相同。由于TcdB2和TFPI之间的结合低于TcdB4和TFPI之间的结合，因此优选在源自TcdB2的功能性片段中包含一个或多个突变以提高结合亲和力。举例来说，可以将某些突变引入源自TcdB2的功能性片段中，以使其与TcdB4的功能性片段更加相似，即，源自TcdB2的功能性片段中的某些残基突变为TcdB4中相应位置处的残基。在一个示例中，所述多肽包含源自TcdB2的功能性片段的变体，并且该变体包含S1496I置换(编号根据SEQ ID NO:2)。

可以采用已经并入ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))，使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比还可以通过Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))来确定，该算法已并入GCG软件包中的GAP程序(可获自http://www.gcg.com)中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。

另外地或备选地，可以将本公开的蛋白质序列进一步用作“查询序列”，以对公共数据库进行搜索，从而例如鉴定相关序列。此类搜索可以使用XBLAST程序(2.0版)来执行，参见Altschul等人,(1990)J.MoI.Biol.215:403-10。可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，分数＝50，字长＝3，以获得与本公开的序列同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可采用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

本文中所谓的“变体”意指相对于亲本氨基酸序列包含一个或多个氨基酸置换、氨基酸缺失或氨基酸添加的多肽。变体包括但不限于具有与本文提供的任何氨基酸序列存在至少60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，同时保留结合TFPI和/或抑制TFPI活性的能力的多肽。

在一些实施方案中，所述多肽包含对应于SEQ ID NO:1的以下残基中的一个或多个：E1433、D1467、D1468、E1469、S1598、L1599、L1434、K1435、M1438、V1492、L1494、I1496、L1489、P1506和Y1510。具体而言，该多肽可以包含SEQ ID NO:1的位置1433至1510的片段。

在一些实施方案中，该多肽进一步包含对应于SEQ ID NO:1的以下残基中的一个或多个：如SEQ ID NO:1所示的L1434、K1435、M1438、K1597、S1598、L1599和K1600。具体而言，该多肽可以包含SEQ ID NO:1的位置1433至1600的片段。

在一些实施方案中，该功能性片段包含SEQ ID NO:7、4或3(分别对应于SEQ IDNO:1的位置1431-1606、1285-1834和841-1834)或由其组成。在一些实施方案中，该功能性片段包含SEQ ID NO:6或5(分别对应于SEQ ID NO:2的位置1285-1834和841-1834)或由其组成。

TcdB的功能性片段和衍生物

一方面，如本文公开的多肽包含野生型全长TcdB4或TcdB2的20个或更多个氨基酸、30个或更多个氨基酸、40个或更多个氨基酸、50个或更多个氨基酸、60个或更多个氨基酸、70个或更多个氨基酸、80个或更多个氨基酸、90个或更多个氨基酸、100个或更多个氨基酸、150个或更多个氨基酸、200个或更多个氨基酸、250个或更多个氨基酸、300个或更多个氨基酸、350个或更多个氨基酸、400个或更多个氨基酸、450个或更多个氨基酸、500个或更多个氨基酸、550个或更多个氨基酸、600个或更多个氨基酸、650个或更多个氨基酸、700个或更多个氨基酸、750个或更多个氨基酸或者800个或更多个氨基酸，优选来自TcdB4或TcdB2的DRBD结构域。在不同的实施方案中，该多肽包含TcdB4或TcdB2的DRBD结构域中的100-300个氨基酸残基(例如，110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300个氨基酸残基)。在一些实施方案中，该多肽包含DRBD结构域中的位置1431-1606，其可能位于TcdB的受体结合界面(RBI)处。然而，还可以设想的是，包含一个或多个延伸或缺失的本文所述的多肽在本发明的上下文中是合适的，只要该多肽结合TFPI，并且任选地阻断TFPI对凝血级联反应的抑制即可。

任选地，本发明的多肽包含不破坏(或甚至提高)该多肽结合和/或抑制TFPI的能力的一个或多个氨基酸置换(参考本文提供的任何氨基酸序列)。

氨基酸置换包括但不限于具有以下功能的置换：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变结合亲和力，和/或(4)赋予多肽其他理化或功能特性，或者改变这些特性。在一些实施方案中，该置换是保守性置换，其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。本领域内已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。

然而，应当理解的是，本发明并不限于创建保守性置换，只要所得多肽保留完全或部分地下调TFPI活性的能力即可。本发明还涵盖包含本领域众所周知的非典型、非天然存在的氨基酸的TFPI抑制性多肽。示例性的非天然存在的氨基酸包括鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘化酪氨酸、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、3-甲基氨基酸、α-C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、2-氨基异丁酸、β-高谷氨酸、β-高苯丙氨酸、β-高赖氨酸、β-高亮氨酸、β-高天冬酰胺、β-高谷氨酰胺、β-高精氨酸、β-高丝氨酸、β-高酪氨酸、β-高天冬氨酸、β-高缬氨酸、β-高天冬酰胺、(S)-环己基丙氨酸、(S)-瓜氨酸、(S)-2,4-二氨基丁酸、(S)-2,4-二氨基丁酸、(S)-二氨基丙酸、(S)-2-炔丙基甘氨酸、(S)-N(ω)-硝基-精氨酸、L-高苯丙氨酸、(S)-高-精氨酸、(S)-高-瓜氨酸、(S)-高-半胱氨酸、(S)-2-氨基-5-甲基-己酸、(S)-高-赖氨酸、(S)-正亮氨酸、(S)-甲基丙氨酸、(S)-N-甲基-天冬氨酸、(S)-N-甲基-谷氨酸、(S)-N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-甘氨酸、(S)-N-甲基-赖氨酸、(S)-N-甲基-亮氨酸、(S)-N-甲基-精氨酸、(S)-N-甲基-丝氨酸、(S)-N-甲基-缬氨酸、(S)-N-甲基-酪氨酸、(S)-2-氨基-戊酸、(S)-2-吡啶基-丙氨酸、(S)-鸟氨酸、L-苯基甘氨酸、4-苯基-丁酸和硒代蛋氨酸。在适当的情况下，各个氨基酸可以具有L或D立体化学结构，尽管多肽中的所有氨基酸通常采用L立体化学结构。

本发明进一步包括多肽变体，其包含插入本文提供的氨基酸序列内和/或附接至N-末端或C-末端的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，多肽进一步包含促进该多肽的合成、操作或使用的一个或多个氨基酸，包括但不限于位于N末端和/或C末端的一个或两个赖氨酸以增加该多肽的溶解度，或者位于N末端和/或C末端的一个或两个蛋氨酸，并且预计此类修饰不会改变多肽的功能。

本发明涵盖“衍生物”，并且其包括已经以不同于氨基酸添加、缺失或置换的某种方式经过化学修饰的TFPI结合性或TFPI抑制性多肽。在这方面，将本文提供的本发明的多肽与聚合物、脂质、其他有机部分和/或无机部分进行化学键合。Hermanson,BioconjugateTechniques,Academic Press,(1996)中给出了多肽和蛋白质修饰的实例。本文所述的TFPI结合性多肽任选地包含促进与另一部分(例如，肽部分)缀合的官能团。示例性官能团包括但不限于异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮、NHS酯、磺酰氯、醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基化剂、酰亚胺酯、碳二亚胺、酸酐、卤代烷衍生物(例如，卤乙酰衍生物)、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰衍生物、芳基化剂、硫醇-二硫化物交换试剂(例如，吡啶基二硫化物或TNB硫醇)、重氮烷、羰基二咪唑、N,N′-二琥珀酰碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯和肼衍生物。马来酰亚胺可用于例如生成在体内与白蛋白结合的TFPI结合性多肽。

在一些情况下制备衍生物以增加溶解度、稳定性、吸收或循环半衰期。各种化学修饰可消除或减弱药剂的任何不期望的副作用。一方面，本发明包括经共价修饰以包含一种或多种水溶性聚合物附接物的TFPI结合性多肽。将水溶性聚合物(或其他化学部分)附接至任何氨基酸残基，尽管在一些实施方案中优选附接至N-末端或C-末端。任选地，将聚合物通过一个或多个氨基酸或者提供促进聚合物附接的官能团的结构单元附接至所述多肽。例如，JBT2315包含C-末端半胱氨酸(就式(XI)而言的位置X4021)，其有助于添加例如马来酰亚胺聚乙二醇(PEG)。可用的聚合物包括但不限于PEG(例如，大小为大约40kD、30kD、20kD、10kD、5kD或1kD的PEG)、聚氧乙二醇(polyoxyethylene glycol)、聚丙二醇、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、羟乙基淀粉、纤维素、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚唾液酸(PSA)、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇，以及任何前述聚合物的混合物。一方面，本发明的多肽可以是PEG化的多肽。PEG部分可以有不同的形状，例如直链或支链。关于水溶性聚合物附接物的进一步讨论，参见美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；和4,179,337。本文还描述了可用于增加多肽半衰期或稳定性的其他部分，并且包括例如白蛋白(任选地经修饰以允许与本发明的多肽缀合)、脂肪酸链(例如，C12-C18脂肪酸，如C14脂肪酸)、抗体或其片段(例如，抗体的Fc部分)和脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体。

另一方面，多肽衍生物包括对特定细胞类型、组织和/或器官具有特异性的靶向部分。备选地，将该多肽与一个或多个化学部分连接，这些化学部分有助于纯化、检测、多聚化、与相互作用配偶体的结合和多肽活性的表征。一个示例性的化学部分是生物素。适合于与本发明的TFPI结合性多肽缀合的其他部分包括但不限于光敏剂、染料、荧光染料、放射性核素、含放射性核素的复合物、酶、毒素和细胞毒性剂。光敏剂包括，例如，Photofrin、Visudyne、Levulan、Foscan、Metvix、Cysview^TM、Laserphyrin、Antrin、Photochlor、Photosens、Photrex、Lumacan、Cevira、Visonac、BF-200ALA和Amphinex。如有必要，将His标签、FLAG标签、strep标签或myc标签与该多肽缀合。

另外，一方面，使本发明的多肽在该多肽的N-末端氨基酸处发生酰化。另一方面，使本发明的多肽在该多肽的C-末端氨基酸处发生酰胺化。再一方面，使本发明的多肽在该多肽的N-末端氨基酸处发生酰化并且在该多肽的C-末端氨基酸处发生酰胺化。

