CN118325984A

CN118325984A - 糖化和发酵纤维素材料的方法

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Publication number: CN118325984A
Application number: CN202410528340.5A
Authority: CN
Inventors: H·徐; J·弗里克曼; J·刘; K·S·约翰森; H·Z·黄
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2013-11-01
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2024-07-12

Abstract

本发明涉及糖化纤维素材料的方法，这些方法包括在浓度处于大于10％的饱和度的溶解氧的存在下使该纤维素材料经受过氧化氢酶和包括GH61多肽的纤维素分解酶组合物。本发明还涉及使用包括本发明的糖化步骤的方法生产所希望的发酵产物如乙醇的方法。

Description

糖化和发酵纤维素材料的方法

本申请是申请号为201480057648.0、申请日为2014年10月31日、名称为“糖化和发酵纤维素材料的方法”的专利申请的分案申请。

对序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。

背景

纤维素材料为产生化石燃料的可替代能源提供了一个有吸引力的平台。将纤维素材料(例如，来自木质纤维素原料)转化成生物燃料具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋材料的合意性以及生物燃料(如乙醇)的清洁性。木材、农业废弃物、草本作物以及城市固体废物已被认为是用于生物燃料生产的原料。一旦将纤维素材料糖化并转化成可发酵的糖(例如，葡萄糖)，那么这些可发酵的糖就可以被酵母发酵成生物燃料(如乙醇)。

在过去十年里已经研发了新的且改进的酶和酶组合物并且已经使得预处理的纤维素材料的糖化变得更有效。然而，仍需要改进预处理的纤维素材料的糖化以及用于生产生物燃料的方法。

发明概述

在此描述了将纤维素材料糖化成可发酵的糖的方法。还描述了通过糖化和发酵从纤维素材料(如预处理的纤维素材料)生产发酵产物(如乙醇)的方法。

在一个方面中，本发明涉及糖化纤维素材料的方法，这些方法包括在浓度处于至少0.5％的饱和度的溶解氧的存在下使该纤维素材料经受过氧化氢酶、纤维素分解酶组合物和GH61多肽。

在另一个方面中，本发明涉及生产发酵产物的方法，这些方法包括：

(a)在浓度处于至少0.5％的饱和度的溶解氧的存在下使纤维素材料经受过氧化氢酶、纤维素分解酶组合物和GH61多肽；

(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料；并且

(c)任选地从(b)中回收该发酵产物。

在一个实施例中，纤维素材料已经例如通过化学和/或物理预处理(如稀酸和/或蒸汽爆炸预处理)而被预处理。在一个实施例中，纤维素材料是未洗涤的，如未洗涤的预处理的玉米秸杆(uwPCS)。

使用本发明的方法将预处理的纤维素材料糖化/水解成糖。可以将这些糖转化为许多有用的所希望的物质，例如燃料、可饮用乙醇和/或发酵产物(例如，酸、醇、酮、气体等)。

糖化的预处理的纤维素材料可以是以下糖，这些糖可以用在用于生产糖浆(例如，高果糖玉米糖浆(HFCS))和/或塑料(例如，聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯)、聚乳酸(例如，用于生产PET)的工艺中。

定义

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、包含(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本发明的目的，使用每ml的100mM乙酸钠(pH 5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme International Ireland,Ltd.)，布瑞公司(Bray,Co.)，威克洛郡，爱尔兰)以总体积200微升在40℃下持续30分钟，随后通过HPX-87H柱色谱(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)进行阿拉伯糖分析来确定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。

α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指一种α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖苷酸水解成D-葡糖醛酸酯和醇。出于本发明的目的，根据德弗里斯(de Vries)，1998，细菌学杂志(J.Bacteriol.)180:243-249来确定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于在pH 5、40℃下每分钟能够释放1微摩尔葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据文丘里(Venturi)等人，2002，来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性(Extracellular beta-D-glucosidase fromChaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and somebiochemical properties)，基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)42:55-66描述的基本程序来确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在包含0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指一种β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-木寡糖的外水解，以从非还原性末端去除连续的D-木糖残基。可以在包含0.01％20的100mM柠檬酸钠中，在pH 5、40℃下，使用1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物确定β-木糖苷酶活性。出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，在包含0.01％20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。

生物质材料：术语“生物质材料”是指任何含糖生物质(例如，植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树叶、树枝和树木)及其任何组分(如纤维素、半纤维素或木脂素)。应理解的是，除非另外说明，否则生物质材料包括未处理的、预处理的和水解的或部分水解的形式(例如，生物质降解产物，如寡糖)。

过氧化氢酶：术语“过氧化氢酶”意指一种过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(E.C.1.11.1.6或E.C.1.11.1.21)，其催化将两个过氧化氢转化为氧和两个水。可以基于以下反应通过在240nm下监测过氧化氢的降解而确定过氧化氢酶活性：

2H₂O₂→2H₂O+O₂

在25℃下，在具有10.3mM底物(H₂O₂)和大约100个单位的酶/ml的50mM磷酸盐(pH7)中进行该反应。用分光光度计监测16-24秒内的吸光度，这应该对应于从0.45至0.4的吸光度降低。可以将一个过氧化氢酶活性单位表示为在pH 7.0和25℃下每分钟降解一微摩尔的H₂O₂。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何包含β-1,4-连接葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的还原性或非还原性末端释放纤维二糖(泰里(Teeri)，1997，结晶纤维素降解：对纤维二糖水解酶的功能的新认识(Crystalline cellulosedegradation:New insight into the function of cellobiohydrolases)，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)15:160-167；泰里等人，1998，里氏木霉纤维二糖水解酶：对结晶纤维素为何如此有效？(Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficienton crystalline cellulose？)，生物化学学会会刊(Biochem.Soc.Trans.)26:173-178)。根据里弗(Lever)等人，1972，分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279；范·帝伯赫(vanTilbeurgh)等人，1982，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)，149:152-156；范·帝伯赫和克莱森斯(Claeyssens)，1985，欧洲生化学会联合会快报，187:283-288；以及汤美(Tomme)等人，1988，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)170:575-581所描述的程序来确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，汤美(Tomme)等人的方法可以用于确定纤维二糖水解酶活性。

纤维素分解酶组合物：术语“纤维素分解酶组合物”意指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，2006，纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略(Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies)，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481中所综述的。通常使用不溶性底物对总纤维素分解活性进行测量，包括沃特曼一号(Whatman№1)滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木质纤维素等。最常用的总纤维素分解活性测定法是使用沃特曼一号滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)(高斯(Ghose)，1987，纤维素酶活性的测量(Measurement of cellulase activities)，纯粹与应用化学(Pure Appl.Chem.)59:257-68)确立的。

出于本发明的目的，通过测量在以下条件下与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比，由一种或多种纤维素分解酶对纤维素材料的水解/糖化的增加来确定纤维素分解酶活性：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g于PCS(或其他预处理的纤维素材料)中的纤维素，在适合的温度(例如50℃、55℃、60℃或65℃)下持续3-7天。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO₄，50℃、55℃、60℃或65℃，72小时，通过HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)进行糖分析。

纤维素材料：术语“纤维素材料”是指包含纤维素(β-(1-4)-D-葡聚糖(包含β(1-4)连接的D-葡萄糖单元的聚合物)的一种化学上均质的寡糖或多糖)的任何生物质材料。尽管纤维素一般为多态的，但可发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树叶、树枝和树木中。纤维素材料可以是，但不限于：草本材料、农业废弃物、林业废弃物、城市固体废物、废纸、以及纸浆和造纸厂废弃物(参见，例如，维色洛戈尔(Wiselogel)等人，1995，于生物乙醇手册(Handbook onBioethanol)(查尔斯·E·怀曼(Charles E.Wyman)编辑)，第105-118页，泰勒弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区(Washington D.C.)；怀曼(Wyman)，1994，生物资源技术(Bioresource Technology)50:3-16；林德(Lynd)，1990，应用生物化学与生物技术(Applied Biochemistry and Biotechnology)24/25:695-719；莫思尔(Mosier)等人，1999，木质纤维素的生物转化的最近进展(Recent Progress in Bioconversion ofLignocellulosics)，于生化工程/生物技术进展(Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology)，T.舍佩尔(T.Scheper)主编，第65卷，第23-40页，施普林格出版社(Springer-Verlag)，纽约)。纤维素材料包括任何形式的纤维素，例如降解或水解为寡糖的多糖。在此应理解的是，纤维素可以呈木质纤维素组分的形式，即在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。

在一个方面中，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面中，纤维素材料是农业废弃物。在另一个方面中，纤维素材料是木材(包括林业废弃物)。在另一个方面中，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面中，纤维素材料是废纸。在另一个方面中，纤维素材料是纸浆和造纸厂废弃物。

在另一个方面中，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面中，纤维素材料是麦秸。在另一个方面中，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面中，纤维素材料是玉米芯。在另一个方面中，纤维素材料是柳枝稷。在另一个方面中，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面中，纤维素材料是稻秸。在另一个方面中，纤维素材料是芒草。在另一个方面中，纤维素材料是芦竹。在另一个方面中，纤维素材料是竹子。在另一个方面中，纤维素材料是橘皮。在另一个方面中，纤维素材料是杨树。在另一个方面中，纤维素材料是松树。在另一个方面中，纤维素材料是白杨。在另一个方面中，纤维素材料是冷杉。在另一个方面中，纤维素材料是云杉。在另一个方面中，纤维素材料是柳树。在另一个方面中，纤维素材料是桉树。

在另一个方面中，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是棉短绒。在另一个方面中，纤维素材料是无定形磷酸处理的纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是滤纸。

在另一个方面中，纤维素材料是水生生物质。如在此使用的，术语“水生生物质(aquatic biomass)”意指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。该水生生物质可以是藻类；沉水植物；挺水植物；以及浮叶植物。

该纤维素材料可以按原样使用或可以使用本领域已知的常规方法经受预处理(预处理的纤维素材料)，如在此所描述。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。

溶解氧饱和度：在标准氧分压(0.21个大气压)下确定氧的饱和度。标准氧分压下的饱和度取决于温度和溶质浓度。在一个水解过程中的温度是50℃的实施例中，取决于溶质浓度，饱和度典型地应处于5-5.5mg氧/kg浆料的范围内。因此，在50℃下0.5％至10％的饱和度的溶解氧浓度对应于从0.025ppm(0.5x 5/100)至0.55ppm(10x 5.5/100)的范围内的溶解氧量，例如像0.05至0.165ppm，并且在50℃下10％-70％的饱和度的溶解氧浓度对应于从0.50ppm(10x 5/100)至3.85ppm(70x 5.5/100)的范围内的溶解氧量，例如像1至2ppm。在一个实施例中，按0.5至5ppm的范围内的量添加氧，例如0.5至4.5ppm、0.5至4ppm、0.5至3.5ppm、0.5至3ppm、0.5至2.5ppm、或0.5至2ppm。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指一种内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481)。出于本发明的目的，根据高斯(Ghose)，1987，纯粹与应用化学(Pure and Appl.Chem.)59:257-268的程序，在pH5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物确定内切葡聚糖酶活性。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61多肽”意指根据亨利萨特(Henrissat)，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(Aclassification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；和亨利萨特和贝洛赫(Bairoch)，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。现在GH61多肽被归类为溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase)(昆兰(Quinlan)等人，2011，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)208：15079-15084；菲利普斯(Phillips)等人，2011，ACS化学生物学(ACS Chem.Biol.)6：1399-1406；林(Lin)等人，2012，结构(Structure)20：1051-1061)并放入一个认定为“辅助活性(Auxiliary Activity)9”或“AA9”的新家族。

GH61多肽通过具有纤维素分解活性的酶增强纤维素材料的水解/糖化。出于本发明的目的，纤维素分解增强活性通过测量来自由纤维素分解酶在以下条件下水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来确定：1-50mg总蛋白/g于PCS中的纤维素，其中总蛋白质由50％-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白以及0.5％-50％w/w GH61多肽的蛋白构成，在合适的温度(例如，50℃、55℃或60℃)下持续1-7天，与用相等的总蛋白负载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g于PCS中的纤维素)的对照水解相比较。在一个优选方面中，将在2％-3％的总蛋白重量米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014，重组产生于米曲霉中)或2％-3％的总蛋白重量烟曲霉β-葡糖苷酶(如描述于WO 02/095014中，重组产生于米曲霉中)的纤维素酶蛋白负载的存在下的1.5L(诺维信公司(Novozymes A/S)，巴格斯韦德丹麦)的混合物用作纤维素分解活性的来源。

GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍、更优选至少1.05倍、更优选至少1.10倍、更优选至少1.25倍、更优选至少1.5倍、更优选至少2倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、甚至更优选至少10倍、以及最优选至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解/糖化。

阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶”意指一种4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶(EC 3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸酯(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)也被称为阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。出于本发明的目的，在50mM乙酸钠(pH 5.0)中，使用0.5mM对硝基苯基阿魏酸酯作为底物确定阿魏酸酯酶活性。一个单位的阿魏酸酯酶等于在pH 5，25℃下每分钟能够释放1微摩尔的对硝基酚根阴离子的酶量。

