CN118318153A - 预测对免疫治疗的响应的方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了预测对象对免疫治疗的响应的方法，该方法包括：(a)对置于衬底上的生物样本进行染色；(b)对生物样本进行成像，其中生成高倍视野(HPF)的一个或多个图像；(c)检测生物样本中的多种生物标志物；以及(d)分析一个或多个图像，从而预测对象对免疫治疗的响应。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年6月9日提交的美国临时专利申请号63/208,829的优先权。该在先申请的公开内容被认为是本申请公开的一部分，并且其全部内容并入本申请中。
技术领域
本公开涉及生物技术领域，并且更具体地，涉及用于免疫治疗的基于组织的生物标志物的测定。
联邦政府资助的研究或开发
本发明是在美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的批准CA142779的资助下在政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
患有多种实体癌类型的患者在接受免疫检查点阻断剂治疗后显示出了更高的肿瘤消退率并提高了存活率。不幸的是，对于大多数癌症类型，只有不到一半的患者对抗PD-(L)1试剂有响应，因此开发能够精确指导每位患者的疗法的预测性生物标志物至关重要。治疗前肿瘤活检中的PD-L1免疫组织化学(IHC)是一种常见的用于预测对抗PD-(L)1的响应(具有许多伴随诊断适应症)的基于组织的生物标志物方法；然而，其作为单个标志物的表达具有有限的预测能力。其他方法还可包括评估微卫星不稳定性、测试肿瘤突变负荷、检测干扰素(IFN)-γ基因标志(gene signature)以及通过多重免疫荧光(mIF)/IHC定量多种蛋白质。在最近的一项荟萃分析中，mIF/IHC证明，在预测抗PD-(L)1响应时，mIF/IHC的诊断性能优于其他基于组织的方法，凸显了这些新兴技术的生物标志物潜力。
发明内容
本公开基于这样的发现：预测对象对本文所述的免疫治疗的响应可以通过使用免疫荧光和/或免疫组织化学方法在固定的肿瘤样本中同时检测作为免疫细胞类型和功能的标志物的多种蛋白质以及肿瘤细胞标志物来确定。该方法具体分析这些标志物中的某些标志物的表达水平以及个体细胞上标志物的共表达。不希望受任何理论的束缚，已发现生物样本中的生物标志物的分析可用于预测对象对免疫治疗的响应。
本文提供了预测对象对免疫治疗的响应的方法，该方法包括：(a)对置于衬底上的生物样本进行染色；(b)对生物样本进行成像，其中生成高倍视野(HPF)的一个或多个图像；(c)检测生物样本中的多种生物标志物；以及(d)分析一个或多个图像，从而预测对象对免疫治疗的响应。
本文还提供了对对象进行分层并将所述对象归入治疗类别中的方法，该方法包括：(a)对置于衬底上的生物样本进行染色；(b)对生物样本进行成像，其中生成高倍视野(HPF)的一个或多个图像；(c)检测生物样本中的多种生物标志物；以及(d)分析一个或多个图像，从而对对象进行分层并将所述对象归入治疗类别中。
在一些实施例中，多种生物标志物包括PD-1、PD-L1、CD8、FoxP3、CD163、肿瘤细胞标志物或其任何组合。在一些实施例中，肿瘤细胞标志物包括Sox10、S100或两者。
在一些实施例中，染色包括免疫荧光染色。在一些实施例中，染色包括免疫组织化学染色。在一些实施例中，生物样本用抗体染色。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体是多克隆抗体。在一些实施例中，生物样本用一种或多种抗体染色。在一些实施例中，生物样本用六种抗体染色。在一些实施例中，生物样本用四种抗体染色。在一些实施例中，生物样本用检测抗体的第二抗体染色。在一些实施例中，第二抗体与标记缀合。在一些实施例中，标记是可检测标记。在一些实施例中，标记是荧光团。在一些实施例中，成像步骤(c)包括对生物样本进行免疫荧光显微镜检查。
在一些实施例中，分析步骤(d)包括：(i)图像采集与处理；(ii)细胞分割和表型分析；以及(iii)图像归一化。在一些实施例中，图像采集的步骤包括编译一个或多个图像以采集衬底内整个生物样本的图像。在一些实施例中，编译包括将一个或多个图像重叠对准。
在一些实施例中，细胞分割和表型分析的步骤包括鉴定生物样本中的细胞类型。在一些实施例中，表型分析的步骤包括检测细胞类型中生物标志物中的至少一种生物标志物的表达。在一些实施例中，至少一种生物标志物的表达被认定为低、中或高。在一些实施例中，细胞类型包括CD163+巨噬细胞、CD8+T细胞、Treg细胞(CD8negFoxP3+)、肿瘤细胞、CD8+FoxP3+细胞或其任何组合。在一些实施例中，细胞类型CD8+FoxP3+PD-1low/mid被认定为对象将对免疫治疗作出响应的指标。在一些实施例中，细胞类型CD163+PD-L1 neg被认定为对象将不会对免疫治疗作出响应的指标，其程度与被认定为不具有细胞类型CD163+PD-L1neg的参考对象相同。
在一些实施例中，细胞分割和表型分析的步骤进一步包括确定生物样本中细胞类型的密度。在一些实施例中，生物样本中细胞类型的密度通过分析细胞与另一细胞之间的距离来确定。在一些实施例中，生物样本中细胞类型的密度通过分析细胞与肿瘤-基质边界之间的距离来确定。在一些实施例中，高密度的CD8+FoxP3+细胞被认定为对象将对免疫治疗作出响应的指标。
在一些实施例中，图像归一化的步骤包括对照组织微阵列校准一个或多个图像中的生物标志物中的至少一种生物标志物的荧光强度。
在一些实施例中，分析步骤(c)还包括鉴定来自患有疾病的对象的生物样本中的至少一种生物标志物，并且其中至少一种生物标志物的鉴定用于预测对象对免疫治疗的响应和/或对对象进行分层并将对象归入治疗类别中。在一些实施例中，疾病是癌症。在一些实施例中，癌症是转移性实体瘤。在一些实施例中，癌症是黑色素瘤。在一些实施例中，癌症是非小细胞肺癌。在一些实施例中，癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠癌、头颈癌、血液癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。
在一些实施例中，免疫治疗包括施用免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，治疗类别包括放射治疗、化学治疗、免疫治疗、激素治疗、抗体治疗或其任何组合。
在一些实施例中，衬底是载玻片。在一些实施例中，生物样本包括组织、组织切片、器官、生物体、类器官或细胞培养物样本。在一些实施例中，组织是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。在一些实施例中，在步骤(a)之前固定生物样本。在一些实施例中，生物样本用甲醛固定。在一些实施例中，生物样本用甲醇固定。
本文还提供提高生物标志物的预测价值的方法，该方法包括：(a)获得从生物样本生成的高倍视野(HPF)的多个图像；(b)检测多个图像中的每个图像中的生物标志物；(c)从步骤(a)的多个图像中选择子多个图像；以及(d)分析子多个图像，从而提高生物标志物的预测价值。
在一些实施例中，方法还包括生成ROC(接受者操作特征)曲线下面积值，该ROC(接受者操作特征)曲线下面积值大于当分析所有图像时生成的ROC(接受者操作特征)曲线下面积值。
在一些实施例中，生物标志物包括PD-1、PD-L1、CD8、FoxP3、CD163、肿瘤细胞标志物或其任何组合。在一些实施例中，肿瘤细胞标志物包括Sox10、S100或两者。
在一些实施例中，子多个图像是步骤(a)的多个图像的30％。在一些实施例中，获得步骤(a)包括对生物样本进行免疫荧光显微镜检查。
在一些实施例中，分析步骤(d)包括：(i)图像采集与处理；(ii)细胞分割和表型分析；以及(iii)图像归一化。在一些实施例中，图像采集的步骤包括编译高倍视野(HPF)的多个图像以采集整个生物样本的图像。在一些实施例中，编译包括将多个图像重叠对准。
在一些实施例中，细胞分割和表型分析的步骤包括鉴定生物样本中的细胞类型。在一些实施例中，表型分析的步骤包括检测细胞类型中生物标志物的表达。在一些实施例中，生物标志物的表达被认定为低、中或高。在一些实施例中，细胞类型包括CD163+巨噬细胞、CD8+T细胞、Treg细胞(CD8negFoxP3+)、肿瘤细胞、CD8+FoxP3+细胞或其任何组合。在一些实施例中，细胞类型CD8+FoxP3+PD-1low/mid被认定为对象将对免疫治疗作出响应的指标。在一些实施例中，细胞类型CD163+PD-L1 neg被认定为对象将不会对免疫治疗作出响应的指标，其程度与被认定为不具有细胞类型CD163+PD-L1 neg的参考对象相同。
在一些实施例中，细胞分割和表型分析的步骤进一步包括确定生物样本中细胞类型的密度。在一些实施例中，生物样本中细胞类型的密度通过分析细胞与另一细胞之间的距离来确定。在一些实施例中，生物样本中细胞类型的密度通过分析细胞与肿瘤-基质边界之间的距离来确定。在一些实施例中，高密度的CD8+FoxP3+细胞被认定为对象将对免疫治疗作出响应的指标。
在一些实施例中，图像归一化的步骤包括对照组织微阵列校准多个图像中的生物标志物的荧光强度。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有如本发明所属的领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些方法或材料相似或等同的方法和材料都可以用于实践本发明，但本文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入。在有矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而非旨在限制。
本发明的一个或多个实施例的细节在附图和下面的描述中阐述。从说明书和附图以及权利要求中，本发明的其他特征、目的和优点将变得显而易见。
附图说明
图1显示了用于染色优化和图像处理以生成高质量数据集的AstroPath平台的示例性示意图。使用用于表征PD-1和PD-L1表达(PD-1、PD-L1、CD163、FoxP3、CD8、Sox10/S100、DAPI)的6重检测的优化来详述多重IF的基于TSA的AstroPath工作流程以及成像和相关数据使用。概述了常见限制和错误来源的解决方案。
图2A-2E显示了使用显色IHC对染色进行优化以实现高灵敏度和特异性。图2A显示了用于告知TSA荧光团-标志物配对的染色指数(SI)和渗色(BT)倾向。图2B显示了与显色IHC相比IF染色的灵敏度，其中当使用制造商推荐的方案时，PD-1、PD-L1和FoxP3中的原始信号降低。通过更换二抗提高了灵敏度。图2C显示了随后进行一抗稀释以优化信噪(S/N)比的图，其中表明1:100是CD8 IF染色的最佳稀释度。图2D显示了每种TSA荧光团的最佳浓度。仅考虑与显色IHC(浅灰色条)具有同等信号的稀释度，以确保测定的灵敏度。为了最大限度地减少通道之间的BT，为标志物(例如CD8/540)选择了可接受的最低TSA浓度。然而，当荧光团-标志物配对倾向于接受BT时，选择可接受的最高TSA浓度以提高真阳性阈值(例如，FoxP3/570)。图2E显示了多重IF中对每个标志物的检测与其各自的单重IF的比较，用于最终验证，从而确认等效性。
