CN118414151A - 用于治疗癌症的包含酮体的透析液 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种用于治疗癌症的透析疗法中的透析液，其包含：a)酮体，例如乙酰乙酸盐、β‑羟基丁酸盐或其药学上可接受的衍生物、酯和盐；和b)碳酸氢根离子。

Description

用于治疗癌症的包含酮体的透析液
本文的公开内容涉及体外血液处理。更具体地，本公开涉及体外血液处理例如血液透析、血液透析滤过和血液滤过在癌症治疗中的用途。最具体地，本公开涉及用于癌症的血液透析疗法中的透析液。
背景技术
大多数人类癌细胞表现出能量代谢的改变，这将它们与正常细胞区分开来。正常细胞通过线粒体氧化磷酸化获得其大部分能量，该线粒体氧化磷酸化是一种有氧过程，其中葡萄糖被氧化，首先通过糖酵解，随后通过三羧酸(TCA)循环产生三磷酸腺苷。与之相反的是，该途径在癌细胞中仅是次要的。Warburg在1920年代首次观察到了这一点。他指出，在癌细胞通过糖酵解代谢葡萄糖之后，从丙酮酸盐(puruvate)中产生乳酸。在正常细胞中，这种情况仅发生在厌氧条件下，但在癌细胞中，即使存在充足的氧气，这种替代途径也会增加。这种现象被称为“有氧糖酵解”或“Warburg效应”(Warburg et al.,1927,Gen Physiol8:519–530)。随后的研究证实了癌细胞中存在特征性糖酵解表型，这些研究还观察到大多数癌细胞中参与糖酵解的酶的过度表达。
上述代谢转变赋予癌细胞选择性生长优势，并有助于抵抗缺氧和凋亡的能力。由于肿瘤细胞增殖的速度超过新血管形成的速度，因此许多肿瘤在低氧环境中生长。癌细胞中存在各种代谢改变，最常见和最著名的是它们通过有氧糖酵解产生能量的习惯。此外，许多糖酵解中间体，例如核糖、甘油和丝氨酸，也是癌细胞生长和增殖过程中必需的生物合成和合成代谢途径的中间体。此外，糖酵解会从ADP中产生ATP，从而维持肿瘤中的细胞生长。然而，糖酵解的效率远低于氧化磷酸化，因此需要大量的葡萄糖来产生足够量的ATP。因此，该代谢途径需要大量的葡萄糖。许多癌细胞变得依赖于葡萄糖作为其主要能量来源。由于多种原因，如果糖酵解肿瘤细胞的葡萄糖供应受到限制，它们就会变得脆弱。
此外，许多癌细胞还表现出对谷氨酰胺的依赖。谷氨酰胺依赖性细胞所表现出的对谷氨酰胺的高摄取率不仅是由于其在核苷酸和氨基酸生物合成中作为氮源的作用，而且谷氨酰胺是癌症中主要的线粒体底物，并且是产生用于氧化还原控制和大分子合成的NADPH所需要的。
癌症中存在的其他代谢改变对生存具有重要作用，并且重要的是，许多癌症显示出令人惊讶的改变其代谢特征的良好能力。这种承受环境挑战(例如当葡萄糖、谷氨酰胺或氧含量较低时)的可塑性对于癌细胞的生存至关重要。
癌症中存在许多代谢改变，并且各种氨基酸(例如谷氨酰胺)在癌症代谢中具有重要作用，以控制氧化还原平衡并产生持续增殖的构建模块，此外，当需要适应新的代谢限制时，许多癌症表现出令人惊讶的利用这些替代途径来改变其代谢特征的良好能力。这种品质(能力)是癌症的一个重要特征，也是癌症在葡萄糖、谷氨酰胺或氧等代谢能源变得稀缺时抵御环境挑战的能力。
因此，为了通过代谢方法有效影响癌症，从多个方向影响其代谢系统非常重要。大多数癌细胞可以很容易地处理减少的葡萄糖，但如果几种代谢可能性同时受到影响(如减少葡萄糖和谷氨酰胺)，则这些变化的总和就会变得比单独的部分更具破坏性。
除了葡萄糖和谷氨酰胺(其是许多癌症的通用能源)之外，丝氨酸和甘氨酸也满足维持癌症细胞生长和增殖的重要特定需求，例如通过一碳代谢。除了大量的能量需求外，癌细胞还必须积累构建新细胞成分的构建模块，包括核酸、蛋白质和脂质，以及同等重要的用于维持其细胞氧化还原状态的辅助因子(Amelio et al.:Trends.Biochem.Sci.(2014),vol.39(4):191-198))。
研究表明，精氨酸对于细胞生长是必需的，并且在快速生长状态下可能成为限制性的，如果癌细胞中缺乏精氨酸的话也会影响存活(Albaugh et al.,J.Surg.Oncol.(2017),vol.115(3),273-280)。
鉴于上述情况，有人建议降低血糖可以作为针对广泛的糖酵解依赖性肿瘤的策略。在低血糖条件下，脂肪(尤其是酮体)可以取代葡萄糖作为正常细胞的主要代谢燃料。然而，许多肿瘤在代谢脂质和酮体获取能量所需的基因和酶方面存在异常。因此，从碳水化合物转变到酮类以获取能量专门针对糖酵解依赖性肿瘤细胞中的能量代谢(Seyfried etal,2010,Nutrition and Metabolism,7:7)。
根据该方法，例如，WO2011070527公开了一种治疗个体的(癌性或非癌性)增殖性疾病的方法，其中使用血液透析装置来降低血糖浓度。
使用血液透析装置来降低血糖的优点在于，可以降低血液中的葡萄糖浓度，从而以与饮食缺葡萄糖相比更受控且有效的方式降低。然而，WO2011070527中公开的方法和装置需要连接到血液摄入流、血液返回流和透析液的血糖传感器和血液谷氨酰胺传感器，这些传感器都连接到血液透析器的中央控制单元。此外，WO2011070527的中央控制单元还连接至脑电图仪(EEG)，以便向中央单元提供与启动葡萄糖和谷氨酰胺水平升高的自发脑电活动有关的信息。如此大量的传感器和仪器导致高度的复杂性和相关的高成本。此外，接受这种治疗的患者在接受治疗前几天必须仅摄入限制葡萄糖的饮食。这对患者来说并不是一个微不足道的负担。
