CN118320092A - 用于治疗和/或预防冠状病毒诱导的急性呼吸窘迫综合征的抑制masp-2的方法 - Google Patents

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G·A·德莫普洛斯
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Abstract

在一个方面，本发明提供了用于治疗、抑制、减轻或预防由冠状病毒例如SARS‑CoV‑2感染的哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征、肺炎或者冠状病毒感染的一些其它肺部表现或其它表现例如血栓形成的方法。所述方法包括将有效抑制MASP‑2依赖性补体活化的量的MASP‑2抑制剂施用于由冠状病毒感染的受试者的步骤。在一个实施方案中，MASP‑2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP‑2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP‑2抑制剂是小分子MASP‑2抑制性化合物。在一个实施方案中，受试者是患有COVID‑19诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的人受试者，并且在治疗之前需要补充氧气，并且MASP‑2抑制剂以足以中止对于补充氧气的需要的量施用。

Description

用于治疗和/或预防冠状病毒诱导的急性呼吸窘迫综合征的 抑制MASP-2的方法
本申请是申请日为2021年3月5日，申请号为202180019367.6，发明名称为“用于治疗和/或预防冠状病毒诱导的急性呼吸窘迫综合征的抑制MASP-2的方法”的发明专利的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月6日提交的美国临时申请号62/986,566的权益，并且要求于2020年4月10日提交的美国临时申请号63/008,540的权益，并且要求于2020年4月24日提交的美国临时申请号63/015,299的权益，并且要求于2020年7月21日提交的美国临时申请号63/054,298的权益，并且要求于2020年8月7日提交的美国临时申请号63/062,843的权益，并且要求于2020年10月22日提交的美国临时申请号63/104,229的权益，并且要求于2020年10月26日提交的美国临时申请号63/105,637的权益，并且要求于2021年1月22日提交的美国临时申请号63/140,591的权益，所述美国临时申请全部在此整体引入作为参考。
背景技术
补体系统提供了在人和其它脊椎动物中的早期作用机制，以启动、扩增且协调对微生物感染和其它急性伤害的免疫应答(M.K.Liszewski和J.P.Atkinson，1993，于Fundamental Immunology，第三版，由W.E.Paul编辑，Raven Press，Ltd.，New York)。虽然补体活化提供了针对潜在病原体的有价值的一线防御，但促进保护性免疫应答的补体活性也可能代表对宿主的潜在威胁(K.R.Kalli等人，Springer Semin.Immunopathol.15:417-431，1994；B.P.Morgan，Eur.J.Clinical Investig.24:219-228，1994)。例如，C3和C5蛋白酶解产物募集并活化嗜中性粒细胞。虽然活化的嗜中性粒细胞对于宿主防御是必不可少的，但在其破坏性酶的释放方面是不加区别的，并且可能引起器官损害。另外，补体活化可能引起裂解性补体组分沉积在附近的宿主细胞以及微生物靶上，从而导致宿主细胞裂解。
当前，广泛公认补体系统可以通过三种不同的途径被活化：经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径通常为由与外来颗粒(即抗原)结合的宿主抗体组成的复合物所触发，因此需要先前暴露于抗原以生成特异性抗体应答。由于经典途径的活化取决于宿主的先前适应性免疫应答，因此经典途径是获得性免疫系统的部分。相比之下，凝集素途径和替代途径两者均不依赖于适应性免疫，并且是先天免疫系统的部分。
凝集素途径被广泛认为在首次用于实验的宿主中针对感染的宿主防御中具有主要作用。MBL涉及宿主防御的有力证据来自功能性MBL的血清水平减少的患者的分析(Kilpatrick，Biochim.Biophys.Acta 1572:401-413,(2002))。此类患者展示对复发性细菌和真菌感染的敏感性。这些症状通常在生命的早期显而易见，在由于母体衍生的抗体滴度减弱而明显的易损性窗口期间，但在抗体应答的完全库(repertoire)发展之前。这种综合征经常起因于在MBL的胶原部分中的几个位点处的突变，所述突变干扰MBL寡聚体的正确形成。然而，由于MBL可以不依赖于补体而充当调理素，因此尚不知道感染敏感性的增加在多大程度上是由于受损的补体活化。
所有三种途径(即，经典途径、凝集素途径和替代途径)已被认为在C5处汇聚，所述C5被切割以形成具有多重促炎效应的产物。汇聚的途径已被称为末端补体途径。C5a是最有效力的过敏毒素，诱导平滑肌和血管紧张度以及血管渗透性的改变。它也是嗜中性粒细胞和单核细胞两者的强大的趋化因子和活化剂。C5a介导的细胞活化可以通过诱导多种另外的炎症介质(包括细胞因子、水解酶、花生四烯酸代谢产物和活性氧物类)的释放，来显著放大炎症应答。C5切割导致C5b-9的形成，后者也称为膜攻击复合物(MAC)。目前有证据强烈表明，除作为裂解孔形成复合物的作用之外，亚裂解性MAC沉积还可能在炎症中起重要作用。
除了在免疫防御中的必要作用之外，补体系统还在许多临床状况下促成组织损伤。尽管存在广泛证据暗示经典补体途径和替代补体途径两者涉及非传染性人疾病的发病机制，但凝集素途径的作用才刚刚开始进行评估。最近的研究提供了以下证据：凝集素途径的活化可能负责缺血/再灌注损伤中的补体活化和有关炎症。Collard等人(2000)报告了经受氧化性应激的培养的内皮细胞结合MBL，并且在暴露于人血清后显示C3的沉积(Collard等人，Am.J.Pathol.156:1549-1556,(2000))。另外，用阻断性抗MBL单克隆抗体处理人血清抑制MBL结合和补体活化。这些发现扩展到心肌缺血再灌注的大鼠模型，在所述模型中，与用对照抗体治疗的大鼠相比，用针对大鼠MBL的阻断抗体治疗的大鼠显示了在冠状动脉闭塞后明显更少的心肌损伤(Jordan等人，Circulation 104:1413-1418,(2001))。在氧化性应激后MBL与血管内皮结合的分子机制尚不清楚；最近的研究提示了，在氧化性应激后凝集素途径的活化可能通过MBL与血管内皮细胞角蛋白(而非糖缀合物)的结合来介导(Collard等人，Am.J.Pathol.159:1045-1054,(2001))。其它研究已暗示经典途径和替代途径涉及缺血/再灌注损伤的发病机制，而凝集素途径在该疾病中的作用仍存在争议(Riedermann，N.C.等人，Am.J.Pathol.162:363-367，2003)。
纤维化是通常响应损害或损伤而在器官或组织中过度形成结缔组织。纤维化的标志是在局部创伤之后过度产生细胞外基质。对损伤的正常生理应答导致结缔组织的沉积，但这种最初有益的修复过程可能持续并变得病理性，改变组织的体系结构和功能。在细胞水平，上皮细胞和成纤维细胞增殖并分化为成肌纤维细胞，导致基质收缩、刚性增加、微血管压缩和缺氧。包括巨噬细胞和淋巴细胞在内的炎性细胞的流入导致细胞因子释放，并且扩大胶原、纤连蛋白和纤维化的其它分子标记物的沉积。使用皮质类固醇和免疫抑制药物，常规治疗方法已在很大程度上靶向纤维化的炎症过程。遗憾的是，这些消炎药具有很少乃至没有临床效应。目前不存在用于纤维化的有效治疗或治疗剂，但动物研究和传闻的人报告两者均提示了，纤维化组织损伤可以被逆转(Tampe和Zeisberg，Nat Rev Nephrol，第10卷:226-237，2014)。
肾脏具有从损伤中恢复的有限能力。各种肾病理状况导致局部炎症，其引起肾组织的瘢痕形成和纤维化。炎性刺激的持续驱动慢性肾脏疾病中的小管间质性炎症和纤维化以及进行性肾功能受损。其进展为终末期肾衰竭与显著的发病率和死亡率相关。由于小管间质性纤维化是多种肾病理状况的共同终点，因此它代表了旨在预防肾衰竭的疗法的关键靶。不依赖于原发性肾疾病的风险因素(例如蛋白尿)通过驱动局部炎症而促成肾纤维化的发展和肾排泄功能的丧失，进而增强了疾病进展。
考虑到纤维化在许多疾病和病症中的作用，例如导致慢性肾脏疾病的小管间质性纤维化，迫切需要开发治疗上有效的药剂，用于治疗由纤维化引起或加剧的疾病和病况。进一步鉴于靶向肾疾病中的炎症性促纤维化途径的新的和现有治疗的匮乏，需要开发治疗上有效的药剂以治疗、抑制、预防和/或逆转肾纤维化，并且从而预防进行性慢性肾脏疾病。
冠状病毒病2019(COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS冠状病毒2或SARS-CoV-2)引起的传染病，所述病毒是与SARS病毒密切相关的病毒(世界卫生组织(World Health Organization)，2/11/2020，Novel Coronavirus Situation Report 22)。受COVID-19影响的那些人可能发生发烧、干咳、疲劳和呼吸短促。病例可能进展为呼吸功能障碍，包括肺炎、严重急性呼吸综合征以及最脆弱的人的死亡(参见例如，HuiD.S.等人，IntJ Infect Dis 91:264-266，2020年1月14日)。不存在疫苗或特异性抗病毒治疗，其管理涉及症状的治疗和支持性护理。
流感(也称为“流行性感冒”)是由RNA流感病毒引起的传染病。流感病毒感染的症状可能为轻度至重度的，并且包括高烧、流鼻涕、咽喉痛、肌肉和关节疼痛、头痛、咳嗽和感到疲倦。这些症状通常在暴露于病毒后两天开始，且大多数持续少于一周，然而，咳嗽可能持续多于两周。(参见“Influenza Seasonal，World Health Organization 6，2018年11月6日)。流感的并发症可能包括病毒性肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、继发性细菌性肺炎、鼻窦感染以及先前的健康问题如哮喘或心力衰竭的恶化(参见“Key Facts AboutInfluenza(Flu)”Centers for Disease Control and Prevention(CDC)，2014年9月9日)。流感的效应比普通感冒严重得多，并且持续更长时间。大多数人在约一至两周内完全恢复，但其它人会发展危及生命的并发症，例如肺炎。因此，流感可能是致命的，尤其是对于具有受损的免疫系统或长期患病的体弱者、幼者和老者。参见Hilleman MR，Vaccine.20(25–26):3068–87(2002)。
四种类型的流感病毒中的三种影响人：甲型、乙型和丙型(参见“Types ofInfluenza Viruses Seasonal Influenza(Flu)，Centers for Disease Control andPrevention(CDC).2017年9月27日)。丁型尚未知感染人，但认为具有这样的潜力(参见“Novel Influenza D virus:Epidemiology，pathology，evolution and biologicalcharacteristics,”Virulence.8(8):1580–91，2017)。已在人中确认的甲型流感的血清型为：H1N1(引起1918年的“西班牙流感”和2009年的“猪流感”)；H2N2(引起1957年的“亚洲流感”)、H3N2(引起1968年在中国香港地区出现的“流感”)、H5N1(引起2004年的“禽流感”)、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9和H6N1。参见世界卫生组织(2006年6月30日)。“Epidemiology of WHO-confirmed human cases of avian influenza A(H5N1)infection，Wkly Epidemiol Rec.81(26):249–57.；Fouchier RA等人(2004)PNAS101(5):1356-61；Wkly Epidemiol Rec.83(46):415–20，Asian Lineage Avian Influenza A(H7N9)Virus，Centers for Disease Control and Prevention(CDC)，2018年12月7日)。
流感病毒(也称为流行性感冒)的常见症状，例如发烧、头痛和疲劳，是由受流感感染的细胞产生的大量促炎细胞因子和趋化因子(例如干扰素或肿瘤坏死因子)的结果。参见Eccles R.等人，Lancet Infect Dis 5(11):718-25(2005)；Schmitz N等人，Journal ofVirology.79(10):6441–8(2005)。这种大规模的免疫应答可能导致危及生命的细胞因子风暴。这种效应已提议为H5N1禽流感和1918年大流行毒株两者的异常致命性的原因。CheungCY等人，Lancet.360(9348):1831–37(2002)；Kash JC等人，Nature.443(7111):578–81(2006)。流感似乎也触发了程序性细胞死亡(细胞凋亡)，参见Clinical RespiratoryMedicine，Elsevier Health Sciences.第311页(2012)。
因此，迫切需要开发治疗上有效的药剂，以治疗、抑制和/或预防冠状病毒诱导的肺炎和急性呼吸窘迫综合征、以及流感病毒诱导的肺炎和急性呼吸窘迫综合征。
概述
提供该概述以简化形式介绍所选择的概念，所述概念在下文详述中进一步描述。该概述并不预期鉴定请求保护的主题的关键特征，也不旨在用作确定请求保护的主题的范围的帮助。
在一个方面，本发明提供了用于治疗、抑制、减轻或预防由冠状病毒感染的哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征的方法，其包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有一种或多种呼吸症状，并且方法包括将有效改善至少一种呼吸症状(即，改善呼吸功能)的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由SARS-CoV-2感染的受试者。在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于患有COVID-19的受试者，例如患有与COVID-19相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的受试者。在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由SARS-CoV感染的受试者。在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由MERS-CoV感染的受试者。在一个实施方案中，在MASP-2抑制剂施用之前，受试者被鉴定为具有冠状病毒(即SARS-CoV-2、SARS-CoV或MERS-CoV)。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂选择性地抑制凝集素途径补体活化，而基本上不抑制C1q依赖性补体活化。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是抑制MASP-2依赖性补体活化的小分子，例如合成或半合成的小分子。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2的表达抑制剂。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体抑制90％人血清(即正常人血清)中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗、抑制、减轻或预防由流感病毒感染的哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征的方法，其包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有一种或多种呼吸症状，并且方法包括将有效改善至少一种呼吸症状(即，改善呼吸功能)的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一个实施方案中，受试者由选自甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的流感病毒感染。在一个实施方案中，受试者由甲型流感感染。该受试者由选自以下的甲型流感血清型感染：H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9和H6N1。在一个实施方案中，在MASP-2抑制剂施用之前，受试者被鉴定为具有流感病毒。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂选择性地抑制凝集素途径补体活化，而基本上不抑制C1q依赖性补体活化。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是抑制MASP-2依赖性补体活化的小分子，例如合成或半合成的小分子。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2的表达抑制剂。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体抑制90％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗、抑制、减轻或预防哺乳动物受试者的纤维化的方法，所述受试者患有疾病或病症或者处于发展疾病或病症的风险中，所述疾病或病症由纤维化和/或炎症引起或者因纤维化和/或炎症而加剧，例如冠状病毒感染，该方法包括将有效抑制纤维化的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂选择性地抑制凝集素途径补体活化，而基本上不抑制C1q依赖性补体活化。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗、抑制、减轻或预防由冠状病毒感染的哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征、肺炎或者冠状病毒感染的一些其它肺部表现或其它表现例如血栓形成的方法，其包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是小分子MASP-2抑制性化合物。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗患有COVID-19诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或肺炎的人受试者的方法，其包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一个实施方案中，受试者在治疗之前处于机械呼吸机(侵入性机械呼吸机或非侵入性机械呼吸机)上，并且MASP-2抑制剂以足以中止对于机械通气的需要的剂量和时间段施用。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是小分子MASP-2抑制性化合物。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗、预防由SARS-CoV-2感染的人受试者的凝血或血栓形成或者降低其严重性的方法，其包括将有效治疗、预防所述受试者的凝血或血栓形成或者降低其严重性的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一个实施方案中，受试者具有的D-二聚体水平高于治疗前的标准范围，并且MASP-2抑制剂以足以将所述受试者的D-二聚体水平降低到健康受试者的正常范围内的量和时间施用。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂提供抗凝和/或抗血栓形成效应，而不影响止血。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是小分子MASP-2抑制性化合物。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗、改善、预防或降低人受试者发展一种或多种COVID-19有关的长期后遗症的风险的方法，所述人受试者目前由SARS-CoV-2感染或已由SARS-CoV-2感染，所述方法包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一个实施方案中，受试者患有COVID-19诱导的肺炎或ARDS，并且MASP-2抑制剂以有效改善呼吸功能的量施用。在一个实施方案中，受试者已从COVID-19诱导的肺炎或ARDS中恢复，并且MASP-2抑制剂以治疗或改善一种或多种长期后遗症的量施用。在一个实施方案中，受试者患有COVID-19诱导的凝血或血栓形成，并且MASP-2抑制剂以有效治疗、预防所述受试者的凝血或血栓形成或者降低其严重性的量施用于受试者。在一个实施方案中，受试者已从COVID-19诱导的凝血或血栓形成中恢复，并且MASP-2抑制剂以治疗或改善一种或多种长期后遗症的量施用。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是小分子MASP-2抑制性化合物。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗、抑制、减轻或预防由流感病毒感染的哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征、肺炎或者流感病毒感染的一些其它肺部表现或其它表现的方法，其包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一个实施方案中，流感病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。在一个实施方案中，甲型流感病毒选自H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9和H6N1。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是小分子MASP-2抑制性化合物。
附图说明
本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更加容易理解，因为当与附图结合考虑时，通过参考下述详述，它们将变得更加容易理解，在所述附图中：
图1是示出了人MASP-2的基因组结构的图；
图2A是示出了人MASP-2蛋白的结构域结构的示意图；
图2B是示出了人MAp19蛋白的结构域结构的示意图；
图3是示出了鼠MASP-2敲除策略的图；
图4是示出了人MASP-2小基因(minigene)构建体的图；
图5A呈现的结果证实了，如实施例2中所述，如通过甘露聚糖上的C4b沉积的缺乏测量的，MASP-2缺陷导致凝集素途径介导的C4活化的丧失；
图5B呈现的结果证实了，如实施例2中所述，如通过酵母聚糖上的C4b沉积的缺乏测量的，MASP-2缺陷导致凝集素途径介导的C4活化的丧失；
图5C呈现的结果证实了，如实施例2中所述，如通过甘露聚糖和酵母聚糖上的C4b沉积测量的，从MASP-2+/-、MASP-2-/-和野生型毒株获得的血清样品的相对C4活化水平；
图6呈现的结果证实了，如实施例2中所述，如通过甘露聚糖上的C4b沉积测量的，向MASP-2-/-血清样品中添加鼠重组MASP-2，以蛋白质浓度依赖性的方式恢复凝集素途径介导的C4活化；
图7呈现的结果证实了，如实施例8中所述，经典途径在MASP-2-/-毒株中是有功能的；
图8A呈现的结果证实了，如实施例10中所述，抗MASP-2 Fab2抗体#11抑制C3转化酶形成；
图8B呈现的结果证实了，如实施例10中所述，抗MASP-2 Fab2抗体#11结合天然大鼠MASP-2；
图8C呈现的结果证实了，如实施例10中所述，抗MASP-2 Fab2抗体#41抑制C4切割；
图9呈现的结果证实了，如实施例10中所述，所有测试的抑制C3转化酶形成的抗MASP-2 Fab2抗体也被发现抑制C4切割；
图10是示出了衍生自大鼠MASP-2的重组多肽的图，所述重组多肽用于MASP-2阻断Fab2抗体的表位作图，如实施例11中所述；
图11呈现的结果证实了，如实施例11中所述，抗MASP-2 Fab2#40和#60与大鼠MASP-2多肽的结合；
图12A以图形方式示出了，在凝集素途径特异性测定条件下，在人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的存在或不存在下的MAC沉积水平，证实了OMS646抑制凝集素介导的MAC沉积，其IC50值为大约1nM，如实施例12中所述；
图12B以图形方式示出了，在经典途径特异性测定条件下，在人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的存在或不存在下的MAC沉积水平，证实了OMS646并不抑制经典途径介导的MAC沉积，如实施例12中所述；
图12C以图形方式示出了，在替代途径特异性测定条件下，在人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的存在或不存在下的MAC沉积水平，证实了OMS646并不抑制替代途径介导的MAC沉积，如实施例12中所述；
图13以图形方式示出了，人MASP-2单克隆抗体(OMS646)在小鼠中的药代动力学(PK)概况，显示了在以指示剂量施用后，根据时间的OMS646浓度(n＝3只动物/组的平均值)，如实施例12中所述；
图14A以图形方式示出了，在静脉内施用之后，在小鼠中测量为系统性凝集素途径活性的下降的人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的药效学(PD)应答，如实施例12中所述；
图14B以图形方式示出了，在皮下施用之后，在小鼠中测量为系统性凝集素途径活性的下降的人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的药效学(PD)应答，如实施例12中所述；
图15以图形方式示出了，用天狼星红染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，其中所述组织切片得自在单侧输尿管梗阻(UUO)7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠，以及假手术的野生型和MASP-2-/-小鼠，如实施例14中所述；
图16以图形方式示出了，用F4/80巨噬细胞特异性抗体染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，其中所述组织切片得自在单侧输尿管梗阻(UUO)7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、以及假手术的野生型和MASP-2-/-小鼠，如实施例14中所述。
图17以图形方式示出了，在得自单侧输尿管梗阻(UUO)7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、以及假手术的野生型和MASP-2-/-小鼠的肾脏组织切片中，如通过定量PCR(qPCR)测量的，胶原-4的相对mRNA表达水平，如实施例14中所述。
图18以图形方式示出了，在得自单侧输尿管梗阻(UUO)7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、以及假手术的野生型和MASP-2-/-小鼠的肾脏组织切片中，如通过qPCR测量的，转化生长因子β-1(TGFβ-1)的相对mRNA表达水平，如实施例14中所述。
图19以图形方式示出了，在得自单侧输尿管梗阻(UUO)7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、以及假手术的野生型和MASP-2-/-小鼠的肾脏组织切片中，如通过qPCR测量的，白细胞介素6(IL-6)的相对mRNA表达水平，如实施例14中所述。
图20以图形方式示出了，在得自单侧输尿管梗阻(UUO)7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、以及假手术的野生型和MASP-2-/-小鼠的肾脏组织切片中，如通过qPCR测量的，干扰素-γ的相对mRNA表达水平，如实施例14中所述。
图21以图形方式示出了，用天狼星红染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，其中所述组织切片在单侧输尿管梗阻(UUO)7天之后，得自用MASP-2抑制性抗体以及同种型对照抗体治疗的野生型小鼠，如实施例15中所述。
图22以图形方式示出了，与来自得自用IgG4同种型对照治疗的野生型小鼠的梗阻肾脏的组织中的羟脯氨酸水平相比，来自得自用MASP-2抑制性抗体治疗的野生型小鼠的单侧输尿管梗阻(UUO)后7天收获的肾脏的羟脯氨酸含量，如实施例15中所述。
图23以图形方式示出了，在仅接受盐水的野生型对照小鼠(n＝2)、接受BSA的野生型小鼠(n＝6)和接受BSA的MASP-2-/-小鼠(n＝6)中，在蛋白质超负荷研究的第15天时测量的血清蛋白质总量(mg/ml)，如实施例16中所述。
图24以图形方式示出了，来自仅接受盐水的野生型对照小鼠(n＝2)、接受BSA的野生型(n＝6)和接受BSA的MASP-2-/-小鼠(n＝6)，在蛋白质超负荷研究的第15天时，在经过24小时时期收集的尿中的排泄蛋白质总量(mg)，如实施例16中所述。
图25显示了在蛋白质超负荷研究的第15天时，来自如下的下述小鼠组的代表性苏木精和曙红(H&E)染色的肾组织切片：(小图A)野生型对照小鼠；(小图B)MASP-2-/-对照小鼠，(小图C)用BSA治疗的野生型小鼠；以及(小图D)用牛血清白蛋白(BSA)治疗的MASP-2-/-小鼠，如实施例16中所述。
图26以图形方式示出了，用巨噬细胞特异性抗体F4/80染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，显示了巨噬细胞的平均染色面积(％)，其中所述组织切片在蛋白质超负荷研究的第15天得自野生型对照小鼠(n＝2)、用BSA治疗的野生型小鼠(n＝6)、以及用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠(n＝5)，如实施例16中所述。
图27A以图形方式示出了，通过相对于巨噬细胞浸润(平均染色面积％)绘制来自24小时样品的尿中测量的总排泄蛋白，关于用BSA治疗的每只野生型小鼠(n＝6)中的巨噬细胞-蛋白尿相关性的存在的分析，如实施例16中所述。
图27B以图形方式示出了，通过相对于巨噬细胞浸润(平均染色面积％)绘制在24小时样品的尿中的总排泄蛋白，关于用BSA治疗的每只MASP-2-/-小鼠(n＝5)中的巨噬细胞-蛋白尿相关性的存在的分析，如实施例16中所述。
图28以图形方式示出了，在用BSA治疗的野生型小鼠(n＝4)和用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠(n＝5)中，用抗TGFβ抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％TGFβ抗体染色面积测量的)，如实施例16中所述。
图29以图形方式示出了，在用BSA治疗的野生型小鼠(n＝4)和用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠(n＝5)中，用抗TNFα抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％TNFα抗体染色面积测量的)，如实施例16中所述。
图30以图形方式示出了，在野生型对照小鼠、MASP-2-/-对照小鼠、用BSA治疗的野生型小鼠(n＝7)和用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠(n＝7)中，用抗IL-6抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％IL-6抗体染色面积测量的)，如实施例16中所述。
图31以图形方式示出了，在野生型对照小鼠(n＝1)、MASP-2-/-对照小鼠(n)、用BSA治疗的野生型小鼠(n＝7)和用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠(n＝7)中，从来自肾皮质的组织切片中连续选择的20个高倍视野(HPF)中计数的TUNEL凋亡细胞的频率，如实施例16所述。
图32显示了在用BSA治疗后的第15天，来自下述小鼠组的代表性H&E染色的组织切片：(小图A)用盐水治疗的野生型对照小鼠，(小图B)同种型抗体治疗的对照小鼠，以及(小图C)用MASP-2抑制性抗体治疗的野生型小鼠，如实施例17中所述。
图33以图形方式示出了，在用盐水对照和BSA治疗的野生型小鼠(n＝8)、用同种型对照抗体和BSA治疗的野生型小鼠(n＝8)、以及用MASP-2抑制性抗体和BSA治疗的野生型小鼠(n＝7)中，从来自肾皮质的组织切片中连续选择的20个高倍视野(HPF)中计数的TUNEL凋亡细胞的频率，如实施例17中所述。
图34以图形方式示出了，在用BSA和盐水治疗的野生型小鼠(n＝8)、用BSA和同种型对照抗体治疗的野生型小鼠(n＝7)、以及用BSA和MASP-2抑制性抗体治疗的野生型小鼠(n＝8)中，用抗TGFβ抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％TGFβ抗体染色面积测量的)，如实施例17中所述。
图35以图形方式示出了，在用BSA和盐水治疗的野生型小鼠(n＝8)、用BSA和同种型对照抗体治疗的野生型小鼠(n＝7)、以及用BSA和MASP-2抑制性抗体治疗的野生型小鼠(n＝8)中，用抗TNFα抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％TNFα抗体染色面积测量的)，如实施例17中所述。
图36以图形方式示出了，在用BSA和盐水治疗的野生型小鼠(n＝8)、用BSA和同种型对照抗体治疗的野生型小鼠(n＝7)、以及用BSA和MASP-2抑制性抗体治疗的野生型小鼠(n＝8)中，用抗IL-6抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％IL-6抗体染色面积测量的)，如实施例17中所述。
图37显示了在仅用阿霉素或盐水(对照)治疗后的第14天，来自下述小鼠组的代表性H&E染色的组织切片：(小图A-1、A-2、A-3)仅用盐水治疗的野生型对照小鼠；(小图B-1、B-2、B-3)用阿霉素治疗的野生型小鼠；以及(小图C-1、C-2、C-3)用阿霉素治疗的MASP-2-/-小鼠，如实施例18中所述；
图38以图形方式示出了，用巨噬细胞特异性抗体F4/80染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，显示了在仅用阿霉素或盐水(野生型对照)治疗后的第14天，来自下述小鼠组的巨噬细胞的平均染色面积(％)：仅用盐水治疗的野生型对照小鼠；用阿霉素治疗的野生型小鼠；仅用盐水治疗的MASP-2-/-小鼠，以及用阿霉素治疗的MASP-2/-小鼠，其中**p＝0.007，如实施例18中所述；
图39以图形方式示出了，用天狼星红染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，显示了在仅用阿霉素或盐水(野生型对照)治疗后的第14天，来自下述小鼠组的胶原沉积的染色面积(％)：仅用盐水治疗的野生型对照小鼠；用阿霉素治疗的野生型小鼠；仅用盐水治疗的MASP-2-/-小鼠，以及用阿霉素治疗的MASP-2/-小鼠，其中**p＝0.005，如实施例18中所述；和
图40以图形方式示出了，在用MASP-2抑制性抗体(OMS646)的每周治疗的十二周研究过程期间，两个IgA患者中的尿白蛋白/肌酐比(uACR)，如实施例19中所述。
图41A显示了来自COVID-19患者肺的中隔血管组织切片的免疫组织化学分析的代表性图像(H&E，400x)，如实施例21中所述。
图41B显示了来自COVID-19患者肺的中隔血管组织切片的免疫组织化学分析的代表性图像(H&E，400x)，如实施例21中所述。
图41C显示了来自COVID-19患者的中等直径肺中隔血管的组织切片的免疫组织化学分析的代表性图像，如实施例21中所述。
图41D显示了来自COVID-19患者的肝实质组织切片的免疫组织化学分析的代表性图像(H&E，400x)，如实施例21中所述。
图42A以图形方式示出了，与并非这项研究的部分的COVID-19患者(n＝33)中的CEC/ml计数相比，在正常健康对照(n-6)的外周血中的循环内皮细胞(CEC)/ml计数，如实施例21中所述。
图42B以图形方式示出了，在用纳索利单抗(narsoplimab)治疗之前(基线)和之后，对于这项研究选择的6个患者中的CEC/ml计数，方框代表了从第一四分位数到第三四分位数的值，水平线显示了中值，而须线指示了最小值和最大值，如实施例21中所述。
图43以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，6个COVID-19患者的C反应蛋白(CRP)的血清水平(中值；四分位数间距(IQR))，如实施例21中所述。
图44以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，6个COVID-19患者的乳酸脱氢酶(LDH)的血清水平(中值；IQR)，如实施例21中所述。
图45以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，6个COVID-19患者的白细胞介素6(IL-6)的血清水平(中值；四分位数间距(IQR))，如实施例21中所述。
图46以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，6个COVID-19患者的白细胞介素8(IL-8)的血清水平(中值；四分位数间距(IQR))，如实施例21中所述。
图47A显示了自入选以后(即，在用纳索利单抗治疗后)的第5天时，患者#4的CT扫描，其中观察到患者患有严重的间质性肺炎，具有涉及周围和中央区域两者的弥漫性磨玻璃影，尤其是在左肺的下叶中的实变，以及大块双侧肺栓塞，伴随在叶间和节段动脉中的充盈缺损(未显示)，如实施例21中所述。
图47B显示了自入选以后(即，在用纳索利单抗治疗后)的第16天时，患者#4的CT扫描，其中磨玻璃影显著降低，并且实质实变的几乎完全消退，如实施例21中所述。
图48以图形方式示出了，在用纳索利单抗治疗的COVID-19患者中，在基线时以及在纳索利单抗治疗后的不同时间点(在2个剂量后，在4个剂量后)，IL-6的血清水平(pg/mL)，其中方框代表了从第一四分位数到第三四分位数的值，水平线显示了中值，而点显示了所有患者的值，如实施例21中所述。
图49以图形方式示出了，在用纳索利单抗治疗的COVID-19患者中，在基线时以及在纳索利单抗治疗后的不同时间点(在2个剂量后，在4个剂量后)，IL-8的血清水平(pg/mL)，其中方框代表了从第一四分位数到第三四分位数的值，水平线显示了中值，而点显示了所有患者的值，如实施例21中所述。
图50以图形方式示出了，用纳索利单抗治疗的6个COVID-19患者的临床结果，如实施例21中所述。
图51A以图形方式示出了，在纳索利单抗治疗之前和之后的天冬氨酸氨基转移酶(AST)的血清水平(单位/升，U/L)。黑线代表了中值和四分位数间距(IQR)。红线代表了正常水平，而点显示了所有患者的值，如实施例21中所述。
图51B以图形方式示出了，在用纳索利单抗治疗起始之前其基线值可用的四个COVID-19患者中，D-二聚体值的血清水平(ng/ml)。黑色圆圈指示了何时启动类固醇治疗。红线代表了正常水平，如实施例21中所述。
图52A以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，在用纳索利单抗治疗的第七个COVID-19患者(患者#7)中，D-二聚体值的血清水平(ng/ml)，其中用纳索利单抗的给药通过垂直箭头指示，并且其中水平线代表了正常水平，如实施例22中所述。
图52B以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，在具有COVID-19的患者#7中的C反应蛋白(CRP)的血清水平，其中用纳索利单抗的给药通过垂直箭头指示，并且其中水平线代表了正常水平，如实施例22中所述。
图52C以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在纳索利单抗治疗后的不同时间点，在具有COVID-19的患者#7中的天冬氨酸氨基转移酶(AST)的血清水平(单位/升，U/L)，其中用纳索利单抗的给药通过垂直箭头指示，并且其中水平线代表了正常水平，如实施例22中所述。
图52D以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在纳索利单抗治疗后的不同时间点，在具有COVID-19的患者#7中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清水平(单位/升，U/L)，其中用纳索利单抗的给药通过垂直箭头指示，并且其中水平线代表了正常水平，如实施例22中所述。
图52E以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，在具有COVID-19的患者#7中的乳酸脱氢酶(LDH)的血清水平，其中用纳索利单抗的给药通过垂直箭头指示，并且其中水平线代表了正常水平，如实施例22中所述。
图53以图形方式示出了，随着时间过去，患者#7的抗SARS-CoV-2抗体滴度，指示了用纳索利单抗的治疗并不阻碍适应性免疫应答的效应子功能，如实施例22中所述。
图54为实施例19中所述的研究设计示意图。
序列表说明
SEQ ID NO:1人MAp19 cDNA
SEQ ID NO:2人MAp19蛋白(具有前导区)
SEQ ID NO:3人MAp19蛋白(成熟的)
SEQ ID NO:4人MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5人MASP-2蛋白(具有前导区)
SEQ ID NO:6人MASP-2蛋白(成熟的)
SEQ ID NO:7人MASP-2 gDNA(外显子1-6)
抗原：(参考MASP-2成熟蛋白)
SEQ ID NO:8 CUBI序列(aa 1-121)
SEQ ID NO:9 CUBEGF序列(aa 1-166)
SEQ ID NO:10 CUBEGFCUBII(aa 1-293)
SEQ ID NO:11 EGF区(aa 122-166)
SEQ ID NO:12丝氨酸蛋白酶结构域(aa429–671)
SEQ ID NO:13失活的丝氨酸蛋白酶结构域(aa 610-625，具有Ser618至Ala突变)
SEQ ID NO:14 TPLGPKWPEPVFGRL(CUBI肽)
SEQ ID NO:15
TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ(CUBI肽)
SEQ ID NO:16 TFRSDYSN(MBL结合区核心)
SEQ ID NO:17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF(MBL结合区)
SEQ ID NO:18 IDECQVAPG(EGF肽)
SEQ ID NO:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV(丝氨酸蛋白酶结合核心)肽抑制剂：
SEQ ID NO:20 MBL全长cDNA
SEQ ID NO:21 MBL全长蛋白质
SEQ ID NO:22 OGK-X-GP(共有区结合)
SEQ ID NO:23 OGKLG
SEQ ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G
SEQ ID NO:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO
SEQ ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG
SEQ ID NO:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO(人h-纤维胶凝蛋白(ficolin))
SEQ ID NO:28
GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO(人纤维胶凝蛋白p35)
SEQ ID NO:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI(C4切割位点)
表达抑制剂：
SEQ ID NO:30 CUBI-EGF结构域的cDNA(SEQ ID NO:4的核苷酸22-680)
SEQ ID NO:31
5'CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC3'
包括MASP-2翻译起始位点的SEQ ID NO:4的核苷酸12-45(有义)
SEQ ID NO:32
5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'
编码包含MASP-2 MBL结合位点的区域的SEQ ID NO:4的核苷酸361-396(有义)
SEQ ID NO:33
5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'
编码包含CUBII结构域的区域的SEQ ID NO:4的核苷酸610-642
克隆引物：
SEQ ID NO:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC(用于CUB的5'PCR)
SEQ ID NO:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA(用于CUB的3’PCR)
SEQ ID NO:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT(用于CUBIEGF的3’PCR)
SEQ ID NO:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT(用于CUBIEGFCUBII的3’PCR)
SEQ ID NOS:38-47是用于人源化抗体的克隆引物
SEQ ID NO:48是9aa肽
表达载体：
SEQ ID NO:49是MASP-2小基因插入片段
SEQ ID NO:50是鼠MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:51是鼠MASP-2蛋白(w/前导区)
SEQ ID NO:52是成熟的鼠MASP-2蛋白
SEQ ID NO:53大鼠MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:54是大鼠MASP-2蛋白(w/前导区)
SEQ ID NO:55是成熟的大鼠MASP-2蛋白
SEQ ID NO:56-59是用于人MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，其用于产生人MASP-2A
SEQ ID NO:60-63是用于鼠MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，其用于产生鼠MASP-2A
SEQ ID NO:64-65是用于大鼠MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，其用于产生大鼠MASP-2A
SEQ ID NO:66编码17D20_dc35VH21N11VL(OMS646)重链可变区(VH)(不含信号肽)的DNA
SEQ ID NO:6717D20_dc35VH21N11VL(OMS646)重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO:6817N16mc重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO:6917D20_dc35VH21N11VL(OMS646)轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO:70编码17D20_dc35VH21N11VL(OMS646)轻链可变区(VL)的DNA SEQ IDNO:7117N16_dc17N9轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO:72：SGMI-2L(全长)
SEQ ID NO:73：SGMI-2M(中等截短的形式)
SEQ ID NO:74：SGMI-2S(短截短的形式)
SEQ ID NO:75：包含VH-M2ab6-SGMI-2-N和具有铰链突变的人IgG4恒定区的成熟多肽
SEQ ID NO:76：包含VH-M2ab6-SGMI-2-C和具有铰链突变的人IgG4恒定区的成熟多肽
SEQ ID NO:77：包含VL-M2ab6-SGMI-2-N和人Igλ恒定区的成熟多肽
SEQ ID NO:78：包含VL-M2ab6-SGMI-2-C和人Igλ恒定区的成熟多肽
SEQ ID NO:79：肽接头(10aa)
SEQ ID NO:80：肽接头(6aa)
SEQ ID NO:81：肽接头(4aa)
SEQ ID NO:82：编码包含VH-M2ab6-SGMI-2-N和具有铰链突变的人IgG4恒定区的多肽的多核苷酸
SEQ ID NO:83：编码包含VH-M2ab 6-SGMI-2-C和具有铰链突变的人IgG4恒定区的多肽的多核苷酸
SEQ ID NO:84：编码包含VL-M2ab6-SGMI-2-N和人Igλ恒定区的多肽的多核苷酸
SEQ ID NO:85：编码包含VL-M2ab6-SGMI-2-C和人Igλ恒定区的多肽的多核苷酸
详述
本发明基于本发明人的下述令人惊讶的发现：对补体系统的凝集素途径的关键调节剂即甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2(MASP-2)的抑制，显著降低了纤维化疾病的各种动物模型中的炎症和纤维化，所述动物模型包括单侧输尿管梗阻(UUO)模型、蛋白质超负荷模型和阿霉素诱导的肾纤维化肾病模型。因此，发明人已证实了，对MASP-2介导的凝集素途径活化的抑制提供了改善、治疗或预防肾纤维化，例如小管间质性炎症和纤维化的有效治疗方法，而不管潜在原因如何。如本文进一步所述，在患有免疫球蛋白A肾病(IgAN)和膜性肾病(MN)的人受试者中，MASP-2抑制性抗体(OMS646)的使用有效改善肾功能并减少皮质类固醇需求。如本文进一步所述，MASP-2抑制剂的使用还可用于治疗、抑制、减轻或预防由冠状病毒例如SARS-CoV-2感染的受试者的急性呼吸窘迫综合征，并且还可用于治疗、抑制、减轻或预防由流感病毒感染的受试者的急性呼吸窘迫。
I.定义
除非本文具体定义，否则本文使用的所有术语具有与本发明领域的普通技术人员理解相同的含义。提供下述定义，以便提供关于术语在说明书和权利要求中用于描述本发明时的明确性。
如本文使用的，术语“MASP-2依赖性补体活化”包含凝集素途径的MASP-2依赖性活化，其在生理条件下(即，在Ca++的存在下)发生，导致凝集素途径C3转化酶C4b2a的形成，并且在C3切割产物C3b的积累后，随后导致C5转化酶C4b2a(C3b)n的形成，所述C4b2a(C3b)n已被确定为主要引起调理作用。
如本文使用的，术语“替代途径”指例如通过以下触发的补体活化：来自真菌和酵母细胞壁的酵母聚糖，来自革兰氏阴性外膜的脂多糖(LPS)和兔红细胞，以及来自许多纯多糖、兔红细胞、病毒、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和损害细胞，并且其在传统上已被认为起于C3b自补体因子C3的自发蛋白酶解生成。
如本文使用的，术语“凝集素途径”指经由血清和非血清碳水化合物结合蛋白的特异性结合而发生的补体活化，所述非血清碳水化合物结合蛋白包括甘露聚糖结合凝集素(MBL)、CL-11和纤维胶凝蛋白(H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)。
如本文使用的，术语“经典途径”指这样的补体活化，其通过与外来颗粒结合的抗体触发，并且需要识别分子C1q的结合。
如本文使用的，术语“MASP-2抑制剂”指与MASP-2结合或直接相互作用，并且有效抑制MASP-2依赖性补体活化的任何试剂，包括抗MASP-2抗体及其MASP-2结合片段、天然和合成肽、小分子、可溶性MASP-2受体、表达抑制剂和分离的天然抑制剂，并且还包括与MASP-2竞争结合凝集素途径中的另一种识别分子(例如MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)的肽，但不包括与此类其它识别分子结合的抗体。可用于本发明的方法中的MASP-2抑制剂可以使MASP-2依赖性补体活化降低大于20％，例如大于50％，例如大于90％。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂使MASP-2依赖性补体活化降低大于90％(即，导致仅10％或更少的MASP-2补体活化)。
如本文使用的，术语“纤维化”指器官或组织中的过量结缔组织的形成或存在。纤维化可能作为对刺激(如组织损伤或炎症)的修复或替换应答而发生。纤维化的标志是过度细胞外基质的产生。对损伤的正常生理应答导致作为愈合过程的部分的结缔组织沉积，但这种结缔组织沉积可能持续并变得病理性，改变组织的体系结构和功能。在细胞水平下，上皮细胞和成纤维细胞增殖并分化为成肌纤维细胞，导致基质收缩、刚性增加、微血管压缩和缺氧。
如本文使用的，术语“治疗患有或处于发展由纤维化和/或炎症引起或者因其加剧的疾病或病症的风险中的哺乳动物受试者的纤维化”，指逆转、减轻、改善或抑制所述哺乳动物受试者的纤维化。
如本文使用的，术语“蛋白尿”指以异常量的尿蛋白的存在，例如在来自人受试者的24小时尿收集中超过0.3g蛋白质的量，或在人受试者中多于1g/升的浓度。
如本文使用的，术语“改善蛋白尿”或“降低蛋白尿”指与在用MASP-2抑制剂治疗之前受试者的基线24小时尿蛋白排泄相比，使患有蛋白尿的受试者的24小时尿蛋白排泄降低至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％或更多。在一个实施方案中，根据本发明的方法用MASP-2抑制剂的治疗有效降低人受试者的蛋白尿，以便实现24小时尿蛋白排泄的大于20百分比降低，或例如24小时尿蛋白排泄的大于30百分比降低，或例如24小时尿蛋白排泄的大于40百分比降低，或例如24小时尿蛋白排泄的大于50百分比降低)。
如本文使用的，术语“小分子”、“有机小分子”和“无机小分子”分别指这样的分子(有机、有机金属或无机)、有机分子和无机分子，其是天然存在的或合成的，并且具有大于约50Da且小于约2500Da的分子量。小有机(例如)分子可以小于约2000Da、在约100Da至约1000Da之间、或在约100至约600Da之间、或在约200至500Da之间。
如本文使用的，术语“抗体”包括这样的抗体及其抗体片段，其衍生自任何产生抗体的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔和灵长类动物包括人)，或者杂交瘤、噬菌体选择、重组表达或转基因动物(或产生抗体或抗体片段的其它方法)，并且特异性结合靶多肽，例如MASP-2、多肽或其一部分。并不预期术语“抗体”在抗体的来源、或它在其中制备的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物、肽合成等)方面受到限制。示例性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体；泛特异性、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体)；人源化抗体；鼠抗体；嵌合的、小鼠-人、小鼠-灵长类动物、灵长类动物-人单克隆抗体；以及抗独特型抗体，并且可以是任何完整的抗体或其片段。如本文使用的，术语“抗体”不仅包括完整的多克隆抗体或单克隆抗体，还包括其片段(例如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其合成变体、天然存在的变体、包含具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体以及免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型，所述免疫球蛋白分子包含具有所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)。
“单克隆抗体”指同质的抗体群体，其中所述单克隆抗体包含涉及表位的选择性结合的氨基酸(天然存在和非天然存在的)。单克隆抗体对于靶抗原是高度特异性的。术语“单克隆抗体”不仅包含完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，还包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其变体、包含抗原结合部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体以及免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型，所述免疫球蛋白分子包含具有所需特异性和结合表位的能力的抗原结合片段(表位识别位点)。它并不预期在抗体的来源、或它在其中制备的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)方面受到限制。该术语包括完整的免疫球蛋白，以及上文在“抗体”的定义下描述的片段等。
如本文使用的，术语“抗体片段”指衍生自全长抗体或与全长抗体有关的一部分，所述全长抗体如抗MASP-2抗体，一般包括其抗原结合区域或可变区。抗体片段的说明性实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文使用的，“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，这使得scFv能够形成对于抗原结合所需的结构。
如本文使用的，“嵌合抗体”是重组蛋白质，其含有衍生自非人物种(例如啮齿类动物)抗体的可变结构域和互补决定区，而抗体分子的剩余部分衍生自人抗体。
如本文使用的，“人源化抗体”是嵌合抗体，其包含与衍生自非人免疫球蛋白的特异性互补决定区一致的最小序列，所述非互补免疫球蛋白被移植到人抗体构架内。人源化抗体通常是重组蛋白质，其中仅抗体互补决定区具有非人来源。
如本文使用的，术语“甘露聚糖结合凝集素”("MBL")等价于甘露聚糖结合蛋白("MBP")。
如本文使用的，“膜攻击复合物”("MAC")指插入膜内，并破坏膜的末端五种补体组分(与C6、C7、C8和C-9组合的C5b)(也称为C5b-9)的复合物。
如本文使用的，“受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬、猫、马、绵羊、山羊、牛、兔、猪和啮齿类动物。
如本文使用的，氨基酸残基如下缩写：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
在最广泛的意义上，天然存在的氨基酸可以基于各自氨基酸的侧链的化学特征分成各组。“疏水性”氨基酸意指Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或Pro。“亲水性”氨基酸意指Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His。氨基酸的这种分组可以进一步如下再分类。“非荷电的亲水性”氨基酸意指Ser、Thr、Asn或Gln。“酸性”氨基酸意指Glu或Asp。“碱性”氨基酸意指Lys、Arg或His。
如本文使用的，术语“保守氨基酸取代”通过下述各组内的氨基酸的取代来示出：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
如本文使用的，术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物。该术语还涵盖由天然存在的核苷酸、糖和共价核苷间(主链)键组成的寡聚核酸碱基(oligonucleobase)，以及具有非天然存在的修饰的寡核苷酸。
如本文使用的，“表位”指蛋白质(例如人MASP-2蛋白)上由抗体结合的位点。“重叠表位”包括至少一个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)共同的氨基酸残基，包括线性表位和非线性表位。
如本文使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且意指任何肽连接的氨基酸链，不管长度或翻译后修饰如何。本文所述的MASP-2蛋白可以含有或可以是野生型蛋白，或者可以是具有不多于50个(例如不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50个)保守氨基酸取代的变体。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。
在一些实施方案中，人MASP-2蛋白可以具有与人MASP-2蛋白等于或大于70(例如，71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)％同一性的氨基酸序列，所述人MASP-2蛋白具有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，肽片段可以是长度至少6个(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500或600个或更多个)氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:5的至少6个邻接氨基酸残基)。在一些实施方案中，人MASP-2蛋白的抗原性肽片段长度小于500个(例如，小于450、400、350、325、300、275、250、225、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6个)氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:5中任一个中小于500个邻接氨基酸残基)。
氨基酸序列同一性的百分比(％)定义为：在将序列比对并在必要时引入空位，以实现最大序列同一性百分比后，候选序列中与参考序列中的氨基酸相同的氨基酸百分比。用于确定序列同一性百分比目的的比对，可以以在本领域技术内的各种方式来实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过已知方法来确定用于测量比对的适当参数，包括在待比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
II.发明概述
如本文所述，发明人已鉴定了凝集素途径在肾小管肾病理状况的启动和疾病进展中的中心作用，从而暗示了凝集素途径活化在不同范围的肾疾病的病理生理学中的关键作用，所述肾疾病包括IgA肾病、C3肾小球病和其它肾小球肾炎。如本文进一步所述，发明人发现，对补体系统的凝集素途径的关键调节剂即甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2(MASP-2)的抑制，显著降低了纤维化疾病的各种动物模型中的炎症和纤维化，所述动物模型包括单侧输尿管梗阻(UUO)模型、蛋白质超负荷模型和阿霉素诱导的肾纤维化肾病模型。因此，发明人已证实了，对MASP-2介导的凝集素途径活化的抑制提供了改善、治疗或预防肾纤维化，例如小管间质性纤维化的有效治疗方法，而不管潜在原因如何。如本文进一步所述，MASP-2抑制剂的使用还可用于治疗、抑制、减轻或预防由冠状病毒例如SARS-CoV-2感染的受试者的急性呼吸窘迫综合征。
凝集素(MBL、M-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和CL-11)是触发先天性补体系统的特异性识别分子，并且该系统包括凝集素启动途径和相关的末端途径扩增环，其扩大了凝集素启动的末端补体效应分子的活化。C1q是触发获得性补体系统的特异性识别分子，并且该系统包括经典启动途径和相关的末端途径扩增环，其扩大了C1q启动的末端补体效应分子的活化。我们将这两个主要的补体活化系统分别称为凝集素依赖性补体系统和C1q依赖性补体系统。
除其在免疫防御中的必要作用之外，补体系统还在许多临床状况下促成组织损伤。因此，迫切需要开发治疗有效的补体抑制剂，以预防这些不良作用。认识到能够抑制凝集素介导的MASP-2途径，同时使经典途径保持原样，从而意识到高度期望仅特异性抑制引起特定病理状况的补体活化系统，而不完全关闭补体的免疫防御能力。例如，在其中补体活化占优势地由凝集素依赖性补体系统介导的疾病状态中，仅特异性抑制该系统将是有利的。这使C1q依赖性补体活化系统保持原样，以处理免疫复合物加工，并帮助针对感染的宿主防御。
在治疗剂的开发中靶向以特异性抑制凝集素依赖性补体系统的优选蛋白质组分是MASP-2。在凝集素依赖性补体系统的所有已知蛋白质组分中(MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白、MASP-2、C2-C9、因子B、因子D和备解素)，仅MASP-2既是凝集素依赖性补体系统所独有的，也是该系统发挥功能所必需的。凝集素(MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和CL-11)也是凝集素依赖性补体系统中的独特组分。然而，由于凝集素冗余性，任何一种凝集素组分的丧失并不一定抑制系统的活化。有必要抑制所有五种凝集素，以便保证凝集素依赖性补体活化系统的抑制。此外，由于还已知MBL和纤维蛋白具有不依赖于补体的调理活性，因此凝集素功能的抑制将导致针对感染的这种有益的宿主防御机制的丧失。相比之下，如果MASP-2是抑制靶，则这种补体不依赖性凝集素调理活性将保持完整。MASP-2作为抑制凝集素依赖性补体活化系统的治疗靶的附加益处在于，MASP-2的血浆浓度是任何补体蛋白中最低的(≈500ng/ml)；因此，相应地低浓度的MASP-2的高亲和力抑制剂可能足以获得完全抑制(Moller-Kristensen，M.等人，J.ImmunolMethods 282:159-167，2003)。
如本文实施例14中所述，在纤维化肾脏疾病(单侧输尿管梗阻UUO)的动物模型中确定，与野生型对照动物相比，不含MASP-2基因(MASP-2-/-)的小鼠显示出明显更少的肾脏疾病，如通过炎症细胞浸润(75％降低)和纤维化的组织学标记物如胶原沉积(三分之一降低)所示。如实施例15中进一步所示，与用同种型对照抗体治疗的野生型小鼠相比，用抗MASP-2单克隆抗体系统治疗的野生型小鼠被保护免受肾纤维化，所述MASP-2单克隆抗体选择性地阻断凝集素途径，同时使经典途径保持原样。这些结果证实了凝集素途径是肾脏疾病的关键贡献者，并且进一步证实了阻断凝集素途径的MASP-2抑制剂(例如MASP-2抗体)作为抗纤维化剂是有效的。如实施例16中进一步所示，在蛋白质超负荷模型中，用牛血清白蛋白(BSA)治疗的野生型小鼠发展蛋白尿性肾病，而用相同水平的BSA治疗的MASP-2-/-小鼠具有降低的肾损伤。如实施例17中所示，在蛋白质超负荷模型中，用抗MASP-2单克隆抗体系统治疗的野生型小鼠被保护免受肾损伤，所述MASP-2单克隆抗体选择性地阻断凝集素途径，同时使经典途径保持原样。如实施例18中所述，与野生型小鼠相比，在阿霉素诱导的肾纤维化肾病模型中，MASP-2-/-小鼠显示出较少的肾炎症和小管间质性损伤。如实施例19中所述，在正在进行的2期开放标签肾试验中，用抗MASP-2抗体治疗的IgA肾病患者证实了试验自始至终，临床上有意义和统计上显著的尿白蛋白/肌酐比(uACR)减少，以及从基线到治疗结束在24小时尿蛋白水平的降低。如实施例19中进一步所述，在相同的2期肾试验中，用抗MASP-2抗体治疗的膜性肾病患者也证实了在治疗期间的uACR降低。
根据前述内容，本发明涉及MASP-2抑制剂例如MASP-2抑制性抗体作为抗纤维化剂的用途，MASP-2抑制剂用于制造用于治疗纤维化状况的药剂的用途，以及预防、治疗、减轻或逆转有此需要的人受试者的纤维化状况的方法，所述方法包括将有效量的MASP-2抑制剂(例如，抗MASP-2抗体)施用于所述患者。如实施例20、21和22中所述，在用纳索利单抗治疗之后，在患有COVID-19有关的呼吸衰竭的患者中观察到临床改善，所述纳索利单抗抑制MASP-2和凝集素途径活化。如实施例21中所述，用纳索利单抗治疗的所有6个COVID-19患者都证实了临床改善。在每种情况下，COVID-19肺损伤在纳索利单抗治疗之前已进展为ARDS，并且所有患者在治疗启动时都接受非侵入性机械通气。其随访(5-6个月)数据可获得的纳索利单抗治疗的COVID-19患者，并未显示观察到的长期后遗症的临床或实验室证据。如实施例22中进一步所述，用纳索利单抗治疗的另外的COVID-19患者也证实了临床改善。与第一个队列相似，在本文所述的用纳索利单抗治疗的这些另外COVID-19患者的任一者中，并未观察到长期后遗症。如实施例22中进一步证实的，纳索利单抗治疗的患者发生适当地高滴度的抗SARS-Cov-2抗体，指示了用纳索利单抗的治疗并不阻碍适应性免疫应答的效应子功能。
相应地，本发明的方法可以用于治疗、抑制、减轻、预防或逆转人受试者的冠状病毒诱导的肺炎或急性呼吸窘迫综合征，所述人受试者患有冠状病毒，例如患有由于SARS-CoV-2、SARS或MERS的COVID-19，如本文进一步所述。本发明的方法还可以用于治疗、抑制、减轻、预防或逆转人受试者的流感病毒诱导的肺炎或急性呼吸窘迫综合征，所述人受试者患有流感病毒，例如甲型流感病毒血清型(H1N1(引起1918年的“西班牙流感”和2009年的“猪流感”)；H2N2(引起1957年的“亚洲流感”)、H3N2(引起1968年在中国香港地区出现的“流感”)、H5N1(引起2004年的“禽流感”)、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9和H6N1)；或乙型流感病毒或丙型流感病毒。
III.MASP-2在由纤维化引起或加剧的疾病和状况中的作用
纤维化是通常响应损害或损伤，在器官或组织中的过度结缔组织形成或存在。纤维化的标志是在损伤之后过度细胞外基质的产生。在肾脏中，纤维化表征为在肾实质上的进行性有害的结缔组织沉积，其不可避免地导致肾功能下降，而不依赖于引起原始肾脏损伤的原发性肾疾病。所谓的上皮间充质转化(EMT)，其中肾小管上皮细胞转化为间充质成纤维细胞的细胞特征的变化，构成肾纤维化的首要机制。纤维化影响几乎所有组织和器官系统，并且可能作为对刺激(如组织损伤或炎症)的修复或替换应答而发生。对损伤的正常生理应答导致结缔组织的沉积，但如果这个过程变成病理性的，则高度分化的细胞通过瘢痕形成性结缔组织的替换改变组织的体系结构和功能。在细胞水平下，上皮细胞和成纤维细胞增殖并分化为成肌纤维细胞，导致基质收缩、刚性增加、微血管压缩和缺氧。目前不存在用于纤维化的有效治疗或治疗剂，但动物研究和传闻性人报告两者均提示了，纤维化组织损伤可以被逆转(Tampe和Zeisberg，Nat Rev Nephrol，第10卷:226-237，2014)。
许多疾病导致引起进行性器官衰竭的纤维化，包括以下的疾病：肾脏(例如，慢性肾脏疾病、IgA肾病、C3肾小球病和其它肾小球肾炎)、肺(例如，特发性肺纤维化、囊性纤维化、支气管扩张)、肝(例如，肝硬化、非酒精性脂肪肝病)、心脏(例如，心肌梗塞、心房纤维化、瓣膜纤维化、心内膜纤维化)、大脑(例如，中风)、皮肤(例如，过度伤口愈合、硬皮病、系统性硬化、瘢痕疙瘩)、血管系统(例如，动脉粥样硬化性血管疾病)、肠道(例如，克罗恩氏病)、眼(例如，前囊下白内障、后囊混浊)、肌肉骨骼的软组织结构(例如，粘连性关节囊炎、迪皮特朗氏挛缩(Dupuytren’s contracture)、骨髓纤维化)、生殖器官(例如，子宫内膜异位症、佩罗尼氏病)、以及某些传染病(例如，冠状病毒、α病毒、丙型肝炎、乙型肝炎等)。
尽管纤维化在许多组织和疾病中发生，但存在其病理状况的共同分子机制和细胞机制。通过成纤维细胞的细胞外基质沉积伴随着免疫细胞浸润，占优势地为单核细胞(参见Wynn T.，Nat Rev Immunol4(8):583-594，2004，在此引入本文作为参考)。稳固的炎症应答导致以下的表达：生长因子(TGF-β、VEGF、肝细胞生长因子、结缔组织生长因子)、细胞因子和激素(内皮素、IL-4、IL-6、IL-13、趋化因子)、降解酶(弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶、组织蛋白酶)和细胞外基质蛋白(胶原、纤连蛋白、整联蛋白)。
另外，补体系统在众多纤维化疾病中变得活化。补体组分，包括膜攻击复合物，已在众多纤维化组织样本中得到鉴定。例如，凝集素途径的组分已在以下的纤维化病变中发现：肾脏疾病(Satomura等人，Nephron.92(3):702-4(2002)；Sato等人，Lupus20(13):1378-86(2011)；Liu等人，Clin Exp Immunol，174(1):152-60(2013))；肝疾病(Rensen等人，Hepatology 50(6):1809-17(2009))；以及肺疾病(Olesen等人，Clin Immunol 121(3):324-31(2006))。
超调补体活化已被确定为免疫复合物介导的以及抗体非依赖性肾小球肾炎的关键贡献者。然而，存在强有力的证据链，其证实了原位不受控制的补体活化在本质上涉及非肾小球疾病中的TI纤维化的病理生理进展(Quigg R.J，J Immunol171:3319-3324，2003，NaikA.等人，Semin Nephrol 33:575-585，2013，Mathern D.R.等人，Clin J Am SocNephrol 10:P1636-1650，2015)。由局部补体活化触发的强促炎信号可以通过以下启动：过滤到近端小管内并随后进入间质间隙的补体组分，或者补体组分通过肾小管或其它常驻和浸润细胞的异常合成，或者肾脏细胞上的补体调节蛋白的异常表达，或者补体调控组分中的功能突变的不存在或丧失或获得(Mathern D.R.等人，ClinJ Am SocNephrol 10:P1636-1650，2015，SheerinN.S.等人，FASEBJ22:1065-1072，2008)。例如，在小鼠中，补体调节蛋白CR1相关基因/蛋白y(Crry)的缺陷，导致小管间质性(TI)补体活化，伴随人TI疾病中可见的后续炎症和损伤典型的纤维化(NaikA.等人，SeminNephrol 33:575-585，2013，Bao L.等人，J Am SocNephrol18:811-822，2007)。肾小管上皮细胞暴露于过敏毒素C3a导致上皮间充质转化(Tsang Z.等人，J Am SocNephrol 20:593-603，2009)。经由单独的C3a受体阻断C3a信号传导最近已显示减轻蛋白尿和非蛋白尿动物的肾TI纤维化(Tsang Z.等人，J AmSoc Nephrol 20:593-603，2009，Bao L.等人，KidneyInt.80:524-534，2011)。
如本文所述，发明人已鉴定了凝集素途径在肾小管肾病理状况的启动和疾病进展中的中心作用，从而暗示了凝集素途径活化在不同范围的肾疾病的病理生理学中的关键作用，所述肾疾病包括IgA肾病、C3肾小球病和其它肾小球肾炎(Endo M.等人，NephrolDialysis Transplant 13:1984-1990，1998；Hisano S.等人，Am J Kidney Dis 45:295-302，2005；Roos A.等人，J Am Soc Nephrol 17:1724-1734，2006；Liu L.L.等人，ClinExp.Immunol 174:152-160，2013；Lhotta K.等人，Nephrol Dialysis Transplant 14:881-886，1999；Pickering等人，Kidney International 84:1079-1089，2013)、糖尿病性肾病(Hovind P.等人，Diabetes 54:1523-1527，2005)、缺血性再灌注损伤(Asgari E.等人，FASEB J 28:3996-4003，2014)和移植排斥(Berger S.P.等人，Am J Transplant 5:1361-1366，2005)。
如本文进一步所述，发明人已证实了MASP-2抑制降低了小管间质性疾病的小鼠模型中的炎症和纤维化。因此，预计MASP-2抑制剂可用于治疗肾纤维化，包括小管间质性炎症和纤维化、蛋白尿、IgA肾病、C3肾小球病和其它肾小球肾炎和肾缺血再灌注损伤。
肺疾病
肺纤维化是肺中的过度纤维结缔组织的形成或发展，其中正常的肺组织被纤维化组织替换。这种瘢痕形成导致肺僵硬，并且损伤肺部结构和功能。在人中，肺纤维化被认为起因于对肺中的微小气囊(肺泡)内和之间的组织的反复损伤。在实验设置下，各种动物模型已复制了人疾病的各个方面。例如，可以将外来试剂如博来霉素、异硫氰酸荧光素、二氧化硅或石棉滴注到动物的气管内(Gharaee-Kermani等人，Animal Models of PulmonaryFibrosis.Methods Mol.Med.，2005，117:251-259)。
相应地，在某些实施方案中，本公开内容提供了抑制患有肺疾病或病症的受试者的肺纤维化的方法，所述肺疾病或病症由纤维化和/或炎症引起或者因纤维化和/或炎症而加剧，例如冠状病毒诱导的ARDS，该方法包括将MASP-2抑制剂，例如MASP-2抑制性抗体施用于有此需要的受试者。该方法包括施用包含有效抑制肺纤维化、减少肺纤维化和/或改善肺功能的量的MASP-2抑制剂的组合物。肺功能的症状的改善包括肺功能和/或容量的改善、疲劳的减少以及氧饱和度的改善。
MASP-2抑制性组合物可以局部施用于纤维化的区域，例如在手术或局部注射期间，通过直接或远程(例如通过导管)局部施加该组合物。可替代地，可以将MASP-2抑制剂全身性地施用于受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它肠胃外施用，或潜在地通过关于非肽能试剂的经口施用。施用可以如通过医生确定的进行重复，直到状况已消退或得到控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)，与对于潜在的肺疾病或状况适当的一种或多种试剂或治疗模式组合进行施用。
传染病
传染病如冠状病毒以及慢性传染病如丙型肝炎和乙型肝炎引起组织炎症和纤维化，并且高凝集素途径活性可能是有害的。在此类疾病中，MASP-2的抑制剂可能是有益的。例如，发现MBL和MASP-1水平是丙型肝炎病毒(HCV)感染中的肝纤维化严重性的重要预测物(Brown等人，Clin Exp Immunol.147(1):90-8，2007；Saadanay等人，Arab JGastroenterol.12(2):68-73，2011；Saeed等人，Clin Exp Immunol.174(2):265-73，2013)。MASP-1先前已显示为MASP-2和凝集素途径的有力活化剂(Megyeri等人，J BiolChem.29:288(13):8922-34，2013)。α病毒如基孔肯雅病毒和罗斯河病毒诱导强宿主炎症应答，导致关节炎和肌炎，并且这种病理状况由MBL和凝集素途径介导(Gunn等人，PLoSPathog.8(3):e1002586，2012)。