半纤维素：如此处使用的，术语“半纤维素”是指生物质材料除了纤维素之外的寡糖或多糖。半纤维素在化学上是异质的并包括通过氢键结合到植物细胞壁中的纤维素微纤维的呈复杂的异质的枝状和线性多糖或寡糖的多种聚合的糖，主要是D-戊糖，例如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、以及甘露聚糖，并且其中木糖通常呈最大量。半纤维素可共价地附接到木质素，并通常氢键合到纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质，形成高度复杂结构。半纤维素材料包括任何形式的半纤维素，例如降解或水解为寡糖的多糖。在此应理解的是，半纤维素可以呈木质纤维素组分的形式，即在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。

半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(若干种)水解半纤维素材料的酶。参见例如沙勒姆(Shallom)和肖汉姆(Shoham)，2003，微生物半纤维素酶(Microbial hemicellulases)，微生物学当前观点(CurrentOpinion In Microbiology)6(3)：219-228。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以通过数字进行标记而被分配到GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族(例如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes)(CAZy)数据库中获得。可以根据高斯(Ghose)和比萨拉(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学(Pure&AppI.Chem.)59:1739-1752测量半纤维素分解酶活性。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的成分中除去的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝，或使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。成熟多肽可使用SignalP程序(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)预测。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在此被定义为编码具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。成熟多肽编码序列可使用SignalP程序(尼尔森((Nielsen)等人，1997，见上文)预测。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

多肽片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽。在一个方面中，片段包含参比成熟多肽的至少85％的氨基酸残基，例如至少90％的氨基酸残基或至少95％的氨基酸残基。

严格条件：对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，非常低至非常高严格条件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严格在25％甲酰胺中，对于中和中-高严格在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严格在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2％ SDS在45℃下(非常低严格)、在50℃下(低严格)、在55℃下(中严格)、在60℃下(中-高严格)、在65℃下(高严格)以及在70℃下(非常高严格)洗涤三次，每次15分钟。

对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言，严格条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390)的计算法所计算的Tm之下约5℃至约10℃下，在每ml 0.9M NaCl、0.09M Tris HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％ NP 40、1X登哈特(Denhardt)溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终在所计算的Tm之下5℃至10℃下，在6X SCC加0.1％ SDS中洗涤一次(持续15分钟)并且使用6X SSC洗涤两次，每次15分钟。

亲本酶：术语“亲本”意指对其作出改变以产生变体的酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。

预处理的玉米秸杆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过预处理(例如，通过加热和稀硫酸预处理、碱预处理或中性预处理)源自玉米秸秆的纤维素材料。

序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有生物活性的片段。

变体：术语“变体”意指在一个或多个位置包含改变(即，一个或多个(例如，若干个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失)的几丁质结合蛋白。取代意指用不同的氨基酸替换占据一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加氨基酸。

木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解包含木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总木聚糖分解活性，和(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如，内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。在若干出版物中对木聚糖分解酶的测定的最近进展进行了总结，包括：别雷(Biely)和普查德(Puchard)，木聚糖分解酶的测定的最近进展(Recent progress in theassays of xylanolytic enzymes)，2006，食品与农业科学杂志(Journal of the Scienceof Food and Agriculture)86(11):1636-1647；斯潘妮科娃(Spanikova)和别雷，2006，葡糖醛酸酯酶-由裂褶菌产生的新型碳水化合物酯酶(Glucuronoyl esterase-Novelcarbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune)，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)580(19):4597-4601；赫尔曼(Herrmann)等人，1997，里氏木霉的β-D-木糖苷酶是一种多功能β-D-木聚糖木糖水解酶(The beta-D-xylosidase of Trichodermareeseiis a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase)，生物化学杂志(Biochemical Journal)321:375-381。

可以通过确定由不同类型的木聚糖，包括例如燕麦木聚糖、山毛榉木材木聚糖、和落叶松木材木聚糖形成的还原糖，或者通过光度确定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段，测量总木聚糖降解活性。最常见的总木聚糖分解活性测定是基于从多聚4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如在贝利(Bailey)等人，1992，用于木聚糖酶活性测定的方法的实验室测试(Interlaboratory testing of methods for assay of xylanaseactivity)，生物技术杂志(Journal of Biotechnology)23(3):257-270中所述的。木聚糖酶活性还可以在37℃下在0.01％X-100和200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中用0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下，在200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中从作为底物的0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖中每分钟生成1.0微摩尔天青精。

出于本发明的目的，通过在以下典型条件下：1ml反应，5mg/ml底物(总固体)，5mg的木聚糖分解蛋白/g的底物，50mM乙酸钠(pH 5)，50℃，24小时，使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定的糖分析，测量由一种或多种木聚糖降解酶所致的白桦木材木聚糖(西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.,Inc.)，圣路易斯，密苏里州，美国)的水解的增加，确定木聚糖降解活性，如由利弗(Lever)，1972，用于比色确定碳水化合物的新反应(A new reactionfor colorimetric determination of carbohydrates)，分析生物化学(Anal.Biochem)47:273-279所述的。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指一种1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。出于本发明的目的，在37℃下，在0.01％X-100和200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中用0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH6下，在200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中从作为底物的0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖中每分钟生成1.0微摩尔天青精。

在此提及“约”一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。

如在此和所附权利要求书中使用的，单数形式“一种/个”、“或”以及“该”包括复数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应理解的是，在此描述的本发明的这些方面包括“由方面组成”和/或“基本由方面组成”。

除非另外定义或由背景清楚指示，否则在此所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

详细说明

本发明尤其涉及将纤维素材料糖化成糖(如可发酵的糖)和将这些糖转化为所希望的产物的方法。

可以将这些可发酵的糖转化为许多有用的所希望的物质，例如燃料、可饮用乙醇和/或发酵产物(例如，酸、醇、酮、气体等)。

糖化的预处理的纤维素材料还可以是以下糖，这些糖可以用在用于生产糖浆(例如，高果糖玉米糖浆(HFCS))和/或塑料(例如，聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯)、聚乳酸(例如，用于生产PET)的工艺中。

糖化纤维素材料的方法

在一个方面中，本发明涉及糖化纤维素材料的方法，这些方法包括在浓度处于至少0.5％的饱和度的溶解氧的存在下使该纤维素材料经受纤维素分解酶组合物、GH61多肽和过氧化氢酶。

在糖化步骤(亦称为水解)中，处理该纤维素材料(例如，预处理的纤维素材料)，以将纤维素和/或半纤维素分解为可发酵的糖，如阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、木酮糖和/或可溶性寡糖。通过纤维素分解酶组合物和GH61多肽酶促地进行糖化。这些组合物的酶可以同时或顺序添加。例如，该GH61多肽可以被包含在该纤维素分解酶组合物中。

优选地，在可以由本领域的普通技术人员容易确定的条件下并且在如在此定义的溶解氧的存在下在适合的水性环境中进行酶糖化。在一个方面中，在适于一种或多种酶的活性，即对于该一种或多种酶而言最佳的条件下进行糖化。糖化可以作为补料分批过程或连续过程进行，其中将例如预处理的纤维素材料(底物)逐渐进料至例如含酶的糖化溶液中。

根据本发明，可以有利地在受控的pH、温度和氧以及混合条件下在搅拌釜反应器、容器、槽或发酵罐中进行糖化。在一个实施例中，反应器、容器、槽或发酵罐包括超过10m³，如超过25m³，如超过50m³纤维素材料。

糖化可以进行长达200小时，例如，约12至约96小时、约16至约72小时或约24至约48小时，如持续至少12小时，例如，至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时或至少72小时。

在一个实施例中，在约25℃至约75℃范围内的温度下进行糖化，例如，约30℃至约70℃、约35℃至约65℃、约40℃至60℃、约45℃至55℃或约50℃。

在一个实施例中，在约3.0至约9.0范围内的pH下进行糖化，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。在一个实施例中，本发明的方法进一步包括向槽中添加碱，以将pH维持在约3.0至约9.0范围内，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。可以使用任何碱，包括但不限于KOH、NaOH、Ca(OH)₂以及NH₄OH或其组合。在一个实施例中，以25-2,500mmol碱/kg干纤维素材料的量添加碱，如25-1000mmol/kg、25-500mmol/kg、25-250mmol/kg、50-200mmol/kg。诸位发明人已经确定，与用纤维素分解组合物和GH61多肽但不存在过氧化氢酶的相同工艺相比，在过氧化氢酶的存在下用该纤维素分解组合物和该GH61多肽糖化纤维素材料过程中需要较少的碱来维持pH。因此，本发明的涉及过氧化氢酶的方法成本更低并且产生更少的处于盐形式的废物。另外，由于源于添加的碱的盐的含量较低，本发明的方法使得用完的生物质更容易地再循环回田里。在一个实施例中，糖化过程中添加的碱量被减少至少1％，例如，至少2.5％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。

糖化过程中的干固体含量(例如，纤维素材料中的总固体)典型地低于约30wt.％、25wt.％、20wt.％、15wt.％、10wt.％、7.5wt.％、5wt.％、2.5wt.％、2wt.％、1wt.％或0.5wt.％，如在5wt.％与30wt.％之间，如在10wt.％与25wt.％之间。

在一个实施例中，该糖化是连续糖化，其中在整个糖化过程中以不同间隔添加纤维素材料和纤维素分解酶组合物，并且在整个糖化过程中以不同间隔去除水解产物。可以在添加纤维素材料和纤维素分解酶组合物之前、同时或之后进行水解产物的去除。

在本发明的一个实施例中，糖化过程中的溶解氧浓度处于约0.5％-10％饱和度范围内，如0.5％-5％、如0.5％-4％、如0.5％-3％、如0.5％-2％、如1％-5％、如1％-4％、如1％-3％、如1％-2％。在一个优选实施例中，在糖化期的至少25％，如至少50％、如至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在约0.5％-10％饱和度范围内，如0.5％-5％、如0.5％-4％、如0.5％-3％、如0.5％-2％、如1％-5％、如1％-4％、如1％-3％、如1％-2％。

在本发明的一个实施例中，糖化过程中的溶解氧浓度处于大于10％上至90％饱和度范围内，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。在一个优选实施例中，在糖化期的至少25％，例如至少50％或至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在大于10％上至90％的饱和度浓度下，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。

向容器中添加氧，以在糖化过程中达到所希望的溶解氧浓度。可以通过经由扩散器或喷雾器添加压缩空气或通过其他已知的通气方法给容器、槽等通气而将溶解氧水平维持在所希望的范围内。可以在来自放置于容器/槽中的溶解氧传感器的反馈的基础上控制通气速率或该系统可以在没有反馈控制的情况下以恒定速率运行。在水解行列由多个串联的容器/槽组成的情况下，可以在这些容器/槽中的一个或多个或所有容器/槽中实施通气。通氧系统在本领域是熟知的。根据本发明，可以使用任何适合的通气系统。商业通气系统由例如凯米尼尔公司(Chemineer)，德比，英格兰设计并且由例如保罗·穆勒公司(PaulMueller Company)，密苏里州，美国制造。

从纤维素材料生产发酵产物的方法

(a)在浓度处于至少0.5％的饱和度的溶解氧的存在下使纤维素材料经受纤维素分解酶组合物、GH61多肽和过氧化氢酶；

(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料；并且

(c)任选地从(b)中回收该发酵产物。

在发酵过程中，将在糖化过程中产生的糖转化为所希望的产物。可以将可发酵的糖转化为许多有用的所希望的物质，例如燃料、可饮用乙醇和/或发酵产物(例如，酸、醇、酮、气体等)。可以将其他糖用在用于生产糖浆(例如，高果糖玉米糖浆(HFCS))和/或塑料(例如，聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯)、聚乳酸(例如，用于生产PET)等的工艺中。

糖化和发酵可以分开或同时进行。这包括但不限于：分开水解和发酵(SHF)；同时糖化和发酵(SSF)；同时糖化和共发酵(SSCF)；杂合的水解和发酵(HHF)；分开水解和共发酵(SHCF)；杂合的水解和共发酵(HHCF)；以及直接微生物转化(DMC)。SHF使用分开的步骤以首先将纤维素材料酶促糖化(水解)为可发酵的糖，例如，葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖以及戊糖，并且然后将这些可发酵的糖发酵成乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶糖化和糖发酵成例如乙醇被组合在一个步骤中(菲利皮迪斯，G.P.(Philippidis,G.P.)，1996，纤维素生物转化技术(Cellulose bioconversion technology)，于生物乙醇手册：生产和利用(Handbookon Bioethanol:Production and Utilization)，怀曼，C.E(Wyman,C.E.)编辑，泰勒弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区(Washington,DC)，179-212)。SSCF涉及多种糖的共发酵(希恩(Sheehan)和希默尔(Himmel)，1999，酶、能量与环境：美国能源部研究和开发生物乙醇活性的战略性观点(Enzymes,energy and the environment:A strategicperspective on the U.S.Department of Energy’s research and developmentactivities for bioethanol)，生物技术进展(Biotechnol.Prog.)15:817-827)。HHF涉及一个分开的糖化(水解)步骤，并且另外涉及一个同时糖化和发酵步骤，这些步骤可以在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度下进行，即高温酶糖化，接着在发酵菌株能够耐受的更低温度下进行SSF。DMC将全部三个过程(酶生产、水解、和发酵)组合在一个或多个(若干个)步骤中，其中使用了相同的生物来产生用于转化纤维素材料为可发酵的糖并且用于转化可发酵的糖为终产物的酶(林德(Lynd)等人，2002，微生物纤维素利用：基本原理和生物技术(Microbial cellulose utilization:Fundamentals andbiotechnology)，微生物学与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Reviews)66:506-577)。在此应理解的是，本领域中已知的包括预处理、酶水解(糖化)、发酵或其组合的任何方法都可以用于实践本发明的方法。

