CN118574647A - 内出血的检测和定位 - Google Patents

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CN118574647A CN202380018139.6A CN202380018139A CN118574647A CN 118574647 A CN118574647 A CN 118574647A CN 202380018139 A CN202380018139 A CN 202380018139A CN 118574647 A CN118574647 A CN 118574647A
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杰瑞·罗克
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Abstract

用于在活动性或非活动性出血期间检测和定位内出血如胃肠道出血的系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，该系统、方法和试剂盒利用单光子发射计算机断层扫描(SPECT)示踪剂。用于制备靶向血管中的损伤部位的锝‑99m(99mTc)标记组合物的试剂盒，其包含：‑缀合的人纤维蛋白原，其中所述人纤维蛋白原与螯合剂键合，所述螯合剂选自二乙烯三胺五乙酸(DTPA)二酐。

Description

内出血的检测和定位
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年1月12日提交的美国临时申请第63/298,911号的优先权和权益，其全部内容在此通过引用并入。
联邦政府资助的研究或开发
本发明是在政府支持下完成的，合同编号为1R41DK106779-01A1，由美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所授予。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本公开的主题总体涉及用于对受试者的内出血进行成像的医疗诊断工具。具体而言，本公开的主题的某些实施方案涉及用于检测和定位胃肠道出血(即使在最小出血发作期间)的系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，系统、方法和试剂盒利用有效的单光子发射计算机断层扫描(SPECT)示踪剂。
背景技术
胃肠道(GI)出血是美国的一个重大医疗问题。美国每年约有500,000人因胃肠道出血(包括上消化道和下消化道)住院，每年导致数百亿美元的医疗支出[1]。尽管由于医学和内窥镜疗法的进步，过去二十年来胃肠道出血的死亡率已显著下降，但研究仍报告上消化道和下消化道出血的死亡率高达10％(即每年50,000名患者)[2,3]。
下消化道出血的定位难度极大。事实上，目前用于诊断和定位胃肠道出血的测试大约有50％的几率失败。现有技术之所以出现此类失败，是因为单个部位的出血经常会多次停止和重新开始[2]，而现有的测试要求测试时的出血率达到最低。
根据初步临床评估，如果怀疑是下消化道出血，现行美国胃肠病学会指南[4]建议进行诊断性结肠镜检查以识别出血部位。同样，如果怀疑是上消化道出血，则开具诊断性内窥镜检查[5]。然而，结肠镜检查和内窥镜检查通常无法得出结论，因为如上所述，消化道出血非常不稳定——在活动性出血和暂时性止血之间摇摆不定[2]。消化道出血的这一特点使其能够逃避目视检查。
即使是活动性出血也常常无法通过目视方法检测到，这是由于其他混杂问题，包括肠道准备不充分和成像时机(充分的肠道准备可能需要超过24小时)[6]。
胃肠道出血分为显性、隐性或隐匿性。显性胃肠道出血是可见的(例如，血性呕吐物、便血和黑便)，而隐匿性胃肠道出血是指无法通过上消化道内窥镜检查、结肠镜检查或小肠造影确定出血来源的复发性出血。隐匿性出血可以是显性的，也可以是隐匿性的，其中隐匿性出血对于患者或医生来说是不可见的。
美国胃肠病学会定义的当前护理标准涉及上消化道内窥镜检查或结肠镜检查，分别作为UGIB和LGIB的一线诊断。当内窥镜检查或结肠镜检查结果不确定或不可行时，可以使用二线诊断技术。这些包括对比血管造影(contrast angiography)和/或锝标记红细胞等药剂(即红细胞闪烁显像)，或与下面竞争部分中描述的影像学模态结合使用的其他诊断示踪剂。然而，所有这些技术都要求出血在检查时处于活动状态以便准确检测。此外，同意依赖于单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像进行读出的标记红细胞扫描曾经是一种常用的技术，但由于无法检测非活动性出血，现已失宠，当前指南不再推荐使用。
缺乏准确、非侵入性和快速的胃肠道出血部位定位方法导致每年发生多达50,000例原本可以避免的死亡。此外，缺乏提供快速、明确诊断的工具会导致不必要的额外检测、延长住院时间并增加再次出血的风险。
一旦找到出血部位，治疗干预(例如内镜止血)通常很简单[7]。然而，准确及时地定位出血部位仍然是有效治疗和降低胃肠道出血相关死亡率的主要未满足的医疗需求。
因此，本领域仍然需要能够准确快速地诊断和定位活动性和非活动性出血(如发生在胃肠道系统中的出血)的技术。
发明内容
本文公开了用于制备靶向血管中的损伤部位的锝-99m(99mTc)标记组合物的试剂盒。例如，所述试剂盒可以包含人纤维蛋白原；选自二乙烯三胺五乙酸(DTPA)二酐、p-SCN-Bz-DTPA、HYNIC及其组合的螯合剂；以及还原剂。所述试剂盒可以包含缀合的人纤维蛋白原，其中所述人纤维蛋白原与螯合剂键合，所述螯合剂选自二乙烯三胺五乙酸(DTPA)二酐、p-SCN-Bz-DTPA、HYNIC及其组合；以及还原剂。
还公开了用于制备靶向血管中的损伤部位的锝-99m(99mTc)标记纤维蛋白原组合物的方法，其包括使用本文公开的试剂盒制备或提供缀合的人纤维蛋白原和还原剂；将所述缀合的人纤维蛋白原与含99mTc的溶液合并，其中所述还原剂在所述含99mTc的溶液之前、之后或同时与所述缀合的人纤维蛋白原合并；温育所合并的缀合的人纤维蛋白原、还原剂和含99mTc的溶液，以得到所述99mTc标记纤维蛋白原组合物；以及任选地检查所述99mTc标记纤维蛋白原组合物的放射化学纯度。还公开了根据这些方法制备的组合物。
还公开了用于检测受试者的内出血部位的方法，其包括向所述受试者施用本文公开的放射性药物组合物，以及对所述受试者的感兴趣区域进行成像，从而检测所述受试者的所述内出血部位。
附图说明
本发明的新颖特征在随附权利要求中具体阐述。通过参考陈述说明性实施方案的以下详细描述和附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在该说明性实施方案中采用了本发明的原理，在附图中：
图1A包括第一批(201022)制备的99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原在30分钟平衡柱后注入20uL(108uCi)的HPLC色谱图，其中顶部色谱图为UV吸光度(mAU)，而底部色谱图为放射活性(mV)。
图1B包括第一批(201023)制备的99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原在30分钟平衡柱后注入50uL(210uCi)的HPLC色谱图，其中顶部色谱图为UV吸光度(mAU)，而底部色谱图为放射活性(mV)。
图1C包括第一批(201027)制备的99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原在30分钟平衡柱后注入40uL(323uCi)的HPLC色谱图，其中顶部色谱图为UV吸光度(mAU)，而底部色谱图为放射活性(mV)。
图2A包括给大鼠#1注射99mTc-纤维蛋白原后30分钟获取的代表性SPECT/CT图像。
图2B包括给大鼠#2注射99mTc-纤维蛋白原后1小时获取的代表性SPECT/CT图像。
图2C包括注射99mTc-O3作为对照化合物2小时后获取的大鼠的代表性SPECT/CT图像。
图3A包括注射99mTc-纤维蛋白原后获取的大鼠的代表性轴向SPECT/CT图像。
图3B包括注射99mTc-纤维蛋白原后获取的大鼠的代表性冠状SPECT/CT图像。
图3C包括注射99mTc-纤维蛋白原后获取的大鼠的代表性矢状SPECT/CT图像。
图3D包括注射99mTcO4作为对照化合物后获取的大鼠的代表性轴向SPECT/CT图像。
图3E包括注射99mTcO4作为对照化合物后获取的大鼠的代表性冠状SPECT/CT图像。
图3F包括注射99mTcO4作为对照化合物后获取的大鼠的代表性矢状SPECT/CT图像。
图4A包括在患有胃损伤的大鼠中注射99mTc-纤维蛋白原后获取的轴向SPECT/CT图像。
图4B包括在患有胃损伤的大鼠中注射99mTc-纤维蛋白原后获取的冠状SPECT/CT图像。
图4C包括在患有胃损伤的大鼠中注射99mTc-纤维蛋白原后获取的矢状SPECT/CT图像。
图4D包括在正常大鼠中注射99mTc-纤维蛋白原后获取的轴向SPECT/CT图像。
图4E包括在正常大鼠中注射99mTc-纤维蛋白原后获取的冠状SPECT/CT图像。
图4F包括在正常大鼠中注射99mTc-纤维蛋白原后获取的矢状SPECT/CT图像。
图4G包括在接受过假手术的大鼠中注射99mTc-纤维蛋白原后获取的轴向SPECT/CT图像。
图4H包括在接受过假手术的大鼠中注射99mTc-纤维蛋白原后获取的冠状SPECT/CT图像。
图4I包括在接受过假手术的大鼠中注射99mTc-纤维蛋白原后获取的矢状SPECT/CT图像。
图5包括如表11中所述，对取自具有胃损伤或假损伤的大鼠的器官进行的离体SPECT/CT成像的结果。标签表示大鼠编号，后跟I代表损伤、C代表对照、L代表肝脏，而K代表肾脏。
图6包括对取自正常健康大鼠的器官的离体分析的结果，这些大鼠在抵达后立即(黑色条)或在抵达后3小时(阴影条)注射99mTc-纤维蛋白原。大鼠在注射放射性示踪剂后1小时被安乐死。*从肾脏获得的计数高于伽马计数器的范围。
图7A显示在胃黏膜胃损伤模型中注射250μCi 99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的大鼠的代表性SPECT/CT图像。
图7B显示在结肠损伤模型中注射250μCi 99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的大鼠的代表性SPECT/CT图像。
图7C显示在假手术中注射250μCi 99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的大鼠的代表性SPECT/CT图像。
图8显示在5分钟预处理时间的情况下注射250μCi 99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的大鼠的SPECT/CT图像的标准摄取值(SUV)。