一直需要改进治疗癌症的方法。更具体地，需要可用于治疗癌症的血液透析疗法中的透析液。
发明内容
本发明提供了一种用于治疗癌症的血液透析疗法中的透析液，其包含：
a)酮体，例如乙酰乙酸盐、β-羟基丁酸盐或其药学上可接受的衍生物、酯和盐；和
b)碳酸氢根离子
优选地，酮体的浓度为1-15mM。
更优选地，酮体的浓度为2-12mM。
优选地，碳酸氢根离子的浓度为15-50mM。
更优选地，碳酸氢根离子的浓度为20-40mM。
在一个优选的实施方案中，透析液中葡萄糖、丙酮酸的浓度和选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸及其衍生物的氨基酸的水解当量浓度的总和为至多3.3mM。
透析液可以含有一种或多种选自葡萄糖、丙酮酸和氨基酸的化合物，所述氨基酸选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸或其药学上可接受的衍生物。此类衍生物可以是盐或寡肽。如果透析液含有一定浓度的寡肽，则给出肽水解后参与的氨基酸的浓度(该浓度在本文中称为“水解当量浓度”)。此类寡肽(通常是二肽，其中至少一个氨基酸残基是谷氨酰胺)的实例是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。如果二肽L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为1mM，则该寡肽的丙氨酸和谷氨酰胺部分的水解当量浓度分别为1mM丙氨酸和1mM谷氨酰胺。不属于寡肽一部分的氨基酸的水解当量浓度简单地就是氨基酸或氨基酸衍生物的浓度。
含谷氨酰胺的寡肽，在本文中也称为含谷氨酰胺的化合物，通常用于代替液体组合物中的谷氨酰胺，以增强稳定性和溶解度。
优选地，透析液不含任何丙酮酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸或其衍生物。
优选地，透析液含有水解当量浓度为至多0.3mM的谷氨酰胺或其衍生物。
在本公开中，术语“受试者”涉及需要治疗的人类或动物患者。
术语“酮体”涉及含有酮基团的水溶性分子，其可由肝脏从脂肪酸产生。通常，根据本发明的酮体是β-羟基丁酸盐或其药学上可接受的衍生物，例如其对映异构体(R)-β-羟基丁酸、(S)-β-羟基丁酸盐，或对映异构体混合物，或其药学上可接受的盐，或其药学上可接受的酯，以及乙酰乙酸盐。中链甘油三酯也被认为是根据本发明的酮体的衍生物。术语“中链甘油三酯”或“MCT油”是具有两个或三个具有6-12个碳原子的脂肪族尾部的脂肪酸的甘油三酯。这种中链甘油三酯或MCT油可以在人体内转化为酮体。含有酮体或酮体衍生物的输注流体的示例有MCT/LCT 20％(B.Braun)或20％(FreseniusKabi)。更多示例可以在WO2018/114309A1中找到。
优选地，癌症是具有使得癌症依赖于葡萄糖和/或谷氨酰胺的代谢改变的癌症。通常，癌症选自人结肠癌和成胶质细胞瘤，以及前列腺癌、乳腺癌和肝癌。
在一个实施方案中，透析液含有药学上可接受量的药学上可接受的细胞抑制剂。
本公开的上述概述并不旨在描述每个实施方案或其每个实施方式。通过参考下面的详细描述和权利要求书，并结合附图，本公开的优点以及对本公开的完整理解将变得明显并且能够理解。
附图简要说明
图1是示例性体外血液处理系统的示意性框图，该系统可用于通过血液透析使用根据本发明的透析液来治疗癌症。
图2A、2B和2C示出了根据本发明的治疗目标。图2D和2E示出了与使用根据本申请的透析液进行透析相关的正常细胞和癌细胞附近可能的pH变化。图2F示出了使用根据本发明的透析液进行的腹膜透析使癌细胞对细胞抑制剂更敏感的假设。
图3a、3b、3c、3d、3e、3f、3g、3h、3i、3j和3k示出了研究1的结果的图表。
图4a、4b、4c和4d示出了研究2的结果的图表。
图5示出了A549和RCC4细胞在所示的培养基A-C中的生长速率。
图6示出了在21％或5％氧的培养基A-C中培养3天后，肺癌A549、肾癌RCC4和原代RCC细胞的量。星号表示通过双向方差分析(2way ANOVA)和Tukey多重比较测试确定的有显著差异的值。
图7示出了在添加8mM Acac、16mM BOHB或4mM Acac/8mM BOHB的组合的培养基A-C中，在常氧和缺氧条件下，培养人神经胶质瘤细胞系A172的结果。4和8mM LiCl用作Acac的对照。用星号表示通过单向方差分析(one-way ANOVA)和Sidak多重比较测试确定的有显著差异的值。
图8示出了神经胶质瘤细胞系U118MG在常氧和低氧下在添加有8mM Acac、16mMBOHB或4mM Acac/8mM BOHB的组合的培养基A-C中培养的结果。4和8mM LiCl用作Acac的对照。星号表示通过单向方差分析和Sidak多重比较测试确定的有显著差异的值。
图9示出了神经胶质瘤细胞系A172在常氧和低氧下在添加有8mM Acac、16mM BOHB或4mM Acac和8mM BOHB的组合的培养基B-C中的培养结果。4和8mM LiCl分别用作4mMAcac/8mM BOHB或8mM Acac的对照。星号表示通过单向方差分析和Sidak多重比较测试确定的有显著差异的值。