图3A-3C显示了利用天文学的经验教训在视野采集和压合整个载玻片期间仪器误差的最小化。图3A显示了使用HPF捕获的整个感兴趣组织的图像，如低倍率图像和高倍率图像中所示，重叠率为20％(每个病例平均采集1300个视野)。图3B显示了图像，其中发现每个HPF具有仪器成像误差，包括透镜畸变和视野照明的变化。图3C显示了重叠图像区域中的像素，对其进行比较以确定视野对准误差。为了改善对准，使用基于spring的模型来最小化像素偏移。错位误差从x方向上的+/-3像素和y方向上的+/-5像素减少到在x和y方向上都小于+/-1像素(报告的范围为第95至第5百分位)。照明变化也减少了，从11.2％变幅到1.2％变幅。
图4A-4B显示了免疫细胞群和原位标志物表达随位置的不同而变化。图4A显示了代表性mIF图像，其显示了肿瘤边缘处的热点，其中显示PD-1low表达的T细胞与具有PD-L1high表达的细胞相邻。在肿瘤实质内，观察到PD-1high和PD-1mid表达的细胞，与PD-L1low表达的细胞相邻，这与更耗竭的T细胞表型一致。包括队列中所有病例的直方图显示出，展示PD-1的CD8+细胞的细胞密度随距肿瘤边界距离的变化而变化。随着T细胞暴露于肿瘤抗原，PD-1表达强度增加。图4B显示了转移性黑色素瘤沉积物的代表性图像，其显示了CD8+FoxP3+细胞在密集CD8+PD-1neg和CD8+PD-1+细胞浸润区域中的定位，其邻近于表现出肿瘤所致的适应性(IFN-γ驱动的)PD-L1表达的肿瘤细胞。包括队列中所有病例的直方图显示CD8+FoxP3+细胞最有可能位于CD8+PD-1neg细胞附近。与肿瘤-基质边界处于相同相对位置的其他细胞类型包括CD8+PD-1+细胞和PD-L1+肿瘤细胞。
图5A-5B显示了使用两种不同的载玻片采样策略的对治疗的响应的AUC热图，对治疗的响应随表达PD-1/L1的各种免疫细胞类型和PD-1/L1表达强度的变化而变化。图5A显示了PD-1/PD-L1 mIF测定与热点HPF选择结合，显示CD8+FoxP3+PD-1low/mid、Tumor PD-L1neg和CD163+PD-L1neg细胞的密度对于预测抗PD-1响应和无响应具有最高的个体特征价值。黑色素瘤中大约86％的CD8-FoxP3-PD-1pos细胞代表传统的CD4T细胞。图5B示出了使用代表性视野采样的类似表征，其中突出显示了与治疗响应相关的类似关键特征。然而，使用这种方法得到的AUC，特别是CD8+细胞亚群，没有那么高。这一发现强调了这样一个事实：载玻片采样是测定性能的另一个组成部分。它也是可以优化和标准化的要素。TumorPD-L1neg和CD163+PD-L1neg是负相关特征，所有其他特征都是正相关特征。
图6A-6D显示了6重mIF测定的多因素分析，重点是用于预测客观响应和长期存活的PD-1和PD-L1强度。图6A是通过30％热点HPF的单变量分析显示了与治疗响应相关的十个特征的表格。特征按预测值的降序排列。图6B显示了组合ROC曲线，针对发现队列以及第二独立队列中这10个特征评估了相应的AUC值。图6C显示了来自患者的TME，其中不良预后的特征是高密度的肿瘤细胞和缺乏PD-L1表达的CD163+细胞，无论是否存在其他免疫细胞(左图)。具有中等预后的患者的TME具有低水平(中图)免疫浸润，并且不富含CD163+PD-L1neg骨髓。预后最好的患者具有高度发炎的TME，例如表达不同水平的PD-1和PD-L1的CD8+和CD8+FoxP3+T细胞(右图)。PD-L1表达在CD163+细胞上也很明显。图6D显示了图表，其中由显示不同水平的PD-1和PD-L1的特定细胞类型定义的不同TME将患者分层为在发现队列中总存活期(OS)和无进展存活期(PFS)较差、中等和良好的那些，Kaplan-Meier分析。使用来自不同机构的独立验证队列实现了类似的对患者结局的分层(OS，p＝0.036；PFS，p＝0.024，对数秩检验)。
图7A-7C显示了酪酰胺信号放大(TSA)技术的示例性示意图，该技术可用于放大信号并使单个载玻片上的多个标志物可视化。图7A是示例性示意图，显示了与使用荧光团标记的二抗进行染色相比，TSA检测允许更大的信号放大(～1000倍)。这种能力可归因于酶催化反应使多个TSA荧光团分子沉积。图7B显示了可以分为三个阶段的多重染色过程：载玻片准备、顺序染色和最终处理。图7C示出了示例性示意图，其示出了在连续染色阶段中，微波处理(MWT)剥离来自之前的染色轮次的抗体，同时保留沉积的TSA荧光团，因为其与组织的结合更强。可以对多个标志物重复染色过程，而不会产生任何交叉反应。
图8显示了使用Vectra 3.0系统进行的多光谱图像采集，该系统允许同时可视化六个感兴趣通道加DAPI。汞卤素灯发出的光被波长横跨可见光谱的五个激发立方体接收。接下来，液晶可调谐滤光器接收光线，该滤光器允许特定波长通过，每一个波长形成单独的单色图像平面。然后使用每个荧光团的纯光谱库对所得图像进行离析。然后对每个荧光团的各个图像进行伪彩色处理并叠加以形成合成图像。然后使用inFormTM软件进一步处理离析的图像。
图9A-9B显示TSA荧光团的染色指数(SI)和渗色(BT)的表征。图9A显示SI是对于量化免疫荧光试剂的亮度有用的信号背景度量(signal to background metric)。荧光团540和620分别具有最低和最高的SI。具有较低SI的TSA荧光团与更丰富的标志物配对，例如，CD8(一种丰富的强抗原)与Opal 540(一种具有低SI的荧光团)配对。图9B示出了BT可以是对由于来自不同通道的溢出而导致的通道中的假阳性信号的检测。当以1:50稀释度使用时，对每种荧光团的BT倾向都进行了表征。左上：绘制了每个可能的TSA荧光团-TSA荧光团配对的归一化荧光强度的对数。如图所示，拟合了参数化双曲正弦曲线。右上：表格显示从每个通道到另一个通道的BT倾向，即参数化双曲正弦函数中的A*a。荧光团之间最显著的BT从高到低排列为：540至570、650至620、520至570、540至620和540至520。左下：低BT和高BT的示例。右下：显微照片中显示了代表性的540至570BT，其中在570(FoxP3)通道中看到来自CD8细胞的膜信号(真正的FoxP3染色是细胞核)。通过在图优化的后续步骤中稀释TSA荧光团，进一步降低BT的倾向。
图10A-10B显示需要一抗优化以最大化IF染色特异性，使用显色IHC作为黄金标准。选择合适的HRP缀合聚合物后，进行一抗稀释以优化信噪(S/N)比，即特异性。图10A显示了CD8单重IF染色的代表性图，表明1:100是具有最佳S/N比的稀释度。三种不同的信号量化方法之间存在一致性。图10B显示了，当适当的HRP缀合聚合物与最佳一抗浓度配对时，单重IF产生与显色IHC等效的信号。
图11A-11B显示单重IF和多重IF染色的比较。图11A显示了条形图，显示出当如本文详述优化时，多重IF产生与单重IF相同百分比的阳性细胞。图11B显示，在多重IF形式中，表位的可用动态范围平均减少了13％。每个点代表单个HPF的阳性细胞平均归一化荧光强度的第95个百分位和第5个百分位之间的差异。
图12A-12C显示了相邻块(tile)的最佳重叠是x＝块宽度和高度的20％。图12A显示重叠的图像块(以红色显示的示例)用于创建整个区域的无缝覆盖，该覆盖是从每个图像的中心矩形(蓝线，桃色阴影显示一个中心矩形)构建的。这些中心矩形形成用于分析的统计样本，并完全覆盖组织。重叠(深蓝色阴影区域)被多次观察并用于内在误差估计。图12B显示，太多的重叠就数据资源和时间方面而言是“高成本的”，而太少的重叠则无法提供足够的信息来纠正成像缺陷。估计校正中的信息内容(逆方差)分别与面积T和O成正比。在等式中，有用面积为T，代表载玻片上的组织面积，O为重叠面积。图12C示出最佳解是x＝0.2，即20％，对应于多次成像的面积(O)等于组织本身的面积(T)的情况。
图13A-13C示出了单独视野的图像处理包括针对系统照明变化的平场校正。图13A示出了平均堆叠了11,508个图像来定义跨单个HPF的图像层的平均照明变化。显示的是层13的未校正、平滑平均图像(FITC宽带滤波器，PD-L1)。图13B示出，开发并应用了平场模型，并且示出了所得的平滑的、校正的平均图像。图13C示出了未校正图像和校正图像之间的相对像素强度，显示照明变化一致地减少了8/9(第5-95个百分位数从11.2％减少到1.2％，平均标准偏差从3.6％减少到0.4％)。此处显示了一个代表性样本的所有图像层中相对于平均层强度的像素强度。
图14A-14C示出了使用20％重叠方法生成的图像块被拼接到绝对笛卡尔坐标系，从而创建精确到像素的一小部分而不丢失信息的整个载玻片图像。图14A示出了图像块的简单邻接可能导致大约3-6％的单元的可靠信息丢失。图14B示出了机械载物台移动中的跳跃和底层拼接算法中的不准确性如何在载玻片的x和y方向上累积的示意性可视化。无缝拼接图像块所需的x和y方向上的相对位移表示为dx和dy。结果发现，整个载玻片上的累积位移平均在x和y方向上产生20μm的误差。图14C示出了来自未校正拼接的轮廓，覆盖在使用AstroPath方法生成的图像上。未校正的整个载玻片拼接导致约80像素的偏移，相当于40μm或4个淋巴细胞的直径。当使用多个显微镜、软件分析套件和/或来自不同系统的扫描时，纠正此类错误尤其重要。当Z堆叠图像(即，将第二载玻片图像叠加在来自同一标本的第一图像的顶部)时，这种方向性的累积偏移也可能导致载玻片配准不准确。
图15A-15D显示了单标志物表型分析方法使由于大细胞的过度分割而导致的数据集中的错误最小化。图15A显示了使用单标志物方法显示出改进的细胞分割的代表性图像(红线＝细胞边界，*＝过度分裂的肿瘤核)。图15B显示了单标志物表型分析之后的合并表型输出的代表性图像(左上)，以及合并之前每个单独的单标志物表型算法的对应输出的代表性图像(底部和右部)。图15C显示通过反映“黄金标准”的单标志物方法量化的阳性细胞的数量，而多标志物方法高估了肿瘤和CD163+细胞。“黄金标准”被定义为在单重IF(即单个染色)上对每个谱系标志物进行的分割/表型分析。图15D是通过单标志物和多标志物方法测试46个标本的CD8热点中计数的细胞数来进一步表征该系统误差的表。细胞计数之间的百分比差异表明，与单标志物方法相比，多标志物方法导致肿瘤和CD163细胞的计数过量30％。
图16A-16E显示了来自定制算法的代表性输出，该算法有利于分割和表型分析性能的目视检查。图16A显示了每个视图显示约1250个单元的自定义显示。mIF图像中的每个细胞上都放置彩色点，指示谱系。此外，如果表达了PD-L1(绿色破折号)和/或PD-1(青色破折号)，则在细胞上方防止破折号。除组织可用性较少的极少数情况外，对每个标本20个视图进行了目视检查。图16B显示了对给定标本中所有HPF中的每个标志物的多达25个随机选择的阳性和阴性细胞/印记的检查。分割算法的结果以红色显示，每个对给定标志物呈阳性的细胞都标有白色“+”。使用这些印记对每个标本中至少2000个显示各标志物的细胞进行目视检查。图16C显示了没有上覆细胞分割图的另外的代表性QA/QC印记。“+”显示被算法称为阳性的每个细胞。图16D显示QA/QC印记查看器还可用于目视检查感兴趣的共表达情况。显示了CD8+FoxP3+细胞的代表性图像(FoxP3为红色；CD8为黄色)。目视检查每个样本平均200个CD8+FoxP3+细胞。图16E显示了为PD-L1+(绿色)的CD8+细胞(黄色)的三个例子。这三个图像是从三份不同的患者标本中获得的，以显示普遍性。顶行仅显示CD8通道；中间行仅显示PD-L1+通道；最下面一行显示了CD8和PD-L1通道。具体来说，底行的左侧图显示CD8+PD-L1-细胞(单个黄色星号)、CD8-PD-L1+细胞(单个绿色星号)和CD8+PD-L1+细胞(一个黄色和一个绿色星号)。DAPI也显示为蓝色。