衍生物还包括包含经修饰的或非蛋白原性氨基酸或者经修饰的接头基团的肽(参见，例如Grant,Synthetic Peptides:A User's Guide,Oxford University Press(1992))。经修饰的氨基酸包括例如其中氨基和/或羧基被另一基团取代的氨基酸。非限制性实例包括引入硫代酰胺类、脲类、硫脲类、酰基酰肼类(acylhydrazides)、酯类、烯烃类、磺酰胺类、磷酸酰胺类、酮类、醇类、硼酸酰胺类、苯二氮卓类和其他芳香族或非芳香族杂环的经修饰氨基酸(参见Estiarte等人,Burgers Medicinal Chemistry,第6版,第1卷,第4部分,John Wiley&Sons,New York(2002))。经修饰的氨基酸通常通过至少一个上述官能团而不是酰胺键与肽连接。非蛋白原性氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(Bal)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、4-氨基丁酸(γ-Abu)、2-氨基异丁酸(Aib)、6-氨基己酸(ε-Ahx)、鸟氨酸(Orn)、羟脯氨酸(Hyp)、牛磺酸、肌氨酸、瓜氨酸(Cit)、磺基丙氨酸(Coh)、环己基丙氨酸(Cha)、蛋氨酸亚砜(Meo)、蛋氨酸砜(Moo)、高丝氨酸甲酯(Hsm)、炔丙基甘氨酸(Eag)、5-氟色氨酸(5Fw)、6-氟色氨酸(6Fw)、3′,4′-二甲氧基苯基-丙氨酸(Ear)、3′,4′-二氟苯丙氨酸(Dff)、4′-氟苯基-丙氨酸(Pff)、1-萘基-丙氨酸(1Ni)、1-甲基色氨酸(1Mw)、青霉胺(Pen)、高丝氨酸(Hse)、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸(Phg)、苯并噻吩基丙氨酸(Bta)、L-高-半胱氨酸(Hcy)、N-甲基-苯丙氨酸(Nmf)、2-噻吩基丙氨酸(Thi)、3,3-二苯基丙氨酸(Ebw)、高苯丙氨酸(Hfe)和S-苄基-L-半胱氨酸(Ece)。现有技术已知许多非蛋白原性氨基酸的结构。这些和其他非蛋白原性氨基酸可能以D-或L-异构体的形式存在。经修饰的接头的实例包括但不限于柔性接头4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺(Ttds)、甘氨酸、6-氨基己酸、β-丙氨酸(Bal)、戊炔酸(Pyn)，以及Ttds、甘氨酸、6-氨基己酸和Bal的组合。

TcdB融合蛋白

合适的融合蛋白包括但不限于包含TFPI抑制性多肽的蛋白质，该TFPI抑制性多肽与一种或多种一般不被认为是该蛋白质序列一部分的多肽、多肽片段或氨基酸连接。在一些实施方案中，融合多肽包含两个或更多个多肽的完整氨基酸序列，或者备选地，包含两个或更多个多肽的部分(片段)。除了本文所述的TFPI抑制性多肽的全部或部分之外，融合蛋白任选地包括包含所需生物活性/功能的任何合适多肽的全部或部分。实际上，在一些实施方案中，将TFPI抑制性多肽可操作地连接至例如以下一种或多种：具有长循环半衰期的多肽、标志物蛋白、促进TFPI抑制性多肽纯化的多肽、促进多聚体蛋白形成的多肽序列或者前述任一种的片段。合适的融合配偶体包括但不限于His标签、FLAG标签、strep标签和myc标签。

任选地，将TFPI抑制性多肽与一种或多种增加该多肽半衰期的实体融合。可以通过例如增加TFPI结合性多肽的分子量以避免肾清除和/或引入用于nFc受体介导的再循环途径的配体来增加半衰期。在一个实施方案中，将TFPI结合性多肽与白蛋白多肽或其片段(例如，人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA))融合或化学缀合(如下文进一步所述)。白蛋白片段包含全长白蛋白蛋白质序列的10％、25％、50％或75％。备选地或附加地，TFPI结合性多肽包含在体内施用时结合白蛋白的白蛋白结合结构域或脂肪酸。其他合适的融合配偶体包括但不限于脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体(PAS化)和抗体或其片段(例如，抗体的Fc部分)。

在一些实施方案中，将两个或更多个TFPI抑制性肽融合在一起，通过多聚化结构域连接，或通过化学键连接，以生成TFPI抑制性多肽复合物。其中的TFPI抑制性肽可以相同或不同。因此，本发明提供了同型二聚体(即，包含两个相同TFPI结合性肽的二聚体)、同型多聚体(即，包含三个或更多个相同TFPI结合性肽的复合物)、异型二聚体(即，包含两个不同TFPI结合性肽的二聚体)和异型多聚体(即，包含三个或更多个TFPI结合性肽的复合物，其中至少两个TFPI结合性肽是不同的)，它们包含本文所述的任何一种肽或由其组成，任选地通过一个或多个接头连接。

用于产生多肽的方法

本发明的TFPI结合性多肽(包括TFPI抑制性多肽)可以以多种方式制备。在一些实施方案中，该多肽通过固相合成技术合成，包括在以下文献中描述的那些技术，即Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85,2149(1963)；Davis等人,Biochem.Intl.,10,394-414(1985)；Larsen等人,J.Am.Chem.Soc.,115,6247(1993)；Smith等人,J.Peptide ProteinRes.,44,183(1994)；O'Donnell等人,J.Am.Chem.Soc.,118,6070(1996)；Stewart和Young,Solid Phase Peptide Synthesis,Freeman(1969)；Finn等人,The Proteins,第3版,第2卷,第105-253页(1976)；以及Erickson等人,The Proteins,第3版,第2卷,第257-527页(1976)。备选地，通过将编码TFPI结合性多肽的核酸导入宿主细胞中，经过培养以表达多肽来重组表达TFPI结合性多肽(例如，TFPI抑制性多肽)。可以使用标准蛋白质纯化技术从细胞培养物中纯化此类多肽。

编码多肽的核酸

本发明还涵盖包含编码本发明的TFPI结合性多肽的核酸序列的核酸。制备DNA和/或RNA分子的方法是本领域众所周知的。在一个方面，使用化学合成技术和/或使用聚合酶链式反应(PCR)生成编码本文提供的TFPI结合性多肽的DNA/RNA分子。如有必要，将TFPI结合性多肽编码序列整合到表达载体中。本领域普通技术人员将理解，本领域已知的许多表达载体中的任何一种都适用于本发明的上下文，诸如但不限于质粒、质粒-脂质体复合物和病毒载体。这些表达载体中的任何一种都可以使用例如在以下文献中描述的标准重组DNA技术来制备，即Sambrook等人,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989),和Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates和John Wiley&Sons,New York,N.Y.(1994)。任选地，将核酸可操作地连接至一种或多种调控序列，例如启动子、激活子、增强子、加帽信号、多聚腺苷酸化信号或涉及转录或翻译控制的其他信号。

本发明的任何TFPI结合性多肽或编码该多肽的核酸也可以组合物(例如，药物组合物)的形式提供。在这方面，如本文进一步描述的，将多肽与生理学上可接受的(即，药理学上可接受的)载剂、缓冲剂、赋形剂或稀释剂一起配制。任选地，多肽采用生理学上可接受的盐的形式，这包括在本发明中。“生理学上可接受的盐类”意指药学上可接受的任何盐。合适盐类的一些实例包括乙酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐和草酸盐。如有必要，该组合物包含一种或多种另外的药学上有效的作用剂。

多肽的性质

本文提供的多肽任选地抑制至少一种TFPI-1(例如，TFPI-1α或TFPI-1β)的活性，诸如但不限于下调血液凝固级联反应的活性。不受任何特定作用机制的束缚，一种提出的抑制机制可能涉及阻止四元TF-FVIIa-FXa-TFPI复合物的形成。该多肽可以抑制TFPI与FXa(例如，抑制TFPI Kunitz结构域2与凝血因子Xa的结合或阻断TFPI Kunitz结构域1与凝血因子Xa的外结合位点的结合)、TF/FVIIa复合物(例如，抑制TFPI Kunitz结构域1与TF/FVIIa复合物的结合)、单独的TF和/或单独的FVIIa的结合(竞争性或变构性)。随着TFPI活性的降低，TF和FVIIa可以自由激活FX，FX又促进凝血酶原向凝血酶的转化。令人惊讶的是，在一些实施方案中，结合Kunitz结构域1的本发明的多肽干扰TFPI介导的对FXa的抑制。因此，本发明提供了例如通过向受试者施用本文所述的结合Kunitz结构域1的多肽来抑制TFPI介导的凝血级联反应的外源性和/或共同途径的下调和/或促进FXa介导的凝血酶原向凝血酶的转化的方法。

在一个方面，本发明的多肽在模型和/或血浆系统中表现出TFPI拮抗活性。用于测定TFPI抑制活性的示例性模型系统是外源性因子X酶(tenase)测定法，其测试候选多肽在TFPI(它是FX活化反应的天然抑制剂)存在的情况下恢复外源性复合物介导的FX活化的能力(参见，例如Lindhout等人,Thromb.Haemost.,74,910-915(1995))。用于表征TFPI抑制活性的另一模型系统是FXa抑制测定法，其中在TFPI存在的情况下测量FXa活性(参见，Sprecher等人,PNAS,91,3353-3357(1994))。任选地，本发明的多肽在TFPI存在的情况下增强FX活化，其半数最大有效浓度(EC50)为小于或等于1×10^-4M、小于或等于1×10^-5M、小于或等于1×10^-6M或者小于或等于1×10^-7M。

一方面，在基于血浆的测定法中表征TFPI拮抗活性。在候选多肽存在的情况下，在基本上缺乏FVIII或FIX活性(例如，残余凝血因子活性低于1％)的血浆中触发凝血酶形成。可以使用荧光或显色底物来检测凝血酶形成。Thrombinoscope BV(Maastricht,TheNetherlands)提供了一种用于测量凝血酶活性的系统。使用例如Thrombograph^TM(ThermoScientific,Waltham,Mass.)测量凝血酶原转化，并将所得数据编译成由ThrombinoscopeBV提供的Thrombinoscope^TM软件生成的校正自动凝血酶生成图(Calibrated AutomaticThrombogram)。在某些实施方案中，TFPI抑制性多肽增加了测定期间生成的凝血酶峰值的量和/或减少达到形成凝血酶峰值所需的时间。在另外的实施方案中，该多肽在不存在凝血因子VIII的情况下将凝血酶形成提高至正常血浆(即，在存在生理水平的凝血因子VIII的条件下)中凝血酶形成水平的至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约7％或至少约10％。在各个方面，将该多肽施用于凝血酶缺乏或血友病的动物模型，以在体内表征TFPI抑制活性。这种体内模型是本领域已知的，并且包括例如施用抗FVIII抗体以诱发甲型血友病的小鼠(Tranholm等人,Blood,102,3615-3620(2003))；凝血因子敲除模型，诸如但不限于FVIII敲除小鼠(Bi等人,Nat.Genet.,10(1),119-121(1995))和FIX敲除小鼠(Wang等人,PNAS,94(21),11563-66(1997))；诱发型家兔甲型血友病(Shen等人,Blood,42(4),509-521(1973))；以及Chapel Hill HA狗(Lozier等人,PNAS,99,12991-12996(2002))。

