CN118302444A - 具有降低的聚集潜力和降低的疏水性的改善的Fc沉默的抗oxMIF抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及Fc沉默的抗oxMIF抗体以及其在治疗oxMIF相关病症中的用途，所述抗体由于轻链和重链可变结构域中的所选的氨基酸取代而具有改善的特性，诸如降低的聚集潜力和降低的疏水性。

Description

具有降低的聚集潜力和降低的疏水性的改善的Fc沉默的抗 oxMIF抗体
技术领域
本发明涉及Fc沉默的抗oxMIF抗体以及其在治疗oxMIF相关病症中的用途，所述抗体由于轻链和重链可变结构域中的所选的氨基酸取代而具有改善的特性，诸如降低的聚集潜力和降低的疏水性。
背景技术
早在1966年就已经描述了细胞因子巨噬细胞移动抑制因子(MIF)(David,J.R.,1966；Bloom B.R.和Bennet,B.,1966)。MIF的生物化学特性和生理作用在其克隆和重组表达后得到阐明(Bernhagen等人,1993；Bernhagen等人,1994)。现在公认的是，MIF是先天免疫的关键调节因子，在炎症反应和癌症中起着核心作用。MIF促进其他促炎介质的产生，诸如TNF(Calandra等人,1994)、一氧化氮(Bernhagen等人,1994)和前列腺素E2(Mitchell等人,1999；Sampey等人,2001)。其最引人注目的特性之一是能够压倒糖皮质激素(GC)的免疫抑制作用。在体外，MIF抵消在单核细胞(TNF、IL-1、IL-6和IL-8)(Calandra等人,1995)和T细胞(Bacher等人,1996)中GC诱导的细胞因子分泌抑制，并且压倒地塞米松对成纤维细胞中TNF诱导的花生四烯酸释放的抑制(Mitchell等人,1999)。体内研究揭示了MIF使用地塞米松治疗的内毒素血症小鼠的死亡率增加(Calandra等人,1995年)。在严重脓毒症患者中描述了MIF血清水平上调及其与疾病相关性的最详细数据(Emonts等人,2007；Bozza等人,2004；Sprong等人,2007)。血浆MIF水平与疾病严重程度和休克状态相关，并且死亡患者的血浆MIF水平显著高于存活患者的血浆MIF水平。MIF浓度与IL-1、IL-6、IL-10、IL-12和皮质醇的血浆浓度升高显著相关。此外，已针对许多炎性疾病，例如类风湿性关节炎(Onodera等人,1999；Morand等人,2002)、克罗恩病(de Jong等人,2001)、银屑病(Shimizu等人,2001)和多发性硬化(Niino等人,2000；Rinta等人,2008)确定了患者的MIF水平升高。
此外，MIF通过抑制p53依赖性细胞死亡并且刺激单核细胞和巨噬细胞的存活而促成炎症过程的维持(Mitchell等人,2002)。
越来越多的证据表明炎症与多种类型的癌症密切相关。被设计用于防御感染和损伤的炎症通路可以促进有利于肿瘤生长和转移的环境(Conroy等人,2010)。因此，提出炎症是肿瘤发生的关键驱动因素，许多癌症是感染或慢性炎症的结果(Bucala和Donnelly,2007；Conroy等人,2010；Karin,2009年)。此外，众所周知，肿瘤微环境的炎性性质促进血管生成和细胞外基质(ECM)分解，这进而促成肿瘤细胞的存活、增殖和迁移(Coussens和Werb,2002；Hagemann和Balkwill,2005；Hagemann等人,2007；Kessenbrock等人,2010)。已表明MIF在许多种人类肿瘤中上调，所述人类肿瘤诸如胰腺、乳腺、前列腺、结肠、脑、皮肤和肺源性肿瘤(Bando等人,2002；Chen等人,2010；Kamimura等人,2000；Meyer-Siegler和Hudson,1996；Shimizu等人,1999；Takahashi等人,1998；Winner等人,2007)。一些研究报道了MIF表达与肿瘤侵袭性和转移潜力密切相关，表明MIF可能在疾病严重程度和细胞存活中起重要作用(Rendon等人,2009)。最近的数据表明，与细胞内MIF相比，细胞外MIF可能促成更具侵袭性的肿瘤表型(Verjans等人,2009)。MIF促成有利于肿瘤生长、血管生成、侵袭性和转移的微环境。除了其促炎功能外，MIF还发挥抗凋亡和促增殖作用，包括抑制p53(Hudson等人,1999；Mitchell和Bucala,2000)和激活中央激酶ERK1/2(Mitchell等人,1999)和AKT(Lue等人,2007)。MIF进一步被描述为促进新血管生成的促血管生成因子(Coleman等人,2008)以及通过稳定HIF-1α导致肿瘤血管形成(Winner等人,2007)和上调促血管生成因子如VEGF和IL-8(Ren等人,2004)。MIF还充当趋化因子，并且预期通过趋化因子受体CXCR2和CXCR4而在肿瘤环境中促成炎性细胞募集(Bernhagen等人,2007；Rendon等人,2007)。
但是，MIF与其他细胞因子和趋化因子明显不同，因为它是组成性表达的并且存在于健康受试者的循环中。预形成的MIF储存在巨噬细胞、T细胞和身体(包括下丘脑-垂体-肾上腺轴)中的许多其他细胞的胞质池中，从而允许在刺激下快速释放而无需从头合成(Bernhagen等人,1993；Bacher等人,1997；Fingerle-Rowson等人,2003)。
由于这种蛋白质的普遍性质，MIF可以被认为是治疗性干预的不适当靶标。但是，MIF以两种免疫学上不同的构象同种型存在，称为还原型MIF(redMIF)和氧化型MIF(oxMIF)(Thiele M.等人,2015)。发现redMIF是丰富表达的MIF同种型，其可以在任何受试者的胞质和循环中发现。redMIF似乎代表一种潜在的非活性储存形式(Schinagl.A.等人,2018)。
相比之下，oxMIF似乎是生理相关和疾病相关的同种型，其可以在肿瘤组织中，特别是在患有结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌的患者的肿瘤组织中被检测到，从而概括出oxMIF的高度肿瘤特异性(Schinagl.A.等人,2016)，而且还在患有炎性疾病的患者的循环和发炎组织中被检测到(Thiele等人,2015)。
治疗癌症(如上面提及的oxMIF阳性适应症)的成功药物靶标的数量有限。例如，描述了超过300个潜在的免疫肿瘤学靶标，但许多临床研究侧重于抗PD-1和抗PD-L1抗体(Tang J.,等人2018)。因此，科学界和医学界急切地等待靶向肿瘤特异性抗原的潜在药物，以增加用于预后不良的癌症患者的治疗选择。
另外，对针对炎性疾病的药物也有很高的需求。糖皮质激素(GC)代表常规临床实践中最重要且最频繁使用的一类抗炎药物(等人,2002)。GC的效用在很大程度上涉及其减少炎性细胞募集和抑制促炎细胞因子和介质合成从而在许多水平上有效阻断炎性级联反应的能力(Barnes等人,2003)。据估计，口服GC使用的流行率占总人口的0.5％，并且占大于55岁人口的1.4％(Ramsey-Goldman,2002；Walsh等人,1996)。虽然GC被认为是明显有益的，但认识到显著的剂量依赖性且经常不可逆的副作用，这限制了其使用(Pisu等人,2005)。最关注的副作用包括高血压、肥胖症、骨质疏松症、肌病、水肿和免疫损害。在包括RA和系统性红斑狼疮在内的炎性疾病中，也越来越多地认识到与动脉粥样硬化相关的过早死亡(Wallberg-Jonsson等人,2005；del Rincon等人,2001；Solomon等人,2003；El-Magadmi等人,2004；Manzi等人,1999)。GC的大量毒性负担要求开发将利于GC对炎性疾病的作用并且允许减少剂量的疗法。然而，这需要阐明调节GC敏感性的因素。在21世纪初，出现了细胞因子巨噬细胞移动抑制因子(MIF)与GC之间独特的关系，从而鉴定出MIF是一种可以调节GC敏感性的候选因子(Aeberli等人,2006)。
靶向oxMIF的抗体在体外和体内炎症和癌症模型中显示出功效(Hussain F.等人,2013；Schinagl.A.等人,2016；Thiele等人,2015)。
WO2019/234241A1披露了抗oxMIF/抗CD3双特异性抗体。
WO2009/086920A1描述了抗oxMIF抗体Bax69(伊玛鲁单抗(Imalumab))。
经常在生物加工的几个阶段(包括蛋白质表达、纯化和储存)中观察到蛋白质聚集，特别是抗体聚集。抗体聚集可能影响治疗性蛋白制造过程的总产率，并且可能有助于治疗性抗体的稳定性和免疫原性。
因此，抗体的蛋白质聚集仍然是其可开发性中的重大问题，并且仍然是抗体生产中的主要关注领域。抗体聚集可能通过其结构域的部分解折叠导致单体-单体缔合，随后成核和聚集体生长而触发。尽管抗体和基于抗体的蛋白质的聚集倾向可能受到外部实验条件的影响，但它们强烈依赖于如由其序列和结构决定的内在抗体特性。
例如，可以通过稳定天然状态(即，抵抗解折叠)或通过降低解折叠或部分折叠状态的蛋白质的聚集倾向来实现抗聚集。稳定天然状态的缺点是蛋白质将可能暴露在它们将解折叠的环境中。通常，当蛋白质变性或解折叠时，暴露出通常在蛋白质内部介导分子内接触的氨基酸残基。这种暴露通常使蛋白质易于形成分子间接触和聚集。与抵抗解折叠的蛋白质相反，在暴露于这种环境后，解折叠时聚集倾向降低的蛋白质将简单地重折叠成生物活性非聚集状态。
包含其抗原结合结构域的抗体和蛋白质的抗聚集性或聚集倾向通常受限于其中包含的最易聚集结构域以及其与周围结构域(如果存在)相互作用的强度。
这是因为一旦该结构域解折叠，如果它不能重折叠，则它可能与相同蛋白质或其他蛋白质中的其他结构域相互作用并且形成聚集体。抗体的恒定结构域通常不会聚集并且不会变化很大。因此，抗体的在聚集潜力和稳定性方面最弱的结构域通常被认为是可变结构域(例如，重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)，Ewert S.等人,2003)。在这方面，将易聚集的VH或VL结构域掺入其他稳定的重组抗体产物中通常会给新重组设计带来这些通常不希望有的特质。因此，将可变结构域工程化为具有抗聚集性最有可能使可包含该可变结构域的整个蛋白质具有抗聚集性。已经提出了减少可变结构域聚集的各种策略，例如，合理设计抗聚集性蛋白、互补决定区(CDR)移植、或在可变结构域中引入二硫键。抗聚集性蛋白的合理设计通常涉及使用计算机模拟分析来预测点突变对蛋白质聚集倾向的影响。然而，这种方法有几个困难。例如，仅鉴定可能减少解折叠蛋白的聚集的突变是不够的。相反，突变还必须不增加折叠蛋白的聚集或影响折叠蛋白的功能，尤其是结合特性，诸如在抗体的情况下是亲和力或特异性。此外，合理的设计需要对所改善的特定蛋白质进行详细的结构分析，并且因此难以用于尚未彻底表征的蛋白质，并且不易应用于多种不同的蛋白质。CDR移植涉及将来自一个可变结构域的CDR移植到另一个可变结构域的框架区(FR)上。这种策略表明可用于稳定抗EGP-2scFv(Willuda J.等人,1999)。这种方法的缺点包括在CDR移植后可能发生亲和力降低。这种亲和力丧失可以通过向FR中引入突变来克服，然而，此类突变可能在蛋白质中产生免疫原性表位，从而从治疗的角度来看使所述蛋白质成为不希望的。此外，CDR移植通常需要分析供体和受体可变结构域的晶体结构或同源性建模，以评估移植的适用性。这种方法费力并且需要专业知识。此外，由于每个可变结构域具有不同的结构，因此所述方法不易应用于多种分子。至于涉及将二硫键引入可变结构域中的方法，虽然所述键可能有助于蛋白质正确重折叠，但它也将刚性引入可变结构域中。这种刚性可能降低抗体对抗原的亲和力。此外，并非所有可变结构域都能支持引入二硫键形成所需的半胱氨酸残基而不丧失亲和力或不引入免疫原性表位。此外，在高蛋白质浓度下二硫键的形成可能导致蛋白质聚集，从而抵消了所述键的任何潜在积极作用。
然而，聚集倾向的降低已表明伴随着表达滴度的增加，表明减少蛋白质聚集在整个开发过程中是有益的，并且可能导致更高效的临床研究途径。对于治疗性蛋白质而言，聚集体是患者有害免疫反应的重要风险因素，并且可能通过多种机制形成。控制聚集可以改善蛋白质的稳定性、可制造性、损耗率、安全性、配制、滴度、免疫原性和溶解性(Wei Li等人,2016；Van der Kant R.等人,2017)。
蛋白质的其他内在特性诸如疏水性也在抗体溶解性中发挥重要作用。由于表面疏水性而引起的这些治疗性蛋白质的低溶解度已表明使配制品开发更加困难，并且可能导致不良的生物分布、不希望的药代动力学行为和体内免疫原性。因此，降低候选单克隆抗体的整体表面疏水性可以提供与纯化和给药方案相关的益处和成本节约。
调节抗体效应子功能以适应特定的治疗性目的也越来越引起兴趣。具体地，Fc无效或Fc沉默的抗体可以是一种消除Fc效应子功能的策略，因为通过FcγR和补体相互作用而产生的强免疫效应子功能有时可能对抗体机制有害。同样，调节IgG抗体的新生儿Fc受体(FcRn)结合以便调节药代动力学也收获了增加的恶名。
Strohl W.R.等人(2012)描述了抗体Fc工程化以增加或降低FcγR介导的IgG同种型的活性。
WO2017/178493A1描述了靶向TIM-3(T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域蛋白质3)的抗体，所述抗体包含用于Fc沉默的经修饰的CH1-CH3结构域。降低的聚集潜力、降低的疏水性和Fc沉默的组合将使抗体特性非常有利。本领域对疏水性降低的针对oxMIF的Fc沉默且抗聚集性抗体仍有未满足的需求。
发明内容
本发明的目的是提供改善的靶向oxMIF的抗体或其抗原结合片段，其具有沉默的Fc并且具有降低的聚集倾向和疏水性。
所述目的通过本发明的主题得到解决。
本发明公开了一种Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段包含野生型人IgG的变体Fc区，其包含具有一个或多个氨基酸取代或糖基化修饰的SEQ ID NO:1(CH2-CH3)或作为替代方案的SEQ ID NO:44(CH1-CH3)；以及以下可变结构域：
(a1)包含具有氨基酸取代M30L、F49Y、A51G、P80S、W93F中的至少一者的SEQ IDNO:2的轻链可变结构域，或
(a2)包含具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:2的轻链可变结构域，该轻链可变结构域还包含：
-在位置36处的保守酪氨酸，和
-氨基酸取代M30L、F49Y、A51G、P80S、W93F中的至少一者；以及
(b1)包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域；或
(b2)包含SEQ ID NO:3和氨基酸取代L5Q和/或W97Y的重链可变结构域，或
(b3)包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域，其具有氨基酸取代L5Q或W97Y中的至少一者和1、2、3、4或5个另外的氨基酸取代；
其中氨基酸位置是根据Kabat编号的，
其中与野生型IgG1 Fc区相比，所述变体Fc区展现出降低的FcγR结合，以及
其中与缺乏所述氨基酸取代的包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗体或其抗原结合片段相比，所述抗体或其抗原结合片段具有降低的聚集潜力和降低的疏水性。
具体地，所述重组抗oxMIF抗体包含参考SEQ ID NO:2的氨基酸取代W93F。
具体地，所述重组抗oxMIF抗体包含参考SEQ ID NO:3的氨基酸取代W97Y。
根据另外的具体实施方案，所述重组抗oxMIF抗体包含氨基酸取代W93F和W97Y。
根据本文所描述的具体实施方案，根据EU编号，Fc区中的氨基酸取代在SEQ IDNO:1的位置E233、L234、L235、G236、G237、P238、D265、S267、H268、N297、S298、T299、E318、L328、P329、A330、P331中的任一者处。
根据替代实施方案，Fc区是非糖基化的(aglycosylated)。
更具体地，根据EU编号，Fc区中的氨基酸取代在位置SEQ ID NO:1的L234和L235处，具体地在L234A和L235A处。
本文具体提供了一种Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含Fc区，所述Fc区包含选自由SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、43和85组成的组的氨基酸序列。
更具体地，本文所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体包含可变重链和轻链：
i.)SEQ ID NO:3和6，
ii.)SEQ ID NO:9和6，
iii.)SEQ ID NO:4和6，
iv.)SEQ ID NO:4和8，
v.)SEQ ID NO:4和5，或
vi.)SEQ ID NO:43以及5、6、7或8中的任一者。
根据实施方案，本文所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体还包含SEQ ID NO:14的CH1至CH3结构域。
根据本发明的具体实施方案，所述抗oxMIF抗体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:15和16或17。
根据另外的实施方案，本文提供了Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段包含野生型人IgG的变体Fc区，所述野生型人IgG的变体Fc区包含具有一个或多个氨基酸取代或糖基化修饰的SEQ ID NO:1，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段包含：
选自SEQ ID NO:72或78的轻链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:73、79、80或81的轻链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:74或82的轻链CDR3序列，和
选自SEQ ID NO:75的重链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:76或83的重链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:77或84的重链CDR3序列，条件是SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:77不包含在一起。
在替代实施方案中，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含：
选自SEQ ID NO:72或78的轻链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:73、79、80或81的轻链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:82的轻链CDR3序列，和
选自SEQ ID NO:75的重链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:76或83的重链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:77或84的重链CDR3序列。
在替代实施方案中，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含：
选自SEQ ID NO:72或78的轻链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:73、79、80或81的轻链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:82的轻链CDR3序列，和
选自SEQ ID NO:75的重链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:76或83的重链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:84的重链CDR3序列。
在替代实施方案中，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含：
选自SEQ ID NO:72或78的轻链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:73、79、80或81的轻链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:82的轻链CDR3序列，和
选自SEQ ID NO:75或83的重链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:76或84的重链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:85的重链CDR3序列。
根据本发明的另外实施方案，根据EU编号索引，本文所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体具有在SEQ ID NO:1的位置E233、L234、L235、G236、G237、P238、I253、D265、S267、H268、N297、S298、T299、H310、E318、L328、P329、A330、P331、H435中的任一者处的氨基酸取代，具体地氨基酸取代在位置L234和L235处，具体地在位置L234、L235、H310和H435处，和/或Fc区是非糖基化的。
本文所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体可以具有含有CH2和CH3抗体结构域的任何形式，具体地它选自由以下组成的组：单特异性抗体、双特异性抗体(例如，交叉mab(Crossmab))、scFv-Fc、(scFv)2-Fc(一条臂上包含两个scFv片段)、scFv/scFv-Fc(即，每条臂包含一个scFv片段)、Fab/scFv-Fc、Fab/(scFv)2-Fc、Fab/Fab-scFv-Fc、Fab/Fab-交叉Fab-Fc、Fab/交叉Fab-Fc、IgG-scFv和IgG-(scFv)2。
在另外的实施方案中，本文所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体还包含至少一个特异性识别CD3表位或组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)的结合位点。在具体实施方案中，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体用于治疗或检测实体瘤，其中在第一步骤中向受试者施用所述抗体，并且在第二步骤中向受试者施用HSG半抗原，其中所述HSG半抗原与所述抗体结合并且被放射性核素标记。
本文还提供了本文所描述的用于制备药剂的Fc沉默的抗体。
在本发明的又一的实施方案中，本文还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的抗体，任选地连同药物载体或佐剂一起。
具体地，所述组合物包含10mg/ml至250mg/ml的本发明抗体，具体地包含>50mg/ml。
更具体地，所述药物组合物经配制用于皮下施用。
如本文所提供的，所述组合物用于作为唯一的物质施用，或用于作为具有包含一种或多种活性物质的另外的药物组合物的组合配制品施用，所述活性物质优选选自由以下组成的组：抗病毒物质、抗癌物质、抗炎物质和抗生素物质。
在另外的实施方案中，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有炎性疾病、感染性疾病的患者，具体地用于治疗哮喘、血管炎、关节炎、脓毒症、脓毒性休克、内毒素休克、中毒性休克综合征、获得性呼吸窘迫综合征、肾小球肾炎、炎性肠病、克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、腹膜炎、肾炎、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、多发性硬化、急性和慢性胰腺炎、1型糖尿病、IgA肾病、间质性膀胱炎、COVID后综合征和银屑病。
根据替代实施方案，所述药物组合物用于治疗患有过度增殖性障碍或癌症的患者，具体地治疗结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌。
本文还提供了一种分离的核酸，所述分离的核酸编码本发明的抗体。
本文还提供了一种表达载体，所述表达载体包含本文所述的一种或多种核酸分子。
在另外的实施方案中，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本文所述的核酸或表达载体。