图17A-17B显示了不同时间染色的标本的准确比较需要校正批次间的变化。图17A显示了图，其中PD-1和PD-L1表达强度的批次间变化是明显的。通过对包含扁桃体和脾脏(各n＝3)的组织微阵列载玻片进行归一化来校正该载玻片，每批都运行该载玻片。图17B显示条形图，其中9个批次的变化百分比系数对于PD-1为17％，对于PD-L1为22％，且归一化后，对于两个标志物均降低了约50％。
图18A-18B显示PD-(L)1low、PD-(L)1mid和PD-(L)1high的强度水平。图18A是显示PD-1(左)和PD-L1(右)强度截止值的直方图，其通过汇集所有PD-1pos或PD-L1pos细胞并将群体分成三分位数来定义。图18B显示显微照片(顶部为亮视野，底部为IF)，显示PD-1+群体的位置随扁桃体组织中特定区域的不同而变化(左)。PD-1high细胞主要位于亮区的生发中心T细胞，而PD-1low和Pd-1midmid细胞则位于滤泡间区。显微照片(顶部为亮视野，底部为IF)显示PD-L1+群体的位置也随扁桃体内的显微解剖位置而变化(右)。扁桃体隐窝显示PD-L1high细胞。在生发中心观察到PD-L1mid和PD-L1low细胞，还可见零散的PD-L1low滤泡周围细胞。为了mIF测定中的PD-1和PD-L1信号的测定优化，优先选择低表达和中表达的解剖区域。
图19A-19B显示整个TME中响应者与非响应者中特定细胞群的密度。分析53名患者的平均肿瘤面积为61mm2(范围5mm2–308mm2)。图19A显示，当使用市售的显色22C3 IHC测定对肿瘤细胞表达％进行评分并由病理学家使用光学显微镜进行解释时，抗PD-1的响应者和非响应者之间的PD-L1阳性细胞密度没有显著差异。PD-L1 IHC的代表性显微照片如右图所示。图19B显示整个TME中的总PD-L1+细胞密度和肿瘤细胞PD-L1+细胞密度(在AstroPath平台上使用6重mIF测定的整个载玻片分析)与响应相关，而对于CD163+PD-L1+细胞密度没有观察到显著关联。中位数+/-95％CI，单尾Mann-Whitney。右栏中显示的是以下的代表性显微照片：mIF检测的任何细胞类型上的PD-L1(顶行)、PD-L1和肿瘤(中行)以及PD-L1和CD163(底行)。
图20A显示了按细胞类型划分的黑色素瘤TME内的PD-1表达比例。使用mIF检测对TMA格式的94份存档黑色素瘤标本进行PD-1、CD8、CD4、CD20、FoxP3和肿瘤(Sox10/S100)染色。CD8+细胞为黑色素瘤TME贡献了大部分PD-1。在贡献PD-1的非CD8+细胞中，86％标记为CD4+(常规CD4+细胞为65％，CD4+FoxP3+细胞为21％)。
图20B显示代表性CD20+PD-1+细胞的显微照片。
图21A-21B显示，当应用类似的策略时，整个TME(100％采样)的分析在对患者进行分层方面不如30％采样有效。在100％TME采样时，确定了多次测试校正后AUC的p值＜0.05的特征(阳性特征：CD8+PDL1low、CD8+FoxP3+、CD8+FoxP3+PD-1low、CD8+FoxP3+PD-1mid、肿瘤PD-L1low，阴性特征：CD163+PD-L1neg和CD163+细胞)(表11)。这些特征用于生成发现队列(图21A)以及第二独立验证队列(图21B)的组合ROC曲线和Kaplan-Meier曲线。对于30％载玻片采样(图6)观察到类似的总体趋势，尽管分层不那么有效。这一发现凸显了这样一个事实：载玻片采样是检测开发中可以被优化和标准化的另一个组成部分。
图22A-22B显示了由特定细胞类型定义的TME以及通过对较小标本进行Kaplan-Meier分析得到的与长期存活的关联。纳入研究的最小肿瘤面积为5mm2。使用针对图12B定义的评分规则将载玻片上存在＜20mm2(图22A)和＞20mm2(图22B)肿瘤区域的患者分为良好、中等和不良预后。选择表面积为20mm2是因为它代表3个核心活检(每个大小为1mmx15mm)其中每个核心有约50％肿瘤的大小。
图23A-23B显示了mIF测定从6重减少到4重的结果，用于预测客观响应和分层总体存活。在指数6重测定(图6)中，CD8+子集用于预测具有良好与中等的长期结局的患者。在这里，我们测试了是否可以单独使用总CD8+细胞密度来进行这种区分，从而可能将必需标志物的数量从6个减少到4个(CD8、CD163、PD-L1、Sox10/S100)。这四个特征用于生成发现队列(图23A)和验证队列(图23B)的组合ROC曲线和Kaplan-Meier曲线。结果发现，当与负相关于响应的特征(CD163+PD-L1neg、肿瘤PD-L1neg或肿瘤细胞)的最高密度相结合时，总CD8+密度的最高三分位数可以组合起来对存活进行分层。这种方法对于预测结局不太有效，尤其是在预测客观响应方面。然而，它的优点是允许包含额外的标志物，例如可以帮助解析中等预后组患者的标志物，或者帮助从中等和不良预后类别的患者中识别TME中的因素，以帮助提供新的合理的治疗策略。
图24显示CD8+FoxP3+PD-1+细胞与用基于抗PD-1的疗法治疗的晚期非小细胞肺癌患者的客观响应强相关。采用6重mIF检测对来自n＝20名晚期疾病患者的治疗前肺癌标本进行染色，并使用高倍视野(HPF)平铺马赛克(tiled mosaic)对整个标本进行成像。
图25A-25B显示AstroPath成像方法应用于来自在晚期疾病的新辅助(neoadjvuant)背景下接受抗PD-1的非小细胞肺癌患者的治疗前标本。图25A显示该队列中的中位治疗前活检尺寸为3mm2(平均为15mm2)。图25B显示进行第二次分析以确定治疗前特征，该治疗前特征预测对治疗的病理响应程度。左图：热图显示了通过该方法识别的一些潜在细胞群及其与10％残留可存活肿瘤(rvt10，其是众多II/III期临床试验的终点)和50％残留可存活肿瘤(rvt50)的病理响应值的关联。右图：使用这种方法确定的特征可之后用于预测这些患者的存活结局(Kaplan-Meier分析)。
具体实施方式
本公开基于以下发现：多种细胞类型及其空间相互作用以及生物标志物(例如免疫调节分子)的表达水平和细胞概况的分析可用于预测对象对免疫治疗的响应。在一些实施例中，使用免疫荧光和/或免疫组织化学方法检测生物样本中的一种或多种生物标志物(例如，PD-1、PD-L1、CD8、FoxP3、CD163和肿瘤细胞标志物)可用于预测对检查点抑制剂疗法(例如，使用基于抗PD-1的疗法的检查点阻断)的响应和/或对免疫治疗后的长期存活进行分层。虽然免疫治疗(例如，免疫检查点抑制剂(ICI)疗法)通过改善总体存活率(OS)改变了癌症治疗，但人们正在努力开发预测性生物标志物，以便为最有可能受益的患者提供特异性治疗，同时为那些极不可能有响应的患者寻找替代方案。
在一些实施例中，本文提供了预测对象对免疫治疗的响应的方法，该方法包括：(a)对置于衬底上的生物样本进行染色；(b)对生物样本进行成像，其中生成高倍视野(HPF)的图像；(c)检测生物样本中的一种或多种生物标志物；以及(d)分析HPF图像，从而预测对象对免疫治疗的响应。
本文描述了这些方法的各种非限制性方面，并且可以不受限制地以任何组合使用。本文描述的方法的各个组成部分的另外的方面是本领域已知的。
如本文所用，术语“施用”通常是指将组合物施用至对象或系统以实现为组合物的试剂或包含在组合物中的试剂的递送。本领域普通技术人员将了解在适当情况下可用于向对象(例如人)施用的多种途径。例如，在一些实施例中，施用可以是经眼施用、口服施用、肠胃外施用、局部施用等。在一些具体实施例中，施用可以是支气管(例如，通过支气管滴注)、颊、皮肤(其可以是皮肤或包括皮肤，例如，局部施用至真皮、皮内、皮间、经皮等中的一种或多种)、肠内、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、特定器官内(例如肝内)、粘膜、鼻、口腔、直肠、皮下、舌下、局部、气管(例如，通过气管内滴注)、阴道、玻璃体施用等。在一些实施例中，施用可以仅涉及单剂量。在一些实施例中，施用可以涉及施加固定数量的剂量。在一些实施例中，施用可以涉及间歇(例如，时间上分开的多个剂量)给药和/或周期性(例如，由同样时间段分开的单个剂量)给药。在一些实施例中，施用可以涉及连续给药(例如，灌注)至少选定的时间段。
如本文所用，术语“抗体”是指与特定抗原特异性结合的试剂。在一些实施例中，该术语涵盖包括足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽或多肽复合物。示例性抗体试剂包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体及其片段。在一些实施例中，抗体试剂可以包括本领域已知的一种或多种序列元件，它们是人源化的、灵长类化的、嵌合的等等。在许多实施例中，术语“抗体”用于指一种或多种本领域已知的或开发的构建体或形式，用于以替代呈现方式利用抗体结构和功能特征。例如，在一些实施例中，根据本文提供的材料和方法使用的抗体的形式选自但不限于：完整的IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性抗体或多特异性抗体(例如，等)；抗体片段，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、Fd'片段、Fd片段和分离的CDR或其集合；单链Fv(scFv)；多肽-Fc融合体；单结构域抗体(例如，鲨鱼单结构域抗体，例如IgNAR或其片段)；驼峰蛋白抗体；掩蔽抗体(例如)；小型模块化免疫药物(“SMIPsTM”)；单链或串联双抗体VHH；微型抗体；锚蛋白重复蛋白或DART；TCR样抗体；MicroProtein；和在一些实施例中，抗体是这样的多肽或包含这样的多肽，该多肽的氨基酸序列包括本领域技术人员识别为免疫球蛋白可变结构域的结构元件。在一些实施例中，抗体是具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大部分同源的结合结构域的多肽蛋白。在一些实施例中，抗体是嵌合抗原受体(CAR)的至少一部分或包含嵌合抗原受体(CAR)的至少一部分。在一些实施例中，抗体是T细胞受体(TCR)或包含T细胞受体(TCR)。
如本文所用，术语“生物样本”是指从对象获得的用于使用多种技术中的任何一种进行分析的样本，所述技术包括但不限于活检、手术和激光捕获显微术(LCM)，并且通常包括细胞和/或来自对象的其他生物材料。生物样本可以从真核生物获得，例如患者来源的类器官(PDO)或患者来源的异种移植物(PDX)。生物样本可以包括类器官，其是在体外以三维方式产生的器官的微型化和简化版本，其显示出真实的微观解剖结构。可以获得生物样本的对象可以是健康的或无症状的个体、患有或疑似患有疾病(例如癌症)或易患疾病的个体、和/或需要治疗或怀疑需要治疗的个体。
生物样本可以包括一种或多种患病细胞。患病细胞的代谢特性、基因表达、蛋白质表达和/或形态特征可能发生改变。疾病的实例包括炎性病症、代谢病症、神经系统病症和癌症。癌细胞可源自实体瘤、血液恶性肿瘤、细胞系，或作为循环肿瘤细胞获得。