图10示出了神经胶质瘤细胞系U118MG在常氧和低氧下在添加有8mM Acac、16mMBOHB或4mM Acac和8mM BOHB的组合的培养基B-C中的培养结果。4和8mM LiCl分别用作4mMAcac/8mM BOHB或8mM Acac的对照。星号表示通过单向方差分析和Sidak多重比较测试确定的有显著差异的值。
图11示出了肾癌细胞系RCC4在常氧和缺氧下在添加有8mM Acac、16mM BOHB或4mMAcac和8mM BOHB的组合的培养基B-C中的培养结果。4和8mM LiCl分别用作4mM Acac/8mMBOHB或8mM Acac的对照。星号表示通过单向方差分析和Sidak多重比较测试确定的有显著差异的值。
图12示出实施例3的实验设置的示意图。使用5ml/min的血流速率在麻醉状态下在患有酮症的Sprague-Dawley大鼠中进行血液透析。在透析之前和之后以及60、90、120、180分钟时采集血液样品。在10、20、40、60、90、120、150和180分钟时采集透析液样品。
图13A、13B、13C和13D公开了透析期间酮、葡萄糖、尿素和血浆碱剩余在血浆中的浓度随时间的变化。
具体实施方式
本发明涉及一种用于治疗癌症的血液透析疗法的新型透析液。
专利申请PCT/EP2021/064592中描述了可以与本文公开的透析液一起使用的用于体外血液处理的示例性系统。此外，用于进行体外血液处理的系统和装置的非限制性示例可以在EP1 668 556、US 5,679,245、US 5,762,805、US 5,776,345和US5,910,252中找到。
在图1的示意图中，示例性体外血液处理系统50通常包括血液管道回路52，其包括可连接到患者血管系统的动脉管线52a和静脉管线52b。该装置包括过滤单元58，其具有由半透过滤膜59分隔的主腔室(血液室)和副腔室(透析液室)。主腔室的入口连接至血液抽取管线或动脉管线52a。类似地，主腔室的出口连接至血液返回管线或静脉管线52b。
副腔室的入口连接到新鲜透析液供应管线54b，该新鲜透析液供应管线54b又连接到用于提供新鲜透析溶液的源74。过滤单元58的副腔室的出口连接到透析溶液或用过的透析液管线54a，其将用过的透析溶液传送至流出物连接器73。
在本发明中，过滤单元58包括膜59，该膜59与传统的血液透析过滤膜的不同之处在于，其被配置为从血液管道回路112中的血液中去除相对较小的化合物。该膜被配置为具有截留分子量(MWCO)为50kDa或更小或者甚至40kDa或更小(例如30kDa或更小、10kDa或更小、5kDa或更小或者2kDa或更小)。
通过血液管线52a、52b和过滤单元58的血液流动由位于动脉管线52a中的血泵60控制。类似地，新鲜透析液通过供应管线54b中的透析液泵68从源74通过过滤单元58流至流出物收集器73，同时透析液管线54中的压力由透析液管线54a中的压力释放阀控制。或者，第二泵62可被包括在用过的透析液管线54a中来代替压力释放阀。
还可以存在连接到血液管线52b的静脉部分的一根或多根输注管线66、80、81、82。在一些实施方案中，这些输注管线中的一根或多根适于直接连接至患者的血管系统(图中未示出)。一根或多根输注管线66、80、81、82中的每一个可包括单独的泵。在一个实施方案中，可以通过这样的输注管线输注含有酮体或酮体衍生物的输注液体。
提供与血泵60、透析液泵68、一根或多根输注管线66、80、81、82中的一个或多个泵以及压力释放阀或附加透析液泵68通讯的系统计算单元64，以便提供对正在使用的那些设备的控制。在一个替代实施方案中，系统计算单元64经由图形用户界面向用户提供用于一根或多根输注管线66、80、81、82中的泵的合适的设置数据。系统计算单元还与输入装置通讯，以向系统处理单元64提供信息和指令。输入装置可以包括图形用户界面，例如可以通过使用触摸屏布置来控制的图形用户界面。在一些实施方案中，输入装置可以包括键盘。在一些实施方案中，输入装置可包括一个或多个传感器，用于检测患者血液和/或用过的透析液中的各种物质的浓度或状况。
如已经提到的，本发明提供了一种用于血液透析方法中的透析液。透析治疗的基本思想是通过使用半透膜和透析液来改变体液的组成。术语“体液”通常涉及血液，但也可以是待治疗的受试者的细胞内液。体液通过膜与透析液分离。该膜对于小分子是可渗透的，但对于较大分子是不可渗透的。因此，较小的体液成分可以通过膜，而较大的物质则保留在原处。结果是体液和透析液的浓度发生变化。这些变化的驱动力是扩散和渗透压。
由于有氧糖酵解或Wartburg效应在许多癌细胞中很常见，因此可以设定以下治疗目标：
a)降低体液中的葡萄糖以及柠檬酸循环的组分和源自这些组分的氨基酸的浓度，例如丙酮酸、丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸及其衍生物的浓度；
b)维持体液的生理pH值(pH值在7.2-7.6范围内)，因为有氧糖酵解过程中形成的乳酸可能会局部降低pH值；和
c)添加酮体以提供依赖有氧糖酵解的肿瘤无法依赖的能量来源。