进一步提供了一种产生本发明抗体的方法，所述方法包括培养宿主细胞并且从细胞培养物中回收所述抗体。
本文进一步提供了一种用于产生本发明抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码所述抗体的核酸。
附图说明
图1：色谱图谱表明新设计的抗oxMIF抗体的聚集和疏水性降低。(A)使用1×PBS作为流动相在Enrich 650凝胶过滤柱上C0008(对照抗体，灰色区域)和新设计的抗体C0115和C0118的亲本抗体(C0083和C0090，无Fc沉默)的洗脱图谱的比较；(B)使用1×PBS作为流动相在Enrich 650凝胶过滤柱上C0008(对照抗体，灰色区域)和新设计的抗体C0115和C0118的洗脱图谱的比较；(C)在HiTrap Butyl HP HIC柱上C0008(对照抗体，灰色区域)和新设计的抗体C0115和C0118及其亲本抗体C0083和C0090(无Fc沉默)的洗脱图谱的比较。
图2：新设计的抗oxMIF抗体与固定oxMIF的结合曲线(KD确定)。通过抗人IgG(Fc)-HRP缀合物检测抗oxMIF抗体，C0008用作参考抗体。使用GraphPad Prism通过S形4参数方程确定EC50值(示出了两个实验的平均值+/-SEM)。
图3：新设计的抗体与oxMIF和redMIF的差异性结合。C0008用作参考抗体，并且同种型IgG用作阴性对照。示出了两至三个实验的平均值+/-SEM。
图4：通过报告物测定确定新设计的Fc沉默的抗体C0115和C0118的效应子功能大幅降低。(A-B)使用稳定表达FcyRIIIa(V：高反应者基因型，F：低反应者基因型)的工程化Jurkat效应细胞和HCT116-pMIF(A)或A2780-pMIF(B)靶细胞，新设计的Fc沉默的抗体C0115和/或C0118与抗oxMIF对照抗体C0008(B)或具有wt Fc的其亲本抗oxMIF抗体C0083和C0090(A)相比的ADCC报告物生物测定；(C)使用稳定表达FcyRIIa的工程化Jurkat效应细胞和HCT116-pMIF靶细胞，新设计的Fc沉默的抗体C0115和/或C0118与具有wt Fc的其亲本抗体C0083和C0090相比的ADCP报告物生物测定。使用GraphPad Prism将数据拟合到S形4参数方程(示出了两次重复的平均值+/-SD)。
图5：通过补体依赖性细胞毒性生物测定确定新设计的Fc沉默的抗体C0115的CDC活性大幅降低。使用BRC作为补体源以及HCT116-HiBiT-pMIF作为靶细胞，新设计的Fc沉默的抗体C0115与具有wt Fc的其亲本抗oxMIF抗体C0083和纳武单抗作为IgG4阴性对照相比的CDC生物测定。使用GraphPad Prism将数据(在适当的情况下)拟合到S形4参数方程(示出了两次重复的平均值+/-SD)。
图6：通过PBMC介导的细胞毒性生物测定确定新设计的Fc沉默的抗体C0115和C0118的ADCC活性大幅降低。使用PBMC作为效应细胞以及HCT116-HiBiT-pMIF作为靶细胞，新设计的Fc沉默的抗体C0115(A)和C0118(B)与抗oxMIF对照抗体C0008或C0115的具有wtFc的亲本抗oxMIF抗体(C0083)相比的ADCC生物测定。示出了使用来自两名健康供体的PBMC的两次重复的平均值和SEM。使用GraphPad Prism将数据拟合到S形4参数方程。
图7：通过FACS确定新设计的抗oxMIF抗体在A2780 MIF-/-细胞上的非特异性结合降低。用新设计的抗oxMIF抗体C0118及其亲本抗体C0090(A)和C0115及其亲本抗体C0083(B)以及对照抗体C0008以及同种型IgG作为阴性对照进行A2780 MIF-/-细胞的染色；活细胞的几何平均值(AF488的平均荧光强度)对抗体浓度作图。
图8：与参考抗体C0008相比，新设计的Fc沉默的抗oxMIF抗体C0115显示出从人PBMC中的细胞因子释放大幅降低。将携带Fc沉默突变的抗oxMIF抗体C0115和参考抗体C0008与人PBMC一起孵育过夜，并且在LegendPlex细胞计数珠测定(BioLegend)中分析上清液中的人MCP-1(A)、人IL-6(B)和人TNF-α(C)。从3个不同PBMC供体中显示出细胞因子浓度(以pg/ml计)的平均值+/-SEM。
图9：通过红外体内成像携带皮下HCT116肿瘤的小鼠，新设计的Fc沉默的抗oxMIF抗体C0115和参考抗体C0008的肿瘤渗透和保留。(A)在注射剂量为5mg/kg的IRDye 800CW标记的抗体C0115(上图)和C0008(下图)后1h、6h、24h、48h、72h、96h和168h拍摄小鼠的红外图像；(B)通过数字图像分析量化的C0115和C0008的肿瘤渗透和保留。示出了3只小鼠平均值。
图10：新设计的Fc沉默的抗oxMIF抗体C0115改善了胶原II诱导的DBA/1j小鼠关节炎模型的疾病严重程度。在用C0115(20mg/ml)、高剂量地塞米松(0.3mg/kg)作为标准护理皮质类固醇药物或媒介物治疗后，在小鼠关节炎模型中评估累积疾病得分(A)和爪厚度(B)。示出了平均值+/-SEM。在GraphPad Prism V 9.4中使用普通单因素方差分析、随后费舍尔LSD检验(Fisher’s LSD test)进行统计分析(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图11：新设计的Fc沉默的抗oxMIF抗体C0115改善了肾毒性血清(NTS)诱导的大鼠肾小球肾炎模型的疾病严重程度。在用抗oxMIF抗体C0115、同种型对照IgG1或媒介物治疗患病大鼠后，在大鼠肾小球肾炎模型中评估血尿(浸渍棒测试(dipstick test))(A)、蛋白尿(B)和肾小球巨噬细胞浸润。示出了平均值±SEM，在GraphPad Prism V 9.4中使用普通单因素方差分析、随后邓尼特多重检验校正(Dunnett’s correction for multipletesting)进行统计分析(*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001)。
图12：新设计的Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG双特异性抗体(bsMab)C0132(Fab/scFv-Fc)和C0133(Fab/Fab-scFv-Fc)的示意图。
图13：新设计的Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132和C0133与固定oxMIF的结合曲线。通过抗人IgG(Fc)-HRP缀合物检测结合的抗体，C0008用作与oxMIF二价结合的参考抗体。使用GraphPad Prism将数据拟合到S形4参数方程(示出了两次重复的平均值+/-SEM)。
图14：新设计的Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132和C0133与oxMIF和redMIF的差异性结合。C0008用作参考抗oxMIF抗体。示出了三次重复的平均值和SEM。
图15：通过红外体内成像携带皮下同系移植CT26肿瘤的小鼠评估新设计的Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132和C0133的肿瘤渗透和保留。在注射剂量为5mg/kg的IRDye800CW标记的抗体后1h、8h、24h、48h、72h、96h和168h拍摄小鼠的红外图像。
图16：(A)HSG半抗原IMP288的结构。(B)通过iTLC基于当与单独的177Lu-IMP288肽的迁移图谱相比时在与bsMab C0132和C0133一起孵育后177Lu-IMP288的迁移图谱的变化评估的bsMab与177Lu-IMP288肽的结合。
图17：示出了用Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132对Balb/c小鼠的同系移植CT26鼠结直肠癌的PRAIT。在第-3天施用C0132，随后在3天后(第0天)施用177Lu-IMP288。(A)以占第0天测量的肿瘤体积的％计的肿瘤体积，示出了平均值±SEM(n＝高达10)。在GraphPad Prism V9.4中使用普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正进行统计分析；**p<0.01，相对于177Lu-IMP288；(B)卡普兰-迈耶生存曲线(Kaplan-Meier survivalcurve)(以存活％计)，(C)占第0天测量体重的％的体重。
图18：示出了用Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0133对Balb/c小鼠的同系移植CT26鼠结直肠癌的PRAIT。在第-3天施用C0133，随后在3天后(第0天)施用177Lu-IMP288。图示出了占第0天测量肿瘤体积的％的肿瘤体积。示出了平均值+/-SEM(n＝高达10)。在GraphPad Prism V9.4中使用普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正进行统计分析；***p<0.001，相对于177Lu-IMP288。
图19：使用PRAIT方法，在同系移植CT26鼠结直肠癌细胞的Balb/c小鼠中抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132的功效。在第-5天以2.5mg/ml和5mg/ml施用C0132，随后在5天后(第0天)施用177Lu-IMP288；示出了平均值+/-SEM(n＝高达10)。在GraphPad Prism V9.4中使用普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正进行统计分析；***p<0.001，相对于177Lu-IMP288。(A)占第0天测量肿瘤体积的％的肿瘤体积，(B)卡普兰-迈耶生存曲线(以存活％计)。
图20：使用PRAIT方法，在异种移植CFPAC-1胰腺腺癌细胞的Balb/c裸小鼠中抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132的功效。在第-5天以5mg/ml施用C0132，随后在5天后(第0天)施用177Lu-IMP288。(A)以占第0天测量的肿瘤体积的％计的肿瘤体积；示出了平均值±SEM(n＝高达10)。在GraphPad Prism V9.4中使用普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正进行统计分析；**p<0.01，相对于媒介物。
图21：新设计的Fc沉默的抗oxMIF抗体C0115(作为单一药剂或与GC组合)改善了DBA/1j小鼠的胶原II诱导的关节炎的疾病严重程度。在用单独C0115(20mg/kg)或与低剂量0.1mg/kg的地塞米松(“Dexa”)、低剂量(0.1mg/kg)和高剂量(0.3mg/kg)地塞米松(“Dexa”)(作为标准护理皮质类固醇药物)或媒介物对照组合治疗后在小鼠关节炎模型中评估累积疾病得分。在GraphPad Prism V 9.4中使用普通单因素方差分析、随后费舍尔LSD检验进行统计分析(*p<0.05；**p<0.01)。
图22：新设计的Fc沉默的抗oxMIF抗体C0115(作为单一药剂以及与GC组合)改善了T细胞转移小鼠结肠炎模型的疾病严重程度。在用C0115(10mg/kg；单独或与低剂量0.01mg/kg的地塞米松(“Dexa”)组合)、低剂量(0.1mg/kg)和高剂量(0.1mg/kg)的地塞米松(“Dexa”)(作为标准护理皮质类固醇药物)或媒介物对照治疗进行治疗后评估在实验结束时(第83天)的体重变化(A)以及累积粪便得分(B)。在GraphPad Prism V 9.4中使用普通单因素方差分析、随后费舍尔LSD检验进行统计分析(*p<0.05；**p<0.01)。
具体实施方式
除非另外指示或定义，否则本文所用的所有术语都具有其在本领域中通常的含义，这对于技术人员而言将是清楚的。例如，参考标准手册，诸如Sambrook等人,“MolecularCloning:A Laboratory Manual”(第4版),第1-3卷,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2012)；Krebs等人,“Lewin’s Genes XI”,Jones&Bartlett Learning,(2017)；和Murphy&Weaver,“Janeway’s Immunobiology”(第9版或更新版本),Taylor&Francis Inc,2017。
权利要求的主题具体地涉及人工产物或使用或产生此类人工产物的方法，所述人工产物可以是天然(野生型)产物的变体。尽管与天然结构可能存在一定程度的序列同一性，但很好理解的是，本发明的材料、方法和用途，(例如，具体地是指分离的核酸序列、氨基酸序列、融合构建体、表达构建体、转化的宿主细胞和修饰的蛋白质)是“人造的”或合成的，并且因此不被认为是“自然法则”的结果。
如本文所用的术语“包括”、“含有”、“具有”和“包含”可以同义使用，并且应当理解为开放的定义，允许另外的成员或部分或要素。“组成”被认为是最接近的定义，但没有组成性定义特征的其他要素。因此，“包括”更宽泛，并且含有“组成性”定义。
如本文所用的术语“约”是指相同值或与给定值相差+/-5％的值。
如本文和权利要求中所用，单数形式，例如“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。
如本文所用，氨基酸是指由61个三联体密码子编码的20种天然存在的氨基酸。这20种氨基酸可以分为带中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：
下面示出了“中性”氨基酸连同其相应的三字母和单字母代码和极性：丙氨酸(Ala，A；非极性、中性)、天冬酰胺(Asn，N；极性、中性)、半胱氨酸(Cys，C；非极性、中性)、谷氨酰胺(Gln，Q；极性、中性)、甘氨酸(Gly，G；非极性、中性)、异亮氨酸(Ile，I；非极性、中性)、亮氨酸(Leu，L；非极性、中性)、甲硫氨酸(Met，M；非极性、中性)、苯丙氨酸(Phe，F；非极性、中性)、脯氨酸(Pro、P；非极性、中性)、丝氨酸(Ser；极性、中性)、苏氨酸(Thr，T；极性、中性)、色氨酸(Trp，W；非极性、中性)、酪氨酸(Tyr，Y；极性、中性)、缬氨酸(Val，V；非极性、中性)和组氨酸(His，H；极性、正(10％)、中性(90％))。
带“正”电荷的氨基酸是：精氨酸(Arg；极性，正)和赖氨酸(Lys，K；极性，正)。
带“负”电荷的氨基酸是：天冬氨酸(Asp，D；极性，负)和谷氨酸(Glu，E；极性，负)。
本发明的抗体或抗原结合片段包含至少一个特异性识别oxMIF的结合位点，并且与缺乏所述氨基酸取代的未修饰抗体相比，由于可变重链和轻链结构域中的靶向氨基酸取代而展现出降低的聚集倾向和降低的疏水性。
聚集潜力的降低是由于本文所述抗体的可变结构域内选定位置处的氨基酸取代。
抗体聚集水平可以使用多种已知技术来测量，包括质谱法、尺寸排阻色谱法(SEC)、疏水相互作用色谱法(HIC)、动态光散射(DLS)、光遮蔽(LO)、动态成像颗粒分析(DIPA)技术诸如微流成像(MFI)和库尔特计数器(CC)、差示扫描荧光测定法(DSF)。
如本文所用的降低的疏水性和降低的聚集潜力是指与参考抗体诸如抗体C0008(其包含如本文所公开的SEQ ID NO:44和2、3)相比，新设计的抗体的表面疏水性降低和聚集潜力降低。C0008的序列含有伊玛鲁单抗的序列(公布于Proposed INN List 111(WHODrug Information,第28卷,第2期,2014))，但缺乏C末端赖氨酸。可以使用多种已知技术进行测量，包括但不限于疏水相互作用色谱法(HIC)或亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱法(AC-SINS,Estep P.等人,2015)。
在一实施方案中，具有降低的聚集潜力和降低的疏水性的本发明oxMIF抗体具体地包含具有根据Kabat编号在位置M30、F49、A51、P80、W93处的一个或多个氨基酸取代(具体地M30L、F49Y、A51G、P80S、W93F)的轻链可变结构域，或与SEQ ID NO:2具有至少95％，具体地至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变结构域，其包含在位置36处的酪氨酸以及此外在位置M30、F49、A51、P80、W93处的氨基酸取代(具体地M30L、F49Y、A51G、P80S、W93F)中的至少一者；与包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域组合，或者与包含根据Kabat编号在位置L5或W97处的氨基酸取代(具体地L5Q或W97Y)的重链可变结构域或包含具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:3并且进一步包含在位置L5或W97处的氨基酸取代(具体地L5Q或W97Y)中的一个或两个的重链可变结构域组合。
在一替代实施方案中，包含SEQ ID NO:2的轻链可变结构域具有1、2、3、4、5个氨基酸取代，条件是在位置36处的酪氨酸被保留，并且此外，在位置M30、F49、A51、P80、W93处的氨基酸中的至少一者被取代。
根据具体实施方案，氨基酸W93被F、Y或H替代。
在另外的实施方案中，具有降低的聚集潜力和降低的疏水性的本发明抗oxMIF抗体具体地包含含有SEQ ID NO:3和在位置W97处的氨基酸取代(具体地W97Y)、或在L5处的氨基酸取代(具体地L5Q)、或氨基酸取代L5Q和W97Y的重链可变结构域，或含有具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:3并且进一步含有氨基酸取代W97Y(任选地与L5Q组合)的重链可变结构域。
根据具体实施方案，氨基酸W97被F、Y或H替代。
在一替代实施方案中，包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域具有1、2、3、4、5个氨基酸取代，并且此外，在位置L5和W93处的氨基酸中的至少一者被取代。
在一优选的实施方案中，具有降低的聚集潜力和降低的疏水性的本发明抗oxMIF抗体具体地包含在位置W93和W97处的氨基酸取代。
在轻链的位置36处的酪氨酸具体地保持未修饰，以保留本文所述抗体的结合特性。在所述氨基酸位置处的任何修饰都可能导致不希望的受损的结合特性。
具体地，可变轻链结构域含有SEQ ID NO:5，并且可变重链结构域含有SEQ ID NO:3、4、9或43中的任何一个或多个。
具体地，可变轻链结构域含有SEQ ID NO:6，并且可变重链结构域是SEQ ID NO:3、4、9或43中的任何一个或多个。
具体地，可变轻链结构域含有SEQ ID NO:7，并且可变重链结构域是SEQ ID NO:3、4、9或43中的任何一个或多个。
具体地，可变轻链结构域含有SEQ ID NO:8，并且可变重链结构域是SEQ ID NO:3、4、9或43中的任何一个或多个。
在另外的实施方案中，所述抗oxMIF抗体包含SEQ ID NO:14和18与上面列出的可变轻链和重链结构域中的任何一个的组合。
Fcγ受体(FcγR)是被充分描述的蛋白质家族，包括膜结合的表面受体、非典型细胞内受体和胞质糖蛋白。FcγR控制体液免疫和先天免疫，这对于对感染的适当反应和对慢性炎症或自身免疫性疾病的预防至关重要。膜结合的受体是例如FcγRlla、FcyRllb-、FcyRllla和FcyRIa受体。抗体可以通过与FcγR相互作用来调节免疫反应。
在先天免疫效应细胞上，激活性和抑制性FcγR为免疫复合物激活细胞设置了阈值。由FcγR调节的效应子反应的重要例子是吞噬作用、ADCC和炎症介质的释放。在树突状细胞(DC)上，成对的FcγR表达调节细胞成熟和抗原呈递，从而间接控制细胞免疫反应。在B细胞上，抑制性FcγRIIB对于维持体液耐受至关重要。它在类别转换记忆B细胞、成浆细胞或浆细胞水平上充当晚期检查点。另外，FcγRIIB在调节浆细胞稳态和存活方面具有重要作用。抗体-FcγR相互作用受几种因素的影响，所述因素影响激活性和抑制性FcγR(诸如细胞因子)的表达水平或改变抗体-FcγR相互作用(诸如差异性抗体糖基化)的亲和力。根据特定的糖基化模式，IgG分子可以具有增强的促炎或抗炎活性。重要的是，抗体糖基化在免疫反应过程中受到调节。
非典型FcγR是新生儿Fc受体(FcRn)和细胞质糖蛋白，诸如补体因子C1q蛋白。FcRn由内皮细胞表达，内皮细胞通过胞饮作用将包括来自血流的可溶性IgG在内的血清组分内化。IgG与FcRn的结合是pH依赖性的；内体隔室内的酸性pH(pH 6.0)允许IgG与FcRn结合。再循环回到细胞表面后，IgG在生理pH(约pH 7.2)下从FcRn解离，释放回血液循环中，并且从而受保护免于溶酶体降解，导致IgG半衰期延长。因此，FcRn的功能是作为负责维持循环中IgG和白蛋白的胞吞转运受体的再循环。导致与FcRn结合有关的Fc减少或沉默的Fc区修饰是本领域已知的，并且描述于例如Kenanova V.等人,2005和Pyzik M.等人2019。
如本文所用的“效应子功能”意指由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。
如本文所用的“效应细胞”意指表达一种或多种Fc受体并且介导一种或多种效应子功能的免疫系统细胞。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans’cell)、自然杀伤(NK)细胞和T细胞，并且可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。根据本发明，本文所述的抗oxMIF抗体由于重链恒定区(具体地Fc区)中选定位置处的氨基酸取代而具有沉默的效应子功能。由于补体和FcγR介导的活性降低而导致的这些抗体的降低或沉默的效应子功能可以包括降低或根除的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
如本文所用的术语“Fc”或“Fc区”(或片段可结晶区)是指包含抗体恒定区的多肽，不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域(CH1结构域)以及在一些情况下铰链的一部分。Fc区是指抗体的C末端区域。Fc区由两个相同蛋白片段构成，所述蛋白片段分别衍生自抗体两条重链(链A和链B)的第二恒定区和第三恒定区。第二恒定区和第三恒定区分别称为CH2结构域和CH3结构域。CH2结构域包含链A的CH2结构域序列和链B的CH2结构域序列。CH3结构域包含链A的CH3结构域序列和链B的CH3结构域序列。如本文所用，Fc区包括铰链区或其一部分。
根据EU编号，人IgG Fc区序列的“CH2结构域”通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域序列是独特的，因为它不与另一个结构域序列紧密配对。相反，在完整天然IgG分子的两个CH2结构域序列之间插入两个N连接的支链碳水化合物链。
“CH3结构域”包含在Fc区序列中CH2结构域序列的C末端的残基延伸段(即，根据EU编号，从IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
“功能Fc区”具有天然Fc区的“效应子功能”和FcRn结合。示例性“效应子功能”包括C1 q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；等等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)结合，并且可以使用本领域已知和如本文公开的各种测定进行评估。
“天然Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区和天然序列人IgG3 Fc区及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含由于“一个或多个氨基酸取代”而不同于天然Fc区序列的氨基酸序列。与天然Fc区序列或亲本多肽的Fc区序列相比，变体Fc区序列具有至少一个氨基酸取代，例如在天然Fc区序列或亲本多肽的Fc区序列中约1至约20个氨基酸取代并且优选约1至约17个氨基酸取代。在某些实施方案中，本文的变体Fc区序列与天然Fc区序列和/或亲本多肽的Fc区序列具有至少约80％的同一性并且最优选与其具有至少约90％的同一性、更优选至少约95％的同一性。