图9A显示在假手术中注射250μCi 99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的大鼠的代表性SPECT/CT图像。
图9B显示在假手术中注射250μCi 99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的大鼠的代表性SPECT/CT图像。
图9C显示在结肠损伤模型中注射250μCi 99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的大鼠的代表性SPECT/CT图像。
图9D显示在结肠损伤模型中注射250μCi 99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的大鼠的代表性SPECT/CT图像。
图10显示在5分钟预处理时间的情况下注射250μCi 99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的大鼠的SPECT/CT图像的标准摄取值(SUV)。
具体实施方式
本文件中阐述了本公开的主题的一个或多个实施方案的细节。在研究了本文件中提供的信息之后，本领域的普通技术人员将明白对本文件中描述的实施方案和其他实施方案的修改。本文件中提供的信息，特别是所述示例性实施方案的具体细节，主要是为了清晰理解，不应由此理解不必要的限制。如有冲突，以本文件的说明书(包括定义)为准。
本公开的主题包括用于准确快速地诊断和定位活动性和非活动性内出血如胃肠道(GI)出血的系统、方法和试剂盒。
本公开的主题的一些实施方案包括用于诊断和定位活动性和非活动性内出血如胃肠道(GI)出血的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒可以包括纤维蛋白原，该纤维蛋白原已被改性以利于用锝-99m(99mTC)进行稳定和有效的标记。该试剂盒可以由医学领域的普通技术人员使用，例如，由放射性药物部门根据治疗疑似患有内出血如胃肠道出血的受试者的医生的医嘱使用。
在本公开的主题的一些实施方案中，提供了一种方法和/或试剂盒，用于合成纤维蛋白原放射性药物组合物，该组合物包括锝-99m(99mTc)、纤维蛋白原和螯合剂，如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)二酐、p-SCN-Bz-DTPA或HYNIC，其连接99mTc和纤维蛋白原。例如，提供了一种方法和/或试剂盒，用于合成纤维蛋白原放射性药物组合物，该组合物包括纤维蛋白原，例如GMP产生的人类纤维蛋白原，其用螯合剂如DTPA二酐、p-SCN-Bz-DTPA或HYNIC来共价修饰。可以使用氯化亚锡(SnCl2)修饰缀合的纤维蛋白原以加入99m-锝。
99mTc是锝-99的亚稳态核异构体，可用作放射活性示踪剂，并且可以通过目前可用的医疗设备(例如伽马照相机)在体内检测到。99mTc具有相对较短的半衰期，并且仅在受试者(例如人类受试者)中停留约24小时，从而允许进行医学扫描过程和数据收集，同时迅速分散以最大限度地减少受试者的辐射暴露。
纤维蛋白原是一种糖蛋白复合物。在组织和血管损伤期间，它转化为纤维蛋白，然后转化为基于纤维蛋白的血凝块。纤维蛋白凝块主要起闭塞血管以止血的作用。在本公开的主题中，纤维蛋白原可以用作靶向剂，将组合物引导至受伤血管的部位。如本领域技术人员所知，螯合剂是与金属离子反应形成稳定复合物的化合物。例如，DTPA二酐、p-SCN-Bz-DTPA和HYNIC是99mTc的高亲和力螯合剂，并且可用于将纤维蛋白原与99mTc连接，以产生具有靶向组分和放射性示踪剂组分的组合物。
一旦合成，该组合物即可用于施用。例如，可以将该组合物注射到受试者体内。一旦注射到受试者体内，纤维蛋白原组分就会将组合物靶向损伤部位，并在那里积聚。
然后，受试者可以经历成像，如单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像。99mTc纤维蛋白原放射性药物组合物允许对积聚的组合物进行成像，从而揭示活动性或非活动性出血的部位，如胃肠道出血。
在本公开的主题的一些实施方案中，提供了用于制备纤维蛋白原放射性药物组合物的系统、方法和试剂盒，该组合物包括纤维蛋白原、螯合剂和锝-99m(99mTc-缀合-纤维蛋白原)，作为粘附凝块的一部分积聚在受伤的血管壁上，并且该组合物可用于定位出血部位，即使在出血停止后也是如此。例如，可以使用美国食品药品监督管理局(FDA)批准的纤维蛋白原源来制备该组合物。例如，可以将该组合物与既有的成像技术如SPECT成像一起使用。
纤维蛋白原放射性药物组合物
公开了一种纤维蛋白原放射性药物组合物，其包含(i)生物相容性载体中的放射性标记纤维蛋白原；(ii)还原剂；(iii)缓冲剂；和(iv)螯合剂。
术语“放射性药物”是核医学领域技术人员所熟知的术语。大多数放射性药物用于体内成像，并且包括具有适合检测的发射的放射性核素，通常是通过单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)进行检测。这种放射性核素与生物相容性载体一起以适合哺乳动物施用的形式形成“放射性药物组合物”。有关放射性药物的概述，请参阅“放射性药物手册(Handbook of Radiopharmaceuticals)”(Welch&Redvanly，Eds.Wiley2003)。
如本文所用，术语“纤维蛋白原”是指通过凝血酶的作用转化为纤维蛋白的蛋白质，尤其是在血凝块形成过程中。纤维蛋白原可以是人类产生的天然物质。还包括从动物(包括但不限于大鼠、小鼠、猪、绵羊、山羊、马、狗或猴)分离的纤维蛋白原。纤维蛋白原还可以是由重组宿主如重组细菌从动物(包括但不限于人类、大鼠、小鼠、猪、绵羊、山羊、马、狗或猴)的纤维蛋白原编码序列产生的重组产物。例如，人纤维蛋白原可从转基因动物的体液，特别是乳汁中分离。参见例如美国专利第5,639,940号。纤维蛋白原还包括天然存在的纤维蛋白原的任何结构和/或功能衍生物，如纤维蛋白原的片段或化学修饰的纤维蛋白原，其保持纤维蛋白原的生物活性。
可通过本领域已知的方法产生用于所公开的系统、方法和试剂盒中的纤维蛋白原，例如，如美国专利第9,371355、9,938,318、10,112,972和11,401,300号中所述，所有这些专利均通过引用并入本文。在一个实施方案中，纤维蛋白原是人纤维蛋白原。有多种血浆来源的人类纤维蛋白原浓缩物可供使用，并且可用于本公开内容，如以以下商标出售的那些：(Octapharma AG,Lachen,Switzerland)、P(CSL Behring GmbH,Marburg,Germany),(LFB,Les Ulis,France)、FIBRINOGEN HT(Benesis,Osaka,Japan)、FIBRORAAS(Shanghai RAAS,Shanghai,China)和GCC-FIBRINOGEN。参见，例如，[23-24]。例如，人纤维蛋白原可以是以商标出售的用于静脉注射的重构的冻干粉末，其中标称组合物为20mg/mL人纤维蛋白原、6mg/mL氯化钠、1.5mg/mL柠檬酸钠二水合物、10mg/mL甘氨酸和10mg/mL L-精氨酸盐酸盐。人纤维蛋白原可以符合美国食品药品管理局的优质生产规范(Good Manufacturing Practice)(GMP)指南。参见21C.F.R.§§210-211。
所公开的系统、方法和试剂盒中有用的纤维蛋白原可含有其他组分，如杂质或赋形剂。纤维蛋白原还可包含例如氯化钠、柠檬酸钠二水合物、柠檬酸钠、氢氧化钠、盐酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、纤连蛋白、血管性血友病因子(VWF)、玻璃粘连蛋白、白蛋白、因子XIII、D-二聚体、纤维蛋白肽A、纤溶酶原或其组合。在一些实施方案中，人纤维蛋白原中可能没有可检测的玻璃粘连蛋白。纤维蛋白原中纤维蛋白肽A的浓度可能低于人血浆的极限(小于约7.6ng/mL)。在另一实施方案中，纤维蛋白原中的纤连蛋白浓度可能低于人血浆中的浓度(约300μg/mL)。在另一实施方案中，纤维蛋白原中的VWF浓度可以等于或低于人血浆中的浓度(约0.36至约1.57U/mL)。
纤维蛋白原可以基本上不含白蛋白。本文使用的短语“基本上不含”是指纤维蛋白原中白蛋白的含量显著降低，例如，白蛋白未加入纤维蛋白原中，但可能以其他方式存在，如杂质或污染物。在一些实施方案中，纤维蛋白原可含有少于50％(w/w)、.01至40％(w/w)、.01至30％(w/w)、.01至20％(w/w)、.01至10％(w/w)、.01至5.0％(w/w)、.50至3.0％(w/w)或约1.9％的白蛋白。在一些实施方案中，纤维蛋白原可含有.001至9.00mg/mL、.001至5.00mg/mL、.001至1.00mg/mL、.100至1.00mg/mL或约0.42mg/mL的白蛋白。
纤维蛋白原可以含有因子XIII，其为在血浆中循环的蛋白质复合物，活性为0.77-1.69U/mL(平均值1.2±0.3U/mL)。纤维蛋白原中的因子XIII活性可以等于或高达人血浆中的活性的2、3、4或5倍。在一个实施方案中，纤维蛋白原中的因子XIII活性为人血浆中的活性的2至4倍。
纤维蛋白原可以以5.0至15mg/mL的浓度用于纤维蛋白原放射性药物组合物中。例如，浓度可以是5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、13、14或15mg/mL。在一个实施方案中，纤维蛋白原在纤维蛋白原放射性药物组合物中的浓度为10mg/mL。
纤维蛋白原可以用放射性核素例如55Co、64Cu或99mTc标记。在一个实施方案中，纤维蛋白原用99mTc标记。因此，在一个实施方案中，纤维蛋白原放射性药物组合物包括(i)生物相容性载体中的99mTc标记的纤维蛋白原；(ii)还原剂；(iii)缓冲剂；和(iv)螯合剂。
“生物相容性载体”是一种流体，尤其是液体，放射性药物悬浮或溶解在其中，使得该组合物在生理上可耐受，即可以在没有毒性或过度不适的情况下施用。生物相容性载体适宜地是可注射载体液体，如无菌、无热原注射用水。生物相容性载体还可以是一种或多种张力剂的水溶液，如具有生物相容性反离子的血浆阳离子的盐(例如氯化钠、氯化钾)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇、甘露醇、肌醇)、乙二醇(例如甘油)或其他非离子多元醇材料(例如聚乙二醇、丙二醇等)。生物相容性载体还可以包括生物相容性有机溶剂，如乙醇。此类有机溶剂可用于溶解更亲脂的化合物或制剂。
在一个实施方案中，生物相容性载体是无热原注射用水或等渗盐水。在另一实施方案中，生物相容性载体包括水性溶剂。在又一实施方案中，生物相容性载体包括等渗盐水溶液。例如，在纤维蛋白原放射性药物组合物中可以使用浓度为0.02至0.2M或0.03至0.07M的氯化钠。
