CN118234858A - 用于调节细胞药物代谢的系统、其方法和组合物 - Google Patents

用于调节细胞药物代谢的系统、其方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本公开提供了通过修饰靶细胞和/或包含这些靶细胞的细胞群体来调节药物代谢，具体地在肠道微生物组中的药物代谢的系统。所公开的系统包括以下组分：(a)至少一种药物代谢调节组分，该至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，该至少一种核酸序列编码和/或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；和(b)至少一种选择性组分，该至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区。该至少一个原间隔区被(a)的该CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，从而灭活所述选择性组分。本公开进一步提供了在药物代谢的调节中和在治疗应用中使用所公开的系统及其任何组分的组合物和方法。

Description

用于调节细胞药物代谢的系统、其方法和组合物
技术领域
本公开涉及微生物组的操纵领域。更具体地，本公开涉及通过特异性和靶向调节参与微生物组细胞(具体地，肠道微生物组的细胞，例如细菌细胞)中的药物代谢的元件来调节药物代谢。
背景技术
以下列出了被认为与目前公开的主题的背景技术相关的参考文献：
-WO2016/084088
-WO2018/002940
-Ahmad，S.，Hughes，M.A.，Lane，K.T.，Redinbo，M.R.，Yeh，L.-A.，&Scott，a.J.(2011).“A High Throughput Assay for Discovery of Bacterialβ-GlucuronidaseInhibitors.”Curr Chem Genomics.
-Boelsterli，U.A.，Redinbo，M.R.，&Saitta，K.S.(2013).“Multiple NSAID-induced hits injure the small intestine：underlying mechanisms and novelstrategies.”Toxicol Sci.
-Coyle，V.M.，Lungulescu，D.，Toganel，C.，Niculescu，A.，Pop，S.，Ciuleanu，T.，Wilson，R.H.(2013).“A randomised double-blind placebo-controlled phase IIstudy of AGI004 for control of chemotherapy-induced diarrhoea.”BritishJournal of Cancer volume.
-Fittkau，M.，Voigt，W.，Holzhausen，H.-J.，&Schmoll，H.J.(2004).“Saccharicacid 1.4-lactone protects against CPT-11-induced mucosa damage in rats.”JCancer Res Clin Oncol.
-Higuchi，K.，Yoda，Y.，Amagase，K.，Kato，S.，Tokioka，S.，Murano，M.，Umegaki，E.(2009).“Prevention of NSAID-Induced Small Intestinal Mucosal Injury：Prophylactic Potential of Lansoprazole.”J Clin Biochem Nutr.
-Kodawara，T.，Masuda，S.，Yano，Y.，Matsubara，K.，Nakamura，T.，&Masada，M.(2014).“Inhibitory effect of ciprofloxacin onβ-glucuronidase-mediateddeconjugation of mycophenolic acid glucuronide.”Biopharm Drug Dispos.
-Koppel，N.，Rekdal，V.M.，&Balskus，E.P.(2017).“Chemical transformationof xenobiotics by the human gut microbiota.”Science.
-Peekhaus，N.，&Conway，T.(1998).“What′s for dinner？：Entner-Doudoroffmetabolism in Escherichia coli.”J Bacteriol.
-Pellock，S.J.，Creekmore，B.C.，Walton，W.G.，Mehta，N.，Biernat，K.A.，Cesmat，A.P.Redinbo，M.R.(2018).“Gut Microbialβ-Glucuronidase Inhibition viaCatalytic Cycle Interception.”ACS Cent Sci.
-Sakamoto，H.，Yokota，H.，Kibe，R.，Sayama，Y.，&Yuasa，A.(2002).“Excretionof bisphenol A-glucuronide into the small intestine and deconjugation in thececum of the rat.”Biochim.Biophys.Acta.
-Tobin，P.J.，Dodds，H.M.，Clarke，S.，Schnitzler，M.，&Rivory，L.P.(2003).“The relative contributions of carboxylesterase and beta-glucuronidase in theformation of SN-38 in human colorectal tumours.”Oncol Rep.
-Wallace，B.D.，Roberts，A.B.，Pollet，R.M.，Ingle，J.D.，Biernat，K.A.，Pellock，S.J.，Redinbo，M.R.(2016).“Structure and Inhibition of Microbiomeβ-Glucuronidases Essential to the Alleviation of Cancer Drug Toxicity.”ChemBiol.