图2A、2B和2C示出了本发明的一些治疗目标和原理的示例。每张图都公开了有关特定血液成分浓度的正常条件的示例。图8A显示患者在治疗开始时通常具有在0.20-0.8mM范围内的谷氨酰胺实际血液浓度GLNa。在使用不含谷氨酰胺或谷氨酰胺含量非常低的透析液治疗期间，谷氨酰胺的实际血液浓度降低至期望值GLNb，其在0.1-0.5mM的范围内，例如0.15-0.3mM。图2B显示患者在治疗开始时通常具有在4-8mmol/l范围内的葡萄糖实际血液浓度GLUCOSEa。在使用不含葡萄糖或葡萄糖含量低的透析液治疗期间，实际血液葡萄糖浓度会降低至期望值GLUCOSEb，该值通常在2–4mmol/l范围内。最后，图2C显示血液最初几乎不含任何酮体，例如β-羟基丁酸或其生理学上可接受的盐或酯，例如钠盐。因此，患者血液中酮体浓度的实际值KETONEa约为0。通常，最初使用的新鲜透析液不含任何酮体或仅含有少量酮体。在治疗期间，通过使用含有酮体的第二透析液，此类酮的血液浓度可以升高至1-15mmol/l范围，例如在2-12mM范围内的期望值KETONEb。透析液应含有缓冲液成分，例如碳酸氢盐，以有利于维持癌症肿瘤附近的生理pH。
图2D示出了正常健康细胞以及正常条件下癌细胞附近的pH。应该注意的是，正常健康细胞周围的pH值是中性至弱碱性，而癌细胞由于有氧糖酵解产生乳酸，周围的pH值呈弱酸性。这样的pH可能具有保护癌细胞的免疫抑制作用。这种癌症酸度已在Huber et al.,Seminars in Cancer Biology,vol.43(2017),pp.74-89中描述。
图2E显示了使用本发明的透析液进行透析对此类正常健康细胞和癌细胞的可能影响。在这两种情况下，细胞附近的pH值都会增加。这种增加是由两种不同的机制引起的。首先，本发明的透析液不含有或含有非常少量的用于有氧糖酵解的燃料。因此，产生较少的乳酸。其次，本发明的透析液还含有缓冲剂和弱碱性碳酸氢根离子，这也会增加pH值。碳酸氢盐是用于治疗终末期肾病的透析液中常用的缓冲物质。作为治疗的结果，图2E中的癌细胞未被酸性环境包围，因此不受任何免疫抑制层的保护。
在含有少量用于有氧糖酵解的燃料且具有非免疫抑制pH的环境中的特定癌细胞应该比正常条件下的相应癌细胞弱。因此，由于用本发明的透析液进行透析治疗应当削弱此类癌细胞，因此推测相应治疗的癌细胞应当对细胞抑制剂更敏感。图2F说明了这一假设。这两张图显示了癌细胞以及不同的非癌细胞的死亡率。随着癌细胞快速生长，它们比典型的非癌细胞对细胞抑制剂更加敏感。左图概述了未进行透析的情况，右图应当显示使用根据本发明的透析液进行透析时的情况。
参考例1
研究了不同人类癌细胞系对细胞培养基中葡萄糖、谷氨酰胺和酮的敏感性，从该细胞培养基中同时耗尽了选定的营养物质，以模拟癌症透析获得的条件。
研究1针对从肾细胞癌、结肠癌和胶质母细胞瘤中建立的一系列人类癌细胞系进行。在第一项研究中，在酮β-羟基丁酸酯浓度增加，同时限制葡萄糖和谷氨酰胺水平的情况下，研究对细胞生长活力的影响。还测试了向细胞培养基中添加柠檬酸盐。将细胞在这些条件下培养三天，然后测定细胞活力。在第一项研究中，发现当从培养基中耗尽了谷氨酰胺时对细胞活力的主要影响。
材料和方法
细胞培养条件
选择从人结肠癌(HCT15、NCI-H508和COLO205)、肾细胞癌(769-P、786-O和RCC4)和胶质母细胞瘤(LN-18、A-172和U-118MG)建立的细胞系用于分析。除了RCC4和HCT15购自Sigma-Aldrich(默克，德国)之外，所有细胞系均获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，LGC标准，英国)。此外，该研究还包括从患者肾脏切除术中分离出的原代人肾细胞癌(RCC)细胞。培养条件按照美国典型培养物保藏中心(ATCC)推荐，即在添加有1mM丙酮酸钠的DMEM培养基中生长细胞，丙酮酸钠也被添加到RPMI-1640培养基中以保持条件更相似。
根据ATCC的建议，将769-P、RCC4、LN-18、A-172、U-118MG和原代RCC细胞在DMEM高葡萄糖培养基中培养，而786-O HCT15、NCI-H508和COLO205在RPMI-1640培养基中培养。向两种培养基中均添加1％青霉素-链霉素和10％小牛血清。根据标准程序扩增细胞并冷冻等分试样。
根据“优化细胞接种密度以确保对数期生长的方案”，确定96孔板中每个细胞系的最佳接种密度。该方案如下：
·制备单细胞悬浮液并测量细胞计数/活力。
·在完全培养基中将细胞稀释至约160,000个细胞/mL。将200μL细胞添加到96孔板的顶行。将100μL完整培养基等分到所有其他孔中。每个板上需要少量的纯培养基对照孔作为空白。
·重复地，使用12孔通道移液器沿着板将细胞制剂按1份稀释为2份，即，将100μL细胞添加到下一行的100μL培养基中。然后，向所有孔中添加50μL完整培养基。将板盖上。
·将板在37℃、5％ CO2下孵育过夜。
·将50μL新鲜培养基添加到板孔中，以获得200μL的最终体积，并在37℃、5％ CO2下孵育72小时。
·根据制造商的方案，使用Cell Titer Glo测定法测量活力。
·将对数细胞数相对于发光强度绘图，以确定实现对数生长的细胞浓度。
使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(Promega)作为活力读数。
研究1.