生物样本还可以包括免疫细胞。对此类细胞的免疫组库(包括基因组、蛋白质组和细胞表面特征)进行序列分析，可以提供丰富的信息，有助于了解免疫系统的状态和功能。生物样本中的免疫细胞的实例包括但不限于：B细胞(例如，浆细胞)、T细胞(例如，细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞和T辅助细胞)、天然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、骨髓细胞，例如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞/多分叶中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞、血小板/巨核细胞和树突细胞。
生物样本可以包括任何数量的大分子，例如细胞大分子和细胞器(例如线粒体和细胞核)。生物样本可以是核酸样本和/或蛋白质样本。生物样本可以是碳水化合物样本或脂质样本。生物样本可以以组织样本的形式获得，例如组织切片、活检、核心活检、针抽吸物或细针抽吸物。样本可以是流体样本，例如血液样本、尿液样本或唾液样本。样本可以是皮肤样本、结肠样本、面颊拭子、组织学样本、组织病理学样本、血浆或血清样本、肿瘤样本、淋巴结样本、活细胞、培养细胞、临床样本例如全血或血液衍生产品、血细胞、或培养的组织或细胞，包括细胞悬浮液。
本文所用的术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”是指这样的细胞，它们表现出相对异常、不受控制和/或自主生长，使得它们表现出异常生长表型，其特征是细胞增殖的控制显著丧失。在一些实施例中，肿瘤可以是或包含癌前期(例如良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性的细胞。本公开具体鉴定了其教导可能特别相关的某些癌症。在一些实施例中，相关癌症的特征可以是实体瘤。在一些实施例中，相关癌症的特征可以是转移性实体瘤。在一些实施例中，相关癌症的特征可以是血液肿瘤。一般而言，本领域已知的不同类型的癌症的例子包括，例如，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠癌、头颈癌、血液癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。在一些实施例中，造血系统癌症可以包括：白血病、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤和骨髓增殖性疾病；肉瘤、黑色素瘤、腺瘤、实体组织癌、口腔、咽喉、喉部和肺的鳞状细胞癌、肝癌、泌尿生殖系统癌症如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌和子宫内膜癌以及肾细胞癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑色素瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、头颈癌、乳腺癌、胃肠道癌和神经系统癌、良性病变等如乳头状瘤、癌前病变如骨髓增生异常综合征、获得性再生障碍性贫血、范可尼贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)和5q-综合征等。
本文所用的术语“治疗剂”和“化疗剂”可以指一种或多种促凋亡剂、细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂，例如具体包括用于和/或推荐用于治疗与不良细胞增殖相关的一种或多种疾病、病症或状况的药剂。在许多实施例中，化疗剂可用于治疗癌症。在一些实施例中，化疗剂可以是或包含一种或多种烷化剂、一种或多种蒽环类、一种或多种细胞骨架破坏剂(例如微管靶向剂，例如紫杉烷、美登素及其类似物)、一种或多种埃博霉素、一种或多种组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDAC)、一种或多种拓扑异构酶抑制剂(例如，拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II的抑制剂)、一种或多种激酶抑制剂、一种或多种核苷酸类似物或核苷酸前体类似物、一种或多种肽抗生素，一种或多种铂基试剂、一种或多种类维生素A、一种或多种长春花生物碱和/或以下一种或多种中的一种或多种类似物(即，具有相关的抗增殖活性)。在一些实施例中，化疗剂可以在抗体-药物缀合物的情况下使用。
如本文所用，术语“分层”是指分配治疗方案。在一些实施例中，可以将对象分层并归入治疗类别中，其中将治疗类别中的治疗方案分配给对象。在一些实施例中，对象的分层可用于前瞻性或回顾性临床研究。在一些实施例中，对象的分层可用于分配关于存活或化疗或放疗敏感性的预后或预测。在一些实施例中，分层通常基于共有的突变模式或其他观察到的特征或特征集合而将对象分配到组。在一些实施例中，治疗方案可以是抗癌治疗。在一些实施例中，治疗方案可以属于治疗类别，其中治疗类别包括抗癌治疗。在一些实施例中，治疗类别可以包括放射治疗、化学治疗、免疫治疗、激素治疗、抗体治疗或其任何组合。
如本文所使用的，术语“对象”是指生物体，通常是哺乳动物(例如，人类，在一些实施例中包括产前人类形式)。在一些实施例中，对象患有相关疾病、病症或病况。在一些实施例中，对象易患疾病、病症或病况。在一些实施例中，对象表现出疾病、病症或病况的一种或多种症状或特征。在一些实施例中，对象不表现出疾病、病症或病况的任何症状或特征。在一些实施例中，对象是具有对疾病、病症或病况的易感性或风险的一种或多种特征的某个对象。在一些实施例中，对象是患者。在一些实施例中，对象是接受和/或已经接受诊断和/或治疗的个体。
如本文所用，术语“治疗结局”是指为评估用于对抗疾病的管理和程序的结果或后果而进行的评价，以确定给予对象的治疗的功效、有效性、安全性和实用性。在一些实施例中，治疗结局的确定可以包括对象是否会对施用于对象的特定治疗作出响应。在一些实施例中，治疗结局的确定可用于将患有疾病的患者分层为具有差别治疗结局(例如，总体存活率、疾病控制率)的组。在一些实施例中，治疗结局的确定可以包括分析总体存活率、疾病控制率、心理状况的变化或身体状况(例如，组织损伤、疼痛水平)的变化。在一些实施例中，，表现出给定细胞类型(例如，CD8+T细胞、CD8+FoxP3+细胞)的对象被预测为与被鉴定为不具有该细胞类型的参照对象相比具有改善的结果(图1)。
预测对免疫治疗的响应的平台
在一些实施例中，本文提供了预测对象对免疫治疗的响应的方法，该方法包括：(a)对置于衬底上的生物样本进行染色；(b)对生物样本进行成像，其中生成高倍视野(HPF)的图像；(c)检测生物样本中的一种或多种生物标志物；以及(d)分析HPF图像，从而预测对象对免疫治疗的响应。
免疫治疗
如本文所用，“免疫治疗”是指通过活化或抑制免疫系统来治疗疾病(例如癌症)。例如，癌症免疫治疗利用免疫系统及其组件通过免疫活化来产生抗肿瘤响应。在一些实施例中，免疫治疗可以包括免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒疗法、基于细胞的疗法、CAR-T细胞疗法或癌症疫苗。在一些实施例中，免疫治疗可以包括免疫检查点阻断，其中施用免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，免疫治疗包括施用免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂。PD-1抑制剂的实例可包括但不限于：派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗、JTX-4014、斯帕他珠单抗(spartalizumab)、卡瑞利珠单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、特瑞普利单抗和多塔利单抗。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是PD-L1抑制剂。PD-L1抑制剂的实例可包括但不限于阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、KN035、CK-301、AUNP12、CA-170和BMS-986189。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂(例如，伊匹单抗、曲美木单抗)。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是与PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂组合使用的CTLA-4抑制剂。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂可以是任何检查点抑制剂，例如，如Mazzarella et al.,Eur J Cancer(2019)117:14-31中所述，其通过引用并入本文。
生物标志物
在一些实施例中，检测生物样本中的一种或多种生物标志物可用于预测对象对免疫治疗的响应。在一些实施例中，检测生物样本中的一种或多种生物标志物可用于监测对象对免疫治疗的响应。如本文所用，术语“生物标志物”是指疾病(例如癌症)状态的严重性或存在的可测量指标。在一些实施例中，生物标志物可用于帮助诊断病况(例如，识别早期癌症)。在一些实施例中，生物标志物可用于确定对象在没有治疗或疗法的情况下的总体存活率。在一些实施例中，生物标志物可以预测对象对治疗(例如，免疫治疗)的响应。在一些实施例中，可以在生物样本中检测一种或多种生物标志物。在一些实施例中，一种或多种生物标志物可包括PD-1、PD-L1、CD8、FoxP3、CD163、肿瘤细胞标志物或其任何组合。在一些实施例中，生物标志物可以包括肿瘤细胞标志物。在一些实施例中，肿瘤细胞标志物可包括AFP、BRAFV600E、S100、Sox10、细胞角蛋白、Melan-A、HMB45、波形蛋白、结蛋白、肌细胞生成素、平滑肌肌动蛋白、GFAP、突触素、嗜铬粒蛋白、CD45/LCA或其任何组合。在一些实施例中，肿瘤细胞标志物可以是Sox10和S100的组合。
多重染色
在一些实施例中，本文描述的方法包括对置于衬底上的生物样本进行染色。为了便于可视化，可以使用多种染色剂和染色技术对生物样本进行染色。在一些实施例中，可以使用任何数量的生物染色剂对生物样本进行染色，包括但不限于：吖啶橙、俾斯麦棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、DAPI、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、Hoechst染色剂、碘、甲基绿、亚甲蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、碘化丙啶、罗丹明或番红。
可以使用已知的染色技术对生物样本进行染色，包括：Can-Grunwald、Giemsa、苏木精和伊红(H&E)、Jenner's、Leishman、Masson’s trichrome、Papanicolaou、Romanowsky、银、Sudan、Wright's和/或Periodic Acid Schiff(PAS)染色技术。在一些实施例中，可以通过使用酪酰胺信号放大(TSA)技术对生物样本进行染色。在一些实施例中，可以通过使用pan膜染色剂对生物样本进行染色。在一些实施例中，可以通过使用质膜染色剂对生物样本进行染色。