常规装置可以包括补料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超过滤的连续流搅拌反应器、和/或连续塞流柱反应器(费尔南达德卡斯蒂约斯柯瑞芝(Fernanda deCastilhos Corazza)等人，2003，用于纤维二糖水解的补料分批反应器中的最佳控制(Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis)，技术学报(Acta Scientiarum.Technology)25:33-38；古萨科夫(Gusakov)和辛涅特西(Sinitsyn)，1985，纤维素酶水解动力学：1.用于分批反应器过程的数学模型(Kinetics of theenzymatic hydrolysis of cellulose:1.A mathematical model for a batch reactorprocess)，酶与微生物技术(Enz.Microb.Technol.)7:346-352)，研磨反应器(隆(Ryu)和李(Lee)，1983，通过使用研磨生物反应器，生物转化废物纤维素(Bioconversion of wastecellulose by using an attrition bioreactor)，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng)25:53-65)，或具有电磁场诱导的有力搅拌的反应器(古萨科夫等人，1996，使用具有电磁场诱导的有力搅拌的新颖类型的生物反应器的纤维素酶糖化的增强(Enhancement of enzymatic cellulose saccharification using a novel type ofbioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field)，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)56:141-153)。另外的反应器类型包括：用于水解和/或发酵的流化床反应器、升流层(upflow blanket)反应器、固定化反应器、以及挤出机型反应器。

纤维素材料。纤维素材料可以是任何生物质材料。在一个优选实施例中，纤维素材料已经例如通过化学和/或物理预处理(如通过稀酸和/或蒸汽爆炸预处理)而被预处理。适合的预处理的实例可以在下面的“预处理”部分中找到。该纤维素材料可以是预处理的玉米秸杆(PCS)，如稀酸预处理的玉米秸杆。该纤维素材料还可以是未洗涤的，如未洗涤的预处理的玉米秸杆(uwPCS)。

预处理。纤维素材料可以是例如通过化学预处理、物理预处理、或化学预处理和物理预处理而被预处理的，如以下所述的。在一个方面中，预处理的纤维素材料通过化学预处理被预处理。在另一个方面中，预处理的纤维素材料通过物理预处理而被预处理。在另一个方面中，预处理的纤维素材料通过化学预处理和物理预处理而被预处理。在一些方面中，预处理的纤维素材料是预处理的玉米秸杆(PCS)。

可以使用本领域已知的任何适合的预处理工艺来破坏纤维素材料的植物细胞壁组分(钱德拉(Chandra)等人，2007，底物预处理：木质纤维素的有效酶水解的关键？(Substrate pretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis oflignocellulosics？)，生物化学工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:67-93；盖博(Galbe)和小林(Zacchi)，2007，用于高效生物乙醇生产的木质纤维素材料的预处理(Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanolproduction)，生物化学工程/生物技术进展108:41-65；亨德里克斯(Hendriks)和季曼(Zeeman)，2009，用以增强木质纤维素生物质的消化性的预处理(Pretreatments toenhance the digestibility of lignocellulosic biomass)，生物资源技术(Bioresource Technol.)100:10-18；莫热(Mosier)等人，2005，用于木质纤维素生物质的预处理的有前景技术的特征(Features of promising technologies for pretreatmentof lignocellulosic biomass)，生物资源技术96:673-686；塔希尔扎德(Taherzadeh)和卡里米(Karimi)，2008，预处理木质纤维素废物以改善乙醇和生物气体产生：综述(Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogasproduction:A review)，国际分子科学杂志(Int.J.Mol.Sci.)9:1621-1651；杨(Yang)和怀曼，2008，预处理：释放低成本纤维素乙醇的关键(Pretreatment:the key to unlockinglow-cost cellulosic ethanol)，生物燃料、生物产品与生物精炼(Biofuels Bioproductsand Biorefining-Biofpr.)2:26-40)。

纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行颗粒尺寸减缩、预浸泡、润湿、洗涤、或调理。

常规预处理包括但不限于：蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO₂、超临界H₂O、臭氧、以及γ辐射预处理。

可以在水解和/或发酵前预处理纤维素材料。优选在水解前进行预处理。可替代地，预处理可以与酶水解同时进行，以释放可发酵的糖，例如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身引起纤维素材料到可发酵的糖的一些转化(即使不存在酶)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁组分，包括木质素、半纤维素、和纤维素以使纤维素和其他级分，例如半纤维素可接近酶。纤维素材料经过或穿过反应容器，将蒸汽注入该反应容器以增加温度至所需温度和压力，并且将蒸汽保持在其中持续希望的反应时间。蒸汽预处理可以在140℃-230℃，例如160℃-200℃、或170℃-190℃下执行，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任意添加。蒸汽预处理的停留时间可以是1-15分钟，例如3-12分钟、或4-10分钟，其中最佳停留时间取决于温度范围和化学催化剂的任意添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这样使得纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆炸放料组合，这被称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和材料湍流，以通过破碎增加可及的表面积(达夫(Duff)和默里(Murray)，1996，生物资源技术(Bioresource Technology)855:1-33；盖博(Galbe)和小林(Zacchi)，2002，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59:618-628；美国专利申请号2002/0164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被裂解，并且所得到的酸自催化半纤维素部分地水解成变得更增溶的半纤维素单糖和半纤维素寡糖。仅在有限的程度上去除木质素。所得的液体主要包含溶解的半纤维素材料(例如半纤维素单糖和半纤维素寡糖)，而余下的固体主要由纤维素材料组成。

经常在蒸汽预处理之前添加催化剂(例如H₂SO₄或SO₂)(典型地是0.3％至3％w/w)，该催化剂减少时间并降低温度、增加回收率、并改进酶水解(巴列斯特罗斯(Ballesteros)等人，2006，应用生物化学与生物技术129-132:496-508；瓦尔加(Varga)等人，2004，应用生物化学与生物技术113-116:509-523；塞斯尼尔(Sassner)等人，2006，酶与微生物技术(Enzyme Microb.Technol.)39:756-762)。

化学预处理。术语“化学处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。适合的化学预处理方法的实例包括(例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、以及有机溶剂预处理。

在稀酸预处理中，纤维素材料与稀酸(典型地是H₂SO₄)和水混合，以形成浆液，由蒸汽加热至希望的温度，并且在停留时间后急骤蒸发至大气压。可以用多种反应器设计进行稀酸预处理，例如塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器(达夫(Duff)和默里(Murray)，1996，见上文；谢尔(Schell)等人，2004，生物资源技术(BioresourceTechnol.)91:179-188；李(Lee)等人，1999，生物化学工程与生物技术进展(Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.)65:93-115)。

还可以使用碱性条件下的若干预处理方法。这些碱预处理包括但不限于：石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。

用碳酸钙、氢氧化钠、或氨，在85℃-150℃的低温下进行石灰预处理，并且停留时间为从1小时到几天(怀曼(Wyman)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technol.)96:1959-1966；莫热(Mosier)等人，2005，生物资源技术96:673-686)。WO 2006/110891、WO2006/110899、WO 2006/110900以及WO 2006/110901披露了使用氨的预处理方法。

湿氧化是典型地在加入如过氧化氢等氧化剂或过压的氧气、在180℃-200℃下进行5-15分钟的热预处理(施密特(Schmidt)和汤姆森(Thomsen)，1998，生物资源技术(Bioresource Technol.)64:139-151；帕隆恩(Palonen)等人，2004，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)117:1-17；瓦尔加(Varga)等人，2004，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)88:567-574；马丁(Martin)等人，2006，化学技术与生物技术杂志(J.Chem.Technol.Biotechnol.)81:1669-1677)。预处理优选以1％至40％干物质，更优选2％至30％干物质，并且最优选5％至20％干物质进行，并且经常通过添加碱如碳酸钠来增加初始pH。

被称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在某一停留时间后，在预处理过程中引入氧化剂。然后通过急骤蒸发至大气压结束预处理(WO 2006/032282)。

氨纤维爆炸(AFEX)涉及用液态或气态氨在中等温度(例如90℃-100℃)和高压(例如17-20巴)下处理纤维素材料，持续5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(戈拉帕里(Gollapalli)等人，2002，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)98:23-35；丘恩达瓦特(Chundawat)等人，2007，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)96:219-231；阿里扎德(Alizadeh)等人，2005，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)121:1133-1141；泰莫里(Teymouri)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technol.)96:2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的解聚和半纤维素的部分水解。木质素-碳水化合物复合物被裂解。

有机溶剂预处理通过使用含水乙醇(40％-60％乙醇)在160℃-200℃下萃取30-60分钟而将纤维素材料脱木质素(潘(Pan)等人，2005，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)90:473-481；潘等人，2006，生物技术与生物工程94:851-861；库拉比(Kurabi)等人，2005，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)121:219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素被去除。

适合的预处理方法的其他实例由谢尔(Schell)等人，2003，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.and Biotechnol.)105-108:69-85，和马塞尔(Mosier)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technology)96:673-686，以及美国公开申请号2002/0164730进行描述。

在一个方面中，化学预处理是作为酸处理进行，例如持续稀酸和/或弱酸处理。该酸可以是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或其混合物。弱酸处理优选在1-5，更优选1-4，并且最优选1-3的pH范围内进行。在一个方面中，酸浓度处于0.01wt.％至20wt.％酸范围内，优选0.05wt.％至10wt.％酸，更优选0.1wt.％至5wt.％酸，并且最优选0.2wt.％至2.0wt.％酸。使酸与生物质材料相接触，并在优选160℃-220℃，并且更优选165℃-195℃范围内的温度下保持从几秒到几分钟，例如1秒至60分钟范围内的时间。

在另一个方面中，预处理是作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。

在另一个方面中，预处理在水性浆料中进行。在一个方面中，在预处理过程中纤维素材料以优选在10wt.％-80wt.％之间，例如20wt.％-70wt.％之间或30wt.％-60wt.％之间，例如约50wt.％的量存在。可以使用本领域已知的任何方法不洗涤或洗涤预处理的纤维素材料，例如用水洗涤。

机械预处理或物理预处理。术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒粒度减小的任何预处理。例如，这样的预处理可以涉及不同类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。

纤维素材料可以物理地(机械地)且化学地预处理。机械或物理预处理可以与蒸汽/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如，微波福射)或其组合相结合。在一个方面中，高压意指在优选约100至约400psi，更优选约150至约250psi范围内的压力。在另一个方面中，高温意指在约100℃至约300℃，优选约140℃至约200℃范围内的温度。在一个优选方面中，机械或物理预处理在分批过程中使用蒸汽枪水解器系统，例如从顺智公司(Sunds Defibrator AB)，瑞典可获得的顺智水解器(SundsHydrolyzer)来进行，该系统使用如上所定义的高压和高温。这些物理预处理和化学预处理可以根据需要顺序地进行或同时进行。

因此，在一个优选方面中，使纤维素材料经受物理(机械)或化学预处理、或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从生物质材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如，舒，T.-A.(Hsu,T.-A.)，1996，生物质的预处理(Pretreatment ofbiomass)，于生物乙醇手册：生产和利用(Handbook on Bioethanol:Production andUtilization)，怀曼，C.E.(Wyman,C.E.)编辑，泰勒弗朗西斯出版集团，华盛顿特区，179-212；高希(Ghosh)和辛格(Singh)，1993，用于纤维素生物质的酶/微生物转化的物理化学与生物处理(Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbialconversion of cellulosic biomass)，应用微生物学进展(Adv.Appl.Microbiol.)39:295-333；麦克米兰，J.D.(McMillan,J.D.)，1994，预处理木质纤维素生物质：综述(Pretreating lignocellulosic biomass:a review)，于用于燃料生产的生物质的酶转化(Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production)，希默尔，M.E.(Himmel,M.E.)、贝克，J.O.(Baker,J.O.)和奥弗伦，R.P.(Overend,R.P.)编辑，美国化学学会讨论会系列566(ACS Symposium Series566)，美国化学学会(American Chemical Society)，华盛顿特区，第15章；贡，C.S.(Gong,C.S.)、曹，N.J.(Cao,N.J.)、杜，J.(Du,J.)、以及曹，G.T.(Tsao,G.T.)，1999，由可再生资源生产乙醇(Ethanol production from renewableresources)，于生物化学工程/生物技术进展(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)，舍佩尔，T.(Scheper,T.)编辑，施普林格出版社(Springer-Verlag)，柏林海德堡，德国，65:207-241)；奥尔森(Olsson)和哈恩-哈格达尔(Hahn-Hagerdal)，1996，用于乙醇生产的木质纤维素水解物的发酵(Fermentation of lignocellulosichydrolysates for ethanol production)，酶与微生物技术(Enz.Microb.Tech.)18:312-331；以及瓦蓝德(Vallander)和埃里克松(Eriksson)，1990，由木质纤维素材料生产乙醇：技术现状(Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of theart)，生物化学工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.)42:63-95)。

发酵。可以通过能够将糖(例如，葡萄糖、木糖)直接或间接发酵成所希望的发酵产物(例如，乙醇)的一种或多种(若干种)发酵微生物发酵根据本发明的从糖化纤维素材料获得的可发酵的糖。