对于每个细胞系，在第0天将上述确定的最佳细胞数接种到96孔板中。第二天，用PBS洗涤细胞，并将培养基更换为DMEM(Fisher Scientific)或RPMI-1640培养基(SaveenWerner)，其不含葡萄糖或L-谷氨酰胺，并添加有表3和文件“板概述”中列出的营养物质。每种情况处理三个孔。在测试条件培养基中孵育3天(每天更换培养基)后，使用CellTiter-Glo活力测试测定细胞活力。每个细胞系重复实验三次。
表1.癌细胞系和培养基
肾
769-P DMEM高葡萄糖
786-O RPMI-1640
RCC4 DMEM高葡萄糖
结肠
HCT15 RPMI-1640
NCI-H508 RPMI-1640
COLO205 RPMI-1640
脑
CRL2610(LN-18) DMEM高葡萄糖
A-172 DMEM高葡萄糖
U-118MG DMEM高葡萄糖
表2.正常培养基中所选营养物质的含量
表3测试条件研究1
BOHB(mM)
葡萄糖* 0 4 12
含有谷氨酰胺 100％ +/-柠檬酸盐
25％ +/-柠檬酸盐
0％ +/-柠檬酸盐
不含谷氨酰胺 100％ +/-柠檬酸盐
25％ +/-柠檬酸盐
0％ +/-柠檬酸盐
矩阵显示研究1中使用的不同生长条件的组合。*葡萄糖的量以用于每个细胞系的标准培养基中存在的浓度的百分比表示。在指明时，将1mM柠檬酸盐添加到培养基中。将所示营养物质添加到不含葡萄糖或L-谷氨酰胺的DMEM(Fisher Scientific)或RPMI-1640培养基(Saveen Werner)中。
表4产品订单信息
研究1的结果呈现在图6所示的图表中。存在的谷氨酰胺的减少和细胞培养基与细胞增殖的减少之间存在明显的联系。
研究2
如上文在研究1中所述，遵循ATCC推荐的培养条件。然而，丙酮酸盐是一种潜在的能量来源，其可能会影响结果。因此，在研究2中，在DMEM培养基中不添加丙酮酸钠的情况下，在两种细胞系A172(胶质母细胞瘤)和RCC4(肾细胞癌)中测试了与研究1相同的培养条件。结果如图7所示。如研究1所示，存在的谷氨酰胺的减少和细胞培养基与细胞增殖的减少之间存在明显的联系。然而，在细胞培养基中不含丙酮酸盐的情况下，结果更加明显得多。BOHB酮浓度的增加似乎也抑制了细胞增殖。
本文引用的所有专利、专利文献和参考文献均以其整体并入，如同每篇文献单独并入一样。本公开是参考说明性实施方案提供的，并且不意味着解释为限制意义。如前所述，本领域技术人员将认识到，其他各种说明性应用可以使用本文描述的技术并且利用本文描述的装置和方法的有益特性。当参考本说明书时，本公开的说明性实施方案以及附加实施方案的各种修改将是显而易见的。
实施例2
研究设计
生长培养基
为了研究营养物质受限的生酮环境对体外癌细胞生长的影响，配制了三种不同的细胞培养基。培养基A是常规培养细胞系的完全RPMI1640培养基。培养基B用作正常人血清中发现的条件的近似值。调整葡萄糖、谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸和精氨酸的水平以匹配人血清中发现的正常生理水平。这些营养物质的选择是基于它们被报道的作为能量来源的用途以及对癌细胞代谢状态的影响。培养基C用于模拟生酮的、营养物质受限的癌症透析条件。这里，将所选营养物质的水平降低至培养基B中生理水平的一半，并添加酮体BOHB。
每种培养基的组成在材料和方法中进行了描述，并列于表5-6中。
氧水平
人类癌细胞系通常在大气氧水平(21％ O2)下建立和培养，然而，组织中的生理氧水平相当低，变化范围为3-13％[Ward,Biochim Biophys Acta2008；1777:1-14]。在肿瘤微环境中，癌细胞的快速生长速度加上经常畸形和有缺陷的脉管系统通常会导致氧水平在0-5％范围内的缺氧区域。鉴于氧水平对能量代谢的影响[Xie et al.,J Biol Chem 2017；292:16825-16832]，并且为了进一步模拟体内的生理条件，在环境、21％ O2和更生理的5％O2两种条件下研究了癌细胞系在培养基A、B和C中的生长。
酮类
酮体乙酰乙酸盐(Acac)、BOHB和丙酮是由肝脏在禁食或饥饿期间产生的。BOHB是哺乳动物中主要的酮体，而Acac约占20％。大多数已发表的研究酮对癌细胞影响的体外研究主要集中在BOHB上，然而也有研究表明，与BOHB相比，添加Acac会产生不同的效果[Vallejo et al.,J Neurooncol2020；147:317-326]。为了进一步模拟两种酮都存在的体内生酮情况，并研究BOHB和Acac可能的差异效应，Acac也被纳入到研究中。
材料和方法
细胞系
除了来自Sigma-Aldrich(Merck)的RCC4之外，所有细胞系均购自ATCC(ATCC，LGC标准)。在获得患者知情同意并获得地区伦理委员会许可后，从瑞典哥德堡的萨尔格伦斯卡大学医院进行的肾脏切除术中分离出原代人肾细胞癌细胞。确定在标准细胞培养基中培养3天的96孔板中每种细胞系的最佳接种密度。
培养条件和添加剂
在37℃和5％ CO2的加湿室中，将细胞维持在RPMI-1640培养基(31870-025GIBCO)中，添加10％血清、200mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素(PEST)。对于低氧条件(5％O2)，将细胞维持在Galaxy 14S CO2培养箱(Eppendorf)中，其中使用N2将O2水平调节至5％。
如下制备培养基A、B和C。
培养基A：RPMI1640(31870-025，GIBCO)，添加1％ PEST、200mM L-谷氨酰胺和10％透析血清。透析血清用于减少氨基酸等小分子的量。
培养基B和C由不含L-谷氨酰胺、葡萄糖和氨基酸的RPMI1640改良培养基粉末(R9010-01，USBiological Life Sciences)制备。对于1L培养基，将7.4g粉末溶解在900ml无菌水中，无需加热，并添加2g碳酸氢钠。添加表5中列出的氨基酸至与完全的RPMI1640培养基中相同的浓度(表5)。所有添加完毕后，将培养基通过0.22um膜过滤灭菌并分装到两个瓶中。