在一具体实施方案中，根据EU编号，参考IgG1，氨基酸取代在位置E233、L234、L235、G236、I253、G237、P238、D265、S267、H268、N297、S298、T299、H310、E318、L328、P329、A330、P331和H435中的任一者处。
导致与效应子功能有关的Fc减少或沉默的Fc区修饰是本领域已知的，并且描述于Saunders K.,2019和Liu R.等人,2020中。
在一替代实施方案中，氨基酸取代在CH2结构域中的位置L234F、H268Q、K274Q、Y296F、A327G、A330S、P331S以及CH3结构域中的R355Q、K409R、Q419E、P445L中的任何一个或全部处。
具体地，本文所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体包含以下氨基酸取代或缺失的组合中的一个或多个：
i)L235、G237和E318，具体地L235A、G237A和E318A；
ii)L234、L235，具体地L234A、L235A；
iii)S228、L235，具体地S228P、L235E；
iv)G236、L328，具体地G236R、L328R；
v)S298、T299，具体地S298G、T299A；
vi)L234、L235、P331，具体地L234F、L235E、P331S；
vii)H268、V309、A330、P331，具体地H268Q、V309L、A330S、P331S；
viii)E233、L234、L235、G236、S267，具体地E233P、L234V、L235A、G236del、S267K；
ix)L234、L235、P329，具体地L234A、L235A、P329G；
x)V234、G237、P238、H268、A330、P331，具体地V234A、G237A、P238S、H268A、A330S、P331S；
xi)L234、L235、D265，具体地L234F、L235E、D265A；
xii)D265，具体地D265A；
xiii)G237，具体地G237A；
xiv)E318，具体地E318A；
xv)E233，具体地E233P；
xvi)G236、L328，具体地G236R、L328R；
xvii)L235，具体地L235E；
xviii)L234、L235、P331，具体地L234Q、L235F、P331S；
xix)L234、L235、G237、P238、H268、A330、P331，具体地L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、P331S。
xx)N297，具体地N297A、N297Q或N297G，导致非糖基化抗体。
糖基化(O-糖基化和N-糖基化)是Ab的翻译后修饰，所述翻译后修饰可能受一系列B细胞刺激的调节，包括环境因素诸如应激或疾病、细胞因子活性和先天免疫信号传导受体，诸如Toll样受体。亲本抗体的糖基化模式可以通过本领域众所周知的方法进行修饰。具体地，O-连接的糖基化位点位于CH2和铰链区。
在另外的实施方案中，氨基酸取代在CH2结构域中的位置I253和H310以及CH3结构域中的位置H435中的任何一个或全部处。
具体地，本文所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体包含以下氨基酸取代的组合中的一个或多个：
i)I253A
ii)H310A
iii)H435，具体地H435A、H345Q或H435R
iv)I253A和H310A
v)I253A和H310A以及H435Q、H435A和H435R中的一个
vi)H310A以及H435Q、H435A和H435R中的一个。
但是，根据EU编号，本文所述的CH结构域中的沉默和进一步突变也可以在相应位置处引入野生型IgG2、IgG3或IgG4的Fc中。
术语“非糖基化的”表明Fc区没有糖基化。已知IgG同种型的所有人恒定区在位置297处的天冬酰胺残基处被糖基化，这构成了N-糖基化基序天冬酰胺297-X 298-丝氨酸299或苏氨酸299的一部分，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸的残基。聚糖具有七糖核心和可变延伸段，诸如岩藻糖、半乳糖和/或唾液酸。因此，本发明的抗体可以通过将这样的恒定区中的天冬酰胺297用另一种不能通过酶手段糖基化或去糖基化的氨基酸替代而被非糖基化。可以潜在地使用任何其他氨基酸残基，但丙氨酸是最优选的。可替代地，在天冬酰胺297处的糖基化可以通过改变基序的一个其他残基来防止，例如通过用脯氨酸替代残基298或者用除丝氨酸或苏氨酸之外的任何氨基酸替代残基299。用于进行这种定点诱变的技术是本领域技术人员众所周知的，并且例如可以使用可商购定点诱变试剂盒来进行。
术语“沉默的Fc”是指抗体的Fc区，其效应子功能和/或FcRn结合由于糖基化模式的氨基酸取代或修饰产生经修饰的聚糖而减少或消除，所述经修饰的聚糖减少或消除抗体与任何FcγR(诸如FcγRIIaH、FcγRllaR、FcyRllb、FcyRlllaF、FcyRlllaV、和FcyRIa和/或FcRn受体)以及补体因子C1 q蛋白的结合。这种结合的减少或消除导致典型地由野生型IgGFc区介导的效应子功能和/或FcRn结合的减少或消除。
如果FcγR结合(诸如任何FcγRlla、FcyRll、FcyRllla、和FcyRIa和/或FcRn受体)以及与补体因子C1 q蛋白的结合被完全根除，则本文中可以使用术语“Fc无效”。
通过突变L234和L235的组合可以实现很大程度的Fc沉默，这些残基位于铰链区域附近并且当被丙氨酸取代时降低FcyR结合。例如，L234A和L235A与P329G的组合可能导致所有FcyR同种型的FcyR相互作用几乎完全抑制。
与亲本多肽或包含天然Fc区序列的多肽相比，FcyR结合亲和力和C1q结合亲和力大大降低、沉默、可忽略或根除的Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段是一种具有减弱的FcyR结合活性和C1q结合活性的Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，与亲本多肽或包含天然Fc区序列的多肽相比，FcR结合亲和力和C1q结合亲和力大大降低、沉默、可忽略或根除的Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段还具有大大降低、沉默、可忽略或根除的ADCC、ADCP和CDC活性。显示与FcyR的结合降低或检测不到的Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段可能以低于亲本多肽的亲和力结合所有FcyR。显示与FcyR的结合降低的此类变体可能具有很少或不明显的与FcyR的结合。在一个具体实施方案中，与天然IgG Fc区相比，变体显示出0-20％的FcyR结合，例如，如通过平衡常数的变化测量的。在一个实施方案中，与天然IgG Fc区相比，变体显示出0-10％的FcyR结合。在一个实施方案中，与天然IgG Fc区相比，变体显示出0-5％的FcyR结合。在一个实施方案中，与天然IgG Fc区相比，变体显示出0-1％的FcyR结合。
具有沉默的补体活性的本文所述抗体可以通过基于细胞的CDC测定来确定，并且通过即SPR或ELISA来确定与C1q的结合的减少或根除。
与参考(即，未经修饰的野生型抗体，例如C0008)相比，降低或沉默的CDC活性被确定为下调至少1.5倍，具体地至少2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍，更具体地至少10倍。
与参考抗体(即，未经修饰的野生型抗体，例如C0008)相比，降低的ADCC或ADCP活性被确定为至少2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍，更具体地至少10倍的效力降低。
在一具体实施方案中，Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段由于重链恒定区中选定位置处的氨基酸取代而显示出与FcRn的结合减少。本发明的Fc沉默的抗oxMIF抗体与FcRn的结合降低导致在循环中的半衰期减少并且体内清除率更快。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期的确定(参见例如，Petkova,S.B.等人,2006)。
与包含野生型IgG Fc区的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段相比展现出降低的FcRn结合的Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段的Fc结构域可以优选地包含在位置I253、H310和H435中的任一者处包含一个、两个或三个氨基酸取代的Fc结构域。
与参考抗体(即，未经修饰的野生型抗体，例如C0008)相比，降低的FcRn结合(即，亲和力)被确定为至少2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍，更具体地至少10倍的结合降低(即，亲和力)。
在另外的实施方案中，通过组合氨基酸位置L234、L235、H310和H435处的突变，可以实现甚至更大程度的Fc沉默。这些残基位于Fc区中并且可以导致几乎完全抑制FcyR相互作用。
具体地，Fc沉默的抗oxMIF抗体包含表1A中列出的如根据Kabat、IMGT和MacCallumRM等人,1996(CONTACT)定义的任何一种或多种CDR：
oxMIF结合特异性可以通过适于确定与oxMIF的选择性结合的任何测定来确定，诸如针对对照抗体(诸如伊玛鲁单抗)与oxMIF结合的任何竞争测定或本领域已知的和如本文公开的各种测定。
本文中的术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且涵盖由抗体结构域组成或包含抗体结构域的多肽或蛋白质，所述抗体结构域被理解为免疫球蛋白重链和/或轻链的恒定和/或可变结构域，具有或不具有接头序列。所述术语涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体、三特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出所希望的抗原结合活性(即，与oxMIF结合)即可。所述术语还涵盖融合蛋白，诸如与免疫毒素的融合物；或抗体缀合物，诸如与oxMIF结合的抗体药物缀合物。
抗体结构域可以具有天然结构或通过诱变或衍生进行修饰，例如以改变抗原结合特性或任何其他特性，诸如稳定性或功能特性，诸如与Fc受体诸如FcRn和/或Fc-γ受体的结合。如果多肽序列包含β-桶状结构，则被认为是抗体结构域，所述β-桶状结构由通过环序列连接的抗体结构域结构的至少两条β链组成。
应当理解，术语“抗体”包括抗原结合衍生物、变体及其片段。衍生物或变体是一个或多个本发明抗体结构域或抗体的任何组合和/或融合蛋白，在所述融合蛋白中，本发明抗体的任何结构域可以在一种或多种其他蛋白质的任何位置融合，所述其他蛋白质诸如其他抗体或抗体形式(例如，包含CDR环的结合结构)、受体多肽，而且还有配体、支架蛋白、酶、标记、毒素等。
术语“抗体”应特别是指展现出与靶抗原oxMIF的结合特性的多肽或蛋白质。
术语“抗体片段、抗原结合片段、抗原结合变体或抗体变体”可以互换使用，并且是指除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体的抗原结合部分，所述抗原结合部分结合完整抗体所结合的抗原；以及由抗体片段或变体形成的多特异性抗体，并且进一步包含如本文所述的变体Fc区。抗原部分的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、单链抗体分子(例如，scFv)、双抗体、交叉-Fab片段；线性抗体。根据本发明，抗体片段或变体通过铰链区和/或接头融合到沉默的Fc部分或沉默的Fc结构域(例如，(scFv)-Fc、(scFv)2-Fc、scFv/scFv-Fc、Fab/scFv-Fc、Fab/(scFv)2-Fc、Fab/Fab-scFv-Fc、Fab/Fab-交叉Fab-Fc、IgG-scFv和IgG-(scFv)2)。
另外，抗体片段包含单链多肽，所述单链多肽具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域组装在一起，或具有VL结构的域特征，即能够与VH结构域组装在一起，成为功能抗原结合位点并且从而提供全长抗体的抗原结合特性。如本文所提及的抗体片段还涵盖包含一个或多个含有抗原结合区的结构环区的沉默的Fc结构域，诸如FcabTM；或者具有IgG结构的全长抗体形式，其中沉默的Fc区已被含有第二不同抗原结合位点的FcabTM替代。
如本文所用，“Fab片段或Fab”是指抗体片段，所述抗体片段包含含有轻链(CL)的VL结构域和恒定结构域的轻链片段以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)。本发明的抗体可以包含至少一个Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。由于可变区或恒定区的交换，所述Fab片段也被称为“交叉-Fab片段(cross-Fab fragment)”或“交叉Fab片段(crossover Fab fragment)”。交叉Fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的抗体中。Fab重链和轻链的可变区可以交换，即交叉Fab分子包含肽链。根据本发明，Fab通过铰链区与沉默的Fc-部分或沉默的Fc-结构域融合。
如本文所用，“Fab臂”是指通过铰链区融合到沉默的Fc-部分或沉默的Fc-结构域的Fab片段。
“(scFv)2”是指作为融合蛋白的人工单克隆抗体，所述融合蛋白由在单条约50千道尔顿的肽链上的两种不同抗体或相同抗体的单链可变片段(scFv)或来自四个或两个不同基因的氨基酸序列组成。
“bs(scFv)2”是指作为融合蛋白的人工单克隆抗体，所述融合蛋白由在单条约50千道尔顿的肽链上的具有不同靶抗原的两个抗体单链可变片段(scFv)或来自四个不同基因的氨基酸序列组成。
术语“功能变体”或“功能活性变体”还包括天然存在的等位基因变体以及突变体或任何其他非天然存在的变体。如本领域中所知，等位基因变体或也称为同源物是核酸或肽的替代形式，其特征在于具有一个或多个核苷酸或氨基酸的取代、缺失或添加，所述取代、缺失或添加基本上不会改变所述核酸或多肽的生物功能。具体地，功能变体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加或其组合，所述取代、缺失和/或添加是保守修饰并且不改变抗原结合特性。具体地，如本文所述的功能变体包含不超过或最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代、缺失和/或添加，所述取代、缺失和/或添加是保守修饰并且不改变抗体的功能。具体地，如本文所述的功能活性变体包含最多15个、优选最多10个或5个氨基酸取代、缺失和/或添加，所述取代、缺失和/或添加是保守修饰并且不改变抗体的功能。
功能变体可以通过多肽或核苷酸序列中的序列改变获得，例如通过一个或多个点突变，其中当与本发明组合使用时，序列改变保留或改善了未改变的多肽或核苷酸序列的功能。此类序列改变可以包括但不限于(保守)取代、添加、缺失、突变和插入。保守取代是在侧链和化学特性相关的氨基酸家族中发生的取代。此类家族的实例是具有碱性侧链、酸性侧链、非极性脂族侧链、非极性芳族侧链、不带电荷的极性侧链、小侧链、大侧链等的氨基酸。
点突变被特别理解为对多核苷酸的工程化，其通过一个或多个单独氨基酸的缺失或插入或通过由于取代而引起的交换，导致与非工程化氨基酸序列不同的氨基酸序列的表达。
根据具体实施方案，本文所述的抗体可以包含一个或多个用于纯化和/或检测的标签，诸如但不限于亲和标签、溶解度增强标签和监测标签。
具体地，亲和标签选自由以下组成的组：多聚组氨酸标签、多聚精氨酸标签、抗体的肽底物、甲壳质结合结构域、RNA酶S肽、蛋白A、β-半乳糖苷酶、FLAG标签、Strep II标签、链霉亲和素结合肽(SBP)标签、钙调蛋白结合肽(CBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、HA标签和c-Myc标签，具体地所述标签是包含一个或多个H的His标签，诸如六组氨酸标签。
“融合”或“连接”意指组分(例如，Fab分子和Fc结构域亚基)通过肽键直接或经由一个或多个肽接头连接。
如本文所用的术语“接头”是指肽接头，并且优选是具有长度为2、3、4、5、6、7或更多个氨基酸、优选长度为2-10个氨基酸、更优选长度为3-5个氨基酸的氨基酸序列的肽。
术语“免疫球蛋白”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻(CL)结构域，也称为轻链恒定区。IgG类免疫球蛋白基本上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。免疫球蛋白的重链可以分配到五种类型之一，称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以分配到两种类型之一，称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种，通常通过重组DNA技术制备。嵌合抗体可以包含兔或鼠可变区和人恒定区。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA链段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA链段的表达免疫球蛋白基因的产物。用于产生嵌合抗体的方法涉及常规重组DNA，并且基因转染技术是本领域众所周知的(Morrison,S.L.,等人,1984)。
“人抗体”具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或者衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这一定义具体地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。如针对嵌合抗体和人源化抗体所提到的，如本文所用的术语“人抗体”还包括这样的抗体，其恒定区被修饰，例如通过“类别转换”，即Fc部分的改变或突变(例如，从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4的突变)。
如本文所用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如从宿主细胞诸如HEK细胞、NS0或CHO细胞中或从针对人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体，或使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然衍生自人类种系序列并且与之相关，但可能不天然存在于体内的人抗体库内。
“人类共有框架”是一种代表选择的人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，选择的人免疫球蛋白VL或VH序列来自可变结构域序列的亚组。通常，所述序列亚组是如Kabat等人,1991中描述的。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和经过人源化的人框架区(FR)的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个并且典型地两个可变结构域，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体可以任选地包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。具体地，本发明涵盖人源化抗体的形式，其中恒定区已从原始抗体的恒定区被额外修饰或改变以产生新的特性，即关于降低或根除的C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。
如本文所用的术语“双特异性”应是指至少与oxMIF抗原和另一种抗原(诸如但不限于例如CD3或HSG抗原)的结合反应。双特异性抗体具体地可以包含至少两个具有特异性结合特性的位点，其中两个不同的靶抗原oxMIF和另一个抗原被抗体识别。示例性双特异性抗体形式可以包含两个结合位点，其中每个结合位点能够特异性结合不同的抗原，例如CD3或HSG和oxMIF。另外的示例性双特异性形式可以包含多于两个结合位点，其中一个或多个结合位点结合oxMIF，并且一个或多个结合位点能够特异性结合一个或多个不同抗原，例如CD3或HSG。
根据本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同结合特异性的抗体。双特异性抗体可以制备为如本文所述的全长抗体或抗体片段，但仍包含沉默的Fc区。免疫球蛋白Fc异二聚体可以通过对CH3结构域界面的修饰进行工程化，其中每个结构域上具有不同的突变，使得携带CH3变体对的工程化Fc片段优先形成异二聚体而不是同二聚体(Ha J-H.等人,2016)。双特异性抗体形式的实例可以是但不限于双特异性IgG(BsIgG)、附加有额外抗原结合部分的IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白、BsAb缀合物、杂交bsIgG、经修饰的Fc融合蛋白、附加的IgG-HC融合体、附加的IgG-LC融合体、附加的IgG-HC&LC融合体、Fc融合体、CH3融合体、F(ab’)2融合体、CH1/CL、经修饰的IgG、Fc修饰的IgG、双抗体等，如Spiess C.等人,2015以及Brinkmann U.和Kontermann R.E.,2017中所描述。
在涵盖本文所述双特异性抗体或抗体片段的替代实施方案中，术语“IgG-scFv”是指这样的双特异性抗体，其通过将一个scFv融合到单特异性免疫球蛋白G(IgG)上而被工程化为具有双特异性。根据本发明，双特异性抗体是Fc沉默的，即它们包含野生型人IgG的变体Fc区，其具有一个或多个本文所述的氨基酸取代或糖基化修饰。IgG的特异性可以针对oxMIF，并且scFv的特异性可以针对CD3或HSG，或反之亦然。此外，轻链或重链之一的氨基末端或C末端可以附加有scFv，这导致产生多样类型的IgG-scFv双特异性抗体(BsAb):(i)IgG(H)-scFv，一种与全长IgG HC之一的C末端连接的scFv；(ii)scFv-(H)IgG，其与IgG(H)-scFv相同，不同之处在于scFv与HC N末端连接；(iii)IgG(L)-scFv或；(iv)scFv-(L)IgG，scFv连接到IgG轻链的C或N末端，分别形成IgG(L)-scFv或scFv-(L)IgG。具体地，IgG-scFv在165kDa至185kDa的范围内，具体地其为约175kDa。
根据替代实施方案，将重组可变结构域(诸如双抗体)融合到沉默的Fc区(例如，scDb-Fc)可以显著增加效价。增加的大小还可以延长双抗体在血清中的半衰期。
术语“双抗体”是指单链抗体(scFv)片段的非共价二聚体，其由通过小肽接头连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成。双抗体的另一种形式是单链(Fv)2，其中两个scFv片段相互共价连接。另外，通过用内部接头串联每条链中的基因，四个VH和VL结构域可以串联表达并且折叠为单链双抗体(scDb)，这也是产生双特异性抗体的有效策略。具体地，双抗体-CH3具有约125kDa。
在一具体实施方案中，术语Fab/bs(scFv)2-Fc是指双特异性抗体，其中一个Fab臂被bs(scFv)2替代而第二IgG臂被保留的IgG。
在一具体实施方案中，术语Fab/scFv-Fc是指双特异性抗体，其中一个Fab臂被scFv替代而第二IgG臂被保留的IgG。如本文所描述和如图12示意性所示，抗体C0132用作Fab/scFv-Fc的非限制性实例。
在一具体实施方案中，术语Fab/Fab-scFv-Fc是指双特异性抗体，其中一个Fab臂被Fab-scFv替代而第二IgG臂被保留的IgG。如本文所描述和如图12示意性所示，抗体C0133用作Fab/Fab-scFv-Fc的非限制性实例。
术语“交叉Mab”(其中Mab是指单克隆抗体)是一种衍生自独立亲本抗体的双特异性Ab形式。重链错配是通过应用旋钮-入-孔(knobs-into-holes，KIH)方法来避免的。避免了轻链错配，因为双特异性抗体是通过抗体结构域交换产生的，而一个Fab臂的可变结构域或恒定结构域(CL和CH1)在轻链与重链之间交换。这种“交叉”保持抗原结合亲和力，并且还保留两个不同的臂，以便避免轻链错配。交叉Mab的实例可以是但不限于在不同区交换的Fab、VH-VL和CH1-CL。在交叉MAb Fab中，完整VH-CH1和VL-CL区被交换；在交叉MAb VH-VL形式中，仅交换VH和VL区；在交叉MAb CH1-CL1形式中，双特异性抗体的CH1和CL区被交换。具体地，交叉MAb具有约150kDa。
