CN118580340A - 一种抗凝多肽及其在制备血浆激肽释放酶活性抑制剂中的应用 - Google Patents

一种抗凝多肽及其在制备血浆激肽释放酶活性抑制剂中的应用 Download PDF

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CN118580340A CN202410797081.6A CN202410797081A CN118580340A CN 118580340 A CN118580340 A CN 118580340A CN 202410797081 A CN202410797081 A CN 202410797081A CN 118580340 A CN118580340 A CN 118580340A
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赖仞
方鸣谦
王婉婷
杨娟
吕秋敏
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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种抗凝多肽及其在制备血浆激肽释放酶活性抑制剂中的应用。本发明所述抗凝多肽包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明所述抗凝多肽能显著抑制血浆复钙时间和活化部分凝血活酶时间，具有良好的抗炎性血栓和脑卒中药物活性作用，低出血风险和低细胞毒性，安全性较高。

Description

一种抗凝多肽及其在制备血浆激肽释放酶活性抑制剂中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗凝多肽及其在制备血浆激肽释放酶活性抑制剂中的应用。
背景技术
血栓是心肌梗塞、缺血性脑中风和静脉血栓栓塞的常见病因。2010年，血栓栓塞病症占全球死亡人数的四分之一，抗血栓治疗已成为医疗保健领域的重大挑战。目前临床上使用组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogen activator，t-PA)、肝素和水蛭素等虽然可以有效地靶向抑制凝血级联和血小板聚集，但也与围手术期出血风险相关。此外，这些疗法并不能完全解决血栓再形成风险，凸显了第三种未充分解决的机制——炎症。
血浆激肽释放酶(Plasmakallikrein，PKa)是一种多功能丝氨酸蛋白酶，在血栓炎症和心血管事件中起着重要作用。传统上，PKa通过裂解高分子量激肽原(KNG)释放缓激肽(BK)来引发炎症，促进等肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)等炎症因子的释放。此外，PKa在凝血级联中起着重要作用，它将凝血因子FXII转化为其活性形式(FXIIa)。这种激活会导致接触途径(内源性凝血级联)的自激活和血栓形成。对内源性凝血途径的抑制被报导与止血(出血)无关，并且大多数PKa缺陷患者没有止血缺陷。因此，抑制PKa为开发抗炎性血栓药物提供了一个理论靶点；目前还没有一种出血风险低的抑制PKa的强效抗炎性血栓小肽药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗凝多肽及其在制备血浆激肽释放酶活性抑制剂中的应用，能抑制血浆激肽释放酶活性，具有良好的抗炎性血栓和脑卒中药物活性作用，低出血风险和低细胞毒性，安全性高。
本发明提供了一种抗凝多肽，所述抗凝多肽包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
优选的，所述抗凝多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗凝多肽在制备血浆激肽释放酶活性抑制剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗凝多肽在制备治疗血浆激肽释放酶和炎症通路相关的精神疾病产品中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗凝多肽在制备抗炎产品中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗凝多肽在制备抗血栓产品中的功能应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗凝多肽在制备抗脑卒中产品中的应用。
优选的，所述脑卒中包括缺血性脑卒中和/或出血性脑卒中。
优选的，所述缺血性脑卒中包括血栓性脑梗塞、栓塞性脑梗塞、腔隙性脑梗塞、多发性脑梗塞和短暂性脑缺血发作中的一种或多种。
本发明还提供了一种抗脑卒中的药物，所述药物的活性成分包括上述技术方案所述的抗凝多肽，以抗凝多肽的用量计，所述药物在人体的用量为0.027～0.444mg/kg。
有益效果
本发明提供了一种抗凝多肽及其在制备血浆激肽释放酶活性抑制剂中的应用，所述抗凝多肽包括下述的一种或多种：1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；2)如SEQ IDNo.1所示氨基酸序列中的部分片段，氨基酸残基数＜14，且包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明所述抗凝多肽能显著抑制血浆复钙时间和活化部分凝血活酶时间，具有良好的抗炎性血栓和脑卒中药物活性作用，且具有低出血风险和低细胞毒性，安全性较高。