“发酵”或“发酵方法”是指任何发酵方法或包括发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费性醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如，发酵奶制品)、皮革工业、以及烟草工业的发酵方法。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵生物，并且可以由本领域的普通技术人员容易地确定。

在发酵步骤中，酶糖化所导致的从纤维素材料释放的糖由发酵生物(如酵母)发酵成产物，例如，乙醇。如上所述，糖化和发酵可以是分开或同时的。

在实践本发明的发酵步骤中可以使用任何适合的根据本发明的糖化的纤维素材料。通常基于所希望的发酵产物(即，要从发酵获得的物质)和所采用的方法来选择材料。

术语“发酵培养基”在此被理解为指在添加一种或多种发酵微生物之前的培养基，如，由糖化产生的培养基，以及例如在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的培养基。

“发酵微生物”是指适用于所希望的发酵方法以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物。发酵生物可以是己糖和/或戊糖发酵生物、或其组合。己糖和戊糖发酵生物二者均是本领域中所熟知的。适合的发酵微生物能够将糖(例如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)为所希望的发酵产物。

由林(Lin)等人，2006，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)69:627-642描述了产生乙醇的细菌和真菌发酵生物的实例。

能够发酵C₆糖的发酵微生物的实例包括细菌生物和真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母菌属菌株，优选酿酒酵母。

能够发酵C₅糖的发酵生物的实例包括细菌生物和真菌生物，例如酵母。优选的C₅发酵酵母包括毕赤酵母属的菌株，优选树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属的菌株，优选博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、芸薹假丝酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、或产朊假丝酵母(Candida utilis)。

其他发酵生物包括发酵单胞菌属的菌株，例如运动发酵单胞菌；汉逊酵母属，例如异常汉森酵母；克鲁维酵母属，例如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、以及脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)；裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；大肠杆菌，尤其已被遗传修饰以提高乙醇产率的大肠杆菌菌株；梭菌属，例如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌(Chlostridium thermocellum)、以及Chlostridium phytofermentans；土芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)；热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)，例如解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)；以及芽孢杆菌属，例如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，例如萨纳瑞西斯假丝酵母(C.sonorensis)、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(C.diddensiae)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、C.naedodendra、布朗克假丝酵母(C.blankii)、嗜虫假丝酵母(C.entomophilia)、芸薹假丝酵母、假热带假丝酵母、博伊丁假丝酵母、产朊假丝酵母、以及休哈塔假丝酵母；克雷伯氏菌属，例如产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)。

在一个方面中，酵母是酵母菌属。在另一个方面中，酵母是酿酒酵母。在另一个方面中，酵母是糖化酵母。在另一个方面中，酵母是葡萄汁酵母。在另一个方面中，酵母是克鲁维酵母属。在另一个方面中，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个方面中，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个方面中，酵母是假丝酵母属。在另一个方面中，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个方面中，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个方面中，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个方面中，酵母是假热带假丝酵母。在另一个方面中，酵母是产朊假丝酵母。在另一个方面中，酵母是棒孢酵母属。在另一个方面中，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个方面中，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个方面中，酵母是管囊酵母属。在另一个方面中，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个方面中，酵母是毕赤酵母属。在另一个方面中，酵母是树干毕赤酵母。在另一个方面中，酵母是酒香酵母属。在另一个方面中，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(菲利皮迪斯(Philippidis)，1996，见上文)。

能够有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌、丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、发酵植物多糖梭菌、土芽孢杆菌属、解糖热厌氧杆菌以及凝结芽孢杆菌(菲利皮迪斯(Philippidis)，1996，见上文)。

在一个方面中，细菌是发酵单胞菌属。在一个方面中，细菌是运动发酵单胞菌。在另一个方面中，细菌是梭菌属。在另一个方面中，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个方面中，细菌是发酵植物多糖梭菌。在另一个方面中，细菌是热纤维梭菌。在另一个方面中，细菌是土芽孢杆菌属。在另一个方面中，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个方面中，细菌是凝结芽孢杆菌。

适于乙醇生产的可商购的酵母包括，例如乙醇红酵母(ETHANOL RED^TMyeast)(可从富酶泰斯/乐斯富(Fermentis/Lesaffre)，美国获得)、FALI^TM(可从弗莱施曼酵母(Fleischmann’s Yeast)，美国获得)、SUPERSTART^TM和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可从乙醇技术(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)、BIOFERM^TMAFT和XR(可从NABC-北美生物产品公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国获得)、GERT STRAND^TM(可从Gert Strand AB，瑞典获得)、以及FERMIOL^TM(可从帝斯曼食品配料部(DSMSpecialties)获得)。

在一个方面中，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。

将异源基因克隆到不同发酵微生物中已经构建出能够将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物(陈(Chen)和霍(Ho)，1993，酿酒酵母中毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆和改善表达(Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylosereductase gene in Saccharomyces cerevisiae)，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)39-40:135-147；霍等人，1998，能够有效共发酵葡萄糖和木糖的遗传工程化的酵母菌属酵母(Genetically engineered Saccharomyces yeastcapable of effectively cofermenting glucose and xylose)，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:1852-1859；科特(Kotter)和西拉塞(Ciriacy)，1993，酿酒酵母发酵木糖(Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae)，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)38:776-783；维尔福森(Walfridsson)等人，1995，过表达编码戊糖磷酸途径酶转酮醇酶和转醛醇酶的TKL1和TAL1基因的木糖代谢酿酒酵母菌株(Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressingthe TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase)，应用与环境微生物学61:4184-4190；凯珀(Kuyper)等人，2004，用于有效厌氧木糖发酵的酿酒酵母的最小代谢工程化：原理的证实(Minimalmetabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobicxylose fermentation:a proof of principle)，欧洲微生物学会联合会酵母研究(FEMSYeast Research)4:655-664；比尔(Beall)等人，1991，通过重组大肠杆菌从木糖和其他糖产生乙醇的参数研究(Parametric studies of ethanol production from xylose andother sugars by recombinant Escherichia coli)，生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)38:296-303；英格拉姆(Ingram)等人，1998，用于乙醇产生的细菌的代谢工程化(Metabolic engineering of bacteria for ethanol production)，生物技术与生物工程58:204-214；张(Zhang)等人，1995，产生乙醇的运动发酵单胞菌中戊糖代谢途径的代谢工程化(Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway inethanologenic Zymomonas mobilis)，科学(Science)267:240-243；狄安妲(Deanda)等人，1996，通过代谢途径工程化开发发酵阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株(Development of anarabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathwayengineering)，应用与环境微生物学62:4465-4470；WO 03/062430，木糖异构酶)。

在一个方面中，遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个方面中，遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个方面中，遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个方面中，遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个方面中，遗传修饰的发酵微生物是克鲁维酵母属。

本领域中熟知的是，以上所描述的生物还可以用于产生其他物质，如在此所描述。

典型地向糖化的预处理的纤维素材料中添加发酵微生物并且发酵可以进行约8至约96小时，如约24至约60小时。温度典型地在约26℃至约60℃之间，具体地约32℃或50℃，并且在约pH 3至约pH 8，例如pH 4至5、6、或7左右。

在一个方面中，应用酵母和/或另一种微生物至糖化的预处理的纤维素材料并且然后将发酵进行约12小时至约96小时，如24-60小时。在一个方面中，温度在约20℃至约60℃之间，例如约25℃至约50℃或约32℃至约50℃，并且pH通常是从约pH 3至约pH 7，例如pH4-7左右，例如pH 5左右。

然而，一些发酵生物(例如细菌)具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以每mL发酵液约10⁵至10¹²，例如从约10⁷至10¹⁰，特别是约2x 10⁸个活细胞计数的量应用。关于使用酵母进行发酵的进一步指南可以见于例如“醇教材”(“The AlcoholTextbook”)(K·雅克(K.Jacques)、T.P.里昂(T.P.Lyons)和D.R.凯尔索尔(D.R.Kelsall)编辑，诺丁汉大学出版社(Nottingham University Press)，联合王国(United Kingdom)1999)，其通过引用特此结合。

对于乙醇生产，在发酵之后，可蒸馏发酵的浆料以萃取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮用乙醇(即可饮用的中性烈酒)，或工业乙醇。

发酵刺激剂可与在此描述的任何方法结合使用以进一步改进发酵过程，并且特别是，改进发酵微生物的性能，例如，提高速度和乙醇产率。“发酵刺激剂”是指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E。例如参见阿尔弗雷多(Alfenore)等人，通过在补料分批方法过程中的一种维生素进料策略改进乙醇产生和酿酒酵母的存活力(Improvingethanol production and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitaminfeeding strategy during fed-batch process)，施普林格出版社(2002)，将其通过引用特此结合。矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu营养素的矿物质和矿物盐。

发酵产物：发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。发酵产物可以是(不限于)醇(例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨醇、以及木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；烷烃(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)；环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)；烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；以及气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)、以及一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。

在一个方面中，发酵产物是醇。应理解的是，术语“醇”涵盖包含一个或多个羟基部分的物质。在一个方面中，醇是阿拉伯糖醇。在另一个方面中，醇是丁醇。在另一个方面中，醇是乙醇。在另一个方面中，醇是甘油。在另一个方面中，醇是甲醇。在另一个方面中，醇是1,3-丙二醇。在另一个方面中，醇是山梨醇。在另一个方面中，醇是木糖醇。参见例如，Gong(宫)等人，1999，Ethanol production from renewable resources(由可再生资源生产乙醇)，于生化工程/生物技术进展(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)，舍佩尔，T.(Scheper,T.)编辑，施普林格出版社，柏林海德堡，德国，65:207-241；西尔维拉(Silveira)和乔纳斯(Jonas)，2002，山梨醇的生物技术生产(Thebiotechnological production of sorbitol)，应用生物化学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59:400-408；尼加姆(Nigam)和辛格(Singh)，1995，木糖醇-一种糖替代物的发酵生产工艺(Processes for fermentative production ofxylitol–a sugar substitute)，加工生物化学(Process Biochemistry)30(2):117-124；埃塞吉(Ezeji)等人，2003，由拜氏梭菌BA101生产丙酮，丁醇和乙醇并通过气提进行原位回收(Production of acetone,butanol and ethanol by Clostridium beijerinckiiBA101 and in situ recovery by gas stripping)，微生物与生物技术世界杂志(WorldJournal of Microbiology and Biotechnology)19(6):595-603。

在另一个方面中，发酵产物是有机酸。在一个方面中，有机酸是乙酸。在另一个方面中，有机酸是醋酮酸。在另一个方面中，有机酸是己二酸。在另一个方面中，有机酸是抗坏血酸。在另一个方面中，有机酸是柠檬酸。在另一个方面中，有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个方面中，有机酸是甲酸。在另一个方面中，有机酸是富马酸。在另一个方面中，有机酸是葡糖二酸。在另一个方面中，有机酸是葡糖酸。在另一个方面中，有机酸是葡糖醛酸。在另一个方面中，有机酸是戊二酸。在另一个方面中，有机酸是3-二羟基丙酸。在另一个方面中，有机酸是衣康酸。在另一个方面中，有机酸是乳酸。在另一个方面中，有机酸是苹果酸。在另一个方面中，有机酸是丙二酸。在另一个方面中，有机酸是草酸。在另一个方面中，有机酸是丙酸。在另一个方面中，有机酸是琥珀酸。在另一个方面中，有机酸是木糖酸。参见例如陈(Chen)和李(Lee)，1997，用于从纤维素生物质生产乳酸的膜介导的抽提发酵(Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosicbiomass)，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)63-65:435-448。

在另一个方面中，发酵产物是酮。应理解的是，术语“酮”涵盖包含一个或多个酮部分的物质。在另一个方面中，酮是丙酮。参见例如，库雷希(Qureshi)和布拉舍克(Blaschek)，2003，见上文。

在另一个方面中，发酵产物是氨基酸。在一个方面中，氨基酸是天冬氨酸。在另一个方面中，氨基酸是谷氨酸。在另一个方面中，氨基酸是甘氨酸。在另一个方面中，氨基酸是赖氨酸。在另一个方面中，氨基酸是丝氨酸。在另一个方面中，氨基酸是苏氨酸。参见例如，理查德(Richard)和马加里蒂(Margaritis)，2004，用于聚(谷氨酸)生产和其他微生物生物聚合物的分批发酵动力学的实验建模(Empirical modeling of batch fermentationkinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers)，生物技术与生物工程(Biotechnology and Bioengineering)87(4):501-515。

在另一个方面中，发酵产物是烷烃。该烷烃可以是无支链或支链烷烃。在一个方面中，烷烃是戊烷。在另一个方面中，烷烃是己烷。在另一个方面中，烷烃是庚烷。在另一个方面中，烷烃是辛烷。在另一个方面中，烷烃是壬烷。在另一个方面中，烷烃是癸烷。在另一个方面中，烷烃是十一烷。在另一个方面中，烷烃是十二烷。

在另一个方面中，发酵产物是环烷烃。在另一个方面中，环烷烃是环戊烷。在另一个方面中，环烷烃是环己烷。在另一个方面中，环烷烃是环庚烷。在另一个方面中，环烷烃是环辛烷。

在另一个方面中，发酵产物是烯烃。该烯烃可以是无支链或支链烯烃。在一个方面中，烯烃是戊烯。在另一个方面中，烯烃是己烯。在另一个方面中，烯烃是庚烯。在另一个方面中，烯烃是辛烯。