本发明的oxMIF抗体可以进一步包含至少一个特异性识别另外表位的结合位点，所述另外表位例如CD3的表位，具体地人CD3的表位，包括细胞表面上存在的CD3g(γ)链、CD3δ(德尔塔)链和CD3ε(伊普西龙)链。T细胞上CD3的簇集(诸如通过固定的抗CD3抗体)导致T细胞激活，类似于T细胞受体的接合，但不依赖于其克隆典型特异性。在某些实施方案中，本文所述抗体的CD3结合结构域不仅展现出与人CD3的强效CD3结合亲和力，而且还显示出与相应食蟹猴CD3蛋白的优异交叉反应性。在一些情况下，抗体的CD3结合结构域与来自食蟹猴的CD3交叉反应。在一个实施方案中，抗CD3结合位点包含本文所述抗CD3结合结构域的一个或多个(例如，所有三个)轻链互补决定区和/或本文所述抗CD3结合结构域(例如，包含一个或多个(例如，所有三个)LC CDR和一个或多个(例如，所有三个)HC CDR的抗CD3结合结构域)的一个或多个(例如，所有三个)重链互补决定区。
根据另外的实施方案，所述抗体可以包含一个或多个额外结合位点，所述额外结合位点特异性识别效应T细胞、NK细胞或巨噬细胞上表达的一种或多种抗原，具体地CD3、ADAM17、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11a、CD11b、CD14、CD16、CD16b、CD25、CD28、CD30、CD32a、CD40、CD 40L、CD44、CD45、CD56、CD57、CD64、CD69、CD74、CD89、CD90、CD137、CD177、CEAECAM6、CEACAM8、HLA-DRα-链、KIR、LSECtin或SLC44A2中的一种或多种，或一种或多种半抗原，即HSG。
根据一替代实施方案，本发明的抗体是双特异性抗体，其进一步包含莫妥珠单抗(mosunetuzumab)、帕妥昔珠单抗(pasotuxizumab)、赛必妥单抗(cibisatamab)、奥特利兹单抗(otelixizumab)、特普利珠单抗(teplizumab)、维西珠单抗(visilizumab)或福雷芦单抗(foralumab)的CD3可变结合结构域中的一个或多个。
根据一具体实施方案，抗CD3结合位点包含选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：莫罗单抗(muromonab)-CD3(OKT3)、奥特利兹单抗(TRX4)、特普利珠单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、索利托单抗(solitomab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、帕妥昔珠单抗、赛必妥单抗、莫妥珠单抗、SP34、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1和WT-31及其任何人源化衍生物，如果适用的话。
具体地，莫罗单抗、奥特利兹单抗、特普利珠单抗、维西珠单抗、索利托单抗、博纳吐单抗、帕妥昔珠单抗、赛必妥单抗、莫妥珠单抗的抗CD3可变区的一个或多个CDR或者包含其任何CDR序列或与其任何CDR序列具有至少70％，具体地80％、90％、95％或99％序列同一性的CDR可以用作根据本发明的CD3结合结构域。
所述与CD3结合的特异性CDR如下：
表1B：抗CD3重链序列
表2：抗CD3轻链序列
更具体地，双特异性抗oxMIF/抗CD3抗体在上面列出的每个CDR序列中包含0、1或2个点突变。
另外的具体实施方案涉及抗oxMIF/抗CD3 bs(scFv)2，其中相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(VL)的区域从N末端到C末端以VH(oxMIF)-VL(oxMIF)-VH(CD3)-VL(CD3)、VH(CD3)-VL(CD3)-VH(oxMIF)-VL(oxMIF)或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(oxMIF)-VH(oxMIF)顺序排列。根据本发明，bs(scFv)2通过铰链区与沉默的Fc-部分或沉默的Fc-结构域融合。
根据另外的实施方案，本发明的Fc沉默的抗oxMIF抗体可以还包含至少一个进一步特异性识别HSG(组胺-琥珀酰-甘氨酸)半抗原的结合位点。
根据一具体实施方案，抗HSG结合位点包含选自以下的互补决定区(CDR)：小鼠(m)抗HSG抗体679(m679)及其任何人源化(hz)衍生物(如果适用)。
这种双特异性抗oxMIF抗体可以包含特异性识别HSG的结合位点，其包含如下表3和表4中列出的CDR(hz抗HSG抗体679(Hz679)序列来自US2009/0240037 A1)。
表3：抗HSG重链序列
表4：抗HSG轻链序列
更具体地，双特异性抗oxMIF/抗HSG抗体在上面列出的每个CDR序列中包含0、1或2个点突变。
另外的具体实施方案涉及抗oxMIF/抗HSG bs(scFv)2，其中相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(VL)的区域从N末端到C末端以VH(oxMIF)-VL(oxMIF)-VH(HSG)-VL(HSG)、VH(HSG)-VL(HSG)-VH(oxMIF)-VL(oxMIF)或VH(HSG)-VL(HSG)-VL(oxMIF)-VH(oxMIF)顺序排列。根据本发明，bs(scFv)2通过铰链区与沉默的Fc-部分或沉默的Fc-结构域融合。
在另外的实施方案中，所述抗体是Fc沉默的双特异性抗体，具体地选自由以下组成的组：双特异性IgG、附加有CD3或HSG结合位点的IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白、BsAb缀合物。
在实体瘤中直接放射性标记的抗体的缓慢的血液清除和延迟的肿瘤摄取导致持续高辐射剂量暴露于健康组织和器官。体内预靶向放射免疫疗法(PRAIT)允许克服这些限制，但用于PRAIT的bsMab形式的选择和设计仍然具有挑战性。与直接放射性标记的抗体或抗体片段相比，PRAIT旨在通过向肿瘤递送增加的吸收剂量来提高治疗指数(肿瘤与正常组织的比率)。PRAIT涉及施用针对HSG和肿瘤靶标的bsMab，几天后施用放射性标记的二价HSG半抗原。使用这种技术，显著量的bsMAb在肿瘤中积累并且在很大程度上从循环中清除，并且放射性标记的二价HSG半抗原与肿瘤中积累的bsMab结合，而未结合的放射性HSG半抗原在几小时内通过肾脏从循环中清除。因此，导致正常器官暴露于放射的程度最小化(US2005/0025709,Sharkey RM等人,2005,Rossi EA等人,和Karacay H.等人,2005)。
对于靶向放射性核素疗法，可以使用例如HSG半抗原IMP288(如US2005/0025709中所描述的)和作为放射性核素的177Lu。IMP288是一种DOTA缀合的D-Tyr-D-Lys-D-Glu-D-Lys-NH2四肽，其中两个赖氨酸残基都经由其ε-氨基用HSG部分衍生。
如本文中与术语“靶标”或“靶抗原”互换使用的术语“抗原”应是指被抗体结合位点识别的完整靶分子或这种分子的片段。具体地，抗原的亚结构，例如多肽或碳水化合物结构，通常称为“表位”，例如免疫相关的B细胞表位或T细胞表位，可以被这种结合位点识别。
如本文所用的术语“表位”应特别是指这样的分子结构，其可以完全构成特异性结合配偶体或者是本发明抗体形式的结合位点的特异性结合配偶体的一部分。表位可以由碳水化合物、肽结构、脂肪酸、有机、生化或无机物质或其衍生物及其任何组合构成。如果肽结构(诸如肽、多肽或蛋白质)中包含表位，则其通常将包含至少3个氨基酸，具体地5至40个氨基酸，并且具体地少于10个氨基酸，具体地4至10个之间的氨基酸。表位可以是线性或构象表位。线性表位由多肽或碳水化合物链的一级序列的单一链段构成。线性表位可以是连续的或重叠的。构象表位由氨基酸或碳水化合物构成，所述氨基酸或碳水化合物通过折叠多肽而聚到一起形成三级结构，并且氨基酸不一定在线性序列中彼此相邻。这种oxMIF表位可以是位于oxMIF的中心区域内的序列EPCALCS(SEQ ID NO:42)。
术语“抗原结合结构域”或“结合结构域”或“结合位点”是指抗原结合部分的一部分，其包含特异性结合并且互补于抗原的一部分或全部的区域。当抗原很大时，抗原结合分子可能只与抗原的特定部分结合，所述部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文中关于本发明抗体所用的术语“结合位点”是指能够与抗原结合相互作用的分子结构。典型地，结合位点位于抗体的互补决定区(CDR)内，本文也称为“CDR结合位点”，其是具有赋予与各种抗原的结合功能的不同结构的特定区域。不同的结构可以衍生自天然的抗体库，例如鼠或人的库，或者可以重组或合成产生，例如通过诱变并且具体地通过随机化技术。这些包括诱变的CDR区、可变抗体结构域的环区，特别是抗体的CDR环，诸如任何VL和/或VH抗体结构域的CDR1、CDR2和CDR3环。如根据本发明使用的抗体形式典型地包含一个或多个CDR结合位点，每个位点特异于抗原。
本文所述抗体的oxMIF结合位点特异于氧化形式的MIF，即动物，具体地哺乳动物oxMIF，诸如但不限于小鼠、大鼠、猴和人，具体地人oxMIF，但对还原型MIF不显示出显著的交叉反应性。oxMIF是MIF的疾病相关结构同种型，其可以在患有炎性疾病的受试者的循环中以及在癌症患者的肿瘤组织中具体地和主要地检测到。在一个实施方案中，人源化或人抗oxMIF结合位点包含本文所述人源化或人抗oxMIF结合结构域的一个或多个(例如，所有三个)轻链互补决定区，诸如包含在例如SEQ ID NO:2、5、6、7或8中的CDR，和/或本文所述人源化或人抗oxMIF结合结构域的一个或多个(例如，所有三个)重链互补决定区，例如SEQ IDNO:3、4、9或43。
如本文所用的术语“特异性”应是指在异质分子群中决定感兴趣的同源配体的结合反应。在本文中，结合反应至少与oxMIF抗原发生。因此，在指定条件下，例如在免疫测定条件下，特异性结合其特定靶标的抗体不会以显著量结合样品中存在的其他分子，具体地，它不会对还原型MIF显示出显著的交叉反应性。
特定结合位点典型地不与其他靶标发生交叉反应。然而，特异性结合位点可以特异性结合靶标的一个或多个表位、同种型或变体，或者与其他相关靶抗原例如同源物或类似物交叉反应。
特异性结合意指结合在靶标身份、高、中或低结合亲和力或亲合力(如所选择的)方面是选择性的。如果与靶抗原诸如oxMIF的结合常数或结合动力学与作为非靶抗原的抗原的结合常数或结合动力学相比相差至少10倍，优选相差至少100倍并且更优选至少1000倍，则通常实现了选择性结合。
如本申请中使用的术语“价”表示抗体分子中存在特定数量的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”表示抗体分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。
如本文中关于抗体结合位点所用的术语“单价”应是指仅包含一个针对靶抗原的结合位点的分子。因此，术语“价”被理解为针对相同靶抗原的结合位点的数量，所述结合位点特异性结合抗原的相同或不同表位。
本发明的抗体被理解为包含特异性结合oxMIF的单价、二价、四价或多价结合位点。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中序列高变和/或形成结构明确的环(“高变环”)的每个区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1、H2、H3)中，并且三个在VL(L1、L2、L3)中。HVR通常包含来自高变环和/或“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别(Kabat等人,1991)。高变区(HVR)也称为互补决定区(CDR)，并且这些术语在本文中可互换使用，指的是可变区中形成抗原结合区的部分。涵盖特定CDR的确切残基数量将根据CDR的序列和大小而变化。给定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基包含特定CDR。
Kabat定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将这种“Kabat编号”系统分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。对于给定抗体，残基的Kabat编号可以通过将抗体序列的同源区域与“标准”Kabat编号的序列进行比对来确定。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人,1983,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest”提出的编号系统。除非另有说明，否则对抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号的提及是根据Kabat编号系统的。恒定区的编号是根据EU编号索引的。
CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，它们是接触抗原的残基。SDR包含在称为缩短-CDR或a-CDR的CDR区域中。除非另有指示，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中是根据Kabat等人(同上)编号的。CDR的确定也可以根据IMGT(LefrancMP.1997)进行。IMGT对框架区(名为FR-IMGT)和CDR(名为CDR-IMGT)有其自己的定义。IMGT编号方法基于种系V序列比对从1至128连续计数残基。
CDR(或SDR)可以进一步根据MacCallum RM等人,1996来确定。在本文中，分析了接触抗原的残基，并且组合了可从蛋白质数据库(Protein Data Bank)获得的抗体Fv和Fab晶体结构中的位点形状。每个抗体残基都呈现了接触抗原的倾向，从而允许基于观察到的抗原接触情况提出CDR的定义。接触更常见于位于结合位点内中央的CDR残基处；一些不太中央的CDR残基只与大抗原接触。CDR内的非接触性残基与由Chothia及其合作者(Chothia C等人,1987)鉴定为在定义“规范”构象方面重要的残基相符。
“点突变”被特别理解为对多核苷酸的工程化，其对一个或多个单一(非连续)或双氨基酸进行取代或交换、缺失或插入为不同氨基酸导致与非工程化氨基酸序列不同的氨基酸序列的表达。优选的点突变是指相同极性和/或电荷的氨基酸的交换。在这方面，氨基酸是指由61个三联体密码子编码的20种天然存在的氨基酸。这20种氨基酸可以分为带中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸。
关于本文鉴定的多肽序列的“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并且引入空位(如果必要的话)以达到最大序列同一性百分比之后并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的全长序列上实现最大比对所需的任何算法。
根据本发明，可变区或恒定区序列与本文所述的相应序列的序列同一性是至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％。
“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物诸如猴)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的核酸”是指与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码抗oxMIF抗体的分离的核酸”是指一种或多种编码抗体重链和轻链(或其片段)的核酸分子，包括在单一载体或单独载体中的此类核酸分子以及存在于宿主细胞中一个或多个位置处的此类核酸分子。
“没有显著的交叉反应性”意指分子(例如，抗体)不识别或特异性结合与分子的实际靶抗原不同的抗原(例如，与靶抗原密切相关的抗原)，具体地是还原型MIF，特别是当与该靶抗原相比时。例如，抗体可以以少于约10％至少于约5％结合不同于实际靶抗原的抗原，或者可以以由以下组成的量结合不同于实际靶抗原的所述抗原：少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，优选少于约2％、1％或0.5％并且最优选少于约0.2％或0.1％结合至不同于实际靶抗原的抗原。结合可以通过本领域已知的任何方法来确定，诸如但不限于ELISA或表面等离子体共振。
本发明抗体的重组产生优选采用表达系统，例如包括含有编码抗体形式的核苷酸序列的表达构建体或载体。
术语“表达系统”是指含有可操作地连接的所希望的编码序列和控制序列的核酸分子，使得用这些序列转化或转染的宿主能够产生编码的蛋白质。为了实现转化，表达系统可以包含在载体上；然而，相关DNA也可以然后整合到宿主染色体中。可替代地，表达系统可以用于体外转录/翻译。
本文所用的“表达载体”被定义为克隆的重组核苷酸序列(即，重组基因)的转录以及其mRNA在合适的宿主生物体中的翻译所需的DNA序列。表达载体包含表达盒，并且另外通常包含在宿主细胞中自主复制的起点或基因组整合位点、一个或多个选择标记(例如，氨基酸合成基因或赋予针对抗生素(诸如吉欧霉素(zeocin)、卡那霉素、G418或潮霉素)的抗性的基因)、多个限制性酶切割位点、合适的启动子序列和转录终止子，所述组分可操作地连接在一起。如本文所用的术语“质粒”和“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合的核苷酸序列。
具体地，所述术语是指一种载体，通过所述载体可以将DNA或RNA序列(例如，外来基因)(例如，编码本发明抗体形式的核苷酸序列)引入宿主细胞中，从而转化宿主并且促进所引入序列的表达(例如，转录和翻译)。质粒是本发明的优选载体。
载体典型地包含可转移因子的DNA，其中插入有外来DNA。将一条DNA链段插入另一条DNA链段的常用方式涉及使用称为限制性酶的酶，所述酶在称为限制性位点的特定位点(特定核苷酸组)切割DNA。
“盒”是指编码表达产物的DNA编码序列或DNA链段，其可以在限定的限制性位点处插入载体中。盒限制性位点被设计成确保盒插入正确的阅读框中。通常，在载体DNA的一个或多个限制性位点处插入外来DNA，并且然后与可转移载体DNA一起被载体带入宿主细胞中。插入或添加了DNA的DNA链段或序列，诸如表达载体，也可以称为“DNA构建体”。一种常见类型的载体是“质粒”，所述质粒通常是双链DNA的自立分子，其可以容易地接受额外的(外来的)DNA并且可以容易地引入合适的宿主细胞。本发明的载体通常含有编码DNA和表达控制序列，例如启动子DNA，并且具有一个或多个适用于插入外来DNA的限制性位点。编码DNA是编码特定多肽或蛋白质(诸如本发明的抗体形式)的特定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是启动、调节或以其他方式介导或控制编码DNA的表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自相同的基因或不同的基因，并且可以来自相同或不同的生物体。本发明的重组克隆载体通常将包含一个或多个用于克隆或表达的复制系统、一个或多个用于在宿主中选择的标记(例如，抗生素抗性)以及一个或多个表达盒。
用于连接DNA序列(例如，分别提供或编码本发明因子和/或目的蛋白质、启动子、终止子和其他序列)并且将它们插入含有整合或宿主复制所需信息的合适载体中的程序是本领域技术人员众所周知的，例如由Sambrook等人,2012所述。
宿主细胞具体地理解为用表达构建体(诸如根据本发明的载体)转染的细胞、重组细胞或细胞系。
如本文所用的术语“宿主细胞系”是指已建立的特定细胞类型的克隆，其获得了在延长的时间段内增殖的能力。术语宿主细胞系是指如用于表达内源或重组基因以产生多肽(诸如本发明的重组抗体形式)的细胞系。
“生产宿主细胞”或“生产细胞”通常被理解为用于在生物反应器中培养以获得生产过程的产物(即，本发明的重组抗体形式)的细胞系或细胞培养物。根据本发明的宿主细胞类型可以是任何原核或真核细胞。
如本文所用的术语“重组”应意指“通过基因工程制备的”或“是基因工程的结果”，例如具体地采用掺入重组载体或重组宿主细胞中的异源序列。
本发明的抗体可以使用任何已知且非常确实的表达系统和重组细胞培养技术产生，例如通过在细菌宿主(原核系统)或真核系统诸如酵母、真菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达。本发明的抗体分子可以在转基因生物体(诸如山羊、植物或转基因小鼠，即具有人免疫球蛋白基因座的大片段并且有小鼠抗体产生缺陷的工程小鼠品系)中产生。抗体也可以通过化学合成产生。
根据一具体实施方案，所述宿主细胞是选自由以下组成的组的细胞的生产细胞系：CHO、PerC6、CAP、HEK、HeLa、NS0、SP2/0、杂交瘤和Jurkat。更具体地，宿主细胞获自CHO细胞。
具体地将本发明的宿主细胞在无血清培养物(例如，包含其他组分，诸如血浆蛋白、激素和生长因子，作为血清的替代物)中培养或维持。
当在无血清条件下并且任选地在不含任何动物源蛋白质/肽的培养基中建立、适应和完全培养时，宿主细胞是最优选的。
可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收本发明的抗oxMIF抗体。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其形式允许其中所含活性成分的生物活性有效并且其不含对将施用配制品的受试者具有不可接受毒性的额外组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除活性成分以外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、氨基酸诸如甘氨酸或组氨酸、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的物质的另外实例是润湿剂或少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们增强抗体的保存期或有效性。
如本文所用，“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指试图改变所治疗个体的自然病程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理过程中进行。希望的治疗作用包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减弱疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
本发明的抗oxMIF抗体和包含它的药物组合物可以与一种或多种其他治疗剂、诊断剂或预防剂组合施用。根据待治疗的疾病，另外的治疗剂包括其他抗赘生物剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂和化疗剂、类固醇或检查点抑制剂。
本发明的药物组合物可以呈多种形式，例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射和不输注溶液)、分散体或混悬剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗性应用。典型的优选组合物呈可注射或可输注溶液的形式，诸如类似于用于人类被动免疫的组合物。优选的施用方式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。在优选的实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射施用。在另一个优选实施方案中，抗体通过肌肉内或皮下注射施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或方式将根据所希望的结果而变化。
由于本发明抗体的优化和有利特性，可以施用高剂量的抗体组合物。具体地，所述组合物包含约10至250mg/ml的抗体，具体地25至100mg/ml，具体地≥50mg/ml。
抗oxMIF抗体可以施用一次，但更优选施用多次。例如，抗体可以从每天三次至每六个月或更长时间一次来施用。施用可以按计划进行，诸如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次和每六个月一次。