如本文所用，“还原剂”是一种与放射性核素(该化合物通常作为相对不活跃的高氧化态化合物获得)反应的化合物，以通过将电子转移给放射性核素来降低其氧化态，从而使其更具活性，该化合物在所需剂量下无毒，因此适合施用于哺乳动物身体，尤其是人体。可用于纤维蛋白原放射性药物组合物的还原剂包括但不限于氯化亚锡、酒石酸亚锡、氟化亚锡、磷酸亚锡、甲脒亚磺酸、连二亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、半胱氨酸、膦和亚铜盐。在一个实施方案中，还原剂是亚锡盐，如氯化亚锡或酒石酸亚锡。
还原剂可以以1至10mM、2至8mM、3至6mM或4至5mM的浓度存在于组合物中。还原剂如氯化亚锡可以以例如4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5mM的浓度存在。
所公开的纤维蛋白原放射性药物组合物可包含至少一种螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、DTPA二酐、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)、反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CDTA)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、二乙烯三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、N-羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、N-羟乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)、五钠五乙酸、喷替酸、二羟乙基甘氨酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸及其类似物，包括DTPA的衍生物，包括环己烷-1,2-二胺-N,N,N',N'-四乙酸酯(CHX-DTPA)、对异硫氰酸苄基二乙烯三胺五乙酸(p-SCN-Bz-DTPA)、二乙烯三胺-N,N,N”,N”-四叔丁基乙酸酯-N'-乙酸(Tetra-t-Bu-DTPA)、DTPA的活化酯，以及其他双功能螯合剂，包括1,4-甲基-苄基异硫氰酸酯二乙烯三胺五乙酸(111In-MX-DTPA)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)和DOTA类似物，如DOTA-NHS-酯、DOTA的其他活化酯、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)。其他有用的螯合剂可以包括6-肼基烟酰胺(HYNIC)、葡萄糖酸钠、潘地肽和巯基乙酰三甘氨酸(MAG3)。螯合剂可以以其酸形式使用，但也可以以其盐之一使用，例如DTPA的钙和/或锌三钠盐、依地酸二钠钙、依地酸二钠、依地酸钠、依地酸三钠、依地酸二钾、抗坏血酸钠和5-磺基水杨酸钠。在一个实施方案中，放射性药物组合物含有DTPA二酐。在另一实施方案中，放射性药物组合物含有p-SCN-Bz-DTPA。在又一实施方案中，放射性药物组合物含有HYNIC。螯合剂，如DTPA二酐、p-SCN-Bz-DTPA或HYNIC，可以以1至5μm的浓度存在，或以3.5μm的浓度存在。在一些实施方案中，螯合剂，如DTPA二酐、p-SCN-Bz-DTPA或HYNIC与纤维蛋白原的摩尔比为1:1至30:1。例如，螯合剂如DTPA二酐、p-SCN-Bz-DTPA或HYNIC与纤维蛋白原的摩尔比可以为约1:1、5:1、10:1、12:1或30:1。放射性药物组合物的“纤维蛋白原”和“螯合剂”可以是分开的，纤维蛋白原和螯合剂之间可以存在螯合键，或者两者兼而有之。在整个公开内容中单独使用这些术语并不意味着排除放射性药物组合物中纤维蛋白原和螯合剂之间存在的螯合键。
所公开的纤维蛋白原放射性药物组合物还可以任选地包含至少一种抗氧化剂。“抗氧化剂”是指保护活性成分不与氧反应的任何化合物。抗氧化剂包括但不限于抗坏血酸、5-磺基水杨酸、龙胆酸、腈乙酸酯(NTA)、亚硫酸盐、蛋氨酸、NAC、谷胱甘肽、硫辛酸、丁羟甲苯(BHT)和半胱氨酸。在一个实施方案中，放射性药物组合物含有抗坏血酸。抗氧化剂如抗坏血酸可为5至40mM的浓度，或为20mM的浓度。
纤维蛋白原放射性药物组合物还可以含有缓冲剂，以确保维持最佳pH，以实现(i)纤维蛋白原的99mTc放射性标记，(ii)重构后稳定性和/或(iii)患者施用的适宜性。放射性药物组合物优选配制为使得溶液在水或盐水中的pH为约生理pH，如pH为7.0至8.6或7.4至8.0。在一个实施方案中，放射性标记的纤维蛋白原组合物的pH为7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。
合适的缓冲剂包括但不限于药学上可接受的缓冲剂，如磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、三羟甲基甲基甘氨酸、TRIS、醋酸盐缓冲剂、盐酸，以及药学上可接受的碱，如碳酸钠、碳酸氢钠、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、二乙醇胺或其混合物。在一个实施方案中，纤维蛋白原放射性药物组合物包含浓度为0.025至0.2M、pH为7.0至8.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在另一实施方案中，PBS的浓度为0.08至0.12M、pH为7.4至8.0。
放射性药物组合物可任选地进一步包括至少一种药物赋形剂，如冻干助剂、稳定助剂、增溶剂、抑菌剂或其组合。用于制备放射性药物组合物的冻干助剂包括但不限于无机盐，如氯化钠和水溶性糖或糖醇，如甘露醇、麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇、葡聚糖、Ficoll和聚乙烯吡咯烷(PVP)。用于制备放射性药物组合物的稳定助剂包括但不限于抗坏血酸、半胱氨酸、单硫代甘油、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、龙胆酸和肌醇。可用于制备放射性药物组合物的增溶剂包括但不限于环糊精(例如羟丙基-β-环糊精或磺丁基醚β-环糊精)、乙醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯、聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)嵌段共聚物(Pluronics)和卵磷脂。可用于制备放射性药物组合物的抑菌剂包括但不限于苯甲醇、苯扎氯铵、氯丁醇、苯醇和对羟基苯甲酸的甲酯、丙酯或丁酯。
当将放射性药物组合物施用于受试者时，所使用的合适放射活性量为每70公斤体重5至50mCi，或每70公斤体重10至20mCi。
示例性纤维蛋白原放射性药物组合物可使用以下组分制备：
或
诊断试剂盒和施用
还公开了用于制备纤维蛋白原放射性药物组合物的非放射活性试剂盒，所述试剂盒包括至少一个合适的容器，该容器中装有制剂，所述制剂包括：(i)纤维蛋白原，(ii)还原剂，(iii)缓冲剂；和(iv)螯合剂。关于试剂盒，术语“纤维蛋白原”、“还原剂”、“缓冲剂”、“螯合剂”及其示例如上文对放射性药物组合物的定义。此外，如上文对放射性药物组合物所述，试剂盒的“纤维蛋白原”和“螯合剂”可以是分开的，纤维蛋白原和螯合剂之间可以存在螯合键，或者两者兼而有之。在整个公开内容中单独使用这些术语并不意味着排除试剂盒中纤维蛋白原和螯合剂之间存在的螯合键。
试剂盒中使用的“合适容器”是指不与放射性药物制剂的任何组分发生相互作用、允许维持无菌完整性、另外允许惰性顶部气体(例如氮气或氩气)进入、同时还允许通过注射器添加和抽取溶液的容器。这种容器可以是液密安瓿和小瓶，密封由液密或气密闭合件(如盖子、塞子或隔膜)提供。在一个实施方案中，这种容器是隔膜密封的小瓶，其中气密闭合件用外密封件(通常为铝)压接。这种容器具有额外的优点，即闭合件可以承受真空(如果需要)，例如以改变顶部气体或脱气溶液，并且可以承受过压，例如以有助于从容器取出溶液。气密密封件适合用皮下注射针头穿刺。在一个实施方案中，这种容器是药用级小瓶。小瓶可适当地由药用级材料如玻璃或塑料制成。容器的玻璃可任选地被涂覆以抑制玻璃中的可浸出物，如用二氧化硅(SiO2)涂覆。
在一个实施方案中，试剂盒的容器设有适合用皮下注射针头刺穿同时保持密封完整性的闭合件。闭合件可在其与容器内容物接触的表面上涂覆，例如用乙烯-四氟乙烯共聚物(ETFE)或其改性版本涂覆。闭合件与其上的涂层不同，其可以由合成的弹性聚合物制成。闭合件可以由例如氯化或溴化丁基橡胶或氯丁橡胶制成，因为此类聚合物具有低氧渗透性。在一个实施方案中，闭合件由氯化丁基橡胶制成。
非放射活性试剂盒可任选地进一步包括附加组分，如至少一种药用赋形剂，如冻干助剂、稳定助剂、增溶剂、抑菌剂或其组合，如上文所定义。在制剂中包含一种或多种任选组分通常会提高最终使用者合成放射性药物的难易程度、制造试剂盒的难易程度、试剂盒的保质期或放射性药物的稳定性和保质期。
包含全部或部分制剂的一个或多个合适容器可以独立地为无菌溶液或冻干固体的形式。在一个实施方案中，制剂以冻干形式存在于试剂盒中。术语“冻干”具有常规含义，即可以无菌方式制备的冷冻干燥组合物。在一些实施方案中，试剂盒包含生物相容性载体，用于将组分重构为溶剂化物或悬浮液形式，以便通过注射等方式施用至受试者。关于试剂盒，术语“生物相容性载体”及其示例如上文针对放射性药物组合物所定义。
纤维蛋白原制剂可以包含在一个合适的容器或多个容器中。例如，一个容器可以包括纤维蛋白原、还原剂如氯化亚锡和至少一种螯合剂如DTPA二酐、p-SCN-Bz-DTPA或HYNIC。第一容器中可以包含张力剂，如氯化钠。在另一实施方案中，试剂盒可以包括至少两个容器。例如，第一容器可以包含纤维蛋白原和至少一种螯合剂，如DTPA二酐、p-SCN-Bz-DTPA或HYNIC；第二容器可以包含还原剂，如氯化亚锡。张力剂如氯化钠可以包含在第一容器、第二容器或第一和第二容器二者中。替代地，张力剂如氯化钠可以包含在第三容器中。
在又一实施方案中，试剂盒可以包括至少三个容器。例如，第一容器可以包含纤维蛋白原和至少一种螯合剂，如DTPA二酐、p-SCN-Bz-DTPA或HYNIC；第二容器可以包含还原剂，如氯化亚锡；第三容器可以包含生物相容性载体，如无菌水溶液。第一容器、第二容器、第三容器或它们的组合中可以包括张力剂，如氯化钠。替代地，张力剂例如氯化钠可以包括在第四容器中。
在一个实施方案中，试剂盒在一个容器中在氮气下包括以下组分，作为冻干粉末：
或
在另一实施方案中，该试剂盒包含以下组分，它们作为冻干粉末形式存在于两个容器中，处于氮气保护下：
或