相应地，在某些实施方案中，本公开内容提供了预防、治疗、逆转、抑制和/或降低受试者的纤维化和/或炎症的方法，所述受试者患有或先前已患有引起炎症和/或纤维化的传染病，例如冠状病毒或流感病毒，该方法包括将MASP-2抑制剂，例如MASP-2抑制性抗体施用于有此需要的受试者。
MASP-2抑制性组合物可以局部施用于纤维化的区域，例如在手术或局部注射期间，通过直接或远程(例如通过导管)局部施加该组合物。可替代地，可以将MASP-2抑制剂全身性地施用于受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它肠胃外施用，或潜在地通过关于非肽能试剂的经口施用。施用可以如通过医生确定的进行重复，直到状况已消退或得到控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)，与对于潜在的传染病适当的一种或多种试剂或治疗模式组合进行施用。例如，在一些实施方案中，可以用包括一种或多种MASP-2抑制剂的试剂组合来治疗诊断有COVID-19的患者，所述试剂组合例如包含抗病毒剂(例如瑞德西韦)和一种或多种MASP-2抑制剂的组合。试剂可以以任何合适的顺序，例如序贯地或同时地施用。
在一些实施方案中，引起炎症和/或纤维化的传染病选自冠状病毒、α病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、结核病、HIV和流感。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体或MASP-2抑制性小分子化合物)，与对于潜在的疾病或病症适当的一种或多种试剂或治疗模式组合进行施用。
在本文描述的各种方法和药物组合物的任一种的某些实施方案中，MASP-2抑制性抗体或小分子化合物选择性地阻断凝集素途径，同时使经典途径保持原样。
IV.MASP-2抑制剂
在各个方面，本发明提供了抑制纤维化和/或炎症的不良作用的方法，其包括将MASP-2抑制剂施用于有此需要的受试者。MASP-2抑制剂以有效抑制活受试者的MASP-2依赖性补体活化的量进行施用。在本发明的这个方面的实践中，代表性的MASP-2抑制剂包括：抑制MASP-2的生物活性的分子(例如小分子抑制剂、抗MASP-2抗体(例如，MASP-2抑制性抗体)、或者与MASP-2相互作用或干扰蛋白质-蛋白质相互作用的阻断肽)、以及减少MASP-2表达的分子(例如MASP-2反义核酸分子、MASP-2特异性RNAi分子和MASP-2核酶)，从而阻止MASP-2活化凝集素补体途径。MASP-2抑制剂可以单独用作主要疗法，或与其它治疗剂组合用作辅助疗法，以增强其它医学治疗的治疗益处。
对MASP-2依赖性补体活化的抑制的特征在于，补体系统组分的下述变化中的至少一种，所述变化由于根据本发明的方法施用MASP-2抑制剂而发生：MASP-2依赖性补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9(MAC)的生成或产生的抑制(例如，如实施例2中所述测量的)、C4切割和C4b沉积的降低(例如，如实施例2中所述测量的)、或者C3切割和C3b沉积的降低(例如，如实施例2中所述测量的)。
根据本发明，利用了MASP-2抑制剂，其有效抑制由冠状病毒如SARS-CoV-2感染的受试者的呼吸窘迫(或换言之，改善呼吸功能)。
呼吸功能的评价可以定期例如每小时、每天、每周或每月进行。这种评价优选地对于给定受试者在几个时间点进行，或者对于给定受试者和健康对照在一个或几个时间点进行。评价可以以规律的时间间隔例如每小时、每天、每周或每月进行。当一项评价已导致呼吸窘迫减少(即，呼吸功能增加)的发现时，MASP-2抑制剂例如MASP-2抑制性抗体，被说成有效治疗患有冠状病毒诱导的急性呼吸窘迫综合征的受试者。
可用于本发明的这个方面的实践中的MASP-2抑制剂包括例如MASP-2抗体及其片段、MASP-2抑制性肽、小分子、MASP-2可溶性受体和表达抑制剂。MASP-2抑制剂可以通过阻断MASP-2的生物学功能，来抑制MASP-2依赖性补体活化系统。例如，抑制剂可以有效地阻断MASP-2蛋白质-蛋白质相互作用，干扰MASP-2二聚化或组装，阻断Ca2+结合，干扰MASP-2丝氨酸蛋白酶活性位点，或可能降低MASP-2蛋白表达。
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂选择性地抑制MASP-2补体活化，使C1q依赖性补体活化系统在功能上保持原样。
在一个实施方案中，可用于本发明的方法中的MASP-2抑制剂是与包含SEQ ID NO:6的多肽特异性结合的特异性MASP-2抑制剂，其亲和力是与补体系统中的其它抗原的至少十倍。在另一个实施方案中，MASP-2抑制剂与包含SEQ ID NO:6的多肽特异性结合，其亲和力是与补体系统中的其它抗原的至少100倍。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂与以下中的至少一种特异性结合：(i)CCP1-CCP2结构域(SEQ ID NO:6的aa 300-431)或MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:6的aa445-682)，并且抑制MASP-2依赖性补体活化。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是与MASP-2特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。MASP-2抑制剂的结合亲和力可以使用合适的结合测定进行确定。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂抑制90％人血清中的C3b沉积，其IC50为30nM或更小。
MASP-2多肽显示出类似于MASP-1、MASP-3、以及C1r和C1s(C1补体系统的蛋白酶)的分子结构。SEQ ID NO:4中所示的cDNA分子编码MASP-2的代表性实例(由SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列组成)，并且提供了具有前导序列(aa 1-15)的人MASP-2多肽，所述前导序列在分泌后被切割，导致成熟形式的人MASP-2(SEQ ID NO:6)。如图2中所示，人MASP 2基因包含十二个外显子。人MASP-2 cDNA由外显子B、C、D、F、G、H、I、J、K和L编码。可变剪接导致20 kDa蛋白，称为MBL相关蛋白19("MAp19"，也称为"sMAP")(SEQ ID NO:2)，由(SEQ ID NO:1)编码，起于外显子B、C、D和E，如图2中所示。SEQ ID NO:50中所示的cDNA分子编码鼠MASP-2(由SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列组成)，并且提供了具有前导序列的鼠MASP-2多肽，所述前导序列在分泌后被切割，导致成熟形式的鼠MASP-2(SEQ ID NO:52)。SEQ ID NO:53中所示的cDNA分子编码大鼠MASP-2(由SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列组成)，并且提供了具有前导序列的大鼠MASP-2多肽，所述前导序列在分泌后被切割，导致成熟形式的大鼠MASP-2(SEQ ID NO:55)。
本领域技术人员将认识到，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53中公开的序列分别代表人、鼠和大鼠MASP-2的单个等位基因，并且预计发生等位基因变异和可变剪接。SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53中所示的核苷酸序列的等位基因变体，包括含有沉默突变的等位基因变体、以及其中突变导致氨基酸序列变化的等位基因变体，在本发明的范围内。MASP-2序列的等位基因变体可以根据标准程序，通过探测来自不同个体的cDNA或基因组文库进行克隆。
人MASP-2蛋白(SEQ ID NO:6)的结构域显示于图1和2A中，并且包括N末端C1r/C1s/海胆Vegf/骨形态发生蛋白(CUBI)结构域(SEQ ID NO:6的aa 1-121)、表皮生长因子样结构域(aa 122-166)、第二CUBI结构域(aa 167-293)、以及串联的补体控制蛋白结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。MASP 2基因的可变剪接导致图1中所示的MAp19。MAp19是非酶促蛋白，其含有MASP-2的N末端CUBI-EGF区域，伴随衍生自外显子E的四个另外残基(EQSL)，如图1中所示。
几种蛋白质已显示通过蛋白质-蛋白质相互作用与MASP-2结合或相互作用。例如，已知MASP-2与凝集素蛋白MBL、H-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白结合，并且与之形成Ca2+依赖性复合物。每种MASP-2/凝集素复合物已显示了，通过蛋白质C4和C2的MASP-2依赖性切割来活化补体(Ikeda，K.等人，J.Biol.Chem.262:7451-7454，1987；Matsushita，M.等人，J.Exp.Med.176:1497-2284，2000；Matsushita，M.等人，J.Immunol.168:3502-3506，2002)。研究已显示了，MASP-2的CUBI-EGF结构域对于MASP-2与MBL的结合是必要的(Thielens，N.M.等人，J.Immunol.166:5068，2001)。还已显示了CUBIEGFCUBII结构域介导MASP-2的二聚化，其为活性MBL复合物形成所必需的(Wallis，R.等人，J.Biol.Chem.275:30962-30969，2000)。因此，可以鉴定MASP-2抑制剂，其结合或干扰已知对于MASP-2依赖性补体活化重要的MASP-2靶区域。
抗MASP-2抗体
在本发明的这个方面的一些实施方案中，MASP-2抑制剂包含抑制MASP-2依赖性补体活化系统的抗MASP-2抗体。可用于本发明的这个方面中的抗MASP-2抗体包括衍生自任何产生抗体的哺乳动物的多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体，并且可以是多特异性的、嵌合的、人源化的、抗独特型的和抗体片段。抗体片段包括如本文进一步所述的Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv片段、scFv片段和单链抗体。
使用本文所述的测定，可以就抑制MASP-2依赖性补体活化系统的能力和抗纤维化活性、和/或抑制与蛋白尿或阿霉素诱导的肾病相关的肾损害的能力，来筛选MASP-2抗体。几种MASP-2抗体已在文献中进行描述，并且一些已是新近生成的，其中一些在下表1中列出。例如，如本文的实施例10和11中所述，已鉴定了阻断MASP-2依赖性补体活化的抗MASP-2Fab2抗体。如实施例12中所述以及在此引入本文作为参考的WO2012/151481中所述，已鉴定了阻断MASP-2依赖性补体活化的全人MASP-2 scFv抗体(例如，OMS646)。如实施例13中所述以及在此引入本文作为参考的WO2014/144542中所述，通过将SGMI-2肽氨基酸序列(SEQ IDNO:72、73或74)融合到人MASP-2抗体(例如，OMS646-SGMI-2)的重链和/或轻链的氨基或羧基末端上，来生成具有MASP-2抑制活性的荷有SGMI-2肽的MASP-2抗体及其片段。
相应地，在一个实施方案中，用于本发明的方法中的MASP-2抑制剂包含人抗体，例如OMS646。相应地，在一个实施方案中，用于本发明的组合物和方法中的MASP-2抑制剂包含人抗体，其结合由人MASP-2(SEQ ID NO:6)组成的多肽，其中所述抗体包括：(I)(a)重链可变区，其包含：i)包含来自SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1；和ii)包含来自SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2；和iii)包含来自SEQ ID NO:67的95-107的氨基酸序列的重链CDR-H3，以及b)轻链可变区，其包含：i)包含来自SEQ ID NO:69的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1；和ii)包含来自SEQ ID NO:69的50-56的氨基酸序列的轻链CDR-L2；和iii)包含来自SEQ ID NO:69的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3，或(II)其变体，其包含与SEQ ID NO:67具有90％的同一性(例如，与SEQ ID NO:67具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性)的重链可变区，以及与SEQ ID NO:69具有90％的同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性)的轻链可变区。
在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用包含一定量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述MASP-2抑制性抗体包括包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的重链可变区、以及包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用包含MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述MASP-2抑制性抗体特异性识别人MASP-2上由参考抗体OMS646识别的表位的至少一部分，所述参考抗体OMS646包含如SEQ ID NO:67中所示的重链可变区和如SEQ ID NO:69中所示的轻链可变区。在一个实施方案中，用于本发明的方法中的MASP-2抑制剂包含人抗体OMS646。
表1：示例性的MASP-2特异性抗体
具有降低的效应子功能的抗MASP-2抗体
在本发明的这个方面的一些实施方案中，抗MASP-2抗体具有降低的效应子功能，以便降低可能起于经典补体途径的活化的炎症。IgG分子触发经典补体途径的能力已显示位于分子的Fc部分内(Duncan，A.R.等人，Nature 332:738-7401988)。已通过酶促切割去除分子的Fc部分的IgG分子缺乏这种效应子功能(参见Harlow，Antibodies:A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1988)。相应地，通过具有使效应子功能降到最低的遗传改造的Fc序列、或者具有人IgG2或IgG4同种型，由于缺少分子的Fc部分而生成具有降低的效应子功能的抗体。
如本文所述以及在Jolliffe等人，Int'l Rev.Immunol.10:241-250，1993、和Rodrigues等人，J.Immunol.151:6954-6961，1998中所述，可以通过IgG重链的Fc部分的标准分子生物学操作，来产生具有降低的效应子功能的抗体。具有降低的效应子功能的抗体还包括人IgG2和IgG4同种型，其具有降低的活化补体和/或与Fc受体相互作用的能力(Ravetch，J.V.等人，Annu.Rev.Immunol.9:457-492，1991；Isaacs，J.D.等人，J.Immunol.148:3062-3071，1992；van de Winkel，J.G.等人，Immunol.Today 14:215-221，1993)。可以通过本领域普通技术人员之一已知的几种方法之一，来产生由IgG2或IgG4同种型组成的对人MASP-2特异性的人源化抗体或全人抗体，如Vaughan，T.J.等人，NatureBiotechnical 16:535-539，1998中所述。
抗MASP-2抗体的产生
可以使用MASP-2多肽(例如全长MASP-2)、或使用荷有抗原性MASP-2表位的肽(例如MASP-2多肽的一部分)，来产生抗MASP-2抗体。免疫原性肽可以小至五个氨基酸残基。例如，包括SEQ ID NO:6的整个氨基酸序列的MASP-2多肽，可以用于诱导可用于本发明的方法中的抗MASP-2抗体。已知涉及蛋白质-蛋白质相互作用的特定MASP-2结构域，例如CUBI和CUBIEGF结构域，以及包含丝氨酸蛋白酶活性位点的区域，可以如实施例3中所述的作为重组多肽进行表达，并且用作抗原。另外，包含MASP-2多肽(SEQ ID NO:6)的至少6个氨基酸的一部分的肽也可用于诱导MASP-2抗体。下表2中提供了可用于诱导MASP-2抗体的MASP-2衍生抗原的另外实例。用于产生抗体的MASP-2肽和多肽可以作为天然多肽、或者重组肽或合成肽、以及无催化活性的重组多肽如MASP-2A进行分离，如本文进一步所述。在本发明的这个方面的一些实施方案中，使用如本文所述的转基因小鼠品系来获得抗MASP-2抗体。
可用于产生抗MASP-2抗体的抗原还包括融合多肽，例如MASP-2或其一部分与免疫球蛋白多肽或麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其一部分。如果多肽部分是半抗原样的，则此类部分可以有利地结合或连接至大分子载体(例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)用于免疫。
表2：MASP-2衍生的抗原
多克隆抗体
可以使用本领域普通技术人员众所周知的方法，通过用MASP-2多肽或其免疫原性部分免疫动物，来制备针对MASP-2的多克隆抗体。参见例如，Green等人，"Production ofPolyclonal Antisera,"于Immunochemical Protocols(Manson，编辑)，第105页。MASP-2多肽的免疫原性可以通过使用佐剂包括矿物凝胶得到增加，所述佐剂如氢氧化铝或弗氏佐剂(完全或不完全)、表面活性物质如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、油乳剂、钥孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。多克隆抗体通常在动物中产生，所述动物例如马、牛、犬、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊。可替代地，可用于本发明中的抗MASP-2抗体也可以衍生自类人猴。用于在狒狒中产生诊断和治疗上有用的抗体的一般技术可以例如在Goldenberg等人，国际专利公开号WO 91/11465，以及Losman，M.J.等人，Int.J.Cancer 46:310，1990中找到。然后使用本领域众所周知的标准程序，从此类免疫动物的血液产生含有免疫活性抗体的血清。
单克隆抗体
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是抗MASP-2单克隆抗体。抗MASP-2单克隆抗体是高度特异性的，针对单个MASP-2表位。如本文使用的，修饰语“单克隆”指示抗体的特征为得自基本上同质的抗体群体，并且不应解释为要求通过任何特定方法的抗体产生。单克隆抗体可以使用任何技术来获得，所述技术提供了通过培养中的连续细胞系的抗体分子产生，例如通过Kohler，G.等人，Nature 256:495，1975描述的杂交瘤方法，或者它们可以通过重组DNA方法(参见例如，授予Cabilly的美国专利号4,816,567)进行制备。也可以使用Clackson，T.等人，Nature 352:624-628，1991，以及Marks，J.D.等人，J.Mol.Biol.222:581-597，1991中描述的技术，从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。此类抗体可以具有任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。
例如，可以通过用包含MASP-2多肽或其一部分的组合物注射合适的哺乳动物(例如BALB/C小鼠)，来获得单克隆抗体。在预定的时间段后，将脾细胞从小鼠中取出，并且悬浮于细胞培养基中。然后将脾细胞与永生细胞系融合，以形成杂交瘤。所形成的杂交瘤在细胞培养物中生长，并且就其产生针对MASP-2的单克隆抗体的能力进行筛选。本文提供了进一步描述抗MASP-2单克隆抗体的产生的实例(还参见Current Protocols in Immunology，第1卷，John Wiley&Sons，第2.5.1-2.6.7页，1991。)
人单克隆抗体可以通过使用转基因小鼠来获得，所述转基因小鼠已进行改造，以响应抗原攻击而产生特异性人抗体。在该技术中，将人免疫球蛋白重链和轻链基因座的元件引入衍生自胚胎干细胞系的小鼠品系内，所述胚胎干细胞系含有内源性免疫球蛋白重链和轻链基因座的靶向破坏。转基因小鼠可以合成对于人抗原，例如本文所述的MASP-2抗原特异性的人抗体，并且可以通过使用常规的Kohler-Milstein技术，将来自此类动物的B细胞与合适的骨髓瘤细胞系融合，将小鼠用于产生分泌人MASP-2抗体的杂交瘤，如本文进一步所述。具有人免疫球蛋白基因组的转基因小鼠是商购可得的(例如，来自Abgenix，Inc.，Fremont，CA和Medarex，Inc.，Annandale，N.J.)。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法例如由Green，L.L.等人，Nature Genet.7:13，1994；Lonberg，N.等人，Nature 368:856，1994；以及Taylor，L.D.等人，Int.Immun.6:579，1994进行描述。
可以通过各种充分确立的技术，从杂交瘤培养物中分离且纯化单克隆抗体。此类分离技术包括用蛋白A琼脂糖的亲和层析、尺寸排阻层析和离子交换层析(参见例如，Coligan在第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页上；Baines等人，"Purification ofImmunoglobulin G(IgG),"于Methods in Molecular Biology，The Humana Press，Inc.，第10卷，第79-104页，1992)。
一旦产生，首先就特异性MASP-2结合测试多克隆抗体、单克隆抗体或噬菌体衍生的抗体。可以利用本领域技术人员已知的各种测定，来检测与MASP-2特异性结合的抗体。示例性测定包括通过标准方法(例如，如Ausubel等人中所述)的蛋白质印迹或免疫沉淀分析、免疫电泳、酶联免疫吸附测定、斑点印迹、抑制或竞争测定和夹心测定(如Harlow和Land，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中所述)。一旦鉴定了与MASP-2特异性结合的抗体，就在几种测定之一中测试抗MASP-2抗体充当MASP-2抑制剂的能力，所述测定例如凝集素特异性C4切割测定(实施例2中所述)、C3b沉积测定(实施例2中所述)、或C4b沉积测定(实施例2中所述)。
抗MASP-2单克隆抗体的亲和力可以通过本领域普通技术人员容易地确定(参见例如，Scatchard，A.，NY Acad.Sci.51:660-672，1949)。在一个实施方案中，可用于本发明的方法中的抗MASP-2单克隆抗体与MASP-2结合，其结合亲和力<100nM，优选<10nM且最优选<2nM。
嵌合/人源化抗体
可用于本发明的方法中的单克隆抗体包括嵌合抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一个物种或者属于另一个抗体类别或亚类的抗体、以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源(授予Cabilly的美国专利号4,816,567；以及Morrison，S.L.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 81:6851-6855，1984)。
可用于本发明中的嵌合抗体的一种形式是人源化的单克隆抗MASP-2抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。通过将非人(例如小鼠)互补决定区(CDR)，从小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区转移到人可变结构域内，来产生人源化的单克隆抗体。通常，然后在非人配对物的构架区中取代人抗体的残基。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。制备这些修饰以进一步完善抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个可变结构域，且通常为两个可变结构域的基本上全部，其中高变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且Fv构架区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的Fv构架区。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区。关于进一步细节，参见Jones，P.T.等人，Nature 321:522-525，1986；Reichmann，L.等人，Nature332:323-329，1988；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596，1992。
可用于本发明中的人源化抗体包括至少包括MASP-2结合CDRH3区的人单克隆抗体。另外，可以这样替换Fc部分，以便产生IgA或IgM以及人IgG抗体。此类人源化抗体将具有特定的临床效用，因为它们将特异性识别人MASP-2，但不在人中引发针对抗体本身的免疫应答。因而，它们更适合于人中的体内施用，尤其是在需要重复施用或长期施用时。
在本文实施例6中提供了从鼠抗MASP-2单克隆抗体生成人源化抗MASP-2抗体的实例。用于产生人源化的单克隆抗体的技术也例如通过以下进行描述：Jones，P.T.等人，Nature 321:522，1986；Carter，P.等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 89:4285，1992；Sandhu，J.S.，Crit.Rev.Biotech.12:437，1992；Singer，I.I.等人，J.Immun.150:2844，1993；Sudhir(编辑)，Antibody Engineering Protocols，Humana Press，Inc.，1995；Kelley，"Engineering Therapeutic Antibodies,"于Protein Engineering:Principlesand Practice，Cleland等人(编辑)，John Wiley&Sons，Inc.，第399-434页，1996；以及授予Queen的美国专利号5,693,762，1997。另外，存在从特异性鼠抗体区域合成人源化抗体的商业实体，例如Protein Design Labs(Mountain View，CA)。
重组抗体
抗MASP-2抗体也可以使用重组方法进行制备。例如，可以使用人免疫球蛋白表达文库(例如，可得自Stratagene，Corp.，La Jolla，CA)制备人抗体，以产生人抗体的片段(VH、VL、Fv、Fd、Fab或F(ab')2)。然后使用类似于产生嵌合抗体的技术，将这些片段用于构建完整的人抗体。
抗独特型抗体
一旦鉴定了具有所需抑制活性的抗MASP-2抗体，就可以使用本领域众所周知的技术，将这些抗体用于生成类似MASP-2的一部分的抗独特型抗体。参见例如，Greenspan，N.S.等人，FASEBJ.7:437，1993。例如，与MASP-2结合并竞争性抑制补体活化所需的MASP-2蛋白相互作用的抗体，可以用于生成抗独特型，其类似MASP-2蛋白上的MBL结合位点，并且因此结合并中和MASP-2的结合配体，例如MBL。
免疫球蛋白片段
可用于本发明的方法中的MASP-2抑制剂不仅包含完整的免疫球蛋白分子，还包含众所周知的片段，包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
本领域众所周知的是，抗体分子的仅一小部分，对位(paratope)，涉及抗体与其表位的结合(参见例如，Clark，W.R.，The Experimental Foundations of ModernImmunology，Wiley&Sons，Inc.，NY，1986)。抗体的pFc'和Fc区是经典补体途径的效应子，但不涉及抗原结合。pFc'区已从其中酶促切割、或已产生不含pFc'区的抗体被指定为F(ab')2片段，并且保留了完整抗体的两个抗原结合位点。分离的F(ab')2片段由于其两个抗原结合位点而被称为二价单克隆片段。类似地，Fc区已从其中酶促切割、或已产生不含Fc区的抗体被指定为Fab片段，并且保留了完整抗体分子的抗原结合位点之一。
抗体片段可以通过蛋白酶解水解，例如通过常规方法通过完整抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶酶促切割抗体来产生，以提供表示为F(ab')2的5S片段。这种片段可以使用硫醇还原剂进一步切割，以产生3.5S Fab'单价片段。任选地，可以使用起因于二硫键合切割的巯基的保护基团，来执行切割反应。作为替代方案，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法在例如以下中进行描述：授予Goldenberg的美国专利号4,331,647；Nisonoff，A.等人，Arch.Biochem.Biophys.89:230，1960；Porter，R.R.，Biochem.J.73:119，1959；Edelman等人，于Methods in Enzymology 1:422，Academic Press，1967；以及通过Coligan在第2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页。
在一些实施方案中，优选使用缺少Fc区的抗体片段，以避免经典补体途径的活化，所述经典补体途径在Fc与Fcγ受体结合后启动。存在通过其可以产生避免Fcγ受体相互作用的MoAb的几种方法。例如，单克隆抗体的Fc区可以使用通过蛋白水解酶的部分消化(例如，无花果酶消化)进行化学去除，从而生成例如抗原结合抗体片段，例如Fab或F(ab)2片段(Mariani，M.等人，Mol.Immunol.28:69-71，1991)。可替代地，可以在如本文所述的人源化抗体的构建期间，使用不结合Fcγ受体的人γ4IgG同种型。缺少Fc结构域的抗体、单链抗体和抗原结合结构域，也可以使用本文所述的重组技术进行改造。
单链抗体片段
可替代地，可以产生对于MASP-2特异性的单一肽链结合分子，其中重链和轻链Fv区是连接的。Fv片段可以通过肽接头连接，以形成单链抗原结合蛋白(scFv)。通过构建包含DNA序列的结构基因来制备这些单链抗原结合蛋白，所述DNA序列编码通过寡核苷酸连接的VH和VL结构域。将结构基因插入表达载体内，随后将所述表达载体引入宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)内。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的接头肽的单条多肽链。用于产生scFv的方法例如通过以下进行描述：Whitlow等人，"Methods:A Companion to Methodsin Enzymology"2:97，1991；Bird等人，Science242:423，1988；授予Ladner的美国专利号4,946,778；Pack，P.等人，Bio/Technology 11:1271，1993。
作为说明性实例，可以通过将淋巴细胞在体外暴露于MASP-2多肽，并且在噬菌体或类似载体中选择抗体展示文库(例如，通过使用固定的或标记的MASP-2蛋白或肽)，来获得MASP-2特异性scFv。可以通过筛选在噬菌体或细菌(例如大肠杆菌)上展示的随机肽文库，来获得编码具有潜在MASP-2多肽结合结构域的多肽的基因。这些随机肽展示文库可以用于筛选与MASP-2相互作用的肽。用于产生和筛选此类随机肽展示文库的技术是本领域众所周知的(授予Lardner的美国专利号5,223,409；授予Lardner的美国专利号4,946,778；授予Lardner的美国专利号5,403,484；授予Lardner的美国专利号5,571,698；以及Kay等人，Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press，Inc.，1996)，并且用于筛选此类文库的随机肽展示文库和试剂盒是例如从CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，Calif.)、Invitrogen Inc.(San Diego，Calif.)、New England Biolabs，Inc.(Ipswich，Mass.)和Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway，N.J.)商购可得的。
可用于本发明的这个方面中的抗MASP-2抗体片段的另一种形式是编码单个互补决定区(CDR)的肽，所述单个互补决定区与MASP-2抗原上的表位结合，并且抑制MASP-2依赖性补体活化。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目的抗体的CDR的基因来获得。例如，通过使用聚合酶链反应，由抗体产生细胞的RNA合成可变区，来制备此类基因(参见例如，Larrick等人，Methods:A Companion toMethods in Enzymology 2:106，1991；Courtenay-Luck，"Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,"于MonoclonalAntibodies:Production，Engineering and Clinical Application，Ritter等人(编辑)，第166页，Cambridge University Press，1995；以及Ward等人，"Genetic Manipulationand Expression of Antibodies,"于Monoclonal Antibodies:PrinciplesandApplications，Birch等人(编辑)，第137页，Wiley-Liss，Inc.，1995)。
将本文所述的MASP-2抗体施用于有此需要的受试者，以抑制MASP-2依赖性补体活化。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是具有降低的效应子功能的高亲和力人或人源化单克隆抗MASP-2抗体。
肽抑制剂
在本发明的这个方面的一些实施方案中，MASP-2抑制剂包含分离的MASP-2肽抑制剂，包括分离的天然肽抑制剂和合成肽抑制剂，其抑制MASP-2依赖性补体活化系统。如本文使用的，术语“分离的MASP-2肽抑制剂”指通过以下抑制MASP-2依赖性补体活化的肽：与MASP-2结合，与MASP-2竞争结合凝集素途径中的另一种识别分子(例如MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)，和/或直接与MASP-2相互作用以抑制MASP-2依赖性补体活化，所述肽是基本上纯的，并且基本不含它们可能与之一起在自然界发现的其它物质，至对于其预期用途实际且适当的程度。
肽抑制剂已成功地在体内用于干扰蛋白质-蛋白质相互作用和催化位点。例如，针对与LFA 1在结构上有关的粘附分子的肽抑制剂最近已批准用于凝血病中的临床使用(Ohman，E.M.等人，European Heart J.16:50-55，1995)。预防或干扰整联蛋白依赖性粘附的短线性肽(<30个氨基酸)已得到描述(Murayama，O.等人，J.Biochem.120:445-51，1996)。长度范围为25至200个氨基酸残基的更长的肽，也已成功地用于阻断整联蛋白依赖性粘附(Zhang，L.等人，J.Biol.Chem.271(47):29953-57，1996)。一般而言，更长的肽抑制剂具有比短肽更高的亲和力和/或更慢的解离速率，并且因此可能是更有力的抑制剂。环肽抑制剂也已显示为体内整联蛋白的有效抑制剂，用于治疗人炎性疾病(Jackson，D.Y.等人，J.Med.Chem.40:3359-68，1997)。产生环状肽的一种方法涉及合成其中肽的末端氨基酸是半胱氨酸的肽，从而允许肽通过末端氨基酸之间的二硫键合以环状形式存在，其已显示为改善在体内的亲和力和半衰期，用于治疗造血系统赘生物(例如，授予Larson的美国专利号6,649,592)。
合成MASP-2肽抑制剂
可用于本发明的这个方面的方法中的MASP-2抑制性肽通过氨基酸序列来例示，所述氨基酸序列模拟对于MASP-2功能重要的靶区域。可用于本发明的方法的实践中的抑制性肽的大小范围为约5个氨基酸至约300个氨基酸。表3提供了可以用于本发明的这个方面的实践中的示例性抑制性肽的列表。可以在几种测定之一中测试候选MASP-2抑制性肽充当MASP-2抑制剂的能力，所述测定包括例如凝集素特异性C4切割测定(实施例2中所述)和C3b沉积测定(实施例2中所述)。
在一些实施方案中，MASP-2抑制性肽衍生自MASP-2多肽，并且选自全长成熟的MASP-2蛋白(SEQ ID NO:6)、或MASP-2蛋白的特定结构域，例如CUBI结构域(SEQ ID NO:8)、CUBIEGF结构域(SEQ ID NO:9)、EGF结构域(SEQ ID NO:11)和丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ IDNO:12)。如先前所述，CUBEGFCUBII区域已显示为二聚化以及与MBL结合所必需的(Thielens等人，同上)。特别地，MASP-2的CUBI结构域中的肽序列TFRSDYN(SEQ ID NO:16)已在一项研究中显示为涉及与MBL的结合，所述研究鉴定了在Asp105至Gly105处携带纯合突变的人，导致MASP-2从MBL复合物中的丧失(Stengaard-Pedersen，K.等人，New England J.Med.349:554-560，2003)。
在一些实施方案中，MASP-2抑制性肽衍生自与MASP-2结合并涉及凝集素补体途径的凝集素蛋白。已鉴定了涉及该途径的几种不同的凝集素，包括甘露聚糖结合凝集素(MBL)、L-纤维胶凝蛋白、M纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白。(Ikeda，K.等人，J.Biol.Chem.262:7451-7454，1987；Matsushita，M.等人，J.Exp.Med.176:1497-2284，2000；Matsushita，M.等人，J.Immunol.168:3502-3506，2002)。这些凝集素作为同源三聚体亚基的寡聚体存在于血清中，所述同源三聚体亚基各自具有含有碳水化合物识别结构域的N末端胶原样纤维。这些不同的凝集素已显示与MASP-2结合，并且凝集素/MASP-2复合物通过蛋白质C4和C2的切割而活化补体。H-纤维胶凝蛋白具有24个氨基酸的氨基末端区域、具有11个Gly-Xaa-Yaa重复的胶原样结构域、12个氨基酸的颈结构域、以及207个氨基酸的纤维蛋白原样结构域(Matsushita，M.等人，J.Immunol.168:3502-3506，2002)。H-纤维胶凝蛋白与GlcNAc结合，并且使由LPS包被的人红细胞凝集，所述LPS衍生自鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、明尼苏达沙门氏菌(S.minnesota)和大肠杆菌。H-纤维胶凝蛋白已显示与MASP-2和MAp19结合，并且活化凝集素途径。同上。L-纤维胶凝蛋白/P35也与GlcNAc结合，并且已显示与人血清中的MASP-2和MAp19结合，并且该复合物已显示活化凝集素途径(Matsushita，M.等人，J.Immunol.164:2281，2000)。相应地，可用于本发明中的MASP-2抑制性肽可以包含选自以下的至少5个氨基酸的区域：MBL蛋白(SEQ ID NO:21)、H-纤维胶凝蛋白(Genbank登录号NM_173452)、M-纤维胶凝蛋白(Genbank登录号O00602)和L-纤维胶凝蛋白(Genbank登录号NM_015838)。
更具体而言，科学家已鉴定了在MBL上的MASP-2结合位点在12个Gly-X-Y三联体"GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS"(SEQID NO:26)内，其位于MBP的胶原样结构域的C末端部分的铰链和颈部之间(Wallis，R.等人，J.Biol.Chem.279:14065，2004)。这个MASP-2结合位点区域在人H-纤维胶凝蛋白和人L-纤维胶凝蛋白中也是高度保守的。已描述了共有结合位点，其存在于包含氨基酸序列"OGK-X-GP"(SEQ ID NO:22)的所有三种凝集素蛋白中，其中字母"O"代表羟脯氨酸，且字母"X"是疏水残基(Wallis等人，2004，同上)。相应地，在一些实施方案中，可用于本发明的这个方面中的MASP-2抑制性肽的长度为至少6个氨基酸，并且包含SEQ ID NO:22。衍生自包括氨基酸序列"GLR GLQ GPO GKL GPO G"(SEQ ID NO:24)的MBL的肽，已显示在体外结合MASP-2(Wallis等人，2004，同上)。为了增强与MASP-2的结合，可以合成在每个端部处侧面为两个GPO三联体的肽("GPO GPO GLRGLQ GPO GKL GPO GGP OGP O"SEQ ID NO:25)，以增强如天然MBL蛋白中发现的三螺旋的形成(如Wallis，R.等人，J.Biol.Chem.279:14065，2004中进一步描述的)。
MASP-2抑制性肽也可以衍生自人H-纤维胶凝蛋白，其包括来自H-纤维胶凝蛋白中的共有MASP-2结合区的序列"GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO"(SEQ IDNO:27)。还包括的是衍生自人L-纤维胶凝蛋白的肽，其包括来自L-纤维胶凝蛋白中的共有MASP-2结合区的序列"GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAOGEO"(SEQ ID NO:28)。
MASP-2抑制性肽也可以衍生自C4切割位点，例如"LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI"(SEQ ID NO:29)，其是与抗凝血酶III的C末端部分连接的C4切割位点(Glover，G.I.等人，Mol.Immunol.25:1261(1988))。
表3：示例性的MASP-2抑制性肽
注意：字母"O"代表羟脯氨酸。字母"X"是疏水残基。
衍生自C4切割位点的肽以及抑制MASP-2丝氨酸蛋白酶位点的其它肽可以进行化学修饰，使得它们成为不可逆的蛋白酶抑制剂。例如，适当的修饰可以包括但不一定限于在C末端、Asp或Glu处，或者附加至功能性侧链的卤代甲基酮(Br、Cl、I、F)；在氨基或其它功能性侧链上的卤代乙酰基(或其它α-卤代乙酰基)；在氨基或羧基末端或功能性侧链上的含环氧化物或亚胺的基团；或者在氨基或羧基末端或功能性侧链上的亚氨酸酯。此类修饰提供通过肽的共价附着来永久地抑制酶的优点。这可以导致较低的有效剂量和/或需要肽抑制剂的较不频繁施用。
除上述抑制性肽之外，可用于本发明的方法中的MASP-2抑制性肽包括这样的肽，其含有如本文所述获得的抗MASP-2 MoAb的MASP-2结合的CDRH3区。用于合成肽的CDR区的序列可以通过本领域已知的方法来确定。重链可变区是长度范围一般为100至150个氨基酸的肽。轻链可变区是长度范围一般为80至130个氨基酸的肽。在重链和轻链可变区内的CDR序列仅包括大约3-25个氨基酸序列，其可以通过本领域普通技术人员容易地进行测序。
本领域技术人员将认识到，上述MASP-2抑制性肽的基本上同源的变异也显示出MASP-2抑制活性。示例性的变异包括但不一定限于在主题肽的羧基末端或氨基末端部分上，具有插入、缺失、替换和/或另外氨基酸的肽及其混合物。相应地，具有MASP-2抑制活性的那些同源肽被视为可用于本发明的方法中。所述的肽还可以包括重复的基序和具有保守取代的其它修饰。保守变体在本文其它地方进行描述，并且包括氨基酸与类似电荷、大小或疏水性等等的另一种氨基酸的交换。
MASP-2抑制性肽可以进行修饰，以增加溶解度和/或使正电荷或负电荷达到最大，以便更紧密地类似完整蛋白质中的区段。衍生物可以具有或可以不具有本文公开的肽的确切一级氨基酸结构，只要衍生物在功能上保留了MASP-2抑制的所需特性。修饰可以包括用通常已知的二十种氨基酸之一或另一种氨基酸的氨基酸取代、用具有辅助期望特征(例如对酶促降解的抗性)的衍生或取代氨基酸的氨基酸取代、或者用D氨基酸的氨基酸取代、或者用另一种分子或化合物例如碳水化合物的取代，所述另一种分子或化合物模拟一种或多种氨基酸或肽的天然构象和功能；氨基酸缺失；用通常已知的二十种氨基酸之一或另一种氨基酸的氨基酸插入、用具有辅助期望特征(例如对酶促降解的抗性)的衍生或插入氨基酸的氨基酸插入、或者用D氨基酸的氨基酸插入、或者用另一种分子或化合物例如碳水化合物的取代，所述另一种分子或化合物模拟一种或多种氨基酸或肽的天然构象和功能；或者用另一种分子或化合物例如碳水化合物或核酸单体的取代，所述另一种分子或化合物模拟亲本肽的天然构象、电荷分布和功能。肽也可以通过乙酰化或酰胺化进行修饰。
衍生物抑制性肽的合成可以依赖肽生物合成、碳水化合物生物合成等等的已知技术。作为起点，技术人员可以依赖合适的计算机程序，以确定目的肽的构象。一旦已知本文公开的肽的构象，则技术人员就可以以合理的设计方式确定可以在一个或多个位点处进行哪种取代，以制备保留亲本肽的基本构象和电荷分布，但可能具有亲本肽中不存在或增强超过亲本肽中发现的特征的衍生物。一旦鉴定了候选衍生物分子，就可以使用本文所述的测定来测试衍生物，以确定它们是否充当MASP-2抑制剂。
筛选MASP-2抑制性肽
还可以使用分子建模和合理的分子设计，来生成且筛选模拟MASP-2的关键结合区的分子结构，并抑制MASP-2的补体活性的肽。用于建模的分子结构包括抗MASP-2单克隆抗体的CDR区，以及已知对于MASP-2功能重要的靶区域，包括二聚化所需的区域、涉及与MBL结合的区域以及丝氨酸蛋白酶活性位点，如先前所述。用于鉴定结合特定靶的肽的方法是本领域众所周知的。例如，分子印迹可以用于从头构建大分子结构，例如与特定分子结合的肽。参见例如，Shea，K.J.，"Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers:TheDe Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties,"TRIP2(5)1994。
作为说明性实例，制备MASP-2结合肽的模拟物的一种方法如下。将已知MASP-2结合肽的功能单体或显示出MASP-2抑制的抗MASP-2抗体的结合区域(模板)聚合。然后去除模板，随后为第二类单体在通过模板留下的空隙中的聚合，以提供显示出与模板相似的一种或多种所需特性的新分子。除以这种方式制备肽之外，还可以制备其为MASP-2抑制剂的其它MASP-2结合分子，例如多糖、核苷、药物、核蛋白、脂蛋白、碳水化合物、糖蛋白、类固醇、脂质和其它生物活性材料。这种方法可用于设计比其天然配对物更稳定的广泛多样的生物模拟物，因为它们通常通过功能单体的自由基聚合进行制备，导致具有不可生物降解的主链的化合物。
肽合成
MASP-2抑制性肽可以使用本领域众所周知的技术进行制备，所述技术例如最初通过Merrifield于J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2154，1963中描述的固相合成技术。可以根据由制造商提供的说明书，例如使用Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Foster City，Calif.)，来实现自动化合成。可以例如在Bodanszky，M.等人，PeptideSynthesis，第二版，John Wiley&Sons，1976，以及本领域技术人员已知的其它参考文献中找到其它技术。
肽也可以使用本领域技术人员已知的标准基因工程技术进行制备。例如，肽可以通过以下酶促产生：将编码肽的核酸插入表达载体内，表达DNA，并且在所需氨基酸的存在下，将DNA翻译成肽。然后使用层析或电泳技术或借助于载体蛋白来纯化肽，通过将编码载体蛋白的核酸序列与肽编码序列同相插入表达载体内，所述载体蛋白可以与肽融合并随后从肽中切割。融合蛋白-肽可以使用层析、电泳或免疫学技术(例如经由针对载体蛋白的抗体与树脂结合)进行分离。可以使用化学方法或如通过例如水解酶来酶切切割肽。
遵循常规技术，还可以在重组宿主细胞中产生可用于本发明的方法中的MASP-2抑制性肽。为了表达MASP-2抑制性肽编码序列，必须将编码该肽的核酸分子与调控序列可操作地连接，所述调控序列控制表达载体中的转录表达，然后引入宿主细胞内。除转录调控序列例如启动子和增强子之外，表达载体还可以包括翻译调控序列和标记物基因，其适合于选择携带表达载体的细胞。
编码MASP-2抑制性肽的核酸分子可以使用方案如亚磷酰胺法，用“基因机器”进行合成。如果化学合成的双链DNA是应用例如基因或基因片段的合成所需的，则分开地制备每条互补链。短基因(60至80个碱基对)的产生是技术上简单的，并且可以通过合成互补链然后使其退火来完成。对于更长基因的产生，合成基因(双链)以模块形式由单链片段进行组装，所述单链片段长度为20至100个核苷酸。关于多核苷酸合成的综述，参见例如，Glick和Pasternak，"Molecular Biotechnology，Principles and Applications of RecombinantDNA"，ASM Press，1994；Itakura，K.等人，Annu.Rev.Biochem.53:323，1984；以及Climie，S.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 87:633，1990。
小分子MASP-2抑制剂
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是小分子抑制剂，包括具有低分子量(例如50至1000Da)的天然、半合成和合成物质，例如肽、拟肽和非肽抑制剂(例如寡核苷酸和有机化合物)。可以基于抗MASP-2抗体的可变区的分子结构，来生成MASP-2的小分子抑制剂。
还可以使用计算药物设计，基于MASP-2的晶体结构，来设计且生成小分子抑制剂(Kuntz I.D.等人，Science 257:1078，1992)。大鼠MASP-2的晶体结构已得到描述(Feinberg，H.等人，EMBOJ.22:2348-2359，2003)。使用通过Kuntz等人描述的方法，将MASP-2晶体结构坐标用作计算机程序如DOCK的输入，所述程序输出预计与MASP-2结合的小分子结构列表。此类计算机程序的使用是本领域技术人员众所周知的。例如，通过使用程序DOCK(Kuntz，I.D.等人，J.Mol.Biol.161:269-288，1982；DesJarlais，R.L.等人，PNAS87:6644-6648，1990)，评估在Cambridge Crystallographic数据库中找到的化合物与酶结合位点的拟合，HIV-1蛋白酶抑制剂的晶体结构用于鉴定其为HIV-1蛋白酶抑制剂的独特的非肽配体。
示例性的MASP-2抑制剂包括但不限于美国专利申请号62/943,629、62/943,622、62/943,611、62/943,599、16/425,791和PCT申请号PCT/US19/34220中公开的化合物，其各自在此整体引入作为参考。
在一些实施方案中，小分子是式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(III)或(IV)的化合物：
或其盐，其中：
Cy1A是未取代或取代的C6-10芳基、或者未取代或取代的5-10元杂芳基；其中形成Cy1A的5-10元杂芳基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；其中形成Cy1A的取代的C6-10芳基或取代的5-10元杂芳基由1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy1A、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、C(＝NORa11)NRc11Rd11、C(＝NOC(O)Rb11)NRc11Rd11、C(＝NRe11)NRc11C(O)ORa11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；
每个RCy1A独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基，其中形成RCy1A的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2、3或4个杂原子组成，其中形成RCy1A的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代，并且其中形成RCy1A的每个C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；
R11为H或C1-6烷基、C6-10芳基-C1-6烷基或5-10元杂芳基-C1-6烷基，其中形成R11的C1-6烷基是未取代的，或者被独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代，并且其中形成R11的C6-10芳基-C1-6烷基或5-10元杂芳基-C1-6烷基是未取代的，或者被独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；
R12为H或C1-6烷基；或
R11和R12连同它们与之连接的基团一起形成4-6元杂环烷基环；
A11为CR13R15或N；
每个R13独立地为Cy1B、(CR13AR13B)n3Cy1B、(C1-6亚烷基)Cy1B、(C2-6亚烯基)Cy1B、(C2-6亚炔基)Cy1B或OCy1B，其中R13的C1-6亚烷基、C2-6亚烯基或C2-6亚炔基组分是未取代的，或者被1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；
每个R14独立地选自H和C1-6烷基；
R15选自H、R13、C1-6烷基和OH；
与相邻碳原子连接的一对R14基团、或与相邻碳原子连接的一对R14和R15基团，可以不依赖于R14的其它出现，一起被替换为连接所述一对R14基团或所述一对R14和R15基团与之连接的相邻碳原子的键，使得相邻的碳原子通过双键连接；或
与同一碳原子连接的一对R14基团、或与同一碳原子连接的一对R13和R15基团，可以不依赖于R14的其它出现，并且连同所述一对R14基团或所述一对R13和R15基团与之连接的碳原子一起，形成螺稠合的C3-10环烷基或4-10元杂环烷基环，其中所形成的4-10元杂环烷基环的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成，其中所形成的螺稠合的C3-10环烷基或4-10元杂环烷基环，任选地进一步由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤代烷基、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；或
与相邻碳原子连接的一对R14基团、或与相邻碳原子连接的一对R14和R15基团，可以不依赖于R14的其它出现，连同所述一对R14基团或所述一对R14和R15基团与之连接的相邻碳原子一起，形成稠合的C3-10环烷基或4-10元杂环烷基环，其中所形成的4-10元杂环烷基环的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成，其中所形成的稠合的C3-10环烷基或4-10元杂环烷基环，任选地进一步由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤代烷基、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；或
与两个相邻的碳原子连接的一组四个R14基团，或与两个相邻的碳原子连接的一组两个R14、一个R13和一个R15基团，可以不依赖于R14的其它出现，连同所述一组四个R14基团，或所述一组两个R14、一个R13和一个R15基团与之连接的两个相邻的碳原子一起，形成稠合的C6-10芳基或5-10元杂芳基、C3-10环烷基或4-10元杂环烷基环，其中所形成的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基环的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成，并且其中所形成的稠合的C6-10芳基或5-10元杂芳基、C3-10环烷基或4-10元杂环烷基环，任选地进一步由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤代烷基、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；
n1为1或2；
n2为0、1或2；
条件是n1和n2之和为1、2或3；
条件是如果n1为1或n2为0，则A11为CR13R15；
n3为0、1或2；
每个R13A独立地为H或C1-6烷基；
每个R13B独立地为H或C1-6烷基；或
或者与同一碳原子连接的R13A和R13B，不依赖于任何其它R13A和R13B基团，一起可以形成–(CH2)2-5-，从而形成3-6元环烷基环；或
Cy1B是未取代或取代的C6-10芳基、未取代或取代的5-10元杂芳基、未取代或取代的C3-10环烷基、或者未取代或取代的4-10元杂环烷基；其中形成Cy1B的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；和
其中形成Cy1B的取代的C6-10芳基、取代的5-10元杂芳基、取代的C3-10环烷基或取代的4-10元杂环烷基由1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy1B、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、C(＝NORa11)NRc11Rd11、C(＝NOC(O)Rb11)NRc11Rd11、C(＝NRe11)NRc11C(O)ORa11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；
其中每个RCy1B独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基，其中形成RCy1B的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；其中形成RCy1B的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；并且其中形成RCy1B的每个C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；
R16为H、Cy1C、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中形成R16的C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基是未取代的，或者被选自以下的1、2、3、4或5个取代基取代：Cy1C、卤素、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代，条件是R16的不多于一个取代基为Cy1C；
Cy1C是未取代或取代的C6-10芳基、未取代或取代的5-10元杂芳基、未取代或取代的C3-10环烷基、或者未取代或取代的4-10元杂环烷基；其中形成Cy1C的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；和
其中形成Cy1C的取代的C6-10芳基、取代的5-10元杂芳基、取代的C3-10环烷基或取代的4-10元杂环烷基由1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy1C、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、C(＝NORa11)NRc11Rd11、C(＝NOC(O)Rb11)NRc11Rd11、C(＝NRe11)NRc11C(O)ORa11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；
其中每个RCy1C独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基，其中形成RCy1C的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；其中形成RCy1C的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；并且其中形成RCy1C的每个C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa11、SRa11、C(O)Rb11、C(O)NRc11Rd11、C(O)ORa11、OC(O)Rb11、OC(O)NRc11Rd11、NRc11Rd11、NRc11C(O)Rb11、NRc11C(O)NRc11Rd11、NRc11C(O)ORa11、C(＝NRe11)NRc11Rd11、NRc11C(＝NRe11)NRc11Rd11、S(O)Rb11、S(O)NRc11Rd11、S(O)2Rb11、NRc11S(O)2Rb11、S(O)2NRc11Rd11和氧代；
Ra11、Rb11、Rc11和Rd11各自独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-7环烷基、5-10元杂芳基、4-10元杂环烷基、C6-10芳基-C1-3烷基、5-10元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-10元杂环烷基-C1-3烷基，其中形成Ra11、Rb11、Rc11和Rd11的所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-7环烷基、5-10元杂芳基、4-10元杂环烷基、C6-10芳基-C1-3烷基、5-10元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-10元杂环烷基-C1-3烷基，各自任选地由独立地选自以下的1、2、3、4或5个取代基取代：C1-6烷基、卤素、CN、ORa12、SRa12、C(O)Rb12、C(O)NRc12Rd12、C(O)ORa12、OC(O)Rb12、OC(O)NRc12Rd12、NRc12Rd12、NRc12C(O)Rb12、NRc12C(O)NRc12Rd12、NRc12C(O)ORa12、C(＝NRe12)NRc12Rd12、NRc12C(＝NRe12)NRc12Rd12、S(O)Rb12、S(O)NRc12Rd12、S(O)2Rb12、NRc12S(O)2Rb12、S(O)2NRc12Rd12和氧代；
或者连接至同一N原子的Rc11和Rd11，连同它们均与之连接的N原子一起，形成4、5、6或7元杂环烷基或者5元杂芳基，各自任选地由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：C1-6烷基、卤素、CN、ORa12、SRa12、C(O)Rb12、C(O)NRc12Rd12、C(O)ORa12、OC(O)Rb12、OC(O)NRc12Rd12、NRc12Rd12、NRc12C(O)Rb12、NRc12C(O)NRc12Rd12、NRc12C(O)ORa12、C(＝NRe12)NRc12Rd12、NRc12C(＝NRe12)NRc12Rd12、S(O)Rb12、S(O)NRc12Rd12、S(O)2Rb12、NRc12S(O)2Rb12、S(O)2NRc12Rd12和氧代；
Ra12、Rb12、Rc12和Rd12各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、苯基、C3-7环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-C1-3烷基、5-6元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-7元杂环烷基-C1-3烷基，其中形成Ra12、Rb12、Rc12和Rd12的所述C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、苯基、C3-7环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-C1-3烷基、5-6元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-7元杂环烷基-C1-3烷基，各自任选地由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：OH、CN、氨基、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基和氧代；
或者连接至同一N原子的Rc12和Rd12，连同它们均与之连接的N原子一起，形成4、5、6或7元杂环烷基或者5元杂芳基，其各自是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：OH、CN、氨基、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基和氧代；
Re11和Re12各自独立地为H、CN或NO2；
Cy2A是未取代或取代的C6-10芳基、或者未取代或取代的5-10元杂芳基；其中形成Cy2A的5-10元杂芳基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；其中形成Cy2A的取代的C6-10芳基或取代的5-10元杂芳基由1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy2A、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa21、SRa21、C(O)Rb21、C(O)NRc21Rd21、C(O)ORa21、OC(O)Rb21、OC(O)NRc21Rd21、NRc21Rd21、NRc21C(O)Rb21、NRc21C(O)NRc21Rd21、NRc21C(O)ORa21、C(＝NRe21)NRc21Rd21、C(＝NORa21)NRc21Rd21、C(＝NOC(O)Rb21)NRc21Rd21、C(＝NRe21)NRc21C(O)ORa21、NRc21C(＝NRe21)NRc21Rd21、S(O)Rb21、S(O)NRc21Rd21、S(O)2Rb21、NRc21S(O)2Rb21、S(O)2NRc21Rd21和氧代；
每个RCy2A独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基，其中形成RCy2A的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2、3或4个杂原子组成，其中形成RCy2A的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa21、SRa21、C(O)Rb21、C(O)NRc21Rd21、C(O)ORa21、OC(O)Rb21、OC(O)NRc21Rd21、NRc21Rd21、NRc21C(O)Rb21、NRc21C(O)NRc21Rd21、NRc21C(O)ORa21、C(＝NRe21)NRc21Rd21、NRc21C(＝NRe21)NRc21Rd21、S(O)Rb21、S(O)NRc21Rd21、S(O)2Rb21、NRc21S(O)2Rb21、S(O)2NRc21Rd21和氧代，其中形成RCy2A的每个C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa21、SRa21、C(O)Rb21、C(O)NRc21Rd21、C(O)ORa21、OC(O)Rb21、OC(O)NRc21Rd21、NRc21Rd21、NRc21C(O)Rb21、NRc21C(O)NRc21Rd21、NRc21C(O)ORa21、C(＝NRe21)NRc21Rd21、NRc21C(＝NRe21)NRc21Rd21、S(O)Rb21、S(O)NRc21Rd21、S(O)2Rb21、NRc21S(O)2Rb21、S(O)2NRc21Rd21和氧代；
R21为H或C1-6烷基、C6-10芳基-C1-6烷基或5-10元杂芳基-C1-6烷基，其中形成R21的C1-6烷基是未取代的，或者被独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa21、SRa21、C(O)Rb21、C(O)NRc21Rd21、C(O)ORa21、OC(O)Rb21、OC(O)NRc21Rd21、NRc21Rd21、NRc21C(O)Rb21、NRc21C(O)NRc21Rd21、NRc21C(O)ORa21、C(＝NRe21)NRc21Rd21、NRc21C(＝NRe21)NRc21Rd21、S(O)Rb21、S(O)NRc21Rd21、S(O)2Rb21、NRc21S(O)2Rb21、S(O)2NRc21Rd21和氧代，并且其中形成R21的C6-10芳基-C1-6烷基或5-10元杂芳基-C1-6烷基是未取代的，或者被独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa21、SRa21、C(O)Rb21、C(O)NRc21Rd21、C(O)ORa21、OC(O)Rb21、OC(O)NRc21Rd21、NRc21Rd21、NRc21C(O)Rb21、NRc21C(O)NRc21Rd21、NRc21C(O)ORa21、C(＝NRe21)NRc21Rd21、NRc21C(＝NRe21)NRc21Rd21、S(O)Rb21、S(O)NRc21Rd21、S(O)2Rb21、NRc21S(O)2Rb21、S(O)2NRc21Rd21和氧代；
R22为H或C1-6烷基；或
R21和R22连同它们与之连接的基团一起形成4-6元杂环烷基环；
A23为N或NR23；
A24为CR24、N和NR24；
A26为CR26或S；
条件是
式(IIA)中的A23、A24和A26这样加以选择，使得包含A23、A24和A26的环为杂芳基环，并且符号表示芳环(标准化的)键；
R23为H或C1-6烷基；
R24为H；C1-6烷基或苯基；
R25为Cy2B、(CR25AR25B)n25Cy2B、(C1-6亚烷基)Cy2B、(C2-6亚烯基)Cy2B或(C2-6亚炔基)Cy2B，其中R25的C1-6亚烷基、C2-6亚烯基或C2-6亚炔基组分是未取代的，或者被1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、CN、ORa21、SRa21、C(O)Rb21、C(O)NRc21Rd21、C(O)ORa21、OC(O)Rb21、OC(O)NRc21Rd21、NRc21Rd21、NRc21C(O)Rb21、NRc21C(O)NRc21Rd21、NRc21C(O)ORa21、C(＝NRe21)NRc21Rd21、NRc21C(＝NRe21)NRc21Rd21、S(O)Rb21、S(O)NRc21Rd21、S(O)2Rb21、NRc21S(O)2Rb21、S(O)2NRc21Rd21和氧代；
R26为H或C1-6烷基；
每个R25A为H或C1-6烷基；
每个R25B为H或C1-6烷基；
n25为0、1或2；
Cy2B为未取代或取代的C6-10芳基、未取代或取代的5-10元杂芳基、未取代或取代的C3-10环烷基、或者未取代或取代的4-10元杂环烷基；其中形成Cy2B的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；和
其中形成Cy2B的取代的C6-10芳基、取代的5-10元杂芳基、取代的C3-10环烷基或取代的4-10元杂环烷基由1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy2B、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa21、SRa21、C(O)Rb21、C(O)NRc21Rd21、C(O)ORa21、OC(O)Rb21、OC(O)NRc21Rd21、NRc21Rd21、NRc21C(O)Rb21、NRc21C(O)NRc21Rd21、NRc21C(O)ORa21、C(＝NRe21)NRc21Rd21、C(＝NORa21)NRc21Rd21、C(＝NOC(O)Rb21)NRc21Rd21、C(＝NRe21)NRc21C(O)ORa21、NRc21C(＝NRe21)NRc21Rd21、S(O)Rb21、S(O)NRc21Rd21、S(O)2Rb21、NRc21S(O)2Rb21、S(O)2NRc21Rd21和氧代；
其中每个RCy2B独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基，其中形成RCy2B的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；其中形成RCy2B的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa21、SRa21、C(O)Rb21、C(O)NRc21Rd21、C(O)ORa21、OC(O)Rb21、OC(O)NRc21Rd21、NRc21Rd21、NRc21C(O)Rb21、NRc21C(O)NRc21Rd21、NRc21C(O)ORa21、C(＝NRe21)NRc21Rd21、NRc21C(＝NRe21)NRc21Rd21、S(O)Rb21、S(O)NRc21Rd21、S(O)2Rb21、NRc21S(O)2Rb21、S(O)2NRc21Rd21和氧代；并且其中形成RCy2B的每个C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa21、SRa21、C(O)Rb21、C(O)NRc21Rd21、C(O)ORa21、OC(O)Rb21、OC(O)NRc21Rd21、NRc21Rd21、NRc21C(O)Rb21、NRc21C(O)NRc21Rd21、NRc21C(O)ORa21、C(＝NRe21)NRc21Rd21、NRc21C(＝NRe21)NRc21Rd21、S(O)Rb21、S(O)NRc21Rd21、S(O)2Rb21、NRc21S(O)2Rb21、S(O)2NRc21Rd21和氧代；
各自独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-7环烷基、5-10元杂芳基、4-10元杂环烷基、C6-10芳基-C1-3烷基、5-10元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-10元杂环烷基-C1-3烷基，其中形成Ra21、Rb21、Rc21和Rd21的所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-7环烷基、5-10元杂芳基、4-10元杂环烷基、C6-10芳基-C1-3烷基、5-10元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-10元杂环烷基-C1-3烷基，各自任选地由独立地选自以下的1、2、3、4或5个取代基取代：C1-6烷基、卤素、CN、ORa22、SRa22、C(O)Rb22、C(O)NRc22Rd22、C(O)ORa22、OC(O)Rb22、OC(O)NRc22Rd22、NRc22Rd22、NRc22C(O)Rb22、NRc22C(O)NRc22Rd22、NRc22C(O)ORa22、C(＝NRe22)NRc22Rd22、NRc22C(＝NRe22)NRc22Rd22、S(O)Rb22、S(O)NRc22Rd22、S(O)2Rb22、NRc22S(O)2Rb22、S(O)2NRc22Rd22和氧代；
或者连接至同一N原子的Rc21和Rd21，连同它们均与之连接的N原子一起，形成4、5、6或7元杂环烷基或者5元杂芳基，各自任选地由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：C1-6烷基、卤素、CN、ORa22、SRa22、C(O)Rb22、C(O)NRc22Rd22、C(O)ORa22、OC(O)Rb22、OC(O)NRc22Rd22、NRc22Rd22、NRc22C(O)Rb22、NRc22C(O)NRc22Rd22、NRc22C(O)ORa22、C(＝NRe22)NRc22Rd22、NRc22C(＝NRe22)NRc22Rd22、S(O)Rb22、S(O)NRc22Rd22、S(O)2Rb22、NRc22S(O)2Rb22、S(O)2NRc22Rd22和氧代；
Ra22、Rb22、Rc22和Rd22各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、苯基、C3-7环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-C1-3烷基、5-6元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-7元杂环烷基-C1-3烷基，其中形成Ra22、Rb22、Rc22和Rd22的所述C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、苯基、C3-7环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-C1-3烷基、5-6元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-7元杂环烷基-C1-3烷基，各自任选地由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：OH、CN、氨基、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基和氧代；
或者连接至同一N原子的Rc22和Rd22，连同它们均与之连接的N原子一起，形成4、5、6或7元杂环烷基或者5元杂芳基，其各自是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：OH、CN、氨基、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基和氧代；
Re21和Re22各自独立地为H、CN或NO2；