在一些实施例中，染色包括免疫荧光(IF)染色。在一些实施例中，染色包括免疫组织化学(IHC)染色。在一些实施例中，可以使用可检测标记(例如，放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料)对生物样本进行染色。在一些实施例中，仅使用一种类型的染色剂或一种技术对生物样本进行染色。在一些实施例中，染色包括生物染色技术，例如H&E染色。在一些实施例中，染色包括使用荧光缀合的抗体。在一些实施例中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或者两种或更多种不同的染色技术对生物样本进行染色。例如，可以通过使用一种技术(例如，H&E染色和亮视野成像)进行染色和成像，然后使用另一种技术(例如，IHC/IF染色和荧光显微镜)对同一生物样本进行染色和成像来制备生物样本。
多重染色的方法描述于，例如，Bolognesi et al.,J.Histochem.Cytochem.2017；65(8):431-444、Lin et al.,Nat Commun.2015；6:8390、Pirici et al.,J.Histochem.Cytochem.2009；57:567–75、以及Glass et al.,J.Histochem.Cytochem.2009；57:899–905，它们的全部内容均通过引用并入本文。
在一些实施例中，生物样本用抗体染色。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体是多克隆抗体。在一些实施例中，生物样本用一种或多种抗体(例如，一种抗体、两种抗体、三种抗体、四种抗体、五种抗体、六种抗体、七种抗体、八种抗体、九种抗体、十种抗体)染色。在一些实施例中，生物样本用六种抗体染色。在一些实施例中，生物样本用四种抗体染色。在一些实施例中，生物样本用检测抗体的第二抗体染色。在一些实施例中，第二抗体与标记缀合。
在一些实施例中，标记是可检测标记。在一些实施例中，标记是荧光团。在一些实施例中，可检测标记本身可以直接被检测到(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以例如通过催化化学底物化合物或组合物的化学改变来间接检测，该化学底物化合物或组合物是可直接检测的。在一些实施例中，可检测标记可以包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料。
在一些实施例中，衬底是载玻片。在一些实施例中，生物样本包括组织、组织切片、器官、生物体、类器官或细胞培养物样本。在一些实施例中，组织是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。在一些实施例中，在染色步骤之前固定生物样本。在一些实施例中，可以使用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)来固定生物样本。在一些实施例中，可以将生物样本固定在多种其他固定剂中的任一种中，以在分析之前保存样本的生物结构。例如，可以通过浸没在乙醇、甲醇、丙酮、甲醛(例如2％甲醛)、多聚甲醛-Triton、戊二醛或其组合中来固定样本。
在一些实施例中，基于期望的工作流程来选择和/或优化兼容的固定方法。例如，可以选择甲醛固定来与使用IHC/IF方案进行蛋白质可视化的工作流程兼容。作为另一个实施例，对于强调RNA/DNA文库质量的工作流程，可以选择甲醇固定。在某些应用中可以选择丙酮固定来透化组织。在一些实施例中，生物样本用甲醛固定。在一些实施例中，生物样本用甲醇固定。
图像分析与处理
在一些实施例中，本文描述的方法还包括对置于衬底上的生物样本进行成像，其中生成了高倍视野(HPF)的图像。如本文所用，“高倍视野(HPF)”是指在显微镜的高放大倍数下观察载玻片的区域。在一些实施例中，成像步骤可以生成一个或多个HPF。在一些实施例中，成像步骤可以生成多达约5000个(例如，约4500个、约4000个、约3500个、约3000个、约2500个、约2000个、约1500个、约1400个、约1300个、约1200个、约1100个、约1000个、约900个、约800个、约700个、约600个、约500个、约400个、约300个、约200个、约100个、约50个、约40个、约30个、约20个、约10个、约5个、约4个、约3个，或约2个)HPF。在一些实施例中，成像步骤包括对生物样本进行免疫荧光显微镜检查。
在一些实施例中，本文提供了提高生物标志物的预测价值的方法，包括：(a)获得从生物样本生成的高倍视野(HPF)的多个图像；(b)检测多个图像中的每个图像中的生物标志物；(c)从步骤(a)的多个图像中选择子多个图像；(d)分析子多个图像；以及(e)生成比分析所有图像时生成的曲线下面积值更大的曲线下面积值，从而提高生物标志物的预测价值。在一些实施例中，子多个图像可以是多个图像的约30％(例如，约5％、约10％、约20％、约40％或约50％)。在一些实施例中，子多个图像可以高达多个图像的100％(例如，高达5％、高达10％、高达20％、高达30％、高达40％、高达50％、高达60％、高达70％、高达80％或高达90％)。
在一些实施例中，本文描述的方法的分析步骤还可以包括：(i)图像采集与处理；(ii)细胞分割和表型分析；以及(iii)图像归一化。用于分析和处理生物样本的图像的方法例如在PCT申请号WO2020/061327和美国专利申请号17/278112中描述，每个的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，该方法可以包括通过装置来获得标本的多个视野图像。在一些实施例中，多个视野图像可以由显微镜捕获。在一些实施例中，该方法可以包括通过该装置处理多个视野图像以导出多个经处理的视野图像。在一些实施例中，处理可以包括对多个视野图像应用空间畸变校正和基于照明的校正，以解决多个视野图像中的一个或多个视野图像中的缺陷。在一些实施例中，该方法可以包括：通过该装置在多个经处理的视野图像中的每个经处理的视野图像中识别包括对细胞表征或亚细胞特征的表征有用的数据的主要区域；通过该装置识别区域多个经处理的视野图像中的重叠区域；以及通过该装置导出关于标本的一个或多个细胞的空间映射的信息。在一些实施例中，导出信息可以基于：通过该装置基于多个经处理的视野图像中的每个经处理的视野图像的主要区域中包括的数据来执行图像分割，以及通过该装置基于重叠区域中包含的其他数据来获得通量测量结果。在一些实施例中，该方法可以包括通过该装置并基于该信息引起要执行的动作，该动作涉及识别与正常组织、疾病的诊断或预后、或用于选择治疗的因素相关的特征。
在一些实施例中，装置可以包括一个或多个存储器、以及通信地耦合到该一个或多个存储器的一个或多个处理器，该一个或多个处理器配置为获得组织样本的多个视野图像。在一些实施例中，多个视野图像可以由显微镜捕获。在一些实施例中，一个或多个处理器可以配置为：对多个视野图像应用空间畸变校正和基于照明的校正以导出多个经处理的视野图像；在多个经处理的视野图像中的每个经处理的视野图像中识别包括对细胞表征有用的数据的主要区域；在多个经处理的视野图像中识别彼此重叠的区域；以及导出关于组织样本的一个或多个细胞的空间映射的信息。在一些实施例中，一个或多个处理器在导出信息时可以配置为基于多个经处理的视野图像中的每个经处理的视野图像的主要区域中包括的数据在亚细胞水平、细胞水平或组织水平上执行分割，以及基于彼此重叠的区域中包括的其他数据获得通量测量结果，并且使信息加载到数据结构中以使得能够对空间映射进行统计分析以识别用于免疫治疗的预测因素。
在一些实施例中，非暂态计算机可读介质可以存储指令。在一些实施例中，指令可以包括一个或多个指令，当由一个或多个处理器执行时，该一个或多个指令使一个或多个处理器：获得组织样本的多个视野图像；对多个视野图像应用空间畸变校正和/或基于照明的校正以导出多个经处理的视野图像；在多个经处理的视野图像中的每个经处理的视野图像中识别包括对细胞表征有用的数据的主要区域；在多个经处理的视野图像中识别彼此重叠的区域；以及导出关于组织样本的一个或多个细胞或亚细胞成分的空间分辨率信息。在一些实施例中，一个或多个指令：使一个或多个处理器导出空间分辨率信息；使一个或多个处理器基于多个已处理的视野图像中的每个已处理的视野图像的主要区域中包括的数据来执行图像分割；以及基于在彼此重叠的区域中包括的其他数据来获得通量测量结果。在一些实施例中，当由一个或多个处理器执行时，一个或多个指令可以使一个或多个处理器：使数据结构被填充有空间分辨率信息，以实现对识别一种或多种疾病或相关疗法的预测因素、预后因素或诊断因素有用的统计分析。
在一些实施例中，图像采集的步骤包括编译多个HPF图像以采集衬底内整个生物样本的图像。在一些实施例中，图像采集的步骤包括编译多个HPF图像以采集生物样本的一部分的图像。在一些实施例中，多个HPF图像来自同一肿瘤。在一些实施例中，多个HPF图像来自不同的肿瘤。在一些实施例中，多个HPF图像是从同一显微镜生成的。在一些实施例中，多个HPF图像是从不同的显微镜生成的。在一些实施例中，多个HPF图像由来自显色IHC载玻片的扫描的成像数据生成。在一些实施例中，多个HPF图像由来自基于组织的质谱法的成像数据生成。在一些实施例中，多个HPF图像由来自用于基因组和转录组分析的收获空间分辨单细胞的成像数据生成。在一些实施例中，根据图像中的特征对多个HPF图像进行排序/排名。在一些实施例中，特征可以是生物标志物的表达。在一些实施例中，特征可以是CD8标志物的表达。在一些实施例中，特征可以是CD163细胞、FoxP3细胞、CD163 PD-Llneg细胞、肿瘤细胞、肿瘤PD-Ll+mid细胞、FoxP3CD8PD-l+low细胞、FoxP3PD-llow+PD-Ll+细胞、FoxP3CD8 PD-LI+mid细胞、其他细胞PD-llow+、PDLI+细胞、FoxP3CD8+PD-l+mid细胞、CD163 PD-LI+细胞或其任何组合。
在一些实施例中，编译包括将多个HPF图像重叠对准。在一些实施方式中，多个HPF图像中的每个HPF图像可以与相邻图像重叠约20％(例如，约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％或约30％)。在一些实施例中，多个HPF图像中的每个HPF图像可以与相邻图像重叠高达100％(例如，高达10％，高达20％，高达30％，高达40％，高达50％，高达60％，高达70％，高达80％，或高达90％)。
在一些实施例中，细胞分割和表型分析的步骤包括鉴定生物样本中的细胞类型。在一些实施例中，可以通过描绘较大细胞的膜与突出显示的较小淋巴细胞分开来进行细胞分割。在一些实施例中，表型分析步骤包括检测细胞类型中生物标志物中的至少一种生物标志物的表达。在一些实施例中，至少一种生物标志物的表达被认定为低、中或高。在一些实施例中，表型分析可包括检测单个生物标志物的表达，其中细胞被认定为单个生物标志物的低、中或高的状态。在一些实施例中，表型分析可以包括检测多个生物标志物的表达，其中来自单个生物标志物的各个表型被合并以确定具有多个生物标志物的细胞表型。在一些实施例中，表型分析可以包括检测PD-1的表达。在一些实施例中，表型分析可以包括检测PD-L1的表达(图4A)。在一些实施例中，细胞类型包括CD163+巨噬细胞、CD8+T细胞、Treg细胞(CD8negFoxP3+)、肿瘤细胞、CD8+FoxP3+细胞或其任何组合。在一些实施例中，细胞类型被确定为生物标志物阴性，其中生物标志物在细胞中不表达。在一些实施例中，细胞类型CD8+FoxP3+PD-1low/mid被认定为对象将对免疫治疗作出响应的指标。在一些实施例中，细胞类型CD163+PD-L1neg被认定为对象将不会对免疫治疗作出响应的指标，其程度与被认定为不具有细胞类型CD163+PD-L1neg的参考对象相同。