在一些实施方案中，试剂盒还包括用于纯化放射性药物组合物的附加组分。例如，试剂盒可以包括用于组合物的凝胶过滤的组份。在一个实施方案中，试剂盒包括适当尺寸的G-25Sephadex柱，用于纯化放射性标记的纤维蛋白原组合物。在另一实施方案中，试剂盒包括具有适合放射性标记纤维蛋白原组合物的凝胶过滤的洗脱缓冲液的容器。在又一实施方案中，试剂盒可以包含适合放射性标记纤维蛋白原组合物的无菌过滤的过滤器。膜过滤介质包括但不限于聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、醋酸纤维素(CA)、混合纤维素醚(MCE)、再生纤维素、聚四氟乙烯(PTFE)和尼龙。在一个实施方案中，试剂盒包括0.22微米孔径的PVDF膜过滤器。
在一些实施方案中，试剂盒还包括处理、储存和/或使用组份的说明。
单位剂量和制备方法
还公开了放射性药物99mTc-纤维蛋白原的单位剂量，其包括本发明的放射性药物组合物，具有适合对单个受试者进行成像的99mTc放射活性含量。术语“单位受试者剂量”或“单位剂量”是指在向单个受试者施用后具有适合体内成像的99mTc放射活性含量的99mTc-纤维蛋白原放射性药物组合物。
单位受试者剂量以适合人类施用的无菌形式提供在合适的容器或注射器中。这种注射器适合临床使用并且可以是一次性的，使得注射器只能用于单个受试者。注射器可以任选地向注射器提供护罩以保护操作员免受辐射剂量。合适的此类放射性药物注射器防护罩是市售的，并且可以包含铅或钨。替代地，99mTc-纤维蛋白原放射性药物的单位剂量也可以装在具有适合用皮下注射针穿刺的密封件(例如，压接的隔膜密封闭合件)的容器中。单位剂量的99mTc放射活性含量可以是10-20mCi或5-50mCi。
还公开了一种制备一个或多个单位剂量的放射性药物99mTc-纤维蛋白原的方法，该方法包括：(i)用99mTc-高锝酸盐无菌溶液或首先用生物相容性载体然后用99mTc-高锝酸盐无菌溶液重构所公开的试剂盒；(ii)任选地在抗菌防腐剂存在下进行步骤(i)；(iii)允许发生99mTc-纤维蛋白原复合物形成；任选地检查99mTc-纤维蛋白原复合物的放射化学纯度；从步骤(iii)的溶液中抽取单位剂量到合适的注射器或容器中；以及任选地在稍后的时间用额外的注射器或容器重复步骤(v)以得到进一步的单位剂量。该过程可以在没有抗菌防腐剂的情况下进行。99mTc-高锝酸盐的无菌溶液可以从锝发生器中获得。
成像方法
所公开的纤维蛋白原放射性药物组合物可用于检测受试者的内出血。因此，还公开了放射活性成像的方法，其中将可检测量的纤维蛋白原放射性药物组合物施用于受试者，并对受试者的感兴趣区域进行成像。
可以使用各种技术将组合物施用于受试者，包括例如肠胃外注射或输注，如静脉内(i.v)、肌肉内(i.m.)、皮内、真皮内、皮下(s.c.、s.q.、sub-Q、Hypo)、腹膜内(i.p.)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(关节液区域)、颅内、脊柱内和鞘内(脊髓液)。在一个实施方案中，纤维蛋白原放射性药物组合物通过静脉注射施用。任何已知的可用于药物制剂的肠外注射或输注的装置均可用于进行此类施用。
可以使用已知程序对受试者进行成像。适当的检测方法包括SPECT(单光子发射计算机断层扫描)、伽马探测器(伽马相机)、PET(正电子发射断层扫描)、射线照相术、放射自显影或其组合。
组合物可用于检测受试者的各个感兴趣区域中的内部出血，包括例如胃、小肠、大肠(即结肠)、食道、头部、颈部、躯干、四肢、气管、肺、纵隔、胸膜腔、肝脏、脾脏、肾脏、胰腺、胆囊、腹膜后、骨盆、直肠、胃肠道系统或其组合。在一个实施方案中，感兴趣区域位于受试者的胃肠道系统内。在另一实施方案中，感兴趣区域选自胃、小肠、大肠、食道及其组合。
如本文所述，本公开的主题可用于识别和定位胃肠道上部或下部区域中的活动性和非活动性胃肠道出血。此外，本公开的主题可用于定位其他非胃肠道内出血源。
例如，本公开的主题的其他应用包括检测出现血尿的受试者的出血部位和/或作为出现血尿的受试者的鉴别诊断的有效工具。血尿或尿液中的血液是一种可能由恶性和非恶性原因引起的症状，包括肾病、肾癌、尿路感染、膀胱癌、前列腺增生、前列腺癌、药物等[8-11]。
另一个示例是，本公开的主题可用于诊断、定位和监测中风，如用于定位血栓以告知和指导血管内介入。
本公开的主题的实施方案也在本文下面的实施方案和权利要求中进行了阐述。
虽然本领域的普通技术人员相信本文使用的术语是可以很好地理解的，但为了便于解释本公开的主题，仍阐述了某些定义。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。
除非另有说明，本文整个公开内容中引用的所有专利、专利申请、已公布的申请和出版物、GenBank序列、数据库、网站和其他已公布的材料均以引用的方式全文并入。
当引用URL或其他此类标识符或地址时，应理解此类标识符可能会发生变化，互联网上的特定信息可能会来来去去，但可以通过搜索互联网找到等效信息。对其的引用证明了此类信息的可用性和公开传播。
如本文所用，任何保护基、氨基酸和其他化合物的缩写，除非另有说明，均符合其常用用法、公认缩写或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(参见Biochem.(1972)11(9):1726-1732)。
本文描述了代表性方法、装置和材料，但任何与本文所述方法、装置和材料类似或等同的方法、装置和材料均可用于实践或测试本公开的主题。
本申请可以“包括”(开放式)或“基本由……组成”本发明的组分以及本文所述的其他成分或要素。如本文所用，“包括”是开放式的，并且是指所列举的要素或其结构或功能等同物，加上未列举的任何其他要素。术语“具有”和“包括”也应解释为开放式的，除非上下文另有说明。
按照长期存在的专利法惯例，术语“一个”、“一种”和“该”在本申请(包括权利要求)中使用时是指“一个或多个”。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括多个这样的细胞，等等。
除非另有说明，否则说明书和权利要求中使用的表示成分数量、性质(如反应条件)等的所有数字应理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非另有说明，本说明书和权利要求中列出的数值参数是近似值，可根据本公开的主题所要获得的期望性质而变化。
如本文所用，术语“约”在指代值或质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，意在涵盖与指定量在一些实施方案中±20％、在一些实施方案中±10％、在一些实施方案中±5％、在一些实施方案中±1％、在一些实施方案中±0.5％、在一些实施方案中±0.1％、在一些实施方案中±0.01％、在一些实施方案中±0.001％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。
如本文所用，范围可以表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。还应理解，本文公开了多个值，并且除了值本身之外，每个值还在本文中公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“约10”。还应理解，还公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
如本文所用，“任选”或“任选地”表示随后描述的事件或情况发生或不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和不发生的情况。例如，任选变体部分表示该部分是变体或非变体。
本公开的主题通过以下特定但非限制性示例进一步说明。以下示例可以包括代表在与本发明相关的开发和实验过程中不同时间收集的数据的数据汇编。
实施例
实施例1.使用氯化亚锡还原剂制备99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原。
所用材料如下。含有甘氨酸、柠檬酸钠二水合物、L-精氨酸盐酸盐、氯化钠作为赋形剂的冻干人纤维蛋白原来自Octapharma。二乙烯三胺五乙酸(DTPA)二酐和二水氯化亚锡购自Sigma-Aldrich Chemical Co.，无需进一步纯化即可使用。用0.1MPBS缓冲液(8mL)预处理PD-10柱(GE Healthcare)。将0.1M NaHCO3溶液(10mL8.4％的NaHCO3)稀释到90mL DI水中。0.1M PBS缓冲液(含0.15M NaCl，pH 8.0)由NaCl 0.8024g、KCl 0.2100g、Na2HPO4·2H2O 1.8198g、KH2PO4 0.2451g溶解于100mL DI H2O中而制成，通过加入0.2mL 4M NaOH溶液调节pH＝8。纤维蛋白原溶液为含有16.71mg纤维蛋白原的47.52mg冻干人纤维蛋白原溶解在1.5mL 0.1MNaHCO3中。25μM DTPA-二酐溶液为9.18mg DTPA-二酐溶解于1020μL DMSO二酐中。将0.1N HCl:19.76mg中的新鲜二水合氯化亚锡溶解于10mL 0.1N HCl溶液中。
缀合的纤维蛋白原的制备和纯化如下。将125μL DTPA-二酐(25μM)的等份在室温充分搅拌下加入1.5mL纤维蛋白原溶液中。pH 9.0；15分钟后，在不断搅拌下加入另一等份125μL DTPA-二酐。温育1小时后，通过凝胶色谱法在预处理的PD-10柱上分离DTPA-DA-纤维蛋白原，用0.1M PBS缓冲液洗脱。每个级分收集15滴。用碘染色确认纯化的DTPA-DA-纤维蛋白原的蛋白质含量。
DTPA-DA-纤维蛋白原如下用99mTc进行放射性标记。将氯化亚锡原液(25μL)加入0.6mL纯化的DTPA-DA-纤维蛋白原(级分6)。立即加入0.5mL 99mTc-高锝酸盐溶液(约20mCi)。将所得溶液在室温下温育20分钟。最终混合物的pH为7.7。通过薄层色谱法(TLC)测试99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原粗品。
99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的纯化如下。将粗品99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原加载在预处理的PD-10柱上，并用0.1M PBS缓冲液洗脱柱以除去任何放射活性的杂质。每个级分收集0.5mL-1.0mL。
薄层色谱法如下进行。使用以丙酮、盐水和乙醇：铵：水(2：1：5)溶剂体系显色的ITLC-SG纸条，通过色谱法评估99mTc的标记效率。通过在Bioscan AR2000Radio-TLC成像扫描仪中成像来计数纸条。通常，99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的粗品产量超过80％，纯化后最终产品的纯度超过95％。