Cy3A是未取代或取代的C6-10芳基、或者未取代或取代的5-10元杂芳基；其中形成Cy3A的5-10元杂芳基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；其中形成Cy3A的取代的C6-10芳基或取代的5-10元杂芳基由1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy3A、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、C(＝NORa31)NRc31Rd31、C(＝NOC(O)Rb31)NRc31Rd31、C(＝NRe31)NRc31C(O)ORa31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代；
每个RCy3A独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基，其中形成RCy3A的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2、3或4个杂原子组成，其中形成RCy3A的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代，并且其中形成RCy3A的每个C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代；
R31为H或C1-6烷基、C6-10芳基-C1-6烷基或5-10元杂芳基-C1-6烷基，其中形成R31的C1-6烷基是未取代的，或者被独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代，并且其中形成R31的C6-10芳基-C1-6烷基或5-10元杂芳基-C1-6烷基是未取代的，或者被独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代；
R32为H或C1-6烷基；或
R31和R32连同它们与之连接的基团一起形成4-6元杂环烷基环；
R33为Cy3B、(CR33AR33B)n33Cy3B、(C1-6亚烷基)Cy3B、(C2-6亚烯基)Cy3B或(C2-6亚炔基)Cy3B，其中R35的C1-6亚烷基、C2-6亚烯基或C2-6亚炔基组分是未取代的，或者被1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代；
每个R33A独立地为H或C1-6烷基；
每个R33B独立地为H或C1-6烷基；或
或者附着至同一碳原子的R33A和R33B，不依赖于任何其它R33A和R33B基团，一起可以形成–(CH2)2-5-，从而形成3-6元环烷基环；或
n33为0、1、2或3；
Cy3B为未取代或取代的C6-10芳基、未取代或取代的5-10元杂芳基、未取代或取代的C3-10环烷基、或者未取代或取代的4-10元杂环烷基；其中形成Cy3B的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；和
其中形成Cy3B的取代的C6-10芳基、取代的5-10元杂芳基、取代的C3-10环烷基或取代的4-10元杂环烷基由1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy3B、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、C(＝NORa31)NRc31Rd31、C(＝NOC(O)Rb31)NRc31Rd31、C(＝NRe31)NRc31C(O)ORa31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代；
其中每个RCy3B独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基，其中形成RCy3B的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；其中形成RCy3B的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代；并且其中形成RCy3B的每个C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代；
R34选自H和C1-6烷基；
R35选自H、取代或取代的C1-6烷基和Cy3C，其中形成R35的取代的C1-6烷基由选自以下的1、2、3、4或5个取代基取代：Cy3C、卤素、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代；条件是R35的不多于一个取代基是Cy3C；
Cy3C为未取代或取代的C6-10芳基、未取代或取代的5-10元杂芳基、未取代或取代的C3-10环烷基、或者未取代或取代的4-10元杂环烷基；其中形成Cy3C的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；和
其中形成Cy3C的取代的C6-10芳基、取代的5-10元杂芳基、取代的C3-10环烷基或取代的4-10元杂环烷基由1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy3C、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、C(＝NORa31)NRc31Rd31、C(＝NOC(O)Rb31)NRc31Rd31、C(＝NRe31)NRc31C(O)ORa31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代；
其中每个RCy3C独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基，其中形成RCy3C的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；其中形成RCy3C的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代；并且其中形成RCy3C的每个C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa31、SRa31、C(O)Rb31、C(O)NRc31Rd31、C(O)ORa31、OC(O)Rb31、OC(O)NRc31Rd31、NRc31Rd31、NRc31C(O)Rb31、NRc31C(O)NRc31Rd31、NRc31C(O)ORa31、C(＝NRe31)NRc31Rd31、NRc31C(＝NRe31)NRc31Rd31、S(O)Rb31、S(O)NRc31Rd31、S(O)2Rb31、NRc31S(O)2Rb31、S(O)2NRc31Rd31和氧代；
R36选自H和C1-6烷基；
Ra31、Rb31、Rc31和Rd31各自独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-7环烷基、5-10元杂芳基、4-10元杂环烷基、C6-10芳基-C1-3烷基、5-10元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-10元杂环烷基-C1-3烷基，其中形成Ra31、Rb31、Rc31和Rd31的所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-7环烷基、5-10元杂芳基、4-10元杂环烷基、C6-10芳基-C1-3烷基、5-10元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-10元杂环烷基-C1-3烷基，各自任选地由独立地选自以下的1、2、3、4或5个取代基取代：C1-6烷基、卤素、CN、ORa32、SRa32、C(O)Rb32、C(O)NRc32Rd32、C(O)ORa32、OC(O)Rb32、OC(O)NRc32Rd32、NRc32Rd32、NRc32C(O)Rb32、NRc32C(O)NRc32Rd32、NRc32C(O)ORa32、C(＝NRe32)NRc32Rd32、NRc32C(＝NRe32)NRc32Rd32、S(O)Rb32、S(O)NRc32Rd32、S(O)2Rb32、NRc32S(O)2Rb32、S(O)2NRc32Rd32和氧代；
或者连接至同一N原子的Rc31和Rd31，连同它们均与之连接的N原子一起，形成4、5、6或7元杂环烷基或者5元杂芳基，各自任选地由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：C1-6烷基、卤素、CN、ORa32、SRa32、C(O)Rb32、C(O)NRc32Rd32、C(O)ORa32、OC(O)Rb32、OC(O)NRc32Rd32、NRc32Rd32、NRc32C(O)Rb32、NRc32C(O)NRc32Rd32、NRc32C(O)ORa32、C(＝NRe32)NRc32Rd32、NRc32C(＝NRe32)NRc32Rd32、S(O)Rb32、S(O)NRc32Rd32、S(O)2Rb32、NRc32S(O)2Rb32、S(O)2NRc32Rd32和氧代；
Ra32、Rb32、Rc32和Rd32各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、苯基、C3-7环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-C1-3烷基、5-6元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-7元杂环烷基-C1-3烷基，其中形成Ra32、Rb32、Rc32和Rd32的所述C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、苯基、C3-7环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-C1-3烷基、5-6元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-7元杂环烷基-C1-3烷基，各自任选地由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：OH、CN、氨基、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基和氧代；
或者连接至同一N原子的Rc32和Rd32，连同它们均与之连接的N原子一起，形成4、5、6或7元杂环烷基或者5元杂芳基，其各自是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：OH、CN、氨基、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基和氧代；和
Re31和Re32各自独立地为H、CN或NO2；
Cy4A是未取代或取代的C6-10芳基、或者未取代或取代的5-10元杂芳基；其中形成Cy4A的5-10元杂芳基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；其中形成Cy4A的取代的C6-10芳基或取代的5-10元杂芳基由1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy4A、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、C(＝NORa41)NRc41Rd41、C(＝NOC(O)Rb41)NRc41Rd41、C(＝NRe41)NRc41C(O)ORa41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代；
每个RCy4A独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基，其中形成RCy4A的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2、3或4个杂原子组成，其中形成RCy4A的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代，并且其中形成RCy4A的每个C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代；
R41为H或C1-6烷基、C6-10芳基-C1-6烷基或5-10元杂芳基-C1-6烷基，其中形成R41的C1-6烷基是未取代的，或者被独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代，并且其中形成R41的C6-10芳基-C1-6烷基或5-10元杂芳基-C1-6烷基是未取代的，或者被独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代；
R42为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或Cy4B；其中形成R42的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基是未取代的，或者被选自以下的1、2、3、4或5个取代基取代：Cy4B、卤素、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代；条件是不多于一个取代基是Cy4B；
Cy4B是未取代或取代的C6-10芳基、未取代或取代的5-10元杂芳基、未取代或取代的C3-10环烷基、或者未取代或取代的4-10元杂环烷基；其中形成Cy4B的5-10元杂芳基、或者未取代或取代的4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；并且其中形成Cy4B的取代的C6-10芳基、取代的5-10元杂芳基、取代的C3-10环烷基或4-10元杂环烷基由1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy4B、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、C(＝NORa41)NRc41Rd41、C(＝NOC(O)Rb41)NRc41Rd41、C(＝NRe41)NRc41C(O)ORa41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代；
其中每个RCy4B独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基，其中形成RCy4B的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成，并且其中形成RCy4B的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代；并且形成RCy4B的每个C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代；
或者R41和R42连同它们与之连接的原子、以及连接R41和R42与之连接的原子的氮原子一起形成4-7元杂环烷基环；其任选地进一步被1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy4B、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、C(＝NORa41)NRc41Rd41、C(＝NOC(O)Rb41)NRc41Rd41、C(＝NRe41)NRc41C(O)ORa41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代；
R43为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或Cy4C；其中形成R43的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基是未取代的，或者被1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自：选自以下的0、1、2、3、4或5个取代基：Cy4C、卤素、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代，条件是形成R43的C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基的不多于一个取代基是Cy4C；
Cy4C为未取代或取代的C6-10芳基、未取代或取代的5-10元杂芳基、未取代或取代的C3-10环烷基、或者未取代或取代的4-10元杂环烷基；其中形成Cy4B的5-10元杂芳基、或者未取代或取代的4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成；并且其中形成Cy4C的取代的C6-10芳基、取代的5-10元杂芳基、取代的C3-10环烷基或4-10元杂环烷基由1、2、3、4或5个取代基取代，所述取代基各自独立地选自RCy4C、卤素、C1-6卤代烷基、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、C(＝NORa41)NRc41Rd41、C(＝NOC(O)Rb41)NRc41Rd41、C(＝NRe41)NRc41C(O)ORa41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代；
每个RCy4C独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基，其中形成RCy4C的5-10元杂芳基或4-10元杂环烷基的环原子由碳原子以及选自O、N和S的1、2或3个杂原子组成，其中形成RCy4C的每个C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的 1、2或3个取代基取代：卤素、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代；并且其中形成每个RCy4A的每个C6-10芳基、5-10元杂芳基、C3-10环烷基和4-10元杂环烷基独立地是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、CN、ORa41、SRa41、C(O)Rb41、C(O)NRc41Rd41、C(O)ORa41、OC(O)Rb41、OC(O)NRc41Rd41、NRc41Rd41、NRc41C(O)Rb41、NRc41C(O)NRc41Rd41、NRc41C(O)ORa41、C(＝NRe41)NRc41Rd41、NRc41C(＝NRe41)NRc41Rd41、S(O)Rb41、S(O)NRc41Rd41、S(O)2Rb41、NRc41S(O)2Rb41、S(O)2NRc41Rd41和氧代；
Ra41、Rb41、Rc41和Rd41各自独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-7环烷基、5-10元杂芳基、4-10元杂环烷基、C6-10芳基-C1-3烷基、5-10元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-10元杂环烷基-C1-3烷基，其中形成Ra41、Rb41、Rc41和Rd41的所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-7环烷基、5-10元杂芳基、4-10元杂环烷基、C6-10芳基-C1-3烷基、5-10元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-10元杂环烷基-C1-3烷基，各自任选地由独立地选自以下的1、2、3、4或5个取代基取代：C1-6烷基、卤素、CN、ORa42、SRa42、C(O)Rb42、C(O)NRc42Rd42、C(O)ORa42、OC(O)Rb42、OC(O)NRc42Rd42、NRc42Rd42、NRc42C(O)Rb42、NRc42C(O)NRc42Rd42、NRc42C(O)ORa42、C(＝NRe42)NRc42Rd42、NRc42C(＝NRe42)NRc42Rd42、S(O)Rb42、S(O)NRc42Rd42、S(O)2Rb42、NRc42S(O)2Rb42、S(O)2NRc42Rd42和氧代；
或者连接至同一N原子的Rc41和Rd41，连同它们均与之连接的N原子一起，形成4、5、6或7元杂环烷基或者5元杂芳基，各自任选地由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：C1-6烷基、卤素、CN、ORa42、SRa42、C(O)Rb42、C(O)NRc42Rd42、C(O)ORa42、OC(O)Rb42、OC(O)NRc42Rd42、NRc42Rd42、NRc42C(O)Rb42、NRc42C(O)NRc42Rd42、NRc42C(O)ORa42、C(＝NRe42)NRc42Rd42、NRc42C(＝NRe42)NRc42Rd42、S(O)Rb42、S(O)NRc42Rd42、S(O)2Rb42、NRc42S(O)2Rb42、S(O)2NRc42Rd42和氧代；
Ra42、Rb42、Rc42和Rd42各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、苯基、C3-7环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-C1-3烷基、5-6元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-7元杂环烷基-C1-3烷基，其中形成Ra42、Rb42、Rc42和Rd42的所述C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、苯基、C3-7环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-C1-3烷基、5-6元杂芳基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基和4-7元杂环烷基-C1-3烷基，各自任选地由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：OH、CN、氨基、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基和氧代；
或者连接至同一N原子的Rc42和Rd42，连同它们均与之连接的N原子一起，形成4、5、6或7元杂环烷基或者5元杂芳基，其各自是未取代的，或者由独立地选自以下的1、2或3个取代基取代：OH、CN、氨基、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基和氧代；和
Re41和Re42各自独立地为H、CN或NO2。
在一些实施方案中，小分子是化合物式(VA)或(VB)：
其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐；
其中：
A1为选自–(C＝NH)–、–(C＝NORa)–、–[C＝NO(C＝O)Ra]–、–[C＝N[O(C＝O)ZRb]}–、稠合的5或6元杂环基和稠合的5或6元杂芳基的成员；
当A1为–(C＝NH)–时，Y1选自–NH2、–NH(C＝O)Ra和–NH(C＝O)ZRb；
当A1为–(C＝NORa)–、–[C＝NO(C＝O)Ra]–或–{C＝N[O(C＝O)ZRb]}–时，Y1为–NH2；
当A1为稠合的杂环基或杂芳基时，Y1为–NH2或卤素，并且A1由m个另外的R1基团取代；
每个Ra和Rb独立地选自C1-C6烷基、C3-C10环烷基、C6-C10芳基和C7-C12芳基烷基；其中Ra具有选自以下的m个取代基：C1-C6烷基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、C2-C9烷氧基烷基、氨基、C1-C6烷基氨基和卤素；或者，可替代地，Ra和Rb连接，以形成具有选自C1-C6烷基、羟基、C1-C6烷氧基和卤素的m个取代基的杂环基环；
每个Z独立地选自O和S；
A2为选自C3-C6杂芳基、C6芳基和C2-C6烷基的成员；
当A2为C3-C6杂芳基时，Y2选自–NH2、–CH2NH2、氯、–(C＝NH)NH2、–(C＝NH)NH(C＝O)Ra、–(C＝NH)NH(C＝O)ZRb、–(C＝NORa)NH2、–[C＝NO(C＝O)Ra]NH2和–{C＝N[O(C＝O)ZRb]}NH2；并且A2由m个另外的R1基团取代；
当A2为C6芳基时，Y2选自氨基甲基、羟基和卤素，并且A2由m个另外的R1基团取代；
当A2为C2-C6烷基时，Y2选自–NH(C＝NH)NH2、–NH(C＝NH)NH(C＝O)Ra和–NH(C＝NH)NH(C＝O)ZRb；
每个R1为独立地选自C1-C6烷基、羟基、C1-C6烷氧基、氨基、C1-C6烷基氨基和卤素的成员；
每个m和n为独立地选自0至3的整数；
L为–(O)p–(C(R2a)(R2b))q–，
每个R2a或R2b为独立地选自氢和氟的成员；
p为0至1的整数；
q为1至2的整数；
R3为选自氢、C1-C6烷基、C1-C6氟烷基和羧基(C1-C6烷基)的成员；或者，可替代地，R3和R4连接，以形成氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环；或
R4为选自氢和C1-C6烷基的成员；或者，可替代地，R3和R4连接，以形成氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环；
R5为选自C3-C7环烷基、C4-C8环烷基烷基、杂芳基和具有0至3个R13取代基的C7-C12芳基烷基或杂芳基烷基的成员；或者，可替代地，R5和R6连接，以形成具有0至3个R13取代基的杂环；
R6为选自氢、C1-C6烷基、C3-C7环烷基、羧基(C1-C6烷基)、具有0至3个R13取代基的C7-C12芳基烷基或杂芳基烷基、氨基(C1-C8烷基)；和酰氨基(C1-C8烷基)的成员；或者，可替代地，R5和R6连接，以形成具有0至3个R13取代基的杂环；和
每个R13为独立地选自C1-C6烷基、C6-C10芳基、(C6-C10芳基)C1-C6烷基、羧基(C1-C6烷氧基)、杂芳基、(C6-C10杂芳基)C1-C6烷基、杂环基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、C2-C9烷氧基烷基、氨基、C1-C6酰氨基、C1-C6烷基氨基和卤素的成员；或者，可替代地，两个R13基团连接，以形成稠合的C6-C10芳基、C6-C10杂芳基或C5-C7环烷基环。
在一些实施方案中，小分子是式(VIA)或(VIB)的化合物：
其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐；
其中：
A1为选自–(C＝NH)–、–(C＝NORa)–、–[C＝NO(C＝O)Ra]–、–[C＝N[O(C＝O)ZRb]]–、稠合的5或6元杂环基和稠合的5或6元杂芳基的成员；
当A1为–(C＝NH)–时，Y1选自–NH2、–NH(C＝O)Ra和–NH(C＝O)ZRb；
当A1为–(C＝NORa)–、–[C＝NO(C＝O)Ra]–或–{C＝N[O(C＝O)ZRb]}–时，Y1为–NH2；
当A1为稠合的杂环基或杂芳基时，Y1为–NH2或卤素，并且A1由m个另外的R1基团取代；
每个Ra和Rb独立地选自C1-C6烷基、C3-C10环烷基、C6-C10芳基和C7-C12芳基烷基；其中Ra具有选自以下的m个取代基：C1-C6烷基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、C2-C9烷氧基烷基、氨基、C1-C6烷基氨基和卤素；或者，可替代地，Ra和Rb连接，以形成具有选自C1-C6烷基、羟基、C1-C6烷氧基和卤素的m个取代基的杂环基环；
每个Z独立地选自O和S；
A2为选自C3-C6杂芳基和C2-C6烷基的成员；
当A2为C3-C6杂芳基时，Y2选自–NH2、–CH2NH2、氯、–(C＝NH)NH2、–(C＝NH)NH(C＝O)Ra、–(C＝NH)NH(C＝O)ZRb、–(C＝NORa)NH2、–[C＝NO(C＝O)Ra]NH2和–{C＝N[O(C＝O)ZRb]}NH2；并且A2由m个另外的R1基团取代；
当A2为C2-C6烷基时，Y2选自–NH(C＝NH)NH2、–NH(C＝NH)NH(C＝O)Ra和–NH(C＝NH)NH(C＝O)ZRb；
每个R1为独立地选自C1-C6烷基、羟基、C1-C6烷氧基、氨基、C1-C6烷基氨基和卤素的成员；
每个m和n为独立地选自0至3的整数；
X和X2各自为选自NR8、CH和CR10的成员；
每个R8为独立地选自氢和C1-C6烷基的成员；
每个R10为独立地选自C1-C6烷基、具有0至3个R13取代基的杂芳基或C6-C10芳基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、C2-C9烷氧基烷基、氨基、C1-C6烷基氨基和卤素的成员；或者，可替代地，两个R10基团连接，以形成具有0至3个R13取代基的稠合的C6芳基、杂芳基或C5-C7环烷基环；或
r是0至4的整数；和
每个R13为独立地选自C1-C6烷基、C6-C10芳基、羧基(C1-C6烷氧基)、杂芳基、杂环基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、C2-C9烷氧基烷基、氨基、C1-C6酰氨基、C1-C6烷基氨基和卤素的成员；或者，可替代地，两个R13基团连接，以形成稠合的C6-C10芳基、C6-C10杂芳基或C5-C7环烷基环。
在某些具体实施方案中，小分子是式(VIIA)或(VIIB)的化合物：
其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐；
其中：
A1为选自–(C＝NH)–、–(C＝NORa)–、–[C＝NO(C＝O)Ra]–、–[C＝N[O(C＝O)ZRb]}–、稠合的5或6元杂环基和稠合的5或6元杂芳基的成员；
当A1为–(C＝NH)–时，Y1选自–NH2、–NH(C＝O)Ra和–NH(C＝O)ZRb；
当A1为–(C＝NORa)–、–[C＝NO(C＝O)Ra]–或–{C＝N[O(C＝O)ZRb]}–时，Y1为–NH2；
当A1为稠合的杂环基或杂芳基时，Y1为–NH2或卤素，并且A1由m个另外的R1基团取代；
每个Ra和Rb独立地选自C1-C6烷基、C3-C10环烷基、C6-C10芳基和C7-C12芳基烷基；其中Ra具有选自以下的m个取代基：C1-C6烷基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、C2-C9烷氧基烷基、氨基、C1-C6烷基氨基和卤素；或者，可替代地，Ra和Rb连接，以形成具有选自C1-C6烷基、羟基、C1-C6烷氧基和卤素的m个取代基的杂环基环；
每个Z独立地选自O和S；
A2为选自C3-C6杂芳基和C2-C6烷基的成员；
当A2为C3-C6杂芳基时，Y2选自–NH2、–CH2NH2、氯、–(C＝NH)NH2、–(C＝NH)NH(C＝O)Ra、–(C＝NH)NH(C＝O)ZRb、–(C＝NORa)NH2、–[C＝NO(C＝O)Ra]NH2和–{C＝N[O(C＝O)ZRb]}NH2；并且A2由m个另外的R1基团取代；
当A2为C2-C6烷基时，Y2选自–NH(C＝NH)NH2、–NH(C＝NH)NH(C＝O)Ra和–NH(C＝NH)NH(C＝O)ZRb；
每个R1为独立地选自C1-C6烷基、羟基、C1-C6烷氧基、氨基、C1-C6烷基氨基和卤素的成员；
每个m和n为独立地选自0至3的整数；
L为–(O)p–(C(R2a)(R2b))q–，
每个R2a或R2b为独立地选自氢和氟的成员；
p为0至1的整数；
q为1至2的整数；
R3为选自氢、C1-C6烷基和羧基(C1-C6烷基)的成员；
每个R11为独立地选自C1-C6烷基、羟基、C1-C6烷氧基、氨基、C1-C6烷基氨基、卤素基和(R14)(R14)N(CO)-的成员；或者，可替代地，两个R11基团连接，以形成具有0至3个R13取代基的稠合的C6芳基、杂芳基或C5-C7环烷基环；或
r为0至4的整数；和
每个Z为独立地选自O和NR8的成员；
每个R8为独立地选自氢和C1-C6烷基的成员；
每个R12为独立地选自氢、具有0至3个R13取代基的C1-C6烷基和C7-C14芳基烷基的成员；
每个R13为独立地选自C1-C6烷基、羟基、羟基(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、C2-C9烷氧基烷基、氨基、C1-C6烷基氨基和卤素的成员；或者，可替代地，两个R13基团连接，以形成稠合的C6芳基、杂芳基或C5-C7环烷基环；和
每个R14为独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C7环烷基、C4-C8环烷基烷基、C7-C14芳基烷基和杂芳基(C1-C6烷基)的成员；或者，可替代地，两个R13基团连接，以形成稠合的杂环基环。
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
R1为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R2a、R2b、R2c和R2d独立地选自氢、卤素、C(＝O)OR5、OC(＝O)R5、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷氧基、氰基、氨基烷基、羧基烷基、NR5R6、C(＝O)NR5R6、N(R5)C(＝O)R6、NR5C(＝O)NR6、S(O)t、SR5、硝基、N(R5)C(O)OR6、C(＝NR5)NR6R7、N(R5)C(＝NR6)NR7R8、S(O)R5、S(O)NR5R6、S(O)2R5、N(R5)S(O)2R6、S(O)2NR5R6、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基和氧代，条件是R2a、R2b、R2c或R2d的至少一次出现不是氢；
R3为NR3aR3b；
R3a和R3b各自独立地为氢、烷基、羟烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、杂环基、杂芳基、杂环基烷基、杂芳基烷基、环烷基、(CH2)nC(＝O)OR6或(CH2)nP(＝O)(OR6)2；
或者R3a和R3b连同它们与之连接的氮一起，形成任选取代的4-7元杂芳基或任选取代的4-7元杂环基；
或者R3a和R4连同它们与之连接的氮和碳一起，分别地形成任选取代的4-7元杂环基；
当n为2、3、4、5或6时，R4为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；或
当n为0或1时，R4为取代或未取代的单环杂芳基、或者取代或未取代的杂环基；
在每次出现时，R5、R6、R7和R8独立地为氢、烷基、羟烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、羧基烷基、杂环基、杂芳基或环烷基；
X为直接键、-CR2eR2f-或-CR2eR2f-CR2gR2h-；
Y为直接键或-CR2iR2j-；
n为0-6的整数；和
t为1-3。
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
R1为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R2a、R2b、R2c、R2d独立地选自氢、卤素、OR5、C(＝O)OR5、OC(＝O)R5、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷氧基、氰基、氨基烷基、羧基烷基、NR5R6、C(＝O)NR5R6、N(R5)C(＝O)R6、NR5C(＝O)NR6、S(O)t、SR5、硝基、N(R5)C(O)OR6、C(＝NR5)NR6R7、N(R5)C(＝NR6)NR7R8、S(O)R5、S(O)NR5R6、S(O)2R5、N(R5)S(O)2R6、S(O)2NR5R6、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基和氧代，条件是R2a、R2b、R2c、R2d的至少一次出现不是氢；
R3为NR3aR3b；
R3a和R3b各自独立地为氢、烷基、羟烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、-CH2C(C＝O)OH、-CH2C(＝O)O烷基、杂环基、杂芳基、杂环基烷基、杂芳基烷基或环烷基；
或者R3a和R3b连同它们与之连接的氮一起，形成任选取代的4-7元杂芳基或任选取代的4-7元杂环基；
当n为2、3、4、5或6时，R4为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；或
当n为0或1时，R4为取代或未取代的单环杂芳基、或者取代或未取代的杂环基；
在每次出现时，R5、R6、R7和R8独立地为氢、烷基、羟烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、羧基烷基、杂环基、杂芳基或环烷基；
X为直接键、-[C(R2e)R2f]-或-[C(R2e)R2f]-[C(R2g)R2h]-；
Y为直接键或-[C(R2i)R2j]-；
n为0-6的整数；和
t为1-3，
条件是：
a)当R2a、R2b、R2c、R2d的一次出现为OH时，R1不具有下述结构：
b)当R2a、R2b、R2c、R2d的一次出现为-OH时，n为2-6的整数；和
c)当R2a、R2b、R2c、R2d的一次出现为未取代的苯基时，R3a和R3b均不具有下述结构：
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
R17为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R18a、R18b独立地选自氢、卤素、-OR21、C(＝O)OR21、OC(＝O)R21、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷氧基、氰基、氨基烷基、羧基烷基、NR21R22、C(＝O)NR21R22、N(R21)C(＝O)R22、NR21C(＝O)NR22、S(O)t、SR21、硝基、N(R21)C(O)OR22、C(＝NR21)NR22R23、N(R21)C(＝NR22)NR23R24、S(O)R21、S(O)NR21R22、S(O)2R21、N(R21)S(O)2R22、S(O)2NR21R22、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基和氧代，条件是R18a、R18b的至少一次出现不是氢；
R19为NR19aR19b；
R19a和R19b各自独立地为氢、烷基、羟烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、杂环基、杂芳基、杂环基烷基、杂芳基烷基、环烷基、(CH2)nC(＝O)OR5或(CH2)nP(＝O)(OR5)2；
或者R19a和R19b连同它们与之连接的氮一起，形成任选取代的4-7元杂芳基或任选取代的4-7元杂环基；
R20为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
在每次出现时，R21、R22、R23和R24独立地为氢、烷基、羟烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、羧基烷基、杂环基、杂芳基或环烷基；
X为直接键、-CR2eR2f-或-CR2eR2f-CR2gR2h-；
Y为直接键或-CR2iR2j-；
Z为O或S；
m为0-6的整数；和
t为1-3。
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
R25为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R26a、R26b独立地选自氢、卤素、-OR29、C(＝O)OR29、OC(＝O)R29、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷氧基、氰基、氨基烷基、羧基烷基、NR29R30、C(＝O)NR29R30、N(R29)C(＝O)R30、NR29C(＝O)NR30、S(O)t、SR29、硝基、N(R29)C(O)OR30、C(＝NR29)NR30R31、N(R29)C(＝NR30)NR31R32、S(O)R29、S(O)NR29R30、S(O)2R30、N(R29)S(O)2R30、S(O)2NR29R30、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基和氧代，条件是R26a、R26b的至少一次出现不是氢；
R27为NR27aR27b；
R27a和R27b各自独立地为氢、烷基、羟烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、杂环基、杂芳基、杂环基烷基、杂芳基烷基、环烷基、(CH2)nC(＝O)OR29或(CH2)nP(＝O)(OR29)2；
或者R27a和R27b连同它们与之连接的氮一起，形成任选取代的4-7元杂芳基或任选取代的4-7元杂环基；
R28为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
在每次出现时，R29、R30、R31和R32独立地为氢、烷基、羟烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、羧基烷基、杂环基、杂芳基或环烷基；
X为直接键或-CR26cR26d-；
p为0-6的整数；和
t为1-3。
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
R1为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R2为氢、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基或环烷基；
R3为氢、烷基、卤代烷基或环烷基；
或者R2和R3连同它们与之连接的碳和氮一起，分别地形成任选取代的4-7元杂环基；
R4为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R5a为氢、烷基、卤代烷基、环烷基、膦烷基、(CH2)nC(＝O)OR6、C(＝O)R6、C(＝O)OR6或C(＝O)NR6R7；
R5b为电子对或烷基；
在每次出现时，R6和R7独立地为氢、烷基、卤代烷基、环烷基或芳基烷基；
R8为烷基、卤代烷基、氨基烷基、取代或未取代的芳基烷基；和
n为1、2、3、4、5、6、7或8，
条件是
A)R5a为烷基、卤代烷基、环烷基、膦烷基、(CH2)nC(＝O)OR6、C(＝O)R6、C(＝O)OR6或C(＝O)NR6R7，或R1由选自取代的杂芳基、C(＝NH)NHC(＝O)OR8、C(＝NOC(＝O)R8)NH2、C(＝NOC(＝O)OR8)NH2和C(＝NOH)NH2的一个或多个取代基取代；和
B)当R5a为烷基或(CH2)nC(＝O)OR6时，R1不具有下述结构：
除非R2和R3连同它们与之连接的碳和氮一起，分别地形成任选取代的4-7元杂环基。
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
R1为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R2为氢、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基或环烷基；
R3为氢、烷基、卤代烷基或环烷基；
或者R2和R3连同它们与之连接的碳和氮一起，分别地形成任选取代的4-7元杂环基；
R4为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R5a为氢、烷基、卤代烷基、环烷基、膦烷基、(CH2)nC(＝O)OR6、C(＝O)R6、C(＝O)OR6或C(＝O)NR6R7；
R5b为电子对或烷基；
在每次出现时，R6和R7独立地为氢、烷基、卤代烷基、环烷基或芳基烷基；
R8为烷基、卤代烷基、氨基烷基、取代或未取代的芳基烷基；和
n为1、2、3、4、5、6、7或8，
条件是
A)R5a为烷基、卤代烷基、环烷基、膦烷基、(CH2)nC(＝O)OR6、C(＝O)R6、C(＝O)OR6或C(＝O)NR6R7，或R1由选自取代的杂芳基、C(＝NH)NHC(＝O)OR8、C(＝NOC(＝O)R8)NH2、C(＝NOC(＝O)OR8)NH2和C(＝NOH)NH2的一个或多个取代基取代；和
B)该化合物不具有下述结构之一：
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
R1为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R2为氢、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基或环烷基；
R3为氢、烷基、卤代烷基或环烷基；
或者R2和R3连同它们与之连接的碳和氮一起，分别地形成任选取代的4-7元杂环基；
R4为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
在每次出现时，R5a和R5b独立地具有下述结构之一：
或者R5a和R5b连同它们与之连接的磷原子一起，形成任选取代的4-7元杂环基；
R6a为烷基、卤代烷基、芳基、杂芳基、环烷基或杂环基；
在每次出现时，R6b独立地为氢或烷基；
在每次出现时，R7独立地为烷基、卤代烷基、杂芳基、环烷基、杂环基、芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基烷基或杂环基烷基；
R8为氨基酸侧链；和
n为1、2、3、4、5、6、7或8。
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
代表双键或单键；
R1为取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R2为氢、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟烷基、卤代烷氧基或环烷基；
R3为氢、烷基、卤代烷基或环烷基，或者R2和R3连同它们与之连接的碳和氮一起，分别地形成任选取代的4-7元杂环基；
R4为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R5为氢、烷基、卤代烷基、环烷基、膦烷基、(CH2)mC(＝O)OR6、C(＝O)R6、C(＝O)OR6、(CH2)mNR6S(O)2R7或C(＝O)NR6R7；
在每次出现时，R6和R7独立地为氢、烷基、卤代烷基、环烷基或芳基烷基；
L1为直接键、-CR8aR8b-、-S(O)t-、NR8c或-O-；
R8a和R8b各自独立地为氢、烷基，或者R8a和R8b连同它们与之连接的碳一起，形成任选取代的3-6元环烷基；
R8c为氢、烷基、卤代烷基、(C＝O)烷基、(C＝O)O烷基、(C＝O)环烷基、(C＝O)O环烷基、(C＝O)芳基、(C＝O)O芳基、(C＝O)杂芳基、(C＝O)O杂芳基、(C＝O)杂环基、(C＝O)O杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的环烷基烷基、或者取代或未取代的杂环基烷基；
n为1或2；
m为1、2、3、4、5或6；和
t为0、1或2。
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
R1为取代或未取代的杂芳基；
R2为取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R3为氢或烷基；
R4为烷基、取代或未取代的芳基烷基、由选自取代或未取代的苯基或者取代或未取代的吡啶基的取代基取代的杂环基，或者R3和R4连同它们与之连接的氮和碳一起，分别地形成任选取代的4-10元杂环基；
R5a为氢或卤素；
R5b为氢、烷基、卤代烷基、(C＝O)烷基、(C＝O)O烷基、(C＝O)环烷基、(C＝O)O环烷基、(C＝O)芳基、(C＝O)O芳基、(C＝O)杂芳基、(C＝O)O杂芳基、(C＝O)杂环基、(C＝O)O杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的环烷基烷基、或者取代或未取代的杂环基烷基；
L1为直接键、-CH2-、-S(O)t-、NR5b、-O-、-C＝C-或-C≡C-；和
t为0、1或2，
条件是：
A)R2不具有下述结构之一：
B)R1不具有下述结构之一：
和
C)当R2为未取代的苯基时，R1不具有下述结构之一：
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
R6为取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R7为烷基、-SR10、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R8为氢、烷基、卤代烷基或环烷基；
R9为取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基，或者R8和R9连同它们与之连接的氮一起，形成任选取代的4-10元杂环基；
R10为氢、烷基、卤代烷基或环烷基；
条件是：
A)当R7为未取代的苯基、3-((甲基磺酰基)氨基)苯基、2-甲基苯基、3-(二甲基氨基)苯基、3-(甲基氨基)苯基、3-甲基苯基、3-氨基甲基苯基、3-氨基苯基、未取代的吡啶基、3-(甲基氨基)-2-噻吩基、3,4-二氨基-2-噻吩基、3-((甲基磺酰基)氨基)-2-噻吩基、3-氨基-2-噻吩基、3-氨基-5-5(氨基羰基)苯基，或具有下述结构之一时：
R6不具有下述结构：
B)当R7为未取代的苯基时，R6不具有下述结构：
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：R11具有下述结构之一：
R12为甲基或卤素；
R13为取代或未取代的芳基；和
n为1或2
条件是：
该化合物不具有下述结构：
在一些实施方案中，小分子是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
R14为取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R15为取代或未取代的芳基烷基、或者取代或未取代的杂芳基烷基；
L2为直接键、-C(＝O)或-S(＝O)t-；和
t为0、1或2。
在一些实施方案中，化合物和/或式的某些特征以组或范围公开。具体地预期此类公开内容包括此类组和范围的成员的每个和每一个个别的子组合。例如，术语"C1-6烷基"和"C1-C6烷基"具体地预期个别地公开了(但不限于)甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
在本说明书的各个地方，描述了定义二价连接基团的变量。具体地预期每个连接取代基包括连接取代基的正向形式和反向形式两者。例如，-NR(CR'R”)n-包括-NR(CR'R”)n-和-(CR'R”)nNR-两者，并且预期个别地公开了每种形式。当结构需要连接基团时，对于该组列出的马库什(Markush)变量应理解为连接基团。例如，如果结构需要连接基团，并且关于该变量的马库什组定义列出“烷基”或“芳基”，则应理解“烷基”或“芳基”分别代表连接亚烷基或亚芳基。
术语“取代的”意指一个原子或一组原子在形式上替换氢作为连接至另一个基团的“取代基”。除非另有说明，否则术语“取代的”指任何取代水平，例如单取代、二取代、三取代、四取代或五取代，当允许此类取代时。取代基是独立地选择的，并且取代可以在任何化学可及的位置处。应理解，在给定原子处的取代受效价的限制。短语“任选地取代的”意指取代或未取代的。术语“取代的”意指氢原子在形式上被去除并且被取代基替换。单个二价取代基，例如氧代，可以替换两个氢原子。
其中n和m为整数的术语"Cn-m"和"Cn-Cm"指示含有n至m个碳原子的基团。实例包括C1-4、C1-6等等。该术语预期明确地公开了范围内的每一个成员，即Cn、Cn+1、Cn+2…Cm-2、Cm-1、Cm。例如，C1-6预期公开了C1、C2、C3、C4、C5和C6。"Cn-m"意欲与"Cn-Cm"相同。
单独或与其它术语组合采用的术语“烷基”指可以是直链或支链的饱和烃基。术语"Cn-m烷基"和"Cn-Cm烷基"指具有n至m个碳原子的烷基。例如，C1-C12指示该基团可以在其中具有1至12个(包括在内)碳原子。如果没有另外说明，则为约1至约20个碳原子的烷基。烷基在形式上对应于具有一个C-H键被替换为烷基与化合物的剩余部分的连接点的烷烃。在一些实施方案中，烷基含有1至6个碳原子、1至4个碳原子、1至3个碳原子或1至2个碳原子。示例性烷基部分包括但不限于化学基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基；较高级的同源物，例如2-甲基-1-丁基、1,1-二甲基丙基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基等等。术语“低级烷基”指在链中具有1-6个碳原子的烷基。“取代的烷基”是由一个或多个取代基取代的烷基。
单独或与其它术语组合采用的术语“烯基”，指对应于具有一个或多个双碳-碳键的烷基的直链或支链烃基。烯基在形式上对应于具有一个C-H键被替换为烯基与化合物的剩余部分的连接点的烯烃。术语"Cn-m烯基"和"Cn-Cm烯基"指具有n至m个碳的烯基。在一些实施方案中，烯基部分含有2至6、2至4、或2至3个碳原子。示例性烯基包括但不限于乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、仲丁烯基等等。
单独或与其它术语组合采用的术语“炔基”，指对应于具有一个或多个三碳-碳键的烷基的直链或支链烃基。炔基在形式上对应于具有一个C-H键被替换为烷基与化合物的剩余部分的连接点的炔烃。术语"Cn-m炔基"和"Cn-Cm炔基"指具有n至m个碳的炔基。示例性炔基包括但不限于乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基等等。在一些实施方案中，炔基部分含有2至6、2至4、或2至3个碳原子。
单独或与其它术语组合采用的术语“亚烷基”指二价烷基连接基团。亚烷基在形式上对应于具有两个C-H键被替换为亚烷基与化合物的剩余部分的连接点的烷烃。术语"Cn-m亚烷基"指具有n至m个碳原子的亚烷基。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基、乙烷-1,2-二基、丙烷-1,3-二基、丙烷-1,2-二基、丁烷-1,4-二基、丁烷-1,3-二基、丁烷-1,2-二基、2-甲基-丙烷-1,3-二基等等。在一些实施方案中，"Cn-m亚烷基"可以指n至m个亚甲基(CH2)基团的链，-(CH2)n-m-，例如-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-等。
单独或与其它术语组合采用的术语“烷氧基”指式-O-烷基的基团，其中烷基如上文定义。术语"Cn-m烷氧基"指其烷基具有n至m个碳的烷氧基。示例性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如正丙氧基和异丙氧基)、叔丁氧基等等。在一些实施方案中，烷基具有1至6、1至4、或1至3个碳原子。
术语“烷氧基烷基”指其中一个或多个氢原子已被烷氧基替换的烷基。术语"Cn-m烷氧基-Cp-q烷基"指被Cn-m烷氧基取代的Cp-q烷基。在一些实施方案中，羟烷基具有一个烷氧基。在一些实施方案中，烷氧基烷基具有一个或两个烷氧基基团，各自在不同的碳原子上。实例可以包括但不限于甲氧基甲基、乙氧基甲基、3-乙氧基乙基和1-甲氧基乙基。
术语“氨基”指式–NH2的基团。
术语“氨基甲酰基”指式–C(O)NH2的基团。
单独或与其它术语组合采用的术语“羰基”指-C(＝O)-基团，其也可以写作C(O)。
术语“氰基”或“腈”指式–C≡N的基团，其也可以写作-CN。
单独或与其它术语组合使用的术语“卤代”或“卤素”指氟、氯、溴和碘。在一些实施方案中，“卤素”指选自F、Cl或Br的卤素原子10。在一些实施方案中，卤素为F。
术语“卤代烷基”指其中一个或多个氢原子已被卤素原子替换的烷基。术语"Cn-m卤代烷基"指具有n至m个碳原子、以及至少一个到至多{2(n至m)+1}个卤素原子的Cn-m烷基，其可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，卤素原子是氟原子。在一些实施方案中，卤代烷基具有1至6或1至4个碳原子。示例性卤代烷基包括CF3、C2F5、CHF2、CCl3、CHCl2、C2Cl5等等。在一些实施方案中，卤代烷基是氟烷基。
单独或与其它术语组合采用的术语“卤代烷氧基”指式-O-卤代烷基的基团，其中卤代烷基如上文定义。术语"Cn-m卤代烷氧基"指其卤代烷基具有n至m个碳的卤代烷氧基。示例性卤代烷氧基包括三氟甲氧基等等。在一些实施方案中，卤代烷氧基具有1至6、1至4、或1至3个碳原子。
术语“羟烷基”指其中一个或多个氢原子已被羟基替换的烷基。术语"Cn-m羟烷基"指具有n至m个碳原子、以及至少一个羟基的Cn-m烷基。在一些实施方案中，羟烷基具有一个醇基。在某些方面，羟烷基具有一个或两个醇基，各自在不同的碳原子上。在某些方面，羟烷基具有1、2、3、4、5或6个醇基。实例可以包括但不限于羟甲基、2-羟乙基和1-羟乙基。
术语“氧代”指作为二价取代基的氧原子，当附着至碳时形成羰基，或者当附着至杂原子时，形成亚砜或砜基或N-氧化物基团。
术语“硫代基(sulfido)”指作为二价取代基的硫原子，当附着至碳时形成硫羰基(C＝S)。
其中n为整数的术语“n元”，通常描述其中成环原子数为n的部分中的成环原子数。其中n和m为整数的术语“n-m元”描述了其中成环原子数为n至m的范围。例如，哌啶基是6元杂环烷基环的实例，吡唑基是5元杂芳基环的实例，吡啶基是6元杂芳基环的实例，而1,2,3,4-四氢萘是10元环烷基的实例。
术语“芳族的”指具有一个或多个多不饱和环的碳环或杂环，所述多不饱和环具有芳族特性(即，具有(4n+2)个离域π(pi)电子，其中n为整数)。
单独或与其它术语组合采用的术语“芳基”，指可以是单环或多环(例如具有2、3或4个稠合环)的芳族烃基。术语"Cn-m芳基"指具有n至m个环碳原子的芳基。芳基包括例如苯基、萘基、蒽基、菲基、茚满基、茚基、并四苯基(tetracenyl)等等。在一些实施方案中，芳基具有6至约20个碳原子、6至约18个碳原子、6至约15个碳原子、或6至约10个碳原子。在一些实施方案中，芳基是苯基。
单独或与其它术语组合采用的术语“芳基烷基”或“芳烷基”或“烷基芳基”指式-亚烷基-芳基的基团，并且指其中至少一个氢已被如本文定义的芳基取代的如本文定义的烷基。在一些实施方案中，芳基烷基是C6-10芳基-C1-3烷基。在一些实施方案中，芳基烷基是C6-10芳基-C1-4烷基。在一些实施方案中，芳基烷基是C6-10芳基-C1-3烷基。在一些实施方案中，芳基烷基是苯基-C1-3烷基。实例包括但不限于苄基、1-苯乙基、4-甲基苄基和1,1,-二甲基-1-苯甲基。在一些实施方案中，芳基烷基是苄基。
单独或与其它术语组合采用的术语“杂芳基”或“杂芳族”，指具有选自硫、氧和氮的至少一个杂原子环成员的单环或多环芳族杂环。其中n为整数的“n元杂芳基”或“n元杂芳族”指具有n个成环原子的杂芳基。其中n和m为整数的“n-m元杂芳基”或“n-m元杂芳族”指具有n至m个成环原子的杂芳基。环中的碳原子数比成环原子数少了杂原子数。因此，在一些实施方案中，n元杂芳基可以具有n-1、n-2、n-3或n-4个环碳原子，而n-m元杂芳基可以具有n-1、n-2、n-3个或n-4个环碳原子至m-1、m-2、m-3或m-4个环碳原子。在一些实施方案中，n-m元杂芳基可以具有1至m-1个环碳原子。在一些实施方案中，杂芳基环具有独立地选自氮、硫和氧的1、2、3或4个杂原子环成员。在一些实施方案中，杂芳基部分中的任何成环N可以是N-氧化物。在一些实施方案中，杂芳基具有5-10个环原子，包括碳原子以及独立地选自氮、硫和氧的1、2、3或4个杂原子环成员。在一些实施方案中，杂芳基具有5-6个环原子以及独立地选自氮、硫和氧的1或2个杂原子环成员。在一些实施方案中，杂芳基是五元或六元杂芳基环。在其它实施方案中，杂芳基是八元、九元或十元稠合双环杂芳基环。示例性杂芳基包括但不限于吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪、吡咯、吡唑、唑基、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、咪唑、呋喃、噻吩、喹啉、异喹啉、萘啶(包括1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-和2,6-萘啶)、吲哚、氮杂吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、苯并异噁唑、苯并咪唑、咪唑并[1,2-b]噻唑、嘌呤、呋咱、三唑、四唑、1,2,4-噻二唑、喹唑啉、酞嗪、咪唑并[1,2-a]吡啶、咪唑并[2,1]-b]噻唑基等等。
五元杂芳基环是具有五个环原子的杂芳基，其中一个或多个(例如1、2或3)环原子独立地选自N、O和S。示例性的五元环杂芳基包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、1,2,3-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-三唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-三唑基、1,3,4-噻二唑基和1,3,4-噁二唑基。
六元杂芳基环是具有六个环原子的杂芳基，其中一个或多个(例如1、2或3)环原子独立地选自N、O和S。示例性的六元环杂芳基是吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基和哒嗪基。
单独或与其它术语组合采用的术语“杂芳基烷基”指式–亚烷基-杂芳基的基团。其中n为整数的术语“n元杂芳基烷基”指其中杂芳基为n元的杂芳基烷基。其中n、m、p和q为整数的术语"n-m元Cp-q-烷基"指这样的杂芳基烷基，其中杂芳基为n至m元的，并且烷基具有p至q个碳原子。在一些实施方案中，杂芳基烷基是5-10元杂芳基-C1-3烷基或C1-9杂芳基-C1-3烷基，其中杂芳基部分是单环或双环的，并且具有独立地选自氮、硫和氧的1、2、3、4或5个杂原子环成员。在一些实施方案中，杂芳基烷基是C1-9杂芳基-C1-4烷基，其中杂芳基部分是单环或双环的，并且具有独立地选自氮、硫和氧的1、2、3或4个杂原子环成员。实例包括吡啶基甲基，例如2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基或4-吡啶基甲基。
单独或与其它术语组合采用的术语“环烷基”指非芳族、饱和、单环、双环或多环烃环系统。该术语包括环化的烷基和烯基。术语"Cn-m环烷基"指具有n至m个环成员碳原子的环烷基。环烷基可以包括单环或多环(例如具有2、3或4个稠环)基团和螺环。环烷基可以具有3、4、5、6或7个成环碳(C3-7)。在一些实施方案中，环烷基具有3至6个环成员、3至5个环成员、或3至4个环成员。在一些实施方案中，环烷基为单环的。在一些实施方案中，环烷基为单环或双环的。在一些实施方案中，环烷基为C3-6单环环烷基。环烷基的成环碳原子可以任选地被氧化，以形成氧代或硫代基团。环烷基还包括环亚烷基。在一些实施方案中，环烷基为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。环烷基的定义中还包括的是具有与环烷基环稠合(即，与之具有共有键)的一个或多个芳环的部分，例如环戊烷、环己烷等等的苯并或噻吩基衍生物。含有稠合芳环的环烷基可以通过任何成环原子，包括稠合芳环的成环原子进行附着。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、4,4-二甲基环己基、环庚基、环戊烯基、环己烯基、环己二烯基、环庚三烯基、降冰片基、降菔基(norpinyl)、降蒈基(norcarnyl)、双环[1.1.1]戊基、双环[2.1.1]己基等等。在一些实施方案中，环烷基为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
单独或与其它术语组合采用的术语“环烷基烷基”指式-亚烷基-环烷基的基团。其中n、m、p和q为整数的术语Cn-m环烷基-Cp-q烷基，指具有n至m个碳原子的环烷基，其附着至具有p至q个碳原子的烷基。在一些实施方案中，环烷基烷基是C3-7环烷基-C1-3烷基，其中环烷基部分是单环或双环的。实例包括环丙基甲基、环丁基甲基、环戊烷甲基和环己基甲基。
单独或与其它术语组合采用的术语“杂环烷基”指非芳族环或环系统，其可以任选地含有一个或多个亚烯基作为环结构的部分，所述环结构具有独立地选自氮、硫和氧的至少一个杂原子环成员。其中n为整数的“n元杂环烷基”指具有n个成环原子的杂芳基。其中n和m为整数的“n-m元杂环烷基”指具有n至m个成环原子的杂环烷基。环中的碳原子数比成环原子数少了杂原子数。因此，在一些实施方案中，n元杂环烷基可以具有n-1、n-2、n-3或n-4个环碳原子，而n-m元杂环烷基可以具有n-1、n-2、n-3个或n-4个环碳原子至m-1、m-2、m-3或m-4个环碳原子。在一些实施方案中，n-m元杂环烷基可以具有1至m-1个环碳原子。在一些实施方案中，杂环烷基具有4-12个环成员、4-10个环成员、4-7个环成员或4-6个环成员。杂环烷基中包括的是单环的4、5、6和7元杂环烷基。杂环烷基可以包括单环或双环(例如，具有两个稠环或桥环)环系统。在一些实施方案中，杂环烷基是具有独立地选自氮、硫和氧的1、2或3个杂原子的单环基团。杂环烷基的成环碳原子和杂原子可以任选地被氧化，以形成氧代或硫代基团或者其它氧化键合(例如C(O)、S(O)、C(S)或S(O)2、N-氧化物等)，或者氮原子可以被季铵化。杂环烷基可以通过成环碳原子或成环杂原子进行附着。在一些实施方案中，杂环烷基含有0至3个双键。在一些实施方案中，杂环烷基含有0至2个双键。杂环烷基的定义中还包括的是具有与杂环烷基环稠合(即，与之具有共有键)的一个或多个芳环的部分，例如哌啶、吗啉、氮杂环庚三烯等的苯并或噻吩基衍生物。含有稠合芳环的杂环烷基可以通过任何成环原子，包括稠合芳环的成环原子进行附着。杂环烷基的实例包括氮杂环丁烷、氮杂环庚烷、二氢苯并呋喃、二氢呋喃、二氢吡喃、吗啉、3-氧杂-9-氮杂螺[5.5]十一烷、1-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷、哌啶、哌嗪、吡喃、吡咯烷、喹核碱、四氢呋喃、四氢吡喃、1,2,3,4-四氢喹啉、莨菪烷和硫代吗啉。
如本文使用的，单独或与其它术语组合采用的术语“杂环烷基烷基”指式-亚烷基-杂环烷基的基团。其中n为整数的术语"n元杂环烷基烷基"指其中杂环烷基为n元的杂芳基烷基烷基。其中n、m、p和q为整数的术语“n元Cp-q-烷基”指这样的杂环烷基烷基，其中杂环烷基为n至m元的，并且烷基具有p至q个碳原子。在一些实施方案中，杂环烷基烷基是4-10元杂环烷基-C1-3烷基或C1-9杂环烷基-C1-3烷基，其中杂环烷基部分是单环或双环的，并且具有独立地选自氮、硫和氧的1、2、3、4或5个杂原子环成员。在一些实施方案中，杂环烷基烷基是C2-9杂环烷基-C1-4烷基或C2-9杂环烷基-C1-3烷基，其中杂环烷基部分是单环或双环的，并且具有独立地选自氮、硫和氧的1、2、3或4个杂原子环成员。
在某些地方，定义或实施方案可以指特定环(例如氮杂环丁烷环、吡啶环等)。除非另有说明，否则这些环可以连接至任何环成员，条件是不超过原子的效价。例如，氮杂环丁烷环可以在环的任何位置处连接，而氮杂环丁烷-3-基环在3位置处连接。
当相同取代基的任何两个基团或两个实例“独立地选自”替代方案列表时，这些基团可以是相同的或不同的。例如，如果Ra和Rb独立地选自烷基、氟、氨基和羟烷基，则具有两个Ra基团和两个Rb基团的分子可以具有都是烷基的所有基团(例如，四个不同的烷基)。可替代地，第一Ra可以是烷基，第二Ra可以是氟，第一Rb可以是羟烷基，而第二Rb可以是氨基(或选自该组的任何其它取代基)。可替代地，Ra和第一Rb均可以是氟，而第二Rb可以是烷基(即，一些取代基对可以是相同的，而其它对可以是不同的)。除非另有说明，否则如果存在具有相同定义的两个或更多个基团，但该定义提供了替代方案，则应理解，相同基团的每次出现独立地选自可能的替代方案。例如，如果化合物中存在两个或更多个Ra基团，并且Ra的定义提供了Ra可以为A、B或C，则应当理解化合物中存在的每个Ra基团独立地选自A、B和C，使得存在于化合物中的Ra基团可以是相同的或不同的。
本文所述的化合物可以是不对称的(例如，具有一个或多个立体中心)。除非另有说明，否则预期所有立体异构体，例如对映异构体和非对映异构体。本文所述的含有不对称取代的碳原子的化合物可以以光学活性或外消旋形式分离。关于如何从光学惰性的原材料制备光学活性形式的方法是本领域已知的，例如通过外消旋混合物的拆分或通过立体选择性合成。烯烃、C＝N双键等等的许多几何异构体也可以存在于本文所述的化合物中，并且在本发明中考虑了所有此类稳定的异构体。描述了本发明的化合物的顺式和反式几何异构体，并且可以作为异构体的混合物或作为分开的异构体形式进行分离。
化合物的外消旋混合物的拆分可以通过本领域已知的众多方法中的任一种来进行。一种方法包括使用手性拆分酸的分级重结晶，所述手性拆分酸是光学活性的、成盐有机酸。用于分级重结晶方法的合适拆分剂是例如光学活性的酸，例如D和L形式的酒石酸、二乙酰酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸或各种光学活性的樟脑磺酸例如β-樟脑磺酸。适合于分级结晶方法的其它拆分剂包括α-甲基苄胺的立体异构纯形式(例如S和R形式，或非对映异构纯形式)、2-苯基甘醇、去甲麻黄碱、麻黄碱、N-甲基麻黄碱、环己基乙胺、1,2-二氨基环己烷等等。
外消旋混合物的拆分也可以通过在装有光学活性拆分剂(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱上洗脱来进行。合适的洗脱溶剂组成可以由本领域技术人员确定。
在一些实施方案中，本发明的化合物具有(R)-构型。在其它实施方案中，化合物具有(S)-构型。在具有多于一个手性中心的化合物中，除非另有说明，否则该化合物中的每个手性中心可以独立地为(R)或(S)。
本文所述的化合物还可以包括互变异构形式。互变异构形式起因于单键与相邻双键的交换连同质子的伴随迁移。互变异构形式包括质子移变互变异构体，其是具有相同经验式和总电荷的异构质子化状态。示例性质子移变互变异构体包括酮-烯醇对、酰胺-亚胺酸对、内酰胺-内酰胺对、烯胺-亚胺对、以及其中质子可以占据杂环系统的两个或更多个位置的环形形式，例如1H-和3H-咪唑，1H-、2H-和4H-1,2,4-三唑，1H-和2H-异吲哚和1H-和2H-吡唑。互变异构形式可以处于平衡，或通过适当的取代在空间上锁定成一种形式。本公开内容预期涵盖所述化合物的所有此类互变异构体。
本文所述的化合物还可以包括在中间产物或最终化合物中存在的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子数但不同质量数的那些原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。
如本文使用的，术语“化合物”意指包括所述结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。
本文所述的化合物可以包括酸性和/或碱性基团并且能够形成盐。应当理解，本公开内容预期包括能够形成盐的化合物的所有盐，无论是否明确描述了盐的可能存在，包括化合物的酸式盐和碱式盐两者。此外，当描述了其为盐的化合物时，应理解该化合物的公开内容预期包括该化合物的所有形式，包括游离碱或游离酸、以及其替代的盐形式。术语“盐”指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱部分转换为其盐形式进行修饰。盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐；等等。术语“其盐(a salt thereof)”、“其盐(salt thereof)”或“其盐(salts thereof)”可以应用于相关的马库什组的任何先前成员。例如，由A、B、C及其盐组成的组在其范围内包括其为A的盐的实施方案、其为B的盐的实施方案、以及其为C的盐的实施方案。
本文公开的化合物的盐包括药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”指例如由无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的无毒盐。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法，由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般地，可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸反应，来制备此类盐，所述碱或酸在水或有机溶剂或两者的混合物中；一般地，非水介质如醚、乙酸乙酯、醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇)或乙腈(MeCN)是优选的。合适盐的列表在以下中找到：Remington'sPharmaceutical Sciences，第17版，(Mack Publishing Company，Easton，1985)，第1418页，Berge等人，J.Pharm.Sci.，1977，66(1)，1-19，以及Stahl等人，Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties，Selection，and Use,(Wiley，2002)。在一些实施方案中，本文所述的化合物包括N-氧化物形式。关于合适的药学上可接受的盐的另外信息可以在Remington's，Pharmaceutical Sciences(当前版本)，Mack Publishing Co.，Easton，PA中找到，所述参考文献引入本文作为参考。
化合物和其盐，包括药学上可接受的盐，可以连同其它物质例如水和溶剂(例如水合物和溶剂化物)一起发现，或可以是分离的。当处于固态时，本文所述的化合物及其盐可以以各种形式存在，并且可以例如采取溶剂化物包括水合物的形式。化合物可以是任何固态形式，例如多晶型物或溶剂化物，因此，除非另有明确说明，否则提及化合物及其盐应当理解为包含化合物的任何固态形式。
在一些实施方案中，本文所述的化合物或其盐是基本上分离的。“基本上分离的”意指该化合物与它在其中形成或检测到的环境至少部分或基本上分开。部分分开可以包括例如富含本发明的化合物的组合物。基本上分开可以包括含有按本发明的化合物或其盐的重量计至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％的组合物。
本文所述的化合物，包括其盐、水合物和/或溶剂化物，可以通过任何合适的已知有机合成技术进行制备，并且可以根据众多可能的合成途径中的任一种进行合成，所述合成途径例如美国专利申请号62/943,629、62/943,622、62/943,611、62/943,599、16/425,791和PCT申请PCT/US19/34220中所述的，所述专利各自在此整体引入作为参考。
用于制备本文所述的化合物的反应可以在合适的溶剂中进行，所述溶剂可以通过有机合成领域的技术人员容易地加以选择。合适的溶剂可以在其下进行反应的温度，例如范围可以从溶剂的冻结温度到溶剂的沸腾温度的温度下，与原材料(反应物)、中间产物或产物基本上不反应。给定的反应可以在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。取决于特定的反应步骤，用于特定反应步骤的合适溶剂可以由本领域技术人员加以选择。
本公开内容的化合物的制备可以涉及各种化学基团的保护和脱保护。关于保护和脱保护的需要以及适当保护基团的选择，可以由本领域技术人员容易地确定。保护基团的化学例如在以下中描述：Kocienski，Protecting Groups,(Thieme，2007)；Robertson，Protecting Group Chemistry,(Oxford University Press，2000)；Smith等人，March'sAdvanced Organic Chemistry:Reactions，Mechanisms，and Structure，第6版(Wiley，2007)；Peturssion等人，"Protecting Groups in Carbohydrate Chemistry,"J.Chem.Educ.，1997，74(11)，1297；以及Wuts等人，Protective Groups in OrganicSynthesis，第4版(Wiley，2006)。
反应可以根据本领域已知的任何合适的方法进行监测。例如，产物形成可以通过以下进行监测：光谱手段如核磁共振光谱法(例如1H或13C)、红外光谱法、分光光度法(例如UV-可见光)、质谱法、或者层析方法如高效液相层析(HPLC)或薄层层析(TLC)。
本领域技术人员将理解，制剂可以使用有机化学的一般知识进行修饰或优化，以制备在本公开内容的范围内的各种化合物。
其合成未在本文中描述的原材料、试剂和中间产物或是商购可得的、文献中已知的，或可以通过本领域技术人员已知的方法进行制备。
本领域技术人员应了解，所述方法并非本公开内容的化合物可以通过其合成的唯一手段，并且广泛的合成有机反应储库是可获得的，以潜在地用于合成本公开内容的化合物中。本领域技术人员知道如何选择且实施适当的合成路线。原材料、中间产物和产物的合适合成方法可以通过参考文献进行鉴定，所述文献包括参考源，例如：Advances inHeterocyclic Chemistry，第1-107卷(Elsevier，1963-2012)；Journal of HeterocyclicChemistry，第1-49卷(Journal of Heterocyclic Chemistry，1964-2012)；Carreira等人(编辑)Science of Synthesis，第1-48卷(2001-2010)和Knowledge Updates KU2010/1-4；2011/1-4；2012/1-2(Thieme，2001-2012)；Katritzky等人(编辑)Comprehensive OrganicFunctional Group Transformations,(Pergamon Press，1996)；Katritzky等人(编辑)；Comprehensive Organic Functional Group Transformations II(Elsevier，第2版，2004)；Katritzky等人(编辑)，Comprehensive Heterocyclic Chemistry(PergamonPress，1984)；Katritzky等人，Comprehensive Heterocyclic ChemistryII(PergamonPress，1996)；Smith等人，March's Advanced Organic Chemistry:Reactions，Mechanisms，and Structure，第6版(Wiley，2007)；Trost等人(编辑)，ComprehensiveOrganic Synthesis(Pergamon Press，1991).