进一步的，体外实验表明，如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列SD6能延长血浆复钙时间和活化部分凝血活酶时间，对内在凝血途径具有特异性抑制作用。在0.25～4mg/kg的剂量范围内，SD6可减轻FeCl3诱导和光化学诱导小鼠的动脉血栓和皮层静脉血栓形成，且不影响出血。此外，SD6还减轻了短暂性脑中动脉闭塞缺血性脑卒中小鼠模型中的脑炎症损伤和脑水肿。表明SD6有希望作为较安全的血栓炎症的治疗剂，且可获得性较高，易于未来的工业化生产。
本发明实施例中使用Fisher-t检验和单因素方差分析确定数据的显著性差异，表现为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；和****p<0.0001。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为发色底物法酶动力学分析CW15和SD6对PKa的活性影响结果；
图2为SPR分析SD6与PKa的结合强度结果；
图3为SD6在体外对PRT的影响；
图4为SD6在体外对APTT的影响；
图5为SD6在体外对PT的影响；
图6为SD6对细胞毒性的影响实验结果；
图7为SD6对HEK293T细胞增殖的影响实验结果；
图8为SD6对小鼠脾细胞增殖的影响实验结果；
图9为SD6对小鼠尾出血时间的作用结果；
图10为卡拉胶致鼠尾血栓模型评估SD6的抗血栓功能结果；
图11为FeCl3诱导的小鼠颈总动脉模型评估SD6的抗血栓功能结果；
图12为SD6对小鼠光化学诱导的脑皮层血栓形成的影响；
图13为SD6对tMCAO小鼠神经功能的恢复作用结果；
图14为SD6对tMCAO小鼠脑缺血再灌注梗死面积的影响结果；
图15为ELISA分析SD6降低tMCAO小鼠脑内炎症因子释放量的情况；
图16为干湿称重法分析SD6对tMCAO小鼠脑水肿的影响；
图17为伊文思蓝染色分析SD6注射后tMCAO小鼠的血脑屏障功能。
具体实施方式
本发明提供了一种抗凝多肽，所述抗凝多肽包括下述的一种或多种：
1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
2)如SEQ ID No.1所示氨基酸序列中的部分片段，氨基酸残基数＜14，且包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
在本发明中，所述部分片段的氨基酸序列优选如SEQ ID No.2所示。本发明SEQIDNo.1和SEQ ID No.2的氨基酸序列信息具体如下：
SEQ ID No.1：CTSVSLGASDPFDY；SEQ ID No.2：SLGASD。
本发明从流感相关免疫球蛋白重链连接区(来源于NCBI上的免疫球蛋白重链链接域序列库，Sequence ID:MBB2084429.1)截取得到如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列CW15，并进一步优化得到如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列SD6，采用发色底物法和酶动力学分析SD6和CW15对PKa的活性影响，结果显示，SD6和CW15抑制剂量依赖性抑制PKa的活性，IC50分别约为200μM和69μM。SD6比CW15的分子量更小，并且显示出更优的PKa抑制活性。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗凝多肽在制备血浆激肽释放酶活性抑制剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗凝多肽在制备治疗血浆激肽释放酶和炎症通路相关的精神疾病产品中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗凝多肽在制备抗炎产品中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗凝多肽在制备抗血栓产品中的功能应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗凝多肽在制备抗脑卒中产品中的应用。在本发明中，所述脑卒中优选包括缺血性脑卒中和/或出血性脑卒中，更优选为缺血性脑卒中；所述缺血性脑卒中优选包括血栓性脑梗塞、栓塞性脑梗塞、腔隙性脑梗塞、多发性脑梗塞和短暂性脑缺血发作中的一种或多种。本发明提供的抗凝多肽能有效减轻脑缺血梗死损伤，减轻血脑屏障损伤，减轻脑水肿并降低脑炎症因子含量，具有良好的抗脑卒中活性。
本发明还提供了一种抗脑卒中的产品，所述产品的活性成分包括上述技术方案所述的抗凝多肽，以抗凝多肽的用量计，所述药物在人体的用量为0.027～0.444mg/kg，进一步优选为0.05～0.2mg/kg，更优选为0.1mg/kg。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种抗凝多肽及其在制备血浆激肽释放酶活性抑制剂中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例使用的材料如下：
CW15：CTSVSLGASDPFDY(SEQ ID No.1)，委托GLBiochem(中国)公司合成(纯度98％)；SD6：SLGASD(SEQ ID No.2)，委托GLBiochem(中国)公司合成(纯度98％)；PKa：购买自美国Enzyme Research公司，HPKa1303。
实施例1