多种多肽结合任何来源的TFPI，包括但不限于来自小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、豚鼠和灵长类动物的TFPI。在一些实施方案中，所述多肽结合人TFPI。任选地，所述多肽结合来自多于一个物种的TFPI(即，该多肽在多个物种之间具有交叉反应性)。在某些方面，该多肽结合TFPI的解离常数(KD)小于或等于1×10^-4M、小于或等于1×10^-5M、小于或等于1×10^-6M或者小于或等于1×10^-7M。亲和力可以使用例如但不限于多种技术中的任何一种、两种或更多种来确定，诸如亲和ELISA测定法、竞争性ELISA测定法和/或表面等离子体共振(BIAcore^TM)测定法。当使用竞争性(IC50)ELISA测定法进行表征时，本发明的多肽任选地显示出IC50小于或等于约50,000nM。举例来说，该多肽显示出IC50小于或等于约10,000nM，诸如IC50小于或等于约5,000nM、小于或等于约1,000nM或者小于或等于约500nM。在一个方面，该多肽显示出IC50小于或等于约250nM、小于或等于约100nM、小于或等于约50nM或者小于或等于约10nM。亲和力也可以通过动力学方法或平衡/溶液方法来确定。此类方法在本文中有进一步详细描述或在本领域中是已知的。

用于表征本发明多肽的另一种合适的测定法是koff测定法，其检查肽从TFPI的释放。Koff测定结果不是解离速率常数，而是测试肽与TFPI孵育一段时间后被阻断与TFPI结合的竞争肽的百分比。示例性koff测定法包括以下步骤：1)将TFPI包被的微孔板与一定量的测试肽一起孵育，可获得约90％的TFPI占据；2)去除未结合的测试肽；3)添加生物素化的示踪(即，竞争)肽，与测试肽竞争与TFPI的结合；4)孵育一段时间，在此期间由测试肽释放的结合位点被示踪肽占据；5)去除未结合的示踪肽和测试肽；并且6)通过使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物的显色反应检测结合的示踪肽。所产生的信号指示由测试肽释放的结合位点。与完全解离的分析物相比，在孵育期间不与TFPI解离的测试肽产生的信号较弱。

正如所有结合剂和结合测定法一样，本领域技术人员认识到，为了在生物学上(例如，治疗上)有效，结合剂不应可检测地与之结合的各种部分将是穷尽性的，并且难以列出。因此，术语“特异性结合”指的是多肽以比其与非TFPI的无关对照蛋白结合更大的亲和力结合TFPI的能力。举例来说，所述多肽与TFPI结合的亲和力可以比对对照蛋白的亲和力高至少5、10、15、25、50、100、250、500、1000或10,000倍。在一些实施方案中，多肽与TFPI结合的亲和力高于其与“反靶标(anti-target)”结合的亲和力，这种“反靶标”是人类中一种蛋白质或其他天然存在的物质，该多肽与“反靶标”的结合可能会导致不良作用。几类多肽或蛋白质是潜在的反靶标。因为TFPI抑制性多肽在血流中和/或在内皮处发挥其活性，因此血浆蛋白代表了潜在的反靶标。含有Kunitz结构域(KD)的蛋白质是潜在的反靶标，因为不同蛋白质的KD具有显著的相似性。组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)与TFPI-1α高度相似，并且与TFPI-1α一样，也含有KD(Sprecher等人,PNAS,91,3353-3357(1994))。因此，在一个方面，本发明的多肽与TFPI结合的亲和力比对反靶标如TFPI-2的亲和力高至少5、10、15、25或50倍。

任选地，TFPI结合性多肽表现出本文所述的一种或多种所需特征，并且如有必要，可以对多肽的氨基酸序列进行修饰，以优化结合、稳定性和/或活性。一种示例性TFPI结合性多肽结合TFPI的KD小于或等于20nM，和/或表现出对TFPI的结合亲和力比对反靶标的结合亲和力高至少100倍。备选地或附加地，TFPI结合性多肽在TFPI存在的情况下增强FX活化，其EC50(如使用任何合适的测定进行测量，诸如本文所述的测定法)小于或等于50nM，和/或在不存在凝血因子VIII的情况下将凝血酶形成提高至含有生理水平的凝血因子VIII的血浆中凝血酶形成水平的至少约20％(例如，40％)。备选地或附加地，TFPI结合性多肽实现了期望的血浆稳定性水平(例如，12小时后，仍有50％或更多的剂量保留在血浆中)，和/或表现出期望的体内半衰期(例如，至少两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时或十小时)。备选地或附加地，TFPI结合性多肽表现出期望水平的生物利用度，诸如皮下施用后期望水平的生物利用度(例如，大于或等于5％、10％、15％、20％、25％、30％或50％)，和/或在给定的体内剂量下表现出期望水平的TFPI抑制活性。

应用

本发明进一步包括一种抑制TFPI的方法。该方法包括使TFPI与如本文所述的TFPI结合性多肽接触。涵盖任何程度的TFPI活性抑制。例如，TFPI抑制性多肽将对外源性途径的TFPI抑制降低至少约5％(例如，至少约10％、至少约25％或至少约30％)。在一些实施方案中，TFPI抑制性多肽与不存在该多肽时的TFPI活性相比，将外源性途径内的TFPI活性降低至少约50％、至少约75％或至少约90％。

在本发明的一个方面，TFPI结合性多肽用于在体内或体外对TFPI进行检测和/或定量。对样品中的TFPI进行检测和/或定量的一个示例性方法包括(a)使样品与本发明的TFPI结合性多肽接触，并(b)检测该TFPI结合性多肽与TFPI的结合。

本发明进一步包括一种用于靶向TFPI所在的生物结构(包括但不限于细胞表面和内皮内衬)的方法。该方法包括使生物结构(例如，包括但不限于在细胞表面上展示TFPI的细胞)与本文所述的TFPI结合性多肽接触，该TFPI结合性多肽任选地与为该多肽增加另外功能性的部分缀合。该部分可以是染料(例如荧光染料)、放射性核素或含有放射性核素的复合物、蛋白质(例如酶、毒素或抗体)或细胞毒剂。举例来说，将该多肽与效应部分连接或缀合，该效应部分有助于多肽检测和/或纯化和/或包含治疗特性。在一个方面，将TFPI结合性多肽或多肽缀合物施用于哺乳动物以靶向哺乳动物内的TFPI展示细胞。任选地，该方法进一步包括检测TFPI结合性多肽与TFPI的结合。该方法可用于疾病的治疗和诊断，在这种情况下，TFPI是合适的诊断标志物或TFPI表达细胞是治疗方法的靶标。

可直接或间接检测多肽-TFPI复合物。检测部分在本领域中广泛用于鉴定生物物质，并且包括例如染料(例如，荧光染料)、放射性核素和含有放射性核素的复合物以及酶。在一些方面，间接检测多肽-TFPI结合。在这方面，使该多肽任选地与相互作用配偶体接触，该相互作用配偶体结合本发明的多肽，而不会显著干扰多肽-TFPI结合，并检测相互作用配偶体。示例性相互作用配偶体包括但不限于抗体、抗原结合抗体片段、抗运载蛋白(anticalin)和抗体模拟物、适配体、链霉亲和素、抗生物素蛋白、中性亲和素以及镜像适配体(spiegelmer)。任选地，相互作用配偶体包含检测部分，以便于检测相互作用配偶体-肽复合物。在一些实施方案中，对TFPI结合性多肽进行修饰以促进相互作用配偶体的结合。例如，将TFPI结合性多肽与生物素缀合，该生物素由包含链霉亲和素的相互作用配偶体结合。示例性相互作用配偶体包含与辣根过氧化物酶融合的链霉亲和素，该辣根过氧化物酶在例如ELISA样测定法中检测。备选地，对TFPI结合性多肽进行修饰以包括抗体表位，并检测相应抗体与多肽-TFPI复合物的结合。检测例如抗体及其片段的方法是本领域众所周知的。

使用许多方法中的任一种来鉴定多肽-TFPI复合物和相互作用配偶体-肽复合物，例如但不限于生化测定法(例如，酶促测定法)、光谱术(例如，基于光密度、荧光、FRET、BRET、TR-FRET、荧光偏振、电化学发光或NMR的检测)、正电子发射断层扫描(PET)以及单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。有助于荧光检测多肽-TFPI复合物或相互作用配偶体-肽复合物的可检测部分包括但不限于荧光素、Alexa350、Marina Blue^TM、CascadeYellow^TM、Alexa405、Pacific Blue^TM、Pacific Orange^TM、Alexa430、Alexa488、Oregon488、Alexa500、Oregon514、Alexa514、Alexa532、Alexa555、四甲基罗丹明、Alexa546、罗丹明B、罗丹明Red^TM-X、Alexa568、Alexa594、TexasTexasAlexa610、Alexa633、Alexa635、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、别藻蓝蛋白、Cy3、Cy5、TAMRA和荧光蛋白(GFP及其衍生物)。包含荧光检测部分的TFPI结合性多肽的一个实例是JBT2454(FAM-Ttds-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)，其标有5,6-羧基荧光素。

放射性标记物也用于检测生物材料(例如，TFPI、TFPI结合性多肽或TFPI结合性多肽-TFPI复合物)，并且在一些情况下，使用螯合剂将这些放射性标记物附接到多肽或相互作用配偶体，该螯合剂诸如(但不限于)EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二乙三胺五乙酸)、CDTA(1,2-环己二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇-O,O′-二(2-氨乙基)-N,N,N′,N′-四乙酸)、HBED(N,N-二(羟基苯基)-乙二胺-N,N′-二乙酸)、TTHA(三乙四胺六乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N′,N″,N′″-四乙酸)、HEDTA(羟基乙基乙二胺三乙酸)或TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N,N″,N″-四乙酸)。放射性标记物的实例包括<99m>Tc、<203>Pb、<66>Ga、<67>Ga、<68>Ga、<72>As、<111>In、<113m>In、<97>Ru、<62>Cu、<64>Cu、<52>Fe、<52m>Mn、<51>Cr、<186>Re、<188>Re、<77>As、<90>Y、<67>Cu、<169>Er、<117m>Sn、<121>Sn、<127>Te、<142>Pr、<143>Pr、<198>Au、<199>Au、<149>Tb、<161>Tb、<109>Pd、<165>Dy、<149>Pm、<151>Pm、<153>Sm、<157>Gd、<166>Ho、<172>Tm、<169>Yb、<175>Yb、<177>Lu、<105>Rh和<111>Ag。顺磁性金属也是可检测的部分，其适于附接至TFPI结合性多肽或相互作用配偶体，任选地通过螯合剂复合物。顺磁性金属的实例包括，例如，Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Sm、Yb、Gd、Tb、Dy、Ho和Er。

在一些方面，对TFPI结合性多肽本身进行修饰以包括一个或多个具有可检测取代基或核素的氨基酸。在这方面，在一个实施方案中，TFPI结合性多肽包含至少一个包含可检测同位素(例如，13C、14C、35S、3H、18O或15N)的氨基酸，和/或由例如<123>I、<124>I、<125>I、<131>I、<75>Br、<76>Br、<77>Br或<82>Br卤化的氨基酸。适于卤化的氨基酸包括但不限于酪氨酸和色氨酸。