本发明还涉及包含抗oxMIF抗体或其抗原结合部分的组合物，用于治疗需要治疗MIF相关病症的受试者，所述MIF相关病症具体地是免疫疾病，诸如炎性疾病和过度增殖性障碍。在一些实施方案中，需要治疗的受试者是人。
如本文所用的术语“癌症”是指增殖性疾病，具体地是指实体癌，诸如结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌(SCC)(例如，头颈癌、食管癌和口腔癌)、肝细胞癌、结肠腺癌、肾癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、星形细胞瘤、成神经细胞瘤、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌和恶性精原细胞瘤，包括上述任何癌症的难治形式，或上述一种或多种癌症的组合。
可用本发明的抗oxMIF抗体治疗的过度增殖性障碍诸如癌性疾病或癌症可以涉及任何组织或器官，并且包括但不限于脑癌、肺癌、鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、头癌、颈癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌、食道癌、妇科癌、鼻咽癌或甲状腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。特别地，本发明抗oxMIF抗体可用于治疗卵巢癌、胰腺癌、结肠癌和肺癌。
在一具体实施方案中，高度适用于治疗癌性疾病、具体地治疗实体瘤的抗体是重组抗oxMIF抗体、其抗原结合片段、双特异性抗oxMIF/抗CD3抗体、或双特异性抗oxMIF/抗HSG抗体，其具有沉默的Fc以及降低的聚集潜力和降低的疏水性，其包含：
(a1)包含具有氨基酸取代M30L、F49Y、A51G、P80S、W93F中的至少一者的SEQ IDNO:2的轻链可变结构域，或
(a2)包含具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:2的轻链可变结构域，该轻链可变结构域还包含：
-在位置36处的保守酪氨酸，和
-氨基酸取代M30L、F49Y、A51G、P80S、W93F中的至少一者；以及
(b1)包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域；或
(b2)包含SEQ ID NO:3和氨基酸取代L5Q和/或W97Y的重链可变结构域，或
(b3)包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域，其具有氨基酸取代L5Q或W97Y中的至少一者和1、2、3、4或5个另外的氨基酸取代；
其中氨基酸位置是根据Kabat编号的，
其中与野生型IgG1 Fc区相比，所述变体Fc区展现出降低的FcγR结合，以及其中与缺乏所述氨基酸取代的包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗体相比，所述抗体或其抗原结合片段具有降低的聚集潜力和降低的疏水性。
本发明还涵盖用于治疗受试者(包括人)的炎性疾病的方法，所述炎性疾病诸如血管炎、关节炎、脓毒症、脓毒性休克、内毒素休克、中毒性休克综合征、获得性呼吸窘迫综合征、肾小球肾炎、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、腹膜炎、肾炎、特应性皮炎、哮喘、结膜炎、发热、疟疾、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、多发性硬化、急性和慢性胰腺炎、1型糖尿病、IgA肾病、间质性膀胱炎、COVID后综合征、银屑病、肾小球肾炎、炎性肠病、肾炎和腹膜炎、系统性红斑狼疮(SLE-包括狼疮肾炎)、哮喘、类风湿性关节炎(RA)和炎性肠病(IBD)，所述方法包括以下步骤：向所述有需要的受试者施用治疗有效量的抗oxMIF抗体或其抗原结合部分。
在一具体实施方案中，高度适用于治疗炎性或感染性疾病的抗体是具有沉默的Fc以及降低的聚集潜力和降低的疏水性的重组抗oxMIF抗体或其抗原结合片段，其包含以下可变结构域：
(a1)包含具有氨基酸取代M30L、F49Y、A51G、P80S、W93F中的至少一者的SEQ IDNO:2的轻链可变结构域，或
(a2)包含具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:2的轻链可变结构域，该轻链可变结构域还包含：
-在位置36处的保守酪氨酸，和
-氨基酸取代M30L、F49Y、A51G、P80S、W93F中的至少一者；以及
(b1)包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域；或
(b2)包含SEQ ID NO:3和氨基酸取代L5Q和/或W97Y的重链可变结构域，或
(b3)包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域，其具有氨基酸取代L5Q或W97Y中的至少一者和1、2、3、4或5个另外的氨基酸取代；
其中氨基酸位置是根据Kabat编号的，
其中与野生型IgG1 Fc区相比，所述变体Fc区展现出降低的FcγR结合，以及
其中与缺乏所述氨基酸取代的包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗体相比，所述抗体或其抗原结合片段具有降低的聚集潜力和降低的疏水性。
在另外的具体实施方案中，高度适用于治疗炎性或感染性疾病的抗体是本文所述的重组抗oxMIF抗体，其结合抑制性受体FcγRIIB的潜力也增加，或者具有高α2,6-N-连接的唾液酸化。
本发明进一步包括以下实施方案：
1.一种Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段包含野生型人IgG的变体Fc区，其包含具有一个或多个氨基酸取代或糖基化修饰的SEQ ID NO:1；以及
(a1)包含具有氨基酸取代M30L、F49Y、A51G、P80S、W93F中的至少一者的SEQ IDNO:2的轻链可变结构域，或
(a2)包含具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:2的轻链可变结构域，该轻链可变结构域还包含
-在位置36处的保守酪氨酸，和
-氨基酸取代M30L、A51G、P80S、W93F中的至少一者；以及
(b1)包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域；或
(b2)包含SEQ ID NO:3和氨基酸取代L5Q和/或W97Y的重链可变结构域，或
(b3)包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域，其具有氨基酸取代L5Q或W97Y中的至少一者和1、2、3、4或5个另外的氨基酸取代；
其中氨基酸位置是根据Kabat编号的，
其中与野生型IgG1 Fc区相比，所述变体Fc区展现出降低的FcγR结合，以及
其中与缺乏所述氨基酸取代的包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗体相比，所述抗体或其抗原结合片段具有降低的聚集潜力和降低的疏水性。
2.根据实施方案1所述的重组抗oxMIF抗体，所述重组抗oxMIF抗体包含氨基酸取代W93F和/或W97Y。
3.根据实施方案1或2所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，其中根据EU编号，所述氨基酸取代在SEQ ID NO:1的位置E233、L234、L235、G236、G237、P238、D265、S267、H268、N297、S298、T299、E318、L328、P329、A330、P331中的任一者处。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，其中所述Fc区是非糖基化的。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，其中所述氨基酸取代在位置L234和L235处，具体地在L234A和L235A处。
6.根据实施方案1所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含可变结构域，所述可变结构域包含选自由SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9和43组成的组的氨基酸序列。
7.根据实施方案1所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含：
i.)SEQ ID NO:3和6，
ii.)SEQ ID NO:9和6，
iii.)SEQ ID NO:4和6，
iv.)SEQ ID NO:4和8，或
v.)SEQ ID NO:4和5，
vi.)SEQ ID NO:43以及5、6、7或8中的任一者。
8.根据实施方案7所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体还包含SEQ ID NO:14。
9.根据实施方案1所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:15和16或17。
10.一种Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段包含野生型人IgG的变体Fc区，其包含具有一个或多个氨基酸取代或糖基化修饰的SEQ ID NO:1，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:72或78的轻链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:73、79、80或81的轻链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:74或82的轻链CDR3序列，和
选自SEQ ID NO:75的重链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:76或83的重链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:77或84的重链CDR3序列，条件是SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:77不包含在一起。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，其中根据EU编号索引，所述氨基酸取代在SEQ ID NO:1的位置E233、L234、L235、G236、G237、P238、I253、D265、S267、H268、N297、S298、T299、H310、E318、L328、P329、A330、P331、H435中的任一者处，具体地所述氨基酸取代在位置L234和L235处，具体地在位置L234、L235、H310和H435处，和/或其中所述Fc区是非糖基化的。
12.根据实施方案1至11中任一项所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体选自由以下组成的组：双特异性抗体(即，交叉mab)、scFv-Fc、(scFv)2-Fc、scFv/scFv-Fc、Fab/scFv-Fc、Fab/(scFv)2-Fc、Fab/Fab-scFv-Fc、Fab/Fab-交叉Fab-Fc、IgG-scFv和IgG-(scFv)2。
13.根据实施方案1至12中任一项所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，其中所述抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体进一步包含至少一个特异性识别CD3表位或组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)的结合位点。
14.根据项目13所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，其用于治疗或检测实体瘤，其中在第一步骤中向受试者施用所述抗体，并且在第二步骤中施用HSG半抗原，其中所述HSG半抗原与抗体结合并且被放射性核素标记。
15.根据实施方案1至13中任一项所述的Fc沉默的抗体，其用于制备药剂。
16.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1至13中任一项所述的抗体，任选地连同药物载体或佐剂一起。
17.根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述组合物包含10mg/ml至250mg/ml的根据实施方案1至13中任一项所述的抗体，具体地包含>50mg/ml。
18.根据实施方案16或17所述的药物组合物，其中所述药物组合物经配制用于皮下施用。
19.根据实施方案16至18中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物用于作为唯一的物质施用，或用于与包含一种或多种活性物质的另外的药物组合物一起施用，所述活性物质优选选自由以下组成的组：抗病毒物质、抗癌物质、抗炎物质和抗生素物质。
20.根据实施方案16至19中任一项所述的药物组合物，用于治疗患有炎性疾病、感染性疾病的患者，具体地用于治疗哮喘、血管炎、关节炎、脓毒症、脓毒性休克、内毒素休克、中毒性休克综合征、获得性呼吸窘迫综合征、肾小球肾炎、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、腹膜炎、肾炎、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、多发性硬化、急性和慢性胰腺炎、1型糖尿病、IgA肾病、间质性膀胱炎、COVID后综合征和银屑病。
21.根据实施方案16至19中任一项所述的药物组合物，其用于治疗患有过度增殖性障碍或癌症的患者，具体地治疗结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌。
22.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据实施方案1至13中任一项所述的抗体。
23.一种表达载体，所述表达载体包含根据实施方案22所述的核酸。
24.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有根据实施方案22所述的核酸或根据实施方案23所述的表达载体。
25.一种产生根据实施方案1至13中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括培养根据实施方案24所述的宿主细胞并且从细胞培养物中回收所述抗体。
实施例
本文描述的实施例是对本发明的说明而不是旨在对其限制。在不脱离本发明的范围的情况下，可以对本文描述和说明的技术进行许多修改和变化。因此，应该理解，这些实施例仅仅是说明性的并且不限制本发明的范围。
实施例1：实施例部分中使用的抗oxMIF抗体(表5A)和抗oxMIF×抗HSG双特异性抗体(表5B)的变体ID、序列组合和序列。
表5A：
表5B：
实施例2：新设计的抗oxMIF抗体的降低的聚集倾向和降低的疏水性
为了评估疏水性和聚集，通过使用两个不同SEC柱并且运行缓冲液条件的凝胶过滤(SEC)并且通过疏水相互作用色谱法(HIC)，与对照抗oxMIF抗体C0008以及无Fc沉默的其亲本抗体C0083和C0090相比分析新设计的抗体C0115和C0118。
对于SEC，将样品在1×磷酸盐缓冲盐水(1×PBS)中稀释至1mg/ml，并且将100μl样品以1.25ml/min的流速应用到Enrich 650(Bio-Rad)凝胶过滤柱上。在室温下在1×PBS中进行分离和平衡。使用在280nm处的吸光度监测蛋白质峰，并且使用ChromLab软件包(Bio-Rad)分析光谱。结果以主峰的保留体积(Vr，ml)报告，并且手动对聚集体的存在进行排序。
对于疏水相互作用色谱(HIC)分析，使用50mM磷酸盐和0.75M硫酸铵(pH 6.9)将所有样品稀释至1mg/ml的终浓度。将高度纯化的抗体样品(约100μg)独立装载到1ml HiTrapButyl HP柱上。注入100μl样品，并且在22℃下将柱流速维持在1ml/min。在0-100％B(缓冲液B：50mM磷酸盐、20％异丙醇；pH 7.0)的20倍柱体积(CV)梯度上进行峰分离。使用在280nm处的吸光度监测蛋白质峰，并且使用ChromLab软件包(Bio-Rad)分析光谱。
结果：对照抗体C0008证明了保留体积接近尺寸排阻柱的空隙体积(约16-18mlEnrich650)，这对应于分子量远小于人IgG的预期值(图1A和图1B)。不寻常的长期保留主要是由于与固定相表面的疏水相互作用。另外，除了高保留体积外，C0008还存在显著量的IgG二聚体和聚集体。所有新设计的抗体都显示出减少的保留体积(Vr)，表明与柱的相互作用减少，并且从而降低了分子的疏水性(表6，图1A和图1B)。当与分子量标准品相比时，新设计的抗体C0115和C0118显示出与单体人IgG的分子量相对应的保留体积(表6，图1B)。另外，在新设计的抗体C0115和C0118的样品中，抗体二聚体和聚集显著减少(图1B)。新的新设计的抗体C0115和C0118的Fc沉默突变分别与具有wt Fc的其亲本抗体C0083和C0090相比没有改变它们的SEC谱。
HIC柱保留体积是疏水性的量度，其中低保留体积的抗体比高保留体积的抗体疏水性低。(图1C)。与显示出非常高的疏水性的对照抗体C0008(保留体积约21ml)相比，新设计的抗体C0115和C0118表现出更低的疏水性(保留体积15-16ml)。新的新设计的抗体C0115和C0118的Fc沉默突变分别与具有wt Fc的其亲本抗体C0083和C0090相比没有改变它们的HIC谱。
结论：从SEC和HIC分析中明显的是，与对照抗oxMIF抗体C0008相比，新设计的抗体具有改善的生物化学特性，特别是降低的疏水性和聚集倾向。
表6尺寸排阻色谱法
图1示出了色谱图谱表明新设计的抗oxMIF抗体的聚集和疏水性降低。(A)使用1×PBS作为流动相在Enrich 650凝胶过滤柱上C0008(对照抗体，灰色区域)和新设计的抗体C0115和C0118的亲本抗体(C0083和C0090，无Fc沉默)的洗脱图谱的比较；(B)使用1×PBS作为流动相在Enrich 650凝胶过滤柱上C0008(对照抗体，灰色区域)和新设计的抗体C0115和C0118的洗脱图谱的比较；(C)在HiTrap Butyl HP HIC柱上C0008(对照抗体，灰色区域)和新设计的抗体C0115和C0118及其亲本抗体C0083和C0090(无Fc沉默)的洗脱图谱的比较。
实施例3：新设计的抗oxMIF抗体与固定的MIF的结合(KD确定)
将在PBS中以1μg/ml稀释的重组人MIF固定到ELISA板中在4℃下过夜(根据Thiele等人,2015将MIF转化为oxMIF)。封闭后，将抗oxMIF抗体的系列稀释液添加到板中。最后，使用山羊抗人IgG(Fc)-HRP缀合物和四甲基联苯胺(TMB)作为底物检测结合的抗体。用3MH2SO4终止显色反应，并且在450nm处测量OD。将来自不同实验的数据相对于相应实验的抗oxMIF抗体C0008的最大OD(＝100％)进行归一化，并且使用GraphPad Prism通过4参数拟合确定EC50值(并且示出了两个实验的平均值+/-SEM)。
结果和结论：在宽的浓度范围内测量新设计的抗体与固定的MIF(oxMIF)的结合，并且所得结合曲线展示在图2中。将抗oxMIF抗体C0008用作oxMIF结合的参考。与C0008相比，结合曲线和计算EC50值(代表表观KD)清楚地表明，新设计的抗体C0115和C0118保留了其对oxMIF的低纳摩尔亲和力(图2，表7)。
图2示出了新设计的抗oxMIF抗体与固定的oxMIF的结合曲线(KD确定)。通过抗人IgG(Fc)-HRP缀合物检测抗oxMIF抗体，C0008用作参考抗体。使用GraphPad Prism通过S形4参数方程确定EC50值(示出了两个实验的平均值+/-SEM)。
表7：抗oxMIF抗体的KD值
实施例4：新设计的抗oxMIF抗体与oxMIF和redMIF的差异性结合。
将抗oxMIF抗体和人IgG同种型对照在4℃下以15nM的浓度固定在微板中过夜。封闭后，将孔用50ng/ml的redMIF或oxMIF替代物NTB-MIF孵育(Schinagl等人,2018)。用多克隆兔抗MIF抗体和山羊抗兔IgG-HRP检测捕获的oxMIF。将板用四甲基联苯胺(TMB)染色，并且通过添加30％H2SO4终止显色反应。在450纳米处测量OD。将来自不同实验的数据相对于相应实验的抗oxMIF抗体C0008的最大OD(＝100％)进行归一化，并且示出了两个至三个实验的平均值+/-SEM。
结果和结论：新设计的抗体与可溶性oxMIF和redMIF的结合展示在图3中。结果清楚地表明，新设计的抗体C0115和C0118表现出与oxMIF的强结合，但与redMIF无结合。新设计的抗体显示出与参考抗体C0008非常相当的OD，所述参考抗体被描述为区分oxMIF与redMIF(Thiele等人,2015)。对于同种型IgG，未观察到结合。因此，降低的疏水性和聚集且Fc沉默的新设计的抗体保留了其区分oxMIF与redMIF的能力。
图3示出了新设计的抗体与oxMIF和redMIF的差异性结合。C0008用作参考抗体，并且同种型IgG用作阴性对照。示出了两至三个实验的平均值+/-SEM。
实施例5：通过报告物测定确定新设计的抗oxMIF抗体C0115和C0118的效应子功能大幅降低。
如上所述，可以努力通过Fc部分中的点突变(即，L234A/L235A)来降低抗体的ADCC和ADCP潜力。当靶标结合的抗体的Fc部分也与效应细胞的细胞表面上的Fc受体结合时，发生两种细胞类型的多重交联，导致ADCC或ADCP的通路激活，这是靶标中和抗体防止功能Fc相关不良事件所不希望的。
使用工程化Jurkat细胞作为稳定表达人FcγRIIIa V158(高亲和力基因型)以阐明ADCC或人FcγRIIa-H131以阐明ADCP的效应细胞以及驱动萤火虫萤光素酶的表达的NFAT反应元件，通过作为效应细胞中NF-AT通路激活的结果产生的萤光素酶来定量抗体生物活性。
ADCC或ADCP报告物测定基本上按照制造商的建议进行(Promega#G7010&#G9991)。
为了产生高反应性靶细胞，将HCT116和A2780细胞用huMIF-pDisplay质粒(Invitrogen)转染，用遗传霉素选择，并且通过FACS分选以产生稳定表达膜锚定的单体人MIF(HCT116-pMIF或A2780-pMIF)的细胞系，即MIF显示为单体蛋白，其中oxMIF表位可及抗oxMIF抗体(Schinagl等人,Biochemistry 2018)。这些细胞系显示出在细胞表面上增加的oxMIF呈递，并且因此是用于体外分析的更灵敏工具。简而言之，将在100μl培养基(补充有Pen/Strept/L-谷氨酰胺和4％低IgG FBS的RPMI 1640培养基)中的1×104个细胞/孔的HCT116-pMIF(图4A和图4C)或A2780-pMIF(图4B)细胞接种到96孔板中，并且在加湿培养箱中在37℃/5％CO2下附着过夜。在之后第二天，将培养基去除并且用25μl新鲜培养基替换。添加25μl的具有沉默的Fc的新设计的抗oxMIF抗体C0115和C0118或具有wt Fc的其亲本抗体C0083、C0090和对照抗体C0008的系列稀释液(终浓度0.01-100nM)以及25μl的Jurkat效应细胞(图4A-图4B，高反应者基因型V158的FcγRIIIa受体效应细胞；图4C，FcγRIIa受体效应细胞)，效应细胞与靶细胞的比率约6:1，并且将细胞与抗体和效应细胞在加湿培养箱中在37℃/5％CO2下孵育6h。最后，将测定板平衡至室温，并且添加75μlBio-Glo萤光素酶试剂。使用Tecan多板读数器(0.5s积分时间)在孵育10-20min后测量发光(RLU)。使用GraphPad Prism将数据(在适当的情况下)拟合到S形4参数方程(示出了两次重复的平均值+/-SD)。
结果：从图4A-图4C中明显的是，含有Fc沉默突变的新设计的抗体C0115和C0118在ADCC(图4A-图4B)或ADCP(图4C)报告物测定中没有显示出报告细胞的任何激活，而具有wtFc的对照抗体C0008(图4B)以及其亲本抗体C0083和C0090(图4A)诱导了强烈的FcyRIIIa(ADCC，图4A-图4B)或FcyRIIa(ADCP，图4C)介导的效应细胞激活。