为了检测SD6和CW15对PKa水解底物的影响，设置CW15-50μM、CW15-100μM、CW15-150μM、SD6-34μM、SD6-69μM、SD6-138μM、SD6-276μM7、对照组组试验，并按照下述方式处理：
CW15-50μM组：将50μM CW15与35nM PKa在37℃孵育3min；
CW15-100μM组：将100μM CW15与35nM PKa在37℃孵育3min；
CW15-150μM组：将150μM CW15与35nM PKa在37℃孵育3min；
SD6-34μM组：将34μM SD6与35nM PKa在37℃孵育3min；
SD6-69μM组：将69μM SD6与35nM PKa在37℃孵育3min；
SD6-138μM组：将138μM SD6与35nM PKa在37℃孵育3min；
SD6-276μM组：将276μM SD6与35nM PKa在37℃孵育3min；
对照组：PBS与35nM PKa在37℃孵育3min。
孵育结束后，每组50μL混合液中，加入50μL 30nM PKa的发色底物(S-2302；Chromogenix；美国)，然后立即使用酶标仪在OD405nm波长处进行动力学监测。在图1中A为CW15对PKa的活性分析图，B为SD6对PKa的活性分析图。
为确定SD6抑制常数，取两份50μL上述含有SD6的混合液和对照溶液，一份加入50μL 60nM PKa发色底物，另一份加入50μL 30nM PKa发色底物，然后立即使用酶标仪在OD405nm波长处进行动力学监测。得到酶标仪活性分析自动生成的最大反应速率后，采用Dixon双倒数作图法进行抑制常数分析。在x轴上绘制抑制剂(CW15和SD6)的浓度，在y轴上绘制反应速率的倒数，以生成Dixon计算图像，如图1中C所示，为SD6与PKa的Dixon计算图用以得到抑制常数Ki。
由图1可知，CW15的IC50值(半数抑制浓度)约为200μM(图1中A)，而SD6的IC50值约为69μM(图1中B)，分子量仅为549Da；表明SD6具有比CW15更优的PKa抑制活性和更小的分子量。此外，Dixon图示分析显示，SD6非竞争性地抑制了PKa的活性，其抑制常数Ki值36.34μM(图1中C)。
实施例2
将PKa固定在CM5芯片(29149603,Cytiva,USA)上，水平值为6000RU，流动相为浓度为0～600μM SD6，流速为30μL/min，结合时间为3min。RU值的增加即表明PKa与SD6结合，结果如图2所示。
由图2可知，与PBS对照相比，浓度分别为37.5μM、75μM、150μM、300μM和600μM的SD6的RU分别增加了7.6、18.61、41.33、85.74和224.82。SD6与PKa相互作用的结合速率常数(Ka)、解离速率常数(Kd)和平衡解离常数(KD)分别为8×103M-1s-1、5.11×10-2s-1和6.39μM，显示出较强的结合能力。
实施例3
凝血级联中的外源性和内源性凝血途径分别与止血和血栓形成有关。在凝血测定中，PRT和APTT显示内在的内源性凝血活性，而凝血酶原时间(PT)则测量外源性凝血活性。
将新鲜血浆随机分为26μM、52μM、104μM和208μM四个处理组，并按照下述方式处理：
26μM组：将10μL26μM SD6和20μL新鲜血浆混合并加入96孔板；
52μM组：将10μL 52μM SD6和20μL新鲜血浆混合并加入96孔板；
104μM组：将10μL 104μM SD6和20μL新鲜血浆混合并加入96孔板；
208μM组：将10μL208μM SD6和20μL新鲜血浆混合并加入96孔板；
然后每组加入50μL含150mM NaCl的HEPES(pH 7.4)缓冲溶液，在37℃下孵育10min；
孵育结束后，每组加入60μL含有25mM CaCl2的HEPES缓冲溶液，并立即在光吸收值为650nm的条件下在酶标仪中进行动力学监测30min，结果如图3和表1所示，其中Med表示溶剂对照组，上图为动力学吸光度记录值，反应了血液凝血程度；下图为上图的定量数据，以反应速率最高值对应的时间点表示。
表1SD6在体外对PRT的影响
按照商业试剂盒(GMS10178.2，GenMed，美国)及其提供的说明书中记载的方式测定26μM SD6、52μM SD6、104μM SD6和208μM SD6对APTT的影响，结果如图4和表2所示，其中Med表示溶剂对照组，上图为动力学吸光度记录值，反应了血液凝血程度；下图为上图的定量数据，以反应速率最高值对应的时间点表示。
表2SD6在体外对APTT的影响
组别 平均值 个案数 标准偏差 平均值标准误差
Med 23.00 3 1.73 1.00
26μM组 41.33 3 1.53 0.88
52μM组 34.33 3 1.15 0.67
104μM组 30.00 3 1.00 0.58
208μM组 25.33 3 2.51 1.45
总计 30.80 15 6.93 1.79
- 平方和 自由度 均方 F
组间 644.40 4 161.10 57.54
组内 28.00 10 2.80 /
总计 672.40 14 / /
显著性 0.0001 / / /
按照商业试剂盒(STY50101，Steellex，中国)及其提供的说明书中记载的方式测定52μM SD6、104μM SD6和208μM SD6对PT的影响，结果如图5和表3所示，其中Med表示溶剂对照组，上图为动力学吸光度记录值，反应了血液凝血程度；下图为上图的定量数据，以反应速率最高值对应的时间点表示。
表3SD6在体外对PT的影响