Weisburger，J.H.，Barnes，W.S.，Lovelette，C.A.，Tong，C.，Tanaka，T.，&Williams，G.M.(1986).“Genotoxicity，carcinogenicity，and mode of action of thefried food mutagen 2-amino-3-methylimidazo[4，5-f]quinoline(IQ).”EnvironmentalHealth Perspectives.
本文对上述参考文献的承认不应被推断为意指这些参考文献以任何方式与目前公开的主题的专利性相关。
背景技术
肠道微生物组是一个高度复杂且动态的生态系统，在成年人体内包含多达1Kg的细菌。个体内的肠道微生物组在生命早期就已建立，并在生命期间保持相对稳定，但其组成和/或功能可能受到一系列因素的影响，诸如饮食、益生菌和药物，尤其是抗生素。
现在已知，这种数万亿个微生物的集合体在人类健康和疾病易感性方面发挥着关键作用。它还执行各种重要的生物学功能，诸如维生素的合成、免疫系统的发育和调节、细菌防御、对上皮细胞损伤的肠道反应和营养代谢。此外，肠道微生物群可产生多种神经递质，包括血清素、多巴胺和去甲肾上腺素。由于其深远的生理作用，研究人员现在将肠道微生物群称为“第二脑”或“第二基因组”。
作为它们与宿主的共生关系的副产物，肠道微生物组直接和间接影响许多药物的药理学和/或毒理学特征，这种能力在40多年前首次被认识到。迄今为止，已有超过30种药物被确定为肠细菌的底物，并且这些数字还在持续快速上升。了解肠道微生物组在药物反应中的作用可能有助于开发提高药物疗效的微生物组靶向方法。因此，已出现了称为药物微生物组学的研究领域，旨在探索肠道微生物组对药物吸收、分布、代谢和排泄(ADME)的影响。
肠道微生物组修饰药物和化合物的能力归因于其进行广泛代谢反应的能力。最重要的反应涉及还原代谢和水解反应(特别是在缀合物上)。还描述了脱甲基、脱氨基、脱羟基、脱酰、脱羧和氧化，并且其重要性不亚于还原代谢。
微生物对药物反应的直接影响是肠道微生物组对药物化合物的化学转化，这些转化影响药物的生物利用度或生物活性及其毒性(Koppel，Rekdal，&Balskus，2017)。当药物的细菌转化导致产生对宿主产生有害影响的代谢物时，就会产生毒性。人体使用葡糖醛酸化来解毒数百种药物和内源性化合物，包括胆红素、胆汁酸和甲状腺素，葡糖醛酸化是外源化学物和内源化学物的II期代谢中最重要的途径之一。这是通过增加它们在水中的溶解度来实现的，并且通过这种方式，允许它们随后以显著增加的速率通过尿液或胃肠道(经由来自肝脏的胆汁)从体内排除。在葡糖醛酸化中，葡糖醛酸(GlcA)经由糖苷键与底物缀合。这一过程由尿苷5′-二磷酸葡糖醛酸基转移酶(UGT)介导，尽管葡糖醛酸化主要发生在肝脏中，但在所有主要身体器官中都发现了这类酶。该过程产生的最终产物命名为β-D-葡糖苷酸(或葡糖苷酸)。
许多肠道微生物组成员可代谢肠道中丰富的葡糖苷酸以从缀合的化合物中释放GlcA用作能量来源。GlcA进入Entner-Doudoroff途径，这是糖酵解的一种细菌替代途径，该途径分解糖酸并将产生的丙酮酸分流到TCA循环中(Peekhaus&Conway，1998)。
肠道中细菌介导的GlcA从葡糖苷酸中的去除再活化并有效逆转了UGT介导的哺乳动物对这些化合物的灭活作用。葡糖苷酸糖苷键的水解由一组称为b-葡糖醛酸糖苷酶或GUS的细菌酶催化。也许肠道微生物组介导的药物毒性中最广泛研究的示例是CPT-11(伊立替康)的情况。伊立替康是结肠癌最常用的化学治疗剂之一。CPT-11是前药，在肝脏中被活化为其毒性形式SN38，一种抗肿瘤拓扑异构酶I毒物。通过UGT介导的葡糖醛酸化将肝脏SN-38灭活为SN38G。一旦在肠中，SN38G用作原位再活化SN38的GUS酶的底物(Tobin，Dodds，Clarke，Schnitzler，&Rivory，2003)。代表伊立替康的剂量限制性毒性的肠中游离SN38是伊立替康引起腹泻的原因，据报道腹泻的总发生率为40％至80％(Coyle，et al.，2013)。
已经进行了多种尝试来克服伊立替康引起的腹泻；口服碱化、添加苯巴比妥和环孢素、活性碳等。探索了在CPT-11之前使用抗生素的可行性，显示了有希望的临床数据，其中消胆胺/左氧氟沙星联合用药降低了伊立替康相关的迟发性腹泻的严重程度。此外，(Kodawara，et al.，2014)证明了环丙沙星对β-葡糖醛酸糖苷酶活性的抑制作用。然而，这种方法有几个缺点：肠道微生物群的生态失调不被推荐用于免疫功能低下的患者，消除共生的肠道微生物组成员会增加病原体感染的机会。