在一些实施例中，细胞分割和表型分析的步骤进一步包括确定生物样本中细胞类型的密度。在一些实施例中，细胞类型的密度可以用作对象对免疫治疗的响应的指标。在一些实施例中，总PD-L1+细胞和肿瘤PD-L1+细胞的密度可以被认定为对免疫治疗的响应的指标。在一些实施例中，CD163+PD-L1+细胞的密度与对免疫治疗的响应不相关。在一些实施例中，高密度的CD8+FoxP3+细胞被认定为对象将对免疫治疗作出响应的指标。
在一些实施例中，图像归一化的步骤包括对照组织微阵列校准多个HPF图像中的生物标志物中的至少一种生物标志物的荧光强度。在一些实施例中，图像归一化包括校准PD-1强度的荧光强度。在一些实施例中，图像归一化包括校准PD-L1强度的荧光强度。
在一些实施例中，分析步骤还包括鉴定来自患有疾病的对象的生物样本中的至少一种生物标志物，并且其中至少一种生物标志物的鉴定用于预测对象对免疫治疗的响应。
实施例
在以下实施例中进一步描述本公开，这些实施例并不限制权利要求中描述的本公开的范围。
实施例1-案例选择
对扁桃体和黑色素瘤的存档福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片进行mIF测定的染色优化。在指数mIF测定(PD-1、PD-L1、CD8、FoxP3、CD163、S100/Sox10)得到优化后，对来自53名继续接受基于抗PD-1的治疗的转移性黑色素瘤患者的治疗前FFPE肿瘤标本的发现队列进行了回顾性分析。34名患者接受抗PD-1单药治疗(纳武单抗或派姆单抗)，19名患者接受双重抗PD-1/CTLA-4阻断治疗(纳武单抗和伊匹单抗)。根据RECIST 1.1标准，将患者分为响应者(完全响应或部分响应)或非响应者。还确定了5年总体存活率和无进展存活率信息。还收集了该队列的其他临床病理特征，例如年龄、性别和疾病阶段，表1。选择单个代表性FFPE块进行mIF染色。还对这些标本进行了PD-L1 IHC伴随诊断测定(22C3)。还研究了来自45名转移性黑色素瘤患者的治疗前FFPE肿瘤标本的独立验证队列，表2。将优化的6重mIF测定应用于这些标本，并与客观响应和长期存活相关。发现队列和验证队列的病例均由委员会认证的皮肤病理学家进行审查，以确认对黑色素瘤的诊断。载玻片上肿瘤小于5mm的病例、具有广泛坏死或折叠组织的病例或纯促结缔织增生组织学亚型的病例被排除在分析之外。
用第二mIF测定(PD-1、CD8、CD4、CD20、FoxP3和Sox10/S100)，用单独的组织微阵列(TMA)来表征黑色素瘤TME中表达PD-1的淋巴细胞亚群。TMA包含来自94名转移性黑色素瘤患者的组织。从每个肿瘤样本中选择单个具有代表性的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块以包含在组织微阵列中。从代表肿瘤中心和周边区域的每个块中取出六个1.2mm核心，并以组织微阵列格式平铺。对所得的TMA进行了核查，并从分析中排除了具有组织折叠、过度坏死和/或肿瘤细胞占据的表面积＜10％的核心。
[表1]
[表2]
实施例2-试剂和多光谱显微镜
荧光团试剂和多重染色
使用酪酰胺信号放大(TSA)技术对FFPE载玻片进行染色，以便实现与标准IF检测相比优异的扩增和更高的复合性，图7A-7C。与使用直接标记的二抗来检测一抗相比，TSA技术利用HRP聚合物(HRP-polymer secondary)二抗介导的检测。单一HRP聚合物二抗可以催化多种荧光团标记的酪酰胺(TSA荧光团)的活化。活化后，TSA荧光团可以与周围的酪氨酸残基共价结合，并在剥离一抗和二抗的热处理步骤期间保持沉积在组织上。通过采用连续几轮染色和剥离，我们在单个FFPE组织切片上标记了6个标志物加DAPI。
载玻片扫描和多光谱离析
使用Vectra 3.0自动定量病理学成像系统(Akoya Biosciences)扫描图像，并使用数字图像分析软件inForm(Ver 2.3，Akoya Biosciences)进行处理。多光谱成像显微镜系统的示意图如图8所示。该系统捕获由35个图像平面的多层图像“立方体”组成的20X多光谱图像。这些平面对应于液晶可调谐滤光片选择的在可见光谱范围内获取的波长。然后使用逆最小二乘拟合方法对多重染色样本的图像进行离析，该方法可最大限度地减少每个荧光团的测量发射光谱与特征发射光谱之间的平方差。离析将每个荧光团的自发荧光和重叠发射信号分开，从而消除自发荧光背景并创建八个信号特定的“分量”平面；每个“分量”平面是每种荧光团加DAPI和自发荧光。
为了离析多光谱图像立方体，使用TSA荧光团、DAPI的已知特征发射光谱和代表背景自发荧光的光谱来生成离析库。为了获得库的纯光谱，将4μm厚的FFPE扁桃体切片通过Monoplex IF(参见Monoplex IF部分)用抗CD20(稀释度1:400，克隆L26 Leica微系统)对每个荧光团进行染色。调整TSA浓度以获得每个TSA荧光团10至15的像素归一化荧光强度(NFI)计数(520 1:150，540 1:500，570 1:200，6201:150，650 1:200，690 1:50)。方案结束时未添加DAPI。将一个扁桃体切片单独用DAPI染色以提取DAPI光谱，同时从感兴趣组织的未染色载玻片中提取自发荧光光谱。使用自动库创建工具对载玻片进行成像并在inForm中提取光谱。类似地，对于显色染色剂的光谱离析，使用DAB和苏木精的光谱库。
实施例3-染色优化
表征TSA荧光团—染色指数(SI)、渗色(BT)和标志物配对
为了探索荧光团染色指数，来自五个存档扁桃体标本的连续载玻片用抗CD8(稀释度1:100，克隆4B11)和各TSA荧光团以稀释度1:50通过单重IF进行染色。单细胞数据从inForm导出。SI计算为阳性细胞群和阴性细胞群的平均荧光强度之间的差除以阴性细胞群的两个标准差。
使用同一扁桃体标本来表征荧光团发射光谱的渗色或溢出，渗色或溢出是多参数荧光方法的常见限制。为所有通道创建标准化荧光强度计数的对数的成对点图。我们一致地观察到低强度计数下的线性关系和高强度下的指数关系，图9A-9B。为了解释这种二象性(duality)，对双曲正弦曲线进行了参数化，并使用非线性最小二乘模型拟合每个配对数据集。为了提高拟合的准确性，噪声群体中的异常值被去除。然后将数据取倒数并以原始噪声的中值为中心。然后将BT倾向性计算为拟合曲线的线性项*非线性项。
显色染色
在四微米厚的切片中分别对CD8、CD163、PD-1、PD-L1、FoxP3、Sox10、S100和Sox10/S100混合物进行染色。简言之，将载玻片脱蜡、再水化，并在pH 6目标抗原修复缓冲液(S1699，Dako)中于120℃(Decloaking室，Biocare Medical)中进行热诱导表位修复(HIER)10分钟。对内源过氧化物酶(3％H2O2、H325-500、Fisher Scientific)和蛋白质(ACEBlock，BUF029，Bio-Rad)进行封闭。对于使用生物素化二抗的方案，还封闭了内源生物素(亲和素/生物素封闭试剂盒，SP-2001，Vector Labs)。一抗在4℃下孵育22小时，然后二抗在室温(RT)下孵育30分钟，如表3所示。对于使用生物素化二抗的方案，如前所述使用酪酰胺信号放大(TSA)系统。使用3,3'-二氨基联苯胺(D4293，Sigma)使抗原-抗体结合可视化。将载玻片用苏木精复染并盖上盖玻片(VectaMount，H-5000，VectorLabs)。
[表3]
单重IF
对连续载玻片、3个扁桃体和黑色素瘤(针对Sox10和S100)进行单重IF染色，以滴定各一抗，表4。简言之，将载玻片脱蜡并在pH 9缓冲液，随后pH 6缓冲液(分别为AR900和AR600，Akoya Biosciences)中经受微波HIER(Haier 1000W)，在100％功率下进行45秒和在20％功率下进行15分钟。进行内源性过氧化物酶去除(3％H2O2、H325-500、Fisher)和蛋白质封闭(抗体稀释液，背景降低，S3022，Dako)，然后在室温下孵育一抗，从用于显色染色的最佳浓度的两倍开始并连续稀释。所有二抗在室温下孵育10分钟。然后施加与给定标志物配对的TSA荧光团(Opal 7颜色试剂盒，NEL811001KT，Akoya Biosciences)10分钟。最后的微波步骤在pH 6下进行，载玻片用DAPI(Opal 7颜色试剂盒，NEL811001KT，AkoyaBiosciences)染色并盖上盖玻片(ProLong Diamond Antifade Mountant，P36970，LifeTechnologies)。为了比较初级滴定，为每次稀释选择10个相应的高倍视野(HPF)，并使用基于像素和基于细胞的方法评估信噪比(SNR)(图10A)。还选择了10个相应的HPF与显色IHC进行比较。HPF经过专门选择以捕获广泛的动态范围的PD-1和PD-L1表达，参见图18A-18B。
[表4]
确定最佳一抗浓度后，对5个黑色素瘤肿瘤切片的所有标志物进行TSA滴定，表5。根据最终多重检测中载玻片的处理方式，在染色之前和之后均执行HIER步骤。选择每种IF条件和相关显色IHC的10个相应HPF进行分析。考虑与显色IHC相比的信号等效性以及荧光通道之间的渗色来选择每个标志物的最佳TSA浓度。
[表5]
多重IF
对来自5个FFPE黑色素瘤标本的单个切片进行了多重面板中所有6种标志物的染色，表6。此外，载玻片用于6重面板之前和之后的三个4um厚的组织切片均针对各个标志物进行了染色。对多重IF和相应的单重IF之间的10个HPF进行了比较。
[表6]
信号量化方法
信号通过多种不同的方法进行量化，包括基于细胞和基于像素的方法，无论是否进行机器学习。制造商推荐基于细胞的方法与机器学习相结合。它标记单个细胞类型并为其分配笛卡尔坐标，从而有助于分析细胞密度、不同细胞区室中标志物的荧光强度、标志物共表达以及细胞之间的距离度量。基于细胞的定量是通过使用inForm软件中的细胞分割模块(其识别和映射单个细胞)进行的，然后是基于机器学习的表型分析，即分配细胞类型。
不进行机器学习的基于细胞的方法也被用来量化信号，因为它更快并且需要更少的用户输入。细胞分割模块用于输出每个细胞感兴趣的区室中每个荧光团的平均荧光强度。然后将数据归入10％相对强度区间，并提取前10％的中值作为信号，提取后10％的中值作为噪声，以进行基于分位数的细胞分析。
基于像素的方法不依赖于细胞识别，即细胞分割，其只是对给定区域上的标志物为阳性的像素的测量。在比较IF和IHC染色时使用了这种方法，因为相同的细胞分割算法不能应用于这两种技术。使用R包mIFTO(针对AstroPath编译和开发，可在https://github.com/AstropathJHU/mIFTO获取)逐像素提取和分析数据。使用用inForm的共定位模块确定的阈值来分配正像素(信号)和负像素(噪声)。使用机器学习算法将像素分类为组织类别，从而研究肿瘤细胞表达。由于肿瘤细胞大小的变化以及双标志物(Sox10/S100)混合物的使用(排除对单个标志物强度的阈值设定)，这是准确的肿瘤定量所必需的。