由图3～图5和表1～表3可知，溶剂对照组(Med)的PRT值(图3)为234±4.04s，而208μM SD6处理组的PRT值为406.3±6.44s；溶剂对照组(Med)的APTT值(图4)为23±1s，而208μM SD6处理组的PRT值为41.33±0.88s；溶剂对照组(Med)的PT值(图5)为30.67±0.33s，而208μM SD6处理组的PRT值为30±0.58s；可见SD6以剂量依赖的方式延长了PRT(F4，10＝133.87，p<0.0001)和APTT(F4，10＝57.54，p<0.0001)，但对PT没有影响(F3，8＝0.60，p＝0.63)，这表明SD6抑制了内源性凝血途径，具有不影响出血的潜能。
实施例4
为了评估SD6对溶血的影响，将新鲜血液样本在常温下3500rpm离心10min。弃去上清液，将获得的红细胞分为阳性对照(Triton-X100)组、阴性对照(Control)组、SD6-5组、SD6-10组、SD6-20组、SD6-40组和SD6-80组7组，每组红细胞以1×107cells/mL的浓度重悬于0.01M PBS(pH 7.2)中，并按照下述方式处理：
阳性对照组(Triton-X100)：将重悬好的红细胞与阳性对照Triton-X100(0.1％v/v)在37℃下孵育30min；
阴性对照组(Control)：将重悬好的200μL红细胞与20μLPBS在37℃下孵育30min；
SD6-5组：将重悬好的红细胞与5μg/mL SD6在37℃下孵育30min；
SD6-10组：将重悬好的红细胞与10μg/mL SD6在37℃下孵育30min；
SD6-20组：将重悬好的红细胞与20μg/mL SD6在37℃下孵育30min；
SD6-40组：将重悬好的红细胞与40μg/mL SD6在37℃下孵育30min；
SD6-80组：将重悬好的红细胞与80μg/mL SD6在37℃下孵育30min。
孵育结束后，每组细胞于3500rpm离心5min，随后使用酶标仪在540nm波长处测量上清液的光吸收值，结果如图6和表4所示。
表4SD6对细胞毒性的影响
SD6对HEK293T细胞增殖的影响
使用DMEM/F-12完全培养基培养HEK293T细胞(1.5×104cells/well)后接种于96孔板中。37℃5％CO2细胞培养箱中培养12h后，将培养好的HEK293T细胞分为阳性对照(10％v/v DMSO)组、阴性对照(Control)组、SD6-5组、SD6-10组、SD6-20组、SD6-40组和SD6-80组7组，并按照下述方式处理：
阳性对照组(10％DMSO)：向培养好的HEK293T细胞中加入10％DMSO，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
阴性对照组(Control)：向培养好的HEK293T细胞中加入20μLPBS，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
SD6-5组：向培养好的HEK293T细胞中加入5μg/mL SD6，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
SD6-10组：向培养好的HEK293T细胞中加入10μg/mL SD6，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
SD6-20组：向培养好的HEK293T细胞中加入20μg/mL SD6，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
SD6-40组：向培养好的HEK293T细胞中加入40μg/mL SD6，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
SD6-80组：向培养好的HEK293T细胞中加入80μg/mL SD6，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h。
之后，在每组细胞中加入10μL CCK-8试剂，再培养3h，统计细胞活力，细胞活力以相对于对照组的百分比表示。结果如图7和表5所示。
表5SD6对HEK293T细胞增殖的影响
SD6对小鼠脾细胞增殖的影响
使用RPMI1640完全培养基培养原代小鼠脾细胞(1.5×105cells/well)后接种于96孔板中。37℃5％CO2细胞培养箱中培养12h后，将培养好的原代小鼠脾细胞分为阳性对照(10％DMSO)组、阴性对照(Control)组、SD6-5组、SD6-10组、SD6-20组、SD6-40组和SD6-80组7组，并按照下述方式处理：
阳性对照组(10％DMSO)：向培养好的原代小鼠脾细胞中加入10％DMSO，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
阴性对照组(Control)：向培养好的原代小鼠脾细胞中加入20μLPBS，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
SD6-5组：向培养好的原代小鼠脾细胞中加入5μg/mL SD6，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
SD6-10组：向培养好的原代小鼠脾细胞中加入10μg/mL SD6，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
SD6-20组：向培养好的原代小鼠脾细胞中加入20μg/mL SD6，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