结论：含有Fc沉默突变(L234A/L235A)的新设计的变体C0115和C0118在报告物生物测定中没有显示出任何ADCC或ADCP开始。因此，它们显示出强烈降低的ADCC和ADCP效应子功能。
图4示出了通过报告物测定确定新设计的Fc沉默的抗体C0115和C0118的效应子功能大幅降低。(A-B)使用稳定表达FcyRIIIa的工程化Jurkat效应细胞和HCT116-pMIF(A)或A2780-pMIF(B)靶细胞，新设计的Fc沉默的抗体C0115和/或C0118与抗oxMIF对照抗体C0008(B)或具有wt Fc的其亲本抗体C0083和C0090(A)相比的ADCC报告物生物测定；(C)使用稳定表达FcyRIIa的工程化Jurkat效应细胞和HCT116-pMIF靶细胞，新设计的Fc沉默的抗体C0115和/或C0118与具有wt Fc的其亲本抗体C0083和C0090相比的ADCP报告物生物测定。使用GraphPad Prism将数据拟合到S形4参数方程(示出了两次重复的平均值+/-SD)。
实施例6：通过补体依赖性细胞毒性(CDC)测定确定新设计的抗oxMIF抗体C0115的CDC功能大幅降低。
进行该测定以确定由新设计的抗oxMIF抗体诱导的抗体驱动的补体依赖性细胞毒性(CDC)导致的细胞裂解。通过HiBiT检测测定(Promega)测量细胞毒性，所述测定使用含有LgBiT(LargeBiT)和呋瑞吗嗪(furimazine)(底物)的非裂解性检测试剂来定量从靶细胞中释放的带HiBiT标签的蛋白。HiBiT和LgBiT自发组装成功能酶，并且在存在底物的情况下发射出可量化的发光信号。
为了产生高反应性报告靶细胞，将HCT116细胞用HaloTag-HiBiT质粒(Promega#CS1956B17)转染，用杀稻瘟菌素选择并且通过FACS分选作为细胞库。然后将稳定的表达HiBiT的细胞库用huMIF-pDisplay质粒(Invitrogen)转染，用遗传霉素选择，并且通过FACS分选以产生稳定表达细胞内HiBiT和膜锚定的单体人MIF(HCT116-HiBiT-pMIF)的细胞库，即MIF显示为单体蛋白，其中oxMIF表位可及抗oxMIF抗体(Schinagl等人,Biochemistry2018)。这些细胞系显示出在细胞表面上增加的oxMIF呈递，并且因此是用于体外分析的更灵敏工具。
简而言之，将在100μl培养基(补充有Pen/Strept/L-谷氨酰胺和10％低IgG FBS的RPMI 1640培养基)中的1×104个细胞/孔的HCT116-HiBiT-pMIF细胞接种到96孔板中，并且在加湿培养箱中在37℃和5％CO2下附着过夜。在之后第二天，将培养基去除并且添加50μl无血清RPMI 1640，并且添加50μl的具有沉默的Fc的新设计的抗oxMIF抗体C0115或具有wtFc的其亲本抗体C0083和纳武单抗(人IgG4，阴性对照)在无血清RPMI 1640中的系列稀释液(终浓度1-100nM)。在37℃下将抗体与细胞孵育30min后，将50μl幼兔补体(BRC，Sedarlane，在测定前不久在无血清RPMI中以1:10稀释)添加到板中。添加补体后，将板在加湿培养箱中在37℃和5％CO2下孵育过夜。第二天，添加10μl Nano-Glo HiBiT细胞外检测试剂(Promega#N2421)，并且3min后在Tecan板读取器上测量发光信号(RLU，积分时间0.1s)。使用GraphPad Prism将数据(在适当的情况下)拟合到S形4参数方程(示出了两次重复的平均值+/-SD)。
结果和结论：图5清楚地示出了含有Fc沉默突变(L234A/L235A)的新设计的抗体C0115没有诱导任何CDC活性，并且测量的信号甚至低于阴性对照(纳武单抗，IgG4)。相比之下，具有wt Fc的亲本抗体C0083显示出HCT116-pMIF细胞的补体依赖性细胞裂解，如针对人IgG1预期的。因此，含有Fc沉默(L234A/L235A)突变的新设计的抗体C0115显示出大幅降低的CDC活性。
图5示出了通过补体依赖性细胞毒性生物测定确定新设计的Fc沉默的抗体C0115的CDC活性大幅降低。使用BRC作为补体源以及HCT116-pMIF作为靶细胞，新设计的Fc沉默的抗体C0115与具有wt Fc的其亲本抗oxMIF抗体C0083和纳武单抗作为IgG4阴性对照相比的CDC生物测定。使用GraphPad Prism将数据(在适当的情况下)拟合到S形4参数方程(示出了两次重复的平均值+/-SD)。
实施例7：通过PBMC细胞裂解生物测定确定新设计的抗oxMIF抗体C0115和C0118的ADCC功能大幅降低。
进行该测定以确定由新设计的抗oxMIF抗体诱导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)导致的细胞裂解。通过HiBiT检测测定(Promega)测量细胞毒性，所述测定使用含有LgBiT(LargeBiT)和呋瑞吗嗪(furimazine)(底物)的非裂解性检测试剂来定量从靶细胞中释放的带HiBiT标签的蛋白。HiBiT和LgBiT自发组装成功能酶，并且在存在底物的情况下发射出可量化的发光信号。
如实施例6中所描述的产生HCT116-HiBiT-pMIF报告靶细胞。
简而言之，将在50μl培养基(补充有Pen/Strept/L-谷氨酰胺和5％超低IgG FBS(Thermo Scientific)的RPMI 1640培养基)中的1×104个细胞/孔的HCT116-HiBiT-pMIF靶细胞接种到96孔板中，并且在加湿培养箱中在37℃/5％CO2下附着过夜。在之后第二天，将50μl在培养基中的具有沉默的Fc的新设计的抗oxMIF抗体C0115和C0118或者C0115亲本抗体(具有wt Fc的C0083)和/或具有wt Fc的参考抗体C0008的连续稀释液(终浓度0.01-100nM)以及50μl来自两名健康供体的人PBMC效应细胞(4×105个细胞/孔；效应细胞与靶细胞的比率是40:1)添加到板中。添加抗体和PBMC后，将板在加湿培养箱中在37℃和5％CO2下孵育过夜。第二天，添加10μl Nano-Glo HiBiT细胞外检测试剂(Promega#N2421)，并且3min后在Tecan板读取器上测量发光信号(RLU，积分时间0.1s)。
结果和结论：从图6中明显的是，含有Fc沉默(L234A/L235A)突变的新设计的抗体C0115和C0118没有显示出任何或强烈降低的ADCC活性。相比之下，C0115的亲本抗体(C0083，具有wt Fc)和具有wt Fc的对照抗oxMIF抗体C0008显示出HCT116-HiBiT-pMIF细胞的抗体依赖性细胞裂解，如针对人IgG1预期的。因此，含有Fc沉默(L234A/L235A)突变的新设计的抗体C0115显示出大幅降低的ADCC活性。
图6示出了通过PBMC介导的细胞毒性生物测定确定新设计的Fc沉默的抗体C0115和C0118的ADCC活性大幅降低。使用PBMC作为效应细胞以及HCT116-HiBiT-pMIF作为靶细胞，新设计的Fc沉默的抗体C0115(A)和C0118(B)与抗oxMIF对照抗体C0008(B)或和C0115的亲本抗oxMIF抗体即具有wt Fc的C0083(A)相比的ADCC生物测定。示出了使用来自两名健康供体的PBMC的两次重复的平均值和SEM。使用GraphPad Prism将数据拟合到S形4参数方程。
实施例8：新设计的抗oxMIF抗体C0115和C0118在A2780 MIF-/-细胞上的非特异性结合降低。
材料和方法。通过A2780卵巢癌细胞系中人MIF基因的CRISPR/Cas9基因编辑产生A2780 MIF-/-细胞系。简而言之，根据为GenCRISPRTM系统设计靶向指导RNA(gRNA)的一般规则分析靶基因序列并且定位靶位点。设计指导RNA(gRNA)以特异性识别MIF基因(TTGGTGTTTACGATGAACATCGG，SEQ ID NO:40)的5’区，并且将gRNA序列克隆到含有化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9(SpCas9)核酸酶的PX459(addgene)载体中。将A2780细胞通过电穿孔瞬时转染，并且通过有限稀释将其铺板在96孔板中以产生等基因单克隆。通过桑格测序筛选(Sanger sequencing screening)鉴定等基因单克隆，其中内源性MIF基因被高效突变，导致MIF蛋白表达的随之减少(或去除)。最终克隆显示在人MIF基因起始密码子后+2位置缺失10bp。通过蛋白质印迹使用多克隆抗人MIF抗体证实A2780 MIF-/-细胞系中不存在内源性人MIF蛋白。
将A2780 MIF-/-细胞用Cell Stripper(康宁公司(Corning)，目录号25-056-Cl)脱附，用染色缓冲液(PBS+5％BSA)洗涤，并且以2×105个细胞/孔铺板到96孔U形底板中。将细胞用可固定的活力染料eFluor780(ThermoFisher，在PBS中稀释1:2000)在4℃下染色20min并且用染色缓冲液洗涤。将细胞重悬于50μl染色缓冲液中，并且添加50μl新设计的抗oxMIF抗体C0115和C0118或相应的其亲本抗体C0083和C0090或对照抗oxMIF抗体C0008或同种型IgG的连续稀释液(终浓度37nM-9.4nM)。在4℃下孵育40min后，将细胞用染色缓冲液洗涤，并且重悬于100μl二抗(山羊抗人IgG(H+L)-AlexaFluor 488，稀释1:100)中。在4℃下孵育30min后，将细胞用染色缓冲液洗涤，重悬于PBS+2％BSA中并且在CytoFlex-S流式细胞仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))上采集。
用FlowJo(BD)分析数据，并且在GraphPad Prism中将活细胞的几何平均值(AF488通道中的平均荧光强度)对抗体浓度作图。
结果和结论：从图7A和图7B中明显的是，新设计的抗oxMIF抗体C0118及其亲本抗体C0090(A)以及C0118及其亲本抗体C0083(B)不结合A2780 MIF-/-细胞，因为其几何平均值非常接近同种型IgG阴性对照的几何平均值。相比之下，抗oxMIF抗体C0008显示出与A2780MIF-/-细胞的显著结合，但它们被证明不表达MIF。因此，疏水性的降低导致新设计的抗oxMIF抗体与A2780 MIF-/-的非特异性结合的大幅降低或消除，而抗oxMIF对照抗体C0008由于其疏水性特性而与细胞表面非特异性结合。
图7示出了通过FACS确定新设计的抗oxMIF抗体在A2780 MIF-/-细胞上的非特异性结合降低。用新设计的抗oxMIF抗体C0118及其亲本抗体C0090(A)和C0115及其亲本抗体C0083(B)以及对照抗体C0008以及同种型IgG作为阴性对照进行A2780 MIF-/-细胞的染色；活细胞的几何平均值(AF488通道中的平均荧光强度)对抗体浓度作图。
实施例9：通过新设计的抗oxMIF抗体C0115，人PBMC中的非特异性细胞因子释放大幅降低。
细胞因子释放综合征(CRS)是可由诸如感染的多种因素触发的全身炎症反应综合征(SIRS)形式。CRS也已知是一些单克隆抗体药物的副作用。当大量白细胞(包括B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞)被激活并且释放炎症细胞因子(如IL-6、IFN-γ、IL-8、MCP-1等)时发生CRS，所述细胞因子在致病性炎症的正反馈回路中激活更多白细胞。当此过程失调时，可能因全身过度炎症、低血压休克和多器官衰竭而危及生命。因此，在体外测定中评估新设计的抗oxMIF抗体C0115的从PMBC释放炎性细胞因子的潜力。
材料和方法：将新设计的抗oxMIF抗体C0115和抗oxMIF参考抗体C0008以70nM、7nM、0.7nM、0.07nM与来自三名健康供体的新鲜解冻的PBMC(4-5×105个细胞/孔)或仅与培养基在96孔板中的150μl补充有5％超低IgG血清的RPMI1640培养基中孵育。在加湿培养箱中在37℃/5％CO2下过夜培养后，将板以300x g离心5min以沉淀细胞，并且将澄清的上清液转移至96孔V形底板(BioLegend)。根据制造商的方案，通过BioLegend LegendPlex流式细胞珠测定对上清液进行人MCP-1、人IL-6和人TNF-γ分析。在带有96孔板加载器(贝克曼库尔特公司)的CytoFlex-S细胞分析仪上进行测量。珠分类通道是APC(来自638nm激光的激发，带通滤波器660/10nm)，而报告通道是PE(来自561nm黄色激光的激发，带通滤波器585/42nm)。使用LegendPlex分析软件(BioLegend)分析数据，并且在GraphPad Prism中产生图表。从3个不同PMBC供体中显示出平均值+/-SEM。
结果和结论：从图8中明显的是，在其可变区中含可制造性突变和Fc沉默突变(L234A/L235A)的新设计的抗体C0115显示出在高达70nM的浓度下，从PBMC中不可检测或少量的MCP-1、IL-6和TNF-α释放。参考抗oxMIF抗体C0008在最高浓度(70nM)下诱导了MCP-1、IL-6和TNF-α的显著释放，与其较高的聚集倾向和因其疏水性而产生的非特异性结合相一致。已知抗体治疗剂的聚集，即使很少，也强烈地增强从免疫细胞释放细胞因子。
图8展示了与参考抗体C0008相比，新设计的抗oxMIF抗体C0115显示出从人PBMC中的细胞因子释放大幅减少。将含Fc沉默突变的抗oxMIF抗体C0115和参考抗oxMIF抗体C0008与人PBMC一起在宽浓度范围(70nM、7nM、0.7nM、0.07nM)下孵育过夜，并且在LegendPlex细胞计数珠测定(BioLegend)中分析上清液中的人MCP-1(A)、人IL-6(B)和人TNF-α(C)。从3个不同PMBC供体中显示出细胞因子浓度(以pg/ml为单位)的平均值+/-SEM。
实施例10：新设计的抗oxMIF抗体C0115和对照抗体C0008在携带异种移植的人HCT116结肠癌肿瘤的Balb/c裸小鼠中的生物分布。
材料和方法：与参考抗oxMIF抗体C0008相比，在携带人结肠癌细胞HCT116的皮下肿瘤的雌性Balb/c裸小鼠中研究新设计的抗oxMIF抗体C0115的生物分布。雌性Balb/c裸小鼠接受单侧皮下注射在50％ PBS和50％基质胶中的5×106个HCT116细胞，总注射体积为100μl。当单独肿瘤体积达到150-300mm3时，将小鼠被分配到治疗组并且接受单一静脉内剂量5mg/kg的IRDye 800CW标记的C0115或C0008。
使用IRDye 800CW蛋白标记试剂盒(高MW，来自LI-COR Biosciences)按照制造商的说明将C0115和C0008用IRDye 800CW标记。在标记过程之后并且在将标记的抗体注射到小鼠中之前，使用Nanodrop技术确定IRDye 800CW标记的抗体的蛋白质浓度和标记效率，并且将基于标记后的蛋白质浓度向小鼠给药。在施用标记的抗体后在以下时间点在LI-CORTrilogy成像装置中进行体内成像：给药后1h、6-8h、24h、48h、72h、96h、168h。进行图像分析以量化肿瘤中抗体的相对荧光强度(RFU)(RFU/面积＝RFU肿瘤面积/mm2肿瘤面积–RFU背景/mm2背景面积)。
结果和结论：图9示出了静脉内施用的IRDye 800CW标记的C0115和C0008分别具有显著的肿瘤内分布，肿瘤保留长达7天。从图9(A)和定量图像分析(图9(B))中明显的是，与在约24h处显示峰的参考抗oxMIF抗体C0008相比，新设计的抗oxMIF抗体C0115的肿瘤摄取在7天内强烈地增强并且增加。
图9示出了通过红外体内成像携带皮下HCT116肿瘤的小鼠，新设计的抗oxMIF抗体C0115和参考抗体C0008的肿瘤渗透和保留。(A)在注射剂量为5mg/kg的IRDye 800CW标记的抗体C0115(上图)和C0008(下图)后1h、6h、24h、48h、72h、96h和168h拍摄小鼠的红外图像；(B)通过数字图像分析量化的C0115和C0008的肿瘤渗透和保留。示出了3只小鼠平均值。
实施例11：
表8：氨基酸序列的综述
实施例12：C0115抗体在胶原II诱导的关节炎(CIA)小鼠模型中的功效。
材料和方法：本研究中使用年龄在8至9周之间(体重范围：18-20克)的DBA/1j(Harlan Laboratories，意大利)雄性小鼠。将牛II型胶原(CII；Chondrex，美国)通过在4℃下轻轻搅拌过夜以2mg/ml溶解在0.05M乙酸中。通过将浓度为2mg/ml的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra(Difco，密歇根州底特律)添加到IFA(不完全弗氏佐剂，Sigma Aldrich，意大利米兰)中来制备CFA(完全弗氏佐剂)。注射前，将CII用等体积的CFA乳化。为了诱导CIA，在小鼠的尾巴底部皮内注射100μl(100μg/小鼠)获得的含有CII和CFA的乳液。在第21天，施用100μl在IFA中的CII(100μg/小鼠)的第二加强剂。在疾病发作时(关节炎得分范围在1与2之间)，将小鼠用媒介物、同种型对照IgG1(40mg/kg)、C0115(20mg/kg)治疗一周两次(腹膜内)持续20天，或者或接受每日注射地塞米松作为标准护理药物(0.3mg/kg)。在治疗结束时，对动物实施安乐死并且收集血液，并且收获组织(前爪和后爪)。通过一周两次监测体重和爪厚度(所有四只爪的爪厚度，使用测厚计)来评估关节炎的临床严重程度。通过计算治疗期间4只单独爪的厚度总和的曲线下面积(AUC)来确定每只小鼠的爪厚度指数。评估每只小鼠的4只爪的范围为0-4的关节炎得分：0＝无关节炎体征；1＝爪或1个趾肿胀和/或发红；2＝2个关节受累；3＝>2个关节受累；4＝整个爪和趾的严重关节炎，导致每只小鼠的最高得分为12。通过将治疗期内单独小鼠的得分相加，计算出每只小鼠的累积疾病得分。在GraphPad Prism中进行计算，并且使用普通单因素方差分析、随后费舍尔LSD检验进行统计分析。
结果和结论：图10揭示了与媒介物治疗组相比，用20mg/kg的C0115治疗导致疾病得分(A)和爪水肿(B)的显著改善。这些作用(特别是爪厚度的减少)与用高剂量标准护理皮质类固醇药物地塞米松(0.3mg/kg)的治疗相当的。同种型对照(IgG)治疗组没有导致疾病得分降低。在病程中，所有治疗组均具有相似的体重变化。
图10示出了新设计的Fc沉默的抗oxMIF抗体C0115改善了胶原II诱导的DBA/1j小鼠关节炎模型的疾病严重程度。在用C0115(20mg/ml)、高剂量地塞米松(0.3mg/kg)作为标准护理皮质类固醇药物或媒介物治疗后，在小鼠关节炎模型中评估累积疾病得分(A)和爪厚度(B)。在GraphPad Prism V 9.4中使用普通单因素方差分析、随后费舍尔LSD检验进行统计分析(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
实施例13：C0115抗体在肾小球肾炎(GN)大鼠模型中的功效。
材料和方法：在WKY大鼠的NTN中评估新设计的Fc沉默的抗oxMIF抗体C0115的功效。这种模型疾病发作迅速，伴有巨噬细胞浸润、纤维蛋白沉积和组织破坏(Tam FWK.等人,1999)。此模型的时间进程和形态与人类新月体肾小球肾炎非常相似。所述模型非常稳健，并且所有动物在通过注射肾毒性血清(NTS)诱导后均发展肾炎。通过给WKY雄性大鼠(重量范围：190-220克)静脉内注射100μl兔抗大鼠NTS(肾毒性血清)诱导肾小球肾炎。在NTS注射后的第4天和第6天，将动物用媒介物、同种型对照IgG1或C0115(30mg/kg)治疗(腹膜内)。在第0天(基线)、第4天(疾病发作)和第7天(治疗后)收集尿液。在研究结束时(第8天)，对动物实施安乐死，并且收集血液和组织(肾、肝、脾和肺)。进行组织学(新月体计数；ED-1巨噬细胞染色，大鼠和兔IgG沉积物)和生化分析(蛋白尿和血尿)来评估疾病的严重程度。在GraphPad Prism V 9.4中使用普通单因素方差分析、随后邓尼特多重检验校正进行统计分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。
结果和结论：与媒介物治疗组相比，用C0115(30mg/kg)治疗显著改善了疾病，通过血尿、蛋白尿和肾小球巨噬细胞浸润减少得到证明(图11)。与媒介物组相比，同种型对照IgG的治疗没有减少血尿。
图11示出了新设计的Fc沉默的抗oxMIF抗体C0115改善了肾毒性血清(NTS)诱导的大鼠肾小球肾炎模型的疾病严重程度。在用抗oxMIF抗体C0115、同种型对照IgG1或媒介物治疗患病大鼠后，在大鼠肾小球肾炎模型中评估尿液中的血尿(浸渍棒)(A)、蛋白尿(B)和肾小球巨噬细胞浸润(C)。示出了平均值±SEM，在GraphPad Prism V 9.4中使用普通单因素方差分析、随后邓尼特多重检验校正进行统计分析(*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001)。
实施例14：双特异性抗体(bsMab)C0132和C0133(抗oxMIF×抗HSG)与oxMIF的结合。
材料和方法：将在PBS中以1μg/ml稀释的重组人MIF固定到ELISA板中在4℃下过夜(根据Thiele等人,2015将MIF转化为oxMIF)。封闭后，将抗体的系列稀释液添加到板中，并且如实施例3中所描述的进行ELISA。
结果和结论：在宽的浓度范围内测量C0132和C0133抗体与固定MIF(oxMIF)的结合，并且所得结合曲线展示在图13中。将抗oxMIF抗体C0008用作二价oxMIF结合的参考抗体。结合曲线和计算的EC50值清楚地表明，具有两个抗oxMIF臂的bsMab C0133结合oxMIF的亲和力类似于C0008(EC50＝242pM(C0133)和158pM(C0008))，而由于亲合力作用的丧失，仅具有一个抗oxMIF臂的bsMab C0132结合oxMIF的EC50值(2508pM)更高。
图12：新设计的Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG双特异性抗体(bsMab)C0132(Fab/scFv-Fc)和C0133(Fab/Fab-scFv-Fc)的示意图。
图13示出了新设计的Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132和C0133与固定oxMIF的结合曲线。通过抗人IgG(Fc)-HRP缀合物检测结合的抗体，C0008用作与oxMIF二价结合的参考抗体。使用GraphPad Prism将数据拟合到S形4参数方程(示出了两次重复的平均值+/-SEM)。
实施例15：C0132和C0133抗oxMIF×抗HSG bsMab与oxMIF和redMIF的差异性结合。
材料和方法：将抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132和C0133、参考抗oxMIF mAb C0008和人IgG1同种型对照在4℃下固定在微板中过夜(对于oxMIF二价抗体为15nM，并且对于oxMIF单价抗体为30nM)。封闭后，将孔用50ng/ml(约1,3nM)的redMIF或oxMIF替代物NTB-MIF孵育(Schinagl等人,2018)。用多克隆兔抗MIF抗体和山羊抗兔IgG-HRP检测捕获的oxMIF。将板用四甲基联苯胺(TMB)染色，并且通过添加30％ H2SO4终止显色反应。在450纳米处测量OD。
结果和结论：C0132和C0133与可溶性oxMIF和redMIF的结合展示在图14中。结果清楚地表明，C0132和C0133均表现出与oxMIF的强结合，但与redMIF无结合。新设计的抗体显示出与参考抗体C0008非常相当的OD值，所述参考抗体被描述为区分oxMIF与redMIF(Thiele等人,2015)。对于同种型IgG，未观察到结合。因此，抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132和C0133保留了其区分oxMIF与redMIF的能力。
图14示出了新设计的Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132和C0133与oxMIF和redMIF的差异性结合。C0008用作参考抗oxMIF抗体。示出了三次重复的平均值和SEM。
实施例16：新设计的Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132和C0133在携带同基因CT26结肠肿瘤的Balb/c小鼠中的生物分布。
材料和方法：在携带小鼠结肠癌CT26细胞系的皮下肿瘤的雌性Balb/c小鼠中研究新设计的Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132和C0133的生物分布。雌性Balb/c小鼠接受单侧皮下注射在PBS中的3×106个CT26细胞，总注射体积为100μl。当单独肿瘤体积达到150-300mm3时，将小鼠被分配到治疗组并且接受单一静脉内剂量5mg/kg的IRDye 800CW标记的C0132或C0133或者不治疗(对照组)。