肠道微生物组GUS活性被证明是肠毒性代谢物(具体地，SN38)浓度升高的原因，因此也是伊立替康引发腹泻的原因。因此，既不会妨碍伊立替康的治疗疗效也不会破坏天然微生物群的有效且特异性的GUS抑制剂将具有巨大的临床价值，并且研究了几种限制或消除这种微生物活性的方法。
Fittkau等人(Fittkau，Voigt，Holzhausen，&Schmoll，2004)然后是Wallace等人(Wallace，et al.，2016)筛选了化合物库并研究了它们对GUS活性的影响。他们鉴定了几种有效的抑制剂，其降低了大鼠中与伊立替康相关的GI毒性。他们还表明，这些抑制剂对细菌GUS的选择性是人酶直系同源物的1000倍以上。这是重要的，因为大肠杆菌(E.coli)GUS与人GUS共有50％氨基酸序列同一性且具有高度保守的活性位点，而人GUS是降解糖胺聚糖的重要溶酶体酶。
Pellock等人(Pellock，et al.，2018)发现了一组合哌嗪的GUS抑制剂，它们对微生物GUS酶具有选择性，并且通过在GUS活性位点形成共价抑制剂-GlcA复合物来抑制GUS。
Ahmad等人(Ahmad，et al.，2011)筛选了FDA批准的药物库，以探索这些已知药物中是否有任何药物具有GUS抑制活性。该筛选确定了尼亚酰胺、异卡波肼和阿莫沙平有可能被重新用作治疗剂，以减少与伊立替康化疗相关的腹泻。
伊立替康不是GUS介导的化合物再活化导致毒性的唯一情况。通过与伊立替康相同的机制，细菌GUS也可引起非甾体抗炎药(NSAID)的毒性，这可导致高达50％的使用者出现胃十二指肠粘膜病变(Higuchi，et al.，2009)。当葡糖醛酸化的NSAID通过肝胆途径分泌并到达远端小肠腔时，细菌GUS代谢这些化合物，增加腔内非葡糖醛酸化的NSAID的浓度。这些分子被肠细胞色素P450进一步代谢为潜在反应性中间体，诱导严重的内质网应激或线粒体应激，导致细胞死亡(Boelsterli，Redihbo，&Saitta，2013)。
此外，Weisburger等人(Weisburger，et al.，1986)表明，肉类加工期间产生的杂芳族化合物的致癌性与肠道细菌GUS有关。Sakamot等人(Sakamoto，Yokota，Kibe，Sayama，&Yuasa，2002)证明，盲肠中的细菌GUS活性延迟了内分泌干扰剂双酚A的消除。因此，细菌GUS酶(其表现出针对许多化合物的广泛活性)似乎通过代谢肠道中的葡糖苷酸而在健康和疾病中起重要作用。它可通过直接调节许多外源性和内源性化合物的局部和全身水平而显著影响这些化合物的药代动力学。
WO 2016/084088涉及用于干扰细菌间致病基因的水平转移和用于预防哺乳动物受试者中由细菌感染引起的病理状况的试剂盒、系统和方法。
WO 2018/002940涉及用于制备改进的核酸递送媒介物(具体地，具有扩展的宿主识别能力的载体)的平台、其组合物和用途。
因此，需要有效操纵微生物群以限制药物的剂量毒性，从而改善药物代谢和疗效。本公开满足了这一需求。
发明内容
本公开的第一方面涉及用于通过修饰靶细胞和/或靶细胞群体来调节药物代谢的系统。通过本公开的系统修饰的细胞或细胞群体表现出至少一种药物的经修饰的代谢。更具体地，本公开的系统包括至少两种元件。
一种组分或部分(a)包含至少一种药物代谢调节组分。该组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，该至少一种核酸序列编码和/或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件。本文所公开的系统的第二组分或部分(b)包含至少一种选择性组分，该至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区，其中所述至少一个原间隔区被(a)的该CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，从而灭活所述选择性组分。在一些实施方案中，靶细胞是细菌细胞。
本公开的另一个方面涉及用于调节靶细胞和/或细胞群体(例如，细菌细胞)的药物代谢的方法。在一些实施方案中，该方法包括以下步骤中的至少一者：