SD6-40组：向培养好的原代小鼠脾细胞中加入40μg/mL SD6，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h；
SD6-80组：向培养好的原代小鼠脾细胞中加入80μg/mL SD6，在37℃5％CO2细胞培养箱中培养10h。
处理10h后，在每组细胞中加入10μL CCK-8试剂，再培养3h，统计细胞活力，细胞活力以相对于对照组的百分比表示，结果如图8和表6所示。
表6SD6对小鼠脾细胞增殖的影响
由图6～8和表4～表6可知，与PBS处理组相比，5-80μg/mL SD6对红细胞溶血(F5，12＝1.243，p＝0.349，图6)以及HEK293T细胞(F5，11＝1.918，p＝0.171，图7)和小鼠脾细胞(F5，12＝1.282，p＝0.334，图8)增殖没有影响。
实施例5
采用断尾出血小鼠模型评估SD6的出血风险：将8周龄的雄性C57BL/6J小鼠分为阳性对照(Heparin-1000U/kg)组、阴性对照(Control)组、SD6-0.25组、SD6-1组和SD6-4组5组，每组6只，并按照下述方式处理：
阳性对照(Heparin-1000U/kg)组：静脉注射1000U/kg肝素；
阴性对照(Control)组：静脉注射200μLPBS；
SD6-0.25组：静脉注射0.25mg/kg SD6；
SD6-1组：静脉注射1mg/kg SD6；
SD6-4组：静脉注射4mg/kg SD6；
注射5分钟后，将每只小鼠从尾尖2mm处切断尾部并放入37℃预热无菌生理盐水中，观察并记录从流出到停止出血的时间，结果如图9和表7所示。
表7SD6对小鼠尾出血时间的影响
组别 平均值 个案数 标准偏差 偏度标准误差 平均值标准误差
Control 113.000 6 19.473 0.845 7.950
SD6-4组 120.667 6 11.961 0.845 4.883
SD6-1组 99.667 6 19.190 0.845 7.834
SD6-0.25组 119.333 6 19.211 0.845 7.843
总计 113.167 24 18.600 0.472 3.797
- 平方和 自由度 均方 F 显著性
组间 1659.333 3 553.111 1.756 0.188
组内 6298.000 20 314.900 / /
总计 7957.333 23 / / /
由图9和表7可知，与对照组小鼠(113±7.95s)相比，肝素处理小鼠的尾部出血时间明显延长(201.5±18.81s)，但0.25～4mg/kg SD6处理小鼠的尾部出血时间无显著差异(F3，20＝1.756，p＝0.188)，表明SD6与肝素(一种靶向抗凝血酶III(AT-III)的抗凝血阳性药物)相比具有更高的止血安全性。
实施例6
为了评估SD6对血栓形成的影响，采用三种不同的小鼠模型，包括卡拉胶诱导的尾部血栓形成模型、氯化铁诱导的颈动脉血栓形成模型和玫瑰红光化学诱导的大脑皮层血栓形成模型。这些模型通过诱导血管内皮细胞损伤和炎症反应引发血栓形成。
1、SD6对卡拉胶诱导的小鼠尾血栓形成的影响
将6周龄雄性BALB/c小鼠分为阳性对照(Heparin-1000U/kg)组、阴性对照(Control)组、SD6-0.25组、SD6-1组和SD6-4组5组，每组6只，并按照下述方式处理：
阳性对照(Heparin-1000U/kg)组：腹腔注射200μL溶于0.9％生理盐水的1％Ⅰ型卡拉胶(CC3171,Coolaber,中国)，然后立即静脉注射1000U/kg肝素钠，每隔12h补充一次，共注射三次；
阴性对照(Control)组：腹腔注射200μL溶于0.9％生理盐水的1％Ⅰ型卡拉胶(CC3171,Coolaber,中国)，然后立即静脉注射PBS，每隔12h补充一次，共注射三次；
SD6-0.25组：腹腔注射200μL溶于0.9％生理盐水的1％Ⅰ型卡拉胶(CC3171,Coolaber,中国)，然后立即静脉注射0.25mg/kg SD6，每隔12h补充一次，共注射三次；
SD6-1组：腹腔注射200μL溶于0.9％生理盐水的1％Ⅰ型卡拉胶(CC3171,Coolaber,中国)，然后立即静脉注射1mg/kg SD6，每隔12h补充一次，共注射三次；
SD6-4组：腹腔注射200μL溶于0.9％生理盐水的1％Ⅰ型卡拉胶(CC3171,Coolaber,中国)，然后立即静脉注射4mg/kg SD6，每隔12h补充一次，共注射三次；
各处理组最后一次注射12h后观察并记录各小鼠尾部血栓的长度，结果如图10所示和表8。
表8SD6对卡拉胶诱导的小鼠尾血栓形成的影响
组别 平均值 个案数 标准偏差 平均值标准误差
Control 4.933 6 1.080 0.441
SD6-4组 1.983 6 0.685 0.280
SD6-1组 2.683 6 1.044 0.426
SD6-0.25组 2.717 6 0.879 0.359
Heparin-1000U/kg 1.607 6 0.986 0.403
总计 2.785 30 1.466 0.268
- 平方和 自由度 均方 F
组间 29.561 3 9.854 11.26
组内 17.498 20 0.875 /
总计 47.060 23 / /
显著性 0.00015 / / /
图10和表8的结果显示，与对照组相比，静脉注射0.25-4mg/kg SD6可显著减少小鼠尾部血栓长度，且呈剂量依赖性(F3，20＝11.26，p＝0.00015)。而4mg/kgSD6的减少量与1000U/kg肝素组的减少量相当(p＝0.5)。