在培养基B中，为了模拟生理条件，根据Mayo Clinic Laboratories的数据(https://www.mayocliniclabs.com/test-atalog/Clinical+and+Interpretive/9265)，将谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸和葡萄糖的水平设置为人血清中测量水平的中位数。
为了在培养基C中模拟癌症透析条件，将这些营养物质的水平降低至生理水平的50％。像培养基A那样，将1％ PEST和10％透析血清添加至培养基B和C中。培养基A-C中所选营养物质的浓度总结于表6中。丙酮酸钠是细胞培养基中常见的添加物，但在使用的任何培养基中都不存在。
表5.RPMI1640中的氨基酸浓度
表6.培养基A、B和C的营养物质组成
氨基酸和其他添加剂购自Sigma Aldrich。
添加所有营养物质后测量pH值。pH值如下：含10％非透析FBS、1％PEST和200mM L-谷氨酰胺的全RPMI1640，pH为7.78；培养基A，pH为7.56；培养基B，pH为7.62；培养基C，pH为7.57。
在水中制备DL-β-羟基丁酸钠盐(H6501，Sigma Aldrich)和乙酰乙酸锂(A8509，Sigma Aldrich)的储备溶液，将其进行无菌过滤，等分并储存在-20℃。氯化锂(L7026，Sigma Aldrich)用作Li-Acac中添加锂的对照。
活力测定
根据制造商的说明，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)来读取细胞数目。在图7-8所示的实验中，对双板进行接种和处理。一组板用于收集用于乳酸测量(见下文)和CellTiterGlo测定的培养基。实验结束时将另一组板冷冻在-80℃。冷冻的板旨在用于CyQuant细胞增殖测定(Thermo Fisher)，其测量每孔的DNA量。通过CellTiterGlo和CyQuant测定对细胞的量进行分析，会确保培养条件对活力或生长速率的影响不会被每个细胞ATP水平的同时变化所掩盖。
用于乳酸测量的培养基的收集
在图7-8所示的实验中，在第3天收集细胞培养基，将其转移至新的96孔板并冷冻于-80℃。该培养基可用于分析排出的乳酸的量，作为代谢状态的测量。有几种用于乳酸测量的试剂盒可供选择，例如Lactate-Glo测定(J5021，Promega)，其被设计用于存在血清的测定。
结果
实施例2被设计为回答以下问题：
-所选癌细胞系的生长是否受到在常氧或缺氧条件下在培养基C中模拟的癌症透析条件的影响？
在培养基A、B和C中的生长
第一步，如材料和方法中所述制备培养基A-C，并测试癌细胞系在这些培养基中生长的能力。建立了所选细胞系在每种培养基中随时间的生长曲线。在常氧(21％ O2)的A-C培养基中培养1、2和3天后，分析细胞数目。
如图5所示，与培养基A相比，将所选营养物质减少至如在培养基B中的更生理水平，显著降低了A549肺癌和RCC4肾癌细胞系的生长速率。与培养基A相比，培养基C进一步降低了生长速率。
癌细胞在常氧和缺氧条件下在培养基A-C中的生长
在图6中，显示了A549肺癌和RCC4肾癌细胞系以及原发性肾癌(RCC)细胞在常氧和缺氧下在培养基A-C中培养3天后的细胞的量。同样，与培养基A相比，在培养基B和C中在常氧下的生长速率降低。在5％ O2培养的细胞中也发现了相同的模式。同样，在RCC4中，与培养基B中的条件相比，培养基C中的低营养物质水平和BOHB的添加没有产生显著的额外效果。
对于A549，在培养基B和C之间发现生长速率小幅但显著降低，但仅限于常氧条件下。
本研究中包括来自三名患者的原发性肾癌细胞。与已建立的细胞系类似，与培养基A相比，这些细胞在培养基B和C中的生长速率降低。
总体而言，将氧压从21％(常氧)更改为5％ O2(缺氧)对这些细胞的生长速度的影响非常有限。
接下来，决定将Acac也纳入研究中，并分析在培养基A-C中单独或组合存在BOHB和Acac的情况下培养的细胞的活力。实验在21％和5％ O2下进行。该实验是用神经胶质瘤细胞系A172和U118MG进行的。
作为一种手性分子，BOHB以D-BOHB和L-BOHB两种对映体形式存在。D-BOHB通常在人体中产生和代谢。本研究中使用的BOHB盐包含50:50的D-BOHB和L-BOHB的混合物。为了确保活性D-形式的高含量，将添加的BOHB总浓度增加至16mM，得到8mM D-BOHB的水平。为了保持活性酮的总浓度恒定，使用8mM Acac，并且对于两种酮的组合，将水平调整为4mM Acac和8mM BOHB(含有4mM D-BOHB)。
可用于体外用途的Acac是锂盐的形式。由于锂本身可以影响癌细胞的活力[Cohen-Harazi et al.,Anticancer Res 2020；40:3831-3837]，因此使用8mM LiCl作为8mM Acac数据点的对照，并且使用4mM LiCl作为4mM Acac/8mM BOHB数据的对照。
实验结束时，收集并冷冻每个孔的培养基，以便随后测定乳酸水平作为代谢状态的测量。此外，还进行了双重实验，其中一组板被冷冻，以便随后使用CyQuant增殖测定对细胞数目进行定量，而另一组中的细胞数目则通过CellTiterGlo活力测定进行分析。
BOHB和Acac单独或联合添加的效果
如图7-8所示，初始实验给出了关于营养物质减少条件下高酮浓度对A172和U118MG神经胶质瘤细胞系生长的影响的有希望的数据。
在培养基A中，在常氧和缺氧条件下，单独添加16mM BOHB对A172或U118MG细胞没有生长抑制作用，并且与8mM LiCl对照相比，8mM Acac没有进一步减少细胞数目。
然而，与4mM LiCl对照相比，在常氧条件下添加4mM Acac与8mM BOHB的组合显著减少了培养基A中A172细胞的数目。
常氧对照样品中的技术错误干扰了对培养基B结果的解释。然而，在缺氧的A172细胞中，BOHB使细胞数目显著减少至不含BOHB的培养基B中细胞数目的约70％。在缺氧的U118MG细胞中也观察到类似的减少。
此外，在培养基B中，与8mM LiCl对照相比，8mM Acac显著减少了两种细胞系中的细胞数目，但仅限于在21％ O2下。
在培养基C中，与8mM LiCl对照相比，单独添加8mM Acac并未显著减少细胞数目。然而，在两种细胞系中，在21％和5％ O2条件下，与不含BOHB的培养基C相比，添加16mMBOHB均使细胞数目显著减少至30％左右。