在一个方面中，发酵产物是异戊二烯。在另一个方面中，发酵产物是聚酮化合物。

在另一个方面中，发酵产物是气体。在一个方面中，气体是甲烷。在另一个方面中，气体是H₂。在另一个方面中，气体是CO₂。在另一个方面中，气体是CO。参见例如，片冈(Kataoka)等人，1997，关于通过产氢气厌氧细菌的连续培养系统的氢气生产的研究(Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria)，水科学与技术(Water Science and Technology)36(6-7):41-47；以及古那森兰(Gunaseelan)，1997，用于甲烷生产的厌氧消化：综述(Anaerobicdigestion of biomass for methane production:A review)，生物质与生物能源(Biomass and Bioenergy)13(1-2):83-114。

回收。可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基中回收一种或多种发酵产物，该方法包括但不限于：色谱法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的甘蔗废物中分离和纯化醇。可以获得具有高达约96vol.％的纯度的乙醇，这可以用作例如燃料乙醇、饮用乙醇(即可饮用的中性烈酒)，或工业乙醇。

酶

下面描述的一种或多种酶和多肽有待以“有效量”用于本发明的方法中。下文应在上文的“定义”部分中的酶披露的背景下加以阅读。

用于糖化的纤维素分解酶组合物

这些纤维素分解酶组合物可以包括有用于降解纤维素材料的任何蛋白。用于糖化的纤维素分解酶组合物可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。

在一个方面中，纤维素分解酶组合物包括或进一步包括选自下组的一种或多种(例如，若干种)蛋白质，该组由以下各项组成：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。在另一个方面中，纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面中，半纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。在另一个方面中，氧化还原酶是过氧化氢酶、漆酶或过氧化物酶。

在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括或进一步包括一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶和一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括内切葡聚糖酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括β-葡糖苷酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。

在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括阿拉伯聚糖酶(例如，α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括阿拉伯呋喃糖苷酶(例如，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括香豆酸酯酶。在另一个方面中，酶组合物包括阿魏酸酯酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括葡糖醛酸糖苷酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括葡糖醛酸酯酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括甘露聚糖酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括甘露糖苷酶(例如，β-甘露糖苷酶)。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括木聚糖酶。在一个实施例中，木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一个实施例中，木聚糖酶是家族11木聚糖酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括木糖苷酶(例如，β-木糖苷酶)。

在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括CIP。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括酯酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括棒曲霉素。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括木质素分解酶。在一个实施例中，木质素分解酶是锰过氧化物酶。在另一个实施例中，木质素分解酶是木质素过氧化物酶。在另一个实施例中，木质素分解酶是H₂O₂产生酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括果胶酶。在另一个方面中，纤维素分解酶组合物包括氧化还原酶。在另一个实施例中，氧化还原酶是漆酶。在另一个实施例中，氧化还原酶是过氧化物酶。在另一个方面中，酶组合物包括蛋白酶。在另一个方面中，酶组合物包括膨胀蛋白。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物来源于或分离自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，例如卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。在一个优选实施例中，纤维素分解酶组合物来源于或分离自里氏木霉的菌株。

具有重组产生的GH61多肽的里氏木霉纤维素分解酶组合物的实例描述于WO2008/151079(诺维信公司)和WO 2013/028928(诺维信公司)中，将两者通过引用特此结合。适合的GH61多肽的实例可以在下面的“GH61多肽”部分中找到。

纤维素分解酶组合物可以进一步包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：酯酶、棒曲霉素、半纤维素酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶以及膨胀蛋白。

纤维素分解酶组合物的最佳量取决于若干因素，包括但不限于，组分酶的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的一种或多种预处理、温度、时间、pH以及所包含的发酵生物(例如，酵母)。

可以按约0.01至约50.0mg，例如，约1至约25mg，如约2-10mg、如约4至约8mg蛋白/g/DS的纤维素材料的量添加纤维素分解酶组合物。

β-葡糖苷酶

在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解酶组合物可以包括一种或多种β-葡糖苷酶。β-葡糖苷酶可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。

在一个实施例中，β-葡糖苷酶来自曲霉属的菌株，例如米曲霉，如披露于WO 02/095014中的β-葡糖苷酶或披露于WO 2008/057637中的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白(参见例如，实例10-15)，或烟曲霉，例如披露为WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或在此的SEQID NO:5的β-葡糖苷酶或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如披露于WO 2012/044915中的变体，例如具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用在此的SEQ ID NO:5用于编号)。

在另一个实施例中，β-葡糖苷酶来源于青霉属的菌株，如在WO 2007/019442中披露为SEQ ID NO:2的巴西青霉(Penicillium brasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。

在一个实施例中，β-葡糖苷酶是一种选自下组的烟曲霉β-葡糖苷酶或其同系物，该组由以下各项组成：

(i)一种β-葡糖苷酶，包括WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽；

(ii)一种β-葡糖苷酶，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性；

(iii)一种β-葡糖苷酶，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与WO 2005/047499中的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的核苷酸序列；以及

(iv)一种β-葡糖苷酶，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中、高严格条件或非常高严格条件下与WO 2005/047499中的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

在一个实施例中，β-葡糖苷酶是一种变体，该变体在对应于WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽的位置100、283、456以及512的一个或多个(若干个)位置处包括取代，其中该变体具有β-葡糖苷酶活性。

在一个实施例中，变体的亲本β-葡糖苷酶是(a)一种多肽，包括WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽；(b)一种多肽，与在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％序列一致性；(c)一种多肽，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低、中、高或非常高严格条件下与(i)WO 2005/047499(通过引用特此结合)中的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)包含在SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交；(d)一种多肽，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与WO 2005/047499中的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％一致性；或(e)WO2005/047499中的SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有β-葡糖苷酶活性。

在一个实施例中，变体与亲本β-葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80％，例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但低于100％序列一致性。

在一个实施例中，变体与WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％，例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但低于100％序列一致性。

在一个实施例中，取代的数目在1与4之间，如1、2、3或4个取代。

在一个实施例中，变体在对应于位置100的位置处包括取代、在对应于位置283的位置处包括取代、在对应于位置456的位置处包括取代和/或在对应于位置512的位置处包括取代。

在一个实施例中，β-葡糖苷酶变体包括WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5中的以下取代：Phe100Asp、Ser283Gly、Asn456Glu、Phe512Tyr。

内切葡聚糖酶

根据本发明使用的纤维素分解酶组合物包括一种或多种内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。

在一个实施例中，这种或这些内切葡聚糖酶可以来自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，例如卢克诺文思金孢子菌的菌株。在一个优选实施例中，内切葡聚糖酶来源于里氏木霉的菌株。

可以根据本发明使用真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切葡聚糖酶I(彭蒂莱(Penttila)等人，1986，基因(Gene)45:253-263)；里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANK^TM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1988，基因63:11-22)；里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANK^TM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(奥卡达(Okada)等人，1988，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:555-563，GENBANK^TM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:219-228，GENBANK^TM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(黄(Ooi)等人，1990，核酸研究(NucleicAcids Research)l8:5884)；川地曲霉(spergillus kawachii)内切葡聚糖酶(坂元(Sakamoto)等人，1995，当代遗传学(Current Genetics)27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人，1990，基因90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号L29381)；灰腐质霉高温变种内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号AB003107)；热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号MAL515703)；粗糙链孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号M15665)。

可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利号5,275,944；WO 96/02551；美国专利号5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)；褐色嗜热裂孢菌内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；和褐色嗜热裂孢菌内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。

纤维二糖水解酶I

根据本发明使用的纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBH I(纤维二糖水解酶I)。纤维二糖水解酶I可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包括一种纤维二糖水解酶I(CBHI)，例如来源于或分离自以下项的纤维二糖水解酶I：曲霉属的菌株如烟曲霉的菌株，例如披露于WO2011/057140中的SEQ ID NO:6或在此的SEQ ID NO:6中的Cel7A CBH I，或木霉属的菌株如里氏木霉的菌株。

在一个实施例中，烟曲霉纤维二糖水解酶I(CBH I)或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：

(i)一种纤维二糖水解酶I，包括在此的SEQ ID NO:6的成熟多肽；

(ii)一种纤维二糖水解酶I，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ IDNO:6的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性；

(iii)一种纤维二糖水解酶I，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与WO 2011/057140(通过引用特此结合)中的SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的核苷酸序列；以及

(iv)一种纤维二糖水解酶I，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低、中、高或非常高严格条件下与WO 2011/057140中的SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

纤维二糖水解酶II

根据本发明使用的纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBH II(纤维二糖水解酶II)。纤维二糖水解酶II可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。

在一个实施例中，纤维二糖水解酶II(CBHII)，如来源于以下项的纤维二糖水解酶II：曲霉属的菌株如烟曲霉的菌株，例如在此的SEQ ID NO:7中的纤维二糖水解酶II，或木霉属的菌株如里氏木霉，或梭孢壳霉属的菌株如土生梭孢壳霉的菌株，例如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。

在一个实施例中，烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：

(i)一种纤维二糖水解酶II，包括SEQ ID NO:4的成熟多肽；

(ii)一种纤维二糖水解酶II，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQID NO:7的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性；

(iii)一种纤维二糖水解酶II，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与WO 2013/028928(通过引用特此结合)中的SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的核苷酸序列；以及

(iv)一种纤维二糖水解酶II，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低、中或高严格条件(例如，非常高严格条件)下与WO 2013/028928中的SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

GH61多肽

根据本发明，在糖化过程中GH61多肽与纤维素分解酶组合物一起存在。GH61多肽可以具有任何来源，如微生物来源，如真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。

GH61多肽可以与该纤维素分解酶组合物分开、同时添加或作为该纤维素分解酶组合物的一部分。

GH61多肽对于该纤维素分解酶组合物来源于其中或分离自其中的菌株而言可以是天然的或外源的，例如里氏木霉、特异腐质霉、埃默森篮状菌或卢克诺文思金孢子菌(嗜热毁丝霉)的菌株。在一个实施例中，GH61多肽是重组GH61多肽。在一个实施例中，GH61多肽不具有与纤维素分解酶组合物的宿主细胞相同的来源，例如，不具有木霉属来源，如不具有里氏木霉来源。在一个实施例中，GH61多肽作为该纤维素分解酶组合物的一部分而重组地产生，例如，由产生纤维素分解酶组合物的里氏木霉宿主细胞产生。

在一个实施例中，GH61多肽来源于或分离自嗜热子囊菌属，例如橙色嗜热子囊菌的菌株，例如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2和在此的SEQ ID NO:1的GH61多肽；或来源于或分离自梭孢壳霉属，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:8或在此的SEQ ID NO:4的GH61多肽；或来源于或分离自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:3的GH61多肽；或来源于或分离自青霉属的菌株，例如埃默森青霉的菌株，例如在WO 2011/041397中披露为SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:2的GH61多肽。

在一个实施例中，青霉属GH61多肽或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：

(i)一种GH61多肽，包括在此的SEQ ID NO:8的成熟多肽；

(ii)一种GH61多肽，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性；

(iii)一种GH61多肽，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与WO 2011/041397(通过引用特此结合)中的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的核苷酸序列；以及

(iv)一种GH61多肽，由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低、中、高或非常高严格条件下与WO 2011/041397中的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

在一个实施例中，多肽或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：一种包括以下项的成熟多肽的GH61多肽，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2；WO 2005/074647中的SEQ IDNO:8；WO 2010/138754中的SEQ ID NO:2；或一种包括以下氨基酸序列的GH61多肽，该氨基酸序列与以下项的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2；WO 2005/074647中的SEQ ID NO:8；或WO 2010/138754中的SEQ ID NO:2(将所有参考文献和序列通过引用特此结合)。

在一个实施例中，GH61多肽构成该纤维素分解酶组合物的从0.1％-25％，如0.5％-20％、0.5％-15％、0.5％-10％或0.5％-7％。在一个实施例中，纤维素分解酶组合物中的GH61多肽的量是约1g至约1000g，如约1g至约200g、约1g至约100g、约1g至约50g、约1g至约20g、约1g至约15g、约1g至约10g、约1g至约7g或约1g至约4g/g的纤维素分解酶组合物。

包含GH61多肽的具体纤维素酶组合物

以下是多种用于在本发明中使用的包含GH61多肽的纤维素分解酶组合物的列表。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包括里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656和在此的SEQ ID NO:1)和米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(参见WO 2008/057637-实例10-15)。

在另一个实施例中，纤维素分解酶组合物包括里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ IDNO:1)和烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)。

在另一个实施例中，纤维素分解组合物包括里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括在WO 2011/041397中披露为SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:2的埃默森青霉GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用在此的SEQ ID NO:5用于编号)(披露于WO 2012/044915中)。

纤维素分解酶组合物的配制品

根据本发明使用的纤维素分解酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞)。

该纤维素分解酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体、或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或另一种多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶组合物进行稳定化。