2、SD6对氯化铁诱导的颈动脉血栓形成的作用
将8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为阳性对照(Heparin-1000U/kg)组、阴性对照(Control)组、SD6-0.25组、SD6-1组和SD6-4组5组，每组6只，每组小鼠麻醉后从颈部中线切口，暴露并分离左侧颈总动脉(CCA)。在动脉下方放置一个直径为4mm的遮光片，以减少背景血流干扰。随后，按照下述方式处理：
阳性对照(Heparin-1000U/kg)组：静脉注射1000U/kg肝素钠；
阴性对照(Control)组：静脉注射PBS；
SD6-0.25组：静脉注射0.25mg/kg SD6；
SD6-1组：静脉注射1mg/kg SD6；
SD6-4组：静脉注射4mg/kg SD6；
静脉注射2min后，对每只小鼠取一张直径为4mm的滤纸浸泡在10％的氯化铁溶液中，放在动脉上诱导动脉壁病变2min；然后取下滤纸，使用实时激光斑点灌注(LSP)成像系统(RWD，中国)和SIM BFI软件(SIM BFI HRPro，Simopto，中国)测量血流量并成像。当图像中血管的颜色从红色变为蓝色时，即确定血栓闭塞。连续记录时间固定为30min。手术时间超过10min的小鼠或出现严重手术出血的小鼠将被排除在进一步的数据分析之外。结果如图11和表9所示，其中图11中A为LSP成像结果，B为A图中对应血流的定量图。
表9小鼠颈总动脉模型10min血流量
组别 平均值 个案数 标准偏差 平均值标准误差
Control 32.515 6 16.922 6.909
SD6-0.25组 29.999 6 8.984 3.668
SD6-1组 13.132 6 9.545 3.897
SD6-4组 9.991 6 6.340 2.588
Heparin-1000U/kg 6.553 6 5.015 2.047
总计 18.438 30 14.447 2.638
表10小鼠颈总动脉模型13min血流量
由图11和表9～表10可知，静脉注射1mg/kg SD6和4mg/kg SD6的小鼠颈动脉在氯化铁诱导后10min和13min的多普勒成像显示的血流减少量低于对照组(图11中A、B)，表明血栓形成较少。而4mg/kg SD6处理的小鼠的动脉血栓减少率也与肝素组相当(图11中A、B)。
4、SD6对小鼠脑皮层光栓形成的影响
将8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为阳性对照(Heparin-1000U/kg)组、阴性对照(Control)组、SD6-0.25组、SD6-1组和SD6-4组5组，每组6只，并按照下述方式处理：
阳性对照(Heparin-1000U/kg)组：静脉注射1000U/kg肝素，每隔12h注射一次，共注射六次；
阴性对照(Control)组：静脉注射PBS200μL，每隔12h注射一次，共注射六次；
SD6-0.25组：静脉注射0.25mg/kg SD6，每隔12h注射一次，共注射六次；
SD6-1组：静脉注射1mg/kg SD6，每隔12h注射一次，共注射六次；
SD6-4组：静脉注射4mg/kg SD6，每隔12h注射一次，共注射六次；
最后一次注射后12h(第4天)，每只小鼠静脉注射50mg/kg玫瑰红(330000，美国Sigma-Aldrich)；1h后，对小鼠进行麻醉后沿中线从眼部向下至颈部切开表皮，露出头骨。使用15.5mW的562nm黄绿光激光器(R-LG561-100-A5，RWD，中国)照射指定区域6min。在CPS过程的第二天，再次暴露头骨进行LSP成像，以选择目标照射脑区血流量相似的小鼠，结果如图12和表11所示，其中A为LPS成像结果，B为LPS成像血流量定量图。
表11SD6对小鼠光化学诱导的脑皮层血栓形成的影响
组别 平均值 个案数 标准偏差 平均值标准误差
Control 90.267 6 10.681 4.360
SD6-0.25组 121.000 6 6.870 2.805
SD6-1组 143.167 6 9.538 3.894
SD6-4组 122.333 6 22.456 9.168
Heparin-1000U/kg 169.000 6 10.412 4.250
总计 129.153 30 29.232 5.337
由图12和表11可知，光化学诱导的血栓形成第1天出现了严重的血栓形成和脑组织损伤，这可能是由于脑内炎症和随后的凝血级联激活阻碍了颅内损伤的修复，但SD6和肝素钠减轻了这些影响，并加速了第4天的血流恢复。虽然与对照组(90.27±4.36)相比，SD6处理组在第4天的血流恢复情况有所改善，0.25mg/kg为121±2.8，1mg/kg为143.17±3.89，4mg/kg为122.33±9.17，但肝素处理组(1000U/kg)的恢复情况更好，为169±4.25。尽管进行了这些比较，但仍无法进行精确的定量分析，以评估对脑组织恢复的影响。总体而言，SD6在减少血栓形成和血栓恶化进展方面表现出积极作用。
实施例7
SD6对tMCAO脑缺血损伤的影响
(1)将8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为阳性对照(Ecallantide-4mg/kg)组、阴性对照(Control)组、SD6-0.25组、SD6-1组和SD6-4组5组，每组6～8只，对每只小鼠进行如下操作：将小鼠麻醉并固定在37℃恒温垫上，解剖右侧CCA、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。捆绑右侧ECA的上端，将栓线(直径0.23±0.02mm，中国CNONTECH)向下穿过ECA并引导进入ICA，闭塞MCA。MCAO后50分钟，按照下述方式处理：