进行高效液相色谱法(HPLC)。通过尺寸排阻HPLC测定99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的标记纯度。注入20-50μL纯化的99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原溶液，用尺寸排阻HPLC柱(Superdex，200Increase，10/300GL，编号：17-5174-01，批号：10041069)进行色谱法，用14XPBS(5X)缓冲液以1mL/min的流速等度洗脱，并使用Hitachi HPLC系统通过280nm处的UV吸光度和Eckert&Ziegler放射活性检测器进行监测。结果如图1A-1C所示。
用TLC评估99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的稳定性达5小时。5小时内没有任何变化。
实施例2：产生具有生物活性的[99mTc]-纤维蛋白原的高效方案。
获得含有人白蛋白、L-精氨酸盐酸盐、氯化钠、柠檬酸钠和任选的pH调节剂氢氧化钠/盐酸作为赋形剂的人纤维蛋白原浓缩物并用无菌注射用水(WFI)重构。然后定期轻轻旋转小瓶，直到粉末完全溶解。将重构溶液等分到5mL小瓶中，随后使用以下配方在Virtis AdvantagePlus EL冷冻干燥机中重新冻干。将样品在搁板冷冻机上以-45℃冷冻，然后在该温度下保持60分钟。在冷冻步骤之后，将冷凝器调节至-85℃并在整个运行过程中保持在该温度。使用Leybold Trivac E2双级旋片真空泵将压力调节至100mtorr并在整个运行过程中保持在该压力。搁板温度保持在-45℃额外120分钟，然后在60分钟内升至-10℃。搁板温度保持在-10℃1,200分钟，在60分钟内升至10℃，然后在10℃再保持至少180分钟。完成最后一步后，将样品在氮气下塞住，从冻干机中取出，盖上盖子，然后在冷藏条件下储存以供进一步使用。
用0.95mL无菌灌注水重构重新冻干的样品并充分混合以制成浓度为约23mg/mL的溶液。在临近放射性标记之前制备10mM SnCl2·2H2O(约2mg/mL)在0.1N HCl中的新鲜储备溶液。用0.1N Na2CO3调节纤维蛋白原溶液的pH值。将SnCl2·2H2O储备液加入纤维蛋白原溶液中，然后立即加入Na99mTcO4溶液(0.5-3mL)(pH 7.5-8)。
为了确定最佳反应条件，测试了许多反应变量，包括纤维蛋白原质量、氯化锡(II)(SnCl2)质量、溶剂/缓冲液类型(pH)和反应时间，如下所述。使用以下两个系统通过放射性TLC确定放射性标记产率：
系统1:乙酮/ITLC-SG(Rf＝0:水解的99mTcO2和99mTc-纤维蛋白原；Rf＝1.0:游离的99mTcO4 -)
系统2:EtOH:NH4OH:H2O＝2:1:5/ITLC-SG(Rf＝0:水解的99mTcO2；Rf＝1.0:99mTc-纤维蛋白原和游离的99mTcO4 -)
或者
测试的初始反应变量是用99mTc放射性标记的反应时间(表1)。实验条件是0.5mL纤维蛋白原溶液(11.5mg)、50μL 0.1M Na2CO3、50μL SnCl2·2H2O(100μg)和2mL Na99mTcO4溶液(7.98mCi，pH 7.5-8)。
接下来对反应溶液的pH进行优化(表2)。反应条件为：0.1mL的纤维蛋白原溶液(2.3mg)，15μL、22μL、30μL、35μL的0.1M Na2CO3(得到pH分别为8、8.5、9、9.2的溶液)，15μL的SnCl2·2H2O(30μg)和0.5mL的Na99mTcO4溶液(1.2-1.5mCi)。
同时对纤维蛋白原的量和反应时间进行了优化(表3)。反应条件为：2.5mg、5mg、8mg、11.5mg的纤维蛋白原，35μL的0.1M Na2CO3，35μL的SnCl2·2H2O(70μg)和3mL的Na99mTcO4溶液(7-8mCi)。
最后对SnCl2·2H2O的量和反应时间进行了优化(表4)。反应条件为：8mg的纤维蛋白原，15μL的0.1M Na2CO3，15μL(30μg)、25μL(50μg)、35μL(70μg)和45μL(90μg)的SnCl2·2H2O和3mL的Na99mTcO4溶液(7-8mCi)。
找到了优化条件，并且发现以下实验方案对于制备99mTc标记纤维蛋白原是可重复的。将上述重新冻干的样品用0.95mL无菌灌注水重构并充分混合以制成浓度为约23mg/mL的溶液。将0.5mL纤维蛋白原溶液(11.5mg纤维蛋白原)移液到10mL无菌小瓶中。在临近放射性标记之前制备0.1N HCl中的10mM SnCl2·2H2O(约2mg/mL)新鲜储备溶液。通过将25μL0.1N Na2CO3移液到纤维蛋白原溶液中将纤维蛋白原溶液的pH调节至pH约9。将25μLSnCl2·2H2O储备溶液(50μg)加入纤维蛋白原溶液(pH 7.5-8)中，然后立即加入Na99mTcO4溶液(0.5-3mL)。反应在室温下温育30分钟。优化放射性标记产量的一些关键因素包括尽可能接近放射性标记时间制备SnCl2·2H2O储备溶液，在加入SnCl2·2H2O之前调节pH以及在加入SnCl2·2H2O后立即加入Na99mTcO4溶液。
在室温下测试99mTc标记纤维蛋白原的24小时的稳定性，在37℃下在大鼠血清中体外测试24小时，并在大鼠尿液中在体内测试。99mTc-纤维蛋白原在室温下稳定24小时，这是因为放射活性TLC测量的同位素和蛋白质没有明显解离(见上表1、3和4)。
为了分析大鼠血清中99mTc-纤维蛋白原的稳定性，通过离心力去除红细胞，从正常大鼠的全血中获得大鼠血清。通过放射性TLC测量标记的99mTc-纤维蛋白原的稳定性。99mTc-纤维蛋白原制备为83mCi/0.5mL。将10μL和20μL 99mTc-纤维蛋白原等份分别加入200μL大鼠血清中，并在37℃水浴中温育24小时。将20μL 99mTc-纤维蛋白原与200μL盐水在相同条件下温育，作为对照。经计算，20和10μL等份的纤维蛋白原最终浓度分别为436μg纤维蛋白原/血清溶液(1.959mCi)和218μg纤维蛋白原/血清溶液(1.08mCi)。盐水对照的最终活性为1.979mCi。在37℃下温育0.5、3、6和24小时后，从反应混合物中取出等份。用丙酮和EtOH/NH4OH/H2O＝2/1/5显色使用TLC确定99mTc-纤维蛋白原的百分比。结果如表5所示，与对照样品相比，未观察到游离Tc-99m从纤维蛋白原上的解吸。温育24小时后，超过90％的放射活性与纤维蛋白原有关。
对于尿液分析，99mTc-纤维蛋白原按上述方法制备，并注射到健康大鼠的尾静脉中。注射后2小时收集尿液，并通过放射性TLC进行分析。结果显示在表6中，表明没有明显的99mTc杂质形成。
如本实施例所述，已建立了一种合成方法，该方法可靠地提供>90％的标记效率，且标记反应之间的差异<10％。该探针在室温下、37℃的大鼠血清中以及注射后2小时的尿液中均表现出长达24小时的优异稳定性。在37℃的大鼠血清中温育99mTc-纤维蛋白原24小时后，大于90％的放射活性仍与纤维蛋白原相关。因此，该方法可靠地生成具有可接受的特定浓度、稳定性和生物活性的高质量[99mTc]-纤维蛋白原。
实施例3：展示[99mTc]-纤维蛋白原在胃肠道出血的动物模型中的效用和效力。
使用实施例2中鉴定的方法产生可注射SPECT示踪剂，以定位大鼠模型中的出血。使用结肠损伤模型评估99mTc-纤维蛋白原的体内效力。通过使用带有3Fr仪器通道的小动物内窥镜(Karl Storz Veterinary Endoscopy,Goleta,CA)进行活检来制作所提出的损伤，这将导致结肠出血。
对结肠损伤后的六只大鼠进行第一次成像研究。五只大鼠接受99mTc-纤维蛋白原的尾静脉注射，而一只大鼠接受单独的99mTc-O3作为对照。对于其中两只大鼠(大鼠#1和#2)，在注射后30分钟在被认为是结肠损伤的部位检测到高信号(图2A、2B)。然而，损伤太小，无法可靠地进行尸检分析。来自其余小鼠的数据要么由于结肠穿孔而无法解释(大鼠#3和#5)，要么在损伤部位没有信号(大鼠#6)。在对照化合物的损伤部位没有观察到信号(大鼠#4，图2C)。从这项研究中得出结论，有用的成像时间范围是在注射示踪剂后30分钟内。在肾脏、膀胱和输尿管中观察到高信号，在胃中则没有显著信号，表明尿液排泄是主要的消除方式。然而，结肠活检损伤模型存在重大挑战，包括难以在死后可视化大鼠结肠中的非常小的活检损伤、活检损伤缺乏可重复性和意外的结肠穿孔。因此，在未来的实验中，结肠活检损伤模型被胃损伤模型取代。
其余的成像研究是使用大鼠胃损伤模型进行的。用2％异氟烷麻醉大鼠，并在损伤前几分钟通过尾静脉注射约37MBq的99mTc-纤维蛋白原或高锝酸盐(99mTcO4)作为对照化合物。在放射性示踪剂施用后约60分钟，在NanoSPECT/CT(Siemens Bioscan,Washington DC)中对大鼠进行成像，共进行24次投影，每次投影60秒，然后进行CT，总成像时间约为30分钟。然后对大鼠实施安乐死，采集组织并在伽马计数器(Capintec,Florham Park,NJ)中计算放射活性。
为了比较靶向药物与非特异性对照在损伤部位的结合和积累，用99mTc-纤维蛋白原或99mTcO4对五只胃损伤大鼠进行成像。三只大鼠接受尾静脉注射99mTc-纤维蛋白原，并且两只大鼠接受99mTcO4作为对照。代表性图像如图3A-3F所示。通过在主要器官(肝脏、肾脏、心脏、膀胱)、切口部位、胃损伤部位和肌肉周围绘制感兴趣区域(ROI)来量化体内积累。将从ROI获得的放射活性相对于注射剂量(ID)标准化，并将值表示为％ID/克(表7)。此外，还确定了器官/肌肉比率(表8)。进行离体分析以确认SPECT/CT成像结果。在肝脏、肾脏、胃损伤部位和对照健康区域中放射活性加以计数。计算每个器官的活性/克(表9)，并计算胃损伤与对照区域相比的信噪比(表10)。从SPECT图像中可以看出，99mTc-纤维蛋白原聚集在损伤部位中，而使用99mTcO4时，损伤部位几乎检测不到信号。肾脏和膀胱再次观察到高信号。定量数据表明，99mTc-纤维蛋白原特异性地与胃损伤部位的出血部位结合。胃损伤部位的信噪比(器官/肌肉)范围为11-16:1，这是此显影阶段可接受的比率。体内成像结果在体外得到确认。与用99mTcO4成像的小鼠相比，用99mTc-纤维蛋白原成像的小鼠的信噪比更高。
为了测试99mTc-纤维蛋白原与损伤部位的结合和积累的特异性，使用99mTc-纤维蛋白原对正常大鼠(n＝2)或胃损伤后的大鼠(n＝4)或假损伤后的大鼠(n＝2)进行成像。代表性图像如图4A-4I所示。通过在肝脏、肾脏、手术部位、胃损伤部位和肌肉周围绘制感兴趣区域(ROI)来量化体内积累。将从ROI获得的放射活性相对于注射剂量(ID)标准化，并将值表示为％ID/克(表11)。进行离体分析以确认SPECT/CT成像结果。在肝脏、肾脏、胃损伤部位和对照健康区域中的放射活性加以计数。图像如图5所示，每个器官的计算浓度见表12，并且胃损伤与对照区域相比的信噪比见表13。从SPECT图像中可以看出，99mTc-纤维蛋白原积聚在损伤部位中。定量数据表明，99mTc-纤维蛋白原与胃损伤部位的出血部位结合。然而，在假损伤小鼠和一只正常小鼠中也观察到了信号。
从离体放射活性计数来看，与对照健康部位相比，所有胃损伤小鼠的损伤部位信号更高。