此外，与4mM LiCl对照相比，BOHB和Acac的组合在两种细胞系和两种氧水平下均导致培养基C中的细胞数目显著减少。
这些结果表明，单独添加高水平的BOHB或Acac不会抑制神经胶质瘤细胞在富含营养物质的环境(如培养基A)中的生长。同样，在具有更多生理营养物质水平的培养基B中，当添加酮类时，仅观察到很小的差异。在培养基C中发现了最大的效果，其中在缺氧和常氧条件下，单独的16mM BOHB以及8mM BOHB与4mM Acac的组合与各自的对照相比均显著减少了细胞数目。当单独添加8mM Acac时，没有看到这种情况。
然而，重复这些实验(重点关注常氧条件下的培养基B和C)却得出了不一致的结果。图9-11显示了实验2-6的神经胶质瘤细胞系A172和U118MG以及肾癌细胞系RCC4的组合结果。当单独添加BOHB或Acac时，在培养基C中观察到生长减少的趋势，尤其是在A172细胞系中。
实施例2的第一部分和第二部分的结果表明癌细胞系在营养物质受限的环境中生长较慢。尽管增殖率降低，但测试的细胞系在培养基B和C中似乎仍能存活。第三天对细胞进行光学检查没有发现任何漂浮的细胞，而漂浮的细胞可能是死细胞的迹象。
该研究的第三部分的数据显示，神经胶质瘤细胞系对营养物质受限的培养基C中高水平的BOHB或者BOHB与Acac的组合的敏感性增加。然而，对于肾癌细胞系RCC4没有发现这种敏感性。
实施例3
在该实施例中，给大鼠喂食水和生酮饮食，然后进行透析。测定了透析对血液酮、乳酸盐和实际HCO3的影响。
方法
动物
实验在六只平均体重为316g(305-318)的雄性Sprague-Dawley大鼠中进行，实验前五天给予水和生酮食物(Kliba-Nafag 2201生酮饮食XL75:XP10)。根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南对这些动物进行治疗。隆德大学动物研究伦理委员会批准了这些实验(Dnr 5.8.18-08386/2022)。将大鼠小心地放入有盖的玻璃容器中，该容器连接有连续供应的空气中的5％异氟烷(Isoban，Abbot Stockholm，瑞典)。完全麻醉后，将大鼠轻轻地从容器中提起。使用小面罩中输送的空气中的1.6-1.8％异氟醚维持麻醉。气管切开术后，使用4cm H2O的正终末呼气压将大鼠连接至容量控制型呼吸机(Ugo Basile；生物研究仪器，Comerio，意大利)。体温保持在37.1℃至37.3℃之间，使用反馈控制加热垫进行控制。呼末pCO2保持在4.8至5.5kPa之间(Capstar-100，CWE，Ardmore，Pa)。右股动脉被插管以连续监测心率和平均动脉压(MAP)；获取血液样本(95μL)以测量葡萄糖、尿素、电解质、血红蛋白和血细胞比容(I-STAT，Abbott，Abbott Park，IL)和血液酮(FreeStyle Precision Neo，Abbott，Abbott Park，IL)。右股静脉被插管并使用塑料管连接至透析器。右股动脉也被插管并连接到压力传感器以连续监测动脉管路压力，并连接到通过塑料管连接至透析器的血液泵(Masterflex Ismatec，Cole-Parmer，IL)。连接之前，用4％白蛋白(Albunorm，Octapharma Nordic AB，瑞典)灌注血液回路，其中添加了肝素50IE(肝素LEO 5000IE/ml，Leo Pharma AB，瑞典)。透析回路在含有新鲜透析液(Hemosol B0，Baxter Healthcare，IL)的玻璃圆筒入口处连接至泵，该透析液具有以下组成：
活性物质 mmol/L
钠 Na+ 140
钙 Ca2+ 1.75
镁 Mg2+ 0.5
氯化物 Cl- 109.5
碳酸氢盐 HCO3 - 32
乳酸盐 3
透析器的出口还连接到蠕动泵，该蠕动泵将用过的透析液泵送到玻璃圆筒中。将两个玻璃圆筒均放置在秤上，以确保没有液体从动物体内流失(图12)。右颈内静脉被插管用于输注含有51Cr-EDTA的维持液。通过离心细的毛细玻璃管测定血细胞比容。实验结束后，通过静脉推注氯化钾对动物实施安乐死。
实验方案
使用从Baxter Healthcare(Hechingen，德国)获得的包含高通量膜(Polyflux、HF-)的微型毛细管透析器装置进行三小时的血液透析期间。在透析之前和透析之后30分钟以及HD期间的60、90、120和180分钟采集动脉血样本。在透析之前以及在10、20、40、60、90、120、150和180分钟收集透析液样品，并在伽玛计数器(Wizard1480，LKP Wallac，Turku，Finland)上进行分析以确定51Cr-EDTA活性。
统计方法
除非另有说明，否则数据显示为中位数(四分位距)。使用渐进弗里德曼综合检验(硬币包)评估显著差异，如果显著差异，则随后进行Wilcoxon-Nemenyi-McDonald-Thompson事后检验。两个血酮值高于测量范围(8.0mmol/L)。在统计分析之前，将其设置为8.0mmol/L。由于它们是数据集中的最高值，因此8mmol/L的值可确保(i)中位数(IQR)不受影响，以及(ii)数据点将获得最高且相同的排名。P值低于5％被认为是显著的。使用R formac版本4.1.1进行计算。
结果
基线参数
六只Sprague-Dawley大鼠接受生酮饮食五天，体重增加(最小-最大)10至37克。透析之前，中位动脉pH值为7.43(7.42至7.44)，实际碳酸氢盐为20.4mmol/L(19.8至21.3)，标准碱剩余为-3.5mmol/L(-4.0至-2.2)，pO2为12.4kPa(12.2至12.7)，pCO2为4.0kPa(4.0至4.3)。透析进行三小时，然后将血液返回动物体内，然后在实验终止前休息30分钟。治疗和基线参数如下：
基线参数
参数 值
平均动脉压，mm Hg 69(62-73)
心率 329(315-356)
动脉血氧饱和度(SO2)％ 98(97-98)
血浆钠，mmol/l 138.5(138.0-139.8)
血浆钾，mmol/l 3.8(3.8-3.9)
血浆氯化物，mmol/l 103(103-103)
血浆离子化的钙，mmol/l 1.28(1.27-1.34)
血浆乳酸盐，mM 2.9(2.1-3.9)
治疗参数