使用IRDye 800CW蛋白标记试剂盒(高MW，来自LI-COR Biosciences)按照制造商的说明将C0132和C0133用IRDye 800CW标记。在标记过程之后并且在将标记的抗体注射到小鼠中之前，使用Nanodrop技术确定IRDye 800CW标记的抗体的蛋白质浓度和标记效率，并且将基于标记后的蛋白质浓度向小鼠给药。在施用标记的抗体后在以下时间点在LI-CORTrilogy成像装置中进行体内成像：给药后1h、8h、24h、48h、72h、96h、168h，所述成像装置在785nm激发波长和820nm发射波长下进行。
结果和结论：图15示出了静脉内施用的IRDye 800CW标记的C0132和C0133分别具有显著的肿瘤内分布，肿瘤保留长达7天。从图15中明显的是，在注射后一小时和所有随后的成像时间点，在肿瘤中观察到的红外信号超过了背景的红外信号，表明抗体在肿瘤中优先积累。
图15示出了通过红外体内成像携带皮下同系移植CT26肿瘤的小鼠评估新设计的Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132和C0133的肿瘤渗透和保留。在注射剂量为5mg/kg的IRDye 800CW标记的抗体后1h、8h、24h、48h、72h、96h和168h拍摄小鼠的红外图像。
实施例17：在Balb/c小鼠中，在同基因CT26结肠癌小鼠模型中使用抗oxMIF×抗HSG双特异性抗体(bsMab)C0132和C0133以及177Lu标记的IMP288的预靶向放射免疫疗法(PRAIT)。
在本实施例中，使用PRAIT方法连同HSG半抗原IMP288(如US2005/0025709中所描述的)和作为放射性核素的177Lu，评估新设计的Fc沉默的双特异性抗oxMIF×抗HSG抗体C0132和C0133的功效。IMP288是一种DOTA缀合的D-Tyr-D-Lys-D-Glu-D-Lys-NH2四肽，其中两个赖氨酸残基都经由其ε-氨基用HSG部分衍生(图16A)。专门设计IMP288的DOTA螯合基团用于放射性金属，包括177Lu。
材料和方法：在带有皮下CT26鼠结直肠癌肿瘤的Balb/c小鼠上评估预RAIT的体内功效。
将IMP288(Genepep，法国)用比活度大约220MBq/nmol的177Lu标记，同时显示出放射化学纯度(RCP)≥95％。简而言之，将IMP288用无菌水稀释至1mM(1.45mg/ml)的终浓度。在2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(500mM，pH 5.5)中进行IMP288储备溶液的1/10稀释。在添加40μl MES缓冲液(250mM，pH 5.5)和0.84nmol稀释的IMP288溶液(8.4μl)后，将在0.04N HCl中的5mCi(185MBq)177LuCl3(ITG，德国)置于放射性标记小瓶中。将反应混合物在95℃下孵育15min。此后，添加5μL的10mM二乙烯五-二胺四乙酸钠盐(DTPA-Na)以络合未掺入的177Lu，并且将溶液在0.9％ NaCl/10g/L抗坏血酸盐/0.05％m/v BSA中稀释至370MBq/mL。通过即时薄层色谱法(iTLC，Agilent Technology，SGI001)分析螯合效率以及与C0132和C0133的结合。简而言之，将50μl的177Lu-IMP288溶液(220MBq/nmol并且对应于0.084nmol IMP288的1.68nmol/ml)与10倍摩尔过量的每种bsMab(0.84nmol)混合。将每个反应在37℃下在温和搅拌下孵育30min。将177Lu-IMP288溶液以及177Lu-IMP288-bsMab溶液应用于iTLC条上，并且用1:1(v/v)0.15M乙酸铵溶液(pH 5.5):MeOH进行洗脱。洗脱后，将iTLC板暴露于磷筛(MS，BAS-IP，Fujifilm 2025)上，并且使用Typhoon IP(Amersham)和相关软件ImageQuant TL 8.2版进行揭示。
将CT26鼠结直肠癌(ATCC-CRL-2638)细胞在补充有10％热灭活FBS和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基中在37℃/5％ CO2下扩增。将CT26细胞悬液制备成在无菌PBS中10×106个活细胞/mL。在Balb/c小鼠右侧皮下注射悬浮于100μL PBS中的1×106个CT26细胞中。一旦肿瘤体积达到50-100mm3(接种后约7-9天)，将小鼠随机分成每组10只小鼠的治疗组。在随机分配当天(第-3天)静脉内注射5mg/kg的抗体(C0132或C0133)。在注射双特异性mAb后3天(第0天)通过静脉内途径施用177Lu-IMP288，其bsMAb/HSGIMP288半抗原摩尔比为10:1(约4nmol/kg C0132 bsMAb或约3nmol/kg C0133 bsMab，分别对应于18.5MBq)。另外，对照组在第0天接受37MBq的177Lu-IMP288或媒介物，不进行任何预先治疗。每2-3天测量肿瘤体积和体重，直到21天或直到小鼠达到1000mm3肿瘤体积的人道终点，并且确定存活百分比。使用GraphPrism软件将每个治疗组的相对肿瘤体积(第0天的肿瘤体积＝100％)、相对体重(第0天的体重＝100％)和卡普兰-迈耶生存曲线(以存活百分比计)对时间作图。在GraphPadPrism V9.4中使用普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正进行统计分析。
结果和结论：图16B揭示了177Lu-IMP288和177Lu-IMP288-bsMab的iTLC图谱。如图16B所展示，在与bsMab C0132和C0133孵育后观察177Lu-IMP288的迁移图谱的变化，证实了177Lu-IMP288被bsMab结合。由通过ImageQuant TL 8.2版揭示的像素强度计算，两种bsMab均结合>94％的177Lu-IMP288肽。
如图17A-图17B所展示，使用5mg/kg的Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132和18.5MBq的IMP288的PRAIT导致在21天的整个监测期内持续产生强效且显著的肿瘤生长抑制作用(图17A)(100％存活，图17B)。统计分析(普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正；**p<0.01)仅进行8天，比较C0132/177Lu-IMP288治疗组与177Lu-IMP288组，因为在第8天后，由于肿瘤过度生长，必须处死媒介物组中近一半的动物。另外，图17C示出了使用C0132的PRAIT耐受性良好，因为它在整个监测期(21天)内没有引起任何显著的体重减轻。从图18中明显的是，用5mg/kg的bsMab C0133和18.5MBq IMP288的PRAIT导致强效且显著的肿瘤生长抑制作用。统计分析(普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正；***p<0.001)仅进行8天，比较C0133/177Lu-IMP288治疗组与177Lu-IMP288组，因为在第8天后，由于肿瘤过度生长，必须处死媒介物组中近一半的动物。总结的结果强调了Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab连同放射性标记的HSG半抗原作为强效PRAIT的潜力。
图16：示出了HSG半抗原IMP288的结构(A)，以及(B)通过iTLC基于当与单独的177Lu-IMP288肽的迁移图谱相比时在与bsMab C0132和C0133一起孵育后177Lu-IMP288的迁移图谱的变化评估的bsMab与177Lu-IMP288肽的结合。
图17示出了用Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132对Balb/c小鼠的同系移植CT26鼠结直肠癌的PRAIT。在第-3天施用C0132，随后在3天后(第0天)施用177Lu-IMP288。(A)以占第0天测量的肿瘤体积的％计的肿瘤体积，示出了平均值±SEM(n＝高达10)。在GraphPad Prism V9.4中使用普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正进行统计分析；**p<0.01，相对于177Lu-IMP288；(B)卡普兰-迈耶生存曲线(以存活％计)，(C)占第0天测量体重的％的体重。
图18示出了用Fc沉默的抗oxMIF×抗HSG bsMab C0133对Balb/c小鼠的同系移植CT26鼠结直肠癌的PRAIT。在第-3天施用C0133，随后在3天后(第0天)施用177Lu-IMP288。图示出了占第0天测量肿瘤体积的％的肿瘤体积。示出了平均值±SEM(n＝高达10)。在GraphPad Prism V9.4中使用普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正进行统计分析；***p<0.001，相对于177Lu-IMP288。
实施例18：在Balb/c小鼠中，在同基因CT26结肠癌小鼠模型中，使用抗oxMIF×抗HSG双特异性抗体(bsMab)C0132以及在C0132应用后5天使用177Lu标记的IMP288的预靶向放射免疫疗法(PRAIT)。
在本实施例中，使用PRAIT方法连同HSG半抗原IMP288(如US2005/0025709中所描述的)和177Lu作为放射性核素，评估新设计的Fc沉默的双特异性抗oxMIF×抗HSG抗体C0132的功效。
材料和方法：在带有皮下CT26鼠结直肠癌肿瘤的Balb/c小鼠上评估RRAIT的体内功效。如实施例16所述进行研究，但有一些修改。简而言之，在Balb/c小鼠(Balb/c ByJ，Janvier Labs，法国)右侧皮下注射悬浮于100μL PBS中的1×106个CT26细胞中。通过视觉观察和触诊控制肿瘤生长，直到接种后第7天。当3个治疗组(每组10只小鼠)的肿瘤大小达到约100-200mm3并且1个对照组(每组10只小鼠)的肿瘤大小达到约400-500mm3时，开始体内治疗性研究。以2个剂量2.5mg/ml和5mg/ml静脉内注射BsMab C0132，而在施用C0132后5天(相对于实施例16中为3天)(第0天)静脉内注射177Lu标记的IMP288。C0132/放射性标记的HSG IMP288半抗原的摩尔比保持恒定在10/1(与实施例16中相同)，意味着177Lu标记的IMP288的剂量分别为2nmol/kg(9.3MBq)和4nmol/kg(18.5MBq)。对照组由一个队列组成，在所述队列中小鼠在第0天接受8nmol/kg(37MBq)的177Lu-IMP288，而没有预先用bsMab进行任何治疗。在给药后21天的时间段内，每两-三天评估动物的体重和肿瘤体积。通过用数字卡尺测量肿瘤的长度、宽度和深度来确定肿瘤体积。使用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(长度×宽度×深度)×0.5。监测小鼠直至21天或直至小鼠达到预定的实验终点：肿瘤体积>1500mm3或体重减轻>20％。使用GraphPad Prism软件将每个治疗组的相对肿瘤体积(第0天的肿瘤体积＝100％)和卡普兰-迈耶生存曲线(以存活百分比计)对时间作图。使用GraphPad Prism仅对第8天和第10天进行统计分析(普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，比较2个C0132治疗组中的每个与对照组(仅177Lu-IMP288，无bsMab)，因为在第11天后，由于肿瘤过度生长，必须将对照组中的动物(177Lu-IMP288，无bsMab)安乐死。
结果和结论：从图19中明显的是，用2.5和5mg/ml的C0132的预靶向疗法导致显著的肿瘤消退(图19A)和生存益处(图19B)。如果以5mg/ml施用C0132，则可以实现最佳存活(100％)持续长达21个监测天数。
图19示出了使用PRAIT方法，在同系移植CT26鼠结直肠癌细胞的小鼠中抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132在Balb/c中的功效。在第-5天以2.5mg/ml和5mg/ml施用C0132，随后在5天后(第0天)施用177Lu-IMP288。(A)以占第0天测量的肿瘤体积的％计的肿瘤体积，示出了平均值±SEM(n＝高达10)。在GraphPad Prism V9.4中使用普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正进行统计分析；***p<0.001，相对于177Lu-IMP288；(B)卡普兰-迈耶生存曲线(以存活％计)。
实施例19：在Balb/c裸小鼠中，在异种移植CFPAC-1胰腺癌小鼠模型中，使用抗oxMIF×抗HSG双特异性抗体(bsMab)C0132以及在C0132应用后5天使用177Lu标记的IMP288的预靶向放射免疫疗法(PRAIT)。
在本实施例中，在异种移植胰腺癌小鼠模型中，使用PRAIT方法连同HSG半抗原IMP288(如US 2005/0025709中所描述的)和177Lu作为放射性核素，评估新设计的Fc沉默的双特异性抗oxMIF×抗HSG抗体C0132的功效。
材料和方法：在带有皮下CFPAC-1导管胰腺腺癌肿瘤的Balb/c裸小鼠上评估PRAIT的体内功效。基本上如实施例16和17所述进行研究，但有一些修改。人胰腺导管腺癌细胞CFPAC-1由ATCC提供(目录号CRL-1918)。在补充有10％ FBS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养细胞。将CFPAC-1细胞悬液制备成在无菌PBS中50×106个细胞/mL。在Balb/c裸小鼠(Balb/c ByAnNRj-Foxn1nu/nu)右侧皮下注射悬浮于100μL PBS中的5×106个CFPAC-1细胞中。通过视觉观察和触诊控制肿瘤生长，直到接种后第4天。当治疗组(每组10只小鼠)的肿瘤大小达到约150-300mm3并且2个对照组(每组10只小鼠)的肿瘤大小达到约350-500mm3时，开始体内治疗性研究。治疗组首先接受5mg/kg(第-5天)剂量的BsMAb C0132。五天后(第0天)，使用固定摩尔比10:1的BsMAb/HSG半抗原IMP288给予放射性标记的IMP288，意味着177Lu标记的HSG半抗原IMP288的剂量分别为4nmol/kg(18.5MBq)。对照组由以下组成：其中小鼠接受8nmol/kg(37MBq)177Lu-IMP288但没有BsMAb的1个队列；以及其中小鼠仅接受用于稀释177Lu-IMP288的媒介物的1个队列。在给药后28天的时间段内，每两至三天评估动物的体重和肿瘤体积。通过用数字卡尺测量肿瘤的长度、宽度和深度来确定肿瘤体积。使用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(长度×宽度×深度)×0.5。监测小鼠直至28天或直至小鼠达到预定的实验终点：肿瘤体积>1500mm3或体重减轻>20％。使用GraphPad Prism软件将每个治疗组的相对肿瘤体积(第0天的肿瘤体积＝100％)对时间作图。在GraphPad PrismV9.4中仅对第14天进行统计分析(普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正；**p<0.01)，比较C0132治疗组与媒介物组。
结果和结论：从图20中明显的是，用5mg/ml的C0132的预靶向疗法导致显著的肿瘤消退(图20)。
图20示出了使用PRAIT方法，在异种移植CFPAC-1胰腺腺癌细胞的Balb/c裸小鼠中抗oxMIF×抗HSG bsMab C0132的功效。在第-5天以5mg/ml施用C0132，随后在5天后(第0天)施用177Lu-IMP288。(A)以占第0天测量的肿瘤体积的％计的肿瘤体积；示出了平均值±SEM(n＝高达10)。在GraphPad Prism V9.4中使用普通单因素方差分析与邓尼特多重检验校正进行统计分析；**p<0.01，相对于媒介物。
实施例20：C0115抗体与糖皮质激素(GC)的组合在II型胶原诱导性的关节炎(CIA)小鼠模型中的功效。
糖皮质激素(诸如地塞米松)是强效免疫抑制剂，其通常用作控制人类患者风湿性疾病的长期疗法，但与多种副作用相关。在本实施例中，评估C0115作为单独治疗或与地塞米松的组合的功效。
材料和方法：本研究中使用年龄在8至9周之间(体重范围：18-20克)的DBA/1j(Harlan Laboratories，意大利)雄性小鼠。将牛II型胶原(CII；Chondrex，美国)通过在4℃下轻轻搅拌过夜以2mg/ml溶解在0.05M乙酸中。通过将浓度为2mg/ml的结核分支杆菌H37Ra(Difco，密歇根州底特律)添加到IFA(不完全弗氏佐剂，Sigma Aldrich，意大利米兰)中来制备CFA(完全弗氏佐剂)。注射前，将CII用等体积的CFA乳化。为了诱导CIA，在小鼠的尾巴底部皮内注射100μl(100μg/小鼠)获得的含有CII和CFA的乳液。在第21天，施用100μl在IFA中的CII(100μg/小鼠)的第二加强剂。在疾病发作时，将小鼠一周两次(腹膜内)用以下治疗20天：媒介物、仅C0115(20mg/kg)、或与每天注射低剂量地塞米松(0.1mg/kg)的组合。对照组小鼠每天接受注射高剂量地塞米松(0.3mg/kg)作为标准护理药物。在治疗结束时，对动物实施安乐死并且收集血液，并且收获组织(前爪和后爪)以进行进一步组织学分析。通过一周两次监测体重和爪厚度(所有四只爪的爪厚度，使用测厚计)来评估关节炎的临床严重程度。评估每只小鼠的4只爪的范围为0-4的关节炎得分：0＝无关节炎体征；1＝爪或1个趾肿胀和/或发红；2＝2个关节受累；3＝>2个关节受累；4＝整个爪和趾的严重关节炎，导致每只小鼠的最高得分为12。通过将治疗期内单独小鼠的得分相加，计算出每只小鼠的累积疾病得分。在GraphPad Prism中使用普通单因素方差分析、随后费舍尔LSD检验进行统计分析。
结果和结论：图21揭示了与媒介物治疗组相比，用C0115(20mg/kg)治疗导致临床关节炎体征显著改善，通过累积疾病得分指示。此外，与作为单一药剂的治疗相比，C0115(20mg/kg)和低剂量地塞米松(0.1mg/kg)的组合治疗导致进一步改善了临床关节炎体征，并且与高剂量地塞米松(0.3mg/kg)的功效相当。
实施例21：C0115抗体以及与糖皮质激素(GC)的组合在结肠炎T细胞转移小鼠模型中的功效。
在本实施例中，在慢性肠道炎症期间评估C0115抗体作为单一药剂或与低剂量地塞米松的组合的功效。
材料和方法：本研究中使用年龄在8至9周之间(体重范围：18-20克)BALB/c和C.B-17SCID(Envigo，意大利，乌迪内，纳蒂索内河畔圣彼得罗)雌性小鼠。
为了诱导结肠炎，将来自BALB/c小鼠的CD4+CD25-T细胞移植到CB-17SCID小鼠(缺乏B细胞和T细胞)中。简而言之，用4μg/ml的伴刀豆球蛋白A体外刺激从Balb/C小鼠分离的脾细胞。通过磁性选择CD4+CD25-细胞分离T细胞，并且通过流式细胞术使用FACS Calibur(BD Bioscience，德国海德堡)和CellQuest软件，将细胞制剂用活力染料(7-放线菌素-D)、FITC缀合的抗小鼠CD4抗体(BD，德国海德堡)和APC缀合的抗小鼠CD25抗体(BD，德国海德堡)染色以控制纯度(CD4+CD25-门中的活T细胞>95％)。将分离的CD4+CD25-T细胞以在最终体积为0.2ml的盐水中500,000个细胞的浓度腹膜内注射到CB-17SCID小鼠中。在T细胞转移后一周，将小鼠(一周两次；腹膜内)用以下治疗83天：媒介物、作为单一药剂的C0115(10mg/kg)或与每天注射低剂量地塞米松(0.01mg/kg)的组合。对照组小鼠每天接受注射高剂量地塞米松(0.1mg/kg)作为标准护理药物。在治疗结束时，收集血液、粪便和结肠组织用于进一步分析。通过定期监测体重变化和粪便稠度来评估结肠炎的临床严重程度。通过将每天的粪便得分相加来确定每只小鼠的累积粪便得分(0＝形成良好的沉淀；1＝软粪便；2＝腹泻)。在GraphPad Prism V 9.4中使用单因素方差分析、随后费舍尔LSD检验进行统计分析。
结果和结论：图22表明用C0115(10mg/kg)治疗导致疾病严重程度的显著改善，通过与媒介物治疗组相比累积粪便得分(A)显著降低并且与高剂量地塞米松(0.1mg/kg)相当得到证明。10mg/kg的C0115和低剂量地塞米松(0.01mg/kg)的组合治疗进一步改善了疾病的严重程度，通过累积粪便得分进一步显著降低得到证明。值得注意的是，与媒介物治疗组和用标准护理皮质类固醇药物地塞米松治疗相比，10mg/kg的C0115和低剂量地塞米松(0.01mg/kg)的组合治疗导致结肠炎进一步改善，其通过在治疗结束时(第83天)体重显著增加来评估。
图22示出了新设计的Fc沉默的抗oxMIF抗体C0115(作为单一药剂以及与GC组合)改善了T细胞转移小鼠结肠炎模型的疾病严重程度。在用C0115(10mg/kg；单独或与低剂量0.01mg/kg的地塞米松组合)、低剂量(0.01mg/kg)和高剂量(0.1mg/kg)的地塞米松(作为标准护理皮质类固醇药物)或媒介物对照治疗进行治疗后评估在实验结束时(D83)的体重变化(A)以及累积粪便得分(B)。数据以平均值±SEM表示，并且使用普通单因素方差分析、随后费舍尔LSD检验进行统计分析(*p<0.05；**p<0.01)。
实施例22：新设计的抗oxMIF抗体的降低的聚集倾向和降低的疏水性以及其结合固定oxMIF的保留(KD估计)
表9：实施例22中使用的抗oxMIF抗体的变体ID、序列组合和序列。VH和VL中的氨基酸取代分别指SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2。
为了评估疏水性和聚集，通过凝胶过滤(SEC)和疏水相互作用色谱法(HIC)分析新设计的抗体，与对照抗oxMIF抗体C0008进行头对头比较。
对于SEC，将抗体在1×磷酸盐缓冲盐水(1×PBS)中稀释至1mg/ml，并且将100μl样品以1.25ml/min的流速应用到Enrich 650(Bio-Rad)凝胶过滤柱上。在室温下在1×PBS中进行分离和平衡。使用在280nm处的吸光度监测蛋白质峰，并且使用ChromLab软件包(Bio-Rad)分析光谱。结果以主峰的保留体积(Vr，ml)报告，并且手动对聚集体的存在进行排序。
对于HIC分析，使用50mM磷酸盐和0.75M硫酸铵(pH 6.8)将抗体稀释至1mg/ml的终浓度。使用1ml加载环将1mg每种抗体注射到1ml HiTrap Butyl HP柱上，并且在室温下将柱流速维持在1ml/min。经过0-100％缓冲液B(50mM磷酸盐，20％异丙醇；pH 7.0)的20倍柱体积(CV)(梯度)进行峰分离。使用在280nm处的吸光度监测蛋白质峰，并且使用Unicorn仿真软件包(GE Healthcare)分析光谱。对于每个峰，以最大峰值处的Vr(ml)报告结果。
为了评估与oxMIF的结合(表观亲和力)，通过ELISA分析新设计的抗体。简而言之，将在PBS中以1μg/ml稀释的重组人MIF固定到ELISA板中在4℃下过夜(根据Thiele等人,2015将MIF转化为oxMIF)。封闭后，将抗oxMIF抗体的系列稀释液添加到板中。最后，用山羊抗人IgG(Fc)-HRP缀合物和四甲基联苯胺(TMB)作为底物检测结合的抗体。用3MH2SO4终止显色反应，并且在450nm处测量OD。使用GraphPad Prism通过4参数拟合来确定代表表观亲和力(KD)的EC50值。
参考文献
Aeberli D，et al.Endogenous macrophage migration inhibitory factormodulates glucocorticoid sensitivity in macrophages via effacts on MAP kinasaphosphatasa-1and p38 MAP kinasa.FEBS Lett.2006；580(3)：974-981
Bacher M，et al.An essential ragulatory role for macrophage migrationinhibitory factor in T-cell activation.Proc Natl Acad Sci U S A.1996；93(15)：7849-7854
Bacher M，et al.Migration inhibitory factor expression inexperimentally induced endotoxemia.Am J Pathol.1997；150(1)：235-246.