阳性对照(Ecallantide-4mg/kg)组：静脉注射4mg/kg Ecallantide(MCE，美国)；
阴性对照(Control)组：静脉注射200μLPBS；
SD6-0.25组：静脉注射0.25mg/kg SD6；
SD6-1组：静脉注射1mg/kg SD6；
SD6-4组：静脉注射4mg/kg SD6；
静脉注射过10min后，缓慢抽出栓线以进行血液再灌注。如果小鼠在tMCAO后24h内死亡或手术持续时间超过15min，则将其排除在终点分析之外。
为了评估tMCAO术后24小时的神经功能和梗塞大小，首先对小鼠进行Bederson评分和抓力测试，结果如图13和表12～表13所示，其中A为抓力测试结果，B为Bederson评分结果。
Bederson神经功能评分标准如下：0分，无行为障碍；1分，右前肢不能伸展；2分，向右旋转；3分，向右倾斜；4分，无自主活动，伴有意识障碍；5分，死亡。
抓力测试：使用抓力计(DS2-50N，Sansbio，中国)按照制造商的说明检测。
表12抓力测试结果
组别 平均值 个案数 标准偏差 平均值标准误差
Control 98.667 6 19.253 7.860
SD6-4组 160.625 8 28.086 9.930
SD6-1组 154.625 8 30.425 10.757
SD6-0.25组 140.286 7 34.067 12.876
Ecallantide-4mg/kg 168.375 8 29.554 10.449
总计 147.108 37 36.082 5.932
表13Bederson评分
图13和表12～表13的结果显示，与对照组(98.67±7.85gf)相比，0.25mg/kg SD6处理组小鼠(140.29±12.88gf)、1mg/kg SD6处理组小鼠(154.63±10.76gf)和4mg/kg SD6处理组小鼠(160.63±9.93gf)和4mg/kg Ecallantide处理组小鼠(168.38±10.45gf)的握力显著增加(图13中A)。并且低剂量(0.25mg/kg)SD6组与高剂量(4mg/kg)Ecallantide组之间没有显著差异(p＝0.071)，表明疗效较阳性对照更佳(图13中A)。此外，1mg/kg SD6组和4mg/kg SD6组小鼠的Bederson神经功能评分(分别为1.22±0.55和1.44±0.58)以及4mg/kg Ecallantide组小鼠的Bederson神经功能评分(1.33±0.58)均低于对照组(3.33±0.5)，显示小鼠的神经功能恢复(图13中B)。
(2)Bederson评分和抓力测试结束后，处死小鼠，用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)对脑切片进行染色，具体的：小鼠安乐死后，立即取出完整的大脑并在-20℃的环境中放置3min。随后，使用小鼠脑切片模具(HarvardApparatus,Holliston,MA,USA)切2毫米厚的冠状切片。这些切片用2％TTC(T-8877，Sigma-Aldrich，美国)染色，并在37℃孵育20min后成像，用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)按照下述公式计算脑梗塞体积，结果如图14所示和表14所示。
脑梗塞体积(V)＝Sd/T2，其中，S代表梗死面积，d代表厚度，T代表线性放大倍数。
表14tMCAO小鼠脑缺血再灌注梗死面积
组别 平均值 个案数 标准偏差 平均值标准误差
Control 32.968 6 12.679 5.176
SD6-4组 11.438 8 6.167 2.180
SD6-1组 17.051 8 6.040 2.135
SD6-0.25组 23.179 7 10.424 3.940
Ecallantide-4mg/kg 15.604 8 8.536 3.018
Sham 4.591 7 1.776 0.671
总计 16.931 44 11.457 1.727
由图14和表14可知，小鼠脑切片的TTC染色的梗塞面积(白色区域)结果显示。4mg/kg SD6治疗组(11.43％±2.18％)与假手术组(4.59％±0.67％)相比无显著差异(p＝0.112)，且比4mg/kg Ecallantide阳性药治疗组(15.6％±3.02％)更有效，这表明SD6对脑组织有实质性保护作用。
(3)另取一部分脑组织样本称干湿重量以确定脑含水量或经过匀浆处理后，通过酶联免疫分析(ELISA)IL-1β、IL-6和TNF-α含量，并采用伊文思蓝染色分析SD6注射后tMCAO小鼠的血脑屏障功能。结果如图15～图17和表15～表17所示所示。
ELISA：IL-6(DG30062M)、IL-1β(DG30045M)和TNF-α(DG30048M)的ELISA检测均使用商品化试剂盒(Dogesce，中国)，按照说明书进行。
伊文思蓝染色：为了评估SD6对血脑屏障的保护作用，小鼠在tMCAO手术后立即注射200μL0.5％伊文思蓝染色液(R20616，中国原野生物科技有限公司)，24h后处死。脑切片成像后匀浆，用酶标仪在650nm下定量分析上清液，成像结果如图17中A所示，酶标仪在650nm下定量分析的结果如图17中B所示。
表15tMCAO小鼠脑内1L1b释放量
组别 平均值 个案数 标准偏差 平均值标准误差
Control 125.167 6 14.508 5.923
SD6-4组 84.900 8 8.291 2.931