在一些实施方案中可以是第一步骤的一个步骤(a)，涉及使细胞或包含细胞的任何细胞群体与至少一种药物代谢调节组分接触，该至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种CRISPR阵列，该至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物代谢的至少一种元件。在一些实施方案中可以是第二步骤的另一步骤(b)，涉及使细胞或包含细胞的任何细胞群体与包含至少一个原间隔区的至少一种选择性组分接触。应当理解，该至少一个原间隔区被(a)的CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活选择性组分。
使靶细胞和/或细胞群体暴露和/或接触药物代谢调节组分和/或选择性组分和/或包含(a)和(b)组分中的至少一者的任何系统或组合物，导致调节靶细菌细胞的药物代谢，并且此外，选择和/或富集表现出至少一种药物的经修饰的代谢的细胞群体。
本公开的另一个方面涉及至少一种细胞和/或细胞群体，或它们的任何组合物或产品，表现出至少一种药物的经修饰的代谢。在一些具体的实施方案中，细胞是细菌细胞，因此本公开提供了表现出至少一种药物的经修饰的代谢的细菌细胞及其群体。在一些实施方案中，细胞和/或细胞群体通过包括以下步骤中的至少一者的方法制备。在一个步骤(a)(在一些实施方案中可以是第一步骤)中，该方法涉及使细胞或包含靶细胞的任何细胞群体与至少一种药物代谢调节组分接触，该至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种CRISPR阵列，该至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物代谢的至少一种元件。在另一步骤(b)(在一些实施方案中可以是下一步骤或第二步骤(b))中，使细胞或包含细胞的任何细胞群体与包含至少一个原间隔区的至少一种选择性组分接触。应当理解，至少一个原间隔区被(a)的CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分。
本公开的另一个方面涉及组合的组合物(具体地，药物组合物)，包含：至少一种药物和至少一种导致所公开组合物的药物的经调节代谢的本发明系统，或表现出药物的经调节代谢的任何细胞或细胞群体。在更具体的实施方案中，本文所公开的组合物可包含：
(I)至少一种药物代谢调节性系统，该至少一种药物代谢调节性系统包含以下项中的至少一者：(a)至少一种药物代谢调节组分，该至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，该至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；和(b)至少一种选择性组分，该至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区。应当注意的是，其中所述至少一个原间隔区被(a)的CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分。在一些另选的或另外的实施方案中，该组合物可进一步包含或者另选地除该药物之外还可包含(II)至少一种细菌细胞和/或这些细菌细胞的群体或它们的表现出该至少一种药物的经修饰的代谢的任何组合物或产品。更进一步，在一些实施方案中，该组合物任选地进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和添加剂中的至少一者。
本公开的另外方面涉及用于调节有此需要的受试者的至少一种药物的代谢的方法。更具体地，该方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的系统、经修饰的细菌细胞或细胞群体、它们的任何组合物或试剂盒或含有至少一种药物的其任何组合中的至少一者的步骤。更具体地，在一些实施方案中，向接受治疗的受试者施用以下的至少一者：(I)至少一种药物代谢调节性系统，该至少一种药物代谢调节性系统包含以下项中的至少一者：(a)至少一种药物代谢调节组分，该至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，该至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；和(b)至少一种选择性组分，该至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区，其中所述至少一个原间隔区被(a)的该CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分。另选地，或另外地，将(II)、至少一种细菌细胞和/或细菌细胞的群体或它们的任何组合物或产品施用给接受治疗的受试者，表现出该至少一种药物的经修饰的代谢。另选地，或另外地，给接受治疗的受试者施用：(III)、包含(I)和(II)中的至少一者的至少一种组合物、试剂盒或系统；和(IV)所述(I)、(II)和(III)中的至少一者与所述至少一种药物的任何组合。