本发明还提供了一种用于诊断患有疾病或病症或者处于患有疾病或病症风险中的受试者的方法，其中该疾病或病症与异常TFPI活性相关或由异常TFPI活性造成。该方法包括向受试者施用TFPI结合性多肽并检测TFPI-肽复合物。在一些情况下，将该多肽与可检测部分缀合，并且该方法包括检测该可检测部分。本文描述了示例性的可检测部分。在其他情况下，该方法包括向受试者施用结合TFPI结合性多肽的TFPI结合性多肽相互作用配偶体，并检测该相互作用配偶体。如有必要，相互作用配偶体包含可检测部分或与可检测部分缀合，并检测可检测部分。可检测部分的存在表明TFPI的存在，从而允许诊断与TFPI相关的疾病或病症(例如，(i)可以通过抑制TFPI来治疗的疾病或病症，或者(ii)包含可以通过抑制TFPI来改善或预防的症状的疾病或病症)。如果不需要向受试者施用所述多肽，则从受试者获得生物样品，使其与如本文所述的TFPI结合性多肽接触，并检测TFPI-肽复合物。

本发明的多肽结合TFPI，因此可用于从生物样品(例如，生物体液，如血清)、发酵提取物、组织制备物、培养基等中纯化TFPI或重组TFPI。本发明包括在TFPI的商业化生产中或在表征TFPI分子的方法中使用TFPI结合性多肽的方法。例如，本发明包括一种纯化TFPI的方法。该方法包括使含有TFPI的样品与如本文定义的多肽在适于在TFPI和多肽之间形成复合物的条件下接触；从样品中取出复合物；并且任选地，解离复合物以释放TFPI。在实施例中公开了适于在TFPI和多肽之间形成复合物的示例性条件，并且可以轻易地改变这些条件以解离TFPI-肽复合物。在一些实施方案中，将该多肽固定到支持物例如固相支持物上，以有利于TFPI的回收。举例来说，在一个实施方案中，将该多肽固定到层析固定相(例如，二氧化硅、亲和层析珠或层析树脂)上，将包含TFPI的样品加载到固定相上，从而形成TFPI-肽复合物，从固定相上去除样品的剩余部分，并将TFPI从固定相中洗脱出来。在这方面，本发明的多肽在一个方面适用于亲和层析技术。

还提供了一种在凝血因子缺乏型受试者中促进凝血酶形成的方法。该方法包括在有效抑制TFPI的条件下向受试者施用本文提供的多肽。在这方面，以有效增强受试者中凝血酶形成的量和条件施用TFPI抑制性多肽。“凝血因子缺乏”意指受试者患有凝血酶形成所需的一种或多种血液因子(诸如FVIII、FIX或FXI)的缺陷。实际上，在一个实施方案中，受试者缺乏FVIII。备选地或附加地，受试者缺乏凝血因子IX。通过检查临床样品中凝血因子的量来鉴定凝血因子缺乏。从业人员根据凝血因子缺乏的程度对血友病进行分类。患有轻度血友病的受试者具有大约5％至30％的正常量(1U/ml)的凝血因子VIII或凝血因子IX。中度血友病的特征在于大约1％至5％的正常凝血因子VIII、凝血因子IX或凝血因子XI水平，而患有重度血友病的受试者具有低于1％的正常量的凝血因子VIII、凝血因子IX或凝血因子XI。可以通过活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)检查间接鉴定缺乏。APTT检查测量血凝块形成所需的时间长度，与凝血因子水平正常的患者相比，凝血因子VIII缺乏(甲型血友病)、凝血因子IX缺乏(乙型血友病)和凝血因子XI缺乏(丙型血友病)的患者的时间较长。几乎100％的重度和中度凝血因子VIII缺乏患者可以通过APTT进行诊断。本发明进一步包括在未患有凝血因子缺乏的受试者中增强凝血酶形成。该方法包括在有效增强凝血酶形成的条件下向受试者(例如，具有正常生理水平的凝血因子的受试者)施用本文提供的多肽。

在一个方面，TFPI抑制性多肽用于在受试者中增加血凝块形成。增加血凝块形成的方法包括以有效增加血凝块形成的量和条件向受试者施用本文所述的多肽。应当理解的是，该方法不需要完全恢复凝血级联反应来实现有益(例如，治疗)效果。涵盖降低与凝血因子缺乏相关的症状的发作或严重程度的凝血酶或血凝块形成的任何增强或增加。确定该方法在促进凝血酶形成和血液凝固方面的功效的方法是本领域已知的并且在本文中进行了描述。

本发明进一步包括一种治疗受试者中的血液凝固病症的方法，该方法包括以有效治疗受试者中血液凝固病症的量和条件向受试者施用一种或多种TFPI抑制性多肽，例如本文所述的任何一种或多种多肽。一方面，该多肽是抑制TFPI活性的重组或合成多肽。“凝血病症”包括由血液凝固因子活性缺陷和血小板活性缺陷造成的出血性病症。血液凝固因子包括但不限于凝血因子V(FV)、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXIII、FII(导致低凝血酶原血症)和血管性血友病因子。凝血因子缺陷是由例如凝血因子的体内半衰期缩短、凝血因子的结合特性改变、凝血因子的遗传缺陷和凝血因子的血浆浓度降低造成的。凝血功能障碍可以是先天性的或获得性的。潜在的遗传缺陷包括编码凝血因子的核苷酸序列内的缺失、添加和/或置换，所述缺失、添加和/或置换分别会对凝血因子的活性产生负面影响。凝血功能障碍还源于针对凝血因子的抑制物或自身免疫(例如，抗体)的形成。在一个示例中，凝血病症是甲型血友病。备选地，凝血病症是乙型血友病或丙型血友病。

血小板病症是由血小板功能缺陷或循环中血小板数量异常偏低造成的。血小板计数偏低可能是由于例如生成不足、血小板扣留或血小板破坏失控。出现血小板减少症(血小板缺乏)的原因有多种，包括化学疗法和其他药物疗法、放射疗法、手术、意外失血和其他疾病状况。涉及血小板减少症的示例性疾病状况有：再生障碍性贫血；特发性或免疫性血小板减少症(ITP)，包括与乳腺癌相关的特发性血小板减少性紫癜；HIV相关ITP和HIV相关血栓性血小板减少性紫癜；导致血小板减少的转移性肿瘤；系统性红斑狼疮，包括新生儿狼疮综合征、脾肿大；范科尼氏综合征(Fanconi's syndrome)；维生素B12缺乏；叶酸缺乏；May-Hegglin异常；Wiskott-Aldrich综合征；慢性肝病；与血小板减少有关的骨髓增生异常综合症；阵发性睡眠性血红蛋白尿；C7E3Fab(阿昔单抗(Abciximab))治疗后出现的急性重度血小板减少症；同种免疫性血小板减少症，包括母体同种免疫性血小板减少症；与抗磷脂抗体和血栓形成相关的血小板减少症；自身免疫性血小板减少症；药物诱导的免疫性血小板减少症，包括卡铂诱导的血小板减少症和肝素诱导的血小板减少症；胎儿血小板减少症；妊娠期血小板减少症；休斯综合征(Hughes'syndrome)；狼疮性血小板减少症；意外和/或大量失血；骨髓增生性病症；恶性肿瘤患者的血小板减少症；血栓性血小板减少紫癜症，包括在癌症患者中表现为血栓性血小板减少性紫癜/溶血性尿毒综合征的血栓性微血管病变；输血后紫癜(PTP)；自身免疫性溶血性贫血；隐匿性空肠憩室穿孔；单纯红细胞再生障碍；自身免疫性血小板减少症；流行性肾病；利福平相关性急性肾衰竭；Paris-Trousseau血小板减少症；新生儿同种免疫性血小板减少症；阵发性睡眠性血红蛋白尿；胃癌的血液学变化；溶血性尿毒综合征(例如，儿童期尿毒病况)；以及与病毒感染相关的血液学表现，包括甲型肝炎病毒和CMV相关性血小板减少症。血小板病症还包括但不限于血管性血友病(VonWillebrand Disease)、副肿瘤性血小板功能异常、血小板无力症(Glanzman'sthrombasthenia)和巨大血小板病(Bernard-Soulier disease)。适合用TFPI抑制性多肽治疗的其他出血性病症包括但不限于，由创伤引起的出血性病况；缺乏一种或多种接触因子，诸如FXI、FXII、前激肽释放酶和高分子量激肽原(HMWK)；维生素K缺乏；纤维蛋白原功能障碍，包括无纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症；以及α2-抗纤溶酶缺乏。在一个实施方案中，TFPI抑制性多肽用于治疗过量出血，诸如由手术、创伤、脑内出血、肝病、肾病、血小板减少症、血小板功能障碍、血肿、内出血、关节积血、体温过低、月经、妊娠和登革出血热造成的过量出血。在本公开的上下文中，上述所有情况都被认为是“血液凝固病症”。

在一个方面，本发明的TFPI抑制性多肽用于逆转(完全或部分地)一种或多种抗凝剂在受试者中的作用。许多抗凝剂是本领域已知的并且包括，例如，肝素；香豆素衍生物，例如华法林或双香豆素；TFPI；AT III；狼疮抗凝剂；线虫抗凝多肽(NAPc2)；FVIIa抑制剂；活性位点阻断的FVIIa(FVIIai)；活性位点阻断的FIXa(FIXai)；FIXa抑制剂；FXa抑制剂，包括磺达肝素(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux)、DX-9065a和雷扎沙班(DPC906)；活性位点阻断的FXa(FXai)；FVa或FVIIIa的抑制剂，包括活化蛋白C(APC)和可溶性血栓调节蛋白；凝血酶抑制剂，包括水蛭素、比伐卢定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和希美加群(ximelagatran)；以及结合凝血因子(例如，FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXIII、FII、FXI、FXII、血管性血友病因子、前激肽释放酶或高分子量激肽原(HMWK))的抗体或抗体片段。

鉴于以上所述，本发明提供了多肽用于治疗受试者的方法中，该方法诸如用于治疗其中抑制TFPI是有益的疾病的方法。在一个方面，疾病或病症是血液凝固病症。受试者患有疾病或病症或者处于患有疾病或病症的风险中(或不良生物事件，如失血过多)。该方法包括以完全或部分有效治疗或预防疾病或病症的量和条件向受试者施用本发明的多肽。本发明进一步提供了多肽用于制备药物。举例来说，该多肽可用于制备用于治疗血液凝固病症的药物，如本文详细描述的。

在一些实施方案中，向受试者施用包含编码本发明的TFPI结合性多肽(例如，TFPI抑制性多肽)的核酸序列的核酸是有利的。在一个方面，提供了这样的核酸来代替TFPI抑制性多肽或作为其补充。表达载体、核酸调控序列、施用方法等在本文和美国专利公布号20030045498中均有进一步描述。