在一些实施方案中，本公开内容的化合物选择性地抑制MASP-2超过凝血酶。在一些实施方案中，MASP-2:凝血酶抑制的选择性比为至少1.1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1或30:1。在一些实施方案中，除抑制MASP-2之外，本发明的化合物还可以抑制一种或多种凝血蛋白酶，例如凝血酶。
本公开内容的小分子化合物的MASP-2抑制活性可以通过本领域已知的方法来确定，例如，利用如PCT申请号PCT/US19/34220中公开的荧光底物的酶促MASP-2测定，所述申请在此整体引入作为参考。同样地，本公开内容的化合物的凝血酶抑制活性可以使用本领域已知的方法来确定。代表性的小分子化合物的示例性测定方法和MASP-2抑制活性，在本文的实施例23至25中进行描述。
在一些实施方案中，本文公开的化合物抑制凝集素途径的活化。本发明的化合物的凝集素途径抑制活性可以通过本领域已知的方法来确定，例如，使用PCT申请号PCT/US19/34220中所述的人血清中的凝集素途径活化(LPA)测定，所述申请在此整体引入作为参考。
在一些实施方案中，如例如通过上述酶促MASP-2测定确定的，化合物具有小于约25μM、小于约10μM、小于约2.5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、或小于约0.1μM的MASP-2抑制Ki值。在一些实施方案中，如例如通过上述凝集素途径活化(LPA)测定确定的，化合物具有小于约50μM、小于约5μM、小于约0.5μM、或小于约0.05μM的凝集素途径抑制IC50。在一些实施方案中，相对于凝血酶，化合物对于MASP-2抑制具有约大于5.0倍、大于约25倍、大于约50倍、或大于约100倍的选择性(如例如通过分别的Ki的比率确定的)。
在一些实施方案中，该化合物是下表4A-4E的化合物。
表4A.示例性化合物
表4B示例性MASP-2抑制性化合物
表4C示例性MASP-2抑制性化合物
表4D示例性MASP-2抑制性化合物
表4E示例性MASP-2抑制性化合物
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是表4A、4B、4C、4D和4E中任一个的化合物。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是化合物1230、1231、III-91或I-89。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是分子量为200Da至2,000Da的小分子。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是分子量为250Da至2,000Da的小分子。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是分子量为350Da至2,000Da的小分子。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是分子量为350Da至1,500Da的小分子。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是分子量为350Da至1,200Da的小分子。
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是仅具有选自胍基和苄脒基的一个碱性基团的小分子。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是不包括选自胍基和苄脒基的碱性基团的小分子。
MASP-2的表达抑制剂
在本发明的这个方面的另一个实施方案中，MASP-2抑制剂是能够抑制MASP-2依赖性补体活化的MASP-2表达抑制剂。在本发明这个方面的实践中，代表性的MASP-2表达抑制剂包括MASP-2反义核酸分子(例如反义mRNA、反义DNA或反义寡核苷酸)、MASP-2核酶和MASP-2 RNAi分子。
通过与MASP-2 mRNA杂交并阻止MASP-2蛋白的翻译，反义RNA和DNA分子作用于阻断MASP-2 mRNA的翻译。反义核酸分子可以以多种不同的方式进行构建，条件是它能够干扰MASP-2的表达。例如，可以通过相对于其正常转录方向，反转MASP-2 cDNA(SEQ ID NO:4)的编码区(或其一部分)，以允许其互补体的转录，来构建反义核酸分子。
反义核酸分子通常与一种或多种靶基因的至少一部分基本上相同。然而，核酸无需完全相同以抑制表达。一般地，较高的同源性可以用于补偿较短的反义核酸分子的使用。最低限度的同一性百分比通常大于约65％，但较高的同一性百分比可以对内源序列的表达施加更有效的阻遏。通常优选多于约80％的基本上更高的同一性百分比，尽管通常最优选约95％至绝对同一性。
反义核酸分子无需具有与靶基因相同的内含子或外显子模式，并且靶基因的非编码区段在实现靶基因表达的反义压制方面可以与编码片段同样有效。至少约8个左右的核苷酸的DNA序列可以用作反义核酸分子，尽管更长的序列是优选的。在本发明中，有用的MASP-2抑制剂的代表性实例是反义MASP-2核酸分子，其与MASP-2cDNA的互补体至少百分之九十相同，所述MASP-2 cDNA由SEQ ID NO:4所示的核酸序列组成。SEQ ID NO:4中所示的核酸序列编码由SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列组成的MASP-2蛋白。
反义寡核苷酸靶向结合MASP-2 mRNA是可以用于降低MASP-2蛋白合成水平的另一种机制。例如，通过针对其各自的mRNA序列的反义寡核苷酸，来抑制聚半乳糖醛酸酶和毒蕈碱2型乙酰胆碱受体的合成(授予Cheng的美国专利号5,739,119和授予Shewmaker的美国专利号5,759,829)。此外，反义抑制的实例已用以下加以证实：核蛋白细胞周期蛋白、多药抗性基因(MDG1)、ICAM-1、E-选择素、STK-1、纹状体GABAA受体和人EGF(参见例如，授予Baracchini的美国专利号5,801,154；授予Baker的美国专利号5,789,573；授予Considine的美国专利号5,718,709；以及授予Reubenstein的美国专利号5,610,288)。
允许普通技术人员确定哪些寡核苷酸可用于本发明中的系统已得到描述，所述系统涉及使用RNA酶H切割作为转录物内的序列可及性的指标，来探测靶mRNA中的合适位点。Scherr，M.等人，Nucleic Acids Res.26:5079-5085，1998；Lloyd等人，Nucleic AcidsRes.29:3665-3673，2001。将与MASP-2转录物的某些区域互补的反义寡核苷酸的混合物，加入表达MASP-2的细胞提取物例如肝细胞中，并且进行杂交以便产生易受RNA酶H影响的位点。这种方法可以与计算机辅助的序列选择组合，基于其形成二聚体、发夹或其它二级结构(其降低或阻止与宿主细胞中的靶mRNA的特异性结合)的相对能力，所述计算机辅助的序列选择可以预测关于反义组合物的最佳序列选择。可以使用OLIGO引物分析软件(Rychlik，I.，1997)、以及BLASTN 2.0.5算法软件(Altschul，S.F.等人，Nucl.Acids Res.25:3389-3402，1997)，来执行这些二级结构分析和靶位点选择考虑。针对靶序列的反义化合物优选包含约8至约50个核苷酸的长度。包含约9至约35个左右核苷酸的反义寡核苷酸是特别优选的。发明人考虑了在9至35个核苷酸范围内的所有寡核苷酸组合物(即，长度9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个左右的碱基的组合物)，对于本发明的基于反义寡核苷酸的方法的实践是高度优选的。MASP-2mRNA的高度优选的靶区域是在AUG翻译起始密码子处或附近的那些区域，以及与mRNA的5'区域，例如MASP-2基因核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的–10至+10区域基本上互补的序列。示例性的MASP-2表达抑制剂在下文提供：
SEQ ID NO:30(SEQ ID NO:4的核苷酸22-680)：编码CUBIEGF的MASP-2 cDNA(SEQID NO:4)的核酸序列。
SEQ ID NO:31(5'CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC3)：包括MASP-2翻译起始位点(有义)的SEQ ID NO:4的核苷酸12-45。
SEQ ID NO:32(5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3')：编码包含MASP-2MBL结合位点的区域(有义)的SEQ ID NO:4的核苷酸361-396。
SEQ ID NO:33(5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3')：编码包含CUBII结构域的区域的SEQ ID NO:4的核苷酸610-642
如上文指出的，如本文使用的，术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物。该术语还涵盖由天然存在的核苷酸、糖和共价核苷间(主链)键组成的寡聚核酸碱基，以及具有非天然存在的修饰的寡核苷酸。这些修饰允许引入通过天然存在的寡核苷酸并未提供的某些期望特性，例如降低的毒性特性、针对核酸酶降解的稳定性增加和增强的细胞摄取。在说明性的实施方案中，本发明的反义化合物与天然DNA的不同之处在于磷酸二酯主链的修饰，以延长反义寡核苷酸的寿命，其中磷酸酯取代基被硫代磷酸酯替换。同样地，寡核苷酸的一个或两个端部可以被一种或多种吖啶衍生物取代，所述吖啶衍生物嵌入核酸链内的相邻碱基对之间。
反义的另一种替代方法是使用“RNA干扰”(RNAi)。双链RNA(dsRNA)可以在哺乳动物体内诱发基因沉默。RNAi和共压制的天然功能似乎是保护基因组免于通过可移动遗传元件的侵入，所述可移动遗传元件例如逆转录转座子和病毒，当它们变得活跃时，在宿主细胞中产生异常的RNA或dsRNA(参见例如，Jensen，J.等人，Nat.Genet.21:209-12，1999)。可以通过合成能够形成双链RNA分子的两条RNA链，来制备双链RNA分子，每条RNA链具有约19至25(例如19个23个核苷酸)的长度。例如，可用于本发明的方法中的dsRNA分子，可以包含对应于本文列出的序列及其互补体(例如，SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:33)的RNA。优选地，RNA的至少一条链具有1-5个核苷酸的3'突出端。合成的RNA链在形成双链分子的条件下组合。RNA序列可以包含SEQ ID NO:4的至少8核苷酸部分，其总长度为25个核苷酸或更短。关于给定靶的siRNA序列设计在本领域技术人员的普通技能内。设计siRNA序列并确保至少70％的表达敲减的商业服务是可获得的(Qiagen，Valencia，Calf)。
dsRNA可以作为药物组合物施用并通过已知方法进行，其中将核酸引入所需的靶细胞内。常用的基因转移方法包括磷酸钙、DEAE-右旋糖酐、电穿孔、显微注射和病毒方法。此类方法在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，1993中得到教导。
核酶也可以用于减少MASP-2的量和/或生物活性，例如靶向MASP-2 mRNA的核酶。核酶是催化性RNA分子，其可以切割具有与核酶的序列完全或部分同源的序列的核酸分子。能够设计编码RNA核酶的核酶转基因，所述RNA核酶与靶RNA特异性配对，并且在特异性位置处切割磷酸二酯主链，从而使靶RNA在功能上失活。在进行这种切割时，核酶本身并不改变，并且因此能够再循环且切割其它分子。在反义RNA内包括核酶序列对其赋予RNA切割活性，从而增加了反义构建体的活性。
可用于本发明的实践中的核酶通常包含至少约九个核苷酸的杂交区域和催化区域，所述杂交区域在核苷酸序列中与靶MASP-2 mRNA的至少一部分互补，所述催化区域适于切割靶MASP-2 mRNA(一般参见EPA编号0321201；WO88/04300；Haseloff，J.等人，Nature334:585-591，1988；Fedor，M.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1668-1672，1990；Cech，T.R.等人，Ann.Rev.Biochem.55:599-629，1986)。
核酶可以以掺入核酶序列的RNA寡核苷酸的形式直接靶向细胞，或作为编码所需核酶RNA的表达载体引入细胞内。核酶可以以与对于反义多核苷酸描述的大致相同的方式进行使用且施加。
可用于本发明的方法中的反义RNA和DNA、核酶和RNAi分子，可以通过本领域已知用于合成DNA和RNA分子的任何方法来制备。这些包括本领域众所周知的、用于化学合成寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技术，例如固相亚磷酰胺化学合成。可替代地，可以通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录，来生成RNA分子。此类DNA序列可以掺入广泛多样的载体内，所述载体掺入合适的RNA聚合酶启动子，例如T7或SP6聚合酶启动子。可替代地，取决于使用的启动子，可以将组成型或诱导型地合成反义RNA的反义cDNA构建体稳定地引入细胞系内。
DNA分子的各种众所周知的修饰可以作为增加稳定性和半衰期的手段而引入。有用的修饰包括但不限于在分子的5'和/或3'端处添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列，或者在寡脱氧核糖核苷酸主链内使用硫代磷酸酯或2'O-甲基而不是磷酸二酯酶键。
V.药物组合物和递送方法
给药
在另一个方面，本发明提供了用于抑制受试者中的MASP-2依赖性补体活化的不良作用的组合物，所述受试者患有如本文公开的疾病或状况，所述方法包括将组合物施用于受试者，所述组合物包含治疗有效量的MASP-2抑制剂和药学上可接受的载体。MASP-2抑制剂可以以治疗有效剂量施用于有此需要的受试者，以治疗或改善与MASP-2依赖性补体活化相关的状况。治疗有效剂量指足以导致与疾病或状况相关的症状改善的MASP-2抑制剂的量。
MASP-2抑制剂的毒性和治疗功效可以通过采用实验动物模型的标准药学程序来确定，所述实验动物模型例如实验例1中所述的，表达人MASP-2转基因的鼠MASP-2-/-小鼠模型。使用此类动物模型，NOAEL(未观察到不良作用水平)和MED(最低有效剂量)可以使用标准方法进行确定。NOAEL和MED效应之间的剂量比是治疗比，其表示为比率NOAEL/MED。显示出大治疗比或指数的MASP-2抑制剂是最优选的。从细胞培养测定和动物研究获得的数据，可以用于制定用于在人中使用的剂量范围。MASP-2抑制剂的剂量优选位于循环浓度的范围内，所述循环浓度包括具有很少毒性或无毒性的MED。剂量可以在该范围内变化，取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂用于治疗、抑制、减轻或预防哺乳动物受试者(其患有或处于发展由纤维化和/或炎症引起或者因其加剧的疾病或病症的风险中)的纤维化的治疗功效，通过下述中的一种或多种进行确定：肾组织中的炎症和瘢痕形成的一种或多种标记物(例如TGFβ-1、CTFF、IL-6、细胞凋亡、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、EMT、浸润性巨噬细胞)的降低；释放到尿和血浆内的炎症和纤维化肾疾病的可溶性标记物的降低(例如，通过肾排泄功能的测量)。
对于任何化合物制剂，可以使用动物模型来估计治疗有效剂量。例如，可以在动物模型中制定剂量，以达到包括MED的循环血浆浓度范围。血浆中的MASP-2抑制剂的定量水平也可以例如通过高效液相层析进行测量。
除毒性研究之外，还可以基于活受试者中存在的MASP-2蛋白的量和MASP-2抑制剂的结合亲和力，来估计有效剂量。已显示正常人受试者的MASP-2水平以在500ng/ml范围内的低水平存在于血清中，并且特定受试者的MASP-2水平可以使用用于MASP-2的定量测定来确定，所述定量测定在Moller-Kristensen M.等人，J.Immunol.Methods 282:159-167，2003中进行描述。
一般地，包含MASP-2抑制剂的所施用组合物的剂量根据此类因素而变，如受试者的年龄、重量、身高、性别、一般医学状况和先前医疗史。作为说明，MASP-2抑制剂，例如抗MASP-2抗体，可以以约0.010至10.0mg/kg，优选0.010至1.0mg/kg，更优选0.010至0.1mg/kg的受试者体重的剂量范围施用。在一些实施方案中，组合物包含抗MASP-2抗体和MASP-2抑制性肽的组合。
可以根据本领域技术人员众所周知的补体测定，来确定本发明的MASP-2抑制性组合物和方法在给定受试者中的治疗功效和适当的剂量。补体生成众多特异性产物。在过去的十年中，已开发了灵敏和特异性的测定，并且在商业上可用于这些活化产物中的大多数，包括小活化片段C3a、C4a和C5a，以及大活化片段iC3b、C4d、Bb和sC5b-9。这些测定中的大多数利用单克隆抗体，其与暴露于片段上的新抗原(新生抗原)反应，但不与它们由其形成的天然蛋白质上的抗原反应，使得这些测定非常简单和特异性。尽管放射免疫测定有时仍用于C3a和C5a，但大多数依赖ELISA技术。后面的这些测定既测量未加工的片段，又测量其'desArg'片段，其是循环中发现的主要形式。未加工的片段和C5adesArg通过与细胞表面受体结合得到快速清除，并且因此以非常低的浓度存在，而C3adesArg不与细胞结合并在血浆中积累。C3a的测量提供了补体活化的敏感、途径不依赖性指标。替代途径活化可以通过测量Bb片段进行评价。膜攻击途径活化的液相产物sC5b-9的检测，提供了补体被活化至完成的证据。由于凝集素途径和经典途径两者均生成相同的活化产物C4a和C4d，因此这两种片段的测量并不提供关于这两个途径中的哪一个已生成活化产物的任何信息。
对MASP-2依赖性补体活化的抑制的特征在于，补体系统的组分的下述变化中的至少一种，所述变化由于根据本发明的方法施用MASP-2抑制剂而发生：MASP-2依赖性补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9(MAC)的生成或产生的抑制(例如，如实施例2中所述测量的)、C4切割和C4b沉积的降低(例如，如实施例10中所述测量的)、或者C3切割和C3b沉积的降低(例如，如实施例10中所述测量的)。
另外的试剂
在某些实施方案中，预防、治疗、逆转和/或抑制纤维化和/或炎症的方法，包括将MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)作为治疗方案的部分，连同适合于抑制纤维化和/或炎症的一种或多种其它药物、生物制品或治疗干预一起施用。在某些实施方案中，另外的药物、生物制品或治疗干预适合于特定症状，所述症状与由纤维化和/或炎症引起或者因其加剧的疾病或病症相关。例如，MASP-2抑制性抗体可以作为治疗方案的部分，连同一种或多种免疫抑制剂(例如氨甲蝶呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤和霉酚酸酯)一起施用。作为进一步的实例，MASP-2抑制性抗体可以作为治疗方案的部分，连同设计为增加血流量的一种或多种试剂(例如硝苯地平、氨氯地平、地尔硫卓、非洛地平或尼卡地平)一起施用。作为进一步的实例，MASP-2抑制性抗体可以作为治疗方案的部分，连同预期减少纤维化的一种或多种试剂(例如d-青霉胺、秋水仙碱、PUVA、松弛素、环孢菌素、TGFβ阻滞剂或p38 MAPK阻滞剂)一起施用。作为进一步的实例，MASP-2抑制性抗体可以作为治疗方案的部分，连同类固醇或支气管扩张剂一起施用。
包含MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)的组合物和方法，可以任选地包含一种或多种另外的治疗剂，其可以加强MASP-2抑制剂的活性、或者以累加或协同方式提供有关的治疗功能。例如，在治疗患有由纤维化和/或炎症引起或者因其加剧的疾病或病症的受试者的背景下，一种或多种MASP-2抑制剂可以与一种或多种另外的抗纤维化剂、和/或一种或多种抗病毒剂和/或消炎药和/或免疫抑制剂组合进行施用(包括共施用)。
MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)可以与其它治疗剂组合使用，所述其它治疗剂例如一般的抗病毒药、或免疫抑制药物例如皮质类固醇、免疫抑制剂或细胞毒素剂和/或抗纤维化剂。
在本文描述的方法的一些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体或MASP-2的小分子抑制剂)用作单一疗法，用于治疗患有冠状病毒例如患有COVID-19或流感病毒的受试者。在本文所述方法的一些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体或MASP-2的小分子抑制剂)与其它治疗剂组合使用，所述其它治疗剂例如抗病毒剂、治疗性抗体、皮质类固醇和/或显示对于治疗患有冠状病毒或流感病毒的受试者有效的其它试剂。在一些实施方案中，药物组合物包含MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体或MASP-2的小分子抑制剂)和至少一种另外的治疗剂，例如抗病毒剂(例如，瑞德西韦)、针对除MASP-2外的靶的治疗性抗体、皮质类固醇、抗凝剂例如低分子量肝素(例如，依诺肝素)和抗生素(例如，阿奇霉素)。
在此类组合疗法中，MASP-2抑制剂可以与以下同时、在以下之前或在以下之后进行配制或施用：一种或多种其它所需的COVID-19治疗剂例如抗病毒剂(例如，瑞德西韦)、针对除MASP-2外的靶的治疗性抗体、皮质类固醇或抗凝剂。可以以本领域已知的各种方式来配制组合疗法的每种组分。例如，组合疗法的MASP-2抑制剂和第二试剂可以一起或分开配制。MASP-2抑制剂和另外的试剂可以一次或经过一系列治疗，适当地施用于COVID-19患者。
示例性的抗病毒剂包括例如达芦那韦(其可以与利托那韦或考比司他一起使用，以增加达芦那韦水平)、法维拉韦、洛匹那韦、利托那韦、瑞德西韦、加利西韦、依巴斯汀、达诺瑞韦、ASC09、恩曲他滨、替诺福韦、umifnovir、巴洛沙韦、阿兹夫定/或ISR-50。示例性的治疗性抗体包括例如血管生长因子抑制剂(例如贝伐珠单抗)、PD-1阻断抗体(例如胸腺素、卡瑞利珠单抗)、CCR5拮抗剂(例如莱隆利单抗)、IL-6受体拮抗剂(例如沙利鲁单抗、托珠单抗)、IL-6靶向抑制剂(例如司妥昔单抗)、抗GMCSF抗体(例如gimsilumab、TJM2)、GMCSF受体α阻断抗体(例如莫夫单抗)、抗C5抗体(例如依库珠单抗、雷武珠单抗)和/或抗C5a抗体(IFX-1)。
在本文描述的方法的一些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体例如OMS646、或MASP-2的小分子抑制剂)与抗病毒剂例如瑞德西韦组合使用，用于治疗患有COVID-19的受试者。
对于治疗冠状病毒和/或流感病毒可能有效的其它试剂包括例如氯喹/羟基氯喹、甲磺酸卡莫司他、鲁索利尼、聚乙二醇干扰素α-2b、乐复能、艾芬地尔、重组ACE2、APN01、brlacidin、BXT-25、BIO-11006、芬戈莫德、WP1122、干扰素β-1a、萘莫司他、氯沙坦和/或阿替普酶。
药物载体和递送媒介物
一般而言，与任何其它选择的治疗剂组合的本发明的MASP-2抑制剂组合物，适当地包含在药学上可接受的载体中。载体是无毒的、生物相容的，并且这样加以选择，以便不会有害地影响MASP-2抑制剂(以及与其组合的任何其它治疗剂)的生物活性。用于肽的示例性药学上可接受的载体在授予Yamada的美国专利号5,211,657中进行描述。可用于本发明中的抗MASP-2抗体和抑制性肽可以配制成以固体、半固体、凝胶、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、贮存剂、吸入剂和注射剂，其允许经口、肠胃外或手术施用。本发明还考虑了通过包被医疗器械等等的组合物的局部施用。
用于经由注射、输注或冲洗的肠胃外递送以及局部递送的合适载体包括蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、正常或乳酸林格氏溶液、右旋糖溶液、汉克氏溶液或丙二醇。另外，无菌的不挥发性油可以用作溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任何生物相容性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可用于注射剂的制备中。载体和试剂可以配混为液体、悬浮液、可聚合或不可聚合的凝胶、糊剂或药膏。
载体还可以包含递送媒介物，以维持(即，延长、延迟或调控)一种或多种试剂的递送，或者增强治疗剂的递送、摄取、稳定性或药代动力学。作为非限制性实例，此类递送媒介物可以包括由蛋白质、脂质体、碳水化合物、合成有机化合物、无机化合物、聚合或共聚水凝胶和聚合胶束组成的微粒、微球、纳米球或纳米颗粒。合适的水凝胶和胶束递送系统包括在WO 2004/009664 A2中公开的PEO:PHB:PEO共聚物和共聚物/环糊精复合物，以及在美国专利申请公开号2002/0019369 A1中公开的PEO和PEO/环糊精复合物。此类水凝胶可以在预期作用部位处局部注射，或者皮下或肌内注射，以形成缓释贮库。
对于关节内递送，MASP-2抑制剂可以在上述可注射的液体或凝胶载体、上述可注射的缓释递送媒介物、或者透明质酸或透明质酸衍生物中携带。
对于非肽能试剂的经口施用，MASP-2抑制剂可以在惰性填料或稀释剂如蔗糖、玉米淀粉或纤维素中携带。
对于局部施用，MASP-2抑制剂可以在软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体或粉末中携带，或者经由透皮贴剂在凝胶或微胶囊递送系统中携带。
各种鼻和肺递送系统，包括气溶胶、定量吸入器、干粉吸入器和喷雾器正在开发中，并且可以适当地适于分别在气溶胶、吸入剂或雾化的递送媒介物中递送本发明。
对于鞘内(IT)或脑室内(ICV)递送，适当的无菌递送系统(例如，液体；凝胶、悬浮液等)可以用于施用本发明。
本发明的组合物还可以包括生物相容性赋形剂，例如分散剂或湿润剂、助悬剂、稀释剂、缓冲剂、渗透促进剂、乳化剂、粘合剂、增稠剂、调味剂(用于经口施用)。
用于抗体和肽的药物载体
更具体地，关于抗MASP-2抗体和抑制性肽，示例性制剂可以作为化合物在具有药物载体的生理上可接受的稀释剂中的溶液或悬浮液的可注射剂量进行施用，所述药物载体可以是无菌液体，例如水、油、盐水、甘油或乙醇。另外，辅助物质例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等等，可以存在于包含抗MASP-2抗体和抑制性肽的组合物中。药物组合物的另外组分包括矿脂(例如动物、植物或合成起源的矿脂)，例如大豆油和矿物油。一般而言，二醇如丙二醇或聚乙二醇是用于可注射溶液的优选液体载体。
抗MASP-2抗体和抑制性肽也可以以贮库注射剂或植入物制剂的形式施用，其可以以允许活性剂的缓释或脉冲式释放的方式进行配制。
用于表达抑制剂的药学上可接受的载体
更具体地，关于可用于本发明的方法中的表达抑制剂，提供了包含如上所述的表达抑制剂和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。该组合物可以进一步包含胶体分散系统。
包括表达抑制剂的药物组合物可以包括但不限于溶液、乳剂和含脂质体的制剂。这些组合物可以由各种组分生成，所述组分包括但不限于预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。此类组合物的制备通常涉及将表达抑制剂与下述中的一种或多种组合：缓冲剂、抗氧化剂、低分子量多肽、蛋白质、氨基酸、碳水化合物(包括葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(例如EDTA、谷胱甘肽和其它稳定剂)和赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是合适稀释剂的实例。
在一些实施方案中，组合物可以作为乳剂制备且配制，所述乳剂通常是一种液体以液滴形式分散在另一种液体中的非均质系统(参见Idson，于Pharmaceutical DosageForms，第1卷，Rieger和Banker(编辑)，Marcek Dekker，Inc.，N.Y.，1988)。乳剂制剂中使用的天然存在的乳化剂的实例包括阿拉伯胶、蜂蜡、羊毛脂、卵磷脂和磷脂。
在一个实施方案中，包括核酸的组合物可以配制为微乳剂。如本文使用的，微乳剂指水、油和两亲化合物的系统，其是单一的光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见Rosoff，于Pharmaceutical Dosage Forms，第1卷)。本发明的方法还可以使用脂质体，用于将反义寡核苷酸转移和递送至所需位点。
用于局部施用的表达抑制剂的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体和粉末。可以使用常规的药物载体，以及水性、粉末或油性基质和增稠剂等等。
施用模式
包含MASP-2抑制剂的药物组合物可以众多方式进行施用，取决于局部还是全身施用模式最适合于待治疗的状况。进一步地，可以通过将组合物包被或掺入可植入医疗装置之上或之内，来递送本发明的组合物。
全身递送
如本文使用的，术语“全身递送”和“全身施用”预期包括但不限于经口和肠胃外途径，包括肌内(IM)、皮下、静脉内(IV)、动脉内、吸入、舌下、颊、局部、透皮、鼻、直肠、阴道和其它施用途径，其有效地导致递送的试剂分散到预期治疗作用的单一或多重部位。用于本组合物的全身递送的优选途径包括静脉内、肌内、皮下和吸入。应了解，将确定本发明的特定组合物中利用的所选试剂的确切全身施用途径，以部分考虑试剂对与给定施用途径相关的代谢转化途径的敏感性。例如，肽能试剂可以最合适地通过除经口外的途径施用。
MASP-2抑制性抗体和多肽可以通过任何合适的手段，递送到有此需要的受试者中。MASP-2抗体和多肽的递送方法包括通过经口、肺、肠胃外(例如肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、吸入(例如经由细粉制剂)、透皮、鼻、阴道、直肠或舌下施用途径的施用，并且可以以对于每种施用途径适当的剂型进行配制。
作为代表性实例，MASP-2抑制性抗体和肽可以通过施加于能够吸收多肽的机体膜，例如鼻、胃肠道和直肠膜，而引入活体内。通常将多肽与渗透促进剂结合施加于吸收膜。(参见例如，Lee，V.H.L.，Crit.Rev.Ther.Drug CarrierSys.5:69，1988；Lee，V.H.L.，J.ControlledRelease 13:213，1990；Lee，V.H.L.，编辑，Peptide andProtein DrugDelivery，Marcel Dekker，New York(1991)；DeBoer，A.G.等人，J.Controlled Release13:241，1990.)例如，STDHF是夫西地酸的合成衍生物，所述夫西地酸是在结构中类似于胆汁盐的甾体表面活性剂，并且已用作用于鼻递送的渗透促进剂。(Lee，W.A.，Biopharm.22，Nov./Dec.1990.)
MASP-2抑制性抗体和多肽可以与另一种分子(例如脂质)结合引入，以保护多肽免受酶促降解。例如，聚合物尤其是聚乙二醇(PEG)的共价附着，已用于保护某些蛋白质免受体内的酶促水解，并且因此延长半衰期(Fuertges，F.等人，J.Controlled Release 11:139，1990)。用于蛋白质递送的许多聚合物系统已得到报告(Bae，Y.H.等人，J.ControlledRelease 9:271，1989；Hori，R.等人，Pharm.Res.6:813，1989；Yamakawa，I.等人，J.Pharm.Sci.79:505，1990；Yoshihiro，I.等人，J.Controlled Release 10:195，1989；Asano，M.等人，J.Controlled Release 9:111，1989；Rosenblatt，J.等人，J.ControlledRelease 9:195，1989；Makino，K.，J.Controlled Release 12:235，1990；Takakura，Y.等人，J.Pharm.Sci.78:117，1989；Takakura，Y.等人，J.Pharm.Sci.78:219，1989)。
最近，已开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(参见例如，授予Webb的美国专利号5,741,516)。此外，脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的各种方法已得到综述(参见例如，授予Szoka的美国专利号5,567,434；授予Yagi的美国专利号5,552,157；授予Nakamori的美国专利号5,565,213；授予Shinkarenko的美国专利号5,738,868；以及授予Gao的美国专利号5,795,587)。
对于透皮应用，可以将MASP-2抑制性抗体和多肽与其它合适的成分(例如载体和/或佐剂)组合。不存在关于此类其它成分的性质的限制，除了它们对于其预期施用必须是药学上可接受的，并且不会降解组合物的活性成分的活性之外。合适媒介物的实例包括具有或不具有纯化胶原的软膏、乳膏、凝胶或悬浮液。MASP-2抑制性抗体和多肽也可以浸入透皮贴剂、石膏和绷带内，优选以液体或半液体形式。
本发明的组合物可以以确定为维持所需疗效水平的间隔，定期进行全身施用。例如，可以每两周至四周或以更不频繁的间隔，例如通过皮下注射来施用组合物。通过医生考虑可能影响试剂组合作用的各种因素来确定剂量方案。这些因素将包括待治疗状况的进展程度，患者的年龄、性别和重量，以及其它临床因素。每种个别试剂的剂量将根据以下而变：组合物中包括的MASP-2抑制剂、以及任何药物递送媒介物(例如缓释递送媒介物)的存在和性质。另外，可以调整剂量数量，以考虑施用频率和所递送试剂的药代动力学行为的变化。
局部递送
如本文使用的，术语“局部的”包含在预期局限性作用的部位中或周围的药物施加，并且可以包括例如局部递送至皮肤或其它受累组织、眼递送、鞘内(IT)、脑室内(ICV)、关节内、腔内、颅内或囊内施用、放置或冲洗。局部施用可能是优选的，以使得能够施用较低的剂量，以避免全身性副作用，并且用于更准确控制递送的时机和在局部递送的部位处的活性剂浓度。不管代谢、血流量等方面的患者间变化性如何，局部施用提供了在靶部位处的已知浓度。还通过直接递送模式提供了改善的剂量控制。
MASP-2抑制剂的局部递送可以在用于治疗由纤维化和/或炎症引起或者因其加剧的疾病或病症的外科方法的背景下，例如在操作如手术的过程中实现。
治疗方案
在预防应用中，将包含MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体或MASP-2抑制性小分子化合物)的药物组合物施用于易受以下影响或在其它方面处于发展以下的风险中的受试者：冠状病毒诱导的急性呼吸窘迫综合征或流感病毒诱导的急性呼吸窘迫综合征，所述药物组合物的量足以抑制MASP-2依赖性补体活化，且从而降低、消除或降低发展呼吸综合征的症状的风险。在预防方案和治疗方案两者中，包含MASP-2抑制剂的组合物可以以几种剂量进行施用，直到在受试者中已实现足够的治疗结果。本发明的MASP-2抑制性组合物的应用可以通过组合物的单次施用或限定的施用顺序来进行，用于治疗与纤维化和/或炎症相关的急性状况。可替代地，组合物可以经过延长的时间段以周期性间隔进行施用，用于治疗与纤维化和/或炎症相关的慢性状况。
在预防方案和治疗方案两者中，包含MASP-2抑制剂的组合物可以以几种剂量进行施用，直到在受试者中已实现足够的治疗结果。在本发明的一个实施方案中，MASP-2抑制剂包含MASP-2抗体，其可以以下述剂量合适地施用于成人患者(例如，70kg的平均成人重量)：0.1mg至10,000mg，更合适地1.0mg至5,000mg，更合适地10.0mg至2,000mg，更合适地10.0mg至1,000mg，且再更合适地50.0mg至500mg。对于儿科患者，剂量可以与患者的重量成比例地进行调整。本发明的MASP-2抑制性组合物的应用可以通过组合物的单次施用或限定的施用顺序来进行，用于治疗患有或处于发展由纤维化和/或炎症引起或者因其加剧的疾病或病症的风险中的受试者。可替代地，组合物可以在延长的时间段内以周期性间隔(例如每天、每两周、每周、每隔一周、每月或每两个月)进行施用，用于治疗患有或处于发展由纤维化和/或炎症引起或者因其加剧的疾病或病症的风险中的受试者。
在预防方案和治疗方案两者中，包含MASP-2抑制剂的组合物可以以几种剂量进行施用，直到在受试者中已实现足够的治疗结果。
VI.实施例
下述实施例仅仅示出了目前考虑用于实践本发明的最佳模式，但不应该解释为限制本发明。本文所有文献引用都明确引入作为参考。
实施例1
本实施例描述了MASP-2(MASP-2-/-)缺陷，但MAp19(MAp19+/+)充分的小鼠品系的生成。
材料和方法：靶向载体pKO-NTKV 1901被设计为破坏编码鼠MASP-2的C末端的三个外显子，包括编码丝氨酸蛋白酶结构域的外显子，如图3中所示。PKO-NTKV 1901用于转染鼠ES细胞系E14.1a(SV129 Ola)。选择了新霉素抗性和胸苷激酶敏感性克隆。筛选了600个ES克隆，并且在这些中，鉴定了四个不同的克隆，并且通过DNA印迹验证为含有预计的选择性靶向和重组事件，如图3中所示。通过胚胎移植由这四个阳性克隆生成了嵌合体。然后将嵌合体在遗传背景C57/BL6中回交，以产生转基因雄性。使转基因雄性与雌性杂交以生成F1，其中50％的后代显示了关于破坏的MASP-2基因的杂合性。使杂合小鼠交配，以生成纯合的MASP-2缺陷后代，分别导致1:2:1比率的杂合小鼠和野生型小鼠。
结果和表型：发现所得到的纯合的MASP-2-/-缺陷纯合小鼠是活的和可育的，并且通过DNA印迹验证为MASP-2缺陷的，以确认正确的靶向事件，通过RNA印迹来确认MASP-2mRNA的不存在，并且通过蛋白质印迹来确认MASP-2蛋白质的不存在(数据未显示)。在LightCycler机器上，使用时间分辨RT-PCR，进一步确认了MAp19 mRNA的存在和MASP-2mRNA的不存在。MASP-2-/-小鼠确实继续如预计的表达MAp19、MASP-1和MASP-3 mRNA和蛋白质(数据未显示)。通过LightCycler分析，来评价MASP-2-/-小鼠中关于备解素、因子B、因子D、C4、C2和C3 mRNA的存在和丰度，并且发现与野生型同窝对照等同(数据未显示)。如实施例2中进一步描述的，来自纯合MASP-2-/-小鼠的血浆完全缺乏凝集素途径介导的补体活化。
在纯C57BL6背景上生成MASP-2-/-品系：在MASP-2-/-品系用作实验动物模型之前，使MASP-2-/-小鼠与纯C57BL6系回交杂交9代。
还如下生成其为鼠MASP-2-/-、MAp19+/+，并且表达人MASP-2转基因(鼠MASP-2敲除和人MASP-2敲入)的转基因小鼠品系：
材料和方法：构建如图4中所示的编码人MASP-2的小基因，称为“微型hMASP-2”(SEQ ID NO:49)，其包括人MASP2基因的启动子区，包括前3个外显子(外显子1至外显子3)，随后为代表后续8个外显子的编码序列的cDNA序列，从而编码由其内源启动子驱动的全长MASP-2蛋白。将微型hMASP-2构建体注射到MASP-2-/-的受精卵内，以便通过转基因表达的人MASP-2替换缺陷的鼠MASP2基因。
实施例2
本实施例证实了MASP-2是经由凝集素途径的活化补体所需的。
方法和材料：
凝集素途径特异性C4切割测定：C4切割测定已通过Petersen等人，J.Immunol.Methods 257:107(2001)进行描述，其测量了起因于来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的脂磷壁酸(LTA)的凝集素途径活化，所述脂磷壁酸结合L-纤维胶凝蛋白。如下所述，在添加来自MASP-2-/-小鼠的血清之前，通过用LPS和甘露聚糖或酵母聚糖包被板，由Petersen等人，(2001)描述的测定适于测量经由MBL的凝集素途径活化。测定还进行修改，以消除由于经典途径的C4切割的可能性。这通过使用含有1M NaCl的样品稀释缓冲液来实现，所述缓冲液允许凝集素途径识别组分与其配体的高亲和力结合，但阻止了内源性C4的活化，从而通过使C1复合物解离而排除了经典途径的参与。简言之，在修改的测定中，将血清样品(在高盐(1M NaCl)缓冲液中稀释)加入配体包被的板中，随后为在具有生理浓度的盐的缓冲液中添加恒定量的纯化C4。含有MASP-2的结合识别复合物切割C4，导致C4b沉积。
测定方法：
1)Nunc Maxisorb微量滴定板(Nunc，目录号442404，FisherScientific)用在包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3，pH 9.6)中稀释的1μg/ml甘露聚糖(M7504 Sigma)或任何其它配体(例如，下文列出的配体)进行包被。
下述试剂用于测定中：
a.甘露聚糖(在100μl包被缓冲液中的1μg/孔的甘露聚糖(M7504 Sigma))：
b.酵母聚糖(在100μl包被缓冲液中的1μg/孔酵母聚糖(Sigma))；
c.LTA(在100μl包被缓冲液中的1μg/孔或在20μl甲醇中的2μg/孔)
d.在包被缓冲液中的1μgH-纤维胶凝蛋白特异性Mab 4H5
e.来自绿色气球菌(Aerococcus viridans)的PSA(在100μl包被缓冲液中的2μg/孔)
f.在包被缓冲液中的 100μl/孔的福尔马林固定的金黄色葡萄球菌DSM20233(OD550＝0.5)。
2)使板在4℃下温育过夜。
3)在过夜温育后，通过使板与0.1％HAS-TBS封闭缓冲液(在10mM Tris-CL、140mMNaCl、1.5mM NaN3，pH 7.4中的0.1％(w/v)HSA)一起温育1-3小时，然后用TBS/tween/Ca2+(具有0.05％Tween 20和5mM CaCl2、1mM MgCl2的TBS，pH 7.4)将板洗涤3X，使残留的蛋白结合位点饱和。
4)待测试的血清样品在MBL结合缓冲液(1M NaCl)中进行稀释，并且将稀释的样品加入板中，并在4℃下温育过夜。仅接收缓冲液的孔用作阴性对照。
5)在4℃下温育过夜之后，将板用TBS/tween/Ca2+洗涤3X。然后将人C4(100μl/孔的在BBS(4mM巴比妥、145mM NaCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2，pH 7.4)中稀释的1μg/ml)加入板中，并且在37℃下温育90分钟。将板再次用TBS/tween/Ca2+洗涤3X。
6)C4b沉积用碱性磷酸酶缀合的鸡抗人C4c(在TBS/tween/Ca2+中1:1000稀释的)进行检测，将所述鸡抗人C4c加入板中并在室温下温育90分钟。然后将板再次用TBS/tween/Ca2+洗涤3X。
7)通过加入100μl对硝基苯磷酸盐底物溶液，在室温下温育20分钟，并且在微量滴定板阅读器中读取OD405，来检测碱性磷酸酶。
结果：图5A-B显示了在来自MASP-2 +/+(十字)、MASP-2+/-(实心圆圈)和MASP-2-/-(实心三角形)的血清稀释物中，在甘露聚糖(图5A)和酵母聚糖(图5B)上的C4b沉积量。图5C显示了基于测量对野生型血清标准化的C4b沉积量，相对于野生型小鼠(n＝5)，来自MASP-2/+小鼠(n＝5)和MASP-2-/-小鼠(n＝4)，在包被有酵母聚糖(白色条)或甘露聚糖(阴影条)的板上的相对C4转化酶活性。误差条代表标准差。如图5A-C中所示，在甘露聚糖和酵母聚糖包被的板上，来自MASP-2-/-小鼠的血浆完全缺乏凝集素途径介导的补体活化。这些结果明确地证实了，MASP-2是凝集素途径的效应子组分。
重组MASP-2重构来自MASP-2-/-小鼠的血清中的凝集素途径依赖性C4活化
为了确定MASP-2的不存在是MASP-2-/-小鼠中的凝集素途径依赖性C4活化丧失的直接原因，在上述C4切割测定中检查了将重组MASP-2蛋白加入血清样品中的效应。如下文实施例3中所述，功能活性的鼠MASP-2以及无催化活性的鼠MASP-2A(其中丝氨酸蛋白酶结构域中的活性位点丝氨酸残基取代了丙氨酸残基)重组蛋白质，如下文实施例3中所述产生并纯化。使来自4只MASP-2-/-小鼠的合并血清与蛋白质浓度增加的重组鼠MASP-2或无活性的重组鼠MASP-2A一起预温育，并且如上所述测定C4转化酶活性。
结果：如图6中所示，功能活性的鼠重组MASP-2蛋白(显示为空心三角形)对得自MASP-2-/-小鼠的血清的添加，以蛋白质浓度依赖性方式恢复了凝集素途径依赖性C4活化，而无催化活性的鼠MASP-2A蛋白(显示为星形)并未恢复C4活化。图6中所示的结果针对用合并的野生型小鼠血清(显示为虚线)观察到的C4活化进行标准化。
实施例3
本实施例描述了重组全长人、大鼠和鼠MASP-2、MASP-2衍生的多肽、以及MASP-2的无催化活性突变体形式的重组表达和蛋白质产生。
全长人、鼠和大鼠MASP-2的表达：
还将人MASP-2的全长cDNA序列(SEQ ID NO:4)亚克隆到哺乳动物表达载体pCI-Neo(Promega)内，所述表达载体在CMV增强子/启动子区的控制下，驱动真核生物表达(在Kaufman R.J.等人，Nucleic Acids Research 19:4485-90，1991；Kaufman，Methods inEnzymology，185:537-66(1991)中进行描述)。将全长小鼠cDNA(SEQ ID NO:50)和大鼠MASP-2 cDNA(SEQ ID NO:53)各自亚克隆到pED表达载体内。然后使用Maniatis等人，1989中描述的标准磷酸钙转染程序，将MASP-2表达载体转染到贴壁的中国仓鼠卵巢细胞系DXB1内。用这些构建体转染的细胞生长非常缓慢，暗示所编码的蛋白酶是细胞毒性的。
在另一种方法中，将含有通过其内源启动子驱动的MASP-2的人cDNA的小基因构建体(SEQ ID NO:49)瞬时转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)内。人MASP-2蛋白被分泌到培养基内，并且如下所述进行分离。
全长无催化活性的MASP-2的表达：
原理：在识别亚组分MBL或纤维胶凝蛋白(L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白或M-纤维胶凝蛋白)与其各自的碳水化合物模式结合后，MASP-2通过自催化切割被活化。导致MASP-2活化的自催化切割经常在来自血清的MASP-2的分离程序过程中，或在重组表达之后的纯化过程中发生。为了获得用作抗原的更稳定的蛋白质制剂，通过将存在于蛋白酶结构域的催化三联体中的丝氨酸残基替换为大鼠(SEQ ID NO:55 Ser617至Ala617)；小鼠(SEQID NO:52 Ser617至Ala617)；或人(SEQ ID NO:6Ser618至Ala618)中的丙氨酸残基，来产生设计为MASP-2A的无催化活性形式的MASP-2。
为了生成无催化活性的人和鼠MASP-2A蛋白，使用表5中所示的寡核苷酸进行定点诱变。
表5中的寡核苷酸被设计为对编码酶促活性的丝氨酸的人和鼠cDNA区域退火，并且寡核苷酸含有错配，以便将丝氨酸密码子改变为丙氨酸密码子。例如，PCR寡核苷酸SEQID NO:56-59与人MASP-2 cDNA(SEQ ID NO:4)组合使用，以扩增从起始密码子到酶促活性的丝氨酸以及从丝氨酸到终止密码子的区域，以生成含有Ser618至Ala618突变的突变MASP-2A的完整开放读码框。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳和条带制备后进行纯化，并且使用标准加尾程序生成单个腺苷重叠。然后将腺苷加尾的MASP-2A克隆到pGEM-T easy载体内，转化到大肠杆菌内。
通过将这两种寡核苷酸以等摩尔的量组合，在100℃下加热2分钟并缓慢冷却至室温，通过对SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65进行激酶化(kinasing)和退火，来生成无催化活性的大鼠MASP-2A蛋白。所得到的退火片段具有Pst1和Xba1相容性端部，并且被插入代替野生型大鼠MASP-2 cDNA(SEQ ID NO:53)的Pst1-Xba1片段，以生成大鼠MASP-2A。
5'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3'(SEQ ID NO:64)
5'CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3'(SEQ ID NO:65)
将人、鼠和大鼠的MASP-2A各自进一步亚克隆到哺乳动物表达载体pED或pCI-Neo内，并且如下所述转染到中国仓鼠卵巢细胞系DXB1内。
在另一种方法中，使用Chen等人，J.Biol.Chem.，276(28):25894-25902，2001中所述的方法，构建无催化活性形式的MASP-2。简言之，用Xho1和EcoR1消化含有全长人MASP-2cDNA的质粒(在Thiel等人，Nature 386:506，1997中进行描述)，并且将MASP-2 cDNA(本文描述为SEQ ID NO:4)克隆到pFastBac1杆状病毒转移载体(Life Technologies，NY)的相应限制位点内。然后，通过用天然区氨基酸610至625取代编码肽区氨基酸610-625(SEQ IDNO:13)的双链寡核苷酸，将在Ser618处的MASP-2丝氨酸蛋白酶活性位点改变为Ala618，以产生具有无活性蛋白酶结构域的MASP-2全长多肽。
含有衍生自人MASP-2的多肽区域的表达质粒的构建
使用MASP-2信号肽(SEQ ID NO:5的残基1-15)来产生下述构建体，以分泌MASP-2的各种结构域。通过PCR扩增编码MASP-2(SEQ ID NO:6)的残基1–121的区域(对应于N末端CUBI结构域)，来制备表达人MASP-2 CUBI结构域(SEQ ID NO:8)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2(SEQ ID NO:6)的残基1–166的区域(对应于N末端CUBIEGF结构域)，来制备表达人MASP-2 CUBIEGF结构域(SEQ ID NO:9)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2(SEQ ID NO:6)的残基1-293的区域(对应于N末端CUBIEGFCUBII结构域)，来制备表达人MASP-2CUBIEGFCUBII结构域(SEQ ID NO:10)的构建体。根据确定的PCR方法，使用VentR聚合酶和pBS-MASP-2作为模板，通过PCR扩增上文提到的结构域。有义引物的 5'引物序列(5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3'SEQ ID NO:34)在PCR产物的5'端处引入BamHI限制位点(加下划线的)。下表5中显示的关于每个MASP-2结构域的反义引物，设计为在每个PCR产物的端部处引入终止密码子(粗体字)，随后为EcoRI位点(加下划线的)。一旦扩增，DNA片段就用BamHI和EcoRI进行消化，并且克隆到pFastBac1载体的相应位点内。所得到的构建体通过限制性图谱进行表征，并且通过dsDNA测序加以确认。
表5：MASP-2 PCR引物
MASP-2的重组真核表达以及无酶促活性的小鼠、大鼠和人MASP-2A的蛋白质产生
使用标准磷酸钙转染程序(Maniatis等人，1989)，将上述MASP-2和MASP-2A表达构建体转染到DXB1细胞内。MASP-2A在无血清培养基中产生，以确保制剂不被其它血清蛋白质污染。每隔一天从融合细胞中收获培养基(总共四次)。对于这三个物种的每一种，重组MASP-2A的水平平均起来大约1.5mg/L培养基。
MASP-2A蛋白纯化：MASP-2A(上述Ser-Ala突变体)通过在MBP-A琼脂糖柱上的亲和层析进行纯化。这种策略使得无需使用外来标签的快速纯化成为可能。将MASP-2A(100-200ml用等体积的上样缓冲液(50mM Tris Cl，pH 7.5，含有150mM NaCl和25mM CaCl2)稀释的培养基)，装载到用10ml上样缓冲液预平衡的MBP琼脂糖亲和柱(4ml)上。在用进一步的10ml上样缓冲液洗涤之后，用含有1.25 M NaCl和10mM EDTA的50mM Tris Cl，pH 7.5，在1ml级分中洗脱蛋白质。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来鉴定含有MASP-2A的级分。必要时，通过在MonoQ柱(HR 5/5)上的离子交换层析，进一步纯化MASP-2A。蛋白质用含有50mM NaCl的50mM Tris-Cl pH 7.5进行透析，然后装载到在相同缓冲液中平衡的柱上。在洗涤之后，结合的MASP-2A用超过10ml的0.05–1M NaCl梯度进行洗脱。
结果：从200ml培养基中获得0.25–0.5mg MASP-2A蛋白的产率。由于糖基化，通过MALDI-MS测定的77.5 kDa分子量大于未修饰的多肽的计算值(73.5 kDa)。在N-糖基化位点各自处的聚糖附着解释了观察到的质量。MASP-2A作为单一条带在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上迁移，证实了它在生物合成过程中并未进行蛋白酶解加工。通过平衡超速离心测定的重均分子量与糖基化多肽的同二聚体的计算值一致。
重组人MASP-2多肽的产生
用于产生重组MASP-2和MASP-2A衍生多肽的另一种方法在Thielens，N.M.等人，J.Immunol.166:5068-5077，2001中进行描述。简言之，草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)昆虫细胞(从Novagen，Madison，WI获得的Ready-Plaque Sf9细胞)在Sf900II无血清培养基(Life Technologies)中生长且维持，所述培养基补充有50IU/ml青霉素和50mg/ml链霉素(Life Technologies)。粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(High Five)昆虫细胞(由Jadwiga Chroboczek，Institut de Biologie Structurale，Grenoble，法国提供)在TC100培养基(Life Technologies)中维持，所述培养基含有10％FCS(DominiqueDutscher，Brumath，法国)，补充有50IU/ml青霉素和50mg/ml链霉素。重组杆状病毒使用Bac-to-Bac(Life Technologies)生成。杆粒DNA使用Qiagen midiprep纯化系统(Qiagen)进行纯化，并且如制造商的方案中所述，使用在Sf900 II SFM培养基(LifeTechnologies)中的cellfectin，用于转染Sf9昆虫细胞。4天后收集重组病毒颗粒，通过病毒噬斑测定滴定，并且如通过King和Possee，于TheBaculovirus Expression System:ALaboratory Guide，Chapman and Hall Ltd.，London，第111-114页，1992所述进行扩增。
在28℃下，在Sf900 II SFM培养基中，用感染复数为2的含有MASP-2多肽的重组病毒，将High Five细胞(1.75x107个细胞/175-cm2组织培养瓶)感染96小时。通过离心收集上清液，并且添加氟磷酸二异丙酯至1mM的最终浓度。
MASP-2多肽被分泌到培养基中。培养上清液针对50mM NaCl、1mM CaCl2、50mM三乙醇胺盐酸盐，pH 8.1进行透析，并且以1.5ml/分钟装载到在相同缓冲液中平衡的Q-Sepharose Fast Flow柱(Amersham Pharmacia Biotech)(2.8x12 cm)上。通过施加在相同缓冲液中至350mM NaCl的1.2升线性梯度进行洗脱。含有重组MASP-2多肽的级分通过蛋白质印迹分析进行鉴定，通过添加(NH4)2SO4至60％(w/v)进行沉淀，并且在4℃下静置过夜。将团块重悬浮于145mM NaCl、1mM CaCl2、50mM三乙醇胺盐酸盐，pH 7.4中，并且施加到在相同缓冲液中平衡的TSK G3000SWG柱(7.5x600mm)(Tosohaas，Montgomeryville，PA)上。然后通过在Microsep微型浓缩器(m.w.截断＝10,000)(Filtron，Karlstein，德国)上的超滤，将纯化的多肽浓缩至0.3mg/ml。
实施例4
本实施例描述了产生针对MASP-2多肽的多克隆抗体的方法。
材料和方法：
MASP-2抗原：多克隆抗人MASP-2抗血清通过用下述分离的MASP-2多肽免疫兔而产生：从血清中分离的人MASP-2(SEQ ID NO:6)；如实施例3中所述的重组人MASP-2(SEQ IDNO:6)，含有无活性蛋白酶结构域(SEQ ID NO:13)的MASP-2A；以及如上文实施例3所述表达的重组CUBI(SEQ ID NO:8)、CUBEGFI(SEQ ID NO:9)和CUBEGFCUBII(SEQ ID NO:10)。
多克隆抗体：用BCG(卡介苗疫苗)引发的六周龄的兔，通过注射在无菌盐水溶液中以100μg/ml的100μg MASP-2多肽进行免疫。注射每4周完成，其中如实施例5中所述，通过ELISA测定监测抗体滴度。收集培养上清液，用于通过蛋白A亲和层析的纯化抗体。
实施例5
本实施例描述了用于产生针对大鼠或人MASP-2多肽的鼠单克隆抗体的方法。
材料和方法：
8-12周龄的雄性A/J小鼠(Harlan，Houston，Tex.)，用100μg人或大鼠rMASP-2和rMASP-2A多肽(如实施例3中所述进行制备)进行皮下注射，所述多肽在200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4中的完全弗氏佐剂(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)中。以两周间隔，小鼠用在不完全弗氏佐剂中的50μg人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽进行两次皮下注射。在第四周时，小鼠用在PBS中的50μg人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽进行注射，并且4天后进行融合。
对于每次融合，由免疫小鼠的脾脏制备单细胞悬浮液，并且用于与Sp2/0骨髓瘤细胞的融合。在含有50％聚乙二醇(M.W.1450)(Kodak，Rochester，N.Y.)和5％二甲基亚砜(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)的培养基中，使5x108个Sp2/0细胞和5x108个脾细胞融合。然后将细胞调整至Iscove培养基(Gibco，Grand Island，N.Y.)中每200μl悬浮液1.5x105个脾细胞的浓度，所述培养基补充有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷。将200微升的细胞悬浮液加入约二十块96孔微量培养板的每个孔中。在约十天后，抽取培养上清液，用于在ELISA测定中筛选与纯化的因子MASP-2的反应性。
ELISA测定：通过在室温下添加50μl的50ng/ml纯化hMASP-2或大鼠rMASP-2(或rMASP-2A)，将2(Dynatech Laboratories，Chantilly，Va.)微量测试板的孔包被过夜。用于包被的低浓度的MASP-2使得能够选择高亲和力的抗体。在通过轻弹板去除包被溶液后，将200μl BLOTTO(脱脂奶粉)的PBS溶液加入每个孔中一小时，以封闭非特异性位点。一小时后，然后用缓冲液PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤孔。收集来自每个融合孔的50微升的培养上清液，并且与50μl BLOTTO混合，然后加入微量测试板的各个孔中。在温育一小时后，将孔用PBST进行洗涤。然后通过与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG(Fc特异性)(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，Pa.)反应，来检测结合的鼠抗体，并且在BLOTTO中以1:2,000进行稀释。将含有0.1％3,3,5,5四甲基联苯胺(Sigma，St.Louis，Mo.)和0.0003％过氧化氢(Sigma)的过氧化物酶底物溶液加入孔中，用于显色30分钟。通过加入50μl 2M H2SO4/孔来终止反应。用ELISAReader(Instruments，Winooski，Vt.)，读取反应混合物在450nm处的光密度。
MASP-2结合测定：
可以在结合测定中测试在上述MASP-2 ELISA测定中测试呈阳性的培养上清液，以确定MASP-2抑制剂对于MASP-2具有的结合亲和力。类似的测定也可以用于确定抑制剂是否与补体系统中的其它抗原结合。
聚苯乙烯微量滴定板孔(96孔中等结合板，Corning Costar，Cambridge，MA)用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4中的MASP-2(20ng/100μl/孔，Advanced ResearchTechnology，SanDiego，CA)在4℃下包被过夜。在吸出MASP-2溶液后，将孔用含有1％牛血清白蛋白(BSA；Sigma Chemical)的PBS在室温下封闭2小时。不含MASP-2包被的孔充当背景对照。将封闭溶液中以不同浓度的杂交瘤上清液或纯化的抗MASP-2 MoAb的等分试样加入孔中。在室温下温育2小时之后，将孔用PBS进行充分清洗。通过在封闭溶液中加入过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Sigma Chemical)，来检测MASP-2结合的抗MASP-2 MoAb，允许其在室温下温育1小时。将板再次用PBS充分清洗，并且添加100μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)。通过添加100μl 1M磷酸猝灭TMB的反应，并且在微板阅读器(SPECTRA MAX 250，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中，在450 nm处读取板。
然后在功能测定例如实施例2中所述的C4切割测定中，测试来自阳性孔的培养上清液抑制补体活化的能力。然后通过有限稀释来克隆阳性孔中的细胞。如上所述，在ELISA测定中再次测试MoAb与hMASP-2的反应性。所选择的杂交瘤在旋转瓶中生长，并且收集耗尽的培养上清液，用于通过蛋白A亲和层析的抗体纯化。
实施例6
本实施例描述了人源化的鼠抗MASP-2抗体和抗体片段的生成和产生。
如实施例5中所述，在雄性A/J小鼠中生成鼠抗MASP-2单克隆抗体。然后通过用其人配对物替换鼠恒定区，以生成抗体的嵌合IgG和Fab片段，如下所述将鼠抗体人源化，以降低其免疫原性，其根据本发明可用于抑制人受试者的MASP-2依赖性补体活化的不良作用。
1.从鼠杂交瘤细胞中克隆抗MASP-2可变区基因。遵循制造商的方案(Biotech，Houston，Tex.)，使用RNAzol，从分泌抗MASP-2 MoAb的杂交瘤细胞(如实施例7中所述获得)中分离总RNA。使用寡聚dT作为引物，从总RNA合成第一链cDNA。使用免疫球蛋白恒定C区衍生的3'引物、以及衍生自鼠VH或VK基因的前导肽或第一构架区的简并引物组作为5'引物，来执行PCR。如通过Chen和Platuscas所述(Chen，P.F.，Scand.J.Immunol.35:539-549，1992)，来进行锚定PCR。为了克隆VK基因，使用Notl-MAK1引物(5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3'SEQ ID NO:38)，来制备双链cDNA。将退火的衔接子AD1(5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3'SEQ ID NO:39)和AD2(5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3'SEQID NO:40)连接到双链cDNA的5'和3'末端两者。通过NotI消化去除在3'端处的衔接子。然后将消化的产物用作PCR中的模板，其中AD1寡核苷酸作为5'引物，且MAK2(5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3'SEQ ID NO:41)作为3'引物。将大约500 bp的DNA片段克隆到pUC19内。选择几个克隆用于序列分析，以验证克隆的序列包含预计的鼠免疫球蛋白恒定区。Not1-MAK1和MAK2寡核苷酸衍生自VK区，并且距Cκ基因第一个碱基对下游分别为182和84bp。选择包括完整VK和前导肽的克隆。
为了克隆VH基因，使用Not1 MAG1引物(5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3'SEQID NO:42)，来制备双链cDNA。将退火的衔接子AD1和AD2连接到双链cDNA的5'和3'末端两者。通过NotI消化去除在3'端处的衔接子。将消化的产物用作PCR中的模板，其中AD1寡核苷酸和MAG2(5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3'SEQ ID NO:43)作为引物。将长度为500至600bp的DNA片段克隆到pUC19内。Not1-MAG1和MAG2寡核苷酸衍生自鼠Cγ.7.1区，并且距鼠Cγ.7.1基因的第一个bp下游分别为180和93bp。选择包含完整VH和前导肽的克隆。