最后，为了测量不同器官和组织类型对99mTc-纤维蛋白原的摄取，在正常健康大鼠中进行了生物分布实验。一组大鼠(n＝4)用2％异氟烷麻醉，并在到达后立即注射约37MBq的99mTc-纤维蛋白原。大鼠保持麻醉60分钟。然后对大鼠实施安乐死，采集组织(肝脏、胃、脾脏、胆囊、心脏、肺、胰腺、肾脏、小肠和结肠)并在Hidex AMG自动伽马计数器(Lablogic,Brandon,FL)中计数放射活性(图6，黑色条)。还测试了放射性示踪剂的完整性。放射性示踪剂到达后约3小时，第二组大鼠(n＝3)用2％异氟烷麻醉并注射约37MBq的99mTc-纤维蛋白原。重复上述切割和计数实验(图6，阴影条)。对于大多数器官而言，无论是在到达后立即注射放射性示踪剂还是在到达后3小时注射，摄取量都没有显著差异。然而，与到达后立即注射相比，在到达后3小时注射放射性示踪剂时，胃部显示的信号明显更高。
这些结果确立了99mTc-纤维蛋白原示踪剂使用SPECT/CT成像定位大鼠模型中胃损伤部位的效力。体内成像结果通过离体放射性分析得到证实。与所有患有胃损伤的小鼠的对照健康部位相比，损伤部位的信号更高。此外，与非特异性对照99mTcO4相比，针对99mTc-纤维蛋白原获得了更高的信噪比。然而，在假性损伤小鼠中也观察到99mTc-纤维蛋白原信号。此外，在肾脏/膀胱中观察到高信号，表明肾脏清除迅速。
因此，结果表明，当比较同一只大鼠的受伤组织与健康组织时，99mTc-纤维蛋白原示踪剂与胃损伤部位的出血部位结合，从而成功定位损伤，信噪比大于等于2(大多数情况下)。
实施例4：用于制备99mTc-纤维蛋白原放射性药物组合物的单小瓶试剂盒。
用于制备放射性标记纤维蛋白原悬浮液的冻干粉末制备如下。纤维蛋白原将在0.1M碳酸氢钠(pH 8.0)中重构至最终纤维蛋白原浓度约为20mg/mL。接下来，每mL纤维蛋白原溶液加入140μL溶于DMSO的二乙烯三胺五乙酸(DTPA)-酐储备液(浓度为25μM)，然后搅拌15分钟。随后将140μL DTPA-酐等份加入纤维蛋白原溶液中，然后再搅拌45分钟。接下来，将混合物通过用0.1M磷酸盐缓冲盐水(pH 8.0)平衡的G-25Sephadex柱。然后汇集含有纤维蛋白原的洗脱级分，其包含与DTPA缀合的纤维蛋白原(DTPA-DA-纤维蛋白原)。最终溶液通过用0.1M磷酸钠(pH 8.0)缓冲液稀释来调节至总纤维蛋白原浓度约为10mg/mL。还向稀释缓冲液加入从0.1N HCl中的0.1M储备溶液中的一定量氯化亚锡，使得最终浓度为5mM。可以加入抗坏血酸钠，使最终浓度为20mM。然后用0.1M氢氧化钠将溶液的pH调节至7.7。然后将溶液通过无菌过滤器，并装入玻璃小瓶中，体积范围为1.0至10mL。然后可以对样品进行冻干，这是通过首先将样品冷冻在-45℃下，然后在-45和-10℃下进行一次干燥至多24小时，腔室压力为100mtorr。然后可以进行二次干燥，这是通过首先在1小时内将温度从-10升至10℃，然后在100mtorr下在10℃下再保持3小时。含有DTPA-DA-纤维蛋白原以及缓冲液、氯化亚锡和抗坏血酸钠的小瓶将用氮气回填、塞上塞子并密封。
为了形成用于施用的放射性标记纤维蛋白原悬浮液，将冻干粉末用NaTcO4[10-8至10-6M，或1.7至169.9μg/L]在生理盐水[0.9％氯化钠]中溶液重构。每瓶中每10mg总纤维蛋白原加入1.0mL体积的在生理盐水中的NaTcO4溶液(5-20mCi)，在室温下重构，直至粉末完全溶解，获得清澈至略带乳白色的溶液。使溶液反应20分钟。
99mTc-纤维蛋白原缀合物的效率和纯度通过薄层色谱法(TLC)使用放射性TLC成像扫描仪确定。99mTc-纤维蛋白原缀合物用G-25葡聚糖凝胶柱进一步纯化，然后通过过滤器。
实施例5.使用氯化亚锡还原剂制备99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原。
最初研究使用含有人白蛋白、L-精氨酸盐酸盐、氯化钠、柠檬酸钠和任选的pH调节剂氢氧化钠/盐酸作为赋形剂的人纤维蛋白原浓缩物进行。我们发现该来源含有大量白蛋白(约50％)。因此，白蛋白也被99mTc标记，用作放射性标记的血池成像剂。为了解决这个问题，我们利用不含白蛋白的来自Sigma的非GMP纯纤维蛋白原改进了我们的合成方法。从Sigma-Aldrich获得的人类血浆中的纤维蛋白原为干固体(50-70％蛋白质，>80％可凝固蛋白质，批号#SLBT8666)。将纤维蛋白原(32±3mg)缓慢溶解于0.1M NaHCO3(2.3mL)中。在29℃的温度下，向其中加入在DMSO中的100μL DTPA-二酐溶液(12.5μM)。允许反应15分钟后，加入第二等份(100μL)DTPA溶液。另外1小时后，通过尺寸排阻柱(PD-10，用0.1M PBS洗脱)纯化DTPA-DA-纤维蛋白原。汇集含有所需DTPA-DA纤维蛋白原的级分，并且向其中加入在0.1N HCl中的25μL新鲜制备的SnCl2[10mM SnCl2·2H2O(约2mg/mL)]，然后立即加入在盐水中的Na99mTcO4 -(30-38mCi，0.5mL)。在室温下进行20分钟的掺入，并通过iTLC监测完成情况(条件如下)。然后通过尺寸排阻柱纯化粗产品，并收集放射活性最高的级分。通过iTLC和放射性HPLC二者确认最终产品的纯度和身份。在所有情况下，最终产品的放射化学纯度均大于95％。放射性标记产率通过放射性TLC确定，使用以下三个系统：
系统1:乙酮/ITLC-SG(Rf＝0:水解的99mTcO2和99mTc-纤维蛋白原；Rf＝1.0:游离99mTcO4-)；
系统2:盐水(Rf＝1.0:游离99mTcO4-和99mTc-DTPA-DA；Rf＝0:其他杂质；系统3:EtOH:NH4OH:H2O＝2:1:5/ITLC-SG(Rf＝0:水解的99mTcO2；Rf＝1.0:99mTc-纤维蛋白原和游离99mTcO4-)。
我们的数据表明，使用双功能螯合剂(DTPA-DA)显著提高放射性标记产品的产量和纯度，从23.43％提高到99.62％。
总体而言，使用从同种的大鼠中抽取的未用药的血液来确定锝-99m标记的纤维蛋白原-DTPA-DA的体内稳定性。将血液旋转以获得血清，然后将纯药物接种到血清中，并在24小时的时程内温育以测试代谢物。这些研究的结果显示药物在24小时的时间点上不同程度分解。对掺有药物的血清的分析显示药物在40分钟后完全稳定，2小时后损失20％，并且24小时后损失45％。总之，我们已经鉴定了一种可靠地提供>95％标记效率的合成方法。我们进行了多次合成，标记反应之间的差异小于5％。我们的探针在室温下和37℃的大鼠血清中都表现出长达24小时的优异稳定性。因此，我们已鉴定一种可靠地生成具有可接受的特定浓度和稳定性的高质量[99mTc]-DTPA-DA-纤维蛋白原的合成方法。
实施例6.胃肠道出血动物模型中的99mTc-纤维蛋白原。
我们进行了两项独立的体内研究，第一项研究是生物分布研究，以评估各种组织中的摄取水平。使用2％异氟烷对大鼠进行麻醉。然后通过尾静脉向大鼠施用200μL体积的1mCi 99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原(如实施例5所述产生)，并用100μL盐水冲洗。在注射后0.5、1、3、5和7小时对大鼠实施安乐死，收集组织并使用Hidex AMG自动伽马计数器(Lablogic,Brandon,FL)测量活性。活性描述为μCi/g组织。在肾脏中观察到最高水平的活性，而肝脏和膀胱显示出较低但显著的摄取。在胃、心脏、肺、肠或脾中观察到最小的摄取，表明放射性配体的肾脏排泄。此外，肾脏中的摄取水平在1小时和3小时时间点处最高。
第二组研究涉及SPECT/CT成像。初步研究是在健康、未受伤的大鼠中进行的，以确定成像的最佳剂量和预处理时间。使用2％异氟烷对大鼠进行麻醉。然后通过尾静脉向大鼠施用200μL体积的99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原(如实施例5中所述产生)，并用100μL盐水冲洗。然后将大鼠置于立体定位头枕中，放入Inveon SPECT/CT(Siemens)中，并且进行30分钟的SPECT采集，然后进行CT。使用Amide软件将SPECT图像手动配准到CT图像。在肾脏和肝脏周围绘制感兴趣区域(ROI)，并根据体重和注射剂量确定标准摄取值(SUV)。初始时间过程研究设计评估了0.5、1、3、5和7小时的预处理时间，注射剂量为1.4mCi。可以在肾脏中观察到大量的摄取，似乎在注射后3小时达到峰值，这与生物分布数据有很好的相关性。由于预处理时间不会显著影响放射性配体的摄取，我们选择在所有未来的成像研究中使用5分钟的预处理时间，以在评估胃肠道出血时尽量减少肾脏摄取的任何潜在干扰。
在确定最佳预处理时间后，我们接下来评估了降低注射剂量对放射性配体摄取的影响。这些研究表明，99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原的剂量可以显著降低(从1.4mCi降低到300μCi)，而不会影响肾脏(SUV：分别为0.68和0.7)或肝脏(SUV：分别为0.24和0.26)对放射性配体的摄取。因此，为了最大限度地减少辐射暴露，我们在下文概述的GI损伤模型中使用了较低的剂量。最后，我们使用99mTc-高锝酸盐SPECT成像进行了对照研究。通过尾静脉向大鼠施用200μL体积的250μCi 99mTc-高锝酸盐，并用100μL盐水冲洗。摄取的主要器官是肝脏，与99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原(n＝3，未显示数据)观察到的摄取不同。
我们使用结肠损伤、胃黏膜损伤或假手术模型来评估99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原的体内效力。对于所有研究，大鼠均用2％异氟烷麻醉并在腹腔中制造切口。通过在胃壁上制造小切口来引入胃黏膜损伤。然后从胃内黏膜壁进行活检。为了帮助定位损伤，将损伤部位的胃在中线处用缝合线固定在腹壁上。通过横切结肠来造成结肠损伤。然后使用缝合线在中线处将结肠的两个横切端固定在腹壁上。假手术是通过在腹腔中线制造同样的切口并将未受伤的胃或结肠固定在腹壁上进行的。胃或结肠内中的所有出血停止后，关闭腹腔。然后给大鼠注射约250μCi 99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原(如实施例5所述产生)，放入SPECT/CT中，并且在注射后约5分钟获取30分钟SPECT扫描，然后获取CT。使用Amide软件将SPECT图像手动配准到CT图像。在损伤(或假手术动物的未损伤器官)、肾脏、肝脏和肌肉周围绘制感兴趣区域(ROI)。然后根据体重和注射剂量计算标准摄取值(SUV)。示踪剂成功的拟议指标是来自SPECT/CT图像的定量数据识别损伤部位的能力。图7(n＝3)显示了来自胃(图7A)和结肠损伤模型(图7B)与假手术(图7C)的代表性图像。从图像中可以看出，在损伤部位观察到显著的99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原摄取。在假手术动物的胃中未观察到摄取。