针对特定受试者的特定施用方案将部分取决于所使用的本发明的TFPI抑制性多肽、所施用的TFPI结合性多肽(例如，TFPI抑制性多肽)的量、施用途径、所治疗的特定疾病、与接受者相关的考虑因素以及任何副作用的原因和程度。施用于受试者(例如，哺乳动物，如人类)的多肽的量和施用条件(例如，施用时机、施用途径、给药方案)足以在合理的时间范围内影响预期的生物学反应。剂量通常取决于多种因素，包括所用的特定TFPI抑制性多肽、受试者的年龄和体重以及受试者中任何疾病或病症的存在和严重程度。剂量的大小也将由施用途径、时机和频次决定。相应地，临床医师可以调整剂量并改变施用途径以获得最佳治疗效果，并且常规的剂量范围探索技术是本领域普通技术人员已知的。仅作为举例说明，在一个方面，该方法包括取决于上述因素施用例如约0.1μg/kg至约100mg/kg或更高的多肽。在其他实施方案中，剂量范围可以是1μg/kg至约75mg/kg；或5μg/kg至约50mg/kg；或10μg/kg至约20mg/kg。在某些实施方案中，剂量包括约0.5mg/kg至约20mg/kg(例如，约1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.3mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)的多肽。考虑到许多血液凝固病症的慢性本质，可以设想受试者将在持续数周、数月或数年的疗程中接受TFPI抑制性多肽，并且可能需要每天或每周一次或多次给药。在其他实施方案中，施用TFPI抑制性多肽以治疗急性病况(例如，由手术或创伤或者凝血因子抑制剂造成的出血/接受凝血替代疗法的受试者中的自身免疫事件)，治疗期相对较短，例如1至14天。

施用生理学上可接受的组合物诸如包含本文所述的多肽的药物组合物的合适方法是本领域众所周知的。尽管可以使用多于一种途径来施用多肽，但是一种特定途径可以比另一种途径提供更即时和更有效的反应。根据具体情况，将药物组合物涂抹或滴注到体腔中、通过皮肤或粘膜吸收、摄入、吸入和/或导入血液循环中。在一个方面，静脉内、动脉内或腹膜内施用包含TFPI抑制性多肽的组合物，以将本发明的多肽导入循环中。非静脉内施用也是合适的，特别是对于低分子量治疗剂。在某些情况下，需要通过以下方式递送包含TFPI抑制性多肽的药物组合物：口服、局部、舌下、经阴道、直肠内、肺内；脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、门静脉内、病灶内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、鼻内、经尿道或肠内途径注射；缓释系统；或植入装置。如有必要，通过动脉内或静脉内施用来区域性施用TFPI抑制性多肽，从而供给感兴趣的区域，例如通过股动脉递送至腿部。在一个实施方案中，将多肽整合到微粒中，如例如下列文献中所述，即美国专利号5,439,686和5,498,421，以及美国专利公布2003/0059474、2003/0064033、2004/0043077、2005/0048127、2005/0170005、2005/0142205、2005/142201、2005/0233945、2005/0147689、2005/0142206、2006/0024379、2006/0260777、2007/0207210、2007/0092452、2007/0281031和2008/0026068。备选地，通过植入膜、海绵或另一种合适的材料来施用组合物，其中已将所需分子吸附或封装到这些材料上。在使用植入装置的情况下，在一个方面，将该装置植入任何合适的组织中，并且在各个方面，通过扩散、定时释放的推注或持续施用来递送所需分子。在其他方面，在外科手术或损伤治疗过程中，将TFPI抑制性多肽直接施用于暴露的组织，或者通过输血程序施用。治疗性递送方法对于本领域技术人员来说是众所周知的，其中一些方法例如在美国专利号5,399,363中有进一步描述。

为了便于施用，在一个实施方案中，将TFPI结合性多肽(例如，TFPI抑制性多肽)配制成包含载剂(即，媒介物、辅助剂、缓冲剂或稀释剂)的生理学上可接受的组合物。所用的特定载剂仅受化学-物理考虑因素诸如溶解度和与多肽缺乏反应性以及施用途径的限制。生理学上可接受的载剂是本领域熟知的。适于注射使用的说明性药物剂型包括但不限于无菌水性溶液剂或分散剂以及用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉剂(例如，参见美国专利号5,466,468)。可注射配制品在例如以下文献中进一步描述，即Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J.B.Lippincott Co.,Philadelphia.Pa.,Banker和Chalmers编著,第238-250页(1982),和ASHP Handbook on Injectable Drugs,Toissel,第4版,第622-630页(1986))。任选地，将包含本文提供的多肽的药物组合物与包装材料一起放置在容器内，该包装材料提供关于此类药物组合物使用的说明书。一般而言，此类说明书包括描述试剂浓度的有形表述，以及在某些实施方案中，描述重构该药物组合物可能必需的赋形剂成分或稀释剂的相对量。

在适当的情况下，将本发明的TFPI结合性多肽(例如，TFPI抑制性多肽)与其他物质和/或其他治疗方式组合施用，以实现额外的或更强的生物学效应。联合治疗包括但不限于血浆来源的或重组的凝血因子、血友病预防治疗、免疫抑制剂、血浆因子抑制性抗体拮抗剂(即，反抑制剂)、抗纤维蛋白溶解药、抗生素、激素疗法、抗炎剂(例如，非甾体类抗炎药(NSAID)或甾体类抗炎物质)、促凝剂和止痛药。在一个方面，该方法是传统因子替代治疗方案的辅助疗法，这些治疗方案涉及向受试者施用例如FXIII、FXII、FXI(例如，(Laboratoire francais du Fractionnement et desBiotechnologies,Les Ulis,France)和FXI浓缩物(BioProducts Laboratory,Elstree,Hertfordshire,UK))、FX、FIX(例如，凝血因子IX(Wyeth,Madison,N.J.)；SD(Grifols,Los Angeles,Calif.)；(CSL Behring,King of Prussia,Pa.)；BEBULIN-VH^TM(Baxter,Deerfield,Ill.)；SD(Grifols,Los Angeles,Calif.)；或PROPLEX T^TM(Baxter,Deerfield,Ill.))、FVIII(例如，ADVATE^TM(Baxter,Deerfield,Ill.)；FS(CSL Behring,King of Prussia,Pa.)；(Wyeth,Madison,N.J.)、XYNTHA^TM(Wyeth,Madison,N.J.)、和FS(Bayer,Pittsburgh,Pa.)；(Grifols,Los Angeles,Calif.)；HEMOPHIL M^TM(Baxter,Deerfield,Ill.)；(Talecris Biotherapeutics-USA,Research Triangle Park,N.C.)；或MONARC-M^TM(Baxter,Deerfield,Ill.))、FVIIa(例如，FVIIa(NovoNordisk,Princeton,N.J.)和FVII浓缩物(Baxter Bioscience,Vienna,Austria或BioProducts Laboratory,Elstree,Hertfordshire,UK))、FV、FVa、FII和/或FIII。在一些情况下，受试者还接受FEIBA VH Immuno^TM(Baxter BioScience,Vienna,Austria)，这是一种冻干的无菌人血浆组分，具有凝血因子VIII抑制物旁路活性。FEIBA VH Immuno^TM包含大约相等单位的凝血因子VIII抑制物旁路活性和凝血酶原复合因子(凝血因子II、VII、IX和X以及蛋白C)。其他示例性共治疗包括但不限于前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、血管性血友病因子、组织因子和凝血酶。备选地或附加地，将该TFPI抑制性多肽与一种或多种不同的TFPI抑制性多肽共同配制。在一个方面，TFPI结合性多肽的施用允许减少实现期望的生物学应答所需的共治疗剂的剂量。

因此，本发明包括将本发明的TFPI结合性多肽(例如，一种或多种TFPI抑制性多肽)与一种或多种另外合适的物质组合施用于受试者，每种物质均根据适合于该药物的方案施用。施用策略包括并行施用(即，基本上同时施用)和非并行施用(即，在不同时间以任何顺序施用，无论是否重叠)TFPI抑制性多肽和一种或多种另外的合适的药剂。应当理解的是，不同的组分任选地在相同或不同的组合物中施用，并且通过相同或不同的施用途径施用。

在一些实施方案中，将本发明的多肽缀合至一个部分，例如治疗或诊断部分，如上述的检测部分和共治疗物。备选地或附加地，将该多肽与相互作用配偶体(例如，抗体、抗体片段、抗运载蛋白、适配体或镜像适配体)组合施用，该相互作用配偶体(a)结合该多肽并且(b)具有治疗活性和/或与为该相互作用配偶体提供额外功能性的部分(例如，治疗剂、诊断剂或检测剂)连接。合适的部分包括但不限于光敏剂、染料、放射性核素、含放射性核素的复合物、酶、毒素、抗体、抗体片段和细胞毒性剂，并且在一些情况下，该部分具有治疗活性(即，实现有利的或期望的生物学效应)。多肽缀合物或多肽-相互作用配偶体对适用于本文所述的任何方法，诸如治疗患有疾病或病症或者处于患有疾病或病症风险中的受试者的方法。

可使用许多方法中的任一种，包括本文所述的检测方法，来检测测试化合物与本文定义的TFPI结合位点的结合。一种用于检测结合的示例性方法采用核磁共振(NMR)来识别TFPI结合位点内氨基酸残基处的化学位移。TFPI氨基酸位置28-30、32、46、47和55以及任选位置27、31、36-38和44处的化学位移表示测试化合物与TFPI上这些氨基酸接触点发生相互作用。为了确定由测试化合物结合引起的特定氨基酸处的化学位移是否存在，将从KD1-测试化合物复合物获得的NMR数据与从游离KD1多肽获得的NMR数据进行比较。在实施例中进一步描述了使用NMR来检测测试化合物和TFPI KD1之间的结合。

备选地，通过检测TFPI KD1与其天然结合配偶体例如FVIIa或FXa相互作用的能力的改变来间接确定测试化合物与本文定义的TFPI结合位点的结合。在这方面，该方法包括在允许KD1与FVIIa结合的条件下，在测试化合物存在的情况下使包含TFPI KD1的多肽与FVIIa接触，并将KD1-FVIIa结合与在测试化合物不存在的情况下的KD1-FVIIa结合进行比较。备选地或附加地，该方法包括在允许KD1与FXa结合的条件下，在测试化合物存在的情况下使包含TFPI KD1的多肽与FXa接触，并将在测试化合物存在的情况下的KD1-FXa结合与在测试化合物不存在的情况下的KD1-FXa结合进行比较。任选地，包含KD1的多肽还包含KD2，该方法包括在允许KD2与FXa结合的条件下，在测试化合物存在的情况下使该多肽与FXa接触，并将KD2-FXa结合与在测试化合物不存在的情况下的KD2-FXa结合进行比较。在测试化合物存在的情况下，KD1-FVIIa结合、KD1-FXa结合或KD2-FXa结合的降低(与在测试化合物不存在的情况下的KD1-FVIIa结合、KD1-FXa结合或KD2-FXa结合相比)表明该测试化合物是TFPI结合性化合物。该方法任选地包括在测试化合物不存在的情况下使KD1和/或KD2与FVIIa和/或FXa接触，以此作为参照来比较在测试化合物存在的情况下的结合。