2.用于嵌合MASP-2 IgG和Fab的表达载体的构建。上述克隆的VH和VK基因用作PCR反应中的模板，以将Kozak共有序列加入核苷酸序列的5'端，并且将剪接供体加入核苷酸序列的3'端。在分析序列以确认不存在PCR错误后，将VH和VK VK分别插入含有人C.γ1和C.κ的表达载体盒内，以得到pSV2neoVH-huCγ1和pSV2neoV-huCγ。重链和轻链载体的CsCl梯度纯化的质粒DNA用于通过电穿孔转染COS细胞。在48小时后，通过ELISA测试培养上清液，以确认大约200ng/ml的嵌合IgG的存在。收获细胞并制备总RNA。使用寡聚dT作为引物，从总RNA合成第一链cDNA。该cDNA用作PCR中的模板，以生成Fd和κDNA片段。对于Fd基因，使用5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3'(SEQ ID NO:44)作为5'引物和CH1衍生的3'引物(5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3'SEQ ID NO:45)，来进行PCR。DNA序列确认为含有人IgG1的完整VH和CH1结构域。在用适当的酶消化后，将Fd DNA片段在表达载体盒pSV2dhfr-TUS的HindIII和BamHI限制位点处插入，以得到pSV2dhfrFd。pSV2质粒是商购可得的，并且由来自各种来源的DNA区段组成：pBR322 DNA(细线)含有pBR322的DNA复制起点(pBRori)和内酰胺酶氨苄青霉素抗性基因(Amp)；以更宽的阴影线表示并标记的SV40 DNA含有SV40的DNA复制起点(SV40 ori)、早期启动子(dhfr和neo基因的5')和多聚腺苷酸化信号(dhfr和neo基因的3')。SV40衍生的多聚腺苷酸化信号(pA)也置于Fd基因的3'端处。
对于κ基因，使用5'-AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3'(SEQ ID NO:46)作为5'引物和CK衍生的3'引物(5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3'SEQ ID NO:47)，来进行PCR。DNA序列确认为含有完整的VK和人CK区。在用适当的限制性酶消化后，将κDNA片段在表达载体盒pSV2neo-TUS的HindIII和BamHI限制位点处插入，以得到pSV2neoK。Fd和κ基因两者的表达均由HCMV衍生的增强子和启动子元件驱动。由于Fd基因不包括涉及链间二硫键的半胱氨酸氨基酸残基，因此这种重组嵌合Fab含有非共价连接的重链和轻链。这种嵌合Fab被指定为cFab。
为了获得具有重链和轻链间二硫键的重组Fab，可以将上述Fd基因扩展为包括来自人IgG1的铰链区的另外9个氨基酸的编码序列(EPKSCDKTH SEQ ID NO:48)。编码在Fd基因的3'端处的30个氨基酸的BstEII-BamHI DNA区段可以替换为编码扩展Fd的DNA区段，导致pSV2dhfrFd/9aa。
3.嵌合抗MASP-2 IgG的表达和纯化
为了生成分泌嵌合抗MASP-2 IgG的细胞系，通过电穿孔，用pSV2neoVH-huC.γ1和pSV2neoV-huCκ的纯化质粒DNA转染NSO细胞。在0.7mg/ml G418的存在下选择转染的细胞。使用含血清的培养基，使细胞在250ml旋转瓶中生长。
将100ml旋转培养物的培养上清液装载到10-ml PROSEP-A柱(Bioprocessing，Inc.，Princeton，N.J.)上。将柱用10柱床体积的PBS进行洗涤。用50mM柠檬酸盐缓冲液，pH3.0来洗脱结合的抗体。将等体积的1M Hepes，pH 8.0加入含有纯化抗体的级分中，以将pH调整至7.0。通过Millipore膜超滤(M.W.截断：3,000)，通过与PBS的缓冲液交换去除残留的盐。纯化抗体的蛋白质浓度通过BCA方法(Pierce)来确定。
4.嵌合抗MASP-2 Fab的表达和纯化
为了生成分泌嵌合抗MASP-2 Fab的细胞系，通过电穿孔，用pSV2dhfrFd(或pSV2dhfrFd/9aa)和pSV2neoκ的纯化质粒DNA转染CHO细胞。在G418和氨甲蝶呤的存在下选择转染的细胞。所选择的细胞系在浓度渐增的氨甲蝶呤下进行扩增。细胞通过有限稀释进行单细胞亚克隆。然后使用无血清培养基，使高生产性单细胞亚克隆细胞系在100ml旋转培养物中生长。
通过使用针对MASP-2 MoAb的小鼠抗独特型MoAb的亲和层析，来纯化嵌合抗MASP-2 Fab。可以通过用与钥孔血蓝蛋白(KLH)缀合的鼠抗MASP-2 MoAb来免疫小鼠，并且筛选可以与人MASP-2竞争的特异性MoAb结合，来制备抗独特型MASP-2 MoAb。对于纯化，将来自产生cFab或cFab/9aa的CHO细胞的旋转培养物的100ml上清液，装载到与抗独特型MASP-2MoAb偶联的亲和柱上。然后将柱用PBS进行充分清洗，然后用50mM二乙胺，pH 11.5洗脱结合的Fab。如上所述，通过缓冲液交换去除残留的盐。纯化Fab的蛋白质浓度通过BCA方法(Pierce)来确定。
嵌合的MASP-2 IgG、cFab和cFAb/9aa抑制MASP-2依赖性补体途径的能力，可以通过使用实施例2或实施例7中所述的抑制测定来确定。
实施例7
本实施例描述了用作功能筛选的体外C4切割测定，以鉴定能够经由L-纤维胶凝蛋白/P35、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或甘露聚糖，来阻断MASP-2依赖性补体活化的MASP-2抑制剂。
C4切割测定：C4切割测定已通过Petersen，S.V.等人，J.Immunol.Methods 257:107，2001进行描述，其测量了起因于来自金黄色葡萄球菌的脂磷壁酸(LTA)的凝集素途径活化，所述脂磷壁酸结合L-纤维胶凝蛋白。
试剂：福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(DSM20233)如下进行制备：细菌在胰蛋白酶大豆血液培养基中在37℃下生长过夜，用PBS洗涤3次，然后在室温下在PBS/0.5％福尔马林中固定1小时，然后用PBS进一步洗涤3次，然后重悬浮于包被缓冲液(15mM Na2Co3、35mMNaHCO3，pH 9.6)中。
测定：Nunc微量滴定板(Nalgene Nunc International，Rochester，NY)的孔用以下进行包被：100μl在包被缓冲液中的福尔马林固定的金黄色葡萄球菌DSM20233(OD550＝0.5)，其中在包被缓冲液中具有1μg L-纤维胶凝蛋白。在过夜温育后，将孔用0.1％人血清白蛋白(HSA)的TBS(10mM Tris HCl、140mM NaCl，pH 7.4)溶液进行封闭，然后用含有0.05％Tween 20和5mM CaCl2的TBS(洗涤缓冲液)进行洗涤。人血清样品在20mM Tris-HCl、1M NaCl、10mM CaCl2、0.05％TritonX-100、0.1％HSA，pH 7.4中进行稀释，其防止内源C4活化并且使C1复合物(由C1q、C1r和C1s组成)解离。MASP-2抑制剂包括抗MASP-2 MoAb和抑制性肽以不同的浓度加入血清样品中。将稀释的样品加入板中，并且在4℃下温育过夜。在24小时后，将板用洗涤缓冲液进行充分洗涤，然后将在100μl4mM巴比妥、145mM NaCl、2mMCaCl2、1mM MgCl2，pH 7.4中的0.1μg纯化人C4(如Dodds，A.W.，Methods Enzymol.223:46，1993中所述获得)加入每个孔中。在37℃下1.5小时后，将板再次洗涤，并且C4b沉积使用碱性磷酸酶缀合的鸡抗人C4c抗体(从Immunsystem，Uppsala，瑞典获得)进行检测，并且使用比色底物对硝基苯磷酸盐进行测量。
在甘露聚糖上的C4测定：上述测定适于在加入与各种MASP-2抑制剂混合的血清之前，通过用LSP和甘露聚糖包被板，来测量经由MBL的凝集素途径活化。
在H-纤维胶凝蛋白(Hakata Ag)上的C4测定：上述测定适于在加入与各种MASP-2抑制剂混合的血清之前，通过用LPS和H-纤维胶凝蛋白包被板，来测量经由H-纤维胶凝蛋白的凝集素途径活化。
实施例8
下述测定证实了野生型和MASP-2-/-小鼠中的经典途径活化的存在。
方法：通过在室温下，用在10mM Tris、140mM NaCl，pH 7.4中的0.1％人血清白蛋白包被微量滴定板(Nunc，目录号442404，Fisher Scientific)共1小时，随后为在4℃下，与在TBS/tween/Ca2+中1:1000稀释的绵羊抗全血清抗血清(Scottish AntibodyProduction Unit，Carluke，苏格兰)的过夜温育，来原位生成免疫复合物。从野生型和MASP-2-/-小鼠获得血清样品，并且加入包被的板中。制备了其中C1q从野生型和MASP-2/血清样品中耗尽的对照样品。根据供应商的说明书，使用由兔抗人C1q IgG(Dako，Glostrup，丹麦)包被的蛋白A偶联的(Dynal Biotech，Oslo，挪威)，来制备C1q耗尽的小鼠血清。使板在37℃下温育90分钟。用在TBS/tw/Ca++中以1:1000稀释的多克隆抗人C3c抗体(Dako A 062)，来检测结合的C3b。二抗是山羊抗兔IgG。
结果：图7显示了在野生型血清、MASP-2-/-血清、C1q耗尽的野生型和C1q耗尽的MASP-2-/-血清中，用IgG包被的板上的相对C3b沉积水平。这些结果证实了，经典途径在MASP-2-/-小鼠品系中是完整的。
实施例9
通过分析MASP-2抑制剂在其中经典途径通过免疫复合物启动的条件下的效应，下述测定用于测试MASP-2抑制剂是否阻断经典途径。
方法：为了测试MASP-2抑制剂对其中经典途径通过免疫复合物启动的补体活化条件的作用，使一式三份的含有90％NHS的50μl样品在10μg/ml免疫复合物(IC)或PBS的存在下在37℃下温育，并且在37℃温育期间还包括平行的一式三份样品(+/-IC)，其含有200nM抗备解素单克隆抗体。在37℃下温育2小时后，向所有样品中添加13mM EDTA，以停止进一步的补体活化，并且将样品立即冷却至5℃。然后将样品贮存于70℃下，然后遵循制造商的说明书，使用ELISA试剂盒(Quidel，目录号A015和A009)，来测定补体活化产物(C3a和sC5b-9)。
实施例10
本实施例描述了阻断MASP-2活性的高亲和力抗MASP-2 Fab2抗体片段的鉴定。
背景和原理：MASP-2是复杂的蛋白质，具有许多分开的功能结构域，包括：MBL和纤维胶凝蛋白的结合位点、丝氨酸蛋白酶催化位点、蛋白酶解底物C2的结合位点、蛋白酶解底物C4的结合位点、MASP-2酶原的自活化的MASP-2切割位点和两个Ca++结合位点。鉴定了以高亲和力与MASP-2结合的Fab2抗体片段，并且在功能测定中测试了所鉴定的Fab2片段，以确定它们是否能够阻断MASP-2功能活性。
为了阻断MASP-2功能活性，抗体或Fab2抗体片段必须结合并干扰MASP-2上对于MASP-2功能活性必需的结构表位。因此，许多或所有高亲和力结合抗MASP-2Fab2可能并不抑制MASP-2功能活性，除非它们与MASP-2上直接涉及MASP-2功能活性的结构表位结合。
测量凝集素途径C3转化酶形成的抑制的功能测定用于评估抗MASP-2 Fab2的“阻断活性”。已知MASP-2在凝集素途径中的主要生理作用是生成凝集素介导的补体途径的下一个功能性组分，即凝集素途径C3转化酶。凝集素途径C3转化酶是关键的酶促复合物(C4bC2a)，其将C3蛋白酶解切割成C3a和C3b。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶(C4bC2a)的结构组分；然而，需要MASP-2功能活性，以便生成构成凝集素途径C3转化酶的两种蛋白质组分(C4b、C2a)。此外，上文列出的MASP-2的所有分开的功能活性似乎是必需的，以便使MASP-2用于生成凝集素途径C3转化酶。出于这些原因，认为用于评估抗MASP-2 Fab2的“阻断活性”的优选测定是功能测定，其测量凝集素途径C3转化酶形成的抑制。
高亲和力Fab2的生成：人可变轻链和重链抗体序列的噬菌体展示文库、以及用于鉴定与所选目的配体反应的Fab2的自动化抗体选择技术，用于产生针对大鼠MASP-2蛋白(SEQ ID NO:55)的高亲和力Fab2。已知量的大鼠MASP-2(～1mg，>85％纯的)蛋白用于抗体筛选。利用三轮扩增来选择具有最佳亲和力的抗体。挑选表达抗体片段的大约250个不同命中，用于ELISA筛选。随后对高亲和力命中进行测序，以确定不同抗体的独特性。
纯化了五十种独特的抗MASP-2抗体，并且250μg每种纯化的Fab2抗体用于MASP-2结合亲和力的表征和补体途径功能测试，如下文更详细地描述的。
用于评估抗MASP-2 Fab2的抑制(阻断)活性的测定
1.测量凝集素途径C3转化酶形成的抑制的测定：
背景：凝集素途径C3转化酶是酶促复合物(C4bC2a)，其将C3蛋白酶解切割成两种有力的促炎片段：过敏毒素C3a和调理素C3b。就介导炎症而言，C3转化酶的形成似乎是凝集素途径中的关键步骤。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶(C4bC2a)的结构组分；因此，抗MASP-2抗体(或Fab2)并不直接抑制预先存在的C3转化酶的活性。然而，需要MASP-2丝氨酸蛋白酶活性，以便生成构成凝集素途径C3转化酶的两种蛋白质组分(C4b、C2a)。因此，抑制MASP-2功能活性的抗MASP-2 Fab2(即，阻断性抗MASP-2 Fab2)将抑制凝集素途径C3转化酶的从头形成。C3含有罕见且高反应性的硫酯基团作为其结构的部分。在该测定中通过C3转化酶切割C3后，C3b上的硫酯基可以与大分子上的羟基或氨基形成共价键，所述大分子经由酯或酰胺键合固定在塑料孔的底部上，因此促成在ELISA测定中的C3b检测。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知活化剂。在测量C3转化酶形成的下述方法中，使包被有甘露聚糖的塑料孔与稀释的大鼠血清在37℃下一起温育30分钟，以活化凝集素途径。然后将孔进行洗涤，并且使用标准ELISA方法测定固定在孔上的C3b。在该测定中生成的C3b的量是凝集素途径C3转化酶的从头形成的直接反映。以所选浓度的抗MASP-2 Fab2在该测定中就其抑制C3转化酶形成和后续C3b生成的能力进行测试。
方法：
使96孔Costar Medium Binding板在5℃下与以1μg/50μL/孔的甘露聚糖一起温育过夜，所述甘露聚糖在50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5中进行稀释。在过夜温育后，每个孔用200μL PBS洗涤3次。然后将孔用100μL/孔的1％牛血清白蛋白的PBS溶液进行封闭，并且在室温下伴随轻柔混合温育一小时。然后每个孔用200μL PBS洗涤3次。抗MASP-2 Fab2样品在5℃下在含有Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0mM巴比妥、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％明胶，pH 7.4)中稀释至所选浓度。将0.5％大鼠血清在5℃下加入上述样品中，并且将100μL转移到每个孔中。将板覆盖并且在37℃水浴中温育30分钟，以允许补体活化。通过将板从37℃水浴转移到含有冰水混合物的容器中，来终止反应。每个孔用200μL PBS Tween20(0.05％Tween 20的PBS溶液)洗涤5次，然后用200μL PBS洗涤两次。将100μL/孔的1:10,000稀释的一抗(兔抗人C3c，DAKO A0062)加入含有2.0mg/ml牛血清白蛋白的PBS中，并且在室温下伴随轻柔混合温育1小时。每个孔用5x200μL PBS进行洗涤。将100μL/孔的1:10,000稀释的二抗(过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG，American QualexA102PU)加入含有2.0mg/ml牛血清白蛋白的PBS中，并且在室温下在振荡器上伴随轻柔混合温育一小时。每个孔用200μLPBS洗涤5次。加入100μL/孔的过氧化物酶底物TMB(Kirkegaard&Perry Laboratories)，并且在室温下温育10分钟。通过加入100μL/孔的1.0 M H3PO4来终止过氧化物酶反应，并且测量OD450。
2.测量MASP-2依赖性C4切割的抑制的测定
背景：MASP-2的丝氨酸蛋白酶活性是高度特异性的，并且仅鉴定了MASP-2的两种蛋白质底物：C2和C4。C4的切割生成C4a和C4b。抗MASP-2 Fab2可以与MASP-2上直接涉及C4切割的结构表位(例如，C4的MASP-2结合位点；MASP-2丝氨酸蛋白酶催化位点)结合，并且从而抑制MASP-2的C4切割功能活性。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知活化剂。在测量MASP-2的C4切割活性的下述方法中，使包被有甘露聚糖的塑料孔与稀释的大鼠血清在37℃下一起温育30分钟，以活化凝集素途径。由于这种ELISA测定中使用的一抗仅识别人C4，因此稀释的大鼠血清中还补充有人C4(1.0μg/ml)。然后将孔进行洗涤，并且使用标准ELISA方法测定固定在孔上的人C4b。在该测定中生成的C4b的量是MASP-2依赖性C4切割活性的量度。以所选浓度的抗MASP-2 Fab2在该测定中就其抑制C4b切割的能力进行测试。
方法：使96孔Costar Medium Binding板在5℃下与1.0μg/50μL/孔的甘露聚糖一起温育过夜，所述甘露聚糖在50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5中进行稀释。每个孔用200μL PBS洗涤3X。然后将孔用100μL/孔的1％牛血清白蛋白的PBS溶液进行封闭，并且在室温下伴随轻柔混合温育一小时。每个孔用200μL PBS洗涤3X。抗MASP-2 Fab2样品在5℃下在含有Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0mM巴比妥、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％明胶，pH7.4)中稀释至所选浓度。这些样品中还包括1.0μg/ml人C4(Quidel)。将0.5％大鼠血清在5℃下加入上述样品中，并且将100μL转移到每个孔中。将板覆盖并且在37℃水浴中温育30分钟，以允许补体活化。通过将板从37℃水浴转移到含有冰水混合物的容器中，来终止反应。每个孔用5x200μL PBS-Tween 20(0.05％Tween 20的PBS溶液)进行洗涤，每个孔然后用200μL PBS洗涤2X。将100μL/孔的1:700稀释的生物素缀合的鸡抗人C4c(Immunsystem AB，Uppsala，瑞典)加入含有2.0mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，并且在室温下伴随轻柔混合温育一小时。每个孔用5x200μL PBS进行洗涤。将100μL/孔的0.1μg/ml过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白(Pierce Chemical#21126)加入含有2.0mg/ml BSA的PBS中，并且在室温下在振荡器上伴随轻柔混合温育一小时。每个孔用5x200μL PBS进行洗涤。加入100μL/孔的过氧化物酶底物TMB(Kirkegaard&Perry Laboratories)，并且在室温下温育16分钟。通过加入100μL/孔的1.0M H3PO4来终止过氧化物酶反应，并且测量OD450。
3.抗大鼠MASP-2 Fab2与‘天然’大鼠MASP-2的结合测定
背景：MASP-2通常作为MASP-2二聚体复合物存在于血浆中，所述复合物还包括特异性凝集素分子(甘露糖结合蛋白(MBL)和纤维胶凝蛋白)。因此，如果有兴趣研究抗MASP-2Fab2与MASP-2生理相关形式的结合，则重要的是开发这样的结合测定，其中使用Fab2和血浆中的‘天然’MASP-2，而不是纯化的重组MASP-2之间的相互作用。在这种结合测定中，首先将来自10％大鼠血清的‘天然’MASP-2 MBL复合物固定到甘露聚糖包被的孔上。然后使用标准ELISA方法，研究了各种抗MASP-2Fab2与固定的‘天然’MASP-2的结合亲和力。
方法：使96孔CostarHigh Binding板在5℃下与1μg/50μL/孔的甘露聚糖一起温育过夜，所述甘露聚糖在50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5中进行稀释。每个孔用200μL PBS洗涤3X。将孔用100μL/孔的0.5％脱脂奶粉的PBST(具有0.05％Tween 20的PBS)溶液进行封闭，并且在室温下伴随轻柔混合温育一小时。每个孔用200μL TBS/Tween/Ca++洗涤缓冲液(Tris缓冲盐水，0.05％Tween 20，含有5.0mM CaCl2，pH 7.4)洗涤3X。在冰上制备在高盐结合缓冲液(20mM Tris、1.0 M NaCl、10mM CaCl2、0.05％Triton-X100、0.1％(w/v)牛血清白蛋白，pH7.4)中的10％大鼠血清，加入100μL/孔，并在5℃下温育过夜。孔用200μL TBS/Tween/Ca++洗涤缓冲液洗涤3X。孔随后用200μL PBS洗涤2X。加入100μL/孔的所选浓度的抗MASP-2 Fab2，其在含有Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0mM巴比妥、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％明胶，pH 7.4)中进行稀释，并且在室温下伴随轻柔混合温育一小时。每个孔用5x200μL PBS进行洗涤。加入100μL/孔的HRP缀合的山羊抗Fab2(Biogenesis，目录号0500-0099)，其在2.0mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液中进行1:5000稀释，并且在室温下伴随轻柔混合温育一小时。每个孔用5x200μL PBS进行洗涤。加入100μL/孔的过氧化物酶底物TMB(Kirkegaard&PerryLaboratories)，并且在室温下温育70分钟。通过加入100μL/孔的1.0 MH3PO4来终止过氧化物酶反应，并且测量OD450。
结果：
挑选以高亲和力与大鼠MASP-2蛋白反应的大约250种不同的Fab2，用于ELISA筛选。对这些高亲和力的Fab2进行测序，以确定不同抗体的独特性，并且纯化了50种独特的抗MASP-2抗体用于进一步分析。250μg每种纯化的Fab2抗体用于MASP-2结合亲和力的表征和补体途径功能测试。这种分析的结果显示于下表6中。
表6：阻断凝集素途径补体活化的抗MASP-2 Fab2
如上表6中所示，在测试的50种抗MASP-2 Fab2中，17种Fab2被鉴定为MASP-2阻断性Fab2，其有力地抑制C3转化酶形成，具有等于或小于10nM Fab2的IC50(34％的阳性命中率)。鉴定的17种Fab2中的8种具有在亚纳摩尔范围内的IC50。此外，表6中所示的所有17种MASP-2阻断性Fab2，在凝集素途径C3转化酶测定中给出C3转化酶形成的基本完全抑制。图8A以图形方式示出了，关于Fab2抗体#11的C3转化酶形成测定的结果，所述Fab2抗体#11是所测试的其它Fab2抗体的代表，其结果显示于表6中。这是重要的考虑因素，因为即使当每个MASP-2分子由Fab2结合时，“阻断”Fab2可能仅部分地抑制MASP-2功能，这在理论上是可能的。
尽管甘露聚糖是凝集素途径的已知活化剂，但大鼠血清中的抗甘露聚糖抗体的存在也可能活化经典途径，并且经由经典途径C3转化酶生成C3b，这在理论上是可能的。然而，本实施例中列出的17种阻断性抗MASP-2 Fab2各自有力地抑制C3b生成(>95％)，因此证实了该测定对于凝集素途径C3转化酶的特异性。
还对所有17种阻断性Fab2执行结合测定，以便计算关于各自的表观Kd。表6中也显示了关于六种阻断性Fab2，抗大鼠MASP-2 Fab2与天然大鼠MASP-2的结合测定结果。图8B以图形方式示出了，用Fab2抗体#11的结合测定结果。还对于其它Fab2进行了类似的结合测定，其结果显示于表6中。一般而言，对于6种Fab2各自与‘天然’MASP-2结合而获得的表观Kd，与C3转化酶功能测定中关于Fab2的IC50合理地良好对应。存在MASP-2在其蛋白酶活性活化后，经历了从‘无活性’到‘活性’形式的构象变化的证据(Feinberg等人，EMBOJ22:2348-59(2003)；Gal等人，J.Biol.Chem.280:33435-44(2005))。在用于C3转化酶形成测定的正常大鼠血浆中，MASP-2主要以‘无活性’酶原构象存在。相比之下，在结合测定中，MASP-2作为复合物的部分存在，所述复合物具有与固定的甘露聚糖结合的MBL；因此，MASP-2处于‘活性’构象(Petersen等人，J.ImmunolMethods 257:107-16，2001)。因而，对于在这两种功能测定中测试的17种阻断性Fab2中的每种，不一定预计IC50与Kd之间的确切对应，因为在每种测定中，Fab2结合不同构象形式的MASP-2。然而，除了Fab2#88之外，对于在两种测定中测试的其它16种Fab2中的每种，IC50与表观Kd之间似乎存在合理地紧密对应(参见表6)。
几种阻断性Fab2就MASP-2介导的C4切割的抑制进行评估。图8C以图形方式示出了C4切割测定的结果，显示了用Fab2#41的抑制，具有IC50＝0.81nM(参见表6)。如图9中所示，所有测试的Fab2被发现抑制C4切割，其IC50与C3转化酶测定中获得的IC50相似(参见表6)。
尽管甘露聚糖是凝集素途径的已知活化剂，但大鼠血清中的抗甘露聚糖抗体的存在也可能活化经典途径，并且从而通过C1s介导的C4切割而生成C4b，这在理论上是可能的。然而，已鉴定了几种抗MASP-2 Fab2，其有力地抑制C4b生成(>95％)，因此证实了这种测定对于MASP-2介导的C4切割的特异性。如同C3，C4含有罕见且高反应性的硫酯基团作为其结构的部分。在该测定中通过MASP-2切割C4后，C4b上的硫酯基可以与大分子上的羟基或氨基形成共价键，所述大分子经由酯或酰胺键固定在塑料孔的底部上，因此促成在ELISA测定中的C4b检测。
这些研究明确地证实针对大鼠MASP-2蛋白的高亲和力Fab2的产生，所述Fab2在功能上阻断C4和C3转化酶活性两者，从而防止了凝集素途径活化。
实施例11
本实施例描述了关于几种阻断性抗大鼠MASP-2 Fab2抗体的表位作图，所述抗体如实施例10中所述生成。
方法：
如图10中所示，使用pED4载体，在CHO细胞中表达全部具有N末端6X His标签的下述蛋白质：
大鼠MASP-2A，通过将在活性中心处的丝氨酸改变为丙氨酸(S613A)而失活的全长MASP-2蛋白；
大鼠MASP-2K，进行改变以降低自活化(R424K)的全长MASP-2蛋白；
CUBI-II，大鼠MASP-2的N末端片段，其仅含有CUBI、EGF样和CUBII结构域；和
CUBI/EGF样，大鼠MASP-2的N末端片段，其仅含有CUBI和EGF样结构域。
如先前所述(Chen等人，J.Biol.Chem.276:25894-02(2001))，通过镍亲和层析，从培养上清液中纯化这些蛋白质。
使用pTrxFus(Invitrogen)，含有大鼠MASP-2的CCPII和丝氨酸蛋白酶结构域的C末端多肽(CCPII-SP)，作为硫氧还蛋白融合蛋白在大肠杆菌中进行表达。使用Thiobond亲和树脂，从细胞裂解产物中纯化蛋白质。硫氧还蛋白融合配偶体作为阴性对照由空pTrxFus进行表达。
将所有重组蛋白质透析到TBS缓冲液内，并且通过测量在280 nm处的OD来确定其浓度。
斑点印迹分析：
将上文描述和图10中所示的5种重组MASP-2多肽(以及作为用于CCPII-丝氨酸蛋白酶多肽的阴性对照的硫氧还蛋白多肽)的系列稀释物，点样到硝酸纤维素膜上。点样的蛋白质的量范围从100ng到6.4pg，在五倍步骤中。在以后的实验中，点样的蛋白质的量范围从50ng下降到16pg，再次在五倍步骤中。膜用5％脱脂奶粉的TBS(封闭缓冲液)溶液进行封闭，然后与在封闭缓冲液(含有5.0mM Ca2+)中的1.0μg/ml抗MASP-2 Fab2一起温育。使用HRP缀合的抗人Fab(AbD/Serotec；1/10,000稀释的)和ECL检测试剂盒(Amersham)，来检测结合的Fab2。一种膜与作为阳性对照的多克隆兔抗人MASP-2 Ab(在Stover等人，J Immunol 163:6848-59(1999)中进行描述)一起温育。在这种情况下，使用HRP缀合的山羊抗兔IgG(Dako；1/2,000稀释的)检测结合的Ab。
MASP-2结合测定
ELISA板在4℃下用在碳酸盐缓冲液(pH 9.0)中的1.0μg/孔的重组MASP-2A或CUBI-II多肽包被过夜。将孔用1％BSA的TBS溶液进行封闭，然后将抗MASP-2 Fab2的系列稀释物加入含有5.0mM Ca2+的TBS中。使板在RT下温育一小时。在用TBS/tween/Ca2+洗涤3次后，加入在TBS/Ca2+中1/10,000稀释的HRP缀合的抗人Fab(AbD/Serotec)，并且使板在RT下进一步温育一小时。使用TMB过氧化物酶底物试剂盒(Biorad)来检测结合的抗体。
结果：
下表7中提供了证实Fab2与各种MASP-2多肽的反应性的斑点印迹分析结果。表7中提供的数值指示了，得到大约一半最大信号强度所需的点样的蛋白质的量。如所示的，所有多肽(除了单独的硫氧还蛋白融合配偶体之外)都被阳性对照Ab(兔中产生的多克隆抗人MASP-2血清)识别。
表7：在斑点印迹上与各种重组大鼠MASP-2多肽的反应性
NR＝无反应。阳性对照抗体是在兔中产生的多克隆抗人MASP-2血清。
所有Fab2都与MASP-2A以及MASP-2K反应(数据未显示)。大多数Fab2识别CCPII-SP多肽，但不识别N末端片段。Fab2#60和Fab2#57是两个例外。Fab2#60识别MASP-2A和CUBI-II片段，但不识别CUBI/EGF样多肽或CCPII-SP多肽，提示了它与CUBII中或跨越CUBII和EGF样结构域的表位结合。Fab2#57识别MASP-2A，但不识别任何测试的MASP-2片段，指示了这种Fab2识别CCP1中的表位。Fab2#40和#49仅与完整MASP-2A结合。在图11中所示的ELISA结合测定中，Fab2#60也与CUBI-II多肽结合，尽管具有略微更低的表观亲和力。
这些发现证实了针对MASP-2蛋白的多重区域的独特阻断性Fab2的鉴定。
实施例12
本实施例描述了使用噬菌体展示的全人scFv抗体鉴定，所述全人scFv抗体与MASP-2结合并抑制凝集素介导的补体活化，同时使免疫系统的经典(C1q依赖性)途径组分保持原样。
概述：
通过筛选噬菌体展示文库，鉴定了全人的高亲和力MASP-2抗体。抗体的可变轻链和重链片段以scFv形式和全长IgG形式两者进行分离。人MASP-2抗体可用于抑制与凝集素途径介导的补体途径活化相关的细胞损伤，同时使免疫系统的经典(C1q依赖性)途径组分保持原样。在一些实施方案中，主题MASP-2抑制性抗体具有下述特征：(a)对于人MASP-2的高亲和力(例如，10nM或更小的KD)，和(b)抑制90％人血清中的MASP-2依赖性补体活性，其IC50为30nM或更小。
方法：
全长无催化活性的MASP-2的表达：
将编码具有前导序列的人MASP-2多肽(SEQ ID NO:5)的人MASP-2的全长cDNA序列(SEQ ID NO:4)，亚克隆到哺乳动物表达载体pCI-Neo(Promega)内，所述表达载体在CMV增强子/启动子区的控制下，驱动真核生物表达(在Kaufman R.J.等人，Nucleic AcidsResearch 19:4485-90，1991；Kaufman，Methods in Enzymology，185:537-66(1991)中进行描述)。
为了生成无催化活性的人MASP-2A蛋白，如在此引入本文作为参考的US2007/0172483中所述进行定点诱变。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳和条带制备后进行纯化，并且使用标准加尾程序生成单个腺苷重叠。然后将腺苷加尾的MASP-2A克隆到pGEM-T easy载体内，并且转化到大肠杆菌内。将人MASP-2A进一步亚克隆到哺乳动物表达载体pED或pCI-Neo内。
使用标准磷酸钙转染程序(Maniatis等人，1989)，将上述MASP-2A表达构建体转染到DXB1细胞内。MASP-2A在无血清培养基中产生，以确保制剂不被其它血清蛋白质污染。每隔一天从融合细胞中收获培养基(总共四次)。重组MASP-2A的水平平均起来大约1.5mg/L培养基。通过在MBP-A琼脂糖柱上的亲和层析，来纯化MASP-2A(上述Ser-Ala突变体)
关于通过淘选/scFv转换和过滤筛选鉴定的ScFv候选克隆的MASP-2A ELISA
使人免疫球蛋白轻链和重链可变区序列的噬菌体展示文库经受抗原淘选，随后为自动化抗体筛选和选择，以鉴定针对人MASP-2蛋白的高亲和力scFv抗体。进行scFv噬菌体文库针对加上HIS标签或加上生物素标签的MASP-2A的三轮淘选。第三轮淘选首先用MBL进行洗脱，然后用TEA(碱性)进行洗脱。为了监测展示针对靶MASP-2A的scFv片段的噬菌体的特异性富集，进行了针对固定的MASP-2A的多克隆噬菌体ELISA。将来自第3轮淘选的scFv基因克隆到pHOG表达载体内，并且在小规模过滤筛选中运行，以寻找针对MASP-2A的特异性克隆。
挑选含有编码来自第三轮淘选的scFv片段的质粒的细菌菌落，在硝酸纤维素膜上栅格化(gridded)，并且在非诱导培养基上生长过夜，以产生母板(master plate)。从第三轮淘选中挑选并分析了总共18,000个菌落，一半来自竞争性洗脱，且一半来自随后的TEA洗脱。scFv噬菌粒文库针对MASP-2A的淘选，随后为scFv转换和过滤筛选，产生了137个阳性克隆。108/137个克隆在ELISA测定中对于MASP-2结合呈阳性(数据未显示)，其中45个克隆进一步分析了阻断正常人血清中的MASP-2活性的能力。
测量凝集素途径C3转化酶形成的抑制的测定
测量凝集素途径C3转化酶形成的抑制的功能测定用于评估抗MASP-2 scFv候选克隆的“阻断活性”。需要MASP-2丝氨酸蛋白酶活性，以便生成构成凝集素途径C3转化酶的两种蛋白质组分(C4b、C2a)。因此，抑制MASP-2功能活性的抗MASP-2scFv(即，阻断性MASP-2scFv)将抑制凝集素途径C3转化酶的从头形成。C3含有罕见且高反应性的硫酯基团作为其结构的部分。在该测定中通过C3转化酶切割C3后，C3b上的硫酯基可以与大分子上的羟基或氨基形成共价键，所述大分子经由酯或酰胺键固定在塑料孔的底部上，因此促成在ELISA测定中的C3b检测。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知活化剂。在测量C3转化酶形成的下述方法中，使包被有甘露聚糖的塑料孔与稀释的人血清一起温育，以活化凝集素途径。然后将孔进行洗涤，并且使用标准ELISA方法测定固定在孔上的C3b。在该测定中生成的C3b的量是凝集素途径C3转化酶的从头形成的直接反映。以所选浓度的MASP-2 scFv克隆在该测定中就其抑制C3转化酶形成和后续C3b生成的能力进行测试。
方法：
将如上所述鉴定的45个候选克隆表达，纯化并稀释至相同的原液浓度，其再次在含有Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0mM巴比妥、141mM NaCl、1.0mMMgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％明胶，pH 7.4)中进行稀释，以确保所有克隆都具有相同量的缓冲。scFv克隆各自以2μg/mL的浓度一式三份进行测试。阳性对照是OMS100 Fab2，且以0.4μg/mL进行测试。在scFv/IgG克隆的存在和不存在下监测C3c形成。
将甘露聚糖在50mM碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3+35mM NaHCO3+1.5mM NaN3)，pH9.5中稀释至20μg/mL(1μg/孔)的浓度，并且在ELISA板上在4℃下包被过夜。第二天，甘露聚糖包被的板用200μl PBS洗涤3次。然后将100μl的1％HSA封闭溶液加入孔中，并在室温下温育1小时。板用200μl PBS洗涤3次，并且用200μl PBS贮存于冰上直至加入样品。
将正常人血清在CaMgGVB缓冲液中稀释至0.5％，并且将scFv克隆或OMS100Fab2阳性对照以0.01μg/mL一式三份加入；向该缓冲液中加入1μg/mL(仅OMS100对照)和10μg/mL，并且在冰上预温育45分钟，然后加入封闭的ELISA板中。反应通过在37℃下温育一小时来启动，并且通过将板转移到冰浴而终止。用兔α-小鼠C3c抗体，随后为山羊α-兔HRP检测山羊C3b沉积。阴性对照是无抗体的缓冲液(无抗体＝最大C3b沉积)，并且阳性对照是具有EDTA的缓冲液(无C3b沉积)。通过进行相同的测定来确定背景，除了不含甘露聚糖的孔之外。从含甘露聚糖的孔中的信号中扣除针对不含甘露聚糖的板的背景信号。截断标准设定为无关scFv克隆(VZV)和单独缓冲液的活性的一半。
结果：基于截断标准，发现总共13个克隆阻断了MASP-2的活性。选择并测序产生>50％途径压制的所有13个克隆，得到10个独特的克隆。发现所有十个克隆都具有相同的轻链亚类λ3，但具有三个不同的重链亚类：VH2、VH3和VH6。在功能测定中，使用0.5％人血清，十个候选scFv克隆中的五个给出小于25nM靶标准的IC50nM值。
为了鉴定具有改善效力的抗体，使如上所述鉴定的三个母scFv克隆经受轻链改组。这个过程涉及组合文库的生成，所述组合文库由与衍生自6个健康供体的首次用于实验的、人λ轻链(VL)文库配对的每个母克隆的VH组成。然后在该文库中筛选具有改善的结合亲和力和/或功能性的scFv克隆。
表8：前导子克隆及其各自的母克隆(都采取scFv形式)的IC50(nM)中的功能效力比较
下文呈现的是关于上表8中所示的母克隆和子克隆的重链可变区(VH)序列。
Kabat CDR(31-35(H1)、50-65(H2)和95-107(H3))是粗体的；并且Chothia CDR(26-32(H1)、52-56(H2)和95-101(H3))是加下划线的。
17D20_35VH-21N11VL重链可变区(VH)(SEQ ID NO:67，由SEQ ID NO:66编码)
d17N9重链可变区(VH)(SEQ ID NO:68)
下文呈现的是关于上表8中所示的母克隆和子克隆的轻链可变区(VL)序列。
Kabat CDR(24-34(L1)；50-56(L2)；和89-97(L3)是粗体的；并且Chothia CDR(24-34(L1)；50-56(L2)和89-97(L3)是加下划线的。无论是通过Kabat系统还是通过Chothia系统编号，这些区域都是相同的。
17D20m_d3521N11轻链可变区(VL)(SEQ ID NO:69，由SEQ ID NO:70编码)
17N16m_d17N9轻链可变区(VL)(SEQ ID NO:71)
已被证实以高亲和力与人MASP-2结合，并且具有阻断功能性补体活性的能力的MASP-2抗体OMS100和MoAb_d3521N11VL(包含如SEQ ID NO:67所示的重链可变区以及如SEQID NO:69所示的轻链可变区，也称为“OMS646”和“mAb6”)，通过斑点印迹分析就表位结合进行分析。结果显示了，OMS646和OMS100抗体对于MASP-2是高度特异性的，并且不与MASP-1/3结合。抗体既不与MAp19结合，也不与不含MASP-2的CCP1结构域的MASP-2片段结合，导致结合位点包含CCP1的结论。
当与C1s、C1r或MASP-1进行比较时，MASP-2抗体OMS646确定为以>5000倍的选择性，与重组MASP-2亲合地结合(Kd 60-250pM)(参见下表9)：
表9：如通过固相ELISA研究评价的，OMS646 MASP-2抗体-MASP-2相互作用的亲和力和特异性
抗原 KD(pM)
MASP-1 >500,000
MASP-2 62±23*
MASP-3 >500,000
纯化的人C1r >500,000
纯化的人C1s ～500,000
*平均值±SD；n＝12
OMS646特异性阻断末端补体组分的凝集素依赖性活化
方法：
使用凝集素途径、经典途径和替代途径的途径特异性条件，分析了OMS646对膜攻击复合物(MAC)沉积的作用。为此，遵循制造商的说明书，使用Wieslab Comp300补体筛选试剂盒(Wieslab，Lund，瑞典)。
结果：
图12A以图形方式示出了，在凝集素途径特异性测定条件下，在抗MASP-2抗体(OMS646)的存在或不存在下的MAC沉积水平。图12B以图形方式示出了，在经典途径特异性测定条件下，在抗MASP-2抗体(OMS646)的存在或不存在下的MAC沉积水平。图12C以图形方式示出了，在替代途径特异性测定条件下，在抗MASP-2抗体(OMS646)的存在或不存在下的MAC沉积水平。
如图12A中所示，OMS646阻断凝集素途径介导的MAC沉积活化，其IC50值为大约1nM。然而，OMS646对由经典途径介导的活化(图12B)或替代途径介导的活化(图12C)生成的MAC沉积没有作用。
在静脉内(IV)或皮下(SC)施用于小鼠之后，OMS646的药代动力学和药效学
在小鼠中的28天单一剂量PK/PD研究中，评估了OMS646的药代动力学(PK)和药效学(PD)。该研究测试了皮下(SC)施用的5mg/kg和15mg/kg OMS646的剂量水平，以及静脉内(IV)施用的5mg/kg OMS646的剂量水平。
关于OMS646的PK概况，图13以图形方式示出了，在以指示剂量施用OMS646后，根据时间的OMS646浓度(n＝3只动物/组的平均值)。如图13中所示，在5mg/kg SC下，OMS646在给药后大约1-2天达到5-6μg/mL的最大血浆浓度。OMS646在5mg/kg SC下的生物利用度为大约60％。如图13中进一步所示，在15mg/kg SC下，OMS646在给药后大约1至2天达到10-12μg/mL的最大血浆浓度。对于所有组，OMS646从全身循环中缓慢清除，具有大约8-10天的终末半衰期。OMS646的概况对于小鼠中的人抗体是典型的。
OMS646的PD活性在图14A和14B中以图示方式示出。图14A和14B显示了对于5mg/kgIV(图14A)和5mg/kg SC(图14B)组中的每只小鼠的PD应答(系统性凝集素途径活性的下降)。虚线指示了测定的基线(最大抑制；在测定前在体外用过量OMS646掺料的首次用于实验的小鼠血清)。如图14A中所示，在5mg/kg OMS646的IV施用之后，系统性凝集素途径活性立即下降至接近无法检测的水平，并且经过28天的观察期，凝集素途径活性仅显示适度的恢复。如图14B中所示，在用5mg/kg OMS646 SC给药的小鼠中，观察到凝集素途径活性的时间依赖性抑制。凝集素途径活性在药物施用的24小时内下降至接近无法检测的水平，并且保持在低水平下至少7天。凝集素途径活性随着时间过去逐渐增加，但在28天的观察期内，并未恢复到剂量前水平。在15mg/kg SC施用后观察到的凝集素途径活性相对于时间曲线，类似于5mg/kg SC剂量(数据未显示)，指示了PD终点的饱和。数据进一步指示了，IV和SC施用的5mg/kg OMS646的每周一次剂量，足以实现小鼠中的系统性凝集素途径活性的连续压制。
实施例13
本实施例描述了抑制MASP-2的重组抗体的生成，所述重组抗体包括包含一个或多个cDNA的重链和/或轻链可变区，所述CDR与MASP-2和至少一个SGMI核心肽序列特异性结合(也称为荷有SGMI肽的MASP-2抗体或其抗原结合片段)。
背景/原理：
称为SGMI-2的MASP-2特异性抑制剂的生成在Heja等人，J Biol Chem287:20290(2012)和Heja等人，PNAS 109:10498(2012)中进行描述，所述参考文献各自在此引入本文作为参考。SGMI-2是36氨基酸的肽，其选自沙漠蝗虫(Schistocerca gregaria)蛋白酶抑制剂2的变体的噬菌体文库，其中蛋白酶结合环的八个位置中的六个是完全随机化的。随后的体外进化得到具有单位数nM KI值的单特异性抑制剂(Heja等人，J.Biol.Chem.287:20290，2012)。结构研究揭示了，优化的蛋白酶结合环形成了主要的结合位点，其限定了两种抑制剂的特异性。延伸的二级和内部结合区的氨基酸序列是两种抑制剂共有的，并且促成接触界面(Heja等人，2012.J.Biol.Chem.287:20290)。在机制上，SGMI-2阻断补体活化的凝集素途径，而不影响经典途径(Heja等人，2012.Proc.Natl.Acad.Sci.109:10498)。
SGMI-2抑制剂的氨基酸序列在下文阐述：
SGMI-2-全长：LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ(SEQ ID NO:72)
SGMI-2-中等：TCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ(SEQ ID NO:73)
SGMI-2-短：………………………………TCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ(SEQ ID NO:74)
如本实施例中所述以及WO2014/144542中所述，通过将SGMI-2肽氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:72、73或74)融合到人MASP-2抗体的重链和/或轻链的氨基或羧基末端上，来生成荷有SGMI-2肽的MASP-2抗体及其片段。如WO2014/144542中所述，当在使用人血清的C3b或C4b沉积测定中进行测量时，与不含SGMI-2肽序列的裸露的MASP-2支架抗体相比，荷有SGMI-2肽的MASP-2抗体和片段具有增强的抑制活性，并且当在体内小鼠模型中进行测量时，与裸露的MASP-2支架抗体相比，还具有增强的抑制活性。下文描述了生成荷有SGMI-2肽的MASP-2抗体的方法。
方法：
生成表达构建体，以编码四种示例性荷有SGMI-2肽的MASP-2抗体，其中SGMI-2肽与代表性MASP-2抑制性抗体OMS646的重链或轻链的N末端或C末端融合(如实施例12中所述生成)。
表10：MASP-2抗体/SGMI-2融合物
表10中的缩写：
“H-N”＝重链的氨基末端
“H-C”＝重链的羧基末端
“L-N”＝轻链的氨基末端
“L-C”＝轻链的羧基末端
“M2”＝MASP-2 ab支架(代表性OMS646)
对于表10中所示的N末端融合，在SGMI-2肽和可变区之间添加了肽接头(‘GTGGGSGSSS’SEQ ID NO:79)。
对于表10中所示的C末端融合，在恒定区和SGMI-2肽之间添加了肽接头(‘AAGGSG’SEQ ID NO:80)，并且在融合多肽的C末端处添加了第二肽“GSGA”(SEQ ID NO:81)，以保护C末端SGMI-2肽免受降解。
下文提供了下述代表性MASP-2抗体/SGMI-2融合物的氨基酸序列：
H-M2ab6-SGMI-2-N(SEQ ID NO:75，由SEQ ID NO:82编码)：
LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQGTGGGSGSSSQVTLKESGPVLVKPTETLTLTCT VSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARI RRGGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
[491 aa蛋白，aa 1-36＝SGMI-2(加下划线的)，aa37-46＝接头(斜体的)；aa47-164＝MASP-2 ab#6的重链可变区(加下划线的)；aa165-491＝具有铰链突变的IgG4恒定区。]
H-M2ab6-SGMI-2-C(SEQ ID NO:76，由SEQ ID NO:83编码)：
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRL TISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAAGGSGLEV TCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQGSGA
[491aa蛋白，aa1-118＝MASP-2 ab#6的重链可变区(加下划线的)；aa 119-445＝具有铰链突变的IgG4恒定区；aa 446-451＝第1接头(斜体的)；aa 452-487＝SGMI-2；aa488-491＝第2接头(斜体的)。]
L-M2ab6-SGMI-2-N(SEQ ID NO:77，由SEQ ID NO:84编码)：
LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQGTGGGSGSSSQPVLTQPPSLSVSPGQTASITCS GEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGG TKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
[258aa蛋白，aa1-36＝SGMI-2(加下划线的)；aa37-46＝接头(斜体的)；aa47-152＝MASP-2 ab#6的轻链可变区(加下划线的)；aa153-258＝人Igλ恒定区]
L-M2ab6-SGMI-2-C(SEQ ID NO:78，由SEQ ID NO:85编码)：
QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNT ATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSAAGGSGLEVTC EPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQGSGA
[258aa蛋白，aa1-106＝MASP-2 ab#6的轻链可变区(加下划线的)；aa 107-212＝人Igλ恒定区；aa 213-218＝第1接头；aa219-254＝SGMI-2；aa255-258＝第2接头]
功能测定：
四种MASP-2-SGMI-2融合抗体构建体在Expi293F细胞(Invitrogen)中进行瞬时表达，通过蛋白A亲和层析进行纯化，并且在如下所述的甘露聚糖包被的珠测定中，在10％正常人血清中测试C3b沉积的抑制。
在甘露聚糖包被的珠测定中，测试MASP-2-SGMI-2融合物的C3b沉积
在甘露聚糖包被的珠上的C3b沉积测定中，就凝集素途径抑制评价MASP-2-SGMI-2融合抗体。通过流式细胞术确定活性程度的这种测定，提供了比测定更高的分辨率。凝集素途径珠测定如下进行：在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中，将甘露聚糖在4℃下吸附到直径7μM的聚苯乙烯珠(Bangs Laboratories；Fishers，IN，USA)过夜。将珠在PBS中进行洗涤，并且暴露于10％人血清或者与抗体或抑制剂预温育的10％血清。血清-珠混合物在室温下在搅动的同时温育一小时。在血清温育之后，将珠洗涤，并且通过用抗C3c兔多克隆抗体(Dako North America；Carpinteria，CA，USA)、以及PE-Cy5缀合的山羊抗兔二抗(Southern Biotech；Birmingham，AL，USA)的检测，来测量珠上的C3b沉积。在染色程序之后，使用FACSCalibur流式细胞仪分析珠。使用前向散射和侧向散射将珠门控为均匀群体，并且C3b沉积明显为FL3阳性颗粒(FL-3或“FL-3通道”指示细胞仪上的第3通道或红色通道)。相对于抗体/抑制剂浓度，绘制群体对于每种实验条件的几何平均荧光强度(MFI)，以评估凝集素途径抑制。
使用GraphPad PRISM软件计算IC50值。具体地，通过应用可变斜率(四参数)、对数非线性拟合(抗体)相对于从细胞计数测定获得的平均荧光强度曲线，来获得IC50值。
结果显示于表11。
表11：在10％人血清中的C3b沉积(甘露聚糖包被的珠测定)
构建体 IC50(nM)
裸的N2ab(mAb#6) ≥3.63nM
H-M2-SGMI-2-N 2.11nM
L-M2-SGMI-2-C 1.99nM
H-M2-SGMI-2-N 2.24nM
L-M2-SGMI-2-N 3.71nM
结果：
对照，不含SGMI的MASP-2“裸”支架抗体(mAb#6)，在该测定中是抑制性的，具有≥3.63nM的IC50值，其与实施例12中观察到的抑制结果一致。值得注意的是，如表11中所示，所有测试的SGMI-2-MASP-2抗体融合物在该测定中都改善了MASP-2支架抗体的效力，提示了增加的效价也可能在C3b沉积的抑制中是有益的。
在用10％人血清的甘露聚糖包被的珠测定中，测试MASP-2-SGMI-2融合物的C4b沉 积测定
使用与上文对于C3b沉积测定描述的相同的测定条件，伴随下述修改，用10％人血清进行C4b沉积测定。在流式细胞术分析之前，通过用抗C4b小鼠单克隆抗体(1:500，Quidel)对沉积反应进行染色，并且用与PE Cy5缀合的二级山羊抗小鼠F(ab’)2(1:200，Southern Biotech)染色，来进行C4b检测和流式细胞术分析。
结果：
与MASP-2支架抗体(HL-M2：IC50＝0.78nM)相比，荷有SGMI-2-的MASP-2-N末端抗体融合物(H-M2-SGMI-2-N:IC50＝0.34nM)、L-M2-SGMI-2-N:IC50＝0.41nM))具有增加的效力。
类似地，与MASP-2支架抗体(HL-M2:IC50＝1.2nM)相比，荷有单个SGMI-2的C末端MASP-2抗体融合物(H-M2-SGMI-2-C:IC50＝0.45nM和L-M2-SGMI-2C:IC50＝0.47nM)两者均具有增加的效力。
在用10％小鼠血清的甘露聚糖包被的珠测定中，测试MASP-2-SGMI-2融合物的C3b 沉积。
如上所述，用10％小鼠血清进行关于C3b沉积的甘露聚糖包被的珠测定。与在人血清中观察到的结果相似，确定与小鼠血清中的MASP-2支架抗体相比，荷有SGMI-2的MASP-2融合物具有增加的效力。
结果概括：本实施例中的结果证实了，所有测试的SGMI-2-MASP-2抗体融合物都改善了MASP-2支架抗体的效力。
实施例14
本实施例提供了使用在MASP-2-/-缺陷和MASP-2 +/+充分的小鼠中的肾纤维化的单侧输尿管梗阻(UUO)模型生成的结果，以评估凝集素途径在肾纤维化中的作用。
背景/原理：
肾纤维化和炎症是晚期肾脏疾病的占优势特征。肾小管间质性纤维化是进行性过程，涉及持续的细胞损伤、异常愈合、驻留和浸润性肾细胞的活化、细胞因子释放、炎症和肾细胞的表型活化以产生细胞外基质。肾小管间质性(TI)纤维化是多重肾病理状况的共同终点，并且代表了旨在预防慢性肾脏疾病(CKD)中的进行性肾功能受损的潜在疗法的关键靶。肾TI损伤与肾小球疾病中的肾功能下降密切联系(Risdon R.A.等人，Lancet 1:363-366，1968；Schainuck L.I.等人，Hum Pathol 1:631-640，1970；Nath K.A.，Am JKidDis 20:1-17，1992)，并且是CKD特有的，其中存在肌成纤维细胞的积累，并且小管和小管周围毛细血管之间的潜在空间变得被基质占据，所述基质由胶原和其它蛋白聚糖组成。TI肌成纤维细胞的起源仍然存在激烈争议，但纤维化一般在炎症之前，最初的特征在于T淋巴细胞的TI积累，且以后的特征在于巨噬细胞(Liu Y.等人，Nat Rev Nephrol 7:684-696，2011；Duffield J.S.，J Clin Invest 124:2299-2306，2014)。
UUO的啮齿类动物模型生成进行性肾纤维化，实际上任何病因的进行性肾疾病的标志(Chevalier等人，Kidney International 75:1145-1152，2009)。已报告，C3基因表达在UUO之后的野生型小鼠中增加，并且与野生型小鼠相比，胶原沉积在UUO之后的C3-/-敲除小鼠中显著降低，提示了补体活化在肾纤维化中的作用(Fearn等人，Mol Immunol 48:1666-1733，2011)。还已报告，在小管间质性损伤的模型中，C5缺乏导致肾纤维化的主要组分的显著改善(Boor P.等人，J of Am Soc of Nephrology:18:1508-1515，2007)。然而，在通过本发明人进行的本文所述的研究之前，涉及肾纤维化的特定补体组分尚未明确定义。因此，进行了下述研究，以评估单侧输尿管梗阻(UUO)模型中的MASP-2(-/-)和MASP-2(+/+)雄性小鼠。
方法：
MASP-2-/-小鼠如实施例1中所述生成，并且与C57BL/6回交10代。将雄性野生型(WT)C57BL/6小鼠、以及在C57BL/6背景下的纯合的MASP-2缺陷(MASP-2-/-)小鼠，保持在12/12日/夜循环的标准条件下，喂食标准食物团块，并且给予对食物和水的自由接近。十周龄的小鼠，6只/组，用在1.5L/分钟氧中的2.5％异氟烷进行麻醉。两组十周龄的雄性C56/BL6小鼠(野生型和MASP-2-/-)的右输尿管进行手术结扎。通过1cm胁腹切口暴露右肾。使用6/0 polyglactin缝合线，在两个点处使右输尿管完全梗阻。围手术期每12小时提供丁丙诺啡镇痛，最多5个剂量，取决于疼痛评分。局部布比卡因麻醉在手术期间给予一次。
在手术7天后处死小鼠，并且收集肾组织，固定并在石蜡块中包埋。在麻醉下通过心脏穿刺从小鼠中收集血液，并且在肾切除术后通过放血将小鼠处死。允许血液在冰上凝固2小时，并且血清通过离心进行分离且作为等分试样在-80℃下保持冷冻。
肾脏组织的免疫组织化学
为了测量如通过胶原沉积指示的肾纤维化程度，如Whittaker P.等人，Basic ResCardiol 89:397-410，1994中所述，用天狼星红，胶原特异性染剂，对5微米石蜡包埋的肾脏切片进行染色。简而言之，使肾脏切片脱石蜡，再水化，并且用在500mL苦味酸饱和水溶液中的天狼星红水溶液(0.5gm天狼星红，Sigma，Dorset UK)，将胶原染色1小时。玻片在酸化水(在蒸馏水中的0.5％冰乙酸)中洗涤两次，各5分钟，然后脱水并固定。
为了测量如通过巨噬细胞浸润指示的炎症程度，如下用巨噬细胞特异性抗体F4/80，对肾脏切片进行染色。使福尔马林固定、石蜡包埋的5微米肾脏切片脱石蜡并再水化。抗原修复在柠檬酸盐缓冲液中在95℃下执行20分钟，随后为通过在3％H2O2中的10分钟温育，来猝灭内源性过氧化物酶活性。使组织切片在封闭缓冲液(磷酸盐缓冲液(PBS)中的具有1％牛血清白蛋白的10％热灭活的正常山羊血清)中，在室温下温育1小时，随后为抗生物素蛋白/生物素封闭。在每个步骤后，将组织切片在PBS中洗涤3次，共5分钟。将在封闭缓冲液中1:100稀释的F4/80巨噬细胞一抗(Santa Cruz，Dallas，TX，USA)施加1小时。然后将1:200稀释的生物素化的山羊抗大鼠二抗施加30分钟，随后为辣根过氧化物酶(HRP)缀合的酶30分钟。染色使用二氨基联苯胺(DAB)底物(Vector Labs，Peterborough UK)显色10分钟，然后将玻片在水中进行洗涤，脱水并无需复染而固定，以促进基于计算机的分析。
图像分析
如Furness P.N.等人，J Clin Pathol 50:118-122，1997中所述，确定肾皮质染色的百分比。简而言之，从围绕肾脏切片整个外围的肾囊正下方的肾皮质的序贯非重叠区域捕获24位彩色图像。在每次图像捕获后，NIH图像用于提取作为8位单色图像的红色通道。使用没有切片就位的照明显微镜视野的预记录图像，来扣除背景照明中的不均匀度。使图像经受固定的阈值，以鉴定与染色阳性相对应的图像区域。然后计算黑色像素的百分比，并且在肾脏周围的所有图像已以这种方式进行测量后，记录平均百分比，提供与肾脏切片中的染色区域百分比相对应的值。
基因表达分析
如下通过定量PCR(qPCR)，测量小鼠肾脏中与肾脏炎症和纤维化有关的几种基因的表达。根据制造商的说明书，使用(ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)，从肾皮质中分离总RNA。用Turbo DNA-free试剂盒(ThermoFisher Scientific)处理提取的RNA，以消除DNA污染，然后使用AMV Reverse Transcription System(Promega，Madison，WI，USA)，来合成第一链cDNA。通过使用TaqMan GAPDH Assay(Applied Biosystems，PaisleyUK)的单次qPCR反应，随后为使用Custom TaqManArray 96孔板(Life Technologies，Paisley，UK)的qPCR反应，来确认cDNA完整性。
在该分析中研究了十二种基因：
胶原IV型α1(col4α1；测定ID：Mm01210125_m1)
转化生长因子β-1(TGFβ-1；测定ID：Mm01178820_m1)；
钙粘蛋白1(Cdh1；测定ID：Mm01247357_m1)；
纤连蛋白1(Fn1；测定ID：Mm01256744_m1)；
白细胞介素6(IL6；测定ID Mm00446191_m1)；
白细胞介素10(IL10；测定ID Mm00439614_m1)；
白细胞介素12a(IL12a；测定ID Mm00434165_m1)；
波形蛋白(Vim；测定ID Mm01333430_m1)；
肌动蛋白α1(Actn1；测定ID Mm01304398_m1)；
肿瘤坏死因子-α(TNF-α；测定ID Mm00443260_g1)
补体组分3(C3；测定ID Mm00437838_m1)；
干扰素γ(Ifn-γ；测定ID Mm01168134)
使用了下述管家对照基因：
3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH；测定ID Mm99999915_g1)；
葡糖醛酸酶β(Gusβ；测定ID Mm00446953_m1)；
真核18S rRNA(18S；测定ID Hs99999901_s1)；
次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT；测定ID Mm00446968_m1)
20μL反应使用TaqMan Fast Universal Master Mix(Applied Biosystems)扩增40个循环。使用Applied Biosystems 7000 SDS v1.4软件，分析实时PCR扩增数据。
结果：
在单侧输尿管梗阻(UUO)之后，梗阻肾脏经历炎性细胞特别是巨噬细胞的流入，随后为纤维化的迅速发展，如通过胶原的积累连同小管扩张和近端小管上皮的变薄所证明的(参见ChevalierR.L.等人，KidneyInt 75:1145-1152，2009)。
图15以图形方式示出了，用天狼星红染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，其中所述组织切片得自在输尿管梗阻(UUO)7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、或假手术的对照小鼠。如图15中所示，与MASP-2-/-小鼠相比，在输尿管梗阻7天之后的野生型小鼠的肾脏切片显示了显著更多的胶原沉积(p值＝0.0096)。在野生型和MASP-2-/-组中，关于UUO手术小鼠的平均值±平均值的标准误分别为24.79±1.908(n＝6)和16.58±1.3(n＝6)。如图15中进一步所示，如预计的，来自假手术的对照野生型和假手术的对照MASP-2-/-小鼠的组织切片，显示了非常低水平的胶原染色。
图16以图形方式示出了，用F4/80巨噬细胞特异性抗体染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，其中所述组织切片得自在输尿管梗阻7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、或假手术的对照小鼠。如图16中所示，与野生型小鼠相比，在输尿管梗阻7天之后，从来自MASP-2-/-小鼠的UUO肾脏获得的组织显示出明显更少的巨噬细胞浸润(WT中染色的％巨噬细胞面积：2.23±0.4相对于MASP-2-/-：0.53±0.06，p＝0.0035)。如图16中进一步所示，来自假手术的野生型和假手术的MASP-2-/-小鼠的组织切片，并未显示可检测的巨噬细胞染色。
在得自输尿管梗阻7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、以及假手术的野生型和MASP-2-/-小鼠的肾脏组织切片中，进行与肾炎症和纤维化相联系的各种基因的基因表达分析。图17-20中显示的数据是相对于野生型假手术样品的相对定量的Log10，并且条表示平均值的标准误。关于纤维化有关基因的基因表达分析结果，图17以图形方式示出了，在得自输尿管梗阻7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、以及假手术的对照小鼠的肾脏组织切片中，如通过qPCR测量的，胶原IV型α1(胶原-4)的相对mRNA表达水平。图18以图形方式示出了，在得自输尿管梗阻7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、以及假手术的对照小鼠的肾脏组织切片中，如通过qPCR测量的，转化生长因子β-1(TGFβ-1)的相对mRNA表达水平。如图17和18中所示，与野生型小鼠中假手术的肾脏相比，来自野生型小鼠的梗阻肾脏证实了纤维化有关基因胶原IV型(图17)和TGFβ-1(图18)的表达显著增加，证实了这些纤维化有关基因在野生型小鼠中的UUO损伤后被诱导，如预计的。相比之下，如图17和18中进一步所示，与经受UUO损伤的野生型小鼠相比，来自经受UUO损伤的MASP-2-/-的梗阻肾脏，显示出胶原IV型表达的显著降低(图17，p＝0.0388)和TGFβ-1表达的显著降低(图18，p＝0.0174)。