血液流速(QB)，mi/min 1.0
透析液流量(Qd)，ml/min 5ml/min
透析液钠，mM 140
透析液钾，mM 4
透析液碳酸氢盐，mM 32
透析液钙，mM 1.75
透析液乳酸盐，mM 3
血液透析不显著降低血液酮水平
透析之前和透析180分钟后，血液酮水平相似，分别为3.5mmol/l(2.2-5.6)和3.8mmol/l(2.2-5.1)(P＝0.53)，透析期间酮浓度无显著差异(图13A)。数据如下表所示：
组别 酮mmol/l 乳酸盐mmol/l 实际HCO3 -mmol/l
透析之前 3.5(2.2–5.6) 2.9(2.0–3.9) 20.4(19.8–21.3)
90min 3.5(2.0–5.5) 1.9(1.3–2.8) 22.8(22.4–24.2)
180min 3.8(2.2–5.1) 2.0(1.9–2.2) 23.5(22.1–24.9)
透析之后30min 3.7(2.2–5.6) 1.6(1.5–1.8) 23.5(22.1–25.0)
渐进弗里德曼检验
P值 0.49 0.39 0.02
透析效果的95％CI [-0.2至0.4] [-0.3至0.5] [0.3至0.6]
尿素减少率(URR)为38％(25-42)，葡萄糖减少率为36％(29-43)，其浓度在治疗过程中降低(图13C、13B)。数据如下表所示：
在整个透析期间内，血液至透析液的51Cr-EDTA清除率稳定，为1.0ml/min(0.7-1.1)。单池Kt/V尿素为0.57(0.52-0.63)，计算公式如下：Kt/V＝–log(1–URR-0.024)。假设体内总水分占体重的70％，这意味着尿素血浆至透析液的清除率为0.67ml/min(0.62至0.80)。
透析过程中对酸碱和血液化学的影响
透析期间血浆碱剩余增加(图13D)。与此一致的是，透析180分钟后动脉pH值从7.42(7.42-7.44)增加至7.51(7.49-7.52)(P＝0.005)。血液透析180分钟后动脉pCO2无显著差异，透析之前为4.0(4.0-4.3)kPa，透析之后为4.0(3.7-4.2)kPa(P＝0.81)。透析前后血红蛋白水平无显著差异，分别为113g/L(106-118)和116g/L(111-118)(P＝1.00)。血浆钾从透析之前的3.8mmol/L(3.8-3.9)增加到透析180分钟后的4.5mmol/L(P＝0.03)，而血浆钠没有显著差异(表3)。
讨论
本实施例表明，尽管酮类(β-羟基丁酸盐、乙酰乙酸盐和丙酮)的低分子量意味着它们会被血液透析有效地去除，但以生酮饮食饲养的大鼠的血液酮水平相对不受血液透析的影响。事实上，与酮-酸具有大致相同大小的分子(例如尿素)被有效去除，甚至更大的分子如51Cr-EDTA也被有效地从血液中清除。
此处透析液血液流速(Qb)被设置为1ml/min，这与大鼠血液透析的其他实验模型(Fukunaga et al.,PLoS One.2020；15:e0233925)类似。在此血液流速下，过滤器前动脉压稳定且为正值，典型值为40-50mmHg。为了阐明该血液流速如何对应于进行血液透析的人，可以相对于分布体积来设置该血液流速。例如，对于尿素，分布体积大约等于体内总水量(TBW)，其为大鼠体重的约70％。因此，300g大鼠的TBW为210ml，这意味着1ml的血液流速可从尿素中清除约0.47％的TBW。对于TBW为42L的70kg的成人，这对应于42x 0.47％＝200ml/min的血液流速。如今，血液流速通常为250ml/min或更高，尤其是在接受血液透析滤过治疗的患者中。另一方面，我们使用的透析液流速为5ml/min，远高于Qb，这意味着溶质传输将受到血流量而不是透析器膜或透析液流量的限制。事实上，与此相符的是，所估计的尿素和51Cr-EDTA(比尿素大得多的分子)的血浆至透析液清除率几乎相同，尿素为0.67ml/min，51Cr-EDTA为0.66ml/min。
我们还发现生酮饮食会导致大鼠轻度代谢性酸中毒，血浆乳酸盐也有非常轻微的增加。此前曾在用生酮饮食饲养的奶牛中观察到乳酸盐略有升高(Zhang et al.,Researchin Vetrenary Science,2016,107:246-256)。此外，透析期间钾水平略有升高，至4.5mmol/l。这可能是由于手动将钾20mmol添加到5L新鲜透析液的袋中，由于钾溶液体积和成分的公差，这可能会导致实际透析液浓度与4mmol/l不同。最后，透析之前出现轻微高血糖，这与之前在小鼠中的研究(Meidenbauer et al.,Faseb Journal,2013,27)一致，在该研究中他们还注意到生酮饮食后胰岛素水平较低。

Claims (9)

1.一种用于治疗癌症的血液透析疗法中的透析液，其包含：
a)酮体，例如乙酰乙酸盐、β-羟基丁酸盐或其药学上可接受的衍生物、酯和盐；和
b)碳酸氢根离子。
2.根据权利要求1所述的透析液，其中酮体的浓度为1-15mM。
3.根据权利要求2所述的透析液，其中酮体的浓度为2-12mM。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的透析液，其中碳酸氢根离子的浓度为15-50mM。
5.根据权利要求4所述的透析液，其中碳酸氢根离子的浓度为20-40mM。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的透析液，其中葡萄糖、丙酮酸的浓度和选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸及其衍生物的氨基酸的水解当量浓度的总和为至多3.3mM。
7.根据权利要求6所述的透析液，其中所述流体不含任何丙酮酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸或其衍生物。
8.根据权利要求7所述的透析液，其中所述流体含有水解当量浓度为至多0.3mM的谷氨酰胺或其衍生物。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的透析液，其中所述流体还含有药学上可接受量的药学上可接受的细胞抑制剂。
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