商业纤维素分解酶组合物

根据本发明的方法使用的纤维素分解酶组合物可以是商业纤维素分解酶组合物。适于根据本发明使用的商业纤维素分解酶组合物的实例包括例如CELLIC^TMCTec(诺维信公司)、CELLIC^TMCTec2(诺维信公司)、CELLIC^TMCTec3(诺维信公司)、CELLUCLAST^TM(诺维信公司)、NOVOZYM^TM188(诺维信公司)、CELLUZYME^TM(诺维信公司)、CEREFLO^TM(诺维信公司)及ULTRAFLO^TM(诺维信公司)、ACCELERASE^TM(杜邦公司(DuPont))、ACCELERASE^TM1000；ACCELERASE^TM1500；ACCELERASE^TMTRIO；ACCELERASE^TMDUET(杜邦公司)；LAMINEX^TM(杰能科国际公司(Genencor Int.))、SPEZYME^TMCP(杰能科国际公司)、ROHAMENT^TM7069W(罗姆公司(GmbH))、LDI(并矢国际公司(Dyadic International,Inc.))、LBR(并矢国际公司)或150L(并矢国际公司)。可以按约0.001wt％至约5.0wt％的固体，更优选从约0.025wt％至约4.0wt％的固体，并且最优选从约0.005wt％至约2.0wt％的干固体(DS)的量添加商业纤维素分解酶组合物。

过氧化氢酶

过氧化氢酶可以是有用于本发明的方法的任何过氧化氢酶。过氧化氢酶可以包括但不限于E.C.1.11.1.6或E.C.1.11.1.21过氧化氢酶。

有用的过氧化氢酶的实例包括但不限于来自以下各项的过氧化氢酶：海水产碱杆菌(Alcaligenes aquamarinus)(WO 98/00526)、兰图鲁斯曲霉(Aspergillus lentilus)、烟曲霉、黑曲霉(美国专利号5,360,901)、米曲霉(JP 2002223772 A；美国专利号6,022,721)、嗜热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidasius)(JP 1 1243961A)、特异腐质霉(WO 2009/104622、WO 2012/130120)、樟绒枝霉、变黑微颤菌(Microscillafurvescens)(WO 98/00526)、粗糙脉孢菌、埃默森青霉(WO 2012/130120)、嗜松青霉、微小根毛霉、巴斯德酵母(WO 2007/105350)、嗜热柱顶孢霉、柄篮状菌(Talaromycesstipitatus)(WO 2012/130120)、橙色嗜热子囊菌(WO 2012/130120)、布氏栖热菌(Thermusbrockianus)(WO 2005/044994)以及土生梭孢壳霉(WO 2010/074972)。

有用于本发明的过氧化氢酶的非限制性实例是来自以下各项的过氧化氢酶：专性嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)(UNIPROT：P30266)、枯草芽孢杆菌(UNIPROT：P42234)、灰腐质霉(GeneSeqP：AXQ55105)、费希新萨托菌(UNIPROT：A1DJU9)、埃默森青霉(GeneSeqP：BAC10987)、嗜松青霉(GeneSeqP：BAC10995)、嗜热柱顶孢霉(GeneSeqP：AAW06109或ADT89624)、柄篮状菌(GeneSeqP：BAC10983或BAC11039；UNIPROT：B8MT74)以及橙色嗜热子囊菌(GeneSeqP：BAC11005)。将登录号以其全部内容结合在此。

在一个方面中，过氧化氢酶与在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性，该成熟多肽具有过氧化氢酶活性。

在另一个方面中，过氧化氢酶的氨基酸序列与在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的成熟多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。

在另一个方面中，过氧化氢酶包括在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的氨基酸序列或由其组成。

在另一个方面中，过氧化氢酶包括在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，过氧化氢酶是在此披露的过氧化氢酶的等位基因变体。

在另一个方面中，过氧化氢酶是包含在此披露的过氧化氢酶的成熟多肽的至少85％氨基酸残基，例如，至少90％氨基酸残基或至少95％氨基酸残基的片段。

在另一个方面中，过氧化氢酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低、低、中、中-高、高或非常高严格条件下与在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

可以使用编码过氧化氢酶的多核苷酸或其子序列、连同过氧化氢酶的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆编码来自不同属或种的菌株的过氧化氢酶的DNA。具体而言，此类探针可以用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，如在上文所述。

出于本发明的目的，杂交是指在非常低至非常高严格条件下多核苷酸杂交到标记的核酸探针上。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X-射线胶片或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。

在一个方面中，核酸探针是过氧化氢酶的成熟多肽编码序列。

在另一个方面中，核酸探针是编码全长过氧化氢酶；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。

在另一个方面中，过氧化氢酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与在此披露的这些过氧化氢酶中的任一项的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

该过氧化氢酶可以是一种杂合多肽，其中一个多肽的一个区域融合在另一个多肽的一个区域的N-末端或C-末端，或一种融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一个多肽融合在过氧化氢酶的N-末端或C-末端，如在此所述。

在糖化反应中，过氧化氢酶的蛋白含量处于约0.5％至约10％，例如，约0.5％至约7％、约0.5％至约5％、约0.5％至约4％、约0.5％至约3％、约0.5％至约2％以及约0.5％至约1％的总酶蛋白的范围内。在一个实施例中，过氧化氢酶与纤维素分解酶组合物的蛋白比处于约1:200至约1:10，例如，约1:100至约1:15或约1:50至约1:25的范围内。

糖化过程中存在或添加的其他酶和多肽

可以在糖化过程中存在或添加其他酶和/或多肽。这些另外的酶和/或多肽可以与纤维素分解组合物和/或GH61多肽分开或一起添加。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包括或进一步包括选自下组的一种或多种(若干种)酶和/或多肽，该组由以下各项组成：半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。

在一个实施例中，半纤维素酶是木聚糖酶(例如，棘孢曲霉木聚糖酶)、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶以及葡糖醛酸糖苷酶。在一个优选实施例中，半纤维素酶是木聚糖酶和/或β-木糖苷酶。

在一个实施例中，木聚糖酶是GH10木聚糖酶。在一个实施例中，木聚糖酶来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2006/078256中披露为Xyl III或在此的SEQ IDNO:9的木聚糖酶，或棘孢曲霉，例如在WO 94/21785中披露为例如Xyl II或在此的SEQ IDNO:8的木聚糖酶。

在一个实施例中，β-木糖苷酶来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株，例如在WO2013/028928(通过引用特此结合)的实例16-17中披露为SEQ ID NO:16或在此的SEQ IDNO:10的β-木糖苷酶，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如WO 2011/057140中的SEQ ID NO:58或在此的SEQ ID NO:11的成熟多肽。

材料与方法

材料：

橙色嗜热子囊菌过氧化氢酶披露于WO 2012/130120中。

纤维素分解酶组合物A：里氏木霉纤维素分解酶组合物包括烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I(WO 2011/057140)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/057140)、具有以下突变F100D、S283G、N456E及F512Y的披露于WO 2012/044915中的烟曲霉β-葡糖苷酶变体、青霉属(埃默森青霉)GH61多肽(WO 2011/041397)、烟曲霉GH10木聚糖酶(WO 2006/078256)以及烟曲霉β-木糖苷酶(WO 2011/057140)。

通过以下实例进一步描述本发明，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实例

实例1：溶解氧和过氧化氢酶对滴定剂的消耗的影响

为了研究溶解氧和过氧化氢酶添加对糖产率和碱滴定剂的消耗的影响，实施以下实验。

这些反应器容器是具有锚式搅拌器的IKA LR-2.ST反应器系统。这些容器各自都配备有一个Mettler Toledo InPro 4260pH和温度传感器以及一个Mettler Toledo InPro6800溶解氧和温度传感器。这些传感器连接至Mettler Toledo M300发送器上。这些传感器信号被发送至一台PC。通过由PC控制的蠕动泵给料氢氧化钠的25％(w/w)溶液而自动控制pH。以0与100ml/min之间的速率向这些反应器的顶部空间中引入空气和氮。通过来自科尔-帕默公司(Cole-Parmer)的气体质量流控制器(型号#32907-59)调节气流。手动地控制氮流，并且在溶解氧传感器信号的基础上通过PC自动控制空气流。运行以下三个反应器：

(1)反应器1.纤维素分解酶组合物A，仅用氮覆盖，以从该反应器中吹扫氧。

(2)反应器2.纤维素分解酶组合物A，仅将溶解氧(DO)调节设置为2％饱和。

(3)反应器3.纤维素分解酶组合物A和橙色嗜热子囊菌过氧化氢酶，将DO调节设置为2％饱和。

对于以上每个反应器，对底物进行蒸汽爆炸，其中麦秸的干物质含量为20％。将温度设置为50℃-51℃，同时搅拌器速度为75rpm。

将总共830g液体和394ml水装进每个反应器中。用25％ NaOH将这些液体的pH调节至5.2-5.3。在搅拌下，通过位于反应器顶部的漏斗添加这些固体。对于反应的剩余部分，将pH维持为5.0。

反应器1和反应器2的酶用量为9mg酶蛋白/g纤维素的纤维素分解酶组合物A。反应器3的酶用量为8.78mg酶蛋白/g纤维素的纤维素分解酶组合物A和0.217mg/g过氧化氢酶。

对于所有反应器而言，初始时氮流为100ml/分钟，直到溶解氧浓度低于10％的饱和度。在试验过程中将至顶部空间的氮流维持为10ml/分钟，以便防止超过DO浓度。对于反应的剩余部分，将反应器2和3的溶解氧浓度维持为2％的饱和度。

用于HPLC的样品的制备：在第3和第5天，用血清移液器将浆料样品从每个反应器容器中移出并转移至15ml塑料管中。将这些样品在台式离心机中以4000rpm离心20分钟，以将液体和固体分离。将来自每个样品的总共300微升的上清液用2.09ml的DI水和6微升的40％ H₂SO₄(8X稀释)稀释。通过0.45μm PES针筒式滤器过滤稀释的样品。

使用配备有0.2μm在线过滤器的300x 7.7mm HyperREZ XP碳水化合物H⁺8μm柱代替保护柱，通过在65℃下以0.9ml/分钟的流速用作为流动相的5mM H₂SO₄洗脱，并通过在50℃下整合由糖标准品校准的来自折射率检测(1200HPLC，安捷伦科技(Agilent Technologies)，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国)的葡萄糖信号定量来测量这些样品的糖浓度。注射体积为10微升并且运行时间为18分钟。

通过添加8.0000g的纤维二糖、15.0000g的葡萄糖、15.0000g的木糖、8.0000g的阿拉伯糖、8.0000g的木糖醇、8.0000g的甘油来制备糖标准品。向具有5mM H₂SO₄的200mL A类容量瓶中添加12.0000g的乙酸钠和15.0000g的乙醇，以制备储备溶液(SS)。在5mM H₂SO₄中从储备溶液(SS)制备以下稀释物：

·标准品5＝SS

·标准品4＝SS稀释2x

·标准品3＝SS稀释4x

·标准品2＝SS稀释20x

·标准品1＝SS稀释50x

·检查标准品＝SS稀释10x

结果提供于下表中：

下表示出了用于在反应过程中将pH维持为5.2，在糖化过程中消耗的碱的量。

反应器	NaOH(25％，ml)
		1：氮	4.9
2：2％DO	9.6
		3：过氧化氢酶+ 2％DO	5.7

结果显示，与缺氧条件相比，低水平的溶解氧(2％饱和)对于糖化过程而言是有利的，但是它导致在水解过程中将pH值维持在5的设置点所需的碱滴定剂的较高消耗(几乎加倍)。数据还表明，添加过氧化氢酶与2％溶解氧饱和一起显著减少滴定剂消耗的增加并且在孵育5天后显著改进木糖和葡萄糖两者的产率。

实例2

将由80％玉米秸秆和20％玉米芯组成的5kg生物质混合物首先与15升的1.3％重量的硫酸混合。将浆料在125℃下预处理120分钟。机械按压总计20kg的预处理的浆料，压出液体并且进行收集；并且然后用15升的水洗涤固体，并且再次按压。将从两个按压步骤收集的液体混合。总计约20.5kg，标记液体馏分。在第二次按压后，使固体经受在190℃下的蒸汽爆炸，持续10分钟。来自蒸汽爆炸的收集的浆料为约14.6kg，标记固体馏分。使用NREL实验方案TP-510-48825，“实验室分析程序(LAP)综述和整合：预处理的浆料(LaboratoryAnalytical Procedure(LAP)Review and Integration:Pretreated Slurries)”(2011年8月发行)，分析每一流的组成，并且结果示于下表中：

水解反应器是2.5升的立式IKA反应器。称取468.28g的酸预处理的玉米秸秆和玉米芯的固体馏分至每一反应器容器中，随后添加765.19ml的液体流。添加另外的水以使浆料的总固体为约16.5％。使搅拌器系统下降进入反应器容器，并且封闭头板/盖，并且用夹具固定。头板还包含用于经由蠕动泵递送空气和NaOH的管。

将以下设置输入控制反应器的计算机：pH-5.0；温度-50℃；搅拌速度-75rpm；以及空气流速-0或20ml/分钟。一旦启动系统，便开始数据采集。允许系统自动调节pH至希望的设置。3小时后，pH处于要求的设置。然后基于实验计划添加酶溶液。在每一反应器中的最终浆料具有15％总固体。在水解过程中，监测反应器的溶解氧(DO)、pH、温度、和混合速度(rpm)。