为了比较单重IF和显色染色，使用了基于像素的方法。对于Sox10/S100染色，还使用了机器学习算法。对于所有其他标志物，机器学习未用于此特定比较。显色染色的阳性像素数被视为基线，并计算使用IF染色时阳性像素的百分比偏差。
使用基于像素和基于细胞的方法比较来自单重和多重IF染色的阳性信号。通过比较每个表位的可用动态范围来评估多重和单重IF之间标志物强度的潜在变化，其定义为每个HPF第95个百分位和第5个百分位的平均细胞荧光强度的差异。
统计分析
为了对从连续载玻片获得的相应视野之间进行染色比较，进行了配对学生t检验，并将数据报告为平均值±SEM。
实施例4-图像采集、表型分析和批次间归一化
图像采集
整个载玻片是通过以20％重叠平铺HPF来获取的，参见图3A和图12A-12C。重叠的中点用于确定修改的HPF的边界，图3B。35层中每一层的平场校正衍生自11,000个HPF的平均值，并通过高斯平滑以减少异常值的影响，图3B和图13A-13C。数学校正也适用于由每个HPF的镜头畸变产生的“枕形效应”，图3B。然后使用基于spring的模型将场缝合在一起，该模型消除了显微镜载物台运动中的“抖动”，图3C和图14A-14C。
组织标注
使用HALO(Indica Labs，NM)图像分析软件手动标注肿瘤-基质边界。坏死区域、组织折叠和其他伪影被排除在分析之外。
单标志物表型分析和相关质量保证/质量控制(QA/QC)
inForm软件通常同时将表型分配给各个细胞谱系，例如CD8与CD163(即“多标志物”表型分析)。还进行了“单标志物”表型分析，其中细胞被单独分配为每个标志物的阳性或阴性状态。然后使用细胞中心将六个单独的数据集合并到单个笛卡尔坐标系中。
最终表型分析的质量由委员会认证的病理学家验证，其使用定制观察器目视检查每个标本平均25,000个表型细胞，图16A。具体来说，为每个标本选择包含至少60个肿瘤细胞、50％组织覆盖率和总共400个细胞的20个最高密度CD8 HPF，用于表型分析算法性能的视觉QA/QC检查。第二定制观察器有助于对来自相同HPF的每个标志物随机选择的多达25个阳性和阴性细胞进行检查，图16B-16D。使用第二观察器对每个标本至少2000个显示各标志物的细胞进行目视检查。两个观察器的定制QA/QC代码可以在https://github.com/AstropathJHU/MaSS上找到。
批次间差异的归一化
每个多重染色批次均运行包含3个正常脾脏和3个扁桃体的组织微阵列(TMA)。使用对照组织中PD-1和PD-L1的染色强度用于批次间归一化。
计算硬件和软件配置
图像是使用与Vectra关联的本地台式计算机获取的，该计算机已升级为包含两个分配为单个驱动器的2TB M.2NVMe SSD，以实现最大的存储和传输效率。然后，多光谱图像块从本地计算机传输到由4台服务器组成的集群，专门用于处理Vectra数据。其中两台服务器的计算性能配置为配备9个2TB nVME SSD、128GB RAM和24个物理核心。另外两台服务器配置用于存储，包含六个配置为RAID5阵列的6x6 TB HDD。这使得HDD总净可用容量达到313.3TB。这项研究在峰值时消耗了32.27TB的存储容量。
一台计算服务器专门用于图像校正和分割，运行多个虚拟机，每个虚拟机都有自己的inForm实体。使用自动化工具覆盖了inForm的交互部分，因此它们可以作为批处理过程执行。另一台计算机专用于存储数据库。其中一台存储机器包含原始数据的压缩备份。每个图像都经过单独压缩，以提高可访问性，并使用7-Zip软件中的设置来实现图像文件的最佳速度和压缩大小。最终存储服务器在处理过程中保存数据。
中间数据产品是可再现的，并且可以在处理过程中或处理后丢弃；在不压缩的情况下，该项目的最低存储要求约为15TB。虽然该配置使用大量并行结构将图像处理和分析速度加快到12-15倍，但值得注意的是，本文描述的一般工作流程可以使用配备有单个inForm许可证的单个计算机来执行。
实施例5-根据距肿瘤-基质边界的距离评估细胞类型的密度
表达PD-1或PD-L1的特定细胞类型的密度是相对于距肿瘤-基质边界的距离来确定的。PD-1水平(阴性、低、中和高)通过将PD-1阳性信号分为三分位数来确定。为了能够比较具有不同丰度水平的细胞类型，通过将每个距离仓(distance bin)中的细胞密度除以该细胞类别的总表面密度来计算概率密度。
实施例6-特定细胞群的密度评估以及与对抗PD-1的响应的关联
确定每个标本的特定细胞类型的密度，包括PD-1和PD-L1表达水平(阴性、低、中、高)的评估，并测试与对治疗的响应的关联。通过对来自所有病例的任一标志物的所有阳性细胞进行分组并将各自的阳性信号的动态范围划分为三分位数来确定PD-1和PD-L1表达水平的评估为低、中或高(图18A-18B)。然后使用单侧Wilcoxon秩和检验在响应者和非响应者之间比较每种细胞类型的显示不同PD-1/PD-L1表达水平的细胞的密度。将秩和值转换为AUC值。
为了确定HPF采样对所得AUC的影响，以迭代方式评估了越来越多的肿瘤微环境。视野采样以两种方式之一进行：1)确定每个HPF的CD8+细胞密度，然后对视野进行排序，并按照“热点”分析中CD8+细胞密度递减的顺序包括在内。2)对视野进行随机排序并以递增的比例进行选择(图5A-5B)。为了避免偏差，生成了100个随机化排序，并报告每个比例步骤的平均AUC。他们被随机选择进行“代表性”分析。使用Benjamini-Hochberg校正对多重比较报告的p值进行校正。
通过单变量分析(校正p值＜0.05)在30％热点HPF采样和对整个TME(100％采样)显示与响应相关的每个特征都被组合成多变量模型。具体来说，应用二元逻辑回归模型来评估组合ROC曲线，并计算相应的AUC，以评估发现队列中前10个特征组合的预后准确性，以预测客观响应。然后，这10个相同的特征在独立的验证队列中进行了测试。还使用这些特征开发了组合模型，用于通过Kaplan Meier分析预测长期存活。在这个组合模型中，样本中包含高密度(前20％)的任何一个与结局负相关的特征的患者首先被分组在一起，而不考虑其他表达因素。接下来，剩余患者被分为具有高密度的任何一个与结果正相关的特征的患者(前15％)。
实施例7-淋巴细胞亚群PD-1表达的mIF测定
在自动化平台(Leica Bond Rx)上开发并验证了针对PD-1、CD8、CD4、CD20、FoxP3和肿瘤(Sox10/S100)的六重mIF测定。表7中提供了染色顺序和条件。这用于评估个体淋巴细胞亚群对黑色素瘤TME所贡献的PD-1表达比例。
[表7]
实施例8-载玻片的多重IF染色
在染色过程中，当未完全检测到信号或由于来自不同通道的溢出(又称“渗色”)而在给定通道中检测到假阳性信号时，就会出现潜在错误源。因此，6重小组的设计和优化涉及：1)确定每个荧光团的染色指数(SI)以及基于渗色计算将TSA荧光团与标志物配对，2)选择二抗/放大试剂，以及选择3)一抗和4)荧光团的浓度以获得最大灵敏度和特异性。最后一步是将所有优化的单重实验方案组合成多重测定格式，以便在6重mIF、单重IF和单染色显色IHC之间实现每个标志物的等效染色(图2A-2E和表8)。
[表8]
首先，确定每个标志物的渗色倾向，图9A-9B。然后使用SI和渗色信息将TSA荧光团与标志物配对，图2A。例如，具有高SI的荧光团与具有较低表达强度的标志物配对，例如TSA荧光团520和PD-L1。有渗色“风险”的荧光团配对被分配给不同细胞区室中发现的标志物，从而在图像分析过程中消除任何潜在的渗色，例如CD8(膜染色剂)与TSA荧光团540配对，而FoxP3(核染色剂)与TSA荧光团570配对。
下一关键步骤是评估二抗/扩增试剂。例如，当使用“不太强大”的二抗/HRP聚合物系统时，与显色IHC相比，仅鉴定出50％的PD-1表达细胞，图2B。PD-L1和FoxP3也显示出较低的表达水平，而所有其他标志物在单重IF和显色IHC之间显示出可比较的染色。为了解决PD-1、PD-L1和FoxP3检测的相对丢失问题，对测定的不同组成部分进行了修改，包括一抗和二抗试剂、孵育时间和不同的扩增方法。新的二抗(PowerVision Poly-HRP，1:1稀释，LeicaBiosystems)提高了这些标志物的测定灵敏度，图2B，因此被小组中的PD-1、PD-L1和FoxP3采用。重要的是，发现在一抗或TSA稀释优化之前为每个标志物选择二抗是关键。接下来确定一抗浓度，图2C和图10A-10B，随后选择每个荧光团的TSA浓度，图2D。后两个步骤分别用于优化信噪比并防止信号渗色或阻塞。
测定验证的最后一步是将所有优化的单重实验方案组合成多重测定格式。当遵循本文描述的方法时，在6重mIF、单重IF和单染色显色IHC之间实现了每个标志物的等效染色，图2E和图11A。值得注意的是，虽然多重格式中的总细胞计数与单一格式中的总细胞计数相匹配，但多重格式中免疫荧光信号的动态范围(代表表达给定标志物的第95个百分位细胞和第5个百分位细胞之间的强度分布)低于单重格式中免疫荧光信号的动态范围，图11B。
[表9]
[表10]
[表11]
实施例9：CD8+FoxP3+PD-1+细胞与用基于抗PD-1的疗法治疗的晚期非小细胞肺癌患者的客观响应强相关。
采用6重mIF检测对来自n＝20名晚期疾病患者的治疗前肺癌标本进行染色，并使用高倍视野(HPF)平铺马赛克对整个标本进行成像。在此实施例中，选择了CD8细胞密度最高的20个HPF进行继续分析。评估HPF块内表达PD-1和PD-L1的细胞群的密度，以评估其对客观响应的预测价值(由接受者操作特征曲线的曲线下面积(AUC)确定)。在这些研究人群中，与治疗阳性响应最密切相关的群体是表达PD-1的CD8+FoxP3+细胞。当该群体进一步分解成以不同三分位表达水平(低、中、高)表达PD-1的细胞时，PD-1low和PD-1mid表达细胞与响应最密切相关(图24)。本文描述的方法促进的图像校正允许对标志物表达强度进行这种稳健且可重复的原位评估。这一发现值得注意，因为它将黑色素瘤中观察到的发现扩展到非小细胞肺癌。在晚期默克尔细胞癌中也观察到了类似的发现，支持了该细胞群以及成像和分析方法的泛肿瘤生物标志物意义。
实施例10-AstroPath成像方法应用于来自接受抗PD-1的非小细胞肺癌患者的治疗前标本
该队列中治疗前活检大小中位数为3mm2(平均15mm2)。HPF采样评估表明，当采样100％的治疗前HPF时，AUC最高。在该分析中，所有CD8+FoxP3+细胞的密度对于mIF测定中鉴定的个体特征的阳性响应具有最高的预测价值(图25A)。进行第二次分析以确定治疗前特征，该治疗前特征预测对治疗的病理响应程度(图25B)。热图显示了通过该方法识别的一些潜在细胞群及其与10％残留可存活肿瘤(rvt10，其是众多II/III期临床试验的终点)和50％残留可存活肿瘤(rvt50)(图25B；左)的病理响应值的关联。使用该方法识别的特征用于预测这些患者的存活结局(Kaplan-Meier分析)(图25B；右)。
Claims (65)
1.一种预测对象对免疫治疗的响应的方法，所述方法包括：
(a)对置于衬底上的生物样本进行染色；
(b)对所述生物样本进行成像，其中生成高倍视野(HPF)的一个或多个图像；
(c)检测所述生物样本中的多种生物标志物；以及
(d)分析所述一个或多个图像，从而预测所述对象对免疫治疗的响应。
2.一种对对象进行分层并将所述对象归入治疗类别中的方法，所述方法包括：