图8(n＝2-3)描绘了两种损伤模型的量化数据。在假手术动物中未测量到明显的活性。此外，在胃和结肠损伤中均观察到显著的摄取。定量数据表明99mTc-纤维蛋白原特异性地结合到损伤部位。在成像会话结束后，我们通过直接切除受伤的组织部位来确认损伤部位的特定摄取。使用盐水冲洗切除的组织中的任何血液，将其放置在eppendorf管中，并使用SPECT成像测量该区域所含的放射活性。
实施例7.缀合纤维蛋白原的生物活性
通过在室温的生物安全柜(Nuaire,序列号72324AER)中用无菌注射水(WFI)重构(人纤维蛋白原，用于静脉注射的冻干粉末)小瓶来制备纤维蛋白原样品和参考标准。该程序包括从小瓶上取下盖子，然后用酒精擦拭布清洁橡胶塞。然后将转移装置插入小瓶的塞子中，然后附接含有50mL WFI的小瓶。WFI转移完成后，定期轻轻旋转小瓶，直到粉末完全溶解并且溶液均匀(约21分钟)。粉末完全重构后，将小瓶中的所有内容物通过颗粒过滤器转移到50mL聚丙烯管中。过滤后，将1mL的重构溶液分装到5mL小瓶中，随后使用以下配方在Virtis AdvantagePlus EL冷冻干燥机中重新冷冻干燥。样品在搁板冷冻机上以-45℃冷冻，然后在该温度下保持60分钟。冷冻步骤后，将冷凝器调节至-85℃，并在整个运行过程中保持该温度。使用Leybold Trivac E2双级旋片真空泵将压力调节至100mtorr，并在整个运行过程中保持该压力。搁板温度在-45℃保持另外120分钟，然后在60分钟内升至-10℃。搁板温度在-10℃保持1,200分钟，在60分钟内升至10℃，在10℃再保持另外180分钟，然后在20℃保持至少180分钟。完成这最后一步后，将样品在氮气下塞住，从冻干机中取出，盖上盖子，然后在冷藏条件下储存以供将来使用。
制备纤维蛋白原，用于与DTPA-二酐或p-SCN-Bz-DTPA缀合，制备是通过首先在室温下用2.0mL生理盐水在轻轻旋转下重构21mg重新冻干的样品约15-20分钟。重构完成后，将0.5mL等份转移到聚丙烯管中，用于纤维蛋白原生物活性测试(如下所述)。将剩余的1.5mL重构样品加载到用生理盐水平衡的PD-10柱(Cytiva G-25Sephadex；目录号17085101)上，并用相同溶剂洗脱。通过测量280nm处的UV吸光度收集含蛋白质的级分，将其汇集到15mL聚丙烯管中，然后将0.4mL等份转移到另一个聚丙烯管中，用于随后的纤维蛋白原生物活性测试。通过加入0.1mL 1.0M碳酸氢钠，然后用0.1和1N NaOH滴定，将剩余汇集级分的pH调节至pH 9.0。从经pH调节的混合物中取出一份0.4mL等份，用于随后的纤维蛋白原生物活性测试，并将剩余体积分成三个0.4mL等份，用于与DTPA-二酐或p-SCN-Bz-DTPA缀合。
进行计算，以便将DTPA-二酐或p-SCN-Bz-DTPA以1:1、5:1和10:1的摩尔比加入纤维蛋白原中。相对于DTPA-二酐，经pH调节的溶液中的蛋白质浓度为5.91mg/mL，相当于约17.38μM(使用340,000的纤维蛋白原分子量)。因此，0.4mL溶液中含有6.95nmol纤维蛋白原(例如17.38μmol/L或17.38nmol/mL*0.4mL)。此时，DTPA-二酐(Sigma-Aldrich；目录号284025-1G)以25mM(即25mmol/L、25μmol/mL或25nmol/μL)溶解在无水DMSO中。然后将DTPA-二酐溶液稀释至1.74、8.69和17.38nmol/μL，使得将4μL每种DTAP-二酐溶液加入3种不同的纤维蛋白原混合物中将分别产生1:1、5:1和10:1的摩尔过量(DTPA-二酐：纤维蛋白原)。因此，获得了三种单独的溶液，其中含有6.95nmol的纤维蛋白原和6.95、34.8或69.5nmol的DTPA-二酐以及最终浓度约为1％(v/v)的DMSO。相对于p-SCN-Bz-DTPA，经pH调节的溶液中的蛋白质浓度为5.75mg/mL，相当于约16.91μM(使用纤维蛋白原的分子量为340,000)。因此，0.4mL溶液中存在6.76nmol的纤维蛋白原(例如16.91μmol/L或16.91nmol/mL*0.4mL)。此时，将p-SCN-Bz-DTPA(Macrocyclics,目录号B-305)溶解在由50mM碳酸氢钠(pH 9.0的生理盐水)组成的缓冲液中，直至5mM，即5mmol/L、5μmol/mL或5nmol/μL。然后使用相同的缓冲液将p-SCN-Bz-DTPA溶液稀释至1nmol/μL。为了加入摩尔比为1:1、5:1和10:1(p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原)，分别将6.8μL 1nmol/μL和6.8和13.5μL的5nmol/μL p-SCN-Bz-DTPA加入3种不同的纤维蛋白原混合物中。因此，制备了三种单独的溶液，分别含有6.8nmol的纤维蛋白原和6.8、33.8或67.8nmol的p-SCN-Bz-DTPA。然后将样品在室温下温育45分钟，然后在用生理盐水平衡的PD-10柱上纯化纤维蛋白原缀合物并用生理盐水洗脱。如上所述收集含蛋白质的级分，然后直接放入-80℃的冷冻机中。第二天早上将样品解冻，然后进行纤维蛋白原生物活性测试。
使用浊度测定法确定纤维蛋白原的生物活性，以确定可凝固蛋白质的浓度，使用双缩脲法<USP-1057>将其相对于总蛋白质浓度标准化。浊度测定基于Inada等人(1978)Faster Determination of Clottable Fibrinogen in Human Plasma:An ImprovedMethod and Kinetic Study,Clinical Chemistry,Volume 24-2,351-353的参考文献。测定法如下：在塑料比色皿中将0.5mL解冻的纤维蛋白原溶液加入在WFI(143个NIH单位/mL)中的1.0mL反应缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 7.0,40mM NaCl)和0.1mL凝血酶(Sigma-Aldrich,目录号T4648-10KU)溶液中，然后用移液器立即混合溶液，并且使凝块形成至少20分钟。使用Shimadzu UV-Vis 2600分光光度计相对于空白样品在450nm处测量每个样品的浊度，两者除了凝血酶的存在之外组成相同。为了评估DTPA-二酐：纤维蛋白原缀合物中的可凝纤维蛋白原的浓度，根据在反应缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.0,40mM NaCl)中稀释的3.29、2.29、1.56、1.13、0.47和0.30mg/ml纤维蛋白原参考标准的吸光度值生成校准曲线。为了评估p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原缀合物中的可凝纤维蛋白原的浓度，根据在反应缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 7.0,40mM NaCl)中稀释的3.39、2.40、1.71、1.29、0.57和0.25mg/mL纤维蛋白原参考标准的吸光度值生成校准曲线。
与浊度测定平行地，使用双缩脲法<USP-1057>确定总蛋白浓度，这是通过将1体积的样品加入1体积的双缩脲试剂1(6％ NaOH)中，然后加入相对于样品体积的0.4体积的双缩脲试剂2(每200mL含3.46g CuSO4-5H2O、34.6g柠檬酸钠二水合物和20g碳酸钠)。允许混合物静置不少于15分钟，然后在加入双缩脲试剂后90分钟内使用Shimadzu UV-Vis 2600分光光度计在545nm处测量吸光度。使用人血清白蛋白(HSA)参考标准(Octapharma，批号C118STD08)制备标准溶液，以达到6.90、6.21、4.66、2.33、1.16、0.58、0.23、0.09和0.05mg/mL的蛋白质浓度。将吸光度值相对于HSA浓度作图以生成校准曲线，该校准曲线用于确定纤维蛋白原参考标准和样品的总蛋白质浓度。
通过将每个纤维蛋白原样品稀释到浊度测定的线性范围内并用报告可凝固和总蛋白质浓度(单位为mg/mL)的双缩脲法来确定纤维蛋白原生物活性。接下来，通过将可凝固蛋白质浓度除以总蛋白质浓度并乘以100(公式1)来计算％生物活性。
公式1：
对于生理盐水重构样品和来自第一个PD-10柱的汇集级分，DTPA-二酐：纤维蛋白原缀合物的纤维蛋白原活性分别为约85％和88％(表14)。在pH调节至9.0后，纤维蛋白原生物活性略微下降至71％。在pH步骤期间，观察到沉淀物，当使用NaOH等份将pH升高至9时，沉淀物变回溶液。回收的纤维蛋白原缀合物的纤维蛋白原生物活性对于1:1、5:1和10:1摩尔比分别为101.3、85.0和84.0％。
表14.使用DTPA-二酐的纤维蛋白原生物活性的总结
与使用DTPA-二酐的纤维蛋白原生物活性相比，在p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原缀合物中未观察到纤维蛋白原生物活性的显著损失，如表15所示。
表15.使用p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原的纤维蛋白原生物活性的总结
实施例8.纤维蛋白原与p-SCN-Bz-DTPA缀合并用99mTc进行放射性标记
根据实施例7中所述的方法将纤维蛋白原与p-SCN-Bz-DTPA缀合，不同之处在于，纤维蛋白原的制备用于与p-SCN-Bz-DTPA缀合，首先在室温下用2.0mL生理盐水在轻轻旋转下重构21mg重新冻干的样品约15-20分钟。将1mL等份加载到用生理盐水平衡的PD-10柱(Cytiva G-25Sephadex；目录号17085101)上，并用相同溶剂洗脱。通过测量280nm处的UV吸光度来收集含蛋白质的级分。汇集级分的纤维蛋白原浓度为4.7mg/mL，通过280nm处的UV吸光度和10mg/mL纤维蛋白原溶液的消光系数15.1确定。进行计算，使得p-SCN-Bz-DTPA(Macrocyclics，目录号B-305)以12:1和30:1的摩尔比加入纤维蛋白原。通过将1.06mL纤维蛋白原溶液(14.7nmol)加入无金属eppendorf小瓶中，然后加入176.5nmol p-SCN-Bz-DTPA(23μl来自5mg/mL p-SCN-Bz-DTPA溶液)进行12:1p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原摩尔比的缀合反应。使用碳酸钠将溶液的pH值调节至9.1，在37℃下温育90分钟，然后用0.05N HCl将pH降低至7.0，并在-80℃冷冻机中储存24小时。将冷冻样品解冻，并通过HPLC分析一等份，以确保蛋白质在迄今为止的加工步骤中没有出现降解迹象，并作为放射性标记前的基线。将剩余体积加载到用生理盐水平衡的PD-10柱上，并用相同溶剂洗脱以纯化纤维蛋白原缀合物。然后收集、汇集含蛋白质的级分，并确定蛋白质浓度为1.96mg/mL。然后使用MilliporeAmicon Ultra 30kDa分子量截止离心过滤器将溶液浓缩至3.39mg/mL。通过在无金属eppendorf小瓶中将441nmol p-SCN-Bz-DTPA(57μL 5mg/mL p-SCN-Bz-DTPA溶液)加入到1.06mL与用于12:1摩尔比相同的混合物中，以p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原的30:1摩尔比进行单独的缀合反应。用碳酸钠将溶液的pH调节至9.1，在37℃下温育90分钟，用0.05N HCl将pH降低至7.0，然后在-80℃冷冻机中储存24小时。还通过HPLC分析了p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原的30:1摩尔比的解冻样品，将其加载到PD-10柱上，然后收集并汇集，如上所述。该样品的纤维蛋白原浓度为2.16mg/mL，然后使用30KDa分子量截留离心过滤单位浓缩至3.07mg/mL。