为了对反应器取样，移出700μL的浆料并且在Spin-X离心管中在14,000rpm下离心10分钟。弃去过滤器，并且通过添加40％硫酸溶液(每100μL的样品1μL)并且通过抽吸进行混合，将滤液灭活。用移液管将每一灭活的滤液分配进管中，以避免在管的顶部上存在任何固体。在HPLC小瓶(最小体积：0.5mL)中，用5mM硫酸将每一灭活的滤液稀释10X。然后使用配备有分析性BIO-RADHPX-87H柱和BIO-RAD阳离子H补充(Cation H refill)保护柱87H柱的用于糖检测的安捷伦HPLC系统确定葡萄糖的含量。

在将酶添加至没有空气供应或添加的反应器后，在水解浆料中的DO为0.5％-2.0％的饱和度。可替代地，在将酶添加至反应器后，以3％-30％之间的饱和度浓度，将DO伴随空气流添加至水解浆料。进入顶部空间的空气流为20ml/分钟。所有其他条件保持相同。在水解过程中，给料的纤维素分解酶组合物A为5mg酶蛋白/克纤维素，并且给料的橙色嗜热子囊菌过氧化氢酶为0.25mg酶蛋白/克纤维素。在50℃、pH 5.0和75rpm搅拌下进行所有水解反应。基于EB-SM-0785.02-D，“通过Konelab(BCA(B))用比色法确认生物质的总蛋白测量(Validation of Total Protein Measurement for Biomass,colorimetric by Konelab(BCA(B)))”，使用BCA(B)测定测量酶蛋白浓度。

结果提供于表1中：

表1

当不供应空气时，过氧化氢酶对纤维素分解酶组合物A进行的水解没有影响。当以20ml/分钟供应空气或DO在3％-30％之间时，过氧化氢酶添加升高用纤维素分解酶组合物A进行的水解中的葡萄糖产率。

在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

在以下编号的段落中进一步描述本发明：

1.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在容器中经受纤维素分解酶组合物、GH61多肽和过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在至少0.5％的饱和度。

2.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在容器中经受纤维素分解酶组合物、GH61多肽和过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在至少0.5ppm，例如像0.5至5ppm、0.5至4.5ppm、0.5至4ppm、0.5至3.5ppm、0.5至3ppm、0.5至2.5ppm、或0.5至2ppm。

3.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在容器中经受纤维素分解酶组合物、GH61多肽和过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在0.025ppm至0.55ppm范围内，例如像0.05至0.165ppm。

4.如段落1-3中任一项所述的方法，其中过氧化氢酶的量处于0.5％至25％，例如，0.5％至20％、0.5％至15％、0.5％至10％、0.5％至7.5％、0.5％至5％以及0.5％至4％的总蛋白范围内。

5.如段落1、3和4中任一项所述的方法，其中糖化过程中的溶解氧浓度处于0.5％-10％饱和度范围内，例如0.5％-7％、例如0.5％-5％、例如0.5％-4％、例如0.5％-3％、例如0.5％-2％、例如1％-5％、例如1％-4％、例如1％-3％、例如1％-2％。

6.如段落1、3、4和5中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，例如至少50％、例如至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在0.5％-10％饱和度范围内，例如0.5％-7％、例如0.5％-5％、例如0.5％-4％、例如0.5％-3％、例如0.5％-2％、例如1％-5％、例如1％-4％、例如1％-3％、例如1％-2％。

7.如段落1、2和4中任一项所述的方法，其中糖化过程中的溶解氧浓度处于大于10％上至90％饱和度范围内，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。

8.如段落1、2、4和7中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，例如至少50％或至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在大于10％上至90％饱和度范围内，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。

9.如段落1-8中任一项所述的方法，其中该纤维素材料选自下组，该组由以下各项组成：草本材料(包括能源作物)、农业废弃物、木材(包括林业废弃物)、城市固体废物、废纸、纸浆以及造纸厂废弃物。

10.如段落1-9中任一项所述的方法，其中该纤维素材料选自下组，该组由以下各项组成：玉米秸秆、麦秸、甘蔗渣、玉米芯、柳枝稷、玉米纤维、稻秸、芒草、芦竹、竹子、橘皮、杨树、松树、白杨、冷杉、云杉、柳树以及桉树。

11.如段落1-10中任一项所述的方法，其中该纤维素材料例如通过化学和/或物理预处理如稀酸和/或蒸汽爆炸预处理而被预处理。

12.如段落1-11中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是预处理的玉米秸秆(PCS)，如稀酸预处理的玉米秸秆。

13.如段落1-12中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是未洗涤的，如未洗涤的预处理的玉米秸杆(uwPCS)。

14.如段落1-13中任一项所述的方法，其中糖化进行长达200小时，例如，约12至约96小时、约16至约72小时或约24至约48小时，例如持续至少12小时，例如，至少24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。

15.如段落1-14中任一项所述的方法，其中在糖化24-48小时后开始向该容器中添加氧并继续直到糖化结束。

16.如段落1-15中任一项所述的方法，其中在整个糖化过程中进行氧的添加。

17.如段落1-16中任一项所述的方法，其中该糖化是连续糖化，其中在整个糖化过程中以不同间隔添加纤维素材料和纤维素分解酶组合物，并且在整个糖化过程中以不同间隔去除水解产物。

18.如段落1-17中任一项所述的方法，其中在约25℃至约75℃范围内的温度下进行糖化，例如，约30℃至约70℃、约35℃至约65℃、约40℃至60℃、约45℃至55℃或约50℃。

19.如段落1-18中任一项所述的方法，其中在约3.0至约9.0范围内的pH下进行糖化，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。

20.如段落19所述的方法，进一步包括在糖化过程中添加碱，以将pH维持在约3.0至约9.0范围内，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。

21.如段落20所述的方法，其中该碱选自下组，该组由以下各项组成：KOH、NaOH、Ca(OH)₂以及NH₄OH。

22.如段落20或21所述的方法，其中以25-2,500mmol碱/kg干纤维素材料的量添加该碱，例如25-1000mmol/kg、25-500mmol/kg、25-250mmol/kg、50-200mmol/kg。

23.如段落1-22中任一项所述的方法，其中糖化过程中的干固体含量(例如，该纤维素材料中的总固体)低于约30wt.％、25wt.％、20wt.％、15wt.％、10wt.％、7.5wt.％、5wt.％、2.5wt.％、2wt.％、1wt.％或0.5wt.％，例如在5wt.％与30wt.％之间或在10wt.％与25wt.％之间。

24.如段落1-23中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物具有真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。

25.如段落1-24中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物来源于木霉属(例如，里氏木霉)。

26.如段落1-25中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物至少包括纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。

27.如段落1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶以及β-葡糖苷酶。

28.如段落1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶以及木聚糖酶。

29.如段落1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶以及木聚糖酶。

30.如段落1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶。

31.如段落26-30中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括选自下组的一种或多种蛋白质，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、CIP、香豆酸酯酶、酯酶、棒曲霉素、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、漆酶、木质素分解酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶、以及膨胀蛋白。

32.如段落1-31中任一项所述的方法，其中该GH61多肽来源于嗜热子嚢菌属，例如橙色嗜热子囊菌的菌株，例如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2或在此的SEQ IDNO:1的GH61多肽；或来源于梭孢壳霉属，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8或在此的SEQ ID NO:4的GH61多肽；或来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:3的GH61多肽；或青霉属的菌株，例如埃默森青霉的菌株，例如披露于WO 2011/041397或在此的SEQ ID NO:2中的GH61多肽。

33.如段落1-32中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括β-葡糖苷酶，优选来源于以下项的β-葡糖苷酶：曲霉属的菌株，例如米曲霉，例如披露于WO02/095014中的β-葡糖苷酶或披露于WO 2008/057637中的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或烟曲霉，例如在WO 2005/047499中披露为SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5的β-葡糖苷酶，或披露于WO 2012/044915中的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；或青霉属的菌株，例如在WO2007/019442中披露为SEQ ID NO:2的巴西青霉的菌株，或木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。

34.如段落1-33中任一项所述的方法，其中该纤维素酶组合物进一步包括木聚糖酶，优选GH10木聚糖酶，例如来源于曲霉属的菌株的木聚糖酶，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2006/078256中披露为Xyl III或在此的SEQ ID NO:9的木聚糖酶，或棘孢曲霉，例如在WO 94/21785中披露为Xyl II或在此的SEQ ID NO:8的木聚糖酶。

35.如段落1-34中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括β-木糖苷酶，例如来源于曲霉属的菌株的β-木糖苷酶，例如烟曲霉的菌株，例如披露于未决国际申请号PCT/US2012/052163或在此的SEQ ID NO:10中的β-木糖苷酶，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如WO 2011/057140中的SEQ ID NO:58或在此的SEQ ID NO:11的成熟多肽。

36.如段落1-35中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶I，例如烟曲霉的菌株，例如披露于WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6或在此的SEQ ID NO:6中的Cel7a CBHI，或木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。

37.如段落1-36中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶II，例如披露于在此的SEQ ID NO:7中的烟曲霉的菌株；或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳霉属的菌株，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶IICEL6A。

38.如段落1-37中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括里氏木霉纤维素酶组合物和橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:1)。

39.如段落1-38中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括β-葡糖苷酶，例如米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。

40.如段落1-39中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括披露于WO 2011/041397或在此的SEQ ID NO:2中的埃默森青霉GH61A多肽。

41.如段落1-40中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括β-葡糖苷酶，例如烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用在此的SEQ ID NO:5用于编号)。

42.如段落1-41中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括以下组分中的一种或多种：

(a)烟曲霉纤维二糖水解酶I；

(b)烟曲霉纤维二糖水解酶II；

(c)烟曲霉β-葡糖苷酶或其具有以下取代中的一种或多种的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y，使用在此的SEQ ID NO:5用于编号；以及

(d)青霉属GH61多肽；或其同系物。

43.如段落1-42中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:1)、米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO 94/21785中的Xyl II或在此的SEQ ID NO:8)。

44.如段落1-43中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:1)、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQID NO:5)和棘孢曲霉木聚糖酶(披露于WO 94/21785中的Xyl II或在此的SEQ ID NO:8)。

45.如段落1-44中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括埃默森青霉GH61A多肽(WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:2)、烟曲霉β-葡糖苷酶(在WO 2005/047499中披露为SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)、烟曲霉木聚糖酶(披露于WO 2006/078256中的Xyl III或在此的SEQ IDNO:9)以及来源于烟曲霉菌株的β-木糖苷酶(在此的SEQ ID NO:10)。

46.如段落1-45中任一项所述的方法，其中按约0.01至约50.0mg，例如，约1至约25mg，如约2-10mg、如约4至约8mg蛋白/g/干固体(DS)的纤维素材料的量添加该纤维素分解酶组合物。

47.如段落1-46中任一项所述的方法，其中该过氧化氢酶是橙色嗜热子囊菌过氧化氢酶。

48.如段落1-47中任一项所述的方法，进一步包括回收该糖化的纤维素材料。

49.如段落48所述的方法，其中该糖化的纤维素材料是糖。

50.如段落49所述的方法，其中该糖选自下组，该组由以下各项组成：阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖以及木糖。

51.如段落1-50中任一项所述的方法，其中该GH61多肽构成该纤维素分解酶组合物的从0.1％-15％，优选0.5％-10％,，并且更优选0.5％-7％。

52.如段落1-51中任一项所述的方法，其中该容器包括超过10m³，如超过25m³，如超过50m³纤维素材料。

53.一种从纤维素材料生产发酵产物的方法，该方法包括：

(a)根据如段落1-52中任一项所述的方法糖化该纤维素材料；并且

(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料。

54.如段落53所述的方法，进一步包括从(b)中回收该发酵产物。

55.如段落53或54所述的方法，其中糖化和发酵同时或顺序进行。

56.如段落53-55中任一项所述的方法，其中发酵进行约8至约96小时，如约24至约60小时。

57.如段落53-56中任一项所述的方法，其中在约26℃至约60℃之间的温度下进行发酵，特别是约32℃或50℃。

58.如段落53-57中任一项所述的方法，其中在约pH 3至约pH 8下进行发酵，如pH4-5、6或7左右。

59.如段落53-58中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸、或气体。

60.如段落59所述的方法，其中该发酵产物是乙醇。

61.如段落53-60中任一项所述的方法，其中该发酵微生物是细菌或真菌生物。

62.如段落53-61中任一项所述的方法，其中该发酵生物是己糖和/或戊糖发酵生物、或其组合。

63.如段落53-62中任一项所述的方法，其中该发酵微生物是酵母菌属菌株，优选酿酒酵母。

64.如段落53-63中任一项所述的方法，其中该发酵生物是毕赤酵母属菌株，优选树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属菌株，优选博伊丁假丝酵母、芸薹假丝酵母、休哈塔假丝酵母、迪丹斯假丝酵母、假热带假丝酵母、或产朊假丝酵母。

65.如段落53-64中任一项所述的方法，其中该发酵生物是发酵单胞菌属菌株，例如运动发酵单胞菌；汉森酵母属，例如异常汉森酵母；克鲁维酵母属，例如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母、以及脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母；大肠杆菌，梭菌属菌株，例如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、以及发酵植物多糖梭菌；土芽孢杆菌属菌株；热厌氧杆菌属菌株，例如解糖热厌氧杆菌；芽孢杆菌属菌株，例如凝结芽孢杆菌。

66.如段落53-65中任一项所述的方法，其中该发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，例如利用木糖的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。