关于炎症相关基因的基因表达分析结果，图19以图形方式示出了，在得自输尿管梗阻7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、以及假手术的对照小鼠的肾脏组织切片中，如通过qPCR测量的，白细胞介素6(IL-6)的相对mRNA表达水平。图20以图形方式示出了，在得自输尿管梗阻7天之后的野生型和MASP-2-/-小鼠、以及假手术的对照小鼠的肾脏组织切片中，如通过qPCR测量的，干扰素-γ的相对mRNA表达水平。如图19和20中所示，与野生型小鼠中的假手术肾脏相比，来自野生型小鼠的梗阻肾脏，证实了炎症有关基因白细胞介素-6(图19)和干扰素-γ(图20)的表达显著增加，证实了这些炎症有关基因在野生型小鼠中的UUO损伤后被诱导。相比之下，如图19和20中进一步所示，与经由UUO损伤的野生型小鼠相比，来自经受UUO损伤的MASP-2-/-的梗阻肾脏，显示出白细胞介素6(图19，p＝0.0109)和干扰素-γ表达的显著降低(图20，p＝0.0182)。
注意到，在从野生型和MASP-2-/-小鼠两者获得的UUO肾脏中，发现Vim、Actn-1、TNFα、C3和IL-10的基因表达都是显著上调的，其中这些特定基因在野生型和MASP-2-/-小鼠之间的表达水平没有显著差异(数据未显示)。在来自任何组中的动物的梗阻肾脏中，Cdh-1和IL-12a的基因表达水平都没有改变(数据未显示)。
讨论：
啮齿类动物中的UUO模型被公认为在梗阻肾脏中诱导早期、活跃和严重的损伤，伴随在梗阻之后的一到两周内降低的肾血流量、间质性炎症和快速纤维化，并且已被广泛用于理解肾脏中的炎症和纤维化的常见机制和介质(参见例如，Chevalier R.L.，Kidney Int75:1145-1152，2009；Yang H.等人，Drug Discov Today Dis Models 7:13-19，2010)。
在本实施例中描述的结果证实了，相对于野生型(+/+)对照小鼠，在MASP-2(-/-)小鼠中的UUO手术的肾脏中，胶原沉积和巨噬细胞浸润的显著降低。在MASP-2-/-动物中，在组织学和基因表达水平两者上，显示了肾损伤的显著降低的出乎意料结果，证实了补体活化的凝集素途径显著促成梗阻肾脏中的炎症和纤维化的发展。尽管不希望受特定理论的束缚，但认为凝集素途径通过触发且维持促炎刺激，关键性地促成纤维化疾病的病理生理学，所述促炎刺激使其中细胞损伤驱动炎症的恶性循环长期存在，所述炎症继而又引起进一步的细胞损伤、瘢痕形成和组织丧失。鉴于这些结果，预计用抑制剂抑制或阻断MASP-2在肾纤维化的抑制或预防方面，以及对于一般而言的纤维化抑制或预防(即，不依赖于组织或器官)，具有预防和/或治疗效应。
实施例15
本实施例描述了单克隆MASP-2抑制性抗体在单侧输尿管梗阻(UUO)模型(肾纤维化的鼠模型)中的功效分析。
背景/原理：
多重肾病理状况的共同终点，肾小管间质性纤维化的改善，代表了旨在预防进行性肾疾病的治疗策略的关键靶。鉴于靶向肾疾病中的炎症性促纤维化途径的新的和现有治疗的匮乏，迫切需要开发新疗法。蛋白尿性肾疾病的许多患者显示出小管间质性炎症和进行性纤维化，其与肾功能下降密切平行。蛋白尿本身诱导小管间质性炎症和蛋白尿性肾病的发展(Brunskill N.J.等人，J Am Soc Nephrol 15:504-505，2004)。不管原发性肾脏疾病如何，小管间质性炎症和纤维化在具有进行性肾受损的患者中常常看到，并且与排泄功能下降密切相关联(Risdon R.A.等人，Lancet 1:363-366，1968；SchainuckL.I.等人，HumPathol 1:631-640，1970)。具有中断导致纤维化的关键常见细胞途径潜力的疗法，有希望在肾病症中具有广泛应用性。
如实施例14中所述，在非蛋白尿性肾纤维化的UUO模型中，确定与野生型对照动物相比，MASP-2-/-小鼠显示出显著更少的肾纤维化和炎症，如通过炎症细胞浸润(75％降低)和纤维化的组织学标记物如胶原(三分之一降低)所示，从而确立凝集素途径在肾纤维化中的关键作用。
如实施例13中所述，生成了单克隆MASP-2抗体(OMS646-SGMI-2融合物，包含与OMS646重链的C末端融合的SGMI-2肽)，其特异性阻断人凝集素途径的功能，还已显示阻断小鼠的凝集素途径。在本实施例中，在野生型小鼠的肾纤维化的UUO小鼠模型中分析了OMS646-SGMI-2，以确定MASP-2的特异性抑制剂是否能够抑制肾纤维化。
方法：
这项研究评估了在雄性WT C57BL/6小鼠中，与人IgG4同种型对照抗体(10mg/kgET904)和媒介物对照相比，MASP-2抑制性抗体(10mg/kg OMS646-SGMI-2)的效应。在UUO手术之前的第7天、第4天和第1天时，以及再次在手术后第2天时，通过腹膜内(ip)注射，将抗体(10mg/kg)施用于9只小鼠的组。在抗体施用之前以及在实验结束时获取血样，以评价凝集素途径的功能活性。
使用实施例14中描述的方法进行UUO手术、组织收集、以及用天狼星红和巨噬细胞特异性抗体F4/80的染色。
根据制造商的说明书，使用特异性比色测定测试试剂盒(Sigma)，来测量小鼠肾脏的羟脯氨酸含量。
为了评价MASP-2抑制性mAb在小鼠中的药效学效应，通过在MASP-2 mAb或对照mAbi.p.施用于小鼠后的指示时间收集的最低限度稀释的血清样品中，定量凝集素诱导的C3活化，来评估系统性凝集素途径活性。简而言之，通过在碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)中与30μg/mL甘露聚糖(Sigma)一起过夜温育，7μM直径的聚苯乙烯微球(Bangs Laboratories，FisherIN，USA)用甘露聚糖进行包被，然后洗涤，用1％胎牛血清的PBS溶液进行封闭，并且以1x108个珠/mL的最终浓度重悬浮于PBS中。通过将2.5μL甘露聚糖包被的珠(～250,000个珠)加入50μL最低限度稀释的小鼠血清样品(90％最终血清浓度)中，启动补体沉积反应，随后为在4℃下的40分钟温育。在通过加入250μL冰冷的流式细胞术缓冲液(FB：含有0.1％胎牛血清的PBS)终止沉积反应之后，珠通过离心进行收集，并且用300μL冰冷的FB再洗涤两次。
为了定量凝集素诱导的C3活化，使珠与50μL在FB中稀释的兔抗人C3c抗体(Dako，Carpenteria，CA，USA)一起在4℃下温育1小时。在用FB洗涤两次以去除未结合的材料后，使珠与50μL在FB中稀释的缀合至PE-Cy5的山羊抗兔抗体(Southern Biotech，Birmingham，AL，USA)一起在4℃下温育30分钟。在用FB洗涤两次以去除未结合的材料后，将珠重悬浮于FB中，并通过FACS Calibur细胞仪进行分析。使用前向散射和侧向散射将珠门控为均匀群体，并且将每个样品中的C3b沉积定量为平均荧光强度(MFI)。
结果：
胶原沉积的评价：
图21以图形方式示出了，用天狼星红染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，其中所述组织切片在输尿管梗阻7天之后，得自用MASP-2抑制性抗体或同种型对照抗体治疗的野生型小鼠。如图21中所示，与来自梗阻肾脏(其得自用IgG4同种型对照治疗的野生型小鼠)的组织切片中的胶原沉积量相比，来自梗阻(UUO)后7天收获的肾脏(其得自用MASP-2抑制性抗体治疗的野生型小鼠)的组织切片，显示了胶原沉积的显著降低(p＝0.0477)。
羟脯氨酸含量的评价：
在肾脏组织中测量羟脯氨酸作为胶原含量的指标。羟脯氨酸是高度指示在该模型中诱导的疾病的病理生理进展的参数。
图22以图形方式示出了，来自得自野生型小鼠的梗阻(UUO)后7天收获的肾脏的羟脯氨酸含量，所述野生型小鼠用MASP-2抑制性抗体或IgG4同种型对照进行治疗。如图22中所示，与来自用IgG4同种型对照mAb治疗的小鼠的肾脏相比，来自用MASP-2抑制性抗体治疗的小鼠的梗阻肾脏组织证实了显著更少的羟脯氨酸——胶原含量的指标(p＝0.0439)。
炎症评价：
来自野生型、同种型对照抗体治疗的动物和用MASP-2抑制性抗体治疗的野生型动物的梗阻肾脏，证实了巨噬细胞的明确浸润。仔细的定量并未揭示在这两组之间的巨噬细胞染色面积百分比的显著差异(数据未显示)。然而，尽管等价数目的浸润性巨噬细胞，但如通过天狼星红染色判断的，与来自同种型对照注射的动物的梗阻肾脏相比，来自MASP-2抑制性抗体注射动物的梗阻肾脏显示出明显更少的纤维化，所述结果与下述结果一致：与用IgG4同种型对照mAb治疗的肾脏相比，来自用MASP-2抑制性抗体治疗的小鼠的梗阻肾脏组织具有显著更少的羟脯氨酸。
讨论
本实施例中所述的结果证实了，MASP-2抑制性抗体的使用在UUO模型中提供了免于肾纤维化的保护，这与实施例14中所述的结果一致，证实了野生型小鼠相比，MASP-2-/-小鼠在UUO模型中具有显著降低的肾纤维化和炎症。本实施例中的结果显示了，用MASP-2抑制性抗体治疗的小鼠中的纤维化降低。在具有MASP-2依赖性凝集素途径活性的降低或阻断的动物中的UUO肾脏中，纤维化降低的发现是非常显著的新发现。总之，实施例14和本实施例中呈现的结果证实了MASP-2抑制对肾小管间质性炎症、小管细胞损伤、促纤维化细胞因子释放和瘢痕形成的有益效应。肾纤维化的缓解仍然是肾治疗学的关键目标。UUO模型是加速肾纤维化的严重模型，并且在该模型中降低纤维化的干预，例如MASP-2抑制性抗体的使用，很可能用于抑制或预防肾纤维化。来自UUO模型的结果很可能可转移到特征在于肾小球和/或蛋白尿性小管损伤的肾疾病。
实施例16
本实施例提供了使用MASP-2-/-和野生型小鼠中的肾纤维化、炎症和小管间质性损伤的蛋白质超负荷蛋白尿模型生成的结果，以评估凝集素途径在蛋白尿性肾病中的作用。
背景/原理：
不管原发性肾疾病如何，蛋白尿都是关于肾纤维化发展和肾排泄功能丧失的风险因素(Tryggvason K.等人，J Intern Med 254:216-224，2003，Williams M.，Am J.Nephrol25:77-94，2005)。蛋白尿性肾病的概念描述了由于肾小球渗透选择性受损，过量蛋白质进入近端小管的毒性效应(Brunskill N.J.，J Am Soc Nephrol 15:504-505，2004，BainesR.J.，Nature Rev Nephrol 7:177-180，2011)。许多肾小球疾病共有的这种现象导致肾脏中的促炎性瘢痕形成环境，并且特征在于由于通过蛋白尿小管流体刺激的信号传导途径失调，近端小管细胞生长、细胞凋亡、基因转录和炎性细胞因子产生的变化。蛋白尿性肾病一般被公认为多种原发性肾病共有的进行性肾损伤的关键贡献者。
慢性肾脏疾病影响美国大于15％的成年人口，并且负责全世界每年大约750,000例死亡(Lozano R.等人，Lancet第380卷，Issue 9859:2095-2128，2012)。蛋白尿是慢性肾脏疾病的指标，以及促进疾病进展的因素。蛋白尿性肾疾病的许多患者显示出小管间质性炎症和进行性纤维化，其与肾功能下降密切平行。蛋白尿本身诱导小管间质性炎症和蛋白尿性肾病的发展(Brunskill N.J.等人，J Am SocNephrol 15:504-505，2004)。在蛋白尿性肾脏疾病中，过量的白蛋白和其它大分子通过肾小球过滤，并且被近端小管上皮细胞重新吸收。这引起由补体活化介导的炎性恶性循环，导致细胞因子和白细胞浸润，其引起小管间质性损伤和纤维化，从而加剧蛋白尿并导致肾功能丧失，并且最终进展为终末期肾衰竭(参见例如，Clark等人，Canadian Medical Association Journal 178:173-175，2008)。调节炎症和蛋白尿的这种有害循环的疗法预计改善慢性肾脏疾病中的结果。
考虑到MASP-2抑制在小管性间质损伤的UUO模型中的有益效应，进行了下述实验，以确定MASP-2抑制是否降低蛋白质超负荷模型中的肾损伤。如Ishola等人，EuropeanRenal Association 21:591-597，2006中所述，这项研究采用蛋白质超负荷来诱导蛋白尿性肾脏疾病。
方法：
MASP-2-/-小鼠如实施例1中所述生成，并且与BALB/c回交10代。当前的研究在如下的蛋白质超负荷蛋白尿模型中，比较了野生型和MASP-2-/-BALB/c小鼠的结果。
在实验前一周，在蛋白质超负荷攻击前，对小鼠进行单侧肾切除术，以便观察最佳应答。所使用的蛋白尿诱导剂是在正常盐水中i.p.给予WT(n＝7)和MASP-2-/-小鼠(n＝7)的低内毒素牛血清白蛋白(BSA，Sigma)，其以下述剂量：各一个剂量的2mg BSA/gm、4mgBSA/gm、6mg BSA/gm、8mg BSA/gm、10mg BSA/gm和12mg BSA/gm体重，以及9个剂量的15mgBSA/gm体重，在15天的时期内总共15个i.p.施用的剂量。对照WT(n＝4)和MASP-2-/-(n＝4)小鼠仅接受i.p施用的盐水。在最后一个剂量施用后，将动物分开关在代谢笼中24小时，以收集尿。通过在麻醉下的心脏穿刺收集血液，允许血液在冰上凝固2小时，并且通过离心分离血清。在第15天的实验结束时收集血清和尿样品，贮存并冷冻用于分析。
在第15天时的最后一次BSA施用后24小时处死小鼠，并且收集各种组织用于分析。收获肾脏并加工用于H&E和免疫染色。免疫组织化学染色如下进行。使来自每只小鼠的福尔马林固定、石蜡包埋的5微米肾脏组织切片脱石蜡并再水化。抗原修复在柠檬酸盐缓冲液中在95℃下执行20分钟，随后为使组织在3％H2O2中温育10分钟。然后使组织在具有10％抗生物素蛋白溶液的封闭缓冲液(来自二抗在其中产生的物种的10％血清和1％BSA的PBS溶液)中，在室温下温育1小时。在每个步骤后，将切片在PBS中洗涤3次，各5分钟。然后将一抗在具有10％生物素溶液的封闭缓冲液中应用1小时，其浓度对于抗体F4/80(Santa Cruz目录#sc-25830)、TGFβ(Santa Cruz目录#sc-7892)、IL-6(Santa Cruz目录#sc-1265)为1:100，并且对于TNFα抗体(Santa Cruz目录#sc-1348)为1:50。然后将生物素化的二抗应用30分钟，其浓度对于F4/80、TGFβ和IL-6切片为1:200，并且对于TNFα切片为1:100，随后为HRP缀合的酶另外30分钟。使用二氨基联苯胺(DAB)底物试剂盒(Vector labs)显色10分钟，并且将玻片在水中进行洗涤，脱水并无需复染而固定，以促进基于计算机的分析。通过数字图像捕获分析来自肾皮质的染色组织切片，随后为使用自动化图像分析软件的定量。
如下通过用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色，来评价组织切片中的细胞凋亡。如下使用Peroxidase试剂盒(Millipore)，对肾脏切片中的凋亡细胞进行染色。使来自每只小鼠的石蜡包埋、福尔马林固定的肾脏切片脱石蜡，再水化，然后使用蛋白酶K(20μg/mL)对蛋白质进行渗透化处理，所述蛋白酶K在室温下对每个样本应用15分钟。样本在步骤之间在PBS中进行洗涤。通过使组织在3％H2O2中温育10分钟，来猝灭内源性过氧化物酶活性。然后使组织在平衡缓冲液中温育，随后为与TdT酶在37℃下一起温育1小时。在终止/洗涤缓冲液中洗涤10分钟后，将抗洋地黄毒苷缀合物在室温下应用30分钟，随后为洗涤。在DAB底物试剂盒中显色4分钟，随后为在水中的洗涤。使组织在苏木精中复染并在DBX中固定。使用Leica DBXM光学显微镜，在来自皮质的连续选择的20个高倍视野中，手动计数TUNEL染色的(棕色着色的)凋亡细胞的频率。
结果：
蛋白尿的评价
为了确认小鼠中蛋白尿的存在，在第15天分析血清中的总蛋白，并且在研究的第15天时，在经过24小时时期收集的尿样品中，测量了尿中的总排泄蛋白。
图23以图形方式示出了，在仅接受盐水的野生型对照小鼠(n＝2)、接受BSA的野生型小鼠(n＝6)和接受BSA的MASP-2-/-小鼠(n＝6)中，在第15天测量的血清蛋白质总量(mg/ml)。如图23中所示，BSA的施用使野生型和MASP-2-/-组两者中的血清总蛋白水平增加至仅接受盐水的对照组浓度的两倍，其中在治疗的组之间无显著差异。
图24以图形方式示出了，来自仅接受盐水的野生型对照小鼠(n＝2)、接受BSA的野生型(n＝6)和接受BSA的MASP-2-/-小鼠(n＝6)，在第15天，在经过24小时时期收集的尿中的排泄蛋白质总量(mg)。如图24中所示，在这项研究的第15天时，与仅接受盐水的假治疗的对照组相比，在BSA治疗的组中的尿中的总排泄蛋白中存在大约六倍增加。图23和24中显示的结果证实了蛋白尿模型如预计的工作。
肾脏中的组织学变化评价
图25显示了在蛋白质超负荷研究的第15天时，从下述小鼠组收获的代表性H&E染色的肾组织切片：(小图A)野生型对照小鼠；(小图B)MASP-2-/-对照小鼠，(小图C)用BSA治疗的野生型小鼠；以及(小图D)用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠。如图25中所示，在相同水平的蛋白质超负荷攻击下，与野生型超负荷组(小图C)相比，在MASP-2-/-超负荷组(小图D)中存在程度高得多的组织保存。例如，与野生型对照组中的鲍氏囊(小图A)相比，观察到用BSA治疗的野生型小鼠(超负荷)的鲍氏囊是极大扩展的(小图C)。相比之下，用相同水平的BSA治疗的MASP-2-/-小鼠(超负荷)中的鲍氏囊(小图D)，保留了类似于MASP-2-/-对照小鼠(小图B)和野生型对照小鼠(小图A)的形态。如图25中进一步所示，在野生型肾脏切片的近端小管和远端小管中(小图C)，已积累了较大的蛋白管型结构，与MASP-2-/-小鼠(小图D)相比，所述蛋白管型结构更大且更丰富。
还应注意的是，通过透射电子显微镜分析来自这项研究的肾脏切片显示了，用BSA治疗的小鼠对远端和近端小管细胞的睫状边界具有整体损害，其中细胞内含物和核突入小管腔内。相比之下，组织在用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠中得到保存。
肾脏中的巨噬细胞浸润评价
为了测量如通过巨噬细胞浸润指示的炎症程度，还使用Boor等人，JofAm SocofNephrology 18:1508-1515，2007中描述的方法，用巨噬细胞特异性抗体F4/80，对收获肾脏的组织切片进行染色。
图26以图形方式示出了，用巨噬细胞特异性抗体F4/80染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，显示了巨噬细胞的平均染色面积(％)，其中所述组织切片在蛋白质超负荷研究的第15天得自野生型对照小鼠(n＝2)、用BSA治疗的野生型小鼠(n＝6)、以及用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠(n＝5)。如图26中所示，用F4/80抗巨噬细胞抗体染色的肾脏组织切片显示了，虽然与野生型假对照相比，用BSA治疗的两组显示了肾脏巨噬细胞浸润的显著增加(作为％F4/80抗体染色面积测量的)，但与来自BSA治疗的野生型小鼠的组织切片中的巨噬细胞浸润相比，在来自BSA治疗的MASP-2-/-小鼠的组织切片中观察到巨噬细胞浸润的显著降低(p值＝0.0345)。
图27A以图形方式示出了，通过相对于巨噬细胞浸润(平均染色面积％)，绘制来自24小时样品的尿中测量的总排泄蛋白，关于用BSA治疗的每只野生型小鼠(n＝6)中的巨噬细胞-蛋白尿相关性的存在的分析。如图27A中所示，来自野生型肾脏的大多数样品显示了在存在的蛋白尿水平与巨噬细胞浸润程度之间的正相关。
图27B以图形方式示出了，通过相对于巨噬细胞浸润(平均染色面积％)，绘制在24小时样品的尿中的总排泄蛋白，关于用BSA治疗的每只MASP-2-/-小鼠(n＝5)中的巨噬细胞-蛋白尿相关性的存在的分析。如图27B中所示，在MASP-2-/-小鼠中并未观察到在野生型小鼠中观察到的、蛋白尿水平与巨噬细胞浸润程度之间的正相关(图27A中所示)。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但这些结果可能指示了在MASP-2-/-小鼠中的高蛋白尿水平下的炎症清除机制的存在。
细胞因子浸润的评价
白细胞介素6(IL-6)、转化生长因子β(TGFβ)和肿瘤坏死因子α(TNFα)是促炎细胞因子，其已知在蛋白尿症模型中的野生型小鼠近端小管中是上调的(Abbate M.等人，Journal of the American Society ofNephrology:JASN，17:2974-2984，2006；David S.等人，Nephrology，Didalysis，Transplantation，Official Publication of theEuropean Dialysis and Transplant Association-European RenalAssociation 12:51-56，1997)。如上所述，用细胞因子特异性抗体，对肾脏的组织切片进行染色。
图28以图形方式示出了，在用BSA治疗的野生型小鼠(n＝4)和用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠(n＝5)中，用抗TGFβ抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％TGFβ抗体染色面积测量的)。如图28中所示，与MASP-2-/-BSA治疗的(超负荷)组相比，在野生型BSA治疗的(超负荷)组中观察到TGFβ染色的显著增加(p＝0.026)。
图29以图形方式示出了，在用BSA治疗的野生型小鼠(n＝4)和用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠(n＝5)中，用抗TNFα抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％TNFα抗体染色面积测量的)。如图29中所示，与MASP-2-/-BSA治疗的(超负荷)组相比，在野生型BSA治疗的(超负荷)组中观察到TNFα染色的显著增加(p＝0.0303)。
图30以图形方式示出了，在野生型对照小鼠、MASP-2-/-对照小鼠、用BSA治疗的野生型小鼠(n＝7)和用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠(n＝7)中，用抗IL-6抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％IL-6抗体染色面积测量的)。如图30中所示，与MASP-2-/-BSA治疗的组相比，在野生型BSA治疗的组中观察到IL-6染色的高度显著增加(p＝0.0016)。
细胞凋亡评价
通过用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色，来评价组织切片中的细胞凋亡，并且在从皮质中连续选择的20个高倍视野(HPF)中，计数TUNEL染色的凋亡细胞的频率。
图31以图形方式示出了，在野生型对照小鼠(n＝1)、MASP-2-/-对照小鼠(n)、用BSA治疗的野生型小鼠(n＝7)和用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠(n＝7)中，从来自肾皮质的组织切片中连续选择的20个高倍视野(HPF)中计数的TUNEL凋亡细胞的频率。如图31中所示，与得自用BSA治疗的MASP-2-/-小鼠的肾脏相比，在得自用BSA治疗的野生型小鼠的肾脏中，观察到在皮质中的显著更高的细胞凋亡率(p＝0.0001)。
结果和结论的总体概括：
本实施例中的结果证实了，MASP-2-/-小鼠在蛋白质超负荷模型中具有降低的肾损伤。因此，MASP-2抑制剂，例如MASP-2抑制性抗体，预计抑制或预防炎症和蛋白尿的有害循环，并且改善慢性肾脏疾病中的结果。
实施例17
本实施例描述了关于在降低和/或预防野生型小鼠中的小鼠蛋白质超负荷蛋白尿模型中的肾炎症和小管间质性损伤中的功效，来分析单克隆MASP-2抑制性抗体。
背景/原理：
如实施例16中所述，在蛋白尿的蛋白质超负荷模型中，确定MASP-2-/-小鼠显示出比野生型小鼠显著更好的结果(例如，更少的小管间质性损伤和更少的肾脏炎症)，暗示了凝集素途径在蛋白尿性肾脏疾病中的致病作用。
如实施例13中所述，生成了单克隆MASP-2抑制性抗体(OMS646-SGMI-2)，其特异性阻断人凝集素途径的功能，并且还显示阻断小鼠中的凝集素途径。在本实施例中，在小鼠蛋白质超负荷蛋白尿模型中，分析了MASP-2抑制性抗体OMS646-SGMI-2在降低和/或预防野生型小鼠的肾炎症和小管间质性损伤中的功效。
方法：
这项研究评估了与人IgG4同种型对照抗体ET904(10mg/kg)和盐水对照比较，MASP-2抑制性抗体(10mg/kg OMS646-SGMI-2)的效应。
与实施例16中描述的研究相似，这项研究利用蛋白质超负荷来诱导蛋白尿性肾脏疾病(Ishola等人，European Renal Association 21:591-597，2006)。通过用递增剂量(2g/kg至15g/kg)的低内毒素牛血清白蛋白(BSA)的每天i.p.注射，总共15天，在单侧肾切除的Balb/c小鼠中诱导蛋白尿，如实施例16中所述。
通过在蛋白尿诱导前7天起始的每两周一次的i.p.注射施用抗体治疗，并且在研究自始至终继续。基于先前的PK/PD和药理学研究选择了这种给药方案，证实了持续的凝集素途径压制(数据未显示)。在第15天时处死小鼠，并且收获肾脏并加工用于H&E和免疫染色。通过数字图像捕获分析来自肾皮质的染色组织切片，随后为使用自动化图像分析软件的定量。
如实施例16所述进行免疫组织化学染色和细胞凋亡评价。
结果：
蛋白尿的评价
为了确认小鼠中蛋白尿的存在，在第15天(实验结束)，在经过24小时时期收集的尿样品中，测量了尿中的总排泄蛋白。确定了与未用BSA治疗的对照组相比，在用BSA治疗的组中，尿样品显示了总蛋白质水平中几乎六倍增加的平均值(数据未显示)，确认了用BSA治疗的小鼠中蛋白尿的存在。在BSA治疗的组之间的蛋白质水平中没有观察到显著差异。
组织学变化的评价
图32显示了在用BSA治疗后的第15天，来自下述小鼠组的代表性H&E染色的组织切片：(小图A)用盐水治疗的野生型对照小鼠，(小图B)同种型抗体治疗的对照小鼠，以及(小图C)用MASP-2抑制性抗体治疗的野生型小鼠。
如图32中所示，在相同水平的蛋白质超负荷攻击下，与用盐水(小图A)或同种型对照(小图B)治疗的野生型组相比，在MASP-2抑制性抗体治疗的组(小图C)中存在程度高得多的组织保存。
细胞凋亡评价
通过用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色，来评价组织切片中的细胞凋亡，并且在从皮质中连续选择的20个高倍视野(HPF)中，计数TUNEL染色的凋亡细胞的频率。图33以图形方式示出了，在用盐水对照和BSA治疗的野生型小鼠(n＝8)、用同种型对照抗体和BSA治疗的野生型小鼠(n＝8)、以及用MASP-2抑制性抗体和BSA治疗的野生型小鼠(n＝7)中，从来自肾皮质的组织切片中连续选择的20个高倍视野(HPF)中计数的TUNEL凋亡细胞的频率。如图33中所示，与盐水和同种型对照治疗的组相比，在从MASP-2抑制性抗体治疗的组获得的肾脏中，观察到皮质的细胞凋亡率的高度显著减少(相对于MASP-2抑制性抗体，对于盐水对照，p＝0.0002；相对于MASP-2抑制性抗体，对于同种型对照，p＝0.0052)。
细胞因子浸润的评价
在这项研究中获得的肾脏组织切片中，评价了白细胞介素6(IL-6)、转化生长因子β(TGFβ)和肿瘤坏死因子α(TNFα)，其为已知在蛋白尿症模型中的野生型小鼠近端小管中是上调的促炎细胞因子。
图34以图形方式示出了，在用BSA和盐水治疗的野生型小鼠(n＝8)、用BSA和同种型对照抗体治疗的野生型小鼠(n＝7)、以及用BSA和MASP-2抑制性抗体治疗的野生型小鼠(n＝8)中，用抗TGFβ抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％TGFβ抗体染色面积测量的)。如图34中所示，与盐水和同种型对照抗体治疗的对照组相比，TGFβ染色区域的定量显示了MASP-2抑制性抗体治疗的小鼠中的TGFβ水平的显著降低(分别为p值＝0.0324和0.0349)。
图35以图形方式示出了，在用BSA和盐水治疗的野生型小鼠(n＝8)、用BSA和同种型对照抗体治疗的野生型小鼠(n＝7)、以及用BSA和MASP-2抑制性抗体治疗的野生型小鼠(n＝8)中，用抗TNFα抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％TNFα抗体染色面积测量的)。如图35中所示，与盐水对照组(p＝0.011)以及同种型对照组(p＝0.0285)相比，染色切片的分析显示了MASP-2抑制性抗体治疗的组中的TNFα水平的显著降低。
图36以图形方式示出了，在用BSA和盐水治疗的野生型小鼠(n＝8)、用BSA和同种型对照抗体治疗的野生型小鼠(n＝7)、以及用BSA和MASP-2抑制性抗体治疗的野生型小鼠(n＝8)中，用抗IL-6抗体的染色组织切片的基于计算机的图像分析结果(作为％IL-6抗体染色面积测量的)。如图36中所示，与盐水对照组(p＝0.0269)以及同种型对照组(p＝0.0445)相比，染色切片的分析显示了MASP-2抑制性抗体治疗的组中的IL-6水平的显著降低。
结果和结论的总体概括：
本实施例中的结果证实了，MASP-2抑制性抗体的使用在蛋白质超负荷模型中提供了免于肾损伤的保护，其与实施例16中所述的结果一致，证实了MASP-2-/-小鼠在蛋白尿模型中具有降低的肾损伤。
实施例18
本实施例提供了在MASP-2-/-和野生型小鼠中，使用阿霉素诱导的肾纤维化、炎症和小管间质性损伤的肾病模型生成的结果，以评估凝集素途径在阿霉素诱导的肾病中的作用。
背景/原理：
阿霉素是用于广泛多样的癌症治疗中的蒽环类抗肿瘤抗生素，所述癌症包括血液系统恶性肿瘤、软组织肉瘤和许多类型的癌症。阿霉素诱导的肾病是充分确立的慢性肾脏疾病的啮齿类动物模型，其已使得能够更好地理解慢性蛋白尿的进展(Lee和Harris，Nephrology，16:30-38，2011)。阿霉素诱导的肾病中的结构和功能损伤类型与人中的慢性蛋白尿性肾疾病非常相似(Pippin等人，American Journal of Renal Physiology 296:F213-29，2009)。
阿霉素诱导的肾病的特征在于对足细胞的损伤，随后为肾小球硬化、小管间质性炎症和纤维化。在许多研究中已显示了，阿霉素诱导的肾病受免疫和非免疫衍生机制两者的调节(Lee和Harris，Nephrology，16:30-38，2011)。作为肾脏疾病的模型，阿霉素诱导的肾病具有几个优势。首先，它是高度可再现和可预测的肾损伤模型。这是因为它的特征在于在药物施用的几天内的肾损伤诱导，其允许简化实验设计，因为损伤的时机是一致的。它也是其中组织损伤的程度很严重，同时与可接受的死亡率(<5％)和发病率(重量减轻)相关的模型。因此，由于阿霉素引起的肾病中肾损伤的严重性和时机，它是适合于测试保护免于肾损伤的干预的模型。
如实施例16和17中所述，在蛋白尿的蛋白质超负荷模型中，确定MASP-2-/-小鼠和用MASP-2抑制性抗体治疗的小鼠，显示出比野生型小鼠明显更好的结果(例如，更少的小管间质性损伤和更少的肾炎症)，暗示了凝集素途径在蛋白尿性肾脏疾病中的致病作用。
在本实施例中，MASP-2-/-小鼠在阿霉素诱导的肾病模型(AN)中与野生型小鼠比较进行分析，以确定MASP-2缺乏是否降低和/或预防由阿霉素诱导的肾炎症和小管间质性损伤。
方法：
1.剂量和时间点优化
进行了初始实验，以确定阿霉素的剂量、以及在其下BALB/c小鼠发展适合于测试治疗干预的肾炎症水平的时间点。
三组野生型BALB/c小鼠(n＝8)用IV施用的单一剂量的阿霉素(10.5mg/kg)进行注射。在三个时间点将小鼠处死：在阿霉素施用后的一周、两周和四周。对照小鼠仅用盐水进行注射。
结果：如通过H&E染色确定的，三组中的所有小鼠都显示了肾小球硬化和蛋白尿的体征，具有如通过肾脏中的巨噬细胞浸润测量的，逐步增加的组织炎症程度(数据未显示)。组织损伤的程度在一周组中是轻度的，在两周组中是中度的，且在四周组中是重度的(数据未显示)。选择了两周时间点用于研究的剩余部分。
2.在野生型和MASP-2-/-小鼠中阿霉素诱导的肾病的分析
为了阐明补体的凝集素途径在阿霉素诱导的肾病中的作用，在相同剂量的阿霉素下，将MASP-2-/-小鼠(BALB/c)组与野生型小鼠(BALB/c)进行比较。将MASP-2-/-小鼠与BALB/c小鼠回交10代。
野生型(n＝8)和MASP-2-/-(n＝8)用阿霉素(10.5mg/kg)进行IV注射，并且每个品系的三只小鼠仅给予盐水作为对照。在治疗后两周将所有小鼠处死，并收集组织。通过H&E染色评价组织病理学损伤的程度。
结果：
图37显示了在仅用阿霉素或盐水(对照)治疗后的第14天，来自下述小鼠组的代表性H&E染色的组织切片：(小图A-1、A-2、A-3)仅用盐水治疗的野生型对照小鼠；(小图B-1、B-2、B-3)用阿霉素治疗的野生型小鼠；以及(小图C-1、C-2、C-3)用阿霉素治疗的MASP-2-/-小鼠。每张照片(例如，小图A-1、A-2、A-3)代表不同的小鼠。
如图37中所示，与用相同剂量的阿霉素治疗的野生型组相比，在用阿霉素治疗的MASP-2-/-组中存在程度高得多的组织保存。
图38以图形方式示出了，用巨噬细胞特异性抗体F4/80染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，显示了在仅用阿霉素或盐水(野生型对照)治疗后的第14天，来自下述小鼠组的巨噬细胞的平均染色面积(％)：仅用盐水治疗的野生型对照小鼠；用阿霉素治疗的野生型小鼠；仅用盐水治疗的MASP-2-/-小鼠，以及用阿霉素治疗的MASP-2/-小鼠。如图38中所示，与用阿霉素治疗的野生型小鼠相比，用阿霉素治疗的MASP-2-/-小鼠具有降低的巨噬细胞浸润(**p＝0.007)。
图39以图形方式示出了，用天狼星红染色的肾脏组织切片的基于计算机的图像分析结果，显示了在仅用阿霉素或盐水(野生型对照)治疗后的第14天，来自下述小鼠组的胶原沉积的染色面积(％)：仅用盐水治疗的野生型对照小鼠；用阿霉素治疗的野生型小鼠；仅用盐水治疗的MASP-2-/-小鼠，以及用阿霉素治疗的MASP-2/-小鼠。如图39中所示，与用阿霉素治疗的野生型小鼠相比，用阿霉素治疗的MASP-2-/-小鼠具有降低的胶原沉积(**p＝0.005)。
总体概括和结论：
肾小管间质性炎症的改善是肾脏疾病治疗的关键靶。本文呈现的结果指示了补体活化的凝集素途径显著促成肾小管间质性炎症的发展。如本文进一步证实的，MASP-2抑制剂，例如MASP-2抑制性抗体，可以用作治疗蛋白尿性肾病、阿霉素肾病和改善肾小管间质性炎症的新治疗方法。
实施例19
本实施例描述了进行中的2期临床试验的初步结果，以评估全人单克隆MASP-2抑制性抗体在类固醇依赖型免疫球蛋白A肾病(IgAN)的成人、以及类固醇依赖型膜性肾病(MN)的成人中的安全性和临床功效。
背景：
慢性肾脏疾病影响美国多于2000万人(Drawz P.等人，Ann Intern Med 162(11)；ITC1-16，2015)。肾小球性肾病(GN)，包括IgAN和MN是其中肾小球被损害，且频繁导致终末期肾疾病和透析的肾脏疾病。存在几种类型的原发性GN，最常见的是IgAN。这些患者中的许多具有持续的肾炎症和进行性恶化。这些患者经常用皮质类固醇或免疫抑制剂进行治疗，其具有许多严重的长期不良后果。即使处于这些治疗下，许多患者仍继续恶化。不存在批准用于治疗IgAN或MN的治疗。
IgA肾病
免疫球蛋白A肾病(IgAN)是自身免疫性肾脏疾病，导致肾内炎症和肾脏损伤。IgAN是全球最常见的原发性肾小球疾病。具有大约2.5/100,000的年发病率，估计美国1400人中的1个发展IgAN。多达40％的IgAN患者发展终末期肾脏疾病(ESRD)。患者通常呈现有显微镜性血尿，具有轻度至中度蛋白尿和可变水平的肾功能不全(Wyatt R.J.等人，NEnglJMed368(25):2402-14，2013)。临床标记物如肾功能受损、持续性高血压和重度蛋白尿(超过1g/天)与预后不良相关(Goto M等人，Nephrol Dial Transplant 24(10):3068-74，2009；Berthoux F.等人，J Am SocNephrol 22(4):752-61，2011)。蛋白尿是在多重大型观察研究和前瞻性试验中，不依赖于其它风险因素的最强预后因素(Coppo R.等人，J Nephrol 18(5):503-12，2005；Reich H.N.等人，J Am Soc Nephrol 18(12):3177-83，2007)。如果不予以治疗，估计15-20％的患者在疾病发作的10年内达到ESRD(D’Amico G.，Am J KidneyDis36(2):227-37，2000)。
IgAN的诊断标志是肾小球系膜中占优势的单独或者与IgG、IgM或两者一起的IgA沉积。在IgAN中，肾脏活组织检查揭示了甘露聚糖结合凝集素(MBL)的肾小球沉积，所述MBL是关于MASP-2(补体系统的凝集素途径的效应酶)活化的关键识别分子。通常与IgA共定位并指示补体活化的肾小球MBL沉积物、以及高水平的尿MBL与IgAN中的不利预后相关，其中这些患者证实了比不具有MBL沉积或具有高水平的尿MBL的患者更严重的组织学改变和系膜增生(Matsuda M.等人，Nephron80(4):408-13，1998；Liu LL等人，Clin Exp Immunol169(2):148-155，2012；Roos A.等人，J Am Soc Nephrol 17(6):1724-34，2006；Liu LL等人，Clin Exp Immunol 174(1):152-60，2013)。缓解率对于具有MBL沉积的患者也基本上更低(Liu LL等人，Clin ExpImmunol 174(1):152-60，2013)。
用于IgAN的目前疗法包括血压控制，以及频繁地，用于严重疾病(例如新月体性IgAN)的皮质类固醇和/或其它免疫抑制剂，例如环磷酰胺、硫唑嘌呤或霉酚酸酯。KidneyDisease Improving Global Outcomes(KDIGO)Guidelines for Glomerulonephritis(Int.Soc ofNephrol 2(2):139-274，2012)，建议皮质类固醇应该施用于蛋白尿大于或等于1g/天的患者，具有6个月的通常治疗持续时间。然而，即使用侵袭性免疫抑制治疗(其与严重的长期后遗症相关)，一些患者具有肾功能的逐渐恶化。不存在用于IgAN的批准治疗，并且即使使用血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂(ARB)来控制血压，增加的蛋白尿在某些患者中持续存在。在处于疾病迅速发展的风险中的患者中，这些治疗无一已显示停止或甚至减缓IgAN的进展。
膜性肾病
膜性肾病(MN)的年发病率为大约10-12/1,000,000。MN患者可以具有可变的临床病程，但大约25％发展终末期肾疾病。
膜性肾病是免疫介导的肾小球疾病，以及成人中的肾病综合征的最常见原因之一。该疾病的特征在于肾小球基底膜的外面上的免疫沉积物(主要是IgG4)形成，其含有足细胞抗原以及对那些抗原特异性的抗体，导致补体活化。MN的最初表现与肾病综合征有关：蛋白尿、低白蛋白血症、高脂血症和水肿。
尽管MN可能无需治疗自发地缓解，但在诊断后5年的中值下，多达三分之一的患者证实了肾脏功能的逐渐丧失和进展为ESRD。皮质类固醇经常用于治疗MN，并且需要开发替代疗法。另外，基于蛋白尿的严重性，确定为处于进展的中度风险中的患者用与环磷酰胺或钙调蛋白抑制剂结合的泼尼松进行治疗，并且这两种治疗一起经常与严重的全身性不良作用相关。
方法：
在健康志愿者中进行的两项1期临床试验已证实了，MASP-2抑制性抗体OMS646的静脉内和皮下给药均导致持续的凝集素途径抑制。
本实施例描述了来自MASP-2抑制性抗体OMS646在患有IgAN和MN的受试者中的进行中的2期、非对照、多中心研究的中期结果。纳入标准要求这项研究中的所有患者，不管肾疾病亚型如何，在研究入选之前已维持在稳定剂量的皮质类固醇下至少12周(即，患者是类固醇依赖性的)。该研究是单组(arm)先导性研究，具有12周治疗期和6周随访期。
计划入选大约四个受试者/疾病。该研究设计为评估OMS646是否可以改善IgAN和MN受试者的肾功能(例如，改善蛋白尿)，且减少皮质类固醇需求。迄今为止，2个IgA肾病患者和2个膜性肾病患者已完成了该研究中的治疗。
在研究进入时，尽管用稳定的皮质类固醇剂量的持续治疗，每个受试者必须具有在尿中高水平的蛋白质。这些标准选择了在研究期过程中不太可能自发地改善的患者。
受试者在筛选时为≥18岁，并且仅在他们具有下述诊断之一时才被纳入研究中：在肾脏活组织检查时诊断的IgAN或在肾脏活组织检查时诊断的原发性MN。入选患者还必须满足所有下述纳入标准：
(1)在筛选期过程中的2次就诊的每一次之前，具有来自连续且每天收集的三个样品的平均尿白蛋白/肌酐比>0.6。
(2)在筛选就诊1之前，已处于≥10mg泼尼松或等价剂量下至少12周；
(3)如果处于免疫抑制治疗(例如环磷酰胺、霉酚酸酯)下，则在筛选就诊1之前已处于稳定剂量下至少2个月，对于研究持续时间没有预计的剂量变化；
(4)具有通过MDRD方程1计算的估计肾小球滤过率(eGFR)≥30mL/分钟/1.73m2；
(5)处于医生指导的、稳定、优化的用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和/或血管紧张素受体阻滞剂(ARB)的治疗，并且具有在休息时<150mmHg的收缩压和<90mmHg的舒张压；
(6)在筛选就诊1的6个月内，未使用贝利木单抗、依库珠单抗或利妥昔单抗；和
(7)没有肾脏移植史。
1MDRD方程：eGFR(mL/分钟/1.73m2)＝175x(SCr)-1.154x(年龄)-0.203x(如果是女性则为0.742)x(如果是非裔美国人则为1.212)。注意：SCr＝血清肌酐测量应为mg/dL。
这项研究中使用的单克隆抗体OMS646是结合并抑制人MASP-2的全人IgG4单克隆抗体。MASP-2为凝集素途径的效应酶。如实施例12中证实的，OMS646与重组MASP-2亲合地结合(表观平衡解离常数在100pM的范围内)，并且显示出超过同源蛋白C1、C1r和MASP-1大于5,000倍的选择性。在功能测定中，OMS646以纳摩尔效力(导致大约3nM的50％抑制[IC50]的浓度)抑制人凝集素途径，但对经典途径没有显著作用。通过对小鼠、非人灵长类动物和人的静脉内(IV)或皮下(SC)注射施用的OMS646导致高血浆浓度，其与离体测定中凝集素途径活化的压制相关。
在这项研究中，OMS646原料药以100mg/mL的浓度提供，所述浓度进一步稀释用于IV施用。使用注射器从小瓶中抽取适当计算体积的OMS646100mg/mL注射溶液，用于剂量制备。输液袋在制备后的四个小时内施用。
研究由筛选(28天)、治疗(12周)和随访(6周)期组成，如图54所示。
在筛选期内且在第一个OMS646剂量之前，同意的受试者提供在两个连续三天时期各自的三个尿样品(每天收集一次)，以建立尿白蛋白/肌酐比的基线值。在筛选期之后，合格的受试者接受每周一次的OMS6464mg/kg IV，共12周(治疗期)。在OMS646的最后一个剂量后存在6周的随访期。
在用OMS646治疗的最初4周过程中，受试者维持在其稳定的研究前皮质类固醇剂量下。在12周治疗期的最初4周结束时，受试者经历皮质类固醇逐渐减少(即，降低皮质类固醇剂量)，如果耐受，则持续4周，随后为在此期间维持所得的皮质类固醇剂量的4周。目标是每天逐渐减少至≤6mg泼尼松(或等价剂量)。经过这个时期，如通过研究者确定的，逐渐减少在具有肾功能恶化的受试者中停止。通过皮质类固醇逐渐减少和整个12周的治疗，用OMS646来治疗受试者。然后，在其最后一次治疗后，对患者再随访6周。皮质类固醇的逐渐减少和OMS646治疗，允许评价OMS646是否允许维持稳定肾功能所需的皮质类固醇剂量的减少。
这项研究中的关键功效测量是从基线到12周，尿白蛋白/肌酐比率(uACR)和24小时蛋白质水平的变化。尿蛋白或白蛋白的测量照常规用于评价肾脏牵涉，并且持续高水平的尿蛋白与肾疾病进展相关联。uACR在临床上用于评价蛋白尿。
功效分析
uACR的分析值定义为对于某个时间点获得的所有值的均值。uACR的计划数目为在每个计划的时间点三个。uACR的基线值定义为两次筛选就诊时的分析值的均值。
结果：
图40以图形方式示出了，在用4mg/kg MASP-2抑制性抗体(OMS646)的每周治疗的十二周研究过程期间，两个IgAN患者中的uACR。如图40中所示，距离基线的变化通过未转化的分析，在时间点“a”(p＝0.003)；时间点“b”(p＝0.007)和时间点“c”(p＝0.033)下是统计上显著的。表12提供了关于用OMS646治疗的两个IgAN患者的24小时尿蛋白数据。
表12：OMS646治疗的IgAN患者中的24小时尿蛋白(mg/天)
如图40和表12中所示，经过研究的过程，IgAN患者证实了肾脏功能的临床和统计上显著的改善。存在uACR(参见图40)和24小时尿蛋白浓度(参见表12)两者统计上显著的减少。如图40中的uACR数据中所示，平均基线uACR为1264mg/g，并且在治疗结束时达到525mg/g(p＝0.011)，在随访期结束时减少至128mg/g。如图40中进一步所示，治疗效应在随访期自始至终得到维持。24小时尿蛋白排泄的测量跟踪uACR，具有从3156mg/24小时到1119mg/24小时的平均降低(p＝0.017)。跨越两个患者的治疗效应是高度一致的。两个患者经历了大约2000mg/天的降低，并且均达到部分缓解(定义为24小时尿蛋白排泄的大于50百分比降低和/或所得的蛋白排泄少于1000mg/天；完全缓解定义为蛋白质排泄少于300mg/天)。两个IgA肾病患者的24小时蛋白尿降低量级与肾存活的显著改善相关。两个IgA肾病患者也能够基本上逐渐减少其类固醇的剂量，各自将日剂量降低至≤5mg(60mg至0mg；30mg至5mg)。
两个MN患者也证实了在用OMS646治疗期间的uACR降低。一个MN患者具有从1003mg/g到69mg/g的uACR减少，并且在随访期自始至终维持在这个低水平下。另一个MN患者具有从1323mg/g到673mg/g的uACR减少，具有在治疗后的可变过程。第一个MN患者显示24小时尿蛋白水平的显著降低(在基线时的10,771mg/24小时到在第85天时的325mg/24小时)，达到部分缓解和几乎完全缓解，而另一个患者保持基本不变(在基线时的4272mg/24小时到在第85天时的4502mg/24)。类固醇在两个MN患者中逐渐减少，从30mg到15mg，且从10mg到5mg。
总之，在用MASP-2抑制性抗体OMS646治疗的IgAN和MN受试者中，观察到肾功能的一致改善。OMS646治疗在IgAN患者中的效应是稳固且一致的，提示了强功效信号。这些效应通过MN患者中的结果得到支持。在治疗期间uACR变化的时间过程和量级在所有四个IgAN和MN患者中是一致的。没有观察到重大的安全问题。这项研究中的患者代表了难以治疗组，并且这些患者中的疗效被认为预测在IgAN和MN患者中用MASP-2抑制性抗体如OMS646的功效，所述患者例如患有类固醇依赖性IgAN和MN的患者(即，在用MASP-2抑制性抗体治疗之前，经历用稳定皮质类固醇剂量的治疗的患者)，包括处于迅速进展为终末期肾疾病的风险中的患者。
根据前述内容，在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有IgAN或MN的人受试者的方法，其包括将包含有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物施用于受试者。在一个实施方案中，该方法包括将足以改善肾功能(例如，改善蛋白尿)的量的MASP-2抑制性抗体施用于患有IgAN或MN的人受试者。在一个实施方案中，受试者患有类固醇依赖性IgAN。在一个实施方案中，受试者患有类固醇依赖性MN。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体以足以改善所述受试者的肾功能和/或减少皮质类固醇剂量的量施用于患有类固醇依赖性IgAN或类固醇依赖性MN的受试者。
在一个实施方案中，该方法进一步包括在将包含有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物施用于受试者的步骤之前，鉴定患有类固醇依赖性IgAN的人受试者。
在一个实施方案中，该方法进一步包括在将包含有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物施用于受试者的步骤之前，鉴定患有类固醇依赖性MN的人受试者。
根据本文公开的实施方案中的任一个，MASP-2抑制性抗体显示出下述特征中的至少一个或多个：所述抗体以10nM或更小的KD结合人MASP-2，所述抗体结合MASP-2的CCP1结构域中的表位，所述抗体在体外测定中，以10nM或更小的IC50抑制1％人血清中的C3b沉积，所述抗体以30nM或更小的IC50抑制90％人血清中的C3b沉积，其中所述抗体为选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段，其中所述抗体是单链分子，其中所述抗体是IgG2分子，其中所述抗体是IgG1分子，其中所述抗体是IgG4分子，其中所述IgG4分子包含S228P突变。在一个实施方案中，该抗体结合MASP-2并选择性地抑制凝集素途径，并且基本上不抑制经典途径(即，抑制凝集素途径，同时使经典补体途径保持原样)。
在一个实施方案中，施用MASP-2抑制性抗体，其量有效改善至少一种或多种肾功能相关的临床参数，例如蛋白尿的改善(例如，uACR的减少和/或24小时尿蛋白浓度的减少，例如24小时尿蛋白排泄的大于20百分比降低，或例如24小时尿蛋白排泄的大于30百分比降低，或例如24小时尿蛋白排泄的大于40百分比降低，或例如24小时尿蛋白排泄的大于50百分比降低)。
在一些实施方案中，该方法包括对于第一时间段(例如，至少一天至一周或两周或三周或四周或更长时间)，经由导管(例如，静脉内)，将MASP-2抑制性抗体施用于患有IgAN(例如，类固醇依赖性IgAN)的受试者，随后为对于第二时间段(例如，至少两周或更长时间的慢性期)，将MASP-2抑制性抗体皮下施用于受试者。
在一些实施方案中，该方法包括对于第一时间段(例如，至少一天至一周或两周或三周或四周或更长时间)，经由导管(例如，静脉内)，将MASP-2抑制性试剂施用于患有MN(例如，类固醇依赖性MN)的受试者，随后为对于第二时间段(例如，至少两周或更长时间的慢性期)，将MASP-2抑制性抗体皮下施用于受试者。
在一些实施方案中，该方法包括将MASP-2抑制性抗体静脉内、肌内或皮下施用于患有IgAN(例如类固醇依赖性IgAN)或MN(例如类固醇依赖性MN)的受试者。治疗可以是慢性的，并且每天至每月施用，但优选至少每两周或每周至少一次，例如每周两次或每周三次。
在一个实施方案中，该方法包括治疗患有IgAN(例如类固醇依赖性IgAN)或MN(例如类固醇依赖性MN)的受试者，其包括向受试者施用包含一定量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，该组合物包括包含以下的MASP-2抑制性抗体：(a)重链可变区，其包含：i)包含来自SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1；和ii)包含来自SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2；和iii)包含来自SEQ ID NO:67的95-107的氨基酸序列的重链CDR-H3，以及b)轻链可变区，其包含：i)包含来自SEQ ID NO:69的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1；和ii)包含来自SEQ ID NO:69的50-56的氨基酸序列的轻链CDR-L2；和iii)包含来自SEQ ID NO:69的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3，或(II)其变体，其包含与SEQ ID NO:67具有90％的同一性(例如，与SEQ ID NO:67具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性)的重链可变区，以及与SEQ ID NO:69具有90％的同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性)的轻链可变区。
在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用包含一定量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述MASP-2抑制性抗体包括包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的重链可变区、以及包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用包含MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述MASP-2抑制性抗体特异性识别人MASP-2上由参考抗体OMS646识别的表位的至少一部分，所述参考抗体OMS646包含如SEQ ID NO:67中所示的重链可变区和如SEQ ID NO:69中所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，该方法包括向患有或处于发展IgAN(例如，类固醇依赖性IgAN)或MN(例如，类固醇依赖性MN)的风险中的受试者，施用包含MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述MASP-2抑制性抗体包括包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的重链可变区、以及包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的轻链可变区，其剂量为1mg/kg至10mg/kg(即，1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)，每周至少一次(例如每周至少两次或每周至少三次)，持续至少3周、或至少4周、或至少5周、或至少6周、或至少7周、或至少8周、或至少9周、或至少10周、或至少11周、或至少12周的时期。
实施例20
本实施例描述了在患有或处于发展冠状病毒诱导的急性呼吸窘迫综合征的风险中的受试者治疗中，使用MASP-2抑制性抗体OMS646的研究。
背景/原理：
急性呼吸窘迫综合征是冠状病毒感染的严重并发症。在2012年，在中东鉴定了新的有关冠状病毒，指定为中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，其引起严重的呼吸系统疾病，具有大于35％的死亡率(Zaki A.M.等人，N Engl J Med 367:1814-1820，2012)。冠状病毒病2019(COVID-19)是在2019年出现的传染病，并且由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS冠状病毒2或SARS-CoV-2)引起，所述病毒是与SARS病毒密切相关的病毒(世界卫生组织，2/11/2020，Novel Coronavirus Situation Report 22)。COVID-19、SARS-CoV和MERS-CoV全都引起从无症状病例到严重急性呼吸窘迫综合征(冠状病毒诱导的ARDS)和呼吸衰竭的一系列疾病。受COVID-19影响的那些人可能发展发烧、干咳、疲劳和呼吸短促。在计算机断层扫描上的发现可以显示肺部磨玻璃影和双侧絮状阴影。病例可能进展为呼吸功能障碍，包括肺炎、严重急性呼吸窘迫综合征，其可以导致多器官衰竭和败血性休克、以及最脆弱的人的死亡(参见例如，Hui D.S.等人，Int J InfectDis 91:264-266，2020年1月14日，以及等人OI:10.1056/NEJMoa2002032)。不存在疫苗或特异性抗病毒治疗，其管理涉及症状的治疗和支持性护理。因此，迫切需要开发治疗上有效的试剂，以治疗、抑制和/或预防冠状病毒诱导的急性呼吸窘迫综合征。
已观察到补体活化促成冠状病毒诱导的严重急性呼吸综合征的发病机制。发现与受SARS-CoV感染的C57BL/6J对照小鼠相比，补体组分3缺陷的受SARS-CoV感染的小鼠(C3-/-小鼠)，显示出显著更少的重量减轻和更少的呼吸功能障碍，尽管肺中的等价病毒载量(Gralinski L.E.等人，mBio 9:e01753-18，2018)。进一步观察到，与受感染的对照小鼠相比，在受SARS-CoV感染的C3-/-小鼠的肺部中，存在显著更少的嗜中性粒细胞和炎性单核细胞，以及与受感染的对照小鼠相比，在受SARS-CoV感染的C3-/-小鼠的肺中，减轻的肺病理状况以及更低的细胞因子和趋化因子水平(例如，IL-5、IL-6)(Gralinski L.E.等人，mBio 9:e01753-18，2018)。
研究还已显示了，SARS-CoV感染的许多幸存者发展肺纤维化，具有在老年患者中的更高患病率(Hui D.S.等人，Chest 128:2247-2261，2005)。存在用于治疗肺部纤维化例如冠状病毒诱导的纤维化的有限选项。传统上，皮质类固醇用于治疗ARDS和肺纤维化，然而，在病毒感染期间，这种治疗障碍免疫应答并且可以导致疾病恶化(Gross T.J.等人，NEnglJMed345:517-525，2001)。
如先前注意到的，尚无用于COVID-19的有效治疗，并且该疾病正在快速传播中。尽管死亡率评价仍为早期，但世界卫生组织报告了在2020年3月上旬3.4％的死亡率(worldwideweb.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19--2020年3月3日)。需要用于严重COVID-19感染的患者的有效治疗。
如本文所述，凝集素途径是补体的三种活化途径之一。其它途径是经典途径和替代途径。所有活化途径都导致过敏毒素C3a和C5a的产生，以及靶细胞上C5b-9或膜攻击复合物(MAC)的产生。
凝集素途径是先天免疫系统的部分，并且被微生物或受损细胞活化。微生物展示基于碳水化合物的病原体相关分子模式(PAMP)，并且受损的宿主细胞展示损害相关分子模式(DAMP)。DAMP并不在健康细胞上展示，但随着细胞损伤而变得暴露。
循环凝集素，例如甘露糖结合凝集素(MBL)、纤维胶凝蛋白和胶原凝集素识别并结合PAMP和DAMP。与PAMP或DAMP结合的凝集素将补体活化定位于细胞膜的附近。这些凝集素携带甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP-2)，其切割补体因子2和4以产生C3转化酶，所述C3转化酶本身然后切割C3，以形成C5转化酶。除凝集素途径活化之外，替代途径也可以被活化并扩大补体活化。所有这些都导致MAC插入受损细胞的膜内，使细胞进一步损伤，具有更多的DAMP暴露。携带MASP-2的循环凝集素识别并结合DAMP，导致进一步的凝集素途径活化和另外的细胞损伤。以这种方式，凝集素途径可以放大并恶化由初始补体活化引起的细胞损伤。
如本文所述，OMS646(也称为OMS721或纳索利单抗)是针对MASP-2的研究性人IgG4单克隆抗体。如本文进一步所述，通过阻断MASP-2，抑制了凝集素途径的活化。这可能破坏上述补体介导的细胞损伤循环。迄今为止，OMS646已施用于大约230个健康志愿者、血栓性微血管病(TMA)患者、以及肾小球性肾病例如免疫球蛋白A[IgA]肾病患者。
凝集素途径可能在冠状病毒诱导的ARDS中启动且持续补体活化中起关键作用，并且经由MASP-2抑制剂(例如MASP-2抑制性抗体OMS646)的凝集素途径抑制，可能解决与冠状病毒感染有关的补体介导的肺部损伤。如本文所述，发明人发现对补体系统的凝集素途径的关键调节剂即甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP-2)的抑制，显著降低了纤维化疾病的各种动物模型中的炎症和纤维化。例如，本文实施例14和15中呈现的结果证实了MASP-2抑制对肾小管间质性炎症、小管细胞损伤、促纤维化细胞因子释放和瘢痕形成的有益作用。如实施例17中所述，在关于降低和/或预防野生型小鼠中的小鼠蛋白质超负荷蛋白尿模型中的肾炎症和小管间质性损伤中的功效，单克隆MASP-2抑制性抗体的分析中，确定与盐水对照组(p＝0.0269)以及同种型对照组(p＝0.0445)相比，存在MASP-2抑制性抗体治疗的组中的IL-6水平的显著降低，如图36中所示。
方法：
进行下述研究，以分析OMS646在治疗患有冠状病毒(例如COVID-19-病毒)感染的一个或多个患者中的用途，以便测量OMS646用于治疗、抑制、减轻或预防所述患者的急性呼吸窘迫综合征中的功效。
该方法涉及鉴定由冠状病毒例如SARS-CoV-2、MERS-CoV或SARS-CoV感染的受试者，其可以通过进行诊断测试，例如分子测试(例如，rRT-PCR)或血清学测试，或参考含有此类信息的数据库来确定。用于SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV的示例性测试在疾病控制中心(Centers For Disease Control)网站(world-wide-web.cdc.gov/coronavirus/mers/lab/lab-testing.html#molecular)上找到。
受试者可能患有COVID-19诱导的ARDS，或处于发展ARDS的风险中，例如患有肺炎的受试者。肺炎是ARDS发展的最常见风险因素(SweeneyR.M.和McAuley，D.F.，Lancet第388卷:2416-30，2016)。
COVID-19诱导的ARDS定义为这样的临床综合征，其在由SARS-CoV-2感染后发展，并且满足下述ARDS标准中的一种或多种(SweeneyR.M.和McAuley，D.F.，Lancet第388卷:2416-30，2016)，基于柏林定义(JAMA 307:2526，2012)：
·氧合(mm Hg)：轻度(PaO2/FiO2200-300)；中度(PaO2/Fi O2100-199)；严重(PaO2/FiO2<100)
·呼气末正压(PEEP)(cm H2O)：要求的最低PEEP为5
·胸部射线照相上的浸润：涉及额叶射线照相或CT上的两个或更多个象限的双侧浸润
·心力衰竭：不足以单独负责临床状态的左心衰竭
·严重性：基于氧合标准
治疗施用
患有COVID-19并经历一种或多种呼吸道症状(例如上文列出的那些标准)的受试者，经由静脉内输注用4mg/kg OMS646给药。治疗每周施用两次。剂量频率由对疗法的患者应答指导。如果患者证实维持4周的临床改善，则剂量可以减少至每周一次4mg/kg。如果患者在每周一次接受4mg/kg共4周时维持治疗应答，则可能中止治疗。
当在呼吸功能例如一种或多种呼吸道症状，例如一种或多种ARDS标准中观察到改善时，确定对治疗的阳性应答。
根据前述内容，在一个方面，本发明提供了用于治疗、抑制、减轻或预防由感染冠状病毒的哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征或疾病的其它表现的方法，其包括向受试者施用有效抑制MASP-2依赖性补体活化(即，抑制凝集素途径活化)的量的MASP-2抑制剂。在一些实施方案中，受试者患有一种或多种呼吸道症状，并且该方法包括向受试者施用有效改善MASP-2依赖性补体活化(即，改善呼吸功能)的量的MASP-2抑制剂。
在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由SARS-CoV-2感染的受试者。在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由SARS-CoV感染的受试者。在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由MERS-CoV感染的受试者。在一个实施方案中，在施用MASP-2抑制剂之前，受试者被鉴定为具有冠状病毒(即，SARS-CoV-2、SARS-CoV或MERS-CoV)。
在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是抑制MASP-2依赖性补体活化的小分子。
在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2的表达抑制剂。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体抑制90％人血清中的C3b沉积，其IC50为30nM或更小。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该方法包括向由冠状病毒感染的受试者施用包含MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述MASP-2抑制性抗体包括包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的重链可变区、以及包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的轻链可变区，其剂量为1mg/kg至10mg/kg(即，1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)，每周至少一次(例如每周至少两次或每周至少三次)，持续至少2周(例如至少3周、或至少4周、或至少5周、或至少6周、或至少7周、或至少8周、或至少9周、或至少10周、或至少11周、或至少12周)的时期。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体的剂量为约4mg/kg(即3.6mg/kg至4.4mg/kg)。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体的剂量是约300mg至约450mg(即，约300mg至约400mg、或约350mg至约400mg)，例如约300mg、约305mg、约310mg、约315mg、约320mg、约325mg、约330mg、约335mg、约340mg、约345mg、约350mg、约355mg、约360mg、约365mg、约370mg、约375mg、约380mg、约385mg、约390mg、约395mg、约400mg、约405mg、约410mg、约415mg、约420mg、约425mg、约430mg、约435mg、约440mg、约445mg和约450mg)的固定剂量。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体的剂量是约370mg(±10％)的固定剂量。