使用用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的任何合适的方法，诸如本文所述的使用可检测标记物的方法，来对KD与FVIIa或FXa的结合进行测定和/或定量。备选地，使用酶促测定法来检测测试化合物与TFPI结合位点的结合。FVIIa或FXa酶促活性是用于评估蛋白质与TFPI KD1或KD2结合的合适替代物；结合本文定义的TFPI结合位点的测试化合物抑制TFPI活性，结果是FVIIa和FXa活性增加。本文详细描述了用于评估FVIIa或FXa活性的酶促测定法。

本发明还包括在本发明的方法中鉴定为TFPI结合性化合物的化合物，以及包含一种或多种所鉴定化合物的组合物。用于分离或纯化化合物，诸如如本文所述鉴定的TFPI结合性化合物(例如，TFPI结合性多肽)的方法是本领域已知的，并在上文有所描述。在一些方面，如本文所述鉴定的TFPI结合性化合物是下调或消除一种或多种TFPI活性的TFPI抑制剂。在一个实施方案中，本发明包括一种用于纯化抑制FXa活性的化合物的方法。该方法包括在允许形成化合物-KD1复合物的条件下使包含TFPI KD1的多肽与化合物接触，去除未结合的化合物，并解离化合物-KD1复合物以释放结合TFPI的化合物。提供了如本文所述鉴定和/或纯化的TFPI抑制剂在制备药物，诸如用于治疗血液凝固病症的药物中的用途，以及一种用于治疗患有疾病或处于患有疾病风险中的受试者的方法，其包括向受试者施用TFPI抑制剂。

另外，提供了一种抑制人TFPI的方法，其中该方法包括使人TFPI与抑制剂接触，该抑制剂在由氨基酸残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47和Ile55限定的结合位点处结合人TFPI。本发明的另一方面包括一种用于治疗患有疾病或处于患有疾病的风险中的受试者的方法。该方法包括向受试者施用在由氨基酸残基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47和Ile55限定的结合位点处结合人TFPI的抑制剂。在一个方面，人TFPI结合位点由氨基酸残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47和Ile55限定，诸如由氨基酸残基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47和Ile55限定的结合位点。与本文定义的TFPI结合位点接触并抑制(下调或消除)一种或多种TFPI活性的任何抑制剂均适用于该方法的上下文。TFPI抑制剂任选地是TFPI结合性多肽，例如具有本文所述特征的TFPI结合性多肽。

序列总结

SEQ ID NO:1(来自艰难梭菌(Clostridioides difficile)菌株8864的全长TcdB4蛋白)：

(带下划线的部分为SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:1的位置841-1834；粗体部分为SEQID NO:4，SEQ ID NO:1的位置1285-1834；SEQ ID NO:13是SEQ ID NO:1的位置842-1834)

SEQ ID NO:2(来自艰难梭菌菌株R20291的全长TcdB2蛋白)：

(带下划线的部分为SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:2的位置841-1834；粗体部分为SEQID NO:6，SEQ ID NO:2的位置1285-1834；SEQ ID NO:14是SEQ ID NO:2的位置842-1834)

SEQ ID NO:7(TcdB4的受体结合界面，SEQ ID NO:1的残基1431-1606)：

SGELKTLMANSNSVQQKIDYIGLNSELQKNIPYSFMDDEGKENGFINCFTKEGLFVSELSDVVLIIKVYMDNSKPPFGYYSNDLKDVKVITKDDVIIITGYYLKDDIKISLSFTIQDKNTIKLNGVYLDENGVAEILKFMNKKGSTNTSDSLMSFLESMNIKSIFIKSLKSNAKLI

SEQ ID NO:10(小鼠TFPIβ)：

MTYKMKKEYAFWATVCLLLSLVPEFLNALSEEADDTDSELGSMKPLHTFCAMKADDGPCKAMIRSYFFNMYTHQCEEFIYGGCEGNENRFDTLEECKKTCIPGYEKTAVKAASGAERPDFCFLEEDPGLCRGYMKRYLYNNQTKQCERFVYGGCLGNRNNFETLDECKKICENPVHSPSPVNEVQMSDYVTDGNTVTDRSTVNNIVVPQSPKVPRRRVTKEETNGGWKNADYTYQGFLSSVYIHVLYFVFRIG

SEQ ID NO:11(人TFPIα)：

DSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDNANRIIKTTLQQEKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNICEDGPNGFQVDNYGTQLNAVNNSLTPQSTKVPSLFEFHGPSWCLTPADRGLCRANENRFYYNSVIGKCRPFKYSGCGGNENNFTSKQECLRACKKGFIQRISKGGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM

SEQ ID NO:12(人TFPIβ)：

DSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDNANRIIKTTLQQEKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNICEDGPNGFQVDNYGTQLNAVNNSLTPQSTKVPSLFVTKEGTNDGWKNAAHIYQVFLNAFCIHASMFFLGLDSISCLC

SEQ ID NO:15(人TFPI的K2结构域)

CFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNIC

实施例

通过参考以下实施例将更容易理解如此概括描述的本发明，这些实施例以说明性示例的方式提供，而并非意在限制本发明。

方法和材料

细胞系

将所有细胞系均在37℃、95％空气和5％ CO₂的加湿环境中，于DMEM培养基加10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素中培养。HeLa和293T细胞的支原体污染测试呈阴性，并通过STR图谱进行鉴定(上海翼和生物技术有限公司，中国上海)。

小鼠

本文报告的所有动物操作均得到西湖大学实验动物使用与管理委员会的批准(IACUC方案编号为19-010-TL)。C57BL/6J小鼠(雄性和雌性，6-8周)购自上海吉辉实验动物饲养有限公司(中国上海)。TfpiβKO小鼠在西湖大学实验动物资源中心培育而成。在食物和水不受限制的条件下饲养小鼠，并在全职工作人员的看护下进行监测。

cDNA构建体

将编码TcdB4^1-841、TcdB4^842-1834、TcdB4^1801-2367、TcdB4^1285-1834和TcdB2^1285-1834的DNA片段进行PCR扩增，并克隆到pET28a载体中，其中在它们的C-末端引入HA-His标签。编码人TFPIα、TFPIβ、TFPI^K1-GPI、TFPI^K2-GPI、TFPI2^K1-GPI、TFPI2^K2-GPI、AMBP^K3-GPI和小鼠Tfpiβ的基因经过密码子优化，由Genscript(中国南京)合成，并将其克隆到PLVX-IRES-Cherry载体中。将编码TFPI^K1+K2、TFPI^K1、TFPI^K2、Tfpi^K1、Tfpi^K2、CSPG4^R1和TFPI^K2-CSPG4^R1的DNA片段进行PCR扩增，并克隆到pCAG或PHLsec载体中，其中FLAG、Fc-FLAG、Fc-His或GFP-His标签融合到它们的C-末端。

重组蛋白

如先前所述，在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SL401中表达重组全长TcdB蛋白(Shen等人,2020)。在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中表达TcdB4^1-841、TcdB4^842-1834、TcdB4^1801-2367、TcdB4^1285-1834和TcdB2^1285-1834，并纯化为带有His标签的蛋白质。在293F细胞中表达重组TFPIα-GFP、TFPI^K1+K2-GFP、TFPI^K1+K2TFPI^K1+K2-Fc、TFPI^K1-Fc、TFPI^K2-Fc、Tfpi^K1-Fc、Tfpi^K2-Fc、CSPG4^R1和TFPI^K2-CSPG4^R1，并纯化为带有His或FLAG标签的蛋白质。

全基因组CRISPR筛选

如先前所述生成HeLa CRISPR/Cas9全基因组KO文库(Tao等人,2019；Tao等人,2016)。GeCKO v2文库由两个子文库(A和B)组成，并且含有靶向每种基因的六个gRNA。293T细胞用于包装慢病毒。转染后48小时，收集293T培养物的上清液。然后用慢病毒文库以0.3的感染复数(MOI)转导HeLa-Cas9细胞，并用2.5ug/mL嘌呤霉素选择4天。对于每个CRISPR子文库，将至少6.7×10⁷个细胞铺到15-cm细胞培养皿上，以确保足够的gRNA覆盖度。然后向细胞文库中添加指定浓度的TcdB4并培养18小时。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤板以除去松散贴壁的细胞。将剩余的细胞用无毒素培养基培养，使其生长至约70％汇合度，并进行下一轮筛选。用递增浓度的TcdB4(分别为0.045、0.15和0.45pM)进行三轮筛选。收集来自最后一轮筛选的细胞，并使用血液和细胞培养DNA小提试剂盒(Qiagen)抽提它们的基因组DNA。使用引物 lentiGP1_F (SEQ ID NO: 8AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) 和lentiGP-3_R (SEQ ID NO: 9ATGAATACTGCCATTTGTCTCAAGATCTAGTTACGC)通过PCR扩增含有gRNA序列的DNA片段。下一代测序(NGS)由商业化供应商(Novogene)进行。

下拉测定法

使用蛋白A琼脂糖微珠(Thermo Fisher Scientific)进行下拉测定法。简言之，将带Fc标签的TFPI结构域与指定浓度的全长TcdB4或TcdB4片段在1mL PBS中混合。将混合物在4℃下孵育30分钟，并通过蛋白A琼脂糖微珠共沉淀。将微珠洗涤，沉淀，在SDS样品缓冲液中煮沸，并进行SDS-PAGE或免疫印迹分析。

生物膜干涉技术测定法

使用Octet RED96系统(ForteBio)通过BLI测定法测量重组TcdB4与人/小鼠TFPI结构域之间的结合亲和力。将所有蛋白质均在PBS中稀释。简言之，将带Fc标签的人/小鼠TFPI结构域(10μg/mL)固定到浸试即读的抗人IgG-Fc生物传感器(ForteBio)上，并用PBS平衡。然后将生物传感器暴露于全长TcdB4、TcdB4^1285-1834或TcdB2^1285-1834，随后用PBS洗涤(解离)。使用数据分析软件(ForteBio)计算出结合亲和力(K_d)。

为了分析FXa和TcdB4与TFPI的顺序结合，将TFPI^K2-Fc(10μg/mL)固定到浸试即读的抗人IgG-Fc生物传感器上，并用HNBSACa缓冲液(50mM HEPES、100mM NaCl、5mM CaCl₂、0.1％ BSA，pH 7.3)平衡。首先将加载的生物传感器暴露于100nM FXa，再次用HNBSACa平衡，然后暴露于300nM TcdB4^1285-1834。备选地，首先将加载的生物传感器暴露于300nMTcdB4^1285-1834，经HNBSACa平衡，然后暴露于100nM FXa。然后用HNBSACa洗涤所有生物传感器。

实施例1：全基因组CRISPR-Cas9筛选将TFPI鉴定为针对TcdB4的因子

为了鉴定TcdB4的受体，在HeLa细胞中进行全基因组CRISPR-Cas9筛选。简言之，使用慢病毒，用靶向19,052个人类基因的全基因组gRNA文库(GeCKO v2)转导细胞(Sanjana等人,2014)，并用递增浓度的TcdB4进行三轮选择(图1A)。通过下一代测序(NGS)对来自存活细胞群的gRNA序列进行解码。基于gRNA读段的富集倍数、每个基因的NGS读段和独特gRNA的数量来评估所鉴定的基因。