SD6-1组 86.950 8 9.144 3.233
SD6-0.25组 88.257 7 16.382 6.192
Ecallantide-4mg/kg 100.775 8 15.919 5.628
Sham 60.250 6 15.317 6.253
总计 90.960 43 22.146 3.377
表16tMCAO小鼠脑内IL6释放量
组别 平均值 个案数 标准偏差 平均值标准误差
Control 182.000 6 31.061 12.681
SD6-4组 91.500 8 28.097 9.934
SD6-1组 80.500 8 17.881 6.322
SD6-0.25组 115.143 7 16.382 6.192
Ecallantide-4mg/kg 100.775 8 15.919 5.628
Sham 60.250 6 15.317 6.253
总计 90.960 43 22.146 3.377
表17tMCAO小鼠脑内TNFα释放量
组别 平均值 个案数 标准偏差 平均值标准误差
Control 149.750 6 21.538 8.793
SD6-4组 54.750 8 14.587 5.157
SD6-1组 71.250 8 18.889 6.678
SD6-0.25组 84.429 7 32.121 12.141
Ecallantide-4mg/kg 117.125 8 30.736 10.867
Sham 24.200 6 12.982 5.300
总计 83.249 43 44.787 6.830
表18tMCAO小鼠脑切片伊文思蓝染色量
表19tMCAO小鼠脑含水量
组别 平均值 个案数 标准偏差 平均值标准误差
Control 87.210 7 1.532 0.579
SD6-4组 81.703 8 1.451 0.513
SD6-1组 83.119 7 0.967 0.365
SD6-0.25组 84.630 7 1.091 0.412
Ecallantide-4mg/kg 82.630 8 1.665 0.589
Sham 79.872 6 1.118 0.456
总计 83.223 43 2.587 0.395
由图15和表15～表17可知，tMCAO手术后24小时，小鼠脑内炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α升高，但静脉注射SD6后，炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α显著降低；可见SD6还可减轻tMCAO脑内炎症和脑水肿，并保护血脑屏障。
再灌注损伤会加剧炎症，并可能导致血栓的进一步形成。tMCAO小鼠大脑中炎症和血栓的相互恶化加剧了脑水肿和BBB破坏。作为一种PKa活性抑制剂，SD6具有相当大的治疗潜力，静脉注射0.25、1和4mg/kg的剂量可使脑水含量分别减少1.5、2.3和4倍(图16、表19)；伊文思蓝染色量分别减少1.9、4.6和15.4倍(图17中A～B、表18)。1mg/kg SD6处理组的脑含水量(p＝0.18)和伊文思蓝染色量(p＝0.52)与4mg/kg Ecallantide处理组相当。这些研究结果表明，SD6通过抑制炎症和血栓形成来保护小鼠免受tMCAO的影响，突出了其作为缺血性脑卒中的治疗剂的潜力。
由上述实施例可知，CW15和SD6能有效抑制PKa活性，进而达到抗血栓炎症的效果。在体外，SD6能延长血浆复钙时间和活化部分凝血活酶时间，对内在凝血途径具有特异性抑制作用。在0.25～4mg/kg的剂量范围内，SD6可减轻FeCl3诱导和光化学诱导小鼠的动脉血栓和皮层静脉血栓形成，且不影响出血。此外，SD6还减轻了短暂性脑中动脉闭塞缺血性脑卒中小鼠模型中的脑炎症损伤和脑水肿。表明本发明所提供的抗凝多肽具有良好的抗炎性血栓和脑卒中药物活性作用，且具有低出血风险和低细胞毒性，安全性较高。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种抗凝多肽，其特征在于，所述抗凝多肽包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗凝多肽，其特征在于，所述抗凝多肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.2和SEQ ID No.1所示。
3.权利要求1或2所述的抗凝多肽在制备血浆激肽释放酶活性抑制剂中的应用。
4.权利要求1所述的抗凝多肽在制备治疗血浆激肽释放酶和炎症通路相关的精神疾病产品中的应用。
5.权利要求1所述的抗凝多肽在制备抗炎产品中的应用。
6.权利要求1所述的抗凝多肽在制备抗血栓产品中的功能应用。
7.权利要求1所述的抗凝多肽在制备抗脑卒中产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述脑卒中包括缺血性脑卒中和/或出血性脑卒中。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述缺血性脑卒中包括血栓性脑梗塞、栓塞性脑梗塞、腔隙性脑梗塞、多发性脑梗塞和短暂性脑缺血发作中的一种或多种。
10.一种抗脑卒中的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括权利要求1或2所述的抗凝多肽，以抗凝多肽的用量计，所述药物在人体的用量为0.027～0.444mg/kg。
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