在一个实施方案中，该方法包括每周两次向由冠状病毒感染的受试者，静脉内施用以约370mg(±10％)的固定剂量的MASP-2抑制性抗体，持续至少8周的治疗期。
在一个实施方案中，将MASP-2抑制剂全身性地递送至受试者。在一个实施方案中，将MASP-2抑制剂经口、皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内或作为吸入剂施用。
实施例21
COVID-19患者中的OMS646(纳索利单抗)治疗
本实施例描述了使用实施例20中所述的方法，在COVID-19患者的治疗中使用纳索利单抗(OMS646)。本实施例中所述的结果确认了纳索利单抗在实施例20中所述的COVID-19患者中的功效。
背景/原理：
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2；COVID-19)到2020年2月下旬，在意大利北部的Lombardy地区诊断了数目快速增长的COVID-19病例(Remuzzi A，RemuzziG.COVID-19 and Italy:what next？The Lancet)。COVID-19的主要死亡原因是严重的呼吸功能障碍。已死于COVID-19的患者中的肺组织显示高浓度的SARS-CoV RNA(Wichmann D.等人，AnnInternMed，2020)，并且相同强度的炎性变化在先前报告的冠状病毒SARS-CoV(SARS)和MERS-CoV(MERS)中可见，并且抗炎策略正在针对COVID-19治疗进行评估(Xu Z.等人，Lancet Respir Med，8(4):420-2，2020；HorbyP.等人，medRxiv 2020:2020.06.22.20137273；Gritti G.等人，medRxiv 2020:2020.04.01.20048561)。血栓形成也已在SARS和SARS-CoV-2感染中得到报告(Wichmann D.等人，Ann Intern Med 2020；Magro C.等人，TranslRes 2020；Ding Y.等人，JPathol 200(3):28209，2003)。如同SARS和MERS，COVID-19可以引起危及生命的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(Guan W.J，Ni Z.Y，Hu Y等人Clinical Characteristics of Coronavirus Disease 2019 in China.NEngl JMed2020[提前在线出版])。
COVID-19和ARDS渗出期的关键病理组分是内皮损伤和活化(Varga Z.等人，Lancet 2020；Ackermann M.等人，N Engl J Med 2020；Green S.J.等人，Microbes Infect22(4-5):149-50，2020；Teuwen L.A.等人，Nat Rev Immunol 20(7):389-91，2020；GoshuaG.等人，Lancet Haematol 2020；Thompson B.T.等人，N Engl J Med 377(19):1904-5，2017)。ARDS中增加的毛细血管渗透性和肺水肿的根本原因，内皮损伤也可以引起微血管血管病和血栓形成。内皮损伤也可以引起微血管血管病和血栓形成。内皮活化进一步增强了局部炎症环境。重要的是，如在人体外和动物研究中证实的，内皮损伤特异性活化内皮细胞表面上的补体的凝集素途径(Collard CD，A，MorrisseyMA等人ComplementActivation after Oxidative Stress:Role ofthe Lectin ComplementPathway.AmJPathol2000；156(5):1549–1556)。
如实施例20中所述，与MSP-2结合并阻断凝集素途径活化的高亲和力单克隆抗体，OMS646(也称为纳索利单抗)预计有效治疗COVID-19患者。与实施例20中的描述一致，在动物模型中，MASP-2已与冠状病毒感染中的肺损伤直接联系。参见Gao等人，medRxiv 3/30/2020。MASP-2还直接作用于凝血级联和接触系统，将凝血酶原切割为凝血酶并形成纤维蛋白凝块。纳索利单抗不仅抑制凝集素途径活化，还阻断微血管损伤相关的血栓形成、以及MASP-2介导的激肽释放酶和因子XII的活化。
尚未显示有效治疗COVID-19的疾病特异性疗法。鉴于意大利的沉重疾病负担，我们在Bergamo的Papa Giovanni XXIII Hospital，在同情使用计划下，用纳索利单抗治疗具有严重COVID-19感染和ARDS的患者。这代表凝集素途径抑制剂已首次用于治疗COVID-19的患者。在此处，我们报告了这种初步的临床经验。
方法
研究监督
本实施例中所述的调查在意大利Bergamo的Azienda Socio-SanitariaTerritoriale Papa Giovanni XXIII进行，并且得到机构伦理委员会和Agenzia Italianadel Farmaco的批准。按照标准临床实践收集实验室值，包括血细胞计数、LDH、C反应蛋白(CRP)。所有用纳索利单抗(OMS646)治疗的患者都提供了知情同意书。这项研究使用实施例20中所述的方法进行，如下文进一步所述。
组织病理学
对得自COVID-19患者的病理尸检的福尔马林固定、石蜡包埋的样品执行标准苏木精和曙红染色(H&E)和免疫组织化学。H&E染色的切片通过两个病理学家进行审查。为了确认诊断，用BondReady-to-Use AntibodyCD34(Clone QBEnd/10，LeicaBiosystems，德国)，已对于Bond Polymer Refine Detection使用特异性优化的即用型产品，执行人内皮细胞标记物(CD34)的免疫组化分析。如通过制造商推荐的，使用基于热的抗原修复技术(BondEpitope Retrieval溶液2，共20分钟)，在自动化染色器平台(LeicaBond-3，Leica，德国)上执行测定。肺泡毛细血管中的内皮的细胞质染色指示阳性结果。
循环内皮细胞(CEC)的鉴定和计数
通过对用EDTA收集的外周血样品执行的流式细胞术分析来测试CEC。在红细胞裂解步骤后，样品用下述单克隆抗体在室温下标记20分钟：抗CD45 V500(克隆2D1，BectonDickinson，San Jose`，CA)、抗CD34 PerCP-CY5.5(克隆8G12，Becton Dickinson，San Jose`，CA)、抗CD146 PE(克隆P1H12BD，Pharmingen，CA)。通过流式细胞术(FACSLyric，BDBiosciences)，获得具有总白细胞形态的至少1×106个事件/样品。为了降低操作者引起的变异性，这项研究中的所有样品始终由同一位实验室技术人员进行分析。如先前报告的，使用淋巴细胞子集作为参考群体，通过双平台计数法计算CEC/ml数(Almici C.等人，BoneMarrow Transplant 52:1637-42，2017)。
细胞因子的血清水平
通过流式细胞术(BD CBA Human Inflammatory Cytokines Kit，BectonDickinson，San Jose，CA)，在单个血清样品中分析白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素12p70(IL-12p70)的水平。
患者
在2020年3月11日至3月23日之间，所有纳索利单抗治疗的患者都入院。经过这13天的跨度，在病房住院的COVID-19患者的每日总数范围为405至542。在这个相同时间段期间，平均每天利用140个头盔持续气道正压通气(CPAP)装置，并且ICU每天管理82个患者的中值(范围66-91)。在这些ICU患者中，在2020年3月11日的61个以及在2020年3月23日的80个，符合ARDS的柏林标准(PaO2/FiO2比<100是重度ARDS；100–200是中度；>200和≤300是轻度)(FergusonN.D等人，Intensive CareMed38(10):1573-82，2012；Fagiuoli S.等人，NEnglJMed382(21)e71，2020)。
在这项研究中治疗的所有患者都具有通过定量逆转录酶-聚合酶链反应测定诊断的实验室确认的SARS-CoV-2感染。通过不同的分子方法检测来自鼻和呼吸道样品的SARS-CoV-2基因组，所述分子方法包括GeneFinderTM Covid-19 Plus RealAmp Kit(ELIThechGroup，92800 Puteaux，法国)、以及AllplexTM2019-nCoV Assay(Seegene Inc，ArrowDiagnostics S.r.l.，意大利)。从临床样品中纯化病毒RNA后，根据世界卫生组织方案(Corman V.M.等人，Euro Surveill 25，2020)，通过实时聚合酶链反应获得RdRp、E和N病毒基因的检测。为了对于用纳索利单抗治疗合格，要求确认COVID-19的患者为成人(>18岁)，并且根据柏林标准患有ARDS(Ferguson ND等人Intensive Care 38(10):1573–1582，2012；还参见SweeneyR.M.和McAuley，D.F.，Lancet第388卷:2416-30，2016；JAMA 307:2526，2012)，并且要求根据机构指南通过持续气道正压通气(CPAP)的非侵入性机械通气，用于呼吸支持。虽然所有入选患者都凭经验每天接受一次500mg阿奇霉素，但患有需要抗菌治疗的活动性全身细菌或真菌感染的患者对于纳索利单抗治疗是不合格的。
纳索利单抗治疗、支持疗法和结果评价
如实施例20中所述，纳索利单抗(OMS646)是由免疫球蛋白γ4(IgG4)重链和λ轻链恒定区组成的全人单克隆抗体。它以亚纳摩尔亲和力结合并抑制MASP-2。根据实施例20中所述的方法，纳索利单抗每周两次以4mg/kg的剂量静脉内施用于6个由COVID-19感染的患者，共2至4周，最多6至8个剂量(共两周、三周或四周)。在研究启动时，给药持续时间设定为2周，但当用纳索利单抗治疗的第一个患者在第2周治疗停止后经历临床和实验室标记物复发时，根据经验增加给药持续时间，随后因另外一周的给药而消退。在研究时，所有患者都按照医院的指南接受了标准的支持护理，包括预防性依诺肝素(Clexane，Sanofi Aventis)4,000IU/04mL、阿奇霉素(Zitromax，Pfizer SpA，意大利)每天一次500mg、羟氯喹(Plaquenil，Sanofi Aventis)每天两次200mg、达芦那韦和考比司他(Rezolsta，Janssen-Cilag S.p.A.，意大利)每天一次800/150mg。从3月27日开始，按照最新机构指南，医院中的所有COVID-19患者都接受甲泼尼龙1mg/kg。相应地，在纳索利单抗治疗启动之后，6个纳索利单抗治疗的患者中的总共5个也接受了全身性皮质类固醇(甲泼尼龙1mg/kg)。所有呼吸支持都根据机构治疗算法提供。这6个患者的临床特点概括于下表13中。
除CEC计数和细胞因子水平之外，还按照标准临床实践，对所有纳索利单抗治疗的患者收集临床和实验室测量，包括血细胞计数、LDH和C反应蛋白(CRP)水平。在每个纳索利单抗剂量之前收集常规血液检查，然后每周两次。每天评估呼吸功能。在入院时对所有患者执行胸部计算机断层成像(CT)扫描，以记录典型的间质性肺炎，并且如果临床上指示，则记录肺栓塞。在治疗过程期间，按照临床要求执行胸部射线照相。
统计分析
人口统计和临床患者数据呈现为具有分类变量的百分比的频率、以及具有关于连续变量的范围的中值。正常患者和COVID-19患者之间的CEC值差异通过曼怀二氏U检验进行评价。在适当的时间点执行重复测量分析，以测试在纳索利单抗治疗期间，CEC和细胞因子水平的差异；使用非参数弗里德曼检验，并且使用成对的威尔科克森符号秩检验执行配对比较。在观察和时间之间，用非参数斯皮尔曼检验评估了在治疗期间LDH和CRP水平的下降趋势。显著性固定在5％下。使用R软件(版本3·6·2)来执行分析。
表13概括了6个纳索利单抗治疗的患者的临床特点。
表13：用纳索利单抗治疗的COVID-19患者的人口统计学
ARDS：急性呼吸窘迫综合征；ICU：重症监护病房；CPAP：持续气道正压通气。
*：仅对于4个患者可获得的数据
**：仅对于5个患者可获得的数据
#最初将几个患者分类为患有糖尿病，但后来被再分类为超重但未患有糖尿病。
##定义为体温>37.5℃
结果：
COVID-19患者中的血栓形成和内皮细胞损害
从3月13日到3月16日，在Bergamo地区令人注目的COVID-19暴发开始后不久，该医院的病理科开始对20个已故患者的初始组执行尸检。在其死亡之前，与当前研究中用纳索利单抗治疗的患者一样，所有患者都需要用CPAP或侵入性机械通气的晚期呼吸支持。与经常致命的肺血栓栓塞的临床现象一致，发现许多患者的肺和肝受到血栓形成事件的广泛影响，如下所述。
在组织病理学水平上，通过血栓形成过程的动脉牵涉在COVID-19患者肺的中隔血管中显而易见，还包括不受破坏性炎症过程影响的区域。CD41(内皮标记物)的免疫组织化学染色证实了严重的内皮损害，伴随细胞皱缩、变性的水溶细胞质以及在内皮表面上的淋巴细胞粘附，如图41A-D中所示。
图41A-D显示了取自COVID-19患者的组织切片的免疫组织化学分析的代表性图像，显示了这些患者中的血管损害。
图41A显示了来自COVID-19患者肺的中隔血管组织切片的免疫组织化学分析的代表性图像。如图41A中所示，在肺的中隔血管中存在通过血栓形成过程的动脉牵涉；注意到动脉腔中的血栓的初始组构(H&E，400x)。
图41B显示了来自COVID-19患者肺的中隔血管组织切片的免疫组织化学分析的代表性图像。如图41B中所示，如图41A中所示的类似的病理特征在不受破坏性炎症过程影响的肺区域中的大多数间隔血管中十分显著(H&E，400x)。
图41C显示了来自COVID-19患者的中等直径肺中隔血管的组织切片的免疫组织化学分析的代表性图像。如图41C中所示，具有完全管腔血栓形成的中等直径的肺中隔血管(圆圈部分)；CD34(内皮标记物)的免疫组织化学棕色染色证实了严重的内皮损害，伴随细胞皱缩、变性的水溶细胞质(参见在右侧上的箭头)、以及在内皮表面上的淋巴细胞粘附(参见在左侧上的箭头)。
图41D显示了来自COVID-19患者的肝实质组织切片的免疫组织化学分析的代表性图像。如图41D中所示，在肝实质中还观察到血管改变，具有大血管部分管腔血栓形成(H&E，400x)。
循环内皮细胞(CEC)的鉴定和计数
循环内皮细胞(CEC)已用作内皮细胞功能障碍的生物标记物(参见Farinacci M等人，Res Pract Thromb Haemost 3:49-58，2019)，并且已显示与没有ARDS的脓毒症患者相比，CEC计数在脓毒症有关的ARDS患者中是升高的(Moussa M等人，Intensive Care Med 41(2):231-8，2015)。结果也已在急性移植物抗宿主病(GvHD)的背景下发表，其中免疫介导的血管内皮细胞攻击导致其脱离血管壁并动员进入血流内(参见例如，Almici等人，BoneMarrow Transplant 52:1637-1642，2017)。
基于这些初步观察和发表的急性移植物抗宿主病(GvHD)中的发现，在用纳索利单抗的研究启动之前，我们开始在我们医院中随机选择的分子确认的COVID-19患者的非研究队列中测量CEC计数。在33个COVID-19患者的这个非研究队列中，我们发现外周血的CEC/mL(中值110，范围38-877)与健康对照(中值7，范围0-37)相比显著增加(P＝0.0004)，如图42A中所示。
在这项研究中，在用纳索利单抗治疗之前和之后的COVID-19患者中测量CEC/ml数目。如上文注意到的，有趣的是，确定当与健康的正常受试者(中值7，范围0-37)相比时，外周血的CEC/ml数目(中值110，范围38-877)在COVID-19患者的独立队列中显著增加(参见图42A)。在选择用于由纳索利单抗治疗的6个患者中，也确认了CEC/ml的数目增加(中值334，范围0-9315)。在用纳索利单抗治疗后，在前两个剂量后记录到CEC/ml数目的快速减少(中值92 CEC/mL，范围18-460)，并且在第四个剂量后得到确认(中值73，范围0-593)，如图42B中所示。进一步确认了，CEC/mL的数目在第六个纳索利单抗剂量后也是减少的(中值59，范围15-276)(数据未在图42B中显示)。
图42A以图形方式示出了，与并非这项研究的部分的COVID-19患者(n＝33)中的CEC/ml计数相比，在正常健康对照(n-6)中的CEC/ml计数。如图42A中所示，确定当与健康正常受试者相比时，CEC/ml的数目在这个独立的COVID-19患者队列显著增加。
图42B以图形方式示出了，在用纳索利单抗治疗之前(基线)和之后，对于这项研究选择的6个患者中的CEC/ml计数，方框代表了从第一四分位数到第三四分位数的值，水平线显示了中值，而须线指示了最小值和最大值。如图42B中所示，增加的CEC/ml在选择用于由纳索利单抗治疗的6个患者中也得到确认，其在用纳索利单抗治疗后快速减少。
因为我们的医院在这项研究启动后16天，制定了对于COVID-19患者实施标准类固醇使用的指导原则，所以在纳索利单抗启动之后2至10天开始，将类固醇治疗给予6个患者中的5个作为支持疗法的部分。为此，还在仅接受类固醇的四个患者(全部为女性，中值年龄83岁，其范围为62至90岁，三个需要通过面罩供氧，并且一个处于CPAP下)的分开组中评估了CEC/ml的数目。在这四个患者中，发现在48小时后评估的CEC计数不受类固醇施用的影响(p＝0·38)。在另外两个仅接受类固醇的患者中，在基线时以及在包括类固醇在内支持治疗4周后评估CEC计数。在其临床病程逐渐恶化的第一个患者中，CEC计数保持不受影响(271/mL相对于247/mL)，而在第二个患者中，临床改善伴随CEC的同时减少(165相对于65/mL)。
在6个纳索利单抗治疗的患者中，CEC/mL在基线时显著增加(中值334，范围0-9315)。使用纳索利单抗，在第二个(中值92 CEC/mL，范围18-460)、第四个(中值72·5，范围0-593)和第六个(中值59，范围15-276)治疗剂量后，CEC计数快速减少(p＝0·01)。使用纳索利单抗治疗，IL-6、IL-8、CRP和LDH的血清浓度也显著减少，如下文进一步所述。
C反应蛋白(CRP)、乳酸脱氢酶(LDH)和细胞因子的血清水平
图43以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，6个COVID-19患者的C反应蛋白(CRP)的血清水平(中值；四分位数间距(IQR))。如表13中所示，健康受试者的CRP血清水平在(0.0-1.0mg/dl)的范围内，并且在治疗起始之前的6个COVID-19患者的CRP中值水平为14mg/dl。如图43中所示，在用纳索利单抗治疗2周后，6个COVID-19患者的CRP水平降低至接近0.0mg/dl的中值水平，其在健康受试者的正常范围内。
图44以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，6个COVID-19患者的乳酸脱氢酶(LDH)的血清水平(中值；IQR)。如表13中所示，健康受试者的LDH血清水平在(120-246 U/l)的范围内，并且在治疗起始之前的6个COVID-19患者的LDH中值水平为518 U/l。如图44中所示，在用纳索利单抗治疗2周后，COVID-19患者的LDH水平降低至约200 U/l的中值水平，其在健康受试者的正常范围内。
图45以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，6个COVID-19患者的白细胞介素6(IL-6)的血清水平pg/mL(中值；四分位数间距(IQR))。如图45中所示，在治疗前的基线时，COVID-19患者的IL-6中值水平为约180pg/mL。在纳索利单抗的1个剂量后(剂量2前)，COVID-19患者的IL-6中值水平降低至约40pg/mL，并且在纳索利单抗的2个剂量后(剂量3前)，COVID-19患者的IL-6中值水平进一步降低至约10pg/mL。
图46以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，6个COVID-19患者的白细胞介素8(IL-8)的血清水平pg/mL(中值；四分位数间距(IQR))。在第1天、第4天、第7天、第11天和第14天时给予用纳索利单抗的治疗。如图46中所示，在治疗前的基线时，COVID-19患者的IL-8中值水平为约30pg/mL。在纳索利单抗的1个剂量后(剂量2前)，COVID-19患者的IL-8中值水平降低至约20pg/mL，并且在纳索利单抗的2个剂量后(剂量3前)，COVID-19患者的IL-8中值水平进一步降低至约15pg/mL。
在用纳索利单抗治疗后的临床结果
表13中概括了选择用于由纳索利单抗治疗的6个患者的临床特点。中值年龄为56.5岁，且大多数患者为男性(83％)。基于体重指数(BMI)≥25和≥30，所有患者都是超重或肥胖的。在入选时，所有患者都患有需要CPAP的肺炎/ARDS，其中两个患者快速恶化且在入选后不久需要插管。在距离用CPAP的非侵入性通气开始的48小时内，起始用纳索利单抗的治疗。在下表14中呈现了在用纳索利单抗治疗的这些患者中观察到的临床结果的概括，所述结果已更新以反映治疗后的患者状态。患者接受每周两次的纳索利单抗施用。在治疗之后，4个患者(67％)的呼吸窘迫得到改善，并且在3个纳索利单抗剂量的中值(范围2-3)后，他们将通气支持从CPAP减轻到高流量氧气。氧气支持然后在3个患者中减少并停止，直到出院。如通过造影增强CT扫描所证实的，患者#4在治疗起始后的第4天发展大块肺栓塞。为此，在进行中的纳索利单抗之上添加低分子量肝素，并且在7天后记录到临床和CT扫描图像的快速改善。在最后两个患者(#5和#6)中，在入选后不久，记录到重度ARDS的快速和进行性恶化。在病例#5中，重度ARDS(其PiO2/FiO2值为57)导致患者在第4天被插管。尽管如此，随后的临床结果是快速有利的，并且患者在3天后从ICU出院。在CPAP2天后，他目前在低流量氧气支持下是稳定的。在病例#6中，在入选4天后发展重度ARDS，并且患者需要插管。与先前的病例相似，她被放回CPAP中，并且由于快速临床改善，随后被放入高流量氧气中，且后来出院。
在这项研究中没有报告治疗有关不良事件。
表14：迄今为止的患者结果
*、**、***、****参见关于下文所述的患者3-6的更新。
讨论
这项研究中的发现指示了，内皮损伤和血栓形成对COVID-19有关的肺损伤的病理生理学是关键的。患有严重呼吸衰竭的患者不仅证实了CRP、LDH、IL-6和IL-8的水平显著升高，还证实了循环内皮细胞(CEC)的水平显著升高。这个新观察与在肺和肝中检测到的组织病理学发现一致，其显示了在COVID-19患者中明显的内皮损伤和血栓形成。多器官微血管的组织病理学变化，具体地微血管血栓的形成，与HSCT-TMA类似，进一步支持了内皮损伤在COVID-19有关的肺部损伤中的作用。内皮损伤已知是ARDS中存在的补体活化的病理生理学的关键组分(Thompson BT等人，NEnglJMed，377(6):562–572，2017)。补体活化还已在SARS和MERS的模型中得到报告，并且在特征在于内皮损伤的其它条件下是重要的。血管内皮损伤，ARDS中增加的毛细血管渗透性和肺水肿的根本原因，也可能引起微血管血管病和血栓形成。
补体系统是免疫系统的重要部分。三种途径响应不同的启动事件来活化补体：经典途径、凝集素途径和替代途径。补体的凝集素途径是先天性免疫应答的部分。模式识别系统，凝集素途径的活化通过MASP酶家族(MASP-1、MASP-2和MASP-3)的成员启动。这些蛋白酶作为酶原合成，所述酶原在血液中与凝集素，具体地甘露聚糖结合凝集素(MBL)、纤维胶凝蛋白和胶原凝集素形成复合物。这些凝集素识别并结合在病原微生物或受损宿主细胞的表面上发现的碳水化合物模式，将MASP靶向其作用位点并导致其活化。以这种方式，凝集素途径活化在损害的内皮细胞的表面上发生。如实施例20中所述，凝集素途径活化预计在COVID-19有关的内皮损伤的背景下发生。
MASP-2是负责凝集素途径活化的关键酶，一旦活化，MASP-2就切割补体组分2(C2)和C4，启动导致C3和C5活化的一系列酶促步骤，产生过敏毒素C3a和C5a，以及C5b-9(膜攻击复合物)的形成。临床前，C3a和C5a已诱导与内皮损伤和促炎变化、白细胞募集和内皮细胞凋亡相关的内皮活化。膜结合的C5b-9也可以引起细胞裂解。即使在亚裂解时，C5b-9也引起另外的细胞损伤，其诱导促血栓因子的分泌、血小板活化、粘附分子的上调和内皮中的功能失调的形态变化(Kerr H，Richards A.Immunobiology 217(2):195–203，2012)。这些补体介导的活性可以扩大内皮损伤和功能障碍，引起或恶化临床状况。通过Gao等人medRxiv2020的最新出版物，报告了MASP-2和凝集素途径在动物模型中SARS和MERS的病理生理学中的核心牵涉。然而，关于Gao等人中所述的LPS诱导的肺损伤的小鼠模型(其并非ARDS模型，而是脓毒症模型)，首先用Ad-SARS N感染小鼠，然后在第6天时，用200μg/kg抗MASP-2抗体注射，并且在30分钟后，用LPS诱导且测量小鼠存活。进一步注意到，在Gao等人中描述的这种动物模型中使用的抗MASP-2抗体(200 ug/kg)(即，HyCult Biotech(HBT)抗MASP-2抗体克隆8B5或克隆6G12)就C3b抑制活性进行测定，并且确定mAb 8B5和6G12均不能抑制正常人血清或小鼠血清中的C3b沉积，而在同一测定中，阳性对照抗体OMS646能够抑制正常人血清和小鼠血清中的C3b沉积)。
MASP-2，负责凝集素途径活化的关键酶，结合并经历通过COVID-19 N蛋白的活化(Gao等人，medRxiv 2020，2020.03.29.20041962)，并且已在严重COVID-19患者的肺组织的微血管系统中发现(Magro C.等人，Transl Res 2020；doi.org/10.1016/j.trsl.2020.04.007)。活化的MASP-2启动一系列酶促步骤，其导致过敏毒素C3a和C5a的产生、以及膜攻击复合物C5b-9的形成(Dobo等人，FrontImmunol9:1851，2018)，其可以诱导促炎应答并导致细胞裂解和死亡。MASP-2还可以通过C4旁路直接切割C3(Yaseen S.等人，FASEBJ31(5):2210-9，2017)。重要的是，MASP-2位于凝集素途径的上游，因此MASP-2的抑制并不干扰经典途径的裂解组(即C1r/C1s驱动的C3和C5转化酶形成)，保存了对抗感染所需的适应性免疫应答(Schwaeble等人，ProcNatlAcadSci 108(18):7523-8，2011)。
除其在补体中的作用之外，MASP-2还直接作用于凝血级联和接触系统，将凝血酶原切割为凝血酶并形成纤维蛋白凝块(Gulla K.C.，Immunology 129(4):482-95，2010；Krarup A.等人，PLoS One 2(7):e623，2007)。如在此引入本文作为参考的WO2019246367中所述，纳索利单抗不仅抑制凝集素途径活化，还阻断微血管损伤相关的血栓形成、以及MASP-2介导的激肽释放酶和因子XII的活化。这些活性可以通过抑制微血管血栓形成而促成有益效应，所述有益效应可能已在纳索利单抗治疗的患者(特别是患有大块肺栓塞的患者)中发挥重要的治疗作用。纳索利单抗并不延长出血时间，它也不影响凝血酶原或活化部分凝血活酶时间，并且在纳索利单抗治疗的患者中并未观察到出血。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但认为纳索利单抗可能阻断起因于内皮损害的(与因子XII活化相关的)凝血，但不阻断细胞外基质有关的(因子VII驱动的)凝血。
凝集素途径抑制先前并未作为用于COVID-19的治疗进行调查。这项研究中的所有患者都患有COVID-19相关的呼吸衰竭。在当前的研究中，通过纳索利单抗抑制MASP-2和凝集素途径，与所有用该药物治疗的COVID-19患者的临床改善和存活相关。在用MASP-2抑制剂纳索利单抗治疗之后，所有6个患者都恢复并且能够出院。在用纳索利单抗治疗之后，在患有COVID-19有关的呼吸衰竭的患者中观察到临床改善，所述纳索利单抗抑制MASP-2和凝集素途径的活化，进一步支持了凝集素途径在COVID-19病理生理学中的重要作用。如本实施例中所述，所有6个COVID-19患者在纳索利单抗治疗之后都证实了临床改善。在每种情况下，COVID-19肺损伤在纳索利单抗治疗之前已进展为ARDS，并且所有患者都接受非侵入性机械通气，各自在入院时启动。在第一个纳索利单抗剂量之后，两个患者经历了持续恶化，并且需要侵入性机械通气。随后，这两个患者用继续的纳索利单抗治疗后能够完全中止机械通气。两个患者(一个插管，且另一个处于CPAP下)经历了大块双侧肺栓塞，并且两个患者用纳索利单抗完全恢复，这可能获益于该药物的抗凝效应。实验室标记物(CEC、IL-6、IL-8、CRP和LDH)的时间模式与观察到的临床改善、以及提议的纳索利单抗的作用机制一致。特别地，CEC计数似乎是评估该疾病中的内皮损害和治疗应答的可靠工具。值得注意的是，IL-6水平和IL-8水平的改善也在时间上与纳索单抗治疗相关联，提示了凝集素途径活化可能先于COVID-19中的细胞因子风暴升高，并且凝集素途径抑制对COVID-19感染的患者中所述的细胞因子风暴具有潜在的有益作用。(Xiong Y等人，EmergMicrobes Infect 9(1):761–770，2020)。最初计划两周的纳索利单抗给药，但当给药第一次中止时，患者#1的CEC升高之后，给药增加到3至4周。在纳索利单抗治疗的3至4周之后，并未观察到反弹的肺部体征和症状。我们没有看到在纳索利单抗治疗的患者中病毒防御受损的证据，也没有观察到纳索利单抗有关的不良事件。值得注意的是，纳索利单抗并不抑制替代或经典补体途径，并且不干扰适应性免疫应答或抗原-抗体复合化。在临床试验中没有观察到纳索利单抗有关的感染风险的证据。除抑制凝集素途径活化之外，纳索利单抗还已证实阻断MASP-2介导的凝血酶原切割为凝血酶(Krarup A等人，PLoS One；2(7):e623，2007)、激肽释放酶的活化、以及因子XII自活化为XIIa。这些活性可以通过抑制微血管血栓形成而促成有益效应。纳索利单抗并不延长出血时间，它也不影响凝血酶原或活化部分凝血活酶时间。(Krarup PLoS One2007)
在本实施例中描述的结果强烈暗示了在COVID-19有关的肺损伤的病理生理学中，由内皮损伤引起的MASP-2介导的凝集素途径活化。在纳索利单抗治疗之后的临床状态和实验室发现的改善是值得注意的。这些发现强烈提示了有意义的临床功效，具有与该药物的作用机制和疾病的病理生理学有关的支持证据。通过纳索利单抗的凝集素途径抑制似乎是COVID-19有关的肺损伤的有希望的潜在治疗。
来自本实施例中描述的临床研究的补充数据
如本实施例中所述，6个实验室确认的COVID-19和ARDS(根据柏林标准)的患者用纳索利单抗(4mg/kg静脉内(IV))每周治疗两次，共3到4周。所有患者都接受了标准的支持护理，包括预防性依诺肝素(Clexane，Sanofi Aventis)4,000IU/0.4mL、阿奇霉素(Zitromax，Pfizer SpA，意大利)每天一次500mg、羟氯喹(Plaquenil，Sanofi Aventis)每天两次200mg、以及达芦那韦和考比司他(Rezolsta，Janssen-Cilag S.p.A.，意大利)每天一次800/150mg。从3月27日开始，按照最新机构指南，医院中的所有Covid-19患者都接受甲泼尼龙(1mg/kg)，其施用于6个纳索利单抗治疗的患者中的5个。
对未用纳索利单抗治疗的已故COVID-19患者执行组织病理学评估。按照标准实践，对纳索利单抗治疗的患者和未用纳索利单抗治疗的患者收集临床和实验室测量，包括血细胞计数、LDH和CRP水平。在每个纳索利单抗剂量之前收集常规血液检查，然后每周两次。通过流式细胞术连续评价循环内皮细胞计数以及IL-6和IL-8水平。每天评估呼吸功能。所有患者在入院时都接受胸部计算机断层扫描(CT)，以记录间质性肺炎，如果临床上指示了，则在住院期间记录肺栓塞。还如临床上指示的执行胸部射线照相。
数据呈现为具有分类变量的百分比的频率、以及具有关于连续变量的范围的中值。用非参数弗里德曼检验，评估了时间点之间的临床和实验室测量的差异。使用成对的威尔科克森符号秩检验执行配对比较。显著性固定在5％下。使用R软件(版本3·6·2)来执行分析。
如本实施例中所述，对20个已故COVID-19患者的初始组执行尸检。与经常致命的肺血栓栓塞的临床现象一致，发现大多数患者的肺和肝受到栓塞的广泛影响。在组织学上，动脉栓塞在肺的中隔血管中显而易见，包括不受破坏性炎症过程影响的区域。CD34(内皮标记物)的免疫组织化学染色证实了严重的内皮损害，伴随细胞皱缩、变性的水溶细胞质和淋巴细胞粘附至内皮表面，如图41A-D中所示。
如本实施例所述，通过纳索利单抗抑制补体的凝集素途径与这项研究中的临床改善相关。用纳索利单抗的治疗与快速且持续的CEC降低相关，与血清IL-6、IL-8、CRP和LDH的伴随降低平行。特别地，CEC计数似乎是评估该疾病中的内皮损害和治疗应答的可靠工具。IL-6和IL-8用纳索利单抗治疗的暂时改善提示了，对Covid-19感染的患者中所述的细胞因子风暴的潜在有益作用((Xiong Y等人，Emerg Microbes Infect 9(1):761–770，2020)。这项研究的发现指示了内皮损伤对COVID-19有关的肺损伤的病理生理学是关键的。患有严重呼吸衰竭的患者不仅证实了C反应蛋白(CRP)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平显著升高，还证实了IL-6、IL-8和循环内皮细胞(CEC)的水平显著升高。这个新观察与在肺和肝中的组织病理学发现一致，其显示了在COVID-19患者中明显的内皮损伤和血栓形成。微血管的组织病理学变化与内皮损伤综合征HSCT-TMA非常相似，进一步支持了内皮损伤在COVID-19有关的肺部损伤中的作用。
最初计划两周的给药，但当给药第一次中止时，患者#1的CEC升高之后，给药增加到3-4周。使用第三周的给药，该患者的CEC计数再次改善。在纳索利单抗治疗的4周之后，并未观察到反弹的肺部体征和症状。我们没有看到在纳索利单抗治疗的患者中病毒防御受损的证据。值得注意的是，纳索利单抗并不抑制经典或替代补体途径，并且不干扰适应性免疫应答或抗原-抗体复合化。在临床试验中没有观察到纳索利单抗有关的感染风险的证据。除抑制凝集素途径活化之外，纳索利单抗还已显示阻断MASP-2介导的凝血酶原切割为凝血酶、激肽释放酶的活化、以及因子XII自活化为XIIa。这些活性可以通过抑制微血管血栓形成而促成有益效应，并且这可能已发挥重要的治疗作用，特别是在患有大块肺栓塞的那些患者中。纳索利单抗并不延长出血时间，它也不影响凝血酶原或活化部分凝血活酶时间，并且在我们治疗的患者中没有观察到出血。
我们的发现强烈暗示了在Covid-19有关的肺损伤的病理生理学中，由内皮损伤引起的凝集素途径活化。通过纳索利单抗抑制补体的凝集素途径与这项研究中的所有患者的临床改善相关。纳索利单抗是良好耐受的，并且没有报告不良的药物反应。所有患者在治疗过程中都得到改善并存活。在纳索利单抗治疗之后的临床状态和实验室发现的改善是值得注意的。这些发现强烈提示了有意义的临床功效，具有与该药物的作用机制和疾病的病理生理学有关的支持证据。通过纳索利单抗的凝集素途径抑制似乎是Covid-19有关的肺损伤的有希望的潜在治疗。
从本实施例中描述的临床研究中提供了另外的数据。
表13中概括了6个纳索利单抗治疗的患者的临床特点。纳索利单抗4mg/kg每周静脉内施用两次，共3至4周。在治疗之后，所有患者在临床上得到改善。
在4个患者中，由于CT扫描记录的肺栓塞(患者#4和#6)、医疗决策(患者#3)和需要插管的呼吸功能快速恶化(患者#5)，依诺肝素以治疗剂量(100IU/kg，每天两次)给予。中值随访为27天(16-90)，并且患者每周施用纳索利单抗两次，具有总共8个纳索利单抗剂量的中值(范围为5-8)。在治疗之后，所有患者都在临床上得到改善。在3个纳索利单抗剂量的中值(范围2-3)后，四个患者(67％)将通气支持从CPAP减轻到高流量氧气(非循环呼吸器或文丘里氧气面罩)。
图50以图形方式示出了，用纳索利单抗治疗的6个COVID-19患者的临床结果。
如图50中所示，在这些患者的3个中，氧气支持先撤除然后停止，并且他们在6(5-8)个纳索利单抗总剂量的中值之后出院。
在患者#4中，在入选之后4天，通过造影增强CT扫描记录到大块双侧肺栓塞。将依诺肝素加入正在进行的纳索利单抗给药中，并且在11天后，记录到快速的临床和射线照相(重复CT扫描)改善(图47A和图47B)，并随后出院。
在剩下的2个患者(#5和#6)中，在入选后不久记录到快速且逐渐恶化为重度ARDS。
在患者#5中，重度ARDS(PaO2/FiO2为55)导致在第4天的插管。尽管如此，随后的临床结果是快速有利的，并且患者在3天后从重症监护病房出院。在CPAP 2天之后，他在低流量氧气支持下得到稳定。随后，他不需要氧气并且出院。
患者#6在入选时具有PaO2/FiO260和重度ARDS，并且2天后需要插管。她的病程通过大块双侧肺栓塞和医院甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)感染复杂化。她的状况得到改善，并且在18天后，她拔管，切开气管(由于幽闭恐惧症)并且得到低流量氧气的支持。她的状况得到改善，去除了氧气支持，且在第90天，她出院了。(第33天到第90天未在图50中显示)
在这项研究中没有报告治疗有关的不良事件。
如上所述，在患者#4中，在入选之后4天，通过造影增强CT扫描记录到大块双侧肺栓塞。将依诺肝素加入正在进行的纳索利单抗给药中，并且在11天后，记录到快速的临床和射线照相(重复CT扫描)改善，如图47A,B中所示。
图47A和图47B是来自用纳索利单抗治疗的患有COVID-19肺炎的患者#4的肺获得的CT扫描的图像。
图47A显示了自入选以后(即，在用纳索利单抗治疗后)的第5天时，患者#4的CT扫描，其中观察到患者患有严重的间质性肺炎，具有涉及周围和中央区域两者的弥漫性磨玻璃影。尤其是在左肺的下叶中的实变。大块双侧肺栓塞，伴随在叶间和节段动脉中的充盈缺损(未显示)。
图47B显示了自入选以后(即，在用纳索利单抗治疗后)的第16天时，患者#4的CT扫描，其中磨玻璃影显著降低，伴随实质实变的几乎完全消退。尤其是在下叶中观察到具有外围分布的“碎石路”征。明显的纵隔气肿。右肺的亚节段动脉的最低限度的充盈缺损(未显示)。
图48以图形方式示出了，在用纳索利单抗治疗的患者中，在基线时以及在纳索利单抗治疗后的不同时间点(在2个剂量后，在4个剂量后)，IL-6的血清水平(pg/mL)。方框代表了从第一四分位数到第三四分位数的值，水平线显示了中值，而点显示了所有患者的值。图48提供了图45中呈现的IL-6数据的更新。
图49以图形方式示出了，在用纳索利单抗治疗的患者中，在基线时以及在纳索利单抗治疗后的不同时间点(在2个剂量后，在4个剂量后)，IL-8的血清水平(pg/mL)。方框代表了从第一四分位数到第三四分位数的值，水平线显示了中值，而点显示了所有患者的值。图49提供了图46中呈现的IL-8数据的更新。
图50以图形方式示出了，用纳索利单抗治疗的6个COVID-19患者的临床结果。条颜色指示了不同的氧气支持(CPAP：黄色；带插管的机械通气：红色；非循环呼吸器式氧气面罩：绿色；通过鼻插管的低流量氧气：浅绿色；室内空气：蓝色)。纳索利单抗剂量由蓝色箭头标记。黑色圆圈指示类固醇治疗的开始。菱形符号指示TEP。星号(*)指示出院。CPAP＝持续气道正压通气。NRM＝非循环呼吸器式氧气面罩。VM＝文丘里面罩。TEP＝肺血栓栓塞。
图51A以图形方式示出了，在纳索利单抗治疗之前和之后的天冬氨酸氨基转移酶(AST)的血清水平(单位/升，U/L)。黑线代表了中值和四分位数间距(IQR)。红线代表了正常水平，而点显示了所有患者的值。
图51B以图形方式示出了，在用纳索利单抗治疗起始之前其基线值可用的四个患者中，D-二聚体值的血清水平(ng/ml)。黑色圆圈指示了何时启动类固醇治疗。红线代表了正常水平。
总之，在这项研究中，首次使用凝集素途径抑制剂来治疗COVID-19，具有需要持续气道正压通气(CPAP)或插管的ARDS的6个COVID-19患者接受了纳索利单抗。患者的中值年龄为57岁(范围47-63岁)，83％为男子，并且全部都患有共病(comorbidity)。在基线时，循环内皮细胞(CEC)计数以及白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、C反应蛋白(CRP)、乳酸脱氢酶(LDH)、D-二聚体和天冬氨酸氨基转移酶(AST)-内皮/细胞损害和/或炎症的所有标记物–的血清水平显著升高。在机械通气启动后的48小时内开始纳索利单抗治疗。给药为每周两次，共两到四周。
研究结果
●所有纳索利单抗治疗的患者都完全恢复，存活并且出院
●纳索利单抗治疗与跨越所有评价的内皮/细胞损害和/或炎症标记物-CEC、IL-6、IL-8、CRP LDH、D-二聚体和AST-的快速且持续的降低/正常化相关
o实验室标记物的时间模式与观察到的临床改善一致
o特别地，CEC计数似乎是评估该疾病中的内皮损害和治疗应答的可靠工具
o IL-6和IL-8用纳索利单抗治疗的暂时改善提示了，凝集素途径活化可能先于COVID-19中的细胞因子升高，并且凝集素途径抑制对COVID-19感染患者中所述的细胞因子风暴具有有益作用
●两个患者的病程(一个插管，且另一个处于CPAP下)通过大块双侧肺栓塞而进一步复杂化，并且两个患者使用纳索利单抗完全恢复，这可能获益于该药物的抗凝效应
●纳索利单抗在研究中是良好耐受的，并且没有报告不良的药物反应
●具有相似入围标准和基线特点的两个对照组用于回顾性比较，两者均显示了32％和53％的大量死亡率。
结论
如本实施例中证实的，用纳索利单抗抑制补体的凝集素途径可能代表了通过降低Covid-19有关的内皮细胞损伤，并且因此降低炎症状态和血栓形成风险，对于Covid-19患者的有效治疗。凝集素途径抑制先前并未作为用于COVID-19的治疗进行调查。这项研究中的所有患者都患有COVID-19有关的呼吸衰竭。在用MASP-2抑制剂纳索利单抗治疗之后，所有患者都恢复并且能够出院，进一步支持了凝集素途径在COVID-19病理生理学中的重要性。
其它补体抑制剂在COVID-19中的使用已得到报告。ACOM-101，基于坎普他汀的C3抑制剂(Mastaglio S.等人，Clin Immunol 215:108450，2020)用于一个患者中，并且依库珠单抗连同抗病毒和抗凝治疗一起施用于四个患者(Diurno F.等人，EurRevMedPharmacol Sci 24(7):4040-7，2020。这五个患者处于CPAP下并存活。两个处于高流量鼻氧气下的COVID-19患者接受了与支持疗法结合的C5a抗体，包括抗病毒疗法，随后为类固醇治疗，并且这两个患者也存活。这些报告共同支持了我们对于纳索利单抗的发现。然而，与C3和C5抑制剂不同，MASP-2抗体纳索利单抗完全维持了经典补体途径功能，并且不干扰适应性免疫应答或抗原-抗体复合物介导的裂解应答(Schwaeble W.等人，ProcNatlAcadSci 108(18):7523-8，2011)。在纳索利单抗临床试验中，并未观察到纳索利单抗有关的感染风险的证据。
虽然这是同情使用的单组研究，但两个不同的对照组提供了回顾性比较。第一个在通过Gritti等人最近发表的论文(medRxiv 2020:2020.04.01.20048561)中进行描述，该论文评估了IL-6抑制剂司妥昔单抗在COVID-19患者中的使用。司妥昔单抗研究和我们的纳索利单抗研究共享相同的主要研究者(G.G.和A.R.)，入围标准和患者特点(即，人口统计学、症状、共病、ARDS严重性、实验室值和在入选时的呼吸支持)。在该研究中，司妥昔单抗治疗的组和对照组中的死亡率分别为33％和53％。第二个回顾性比较者由33个患者代表，所述患者是在我们的医院内随机选择的，以评价COVID-19患者中CEC测量的可行性。在这33个患者中，22个符合与纳索利单抗治疗的患者相同的入围标准，并且具有相似的基线特点。然而，与纳索利单抗治疗的组相比，对照组的中值基线CEC计数分别为101/mL相对于334/mL。引人关注的是，这22个患者中的20个(91％)用IL-6抑制剂(托珠单抗或司妥昔单抗)和/或类固醇进行治疗，并且该组具有32％的总体30天死亡率。当结果分析限于与纳索利单抗治疗的患者年龄相匹配的16个患者(中值58岁，范围51-65岁)时，死亡率仍为31％。在后一组中，94％接受了IL-6和/或类固醇治疗，并且以55/mL的中值基线CEC计数是纳索利单抗治疗的患者中的6分之一。
在COVID-19中使用类固醇已导致混合结果的报告(Veronese N.等人，Front Med(Lausanne)7:170，2020)。最近以来，COVID-19疗法(RECOVERY)试验的随机化评估证实了，地塞米松使处于侵入性机械通气下的患者的28天死亡率降低了28.7％(29.0％相对于用常规护理的40.7％)、在接受无需非侵入性机械通气的氧气支持的患者中降低了14％(21.5％相对于用常规护理的25.0％)，并且对在随机化时未接受呼吸支持的患者中的死亡率没有作用(17.0％相对于用常规护理的13.2％)(Horby P.等人，medRxiv 2020:2020.06.22.20137273)。基于这些数据和我们医院的经验，我们认为类固醇在治疗具有呼吸功能障碍的COVID-19患者中发挥一定作用，作用于减轻炎症应答。在纳索利单抗治疗的组中，6个患者中的1个(患者#1)并未接受类固醇。随后，在三月下旬，机构指南进行更新，要求我们医院中的所有患者都接受类固醇。在接受类固醇的5个纳索利单抗治疗的患者中，2个(患者#2和#3)在已经改善后启动治疗，使得不再需要CPAP或在第二天中止。如先前所述，我们评估了仅对于短持续时间接受类固醇的四个患者的分开组中的CEC计数，并且发现该计数不受类固醇施用的影响。这提示了类固醇对COVID-19相关的内皮损害的任何有益作用都可能延迟，并且对患者#2和#3的恢复过程具有很小的作用。
总的来说，我们的发现强烈提示了，内皮损伤诱导的MASP-2活化和凝集素途径在COVID-19有关的肺损伤的病理生理学中发挥关键作用。在纳索利单抗治疗之后的临床状态和实验室发现中的改善是值得注意的。这些发现强烈提示了有意义的临床功效，并且提供了与该药物的作用机制和疾病的病理生理学有关的支持证据。通过纳索利单抗的凝集素途径抑制似乎是COVID-19有关的肺损伤和内皮损害相关的栓塞的有希望治疗。
来自本实施例中描述的临床研究的进一步补充数据
如本实施例中所述，6个实验室确认的COVID-19和ARDS(按照柏林标准)的患者用纳索利单抗(4mg/kg静脉内(IV))每周治疗两次，持续3到4周。如本实施例中所述，这项研究中的所有6个患者都患有COVID-19有关的呼吸衰竭。在用MASP-2抑制剂纳索利单抗治疗之后，所有患者都恢复并且能够出院。这些患者自出院以后已进行监测。截至2020年10月22日(在用纳索利单抗治疗之后5至6个月)，所有6个患者都是临床上正常的，而没有在未用纳索利单抗治疗的COVID-19患者已报告的任何长期后遗症的证据。截至2020年10月22日，所有6个患者的临床实验室测量也是正常的，包括D-二聚体的血清水平都发现在正常范围内(参见下表15)。
表15显示了与在2020年10月(5至6个月后)获得的实验室测量相比，在用纳索利单抗治疗之前，在入院(基线)时从6个COVID-19患者获得的基线实验室测量。
表15概括了在基线时(在治疗之前，还参见表13)以及如2020年10月(治疗后5至6个月)测量的6个纳索利单抗治疗的患者的临床特点。
表15：用纳索利单抗治疗的COVID-19患者(#1-6)的实验室测量
这些结果证实了，在这6个患者中用纳索利单抗治疗COVID-19患者已导致这些患者中的完全恢复，而没有任何长期COVID后遗症的证据。
如广泛报告的，许多COVID-19患者，包括具有轻度症状的患者、以及具有严重COVID-19有关的肺损伤(如ARDS和/或栓塞)的患者，患有来自COVID-19感染的立即并发症，以及即使从最初的感染恢复后的长期后遗症，也称为“长途运输者”。如Marshall M.(“Thelasting misery of coronavirus long-haulers,”Nature第585卷，9/17/2020，第339-341页)中所述，患有更严重的COVID-19感染的人可能经历在其肺、心脏、免疫系统、大脑、中枢神经系统、肾脏、肠道及其它地方的长期损害，并且即使COVID-19感染的轻微病例也可能引起类似于慢性疲劳综合征的持续不适。如Marshall(2020)中进一步所述，来自COVID-19感染引起的立即和长期后遗症包括心血管并发症(包括心肌损伤、心肌病、心肌炎、血管内凝血、中风、静脉和动脉并发症以及肺栓塞)；神经系统并发症(包括认知困难、意识模糊、也称为“脑雾”的记忆丧失、头痛、中风、头晕、晕厥、癫痫发作、食欲减退、失眠、嗅觉丧失、味觉丧失、肌阵挛、神经性疼痛、肌痛；神经系统疾病如阿尔茨海默氏病、格巴二氏综合征、米勒-费希尔综合征、帕金森氏病)的进展；肾脏损伤(例如急性肾脏损伤(AKI))、肺部并发症(包括肺纤维化、呼吸困难、肺栓塞)；炎性病况例如川崎病、川崎样病、儿童的多系统炎症综合征；以及多系统器官衰竭。还参见Troyer A.等人，Brain，Behavior and Immunity 87:43-39，2020；Babapoor-Farrokhram S.等人，Life Sciences253:117723，2020；以及Heneka M.等人，Alzheimer’s Research&Therapy，第12卷:69，2020。如Yelin D.等人，Lancet InfectDis 2020，9/1/2020中进一步所述，从急性COVID-19中恢复的人的长期抱怨包括：极度疲劳、肌无力、低烧、注意力不集中、记忆差错、情绪变化、睡眠困难、手臂和腿部中的针痛、腹泻和呕吐、味觉和嗅觉丧失、喉咙痛和吞咽困难、糖尿病和高血压的新发作、皮疹、呼吸短促、胸痛和心悸。
如本实施例中所述，在这6个患者中用纳索利单抗治疗COVID-19患者已导致这些患者的完全恢复，而没有来自COVID-19感染的任何长期后遗症的证据。
实施例22
在COVID-19患者#7中的OMS646(纳索利单抗)治疗
本实施例描述了使用实施例20和实施例21中描述的方法，在第七个COVID-19患者(患者#7)中使用纳索利单抗(OMS646)。本实施例中描述的结果与实施例21中用6个COVID-19患者观察到的结果一致，并且进一步确认了纳索利单抗在受COVID-19感染的患者治疗中的功效。
方法和结果：
患者#7是受SARS-CoV-2感染的76岁肥胖的糖尿病男子，具有很长的吸烟史和COPD，其也已经历了用于前列腺癌的手术(即，分类为关于COVID-19有关并发症的“高危”患者)。患者进入Bergamo医院，最初需要通过鼻插管的供氧。他的呼吸状态迅速恶化，首先需要通过面罩的氧合，随后为具有持续气道正压通气的机械通气，然后是插管。在插管后，启动用纳索利单抗(OMS646)的治疗，所述纳索利单抗(OMS646)是由免疫球蛋白γ4(IgG4)重链和λ轻链恒定区组成的全人单克隆抗体。纳索利单抗以亚纳摩尔亲和力结合并抑制MASP-2。根据实施例20和实施例21中所述的方法，用纳索利单抗治疗患者#7以每周静脉内施用两次的4mg/kg剂量进行，共2至4周，最多6至8个剂量(即，给药持续时间为两周、三周或四周)。迄今为止，患者#7已接受了4个纳索利单抗剂量。在用纳索利单抗治疗后，患者#7快速改善，并且他在第二个剂量后拔管。他的实验室发现显示于下文描述的图52A-E中，其给药通过每个图上的垂直箭头指出。
图52A以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，患有COVID-19的危重病患者#7中的D-二聚体值的血清水平(ng/mL)。用纳索利单抗的给药通过垂直箭头指示。红色水平线代表正常水平。
图52B以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，患有COVID-19的危重病患者#7的C反应蛋白(CRP)的血清水平。用纳索利单抗的给药通过垂直箭头指示。红色水平线代表正常水平。
图52C以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在纳索利单抗治疗后的不同时间点，患有COVID-19的危重病患者#7的天冬氨酸氨基转移酶(AST)的血清水平(单位/升，U/L)。用纳索利单抗的给药通过垂直箭头指示。红色水平线代表正常水平。
图52D以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在纳索利单抗治疗后的不同时间点，患有COVID-19的危重病患者#7的丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清水平(单位/升，U/L)。用纳索利单抗的给药通过垂直箭头指示。红色水平线代表正常水平。
图52E以图形方式示出了，在治疗之前的基线时(第0天)、以及在用纳索利单抗治疗后的不同时间点，患有严重COVID-19的患者#7的乳酸脱氢酶(LDH)的血清水平。用纳索利单抗的给药通过垂直箭头指示。红色水平线代表正常水平。
结果概括：
如图52A至52E中所示，在入院时以及在用纳索利单抗治疗之前，患者#7具有D-二聚体(被认为是COVID-19中的可凝性的主要标记物)的高血清水平、C反应蛋白(炎症标记物)的高血清水平、天冬氨酸氨基转移酶(COVID-19中的危重病的酶标记物)的高血清水平、丙氨酸氨基转移酶(肝功能标记物)的高血清水平、以及乳酸脱氢酶(细胞死亡的标记物)的高血清水平。如图52A至52E中进一步所示，患者#7在第一个纳索利单抗剂量之后得到改善，其中所有上述实验室测量在第四个剂量后都降至接近正常水平或降至正常水平。他在第二个纳索利单抗剂量之后拔管。在用纳索利单抗治疗之后，ICU工作人员对他的快速改善感到惊讶。如实施例21中所述，在本实施例中报告的患者#7的快速改善与在用纳索利单抗治疗后COVID-19患者#1-6的恢复是一致的。
从本实施例中描述的临床研究中提供了另外的数据：
如本实施例中所述，患者#7在第一个纳索利单抗剂量后得到改善，他在第二个剂量后拔管，并且所有上述实验室测量在第四个剂量后都降至接近正常水平或降至正常水平。作为更新，患者#7接受了总共6个纳索利单抗剂量并且出院。如图53中所示，随着时间过去来自患者#7的血清学数据指示了，在用纳索利单抗治疗期间生成了适当地高滴度的抗SARS-CoV-2抗体，指示了纳索利单抗并不阻碍适应性免疫应答的效应子功能。
除本文所述的患者#1-7之外，根据实施例20和实施例21中所述的方法，在同情使用下，已用纳索利单抗以每周静脉内施用两次的4mg/kg剂量治疗了众多的另外患有ARDS的COVID-19患者(总共n＝19)，共2周至4周或5周，最多4至10个剂量(共两周、三周、四周或五周)。本实施例中所述的所有另外患者在治疗之前都患有COVID-19相关的ARDS的严重病，全部都被插管，其中大多数在插管后数天启动纳索利单抗，并且全部在启动纳索利单抗之前其它疗法已失败。在大多数用纳索利单抗治疗的患者中观察到了惊人的积极结果，类似于对于本文所述的患者#1-7观察到的结果。大多数用纳索利单抗治疗的COVID-19患者显示了在临床症状和实验室值方面的快速且明显的改善，并且随后出院。重要的是，关于其随访数据(在纳索利单抗治疗停止后5-6个月)可获得的纳索利单抗治疗的COVID-19患者，并未显示观察到的长期后遗症的临床或实验室证据。还观察到，用纳索利单抗治疗的存活的COVID-19患者发展适当地高抗SARS-CoV-2抗体，如上文对于患者#7所述。这些结果证实了，用纳索利单抗(其特异性抑制凝集素途径，并且使补体的替代途径和经典途径保持完全功能性)的治疗，保存了适应性免疫应答的抗感染效应子功能，并且维持了抗原-抗体复合物介导的裂解应答，其在杀死受病毒感染的细胞中起重要作用。
下文提供了在意大利Bergamo用纳索利单抗治疗的危重病COV-19-19患者#8-15、以及在美国用纳索利单抗治疗的患者#1-4的治疗过程的简要描述：
患者#8(Bergamo，意大利)
患者#8是76岁的肥胖男子，患有充血性心力衰竭、高血压、血脂异常和严重COVID-19。他在插管后3天启动纳索利单抗治疗，并且在第3个剂量之后，死于先前存在的心肌病并发症。在1至2个纳索利单抗剂量后，他的D-二聚体和LDH水平得到改善。血清学数据指示了他并未发展高滴度的抗SARS-CoV-2抗体。
患者#9(Bergamo，意大利)
患者#9是患有严重COVID-19的41岁的超重男子。他在插管后2天开始纳索利单抗治疗，且在第3个剂量后拔管。他接受了总共6个剂量，并且出院。在1至2个纳索利单抗剂量后，他的D-二聚体和LDH水平得到改善。血清学数据指示了，他在用纳索利单抗治疗过程期间发展适当地高滴度的抗SARS-CoV-2抗体。
患者#10(Bergamo，意大利)
患者#10是患有严重COVID-19的65岁的超重男子。他在插管后3天开始纳索利单抗治疗，且在第4个剂量后拔管。他接受了总共8个纳索利单抗剂量，并且出院。在1至2个纳索利单抗剂量后，他的D-二聚体和LDH水平得到改善。血清学数据指示了，他在用纳索利单抗治疗过程期间发展适当地高滴度的抗SARS-CoV-2抗体。
患者#11(Bergamo，意大利)
患者#11是68岁的超重男子，患有高血压、血脂异常和严重COVID-19。他在插管后13天开始纳索利单抗治疗。他接受了总共7个剂量，并且死于多器官衰竭。血清学数据指示了他并未发展高滴度的抗SARS-CoV-2抗体。
患者#12(Bergamo，意大利)
患者#12是62岁的超重男子，患有糖尿病、高血压、血脂异常和严重COVID-19。他在插管后2天开始纳索利单抗治疗，并且在5个剂量后拔管。他接受了总共6个纳索利单抗剂量，然后发展医院感染，需要再次插管和气管造口术，其在9天后去除。他从医院出院时被送往处于低流量氧气下的康复设施。血清学数据指示了，他在用纳索利单抗治疗过程期间发展适当地高滴度的抗SARS-CoV-2抗体。
患者#13(Bergamo，意大利)
患者#13是62岁的超重男子，患有高血压和严重COVID-19。他在插管后3天开始纳索利单抗治疗，并且在第6个剂量后切开气管。他接受了总共8个纳索利单抗剂量，随后去除气管造口术，并且他从医院出院处于室内空气下。血清学数据指示了，他在用纳索利单抗治疗过程期间发展适当地高滴度的抗SARS-CoV-2抗体。
患者#14(Bergamo，意大利)
患者#14是受SARS-CoV-2感染的64岁的超重男子，患有高血压和严重COVID-19。他在插管后6天开始纳索利单抗治疗。他在第7个剂量后切开气管。他接受了总共8个纳索利单抗剂量，随后去除气管造口术，并且他从医院出院处于室内空气下。血清学数据指示了，他在用纳索利单抗治疗过程期间发展适当地高滴度的抗SARS-CoV-2抗体。
患者#15(Bergamo，意大利)
患者#15是79岁的超重男子，患有高血压和严重COVID-19。他在插管后3天开始纳索利单抗治疗。他在3个纳索利单抗剂量后拔管。他接受了总共6个纳索利单抗剂量，并且出院。血清学数据指示了，他在用纳索利单抗治疗过程期间发展适当地高滴度的抗SARS-CoV-2抗体。
患者#1(美国)
患者#1是患有严重COVID-19的53岁的男子，其在其它治疗方案(包括瑞德西韦、托珠单抗、初始类固醇治疗和恢复期血浆)失败后已插管约2周。他开始用纳索利单抗的治疗，并且同时接受依诺肝素和甲泼尼龙。他迅速响应，并且在第5个纳索利单抗剂量后不久拔管。他被送往康复机构用于物理治疗，继续改善并于上个月恢复工作。据报告，他没有COVID-19的长期后遗症。
患者#2(美国)
患者#2是55岁的非裔美国妇女，具有由于严重COVID-19而快速恶化的呼吸功能。她在插管后几天开始用纳索利单抗的治疗。她的氧气需求已成功撤除，但由于面罩不耐受，放置气管造口术用于低水平的氧气支持，并且插入饲管。她被送往急症监护设施，然后回家。气管造口术和饲管被去除，并且据报告，她完全恢复，而没有长期临床后遗症的证据。
患者#3(美国)
患者#3是患有严重COVID-19的80岁的男子。他在插管后几天开始用纳索利单抗的治疗。他在第3个或第4个纳索利单抗剂量后死亡。据报告他的死亡与气压伤以及机械通气继发的有关并发症相关。他的家人出于宗教原因拒绝接受体外膜式氧合(ECMO)治疗。
患者#4(美国)
患者#4是61岁的男子，患有高血压和严重COVID-19。在纳索利单抗治疗启动之前，他已插管8天并经历ECMO。他对用瑞德西韦、巴瑞替尼和大剂量类固醇的治疗已失败。他接受了3个纳索利单抗剂量且死亡。
总之，纳索利单抗已用于治疗本文所述的19个患者，具有惊人的结果。所有用纳索利单抗治疗的COVID-19患者都具有需要机械通气的ARDS–CPAP(4)或插管(14)。所有患者都具有高危特点/共病。大多数用纳索利单抗治疗的COVID-19患者显示了在症状(即不再需要补充氧气)和实验室值方面的快速且显著的改善，并且随后出院。如本文进一步所述，其随访(5-6个月)数据可获得的纳索利单抗治疗的COVID-19患者，并未显示观察到的长期COVID后遗症的临床或实验室证据。纳索利单抗治疗的COVID-19患者发展适当地高滴度的SARS-CoV-2抗体，指示了与用其它补体抑制剂的治疗不同，纳索利单抗并不阻碍适应性免疫应答的效应子功能。
表16：患者#7-#15(Bergamo，意大利)的临床特点
流感病毒
如实施例20、21和22中所述，已证实了凝集素途径促成COVID-19感染中的肺部损伤，并且代表性的MASP-2抑制性抗体纳索利单抗有效缓解COVID-19患者中的肺部症状。在流感H5N1病毒感染模型中，补体活化也已证实为促成肺部损伤。肺组织病理学变化在具有H5N1感染和SARS-CoV感染的患者中非常相似。在H5N1鼠模型中，MASP-2 RNA、C3a受体RNA和C5a受体RNA的表达在感染之后的第一天全部都增加。使用C3aR拮抗剂或眼镜蛇毒因子的补体抑制减轻肺损伤和临床体征。存活也是增加的(参见Sun等人，AmJRespir CellMolBiol49(2):221-30，2013)。相应地，预计MASP-2抑制剂也将有效用于治疗、抑制、减轻或预防由流感病毒感染的哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征或疾病的其它表现的方法中。
实施例23
用于MASP-2的酶促测定
基于其天然底物C2的切割位点，MASP-2测定利用了荧光底物。该测定在室温下在含有20mM Hepes，pH 7.4，140mMNaCl和0.1％Tween 20的测定缓冲液中运行。这样调整测定参数，使得测定相对于时间、酶和底物浓度呈线性。在这些优化的测定条件下，IC50值等价于Ki值，除了“紧密结合”抑制剂的少数情况之外。通过Copeland R.A.(2013)EvaluationofEnzyme Inhibitors in Drug Discovery.第2版，John Wiley and Sons，Inc.，第5-7章中所述的方法，来处理“紧密结合”或可能的“缓慢结合”抑制剂的情况。
MASP-2测定方案如下进行。将测试化合物在DMSO中连续稀释，然后将100 nL每种稀释物转移至测定板。加入10μL测定缓冲液，随后为在测定缓冲液中的15μL酶(MASP-2(CCP1-CCP2-SP)。然后加入在测定缓冲液中的15μL底物并混合，以起始反应。在室温下20分钟后，加入15μL终止溶液(0.1M乙酸)，混合，并在SpectraMax i3x Microplate Reader上读取板，并作为Excel文件输出。每块测定板包括“无抑制剂”(仅DMSO)对照、“无酶”对照和参考抑制剂对照。％活性值＝100*(平均测试化合物荧光–平均“无酶”荧光)/(平均“仅DMSO”荧光–平均“无酶”荧光)。IC50和Ki值是非常可重现的，良好地落入±2倍内。
实施例24
用小分子化合物治疗的人血清中的凝集素途径活化测定
微量滴定ELISA板用来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甘露聚糖(Sigma-Aldrich，M7504)，在包被缓冲液[15mM Na2CO3、35mM NaHCO3]中在4℃下包被过夜。板用在Tris缓冲盐水(TBS)[10mM Tris-HCl，140mM NaCl]中的1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich，A3294)在室温下封闭2小时。使1％人血清与在GVB++[4mM巴比妥、145mMNaCl、0.2mM MgCl2、0.2mM CaCl2、1％明胶]中的小化合物的系列稀释物一起温育，并在室温下温育15分钟。然后将100μL的这种混合物加入板中，并且使板在37℃下伴随200 rpm的轻柔振荡温育长达一个小时。这之后，将板在洗涤缓冲液[含有5mM CaCl2和0.05％Tween-20的TBS]中洗涤三次，然后添加100μL在洗涤缓冲液中1:5000稀释的兔抗人C3c(Dako，A0062)，并且在37℃下温育30分钟。将板洗涤，并且添加在洗涤缓冲液中1:8000稀释的100μL HRP山羊抗兔IgG(Southern Biotech，4050-05)，并在室温下温育30分钟。这之后，将板洗涤3次，然后加入100μL/孔的TMB比色底物(Thermo Scientific，34029)，并在室温下温育5分钟，并且通过加入100μL/孔的0.1 N硫酸(BDH7230)来终止反应，并在450 nm处测量吸光度。
实施例25.关于凝血酶的酶促测定
凝血酶测定利用荧光肽底物(Boc-VPR-AMC(R&D Systems)，并且在室温下在含有20mM Hepes，pH 7.4，140mMNaCl和0.1％Tween 20的测定缓冲液中运行。这样调整测定参数，使得测定相对于时间、酶和底物浓度呈线性。在这些优化的测定条件下，IC50值等价于Ki值，除了“紧密结合”抑制剂的少数情况之外。通过Copeland R.A.(2013)EvaluationofEnzyme Inhibitors in Drug Discovery.第2版，John Wiley and Sons，Inc.，第5-7章中所述的方法，来处理“紧密结合”或可能的“缓慢结合”抑制剂的情况。