(a)对置于衬底上的生物样本进行染色；
(b)对所述生物样本进行成像，其中生成高倍视野(HPF)的一个或多个图像；
(c)检测所述生物样本中的多种生物标志物；以及
(d)分析所述一个或多个图像，从而对对象进行分层并将所述对象归入治疗类别中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多种生物标志物包括PD-1、PD-L1、CD8、FoxP3、CD163、肿瘤细胞标志物或其任何组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤细胞标志物包括Sox10、S100或两者。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述染色包括免疫荧光染色。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述染色包括免疫组织化学染色。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述生物样本用抗体染色。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述生物样本用一种或多种抗体染色。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物样本用六种抗体染色。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物样本用四种抗体染色。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述生物样本用检测所述抗体的第二抗体染色。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二抗体与标记缀合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述标记是可检测标记。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述标记是荧光团。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述成像步骤(c)包括对所述生物样本进行免疫荧光显微镜检查。
18.根据权利要求1-17任一项所述的方法，其中所述分析步骤(d)包括：
(i)图像采集与处理；
(ii)细胞分割和表型分析；以及
(iii)图像归一化。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述图像采集的步骤包括编译所述一个或多个图像以采集所述衬底内整个生物样本的图像。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述编译包括将所述一个或多个图像重叠对准。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞分割和表型分析的步骤包括鉴定所述生物样本中的细胞类型。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述表型分析的步骤包括检测所述细胞类型中所述生物标志物中的至少一种生物标志物的表达。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少一种生物标志物的表达被认定为低、中或高。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞类型包括CD163+巨噬细胞、CD8+T细胞、Treg细胞(CD8negFoxP3+)、肿瘤细胞、CD8+FoxP3+细胞或其任何组合。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞类型CD8+FoxP3+PD-1low/mid被认定为所述对象将对所述免疫治疗作出响应的指标。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞类型CD163+PD-L1 neg被认定为所述对象将不会对所述免疫治疗作出响应的指标，其程度与被认定为不具有细胞类型CD163+PD-L1 neg的参考对象相同。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞分割和表型分析的步骤进一步包括确定所述生物样本中所述细胞类型的密度。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述生物样本中所述细胞类型的密度通过分析细胞与另一细胞之间的距离来确定。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述生物样本中所述细胞类型的密度通过分析细胞与肿瘤-基质边界之间的距离来确定。
30.根据权利要求27所述的方法，其中高密度的CD8+FoxP3+细胞被认定为所述对象将对所述免疫治疗作出响应的指标。
31.根据权利要求18所述的方法，其中所述图像归一化的步骤包括对照组织微阵列校准所述一个或多个图像中的所述生物标志物中的至少一种生物标志物的荧光强度。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中所述分析步骤(c)还包括鉴定来自患有疾病的对象的生物样本中的至少一种生物标志物，并且其中所述至少一种生物标志物的鉴定用于预测所述对象对免疫治疗的响应和/或对所述对象进行分层并将所述对象归入治疗类别中。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述疾病是癌症。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述癌症是转移性实体瘤。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠癌、头颈癌、血液癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。
38.权利要求32的方法，其中所述免疫治疗包括施用免疫检查点抑制剂。
39.根据权利要求32所述的方法，其中所述治疗类别包括放射治疗、化学治疗、免疫治疗、激素治疗、抗体治疗或其任何组合。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述衬底是载玻片。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述生物样本包括组织、组织切片、器官、生物体、类器官或细胞培养物样本。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述组织是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前固定所述生物样本。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述生物样本用甲醛固定。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述生物样本用甲醇固定。
46.一种提高生物标志物的预测价值的方法，所述方法包括：
(a)获得从生物样本生成的高倍视野(HPF)的多个图像；
(b)检测所述多个图像中的每个图像中的生物标志物；
(c)从步骤(a)的所述多个图像中选择子多个图像；以及
(d)分析所述子多个图像，从而提高所述生物标志物的预测价值。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述方法还包括生成ROC(接受者操作特征)曲线下面积值，所述ROC(接受者操作特征)曲线下面积值大于当分析所有图像时生成的ROC(接受者操作特征)曲线下面积值。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述生物标志物包括PD-1、PD-L1、CD8、FoxP3、CD163、肿瘤细胞标志物或其任何组合。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述肿瘤细胞标志物包括Sox10、S100或两者。
50.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述子多个图像是步骤(a)的所述多个图像的30％。
51.根据权利要求46-50中任一项所述的方法，其中所述获得步骤(a)包括对所述生物样本进行免疫荧光显微镜检查。
52.根据权利要求46-51任一项所述的方法，其中所述分析步骤(d)包括：
(i)图像采集与处理；
(ii)细胞分割和表型分析；以及
(iii)图像归一化。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述图像采集的步骤包括编译高倍视野(HPF)的多个图像以采集整个生物样本的图像。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述编译包括将所述多个图像重叠对准。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述细胞分割和表型分析的步骤包括鉴定所述生物样本中的细胞类型。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述表型分析的步骤包括检测所述细胞类型中所述生物标志物的表达。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述生物标志物的表达被认定为低、中或高。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述细胞类型包括CD163+巨噬细胞、CD8+T细胞、Treg细胞(CD8negFoxP3+)、肿瘤细胞、CD8+FoxP3+细胞或其任何组合。
59.根据权利要求55所述的方法，其中所述细胞类型CD8+FoxP3+PD-1low/mid被认定为所述对象将对所述免疫治疗作出响应的指标。
60.根据权利要求55所述的方法，其中所述细胞类型CD163+PD-L1 neg被认定为所述对象将不会对所述免疫治疗作出响应的指标，其程度与被认定为不具有细胞类型CD163+PD-L1 neg的参考对象相同。
61.根据权利要求55所述的方法，其中所述细胞分割和表型分析的步骤进一步包括确定所述生物样本中所述细胞类型的密度。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述生物样本中所述细胞类型的所述密度通过分析细胞与另一细胞之间的距离来确定。
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述生物样本中所述细胞类型的所述密度通过分析细胞与肿瘤-基质边界之间的距离来确定。
64.根据权利要求61所述的方法，其中高密度的CD8+FoxP3+细胞被认定为所述对象将对所述免疫治疗作出响应的指标。
65.根据权利要求52所述的方法，其中所述图像归一化的步骤包括对照组织微阵列校准所述多个图像中的所述生物标志物的荧光强度。
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