67.如段落53-66中任一项所述的方法，其中该发酵微生物是能够共发酵葡萄糖和木糖的酵母菌属菌株，例如酿酒酵母。

68.如段落53-67中任一项所述的方法，其中该发酵微生物表达木糖异构酶。

本申请还涉及以下项目。

4.如项目1-3中任一项所述的方法，其中过氧化氢酶的量处于0.5％至25％，例如，0.5％至20％、0.5％至15％、0.5％至10％、0.5％至7.5％、0.5％至5％以及0.5％至4％的总蛋白范围内。

5.如项目1、3和4中任一项所述的方法，其中糖化过程中的溶解氧浓度处于0.5％-10％饱和度范围内，例如0.5％-7％、例如0.5％-5％、例如0.5％-4％、例如0.5％-3％、例如0.5％-2％、例如1％-5％、例如1％-4％、例如1％-3％、例如1％-2％。

6.如项目1、3、4和5中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，例如至少50％、例如至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在0.5％-10％饱和度范围内，例如0.5％-7％、例如0.5％-5％、例如0.5％-4％、例如0.5％-3％、例如0.5％-2％、例如1％-5％、例如1％-4％、例如1％-3％、例如1％-2％。

7.如项目1、2和4中任一项所述的方法，其中糖化过程中的溶解氧浓度处于大于10％上至90％饱和度范围内，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。

8.如项目1、2、4和7中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，例如至少50％或至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在大于10％上至90％饱和度范围内，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。

9.如项目1-8中任一项所述的方法，其中在整个糖化过程中进行氧的添加。

10.如项目1-9中任一项所述的方法，其中该糖化是连续糖化，其中在整个糖化过程中以不同间隔添加纤维素材料和纤维素分解酶组合物，并且在整个糖化过程中以不同间隔去除水解产物。

11.如项目10所述的方法，进一步包括在糖化过程中添加碱，以将pH维持在约3.0至约9.0范围内，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。

12.如项目11所述的方法，其中该碱选自下组，该组由以下各项组成：KOH、NaOH、Ca(OH)₂以及NH₄OH。

13.如项目11或12所述的方法，其中以25-2,500mmol碱/kg干纤维素材料的量添加该碱，例如25-1000mmol/kg、25-500mmol/kg、25-250mmol/kg、50-200mmol/kg。

14.如项目1-13中任一项所述的方法，进一步包括回收该糖化的纤维素材料。

15.如项目14所述的方法，其中该糖化的纤维素材料是糖。

16.如项目15所述的方法，其中该糖选自下组，该组由以下各项组成：阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖以及木糖。

17.如项目1-16中任一项所述的方法，其中该GH61多肽构成该纤维素分解酶组合物的从0.1％-15％，优选0.5％-10％,，并且更优选0.5％-7％。

18.如项目1-17中任一项所述的方法，其中该容器包括超过10m³，如超过25m³，如超过50m³纤维素材料。

19.一种从纤维素材料生产发酵产物的方法，该方法包括：

(a)根据如项目1-18中任一项所述的方法糖化该纤维素材料；并且

(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料。

20.如项目19所述的方法，进一步包括从(b)中回收该发酵产物。

21.如项目19或20所述的方法，其中该发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸、或气体。

22.如项目21所述的方法，其中该发酵产物是乙醇。

Claims

1.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在容器中经受纤维素分解酶组合物、GH61多肽和过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在2-30％的饱和度。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中过氧化氢酶的量处于0.5％至25％，例如，0.5％至20％、0.5％至15％、0.5％至10％、0.5％至7.5％、0.5％至5％以及0.5％至4％的总蛋白范围内。

5.如权利要求1、3和4中任一项所述的方法，其中糖化过程中的溶解氧浓度处于0.5％-10％饱和度范围内，例如0.5％-7％、例如0.5％-5％、例如0.5％-4％、例如0.5％-3％、例如0.5％-2％、例如1％-5％、例如1％-4％、例如1％-3％、例如1％-2％。

6.如权利要求1、3、4和5中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，例如至少50％、例如至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在0.5％-10％饱和度范围内，例如0.5％-7％、例如0.5％-5％、例如0.5％-4％、例如0.5％-3％、例如0.5％-2％、例如1％-5％、例如1％-4％、例如1％-3％、例如1％-2％。

7.如权利要求1、2和4中任一项所述的方法，其中糖化过程中的溶解氧浓度处于大于10％上至90％饱和度范围内，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。

8.如权利要求1、2、4和7中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，例如至少50％或至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在大于10％上至90％饱和度范围内，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该纤维素材料选自下组，该组由以下各项组成：草本材料(包括能源作物)、农业废弃物、木材(包括林业废弃物)、城市固体废物、废纸、纸浆以及造纸厂废弃物。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该纤维素材料选自下组，该组由以下各项组成：玉米秸秆、麦秸、甘蔗渣、玉米芯、柳枝稷、玉米纤维、稻秸、芒草、芦竹、竹子、橘皮、杨树、松树、白杨、冷杉、云杉、柳树以及桉树。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该纤维素材料例如通过化学和/或物理预处理如稀酸和/或蒸汽爆炸预处理而被预处理。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是预处理的玉米秸秆(PCS)，如稀酸预处理的玉米秸秆。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是未洗涤的，如未洗涤的预处理的玉米秸杆(uwPCS)。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中糖化进行长达200小时，例如，约12至约96小时、约16至约72小时或约24至约48小时，例如持续至少12小时，例如，至少24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中在糖化24-48小时后开始向该容器中添加氧并继续直到糖化结束。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中在整个糖化过程中进行氧的添加。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中该糖化是连续糖化，其中在整个糖化过程中以不同间隔添加纤维素材料和纤维素分解酶组合物，并且在整个糖化过程中以不同间隔去除水解产物。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在约25℃至约75℃范围内的温度下进行糖化，例如，约30℃至约70℃、约35℃至约65℃、约40℃至60℃、约45℃至55℃或约50℃。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在约3.0至约9.0范围内的pH下进行糖化，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。

20.如权利要求19所述的方法，进一步包括在糖化过程中添加碱，以将pH维持在约3.0至约9.0范围内，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。

21.如权利要求20所述的方法，其中该碱选自下组，该组由以下各项组成：KOH、NaOH、Ca(OH)₂以及NH₄OH。

22.如权利要求20或21所述的方法，其中以25-2,500mmol碱/kg干纤维素材料的量添加该碱，例如25-1000mmol/kg、25-500mmol/kg、25-250mmol/kg、50-200mmol/kg。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中糖化过程中的干固体含量(例如，该纤维素材料中的总固体)低于约30wt.％、25wt.％、20wt.％、15wt.％、10wt.％、7.5wt.％、5wt.％、2.5wt.％、2wt.％、1wt.％或0.5wt.％，例如在5wt.％与30wt.％之间或在10wt.％与25wt.％之间。

24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物具有真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。

25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物来源于木霉属(例如，里氏木霉)。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物至少包括纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。

27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶以及β-葡糖苷酶。

28.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶以及木聚糖酶。

29.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶以及木聚糖酶。

30.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶。

31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括选自下组的一种或多种蛋白质，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、CIP、香豆酸酯酶、酯酶、棒曲霉素、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、漆酶、木质素分解酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶、以及膨胀蛋白。

32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中该GH61多肽来源于嗜热子嚢菌属，例如橙色嗜热子囊菌的菌株，例如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2或在此的SEQ IDNO:1的GH61多肽；或来源于梭孢壳霉属，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8或在此的SEQ ID NO:4的GH61多肽；或来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:3的GH61多肽；或青霉属的菌株，例如埃默森青霉的菌株，例如披露于WO 2011/041397或在此的SEQ ID NO:2中的GH61多肽。

33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括β-葡糖苷酶，优选来源于以下项的β-葡糖苷酶：曲霉属的菌株，例如米曲霉，例如披露于WO02/095014中的β-葡糖苷酶或披露于WO 2008/057637中的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或烟曲霉，例如在WO 2005/047499中披露为SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5的β-葡糖苷酶，或披露于WO 2012/044915中的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；或青霉属的菌株，例如在WO2007/019442中披露为SEQ ID NO:2的巴西青霉的菌株，或木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。

34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中该纤维素酶组合物进一步包括木聚糖酶，优选GH10木聚糖酶，例如来源于曲霉属的菌株的木聚糖酶，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2006/078256中披露为Xyl III或在此的SEQ ID NO:9的木聚糖酶，或棘孢曲霉，例如在WO 94/21785中披露为Xyl II或在此的SEQ ID NO:8的木聚糖酶。

35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括β-木糖苷酶，例如来源于曲霉属的菌株的β-木糖苷酶，例如烟曲霉的菌株，例如披露于未决国际申请号PCT/US2012/052163或在此的SEQ IDNO:10中的β-木糖苷酶，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如WO 2011/057140中的SEQ ID NO:58或在此的SEQ ID NO:11的成熟多肽。

36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶I，例如烟曲霉的菌株，例如披露于WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6或在此的SEQ ID NO:6中的Cel7a CBHI，或木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。

37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶II，例如披露于在此的SEQ ID NO:7中的烟曲霉的菌株；或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳霉属的菌株，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶IICEL6A。

38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括里氏木霉纤维素酶组合物和橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:1)。

39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括β-葡糖苷酶，例如米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。

40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括披露于WO 2011/041397或在此的SEQ ID NO:2中的埃默森青霉GH61A多肽。

41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括β-葡糖苷酶，例如烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用在此的SEQ ID NO:5用于编号)。

42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括以下组分中的一种或多种：

(a)烟曲霉纤维二糖水解酶I；

(b)烟曲霉纤维二糖水解酶II；

(d)青霉属GH61多肽；或其同系物。

43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:1)、米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO 94/21785中的Xyl II或在此的SEQ ID NO:8)。

44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:1)、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQID NO:5)和棘孢曲霉木聚糖酶(披露于WO 94/21785中的Xyl II或在此的SEQ ID NO:8)。

45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括埃默森青霉GH61A多肽(WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:2)、烟曲霉β-葡糖苷酶(在WO 2005/047499中披露为SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)、烟曲霉木聚糖酶(披露于WO 2006/078256中的Xyl III或在此的SEQ IDNO:9)以及来源于烟曲霉菌株的β-木糖苷酶(在此的SEQ ID NO:10)。

46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中按约0.01至约50.0mg，例如，约1至约25mg，如约2-10mg、如约4至约8mg蛋白/g/干固体(DS)的纤维素材料的量添加该纤维素分解酶组合物。

47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中该过氧化氢酶是橙色嗜热子囊菌过氧化氢酶。

48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，进一步包括回收该糖化的纤维素材料。

49.如权利要求48所述的方法，其中该糖化的纤维素材料是糖。

50.如权利要求49所述的方法，其中该糖选自下组，该组由以下各项组成：阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖以及木糖。

51.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中该GH61多肽构成该纤维素分解酶组合物的从0.1％-15％，优选0.5％-10％,，并且更优选0.5％-7％。

52.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其中该容器包括超过10m³，如超过25m³，如超过50m³纤维素材料。

53.一种从纤维素材料生产发酵产物的方法，该方法包括：

(a)根据如权利要求1-52中任一项所述的方法糖化该纤维素材料；并且

(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料。

54.如权利要求53所述的方法，进一步包括从(b)中回收该发酵产物。

55.如权利要求53或54所述的方法，其中糖化和发酵同时或顺序进行。

56.如权利要求53-55中任一项所述的方法，其中发酵进行约8至约96小时，如约24至约60小时。

57.如权利要求53-56中任一项所述的方法，其中在约26℃至约60℃之间的温度下进行发酵，特别是约32℃或50℃。

58.如权利要求53-57中任一项所述的方法，其中在约pH 3至约pH 8下进行发酵，如pH4-5、6或7左右。

59.如权利要求53-58中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸、或气体。

60.如权利要求59所述的方法，其中该发酵产物是乙醇。

61.如权利要求53-60中任一项所述的方法，其中该发酵微生物是细菌或真菌生物。

62.如权利要求53-61中任一项所述的方法，其中该发酵生物是己糖和/或戊糖发酵生物、或其组合。

63.如权利要求53-62中任一项所述的方法，其中该发酵微生物是酵母菌属菌株，优选酿酒酵母。

64.如权利要求53-63中任一项所述的方法，其中该发酵生物是毕赤酵母属菌株，优选树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属菌株，优选博伊丁假丝酵母、芸薹假丝酵母、休哈塔假丝酵母、迪丹斯假丝酵母、假热带假丝酵母、或产朊假丝酵母。

65.如权利要求53-64中任一项所述的方法，其中该发酵生物是发酵单胞菌属菌株，例如运动发酵单胞菌；汉森酵母属，例如异常汉森酵母；克鲁维酵母属，例如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母、以及脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母；大肠杆菌，梭菌属菌株，例如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、以及发酵植物多糖梭菌；土芽孢杆菌属菌株；热厌氧杆菌属菌株，例如解糖热厌氧杆菌；芽孢杆菌属菌株，例如凝结芽孢杆菌。

66.如权利要求53-65中任一项所述的方法，其中该发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，例如利用木糖的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。

67.如权利要求53-66中任一项所述的方法，其中该发酵微生物是能够共发酵葡萄糖和木糖的酵母菌属菌株，例如酿酒酵母。

68.如权利要求53-67中任一项所述的方法，其中该发酵微生物表达木糖异构酶。