凝血酶测定方案如下进行。将测试化合物在DMSO中连续稀释，然后将100 nl每种稀释物转移至测定板。加入10μL测定缓冲液，随后为在测定缓冲液中的15μL酶(人α-凝血酶(BioPharm Lab.))。然后加入在测定缓冲液中的15μL底物并混合，以起始反应。在室温下20分钟后，加入15μL终止溶液(0.1M乙酸)，混合，并在SpectraMax i3x Microplate Reader上读取板，并作为Excel文件输出。每块测定板包括“无抑制剂”(仅DMSO)对照、“无酶”对照和参考抑制剂对照。％活性值＝100*(平均测试化合物荧光–平均“无酶”荧光)/(平均“仅DMSO”荧光–平均“无酶”荧光)。IC50和Ki值是非常可重现的，良好地落入±2倍内。
关于表4A-4E中列出化合物的生物测定结果在下表17A、17B和17C中列出。
表17A：关于化合物1000-1229的MASP-2/凝血酶/凝集素途径抑制
MASP-2抑制和凝血酶抑制Ki值：
*小于25μM的Ki
**小于10μM的Ki
***小于2.5μM的Ki
****小于0.5μM的Ki
-->25μM的Ki
凝集素途径抑制
-->50μM的IC50值
+在5μM至50μM的范围内的IC50值++在0.5μM至5μM的范围内的IC50值+++在0.05μM至0.5μM的范围内的IC50值
++++IC50值<0.05μM
化合物对于MASP-2的抑制相对于凝血酶的选择性：
--小于1.0倍
*1.0至5.0倍
**5.0至25倍
***25至100倍
****>100倍
ND未确定
表17B.关于化合物1230-1497的MASP-2/凝血酶/凝集素途径抑制
MASP-2抑制和凝血酶抑制Ki值：
*10μM<Ki≤25μM
**2.5μM≤Ki<10μM
***0.5μM≤Ki<2.5μM
****Ki<0.5μM
-->25μM的Ki ND未确定
凝集素途径抑制
+5μM<IC50≤50μM
++0.5μM≤IC50<5μM
+++0.05μM≤Ki<0.5μM
++++Ki<0.05μM
--IC50>50μM
化合物对于MASP-2的抑制相对于凝血酶的选择性：--<1.0倍
*≥1.0至<5.0倍
**≥5.0至<25倍
***≥25至<100倍
****≥100倍
ND未确定
表17C.MASP-2/凝血酶/凝集素途径抑制
MASP-2抑制和凝血酶抑制Ki值：
*小于25μM的Ki
**小于10μM的Ki
***小于2.5μM的Ki
****小于0.5μM的Ki
*****小于0.05μM的Ki
-->25μM的Ki
凝集素途径抑制：
-->50μM的IC50值
+在5μM至50μM的范围内的IC50值化合物对于MASP-2相对于凝血酶的选择性：--小于1.0倍
+1.0至5.0倍
++5.0至25倍
+++25至100倍
++++>100倍
ND未确定
根据前述内容，在一个方面，本发明提供了用于治疗、抑制、减轻或预防哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征或疾病的其它表现例如血栓形成的方法，所述哺乳动物受试者由冠状病毒或流感病毒感染，所述方法包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化(即，抑制凝集素途径活化)的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有一种或多种呼吸道症状和/或血栓形成，并且该方法包括将有效改善至少一种呼吸道症状(即，改善呼吸功能)和/或减轻血栓形成的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。
在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由COVID-19感染的受试者。在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由SARS-CoV感染的受试者。在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由MERS-CoV感染的受试者。在一个实施方案中，在MASP-2抑制剂施用之前，受试者被鉴定为具有冠状病毒(即COVID-19、SARS-CoV或MERS-CoV)。在一个实施方案中，受试者被鉴定为由COVID-19感染，并且需要补充氧气，并且将MASP-2抑制剂例如MASP-2抑制性抗体例如纳索利单抗施用于患者，其剂量和时间段有效消除对于补充氧气的需要。
在一个实施方案中，受试者被鉴定为患有COVID-19，并且患有或处于发展COVID-19诱导的血栓形成的风险中，并且该方法包括以治疗有效量施用包含MASP-2抑制剂(例如MASP-2抑制性抗体，例如纳索利单抗)的组合物，以治疗、预防或降低所述受试者中的凝血或血栓形成的严重性。在一些实施方案中，本发明的方法提供了抗凝和/或抗血栓形成和/或抗血栓栓塞，而不影响止血。在一个实施方案中，在患有COVID-19的受试者中测量D-二聚体水平，以确定所述受试者中血栓形成的存在或不存在，其中高于标准范围的D-二聚体水平指示血栓形成的存在，并且受试者用治疗有效量的MASP-2抑制剂(例如MASP-2抑制性抗体，例如纳索利单抗)进行治疗，以治疗、预防或降低所述受试者的凝血或血栓形成的严重性，其可以例如通过D-二聚体水平降低到健康受试者的正常范围内的水平进行测量。
在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由流感病毒感染的受试者，所述流感病毒例如甲型流感病毒(H1N1(引起1918年的“西班牙流感”和2009年的“猪流感”)；H2N2(引起1957年的“亚洲流感”)、H3N2(引起1968年在中国香港地区出现的“流感”)、H5N1(引起2004年的“禽流感”)、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9和H6N1)；或乙型流感病毒或丙型流感病毒。在一个实施方案中，在MASP-2抑制剂施用之前，受试者被鉴定为具有流感病毒。
在一个实施方案中，与对照健康受试者或群体的循环内皮细胞水平相比，在用MASP-2抑制剂治疗之前，受试者被确定为在从受试者获得的血液样品中具有增加水平的循环内皮细胞。在一些实施方案中，该方法包括施用足以降低由冠状病毒或流感病毒感染的受试者的循环内皮细胞数目的量的MASP-2抑制剂。
在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是抑制MASP-2依赖性补体活化的小分子。
在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2的表达抑制剂。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体抑制90％人血清中的C3b沉积，其IC50为30nM或更小。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该方法包括向由冠状病毒或流感病毒感染的受试者施用包含MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述MASP-2抑制性抗体包括包含如SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列的重链可变区、以及包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的轻链可变区，其剂量为1mg/kg至10mg/kg(即，1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)，每周至少一次(例如每周至少两次或每周至少三次)，持续至少2周(例如至少3周、或至少4周、或至少5周、或至少6周、或至少7周、或至少8周、或至少9周、或至少10周、或至少11周、或至少12周)的时期。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体的剂量为约4mg/kg(即3.6mg/kg至4.4mg/kg)。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体(例如，纳索利单抗)的剂量以约4mg/kg(即，3.6mg/kg至4.4mg/kg)的剂量施用于患有COVID-19的受试者，每周至少两次，持续至少两周、或至少三周、或至少四周(例如，两周至四周)的时间段。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体的剂量是约300mg至约450mg(即，约300mg至约400mg、或约350mg至约400mg)，例如约300mg、约305mg、约310mg、约315mg、约320mg、约325mg、约330mg、约335mg、约340mg、约345mg、约350mg、约355mg、约360mg、约365mg、约370mg、约375mg、约380mg、约385mg、约390mg、约395mg、约400mg、约405mg、约410mg、约415mg、约420mg、约425mg、约430mg、约435mg、约440mg、约445mg和约450mg)的固定剂量。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体的剂量是约370mg(±10％)的固定剂量。
在一个实施方案中，该方法包括每周两次向由冠状病毒或流感病毒感染的受试者，静脉内施用以约370mg(±10％)的固定剂量的MASP-2抑制性抗体，持续至少8周的治疗期。
在一个实施方案中，将MASP-2抑制剂全身性地递送至受试者。在一个实施方案中，将MASP-2抑制剂经口、皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内或作为吸入剂施用。
在一个实施方案中，受试者患有COVID-19诱导的肺炎或ARDS，并且将MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)施用足以减轻肺炎或ARDS的一种或多种症状的时间。在一个实施方案中，受试者处于机械呼吸机上，并且MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)以足以中止对于机械通气的需要的剂量和时间段施用。在一个实施方案中，受试者处于侵入性机械呼吸机上。在一个实施方案中，受试者处于非侵入性机械呼吸机上。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)以足以中止对于补充氧气的使用的剂量和时间段施用。
在一个实施方案中，将MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)作为单一疗法，施用于由冠状病毒或流感病毒感染的受试者。在一些实施方案中，将MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与一种或多种另外的治疗剂组合，施用于由冠状病毒或流感病毒感染的受试者，例如在包含MASP-2抑制剂和一种或多种抗病毒剂、或一种或多种抗凝剂、或一种或多种治疗性抗体、或者一种或多种治疗性小分子化合物的组合物中。在一些实施方案中，将MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)施用于由冠状病毒或流感病毒感染的受试者，其中所述受试者经历用一种或多种另外的治疗剂的治疗，所述一种或多种另外的治疗剂例如一种或多种抗病毒剂、或一种或多种抗凝剂、或一种或多种治疗性抗体、或者一种或多种治疗性小分子化合物。
根据前述内容，在另一个方面，本发明提供了用于治疗、改善、预防或降低哺乳动物受试者发展一种或多种长期后遗症的风险的方法，所述哺乳动物受试者由冠状病毒或流感病毒感染，所述方法包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化(即，抑制凝集素途径活化)的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有一种或多种呼吸道症状和/或血栓形成，并且该方法包括将有效改善至少一种呼吸道症状(即，改善呼吸功能)和/或减轻血栓形成的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。
在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由COVID-19感染的受试者。在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由SARS-CoV感染的受试者。在一个实施方案中，该方法包括将组合物施用于由MERS-CoV感染的受试者。在一个实施方案中，在MASP-2抑制剂施用之前，受试者被鉴定为具有冠状病毒(即COVID-19、SARS-CoV或MERS-CoV)。在一个实施方案中，受试者被鉴定为由SARS-CoV-2感染，并且需要补充氧气，并且将MASP-2抑制剂例如MASP-2抑制性抗体例如纳索利单抗施用于患者，其剂量和时间段有效消除对于补充氧气的需要。
在一个实施方案中，受试者被鉴定为由COVID-19感染并且经历轻度症状，并且将MASP-2抑制剂例如MASP-2抑制性抗体例如纳索利单抗施用于受试者，其剂量和时间段有效治疗、改善、预防或降低所述受试者中发展一种或多种COVID-19有关的长期后遗症的风险。在一些实施方案中，该方法可用于治疗、改善、预防或降低患有COVID-19或先前由COVID-19感染的受试者的一种或多种COVID-19有关的长期后遗症的风险，其中所述长期后遗症选自已由COVID-19感染的受试者的心血管并发症(包括心肌损伤、心肌病、心肌炎、血管内凝血、中风、静脉和动脉并发症以及肺栓塞)；神经系统并发症(包括认知困难、意识模糊、也称为“脑雾”的记忆丧失、头痛、中风、头晕、晕厥、癫痫发作、食欲减退、失眠、嗅觉丧失、味觉丧失、肌阵挛、神经性疼痛、肌痛；神经系统疾病如阿尔茨海默氏病、格巴二氏综合征、米勒-费希尔综合征、帕金森氏病)的进展；肾脏损伤(例如急性肾脏损伤(AKI))、肺部并发症(包括肺纤维化、呼吸困难、肺栓塞)，以及炎性病况例如川崎病、川崎样病、儿童的多系统炎症综合征(MIS-C)和多系统器官衰竭。最近发表的数据显示了，儿童中的SARS-CoV-2感染导致不依赖于临床严重性的TMA的高发病率(参见Diorio C.等人，Blood Advances第4卷(23)，Dec8，2020)。还已报告，儿童中的SARS-CoV-2感染可以导致多系统炎症综合征(MIS-C)(参见Radia T.等人，Paediatr Respri Rev 2020年8月11日)。
多个国际团体最近已发表报告，多于60％的“恢复的”COVID-19患者患有严重的后遗症，包括认知/CNS、肺、心脏、肝和其它异常(参见Bonow等人，JAMA Cardiology第5卷(7)2020年7月；Del Rio等人，JAMA第324卷(17)，2020年11月；Lindner等人，JAMA Cardiology第5卷(11)，2020年11月；Marchiano S.等人，bioRxiv，2020年8月30日；Puntmann V.等人，JAMA Cardiology第5卷(11)，2020年11月；Xiong Q.等人，Clin Microbial Infect 2020)。例如，如Yelin D.等人，Lancet Infect Dis 2020，9/1/2020中所述，从急性COVID-19中恢复的人的长期抱怨包括：极度疲劳、肌无力、低烧、注意力不集中、记忆差错、情绪变化、睡眠困难、手臂和腿部的针痛、腹泻和呕吐、味觉和嗅觉丧失、喉咙痛和吞咽困难、糖尿病和高血压的新发作、皮疹、呼吸短促、胸痛和心悸。值得注意的是，如本文实施例21和22中所述，关于最初的6个Bergamo研究中用纳索利单抗治疗的COVID-19患者的5至6个月随访，并未显示长期COVID-19后遗症的临床或实验室证据。
在一个实施方案中，与对照健康受试者或群体的循环内皮细胞水平相比，在用MASP-2抑制剂治疗之前，受试者被确定为在从受试者获得的血液样品中具有增加水平的循环内皮细胞。在一些实施方案中，该方法包括施用足以降低由冠状病毒或流感病毒感染的受试者的循环内皮细胞数目的量的MASP-2抑制剂。
在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是抑制MASP-2依赖性补体活化的小分子。
在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2的表达抑制剂。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体抑制90％人血清中的C3b沉积，其IC50为30nM或更小。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该方法包括向由冠状病毒或流感病毒感染的受试者施用包含MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述MASP-2抑制性抗体包括包含如SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列的重链可变区、以及包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的轻链可变区，其剂量为1mg/kg至10mg/kg(即，1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)，每周至少一次(例如每周至少两次或每周至少三次)，持续至少2周(例如至少3周、或至少4周、或至少5周、或至少6周、或至少7周、或至少8周、或至少9周、或至少10周、或至少11周、或至少12周)的时期。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体的剂量为约4mg/kg(即3.6mg/kg至4.4mg/kg)。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体(例如，纳索利单抗)的剂量以约4mg/kg(即，3.6mg/kg至4.4mg/kg)的剂量施用于患有COVID-19的受试者，每周至少两次，持续至少两周、或至少三周、或至少四周、或至少五周、或至少六周、或至少七周或至少八周(例如，两周至四周、或两周至五周、或两周至六周、或两周至七周、或两周至八周)的时间段。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体的剂量是约300mg至约450mg(即，约300mg至约400mg、或约350mg至约400mg)，例如约300mg、约305mg、约310mg、约315mg、约320mg、约325mg、约330mg、约335mg、约340mg、约345mg、约350mg、约355mg、约360mg、约365mg、约370mg、约375mg、约380mg、约385mg、约390mg、约395mg、约400mg、约405mg、约410mg、约415mg、约420mg、约425mg、约430mg、约435mg、约440mg、约445mg和约450mg)的固定剂量。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体的剂量是约370mg(±10％)的固定剂量。
在一个实施方案中，该方法包括每周两次向由冠状病毒或流感病毒感染的受试者，静脉内施用约370mg(±10％)的固定剂量的MASP-2抑制性抗体，持续至少8周的治疗期。
在一个实施方案中，将MASP-2抑制剂全身性地递送至受试者。在一个实施方案中，将MASP-2抑制剂经口、皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内或作为吸入剂施用。
在一个实施方案中，受试者患有COVID-19诱导的肺炎或ARDS，并且将MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)施用足以减轻肺炎或ARDS的一种或多种症状，和足以减轻或预防COVID-19有关的长期后遗症的时间。在一个实施方案中，受试者处于机械呼吸机上，并且MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)以足以中止对于机械通气的需要的剂量和时间段施用。在一个实施方案中，受试者处于侵入性机械呼吸机上。在一个实施方案中，受试者处于非侵入性机械呼吸机上。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)以足以中止对于补充氧气的使用的剂量和时间段施用。
在一个实施方案中，将MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)作为单一疗法施用于由冠状病毒或流感病毒感染的受试者。在一些实施方案中，将MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与一种或多种另外的治疗剂组合，施用于由冠状病毒或流感病毒感染的受试者，例如在包含MASP-2抑制剂和一种或多种抗病毒剂、或一种或多种抗凝剂、或一种或多种治疗性抗体、或者一种或多种治疗性小分子化合物的组合物中。在一些实施方案中，将MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)施用于由冠状病毒或流感病毒感染的受试者，其中所述受试者经历用一种或多种另外的治疗剂的治疗，所述一种或多种另外的治疗剂例如一种或多种抗病毒剂、或一种或多种抗凝剂、或一种或多种治疗性抗体、或者一种或多种治疗性小分子化合物。
其它实施例
I.用于治疗、抑制、减轻或预防由冠状病毒感染的受试者的急性呼吸窘迫综合征的方法。
1.一种用于治疗、抑制、减轻或预防由冠状病毒感染的哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征、肺炎或者冠状病毒感染的一些其它肺部表现或其它表现例如血栓形成的方法，其包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。
2.段落1的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。
3.段落2的方法，其中所述MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。
4.段落2的方法，其中所述MASP-2抗体或其片段与包含SEQ ID NO:6的多肽特异性结合，其中亲和力是其与补体系统中不同抗原结合的至少10倍。
5.段落2的方法，其中所述抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
6.段落2的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体选择性地抑制凝集素途径补体活化，而基本上不抑制C1q依赖性补体活化。
7.段落2的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制10％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
8.段落2的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制90％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
9.段落2的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
10.段落2的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ IDNO:67的重链可变区和包含SEQ ID NO:69的轻链可变区。
11.段落1的方法，其中所述MASP-2抑制剂是小分子MASP-2抑制性化合物。
12.段落11的方法，其中所述MASP-2抑制性化合物是合成或半合成的小分子。
13.段落1的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2的表达抑制剂。
14.段落11的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(III)、(IV)、(VA)、(VB)、(VIA)、(VB)、(VIIA)或(VIIB)中任一个的化合物。
15.段落11的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
代表双键或单键；
R1为取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R2为氢、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟烷基、卤代烷氧基或环烷基；
R3为氢、烷基、卤代烷基或环烷基，或者R2和R3连同它们各自与之连接的碳和氮一起形成任选取代的4-7元杂环基；
R4为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R5为氢、烷基、卤代烷基、环烷基、膦烷基、(CH2)mC(＝O)OR6、C(＝O)R6、C(＝O)OR6、(CH2)mNR6S(O)2R7或C(＝O)NR6R7；
在每次出现时，R6和R7独立地为氢、烷基、卤代烷基、环烷基或芳基烷基；
L1为直接键、-CR8aR8b-、-S(O)t-、NR8c或-O-；
R8a和R8b各自独立地为氢、烷基，或者R8a和R8b连同它们与之连接的碳一起，形成任选取代的3-6元环烷基；
R8c为氢、烷基、卤代烷基、(C＝O)烷基、(C＝O)O烷基、(C＝O)环烷基、(C＝O)O环烷基、(C＝O)芳基、(C＝O)O芳基、(C＝O)杂芳基、(C＝O)O杂芳基、(C＝O)杂环基、(C＝O)O杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的环烷基烷基、或者取代或未取代的杂环基烷基；
n为1或2；
m为1、2、3、4、5或6；和
t为0、1或2。
16.段落11的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是表4A、4B、4C、4D或4E的化合物。
17.段落11的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是分子量为200Da至2,000Da、250Da至2,000Da、300Da至2,000Da、300Da至1,000Da、300Da至600Da、350Da至2,000Da、350Da至1,500Da、350Da至1,200Da、350Da至1,000Da、350Da至900Da、350Da至800Da、350Da至700Da、350Da至600Da的小分子。
18.段落11的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物具有选自胍基和苄脒基的零至一个碱性基团。
19.段落11的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物具有小于约25μM、小于约10μM、小于约2.5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、或小于约0.1μM的MASP-2抑制Ki值。
20.段落11的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是其凝集素途径抑制IC50小于约50μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、或小于约0.05μM的凝集素途径抑制剂。
21.段落11的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是选择性MASP-2抑制剂，相对于凝血酶抑制，其对于MASP-2抑制的选择性为大于约2倍、大于约5倍、大于约10倍、大于约25倍、大于约50倍、或大于约100倍。
22.段落11的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物对于MASP-2具有的亲和力大于对于凝血酶的，其中MASP-2:凝血酶的选择性比为至少1.1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1或30:1。
22.段落11的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物不是MASP-2的共价抑制剂。
23.段落11的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物不是内源性MASP-2配体或底物。
24.段落1至23中任一项的方法，其中将所述MASP-2抑制剂皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内、经口或作为吸入剂施用。
25.段落1至24中任一项的方法，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(又被称为SARS冠状病毒2或SARS-CoV-2)。
26.段落1至24中任一项的方法，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)。
27.段落1至24中任一项的方法，其中所述冠状病毒是中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。
28.段落1至27中任一项的方法，其中在所述MASP-2抑制剂施用之前，所述受试者被鉴定为具有冠状病毒。
29.段落1至28中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段以有效改善呼吸功能的量施用。
30.段落1-29中任一项的方法，其中所述哺乳动物受试者是人受试者。
II.用于治疗患有COVID-19诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或肺炎的人受试者的方法
1.一种用于治疗患有COVID-19诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或肺炎的人受试者的方法，其包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。
2.段落1的方法，其中所述受试者在治疗之前处于机械呼吸机上，并且所述MASP-2抑制剂以足以中止对于机械通气的需要的剂量和时间段施用。
3.段落2的方法，其中所述受试者处于侵入性机械呼吸机上。
4.段落2的方法，其中所述受试者处于非侵入性机械呼吸机上。
5.段落1的方法，其中所述受试者在治疗之前需要补充氧气，并且所述MASP-2抑制剂以足以中止对于补充氧气的使用的剂量和时间段施用。
6.段落1至5中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。
7.段落6的方法，其中所述MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。
8.段落6或7的方法，其中所述MASP-2抗体或其片段与包含SEQ ID NO:6的多肽特异性结合，其中亲和力是其与补体系统中不同抗原结合的至少10倍。
9.段落6至8中任一项的方法，其中所述抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
10.段落6至9中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体选择性地抑制凝集素途径补体活化，而基本上不抑制C1q依赖性补体活化。
11.段落6至10中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制10％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
12.段落6至10中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制90％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
13.段落6至12中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
14.段落6至13中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:67的重链可变区和包含SEQ ID NO:69的轻链可变区。
15.段落1至5中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制剂是小分子MASP-2抑制性化合物。
16.段落15的方法，其中所述MASP-2抑制性化合物是合成或半合成的小分子。
17.段落1的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2的表达抑制剂。
18.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(III)、(IV)、(VA)、(VB)、(VIA)、(VB)、(VIIA)或(VIIB)中任一个的化合物。
19.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
代表双键或单键；
R1为取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R2为氢、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟烷基、卤代烷氧基或环烷基；
R3为氢、烷基、卤代烷基或环烷基，或者R2和R3连同它们各自与之连接的碳和氮一起形成任选取代的4-7元杂环基；
R4为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R5为氢、烷基、卤代烷基、环烷基、膦烷基、(CH2)mC(＝O)OR6、C(＝O)R6、C(＝O)OR6、(CH2)mNR6S(O)2R7或C(＝O)NR6R7；
在每次出现时，R6和R7独立地为氢、烷基、卤代烷基、环烷基或芳基烷基；
L1为直接键、-CR8aR8b-、-S(O)t-、NR8c或-O-；
R8a和R8b各自独立地为氢、烷基，或者R8a和R8b连同它们与之连接的碳一起，形成任选取代的3-6元环烷基；
R8c为氢、烷基、卤代烷基、(C＝O)烷基、(C＝O)O烷基、(C＝O)环烷基、(C＝O)O环烷基、(C＝O)芳基、(C＝O)O芳基、(C＝O)杂芳基、(C＝O)O杂芳基、(C＝O)杂环基、(C＝O)O杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的环烷基烷基、或者取代或未取代的杂环基烷基；
n为1或2；
m为1、2、3、4、5或6；和
t为0、1或2。
20.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是表4A、4B、4C、4D或4E的化合物。
21.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是分子量为200Da至2,000Da、250Da至2,000Da、300Da至2,000Da、300Da至1,000Da、300Da至600Da、350Da至2,000Da、350Da至1,500Da、350Da至1,200Da、350Da至1,000Da、350Da至900Da、350Da至800Da、350Da至700Da、350Da至600Da的小分子。
22.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物具有选自胍基和苄脒基的零至一个碱性基团。
23.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物具有小于约25μM、小于约10μM、小于约2.5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、或小于约0.1μM的MASP-2抑制Ki值。
24.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是其凝集素途径抑制IC50小于约50μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、或小于约0.05μM的凝集素途径抑制剂。
25.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是选择性MASP-2抑制剂，相对于凝血酶抑制，其对于MASP-2抑制的选择性为大于约2倍、大于约5倍、大于约10倍、大于约25倍、大于约50倍、或大于约100倍。
26.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物对于MASP-2具有的亲和力大于对于凝血酶的，其MASP-2:凝血酶的选择性比为至少1.1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1或30:1。
27.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物不是MASP-2的共价抑制剂。
28.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物不是内源性MASP-2配体或底物。
29.段落1至28中任一项的方法，其中将所述MASP-2抑制剂皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内、经口或作为吸入剂施用。
III.用于治疗、抑制、减轻或预防由SARS-CoV-2感染的人受试者的血栓形成的方法
1.一种用于治疗、预防由SARS-CoV-2感染的人受试者的凝血或血栓形成或者降低其严重性的方法，其包括将有效治疗、预防所述受试者的凝血或血栓形成或者降低其严重性的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。
2.段落1的方法，其中所述受试者具有的D-二聚体水平高于治疗前的标准范围，并且所述MASP-2抑制剂以足以将所述受试者的D-二聚体水平降低到健康受试者的正常范围内的量和时间施用。
3.段落1或2的方法，其中所述MASP-2抑制剂提供抗凝和/或抗血栓形成效应，而不影响止血。
4.段落1至3中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。
5.段落4的方法，其中所述MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。
6.段落4或5的方法，其中所述MASP-2抗体或其片段与包含SEQ ID NO:6的多肽特异性结合，其中亲和力是其与补体系统中不同抗原结合的至少10倍。
7.段落4至6中任一项的方法，其中所述抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
8.段落4至7中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体选择性地抑制凝集素途径补体活化，而基本上不抑制C1q依赖性补体活化。
9.段落4至8中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制10％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
10.段落4至9中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制90％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
11.段落4至10中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
12.段落4至11中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:67的重链可变区和包含SEQ ID NO:69的轻链可变区。
13.段落1至3中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制剂是小分子MASP-2抑制性化合物。
14.段落13的方法，其中所述MASP-2抑制性化合物是合成或半合成的小分子。
15.段落1的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2的表达抑制剂。
16.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(III)、(IV)、(VA)、(VB)、(VIA)、(VB)、(VIIA)或(VIIB)中任一个的化合物。
17.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
代表双键或单键；
R1为取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R2为氢、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟烷基、卤代烷氧基或环烷基；
R3为氢、烷基、卤代烷基或环烷基，或者R2和R3连同它们各自与之连接的碳和氮一起形成任选取代的4-7元杂环基；
R4为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R5为氢、烷基、卤代烷基、环烷基、膦烷基、(CH2)mC(＝O)OR6、C(＝O)R6、C(＝O)OR6、(CH2)mNR6S(O)2R7或C(＝O)NR6R7；
在每次出现时，R6和R7独立地为氢、烷基、卤代烷基、环烷基或芳基烷基；
L1为直接键、-CR8aR8b-、-S(O)t-、NR8c或-O-；
R8a和R8b各自独立地为氢、烷基，或者R8a和R8b连同它们与之连接的碳一起，形成任选取代的3-6元环烷基；
R8c为氢、烷基、卤代烷基、(C＝O)烷基、(C＝O)O烷基、(C＝O)环烷基、(C＝O)O环烷基、(C＝O)芳基、(C＝O)O芳基、(C＝O)杂芳基、(C＝O)O杂芳基、(C＝O)杂环基、(C＝O)O杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的环烷基烷基、或者取代或未取代的杂环基烷基；
n为1或2；
m为1、2、3、4、5或6；和
t为0、1或2。
18.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是表4A、4B、4C、4D或4E的化合物。
19.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是分子量为200Da至2,000Da、250Da至2,000Da、300Da至2,000Da、300Da至1,000Da、300Da至600Da、350Da至2,000Da、350Da至1,500Da、350Da至1,200Da、350Da至1,000Da、350Da至900Da、350Da至800Da、350Da至700Da、350Da至600Da的小分子。
20.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物具有选自胍基和苄脒基的零至一个碱性基团。
21.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物具有小于约25μM、小于约10μM、小于约2.5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、或小于约0.1μM的MASP-2抑制Ki值。
22.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是其凝集素途径抑制IC50小于约50μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、或小于约0.05μM的凝集素途径抑制剂。
23.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是选择性MASP-2抑制剂，相对于凝血酶抑制，其对于MASP-2抑制的选择性为大于约2倍、大于约5倍、大于约10倍、大于约25倍、大于约50倍、或大于约100倍。
24.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物对于MASP-2具有的亲和力大于对于凝血酶的，其MASP-2:凝血酶的选择性比为至少1.1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1或30:1。
25.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物不是MASP-2的共价抑制剂。
26.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物不是内源性MASP-2配体或底物。
27.段落1至26中任一项的方法，其中将所述MASP-2抑制剂皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内、经口或作为吸入剂施用。
IV.一种用于治疗、改善、预防已由SARS-CoV-2感染的人受试者的一种或多种COVID-19有关的长期后遗症或降低其发生的风险的方法
1.一种用于治疗、改善、预防人受试者的一种或多种COVID-19有关的长期后遗症或降低其发生的风险的方法，所述人受试者目前由SARS-CoV-2感染或已由SARS-CoV-2感染，所述方法包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。
2.段落1的方法，其中所述受试者患有COVID-19诱导的肺炎或ARDS，并且所述MASP-2抑制剂以有效改善呼吸功能的量施用。
3.段落1的方法，其中所述受试者患有COVID-19诱导的凝血或血栓形成，并且所述MASP-2抑制剂以有效治疗、预防所述受试者的凝血或血栓形成或者降低其严重性的量施用于受试者。
4.段落1至3中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。
5.段落4的方法，其中所述MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。
6.段落4或5的方法，其中所述MASP-2抗体或其片段与包含SEQ ID NO:6的多肽特异性结合，其中亲和力是其与补体系统中不同抗原结合的至少10倍。
7.段落4至6中任一项的方法，其中所述抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
8.段落4至7中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体选择性地抑制凝集素途径补体活化，而基本上不抑制C1q依赖性补体活化。
9.段落4至8中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制10％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
10.段落4至9中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制90％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
11.段落4至10中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
12.段落4至11中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:67的重链可变区和包含SEQ ID NO:69的轻链可变区。
13.段落1至3中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制剂是小分子MASP-2抑制性化合物。
14.段落13的方法，其中所述MASP-2抑制性化合物是合成或半合成的小分子。
15.段落1的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2的表达抑制剂。
16.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(III)、(IV)、(VA)、(VB)、(VIA)、(VB)、(VIIA)或(VIIB)中任一个的化合物。
17.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
代表双键或单键；
R1为取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R2为氢、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟烷基、卤代烷氧基或环烷基；
R3为氢、烷基、卤代烷基或环烷基，或者R2和R3连同它们各自与之连接的碳和氮一起形成任选取代的4-7元杂环基；
R4为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R5为氢、烷基、卤代烷基、环烷基、膦烷基、(CH2)mC(＝O)OR6、C(＝O)R6、C(＝O)OR6、(CH2)mNR6S(O)2R7或C(＝O)NR6R7；
在每次出现时，R6和R7独立地为氢、烷基、卤代烷基、环烷基或芳基烷基；
L1为直接键、-CR8aR8b-、-S(O)t-、NR8c或-O-；
R8a和R8b各自独立地为氢、烷基，或者R8a和R8b连同它们与之连接的碳一起，形成任选取代的3-6元环烷基；
R8c为氢、烷基、卤代烷基、(C＝O)烷基、(C＝O)O烷基、(C＝O)环烷基、(C＝O)O环烷基、(C＝O)芳基、(C＝O)O芳基、(C＝O)杂芳基、(C＝O)O杂芳基、(C＝O)杂环基、(C＝O)O杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的环烷基烷基、或者取代或未取代的杂环基烷基；
n为1或2；
m为1、2、3、4、5或6；和
t为0、1或2。
18.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是表4A、4B、4C、4D或4E的化合物。
19.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是分子量为200Da至2,000Da、250Da至2,000Da、300Da至2,000Da、300Da至1,000Da、300Da至600Da、350Da至2,000Da、350Da至1,500Da、350Da至1,200Da、350Da至1,000Da、350Da至900Da、350Da至800Da、350Da至700Da、350Da至600Da的小分子。
20.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物具有选自胍基和苄脒基的零至一个碱性基团。
21.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物具有小于约25μM、小于约10μM、小于约2.5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、或小于约0.1μM的MASP-2抑制Ki值。
22.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是其凝集素途径抑制IC50小于约50μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、或小于约0.05μM的凝集素途径抑制剂。
23.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是选择性MASP-2抑制剂，相对于凝血酶抑制，其对于MASP-2抑制的选择性为大于约2倍、大于约5倍、大于约10倍、大于约25倍、大于约50倍、或大于约100倍。
24.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物对于MASP-2具有的亲和力大于对于凝血酶的，其MASP-2:凝血酶的选择性比为至少1.1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1或30:1。
25.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物不是MASP-2的共价抑制剂。
26.段落13的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物不是内源性MASP-2配体或底物。
27.段落1至26中任一项的方法，其中将所述MASP-2抑制剂皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内、经口或作为吸入剂施用。
28.段落1至27中任一段的方法，其中所述一种或多种COVID-19有关的长期后遗症选自心血管并发症(包括心肌损伤、心肌病、心肌炎、血管内凝血、中风、静脉和动脉并发症以及肺栓塞)；神经系统并发症(包括认知困难、意识模糊、也称为“脑雾”的记忆丧失、头痛、中风、头晕、晕厥、癫痫发作、食欲减退、失眠、嗅觉丧失、味觉丧失、肌阵挛、神经性疼痛、肌痛；神经系统疾病如阿尔茨海默氏病、格巴二氏综合征、米勒-费希尔综合征、帕金森氏病)的进展；肾脏损伤(例如急性肾脏损伤(AKI))、肺部并发症(包括肺纤维化、呼吸困难、肺栓塞)；炎性病况例如川崎病、川崎样病、儿童的多系统炎症综合征、多系统器官衰竭、极度疲劳、肌无力、低烧、注意力不集中、记忆差错、情绪变化、睡眠困难、手臂和腿部的针痛、腹泻和呕吐、味觉和嗅觉丧失、喉咙痛和吞咽困难、糖尿病和高血压的新发作、皮疹、呼吸短促、胸痛和心悸。
29.根据权利要求28的方法，其中所述受试者已从COVID-19诱导的肺炎或ARDS中恢复，并且所述MASP-2抑制剂以治疗或改善一种或多种长期后遗症的量施用。
30.根据权利要求28的方法，其中所述受试者已从COVID-19诱导的凝血或血栓形成中恢复，并且所述MASP-2抑制剂以治疗或改善一种或多种长期后遗症的量施用。
V.用于治疗、抑制、减轻或预防由流感病毒感染的哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征、肺炎或者流感病毒感染的一些其它肺部表现或其它表现形式的方法
1.一种用于治疗、抑制、减轻或预防由流感病毒感染的哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征、肺炎或者流感病毒感染的一些其它肺部表现或其它表现的方法，其包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂施用于受试者。
2.段落1的方法，其中所述流感病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。
3.段落2的方法，其中甲型流感病毒选自H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9和H6N1。
4.段落1至3中任一项的方法，其中在所述MASP-2抑制剂施用之前，所述受试者被鉴定为具有流感病毒。
5，段落1至4中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制剂以有效改善呼吸功能的量施用。
6.段落1至5中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。
7.段落6的方法，其中所述MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。
8.段落6或7的方法，其中所述MASP-2抗体或其片段与包含SEQ ID NO:6的多肽特异性结合，其中亲和力是其与补体系统中不同抗原结合的至少10倍。
9.段落6至8中任一项的方法，其中所述抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
10.段落6至9中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体选择性地抑制凝集素途径补体活化，而基本上不抑制C1q依赖性补体活化。
11.段落6至10中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制10％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
12.段落6至10中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制90％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
13.段落6至12中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
14.段落6至13中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:67的重链可变区和包含SEQ ID NO:69的轻链可变区。
15.段落1至5中任一项的方法，其中所述MASP-2抑制剂是小分子MASP-2抑制性化合物。
16.段落15的方法，其中所述MASP-2抑制性化合物是合成或半合成的小分子。
17.段落1的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2的表达抑制剂。
18.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(III)、(IV)、(VA)、(VB)、(VIA)、(VB)、(VIIA)或(VIIB)中任一个的化合物。
19.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是具有下述结构的化合物：
或者其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，其中：
代表双键或单键；
R1为取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R2为氢、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟烷基、卤代烷氧基或环烷基；
R3为氢、烷基、卤代烷基或环烷基，或者R2和R3连同它们各自与之连接的碳和氮一起形成任选取代的4-7元杂环基；
R4为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或者取代或未取代的杂环基；
R5为氢、烷基、卤代烷基、环烷基、膦烷基、(CH2)mC(＝O)OR6、C(＝O)R6、C(＝O)OR6、(CH2)mNR6S(O)2R7或C(＝O)NR6R7；
在每次出现时，R6和R7独立地为氢、烷基、卤代烷基、环烷基或芳基烷基；
L1为直接键、-CR8aR8b-、-S(O)t-、NR8c或-O-；
R8a和R8b各自独立地为氢、烷基，或者R8a和R8b连同它们与之连接的碳一起，形成任选取代的3-6元环烷基；
R8c为氢、烷基、卤代烷基、(C＝O)烷基、(C＝O)O烷基、(C＝O)环烷基、(C＝O)O环烷基、(C＝O)芳基、(C＝O)O芳基、(C＝O)杂芳基、(C＝O)O杂芳基、(C＝O)杂环基、(C＝O)O杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的环烷基烷基、或者取代或未取代的杂环基烷基；
n为1或2；
m为1、2、3、4、5或6；和
t为0、1或2。
20.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是表4A、4B、4C、4D或4E的化合物。
21.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是分子量为200Da至2,000Da、250Da至2,000Da、300Da至2,000Da、300Da至1,000Da、300Da至600Da、350Da至2,000Da、350Da至1,500Da、350Da至1,200Da、350Da至1,000Da、350Da至900Da、350Da至800Da、350Da至700Da、350Da至600Da的小分子。
22.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物具有选自胍基和苄脒基的零至一个碱性基团。
23.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物具有小于约25μM、小于约10μM、小于约2.5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、或小于约0.1μM的MASP-2抑制Ki值。
24.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是其凝集素途径抑制IC50小于约50μM、小于约5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、或小于约0.05μM的凝集素途径抑制剂。
25.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物是选择性MASP-2抑制剂，相对于凝血酶抑制，其对于MASP-2抑制的选择性为大于约2倍、大于约5倍、大于约10倍、大于约25倍、大于约50倍、或大于约100倍。
26.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物对于MASP-2具有的亲和力大于对于凝血酶的，其MASP-2:凝血酶的选择性比为至少1.1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1或30:1。
27.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物不是MASP-2的共价抑制剂。
28.段落15的方法，其中所述小分子MASP-2抑制性化合物不是内源性MASP-2配体或底物。
29.段落1至28中任一项的方法，其中将所述MASP-2抑制剂皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内、经口或作为吸入剂施用。
本说明书中提到的所有出版物、专利申请和专利都引入本文作为参考。
本发明的所述方法和组合物的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的，而不脱离本发明的范围和精神。尽管已与具体的期望的实施方案结合描述了本发明，但应当理解，请求保护的本发明不应不适当地限于此类具体实施方案。
尽管已示出且描述了说明性实施方案，但应当理解，可以在其中制备各种改变，而不脱离本发明的精神和范围。

Claims (14)

1.包含有效抑制MASP-2依赖性补体活化的MASP-2抑制剂的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、抑制、减轻或预防感染流感病毒的哺乳动物受试者的急性呼吸窘迫综合征、肺炎或者流感病毒感染的一些其它肺部表现。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述流感病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。
3.根据权利要求2所述的用途，其中甲型流感病毒选自H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9和H6N1。
4.根据权利要求1所述的用途，其中在所述MASP-2抑制剂施用之前，所述受试者被鉴定为具有流感病毒。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述MASP-2抑制剂以有效改善呼吸功能的量施用。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述MASP-2抑制剂是与SEQ ID NO:6的一部分特异性结合的MASP-2单克隆抗体或其片段。
8.根据权利要求6所述的用途，其中所述MASP-2抗体或其片段与包含SEQ ID NO:6的多肽特异性结合，其中亲和力是其与补体系统中不同抗原结合的至少10倍。
9.根据权利要求6所述的用途，其中所述抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
10.根据权利要求6所述的用途，其中所述MASP-2抑制性抗体选择性地抑制凝集素途径补体活化，而基本上不抑制C1q依赖性补体活化。
11.根据权利要求6所述的用途，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制10％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
12.根据权利要求6至10中任一项所述的用途，其中所述MASP-2抑制性抗体抑制90％人血清中的C3b沉积，其中IC50为30nM或更小。
13.根据权利要求6所述的用途，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
14.根据权利要求6所述的用途，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:67的重链可变区和包含SEQ ID NO:69的轻链可变区。
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