Bando，H.，et al.(2002).Expression of macrophage migration inhibitoryfactor in human breast cancer：association with nodal spread.Jpn J Cancer Res93，389-396.
Barnes PJ，Adcock IM.How do corticosteroids work in asthma？Ann InternMed.2003：139(5 Pt 1)：359-370
Bernhagen，J.et al.(1993).MIF is a pituitary-derived cytokine thatpotentiates lethal endotoxaemia.Nature 365，756-759
Bernhagen，J.，et al.(1994).Purification，bioactivity，and secondarystructure analysis of mouse and human macrophage migration inhibitory factor(MIF).Biochemistry33，14144-14155
Bernhagen，J.，et al.(2007)，MIF is a noncognate ligand of CXC chemokineraceptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.Nat Med 13，587-596
Bloom B.R.and Bennet，B.，1966，Mechanism of a reaction in vitroessociated with delayed-type hypersensitivity，Science 153，80-82
Bozza FA，et al.Macrophage migration inhibitory factor levelscorrelate with fatal outcome in sepsis.Shock.2004；22(4)：30g-313
Brinkmann U.and Kontermann R.E.，2017，The making of bispecificantibodies，MABS，9，2，182-212
Bucala，R.，and Donnelly，S.C.(2007).Macrophage migration inhibitoryfactor：a probable link between inflammation and cancer.Immunity 26，281-285
Calandra T，et al.The macrophage is an important and previouslyunrecognized source of macrophage migration inhibitory factor.J Exp Med.1994；179(6)：1895-1902
Calandra T，et al.MIF as a glucocorticoid-induced modulator ofcytokine production.Nature.1995；377(6544)：68-71
Chen，R.，et al.(2010).Pilot study of blood biomarker candidates fordetection of pancreatic cancer.Pancreas 39，981-988
Chothia C.，et al.(1987)Canonical structures for the hypervariableregions of immunoglobulins.J.Mol.Biol.，196，901-17
Coleman，A.M.，et al(2008).Cooperative regulation of non-small celllung carcinoma angiogenic potential by macrophage migration inhibitory factorand its homolog，D-dopachrome tautomerase.J Immunol 181，2330-2337
Conroy，H.，et al.(2010).Inflammation and cancer：macrophage migrationinhibitory factor(MIF)--the potential missing link.Qjm 103，831-836
Coussens，L.M.，and Werb，Z.(2002).Inflammation and cancer.Nature 420，860-867
David，J.R.，1966，Delayed hypersensitivity in vitro：its mediation bycell-free substances formed by lymphoid cell-antigen interaction，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.56，72-77
de Jong et al.，(2001).Development of chronic colitis is dependent onthe cytokine MIF，Nat.Immunol.(11)1061：6
del Rincón ID，et al.High incidence of cardiovascular events in arheumatoid arthritis cohort not explained by traditional cardiac riskfactors.Arthritis Rheum.2001；44(12)：2737-2745
Ehrenmann F.，et al.2010，MGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign：adatabasa and a tool for immunoglobulins or antibodies，T cell receptors，MHC，IgSF and MhcSF，Nucleic Acids Res.38，D301-307
EI-Magadmi M，et al.Systemic lupus erythematosus；an independent riskfactor for endothelial dysfunction in women.Circulation.2004；110(4)：399-404.
Emonts M，et al.Association between high levels of blood macrophagemigration inhibitory factor，inappropriate adrenal response，and early death inpatients with severe sepsis.Clin Infect Dis.2007；44(10)：1321-1328
Estep P.et al.，2015，An alternative assay to hydrophobic interactionchromatography for high-throughput characterization of monoclonal antibodies，MAbs，7(3)，553-561
Ewert S.et al.，2003，Structure-based improvement of the biophysicalproperties of immunoglobulin VH domains with a generalizable approach，Biochemistry，18，42(6)，1517-28
Fingerle-Rowson G，et al.Regulation of macrophage migration inhibitoryfactor expression by glucocorticoids in vivo.Am J Pathol.2003；162(1)：47-56
Ha J-H.et al.，2016，Immunoglobulin Fc heterodimer platform technology：From design to applications in therapeutic antibodies and proteins，frontiersImmunol.，7，article 394
Hagemann，T.，and Balkwill，F.(2005).MIFed about cancer？Gastroenterology 129，1785-1787.
Hagemann，T.，et al.(2007).Ovarian cancer cell-derived migrationinhibitory factor enhances tumor growth，progression，and angiogenesis.MolCancer Ther 6，1993-2002
Hong，P.，et al.(2012).A review size-exclusion chromatography for theanalysis of protein biotherapeutics and their aggregates.In Journal of LiquidChromatography and Related Technologies(Vol.35，Issue 20，pp.2923-2950).Taylor&Francis.https：//doi.org/10.1080/10826076.2012.743724
Hudson，J.D.，et al.(1999).A proinflammatory cytokine inhibits p53tumor suppressor activity.J Exp Med 190，1375-1382.
Hussain F.et al.，2013，Human anti-macrophage migration inhibitoryfactor antibodies inhibit growth of human prostate cancer cells in vitro andin vivo，Mol Cancer Ther.Jul；12(7)：1223-34
lanello A.and Ahmad A.，2005，Role of antibody-dependent cell-madiatedcytotoxicity in the efficacy of therapeutic anti-cancer monoclonalantibodies，Cancer and Metastasis Review，24，487-499
Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interast，FifthEdition，NIH Publication91-3242，Bethesda MD(1991)，vols.1-3
Kamimura，A.，et al.(2000).Intracellular distribution of macrophagemigration inhibitory factor predicts the prognosis of patients withadenocarcinoma of the lung.Cencer 89，334-341
Karacay H.et al.，(2005)Pretargeting with bispecifics aCEA x aHSG，ClinCancer Res，11(21)
Karin，M.(2009).NF-kappaB as a critical link between inflemmation andcancer.Cold Spring Harb Perspect Biol 1，a000141
Kenanova V.et al.(2005)Tailoring the Pharmacokinetics and PositronEmission Tomography Imeging Properties of Anti-Carcinoembryonic AntigenSingle-Chain Fv-Fc Antibody Fragments.Cancer Res.2005，65：622-633
Kessenbrock，K.，et al.(2010).Matrix metalloproteinases：ragulators ofthe tumor microenvironment.Cell141，52-67.
Lefranc MP.Unique database numbering system for immunogeneticanalysis.Immunol Today(1997)18：509.
Liu R.et al.，2020，″Fc-Engineering for modulated effector functions-improving antibodies for cancer treatmant″，Antibodies，9，64
Lue，H.，et al.(2007).Macrophage migration inhibitory factor(MIF)promotes cell survival by activation of the Akt pathway and role for CSN5/JAB1 in the control of autocrine MIF activity.Oncogene 26，5046-5059
MacCallum R.M et al.(1996)Antibody-antigen Interactions：ContactAnalysis and Binding Site Topography，J.Mol.Biol.，262，5：732-745
Mahalingam D.et al.，2015，ASCO Abstract ID2518
Mahalingam et al.2020，Phasa l study of Imalumab(BAX69)，a fully humanracombinant antioxidized macrophage migration inhibitory factor antibody inadvanced solid tumours，Br J Clin Pharmacol.86(9)：1836-1848
Manzi S，et al.Prevalence and risk factors of carotid plaqua in womenwith systemic lupus erythamatosus.Arthritis Rheum.1999；42(1)：51-60
Meyer-Siegler，K.，and Hudson，P.B.(1996).Enhanced expression ofmacrophage migration inhibitory factor in prostatic adenocarcinomametastasas.Urology 48，448-452.
Mitchell RA，et al.Sustained mitogen-activated protein kinasa(MAPK)andcytoplasmic phospholipasa A2 activation by macrophage migration inhibitoryfactor (MIF).Regulatory role in cell proliferation and glucocorticoidaction.J Biol Chem.1999；274(25)：18100-18106
Mitchell RA，et al.Macrophage migration inhibitory factor(MIF)sustainsmacrophage proinflammatory function by inhibiting p53：regulatory role in theinnate immune response.Proc Natl Acad Sci U S A.2002；99(1)：345-350
Mitchell，R.A.，and Bucala，R.(2000).Tumor growth-promoting propertiesof macrophage migration inhibitory factor(MIF).Semin Cancer Biol 10，359-366.
Morand EF，et al.Macrophage migration inhibitory factor in rheumatoidarthritis：clinical correlations.Rheumatology(Oxford).2002；41(5)：558-562.
Morrison，S.L.，et al.，1984，Chimeric human antibody molecules：mouseantigen-binding domains with human constant region domains，Proc.Natl.Acad.Sci.81，6851-6855
Natsume A.et al.，2009，“Improving effector functions of antibodies forcancer treatment：Enhancing ADCC and CDC”，Drug，Design，development and Therapy，3，7-16
Niino M.，et al.Macrophage migration inhibitory factor in thecerebrospinal fluid of patients with conventional and optic-spinal forms ofmultiple sclerosis and neuro-disease.J Neurol Sci.2000；179(S1-2)：127-131
Onodera S.，et al.High expression of macrophage migration inhibitoryfactor in the synovial tissues of rheumatoid joints.Cytokine.1999；11(2)：163-167.
Petkova，S.B.，et al.，2006，Enhanced half-life of genetically engineeredhuman lgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model：potential applicationin humorally mediated autoimmune disease，Int′l.Immunol.18(12)1759-1769
Pisu M.，et al.The cost of glucocorticoid-associated adverse events inrheumatoid arthritis.Rheumatology(Oxford).2005；44(6)：781-788
Pyzik M.et al.2019.The Neonatal Fc Receptor(FcRn)：A Misnomer？，Frontiers in Immunol.，Vol10，1540：1-24
Ramsey-Goldman R.Missed opportunities in physician management ofglucocorticoid-induced osteoporosis？Arthritis Rheum.2002；46(12)：3115-3120
Ren，Y.，et al.(2004).Upregulation of macrophage migration inhibitoryfactor contributes to induced N-Myc expression by the activation of ERKsignaling pathway and increased expression of interleukin-8and VEGF inneuroblastoma.Oncogene 23，4146-4154
Rendon，B.E.，et al.(2007).Regulation of human lung adenocarcinoma cellmigration and invasion by macrophage migration inhibitory factor.J Biol Chem282，29910-29918
Rendon，B.E.，et al.(2009).Mechanisms of macrophage migrationinhibitory factor(MIF)-dependent tumor microenvironmental adaptation.Exp MolPathol 86，180-185.
Rinta S.，et al.Apoptosis-related molecules in blood in multiplesclerosis.J Neuroimmunol.2008；205(1-2)：135-141
Rossi EA et al.，(2006)Stably tethered multifunctional structures ofdefined composition made by the dock and lock method for use in cancertargeting，PNAS，103，18，6841-6846
Sampey AV，et al.(2001)Regulation of synoviocyte phospholipase A2 andcyclooxygenase 2by macrophage migration inhibitory factor.Arthritis Rheum.44(6)：1273-1280.
Saunders K.O.，(2019)“Conceptual approaches to modulating antibodyeffector functions and circulation haIf-life，frontiers Immunol.，10，1-20，doi：10.3389/fimmu.2019.01296
Sambrook et al，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″(4th Ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012).
Sharkey RM et al.(2005)Pretargeting with bispecific aCD20x aHSG，Leukemia，15，1064-1069
H.，et al.(2002)Mechanisms involved in the side effects ofglucocorticoids.Pharmacol Ther.96(1)：23-43
Schinagl，A.，et al.，(2018)Role of the Cysteine 81Residue of MacrophageMigration Inhibitory Factor as a Molecular Redox Switch.Biochemistry，57(9)，1523-1532.https：//doi.org/10.1021/acs.biochem.7b01156
Schinagl.A.et al.，(2016)Oxidized macrophage migration inhibitoryfactor is a potential new tissue marker and drug target in cancer，Oncotarget.Nov 8；7(45)：73486-73496
Shimizu，T，et al.(1999).High expression of macrophage migrationinhibitory factor in human melanoma cells and its role in tumor call growthand angiogenesis.Biochem Biophys Res Commun 264，751-758
Shimizu T.，et al.(2001)High macrophage migration inhibitory factor(MIF)serum levels associated with extended psoriasis.J Invest Dermatol.116(6)：989-990
Solomon DH，et al.(2003)Cardiovascular morbidity and mortrtality inwomen diagnosed with rheumatoid arthritis.Circulation.107(9)：1303-1307
Spiess C.et al.，(2015)Alternative molecular formats and therapeuticapplications for bispecific antibodies，Mol.Immunol.，67，95-106
Sprong T，et al.Macrophage migration inhibitory factor(MIF)inmeningococcal septic shock and experimental human endotoxemia.Shock.2007；27(5)：482-487.
Strohl W.R.et al.(2012)Antibody Fc engineering for optimal antibodyperformance，Therapeutic Antibody Engineering，Woodhead Publishing Series inBiomedicine，No.11，pp.225-249
Takahashi，N.，et al.(1998).Involvement of macrophage migrationinhibitory factor(MIF)in the nechanism of tumor cell growth.Mol Med 4，707-714.
Tam FWK，et al.，(1999)Development of scarring and renal failure in arat model of crescentic glomerulonephritis.Nephrol Dial Transplant 14：1658-1666
Tang J.，et al.，(2018)Comprehensive analysis of the clinical immuno-oncology landscape，Ann Oncol.；29(1)：84-91
Thiele，M.et al.，(2017).Selective Targeting of a Disease-RelatedConformational lsoform of Macrophage Migration Inhibitory Factor AmelioratesInflammatory Conditions.Journal of Immunology，195(5)，2343-2352.https：//doi.org/10.4049/jimmunol.1500572
Van der Kant，R.et al.，(2017)Prediction and Reduction of theAggregation of Monoclonal Antibodies，J.Mol.Biol.，429(8)，1244-1261
Verjans，E.，et al.(2009).Dual role of macrophage migration inhibitoryfactor(MIF)in human breast cancer.BMC Cancer 9，230
Walsh LJ，et al.(1996)Use of oral corticosteroids in the community andthe prevention of secondary osteoporosis：a cross sectional study.BMJ.313(7053)：344-346
Wang P，et al.，(2008)A systematic assessment of MHC class II peptidebinding predictions and evaluation of a consensus approach，PLoS Comput Biol.4(4)：e1000048；
Wang P，et al.，(2010)Peptide binding predictions for HLA DR，DP and DQmolecules，BMC Bioinformatics.11：568
Wei Li et al.，(2016)Antibody Aggregation：Insights from Sequence andStructure，Antibodies，5(3)，19
WHO Drug Information，Vol.28，No.2，2014
Willuda J.et al.，(1999)High thermal stability is essential for tumortargeting of antibody fragments：engineering of a humanized anti-epithelialglycoprotein-2(epithelial cell adhesion molecule)single-chain Fv fragment，Cancer Res.，15；59(22)，5758-67
Winner，M.，et al.(2007).Amplification of Tumor Hypoxic Responses byMacrophage Migration Inhibitory Factor-Dependent Hypoxia-Inducible FactorStabilization.Cancer Research 67，186-193。

Claims (18)

1.一种Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含野生型人IgG的变体Fc区，其包含具有一个或多个氨基酸取代或糖基化修饰的SEQ ID NO:1；以及以下可变结构域：
(a1)包含具有氨基酸取代M30L、F49Y、A51G、P80S、W93F中的至少一者的SEQ ID NO:2的轻链可变结构域，或
(a2)包含具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的SEQ ID NO:2的轻链可变结构域，该轻链可变结构域还包含
-在位置36处的保守酪氨酸，和
-氨基酸取代M30L、F49Y、A51G、P80S、W93F中的至少一者；
以及
(b1)包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域；或
(b2)包含SEQ ID NO:3和氨基酸取代L5Q和/或W97Y的重链可变结构域，或
(b3)包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域，其具有氨基酸取代L5Q或W97Y中的至少一者和1、2、3、4或5个另外的氨基酸取代；
其中氨基酸位置是根据Kabat编号的，
其中与野生型IgG1 Fc区相比，所述变体Fc区展现出降低的FcγR结合，以及
其中与缺乏所述氨基酸取代的包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗体或其抗原结合片段相比，所述抗体或其抗原结合片段具有降低的聚集潜力和降低的疏水性。
2.根据权利要求1所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，其中所述轻链可变结构域包含氨基酸取代W93F，并且所述重链可变区包含氨基酸取代W97Y。
3.根据权利要求1或2所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含可变结构域，该可变结构域包含选自由SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、43和85组成的组的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含：
i.)SEQ ID NO:3和6，
ii.)SEQ ID NO:9和6，
iii.)SEQ ID NO:4和6，
iv.)SEQ ID NO:4和8，
v.)SEQ ID NO:4和5，或
vi.)SEQ ID NO:43以及SEQ ID NO:5、6、7或8中的任一者。
5.根据权利要求4所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体还包含SEQID NO:14。
6.根据权利要求1或2中任一项所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:15和16或17。
7.一种Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含野生型人IgG的变体Fc区，其包含具有一个或多个氨基酸取代或糖基化修饰的SEQ ID NO:1，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体包含：
选自SEQ ID NO:72或78的轻链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:73、79、80或81的轻链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:74或82的轻链CDR3序列，和
选自SEQ ID NO:75的重链CDR1序列，和
选自SEQ ID NO:76或83的重链CDR2序列，和
选自SEQ ID NO:77或84的重链CDR3序列，
条件是SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:77不包含在一起。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，其中根据EU编号索引，所述氨基酸取代在SEQ ID NO:1的位置E233、L234、L235、G236、G237、P238、I253、D265、S267、H268、N297、S298、T299、H310、E318、L328、P329、A330、P331、H435中的任一者处，具体地所述氨基酸取代在位置L234和L235处，具体地在位置L234、L235、H310和H435处，和/或其中所述Fc区是非糖基化的。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，所述Fc沉默的抗oxMIF抗体选自由以下组成的组：双特异性抗体、scFv-Fc、(scFv)2-Fc、scFv/scFv-Fc、Fab/scFv-Fc、Fab/(scFv)2-Fc、Fab/Fab-scFv-Fc、Fab/Fab-交叉Fab-Fc、Fab/交叉Fab-Fc、IgG-scFv和IgG-(scFv)2。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，其中所述抗体是双特异性抗体，具体地还包含至少一个特异性识别CD3表位或组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)的结合位点。
11.根据权利要求10所述的Fc沉默的抗oxMIF抗体，其用于治疗或检测实体瘤，其中在第一步骤中向受试者施用所述抗体，以及在第二步骤中施用HSG半抗原，其中所述HSG半抗原与抗体结合并且被放射性核素标记。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的Fc沉默的抗体，其用于制备药剂。
13.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗体，任选地连同药物载体或佐剂一起。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述药物组合物经配制用于皮下施用。
15.根据权利要求13或14所述的药物组合物，其中所述组合物用于作为唯一的物质施用，或用于与其他活性物质一起施用，所述活性物质优选选自由以下组成的组：抗病毒物质、抗癌物质、抗炎物质和抗生素物质。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的药物组合物，用于治疗患有炎性疾病、感染性疾病的患者，具体地用于治疗哮喘、血管炎、关节炎、脓毒症、脓毒性休克、内毒素休克、中毒性休克综合征、获得性呼吸窘迫综合征、肾小球肾炎、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、腹膜炎、肾炎、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、多发性硬化、急性和慢性胰腺炎、1型糖尿病、IgA肾病、间质性膀胱炎、COVID后综合征和银屑病，或者用于治疗患有过度增殖性障碍或癌症的患者，具体地治疗结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌。
17.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗体。
18.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求17所述的核酸。
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