关注的是由多个独特gRNA所靶向的最富集基因。除了UGP2和CSPG4这两个预期的最佳命中之外，TFPI出乎意料地从筛选中脱颖而出，其由五个不同的gRNA所靶向(图1B)。已知TFPI调节血液凝固的组织因子依赖性途径，并且主要存在于细胞膜上和细胞外间隙中(Broze和Girard,2012；Wood等人,2014)。

实施例2：TcdB4与两种TFPI亚型结合

在人类中，TFPI有两种主要的亚型，TFPIα和TFPIβ。TFPIα含有三个串联的Kunitz型蛋白酶抑制(K1、K2和K3)结构域，后跟碱性羧基末端(C-末端)区域。TFPIβ缺乏TFPIα的K3和碱性C-末端结构域，而是含有一个C-末端信号肽，它指导GPI锚的切割和附着(图2A)。

TFPIβ是一种GPI锚定的蛋白质，这与靶向多个GPI锚生物合成基因的筛选结果一致。因为TcdB4也结合CSPG4(但效率低下)用于进入细胞并且CSPG4在HeLa细胞中高表达(Gupta等人,2017；Tao等人,2016)，所以在研究TFPI在HeLa细胞中的作用时，利用HeLaCSPG4^–/–细胞来最大限度地减少CSPG4的影响。

结果表明，HeLa CSPG4^–/–/TFPI^–/–细胞比CSPG4^–/–细胞对TcdB4更具抗性，而瞬时转染TFPIβ可恢复CSPG4^–/–/TFPI^–/–细胞的易感性(图2B和2C)。另外，瞬时转染TFPIα也恢复了CSPG4^–/–/TFPI^–/–细胞对TcdB4的易感性(图2B和2C)，表明TFPIα也可以介导TcdB4的进入。

与此一致地，免疫印迹分析表明，过表达TFPIα或TFPIβ都介导TcdB4在细胞表面上的稳健结合(图2D)。总之，这些数据表明以α和β同等型两种形式存在的膜附着的TFPI充当了TcdB4的细胞受体。

实施例3：TcdB4与TFPI的Kunitz-2结构域相互作用

由于TFPIα和TFPIβ都可以介导TcdB4的结合/进入，因此推测TcdB4与TFPI的Kunitz-1和Kunitz-2结构域(TFPI^K1+K2)相互作用。由此，表达并纯化了与人Fc片段融合的重组TFPI^K1+K2(图3A)，并在HeLa CSPG4^–/–细胞上进行了竞争性测定。TFPI^K1+K2有效地保护细胞免受TcdB4的侵害，但未能减轻TcdB1的毒性作用(图3B和4A)，这支持了TcdB4特异性结合TFPI^K1+K2的观点。同样，TcdB4而非TcdB1与重组TFPI^K1+K2-Fc结合，并通过蛋白A微珠共沉淀(图4B)。

Kunitz结构域是小型、富含二硫化物的且具有α/β折叠结构的结构域，具有蛋白酶抑制剂的功能(Ascenzi等人,2003)。Kunitz结构域存在于许多蛋白质中，包括TFPI、TFPI2、α-1-微球蛋白/Bikunin前体(AMBP)和淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein(APP))。系统发生分析表明，TFPI^K2的一级序列与TFPI^K1的亲缘关系最近，序列相似性为67.9％，其次是TFPI2^K1(64.1％的相似性)，而TFPI^K3与TFPI^K1(56.6％的相似性)或TFPI^K2(58.5％的相似性)的相似性较低(图3C)。

为了确定TcdB4是否与TFPI^K1或TFPI^K2结合以及结合选择性，我们在HeLaCSPG4^–/–/TFPI^–/–细胞中表达了GPI锚定的TFPI^K1、TFPI^K2、TFPI2^K1或AMBP^K3，然后测试了它们对TcdB4的灵敏度。结果显示，仅瞬时转染GPI锚定的TFPI^K2即可恢复CSPG4^–/–/TFPI^–/–细胞的易感性(图3D)，表明TcdB4特异性识别TFPI的Kunitz-2结构域。一致的是，在竞争性实验中，TFPI^K2-Fc而非TFPI^K1-Fc保护HeLa CSPG4^–/–细胞(图4C)。

使用生物膜干涉技术(BLI)测定法进一步量化TFPI^K1+K2-Fc和TcdB4之间的结合动力学，其显示出高亲和力，解离常数(K_d)为约13nM(图5A)。BLI测定法还显示，TcdB4与TFPI^K2-Fc结合的K_d为约6nM，但不与TFPI^K1-Fc或人Fc片段结合(图3E和5B)。类似地，TcdB4与带Fc标签的小鼠TFPI^K2结合，K_d为约4nM(图5C)。

还进行了BLI分析以检测TcdB2-TFPI相互作用(来自ST01/RT027菌株R20291的参照序列)，并观察到TcdB2和TcdB2^1285-1834与带Fc标签的小鼠Tfpi^K2和人TFPI^K2结合，K_d分别为约0.2和0.4μM(图12B-12D)。

此外，先前的研究表明，TFPI的K2结构域与胰蛋白酶样底物如凝血因子Xa(FXa)结合(Brandstetter等人,1996；Burgering等人,1997)。在结构上，TFPI的K2结构域通过相同的环与FXa和TcdB4发生相互作用(图10B)。使用BLI测定法，我们进一步证明TcdB4^1285-1834与TFPI的预结合阻断了FXa的结合，反之亦然(图6F和10C)，表明TcdB4或其片段如TcdB4^{1285 -1834}可能作为治疗血液凝固相关病症的潜在靶标。

实施例4：TcdB4-TFPI复合物的冷冻电镜结构

TcdB(约270kDa)是最大的细菌毒素之一，由四个功能性结构域组成，包括葡糖基转移酶结构域(GTD)、半胱氨酸蛋白酶结构域(CPD)、跨膜递送和受体结合结构域(DRBD)和C-末端组合重复寡肽(CROP)结构域(图6A)。为了进一步表征TcdB4和TFPI之间的具体相互作用，将全长TcdB4(如SEQ ID NO:1所示)与TFPI^K1+K2混合，然后通过尺寸排阻FPLC分离出复合物。通过SDS-PAGE确认复合物级分并浓缩用于冷冻电镜样品制备(图7)。TcdB4-TFPI复合物的二维类别平均数据显示出清晰的结构特征(图8)。在中性pH条件下，分辨率为的全长TcdB4核心区域的最终图和分辨率为的TcdB4-TFPI复合物的最终图揭示了大多数侧链密度和二级结构元件(图6B和9)。

TcdB4的总体架构类似于先前确定的TcdB结构(Chen等人,2019；Simeon等人,2019)。CPD和GTD形成一个整合区域，而CROP结构域模块围绕核心区域弯曲形成一个大钩(图6B)。TFPI的Kunitz-2结构域在很大程度上通过TFPI中的两个柔性环即环-1(残基131-138)和环-2(残基155-162)与DRBD的凸边(残基841-1834)结合(图6B和6C)。每个环通过由氢键和疏水相互作用组成的密集网络与TcdB4衔接(图6D)。通过下拉测定法进一步验证了TcdB4^DRBD和TFPI^K2之间的相互作用(图10A)。

此外，TcdB4中L1599、K1435、L1434、V1492、L1494、M1438和D1468处的点突变消除了TFPI结合能力，表明这些位置对于TFPI受体识别很重要(图6E)。

实施例5：测定TcdB变体的受体结合特异性

TcdB4-TFPI的解析结构以及先前报道的TcdB1-FZD2结构(Chen等人,2018)一起，揭示了TcdB中用于受体识别的进化功能区。为了预测不同TcdB序列的受体特异性，我们对TcdB的受体结合界面(RBI)进行了系统发育分析(残基1431-1606，图11A)。

系统发生树聚类成两个主要分支(表示为I类和II类)。I类RBI源自TcdB1、TcdB3和TcdB5，它们倾向于结合FZD。II类RBI由来自TcdB2、TcdB4、TcdB6和TcdB7的序列组成(图11A)，主要存在于艰难梭菌进化枝2中(图11B)。来自TcdB2和TcdB4的少量RBI要么存在于I类中，要么以异常值的形式存在，这可能是由于TcdB变体之间在历史上频繁发生的重组事件(Knight等人,2021；Mansfield等人,2020；Shen等人,2020)。

尽管FZD2和TFPI在结构上截然不同，但它们都与位于TcdB^RBI凸边的相同疏水界面衔接(图11C)。一些残基，包括但不限于L1434、M1438、L1494和Y1510(TcdB4中的位置；TcdB1中的残基在比对中向左移位一个位置)，由I类和II类RBI共有，并有助于FZD和TFPI相互作用。在TcdB1-FZD2复合物中，相互作用由棕榈油酸(PAM)桥接，其尾部伸入TcdB1中的疏水袋中。在TcdB4-TFPI复合物中，TFPI R135的侧链深深地嵌入同一袋中，但与相邻残基包括来自TcdB4的E1433、D1467和E1469形成多个氢键(图11D)。TcdB1中的F1597是稳定PAM中间部分的关键残基，并与FZD2中附近的F130相互作用(Chen等人,2018；Peng等人,2019)，而模拟TcdB2和TcdB4的Phe至Ser的置换消除了FZD结合(Henkel等人,2020)。值得注意的是，TcdB4中的S1598与TFPI中附近的R140形成了紧密的氢键(图11E)。因此，TcdB的F1598S置换可能会损害FZD结合，但有助于TFPI结合。相应地，在该位置处，Phe在所有I类RBI中都具有保守性，而Ser在所有II类RBI中都具有保守性。

TcdB2中潜在的TFPI结合界面类似于TcdB4(图11F)，这提供了TcdB2也可能识别TFPI的结构线索。如预期的，HeLa CSPG4^–/–/TFPI^–/–细胞比其亲本CSPG4^–/–细胞对TcdB2更具抗性(图11G)，而其对TcdB2的易感性可通过异位表达GPI锚定的Tfpi^K2来恢复(图11H)。另外，Tfpi^K2-Fc有效地保护HeLa CSPG4^–/–细胞免受TcdB2毒性侵害(图11I和12A)。我们还进行了BLI分析以检测TcdB2-TFPI相互作用(来自ST01/RT027菌株R20291的参照序列)，并观察到TcdB2与带Fc标签的小鼠Tfpi^K2和人TFPI^K2结合，K_d分别为约0.2和0.4μM(图12B-12D)。

在RBI内，TcdB2和TcdB4之间存在几个不同的残基(图13A)。为了探询TcdB2中导致与TFPI结合降低的残基，我们通过将残基替换为TcdB2中的相应残基，生成了一系列TcdB4^1285-1834突变体。下拉实验显示，I1496S是减弱TFPI结合的关键突变，而置换P1506L、Y1510C和K1597N/K1600Q则略微降低了相互作用(图11J)。另一方面，TcdB2^1285-1834内的S1496I置换增强了其对人和小鼠TFPI的结合亲和力(图13B和13C)。

参考文献

1.Broze,G.J.,Jr.和Girard,T.J.(2012).Tissue factor pathway inhibitor:structure-function.Front Biosci(Landmark版)17,262-280.3926[pii]10.2741/3926.