然后用99mTc对纤维蛋白原缀合物进行放射性标记。向每个反应小瓶中加入总计1mCi的99mTc，然后将0.2mL等份的由12:1和30:1p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原摩尔比实验产生的纤维蛋白原缀合物加入单独的小瓶。然后将1μL SnCl2溶液(1mg/mL)加入每个反应小瓶，并使用丙酮洗脱液通过TLC观察99mTc还原。将反应在室温下温育20分钟，偶尔轻轻混合，并使用带有UV和辐射检测的Agilent HPLC评估放射性标记的程度。色谱分离在TosohBiosciences的TSK-gel 3000SWXL柱上进行，柱尺寸为7.8x 300mm，颗粒大小为3-5μm。流速为1.0mL/分钟，流动相为100mM柠檬酸钠、100mM氯化钠，pH为6.4。注射量为20μL，并且检测波长为280nm。此外，将来自30:1p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原反应的纤维蛋白原缀合物样品加载到PD-10柱上，并用盐水洗脱10个级分，该级分使用剂量校准器测量放射活性。
在280nm处对p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原的摩尔比为12:1和30:1的缀合物进行HPLC-UV分析，显示在RT约6.2-6.3分钟处的主峰，这是纤维蛋白原主峰。存在在RT约5.7分钟处洗脱的小峰，就在纤维蛋白原主峰之前。该峰很可能是过程中二聚化/聚集形成的高分子量形式的纤维蛋白原。纤维蛋白原可能由于与p-SCN-Bz-DTPA相互作用而自行聚集。在RT约9和11分钟处检测到低水平杂质。对12:1和30:1摩尔比的p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原进行HPLC-放射分析，显示RT约6.5-6.6分钟和5.9-6.0分钟处的峰，对应于两种缀合物的纤维蛋白原主峰和纤维蛋白原聚集体。HPLC-放射检测的色谱图中没有其他峰，表明所有99mTc都与纤维蛋白原和纤维蛋白原聚集体结合。将p-SCN-Bz-DTPA:纤维蛋白原摩尔比为30:1的99mTc纤维蛋白原缀合物加载到用生理盐水平衡的PD-10柱上，并用相同溶剂洗脱。收集的级分4-8的剂量校准读数(单位μCi)进一步证实，放射活性随含有纤维蛋白原的级分一起洗脱，这些级分与游离99mTc分离(表16)。
表16.收集的用于纯化99mTc纤维蛋白原缀合物的级分的剂量校准读数。
实施例9.99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原的SPECT/CT成像研究
为了评估99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原在定位胃肠道出血部位的体内效力，我们使用了结肠损伤和假手术模型。在所有模型中，在麻醉大鼠的腹腔中制造切口。结肠损伤是通过横切结肠造成的。假手术是通过在腹腔中线制造相同的切口进行的。胃或结肠中的所有出血停止后，关闭腹腔。然后给大鼠注射根据实施例1制备的约250μCi99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原，并在输注后5分钟进行SPECT/CT成像。示踪剂成功的拟议指标是来自SPECT/CT图像的定量数据识别损伤部位的能力。图9A-D显示了结肠损伤模型(9C、9D)与假手术(9A、9B)的代表性图像。从图像中可以看出，在损伤部位观察到显著的99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原摄取。在假手术动物中，胃或结肠的摄取量可忽略不计。两种损伤模型的量化数据(n＝7-9，与假手术相比的单因素方差分析*p<0.05)表明，在假手术动物中未测量到明显的活性。此外，在胃(是假手术2.35倍)和结肠(是假手术的4.15倍)损伤中均观察到显著的摄取。定量数据表明99mTc-纤维蛋白原特异性地与损伤部位结合。
遮蔽/特异性研究：我们使用非放射性标记的“冷”纤维蛋白原进行施用之后紧接着施用99mTc-DTPA-纤维蛋白原，进行了遮蔽研究。在实施上述损伤模型后，在向大鼠施用3mg/kg重构的(人纤维蛋白原，用于静脉内重构的冻干粉末)之后紧接着施用根据实施例1制备的约250μCi 99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原。然后进行SPECT/CT分析，并从分析的图像计算标准摄取值。图10表明，遮蔽导致99mTc-DTPA-DA-纤维蛋白原摄取减少，与假手术动物中观察到的水平相似(与假手术相比，p＝0.08，遮蔽组的n＝4)。这些结果支持了99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原示踪剂通过掺入纤维蛋白凝块来识别出血部位的特异性。
总之，我们进行了实验，显示99mTc-DTPA-DA纤维蛋白原放射性配体使用SPECT/CT成像定位大鼠下消化道出血部位的效力。我们能够通过离体放射性分析确认体内成像结果。与对照健康部位相比，所有损伤大鼠的损伤部位信号更高，而假损伤大鼠中则没有观察到这种情况。虽然在所有动物的肾脏和膀胱中都观察到了高信号，但该信号不会干扰损伤部位的识别。通过遮蔽研究验证了示踪剂的特异性。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文中，其引用范围与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指出以引用的方式并入的程度相同，包括以下列表中列出的参考文献：
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应当理解，可以改变本公开的主题的各种细节，而不脱离本文公开的主题的范围。此外，前述描述仅用于说明目的，而不是用于限制目的。

Claims (21)

1.一种用于制备靶向血管中的损伤部位的锝-99m(99mTc)标记组合物的试剂盒，其包含：
-人纤维蛋白原；
-螯合剂，所述螯合剂选自二乙烯三胺五乙酸(DTPA)二酐、p-SCN-Bz-DTPA、HYNIC及其组合；以及
-还原剂。
2.一种用于制备靶向血管中的损伤部位的锝-99m(99mTc)标记组合物的试剂盒，其包含：
-缀合的人纤维蛋白原，其中所述人纤维蛋白原与螯合剂键合，所述螯合剂选自二乙烯三胺五乙酸(DTPA)二酐、p-SCN-Bz-DTPA、HYNIC及其组合；以及
-还原剂。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述还原剂是氯化亚锡。
4.如权利要求3所述的试剂盒，还包含第一小瓶，所述第一小瓶含有所述缀合的人纤维蛋白原或所述螯合剂和人纤维蛋白原；和第二小瓶，所述第二小瓶含有氯化亚锡。
5.如权利要求1至4中的任一项所述的试剂盒，其中所述螯合剂是p-SCN-Bz-DTPA。
6.如权利要求1至5中的任一项所述的试剂盒，其中所述螯合剂与所述人纤维蛋白原的摩尔比为1:1至30:1。
7.如权利要求1至6中的任一项所述的试剂盒，还包含一种或多种组分，所述一种或多种组分选自缓冲化合物、用于调节pH的化合物、张力剂和抗氧化剂。
8.如权利要求1至7中的任一项所述的试剂盒，还包含纯化柱，并且任选包含洗脱溶液。
9.如权利要求1至8中的任一项所述的试剂盒，其中所述人纤维蛋白原、所述螯合剂、所述还原剂或其组合以冻干粉末的形式提供。
10.如权利要求1至9中的任一项所述的试剂盒，其中所述人纤维蛋白原含有.01至40％(w/w)、.01至30％(w/w)、.01至20％(w/w)、.01至10％(w/w)、.01至5.0％(w/w)、或.50至3.0％(w/w)白蛋白。
11.如权利要求1至10中的任一项所述的试剂盒，其中所述纤维蛋白原以约5-15mg的量提供，所述螯合剂以约.1-5μg的量提供，并且氯化亚锡以约0.001-1.90mg或0.005-10mM的浓度提供。
12.一种用于制备靶向血管中的损伤部位的锝-99m(99mTc)标记纤维蛋白原组合物的方法，其包含：
使用根据权利要求1至11中的任一项所述的试剂盒制备或提供缀合的人纤维蛋白原和还原剂；
将所述缀合的人纤维蛋白原与含99mTc的溶液合并，其中所述还原剂在所述含99mTc的溶液之前、之后或同时与所述缀合的人纤维蛋白原合并；
温育所合并的缀合的人纤维蛋白原、还原剂和含99mTc的溶液，以得到所述99mTc标记纤维蛋白原组合物；以及
任选地检查所述99mTc标记纤维蛋白原组合物的放射化学纯度。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述缀合的人纤维蛋白原被制备为溶液，并且所述还原剂在与所述含99mTc的溶液合并之前加入所述溶液。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述含99mTc的溶液是Na99mTcO4溶液。
15.如权利要求12或13所述的方法，其中所述还原剂是氯化亚锡。
16.如权利要求12或13所述的方法，其中所述人纤维蛋白原与p-SCN-Bz-DTPA缀合。
17.一种根据权利要求12至16中的任一项所述的方法制备的组合物。
18.一种用于检测受试者的内出血部位的方法，其包括：
向所述受试者施用权利要求17所述的组合物；以及
对所述受试者的感兴趣区域进行成像，从而检测所述受试者的所述内出血部位。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述成像是使用单光子发射计算机断层扫描(SPECT)进行的。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述感兴趣区域在所述受试者的胃肠道(GI)系统内。
21.根据权利要求18至20中的任一项所述的方法，其中所述内出血部位具有非活动性出血。
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