2.Maroney,S.A.,Ellery,P.E.和Mast,A.E.(2010).Alternatively splicedisoforms of tissue factor pathway inhibitor.Thromb.Res.125增刊1,S52-56.10.1016/j.thromres.2010.01.038S0049-3848(10)00091-5[pii].

3.Maroney,S.A.和Mast,A.E.(2015).New insights into the biology oftissue factor pathway inhibitor.J Thromb Haemost 13增刊1,S200-207.10.1111/jth.12897.

4.Mast,A.E.(2016).Tissue Factor Pathway Inhibitor:MultipleAnticoagulant Activities for a Single Protein.Atertio.Thromb.Vasc.Biol.36,9-14.10.1161/ATVBAHA.115.305996ATVBAHA.115.305996[pii].

5.Chen,P.,Zeng,J.,Liu,Z.,Thaker,H.,Wang,S.,Tian,S.,Zhang,J.,Tao,L.,Gutierrez,C.B.,Xing,L.等人(2021).Structural basis for CSPG4 as a receptor forTcdB and atherapeutic target in Clostridioides difficile infection.Nat Commun12,3748.10.1038/s41467-021-23878-310.1038/s41467-021-23878-3[pii].

6.Sanjana,N.E.,Shalem,O.和Zhang,F.(2014).Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.Nat Methods 11,783-784.10.1038/nmeth.3047.

7.Wood,J.P.,Ellery,P.E.,Maroney,S.A.和Mast,A.E.(2014).Biology oftissue factor pathway inhibitor.Blood 123,2934-2943.10.1182/blood-2013-11-512764blood-2013-11-512764[pii].

8.Gupta,P.,Zhang,Z.,Sugiman-Marangos,S.N.,Tam,J.,Raman,S.,Julien,J.P.,Kroh,H.K.,Lacy,D.B.,Murgolo,N.,Bekkari,K.等人(2017).Functional defectsin Clostridium difficile TcdB toxin uptake identify CSPG4 receptor-bindingdeterminants.J Biol Chem 292,17290-17301.10.1074/jbc.M117.806687

9.Tao,L.,Zhang,J.,Meraner,P.,Tovaglieri,A.,Wu,X.,Gerhard,R.,Zhang,X.,Stallcup,W.B.,Miao,J.,He,X.等人(2016).Frizzled proteins are colonicepithelial receptors for C.difficile toxin B.Nature 538,350-355.10.1038/nature19799

10.Knight,D.R.,Imwattana,K.,Kullin,B.,Guerrero-Araya,E.,Paredes-Sabja,D.,Didelot,X.,Dingle,K.E.,Eyre,D.W.,Rodriguez,C.和Riley,T.V.(2021).Major genetic discontinuity and novel toxigenic species in Clostridioidesdifficile taxonomy.Elife 10.10.7554/eLife.64325

11.Mansfield,M.J.,Tremblay,B.J.,Zeng,J.,Wei,X.,Hodgins,H.,Worley,J.,Bry,L.,Dong,M.和Doxey,A.C.(2020).Phylogenomics of 8,839Clostridioidesdifficile genomes reveals recombination-driven evolution and diversificationof toxin A and B.PLoS Pathog 16,e1009181.10.1371/journal.ppat.1009181

12.Shen,E.,Zhu,K.,Li,D.,Pan,Z.,Luo,Y.,Bian,Q.,He,L.,Song,X.,Zhen,Y.,Jin,D.和Tao,L.(2020).Subtyping analysis reveals new variants and acceleratedevolution of Clostridioides difficile toxin B.Communications Biology 3,347.10.1038/s42003-020-1078-y10.1038/s42003-020-1078-y[pii].

13.Chen,S.,McMullan,G.,Faruqi,A.R.,Murshudov,G.N.,Short,J.M.,Scheres,S.H.和Henderson,R.(2013).High-resolution noise substitution to measureoverfitting and validate resolution in 3D structure determination by singleparticle electron cryomicroscopy.Ultramicroscopy 135,24-35.10.1016/j.ultramic.2013.06.004

14.Peng,Z.,Simeon,R.,Mitchell,S.B.,Zhang,J.,Feng,H.和Chen,Z.(2019).Designed Ankyrin Repeat Protein(DARPin)Neutralizers of TcdB from Clostridiumdifficile Ribotype027.mSphere 4.e00596-19[pii]

15.Henkel,D.,Tatge,H.,Schottelndreier,D.,Tao,L.,Dong,M.和Gerhard,R.(2020).Receptor Binding Domains of TcdB from Clostridioides difficile forChondroitin Sulfate Proteoglycan-4and Frizzled Proteins Are FunctionallyIndependent and Additive.Toxins(Basel)12.E736[pii]

16.Uhlen,M.,Fagerberg,L.,Hallstrom,B.M.,Lindskog,C.,Oksvold,P.,Mardinoglu,A.,Sivertsson,A.,Kampf,C.,Sjostedt,E.,Asplund,A.等人(2015).Proteomics.Tissue-based map of the human proteome.Science 347,1260419.10.1126/science.1260419

17.Ascenzi,P.,Bocedi,A.,Bolognesi,M.,Spallarossa,A.,Coletta,M.,DeCristofaro,R.和Menegatti,E.(2003).The bovine basic pancreatic trypsininhibitor(Kunitz inhibitor):amilestone protein.Curr Protein Pept Sci 4,231-251.10.2174/1389203033487180.

18.Chen,P.,Lam,K.H.,Liu,Z.,Mindlin,F.A.,Chen,B.,Gutierrez,C.B.,Huang,L.,Zhang,Y.,Hamza,T.,Feng,H.等人(2019).Structure of the full-lengthClostridium difficile toxin B.Nat Struct Mol Biol 26,712-719.10.1038/s41594-019-0268-0

19.Simeon,R.,Jiang,M.,Chamoun-Emanuelli,A.M.,Yu,H.,Zhang,Y.,Meng,R.,Peng,Z.,Jakana,J.,Zhang,J.,Feng,H.和Chen,Z.(2019).Selection andcharacterization of ultrahigh potency designed ankyrin repeat proteininhibitors of C.difficile toxin B.PLoS Biol17,e3000311.10.1371/journal.pbio.3000311

20.Zhang,J.,Piro,O.,Lu,L.和Broze,G.J.,Jr.(2003).Glycosylphosphatidylinositol anchorage of tissue factor pathway inhibitor.Circulation108,623-627.10.1161/01.CIR.0000078642.45127.7B 01.CIR.0000078642.45127.7B[pii].

Claims (23)

1.一种与组织因子途径抑制物(TFPI)结合的分离的多肽，其中所述多肽包含：

保留与TFPI结合的野生型TcdB4蛋白或TcdB2蛋白的功能性片段；或者

保留与TFPI的结合的所述功能性片段的变体，其中所述变体的氨基酸序列与所述功能性片段的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。

2.权利要求1所述的分离的多肽，其中所述野生型TcdB4蛋白如SEQ ID NO:1所示，和/或所述野生型TcdB2蛋白如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求2所述的分离的多肽，其中所述多肽包含：

(a)与如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列；

(b)与如SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列；

(c)(a)或(b)的氨基酸序列的N末端和/或C末端截短的氨基酸序列，例如，截短200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸；或者

(d)(a)或(b)的氨基酸序列的N末端和/或C末端延伸的氨基酸序列，例如，延伸200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个在SEQ IDNO:1或2的相应位置处的氨基酸。

4.权利要求1-3中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽包含对应于SEQ ID NO:1的以下残基中的一个或多个：E1433、D1467、D1468、E1469、S1598、L1599、L1434、K1435、M1438、V1492、L1494、I1496、L1489、P1506和Y1510。

5.权利要求4所述的分离的多肽，其中所述多肽进一步包含对应于SEQ ID NO:1的以下残基中的一个或多个：如SEQ ID NO:1所示的L1434、K1435、M1438、K1597、S1598、L1599和K1600。

6.前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述功能性片段包含SEQ ID NO:3-7和13中的任一个或由其组成。

7.前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其中所述功能性片段的变体包含至少一个突变(例如，置换、插入或缺失)，以提高与TFPI的结合。

8.前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其与TFPI结合的解离常数小于10μM、小于1μM、小于100nM、小于50nM、小于25nM、小于10nM或小于5nM，如通过生物膜干涉技术(BLI)测定法所测量的。

9.前述权利要求中任一项所述的分离的多肽，其与TFPI的K2结构域而非K1结构域特异性结合。

10.一种融合蛋白，其包含与异源多肽融合的权利要求1-9中任一项所述的分离的多肽，所述异源多肽诸如增加所述融合蛋白的半衰期的异源多肽。

11.权利要求10所述的融合蛋白，其中所述异源多肽是IgG Fc部分，任选地包含铰链区。

12.一种缀合物，其包含与一个部分缀合的权利要求1-9中任一项所述的多肽，所述部分诸如聚乙二醇(PEG)部分、细胞毒性部分、小分子药物、人血清白蛋白(HSA)、抗体或其片段、羟乙基淀粉、包含脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸或其组合(PAS化)的多聚体或者C12-C18脂肪酸。

13.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-9中任一项所述的分离的多肽或权利要求10所述的融合蛋白的核酸序列。

14.一种载体，其包含权利要求13所述的核酸分子。

15.一种宿主细胞，其包含权利要求13所述的核酸分子或权利要求14所述的载体。

16.一种药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的分离的多肽和药学上可接受的载剂。

17.一种用于检测样品中TFPI的方法，所述方法包括使所述样品与权利要求1-9中任一项所述的分离的多肽接触。

18.一种用于治疗患有TFPI相关或TFPI介导的病症或者处于患有这种病症的风险中的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-9中任一项所述的分离的多肽或权利要求16所述的药物组合物。

19.权利要求18所述的方法，其中所述TFPI相关或TFPI介导的病症是血液凝固功能障碍，例如血友病。

20.一种用于纯化TFPI的方法，其中所述方法包括

a)使含有TFPI的样品与权利要求1-8中任一项所述的多肽在适于在TFPI和所述多肽之间形成复合物的条件下接触；

b)从所述样品中取出所述复合物；并且

c)任选地，解离所述复合物以释放TFPI。

21.一种抑制或拮抗受试者中TFPI活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-9中任一项所述的分离的多肽或权利要求16所述的药物组合物。

22.权利要求1-9中任一项所述的分离的多肽在制备用于治疗或预防血液凝固病症的药物中的用途。

23.一种试剂盒，其中所述试剂盒包含容器，所述容器包含权利要求1-9中任一项所述的多肽。