更进一步，在另外方面，本发明提供了用于治疗、预防、改善、降低或延迟有此需要的受试者的至少一种病理性病患的发作的方法。更具体地，该方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的系统、经修饰的细菌细胞或细胞群体、它们的任何组合物或试剂盒或含有至少一种药物的其任何组合中的至少一者的步骤。更具体地，在一些实施方案中，向接受治疗的受试者施用以下的至少一者：(I)至少一种药物代谢调节性系统，该至少一种药物代谢调节性系统包含以下项中的至少一者：(a)至少一种药物代谢调节组分，该至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，该至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；和(b)至少一种选择性组分，该至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区，其中所述至少一个原间隔区被(a)的该CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分。另选地，或另外地，将(II)、至少一种细菌细胞和/或细菌细胞的群体或它们的任何组合物或产品施用给接受治疗的受试者，表现出该至少一种药物的经修饰的代谢。另选地，或另外地，给接受治疗的受试者施用：(III)、包含(I)和(II)中的至少一者的至少一种组合物、试剂盒或系统；和(IV)所述(I)、(II)和(III)中的至少一者与所述至少一种药物的任何组合。
借助以下描述，本公开的这些方面和其他方面将变得显而易见。
附图说明
为了更好地理解本文所公开的主题并且举例说明如何在实践中实施该主题，现在将参考附图仅通过非限制性示例来描述实施方案，在附图中：
图1.药物代谢调节(DOIN)组分
该图显示了药物代谢调节的一个实施方案，GusR K125A载体将K125A突变体GusR阻遏物引入靶向的细菌细胞内。ori-复制起点，gusRK125A-该基因编码GusR突变酶，Cas-Cas基因，CRISPR阵列-包含交替的保守重复序列和间隔区；在靶向选择性载体的红色间隔区中。
图2.选择性载体将细菌毒素引入靶向的细菌细胞中
该图显示了选择性组分的实施方案。ori-复制起点，毒素-该基因编码杀死细菌的毒素，原间隔区-选择性载体上被同源间隔区靶向的区域位于DOIN载体中。
图3A至图3C.GusR突变体K125A对GUS操纵子的调节
大肠杆菌GUS操纵子的示意图。GUS操纵子由三个基因：gusA、gusB和gusC组成。gusR基因编码操纵子阻遏物GusR。
图3A：在不存在配体的情况下，GusR结合其上游调节区(操纵子)并抑制操纵子基因的表达。
图3B：在配体存在时，配体(圆圈)与GusR阻遏物结合，这导致构象变化和从操纵子中释放阻遏物。这导致GUS操纵子的表达。
图3C：在存在GusR_K125A突变体(也由SEQ ID NO：9的氨基酸序列表示，带有星号的黑色箭头，在本文中也称为TBX201)的情况下，GusR保持附着于调控区，即使在存在配体的情况下，也不产生GUS酶。
圆圈-GUS诱导配体；GusR蛋白中的星形突变K125A。
图4.在细菌菌株中使用GusR K125A突变体抑制GUS活性
柱状图显示了在两种细菌宿主BW25113和MG1655中测量的突变体阻遏物K125A的GUS比活性(任意单位)。在GUS操纵子诱导物PNPG不存在(-)或存在(+)的情况下确定GUS操纵子的活性。数据代表至少两次独立实验。
图5.GusR K125A突变体抑制另外的大肠杆菌菌株中的GUS酶活性
根据GUS测定来确定GUS酶的比活性(任意单位)。对于每种菌株，具体地MG1655(灰色柱)和Nissle1917(黑色柱)，使用两种培养物：一种含有空载体(载体)，并且第二种含有表达GusR突变体K125A(K125A)的DOIN载体(本公开的调节性组分)。在存在或不存在用作GUS酶的底物(GUS底物)的PNPG的情况下温育培养物。数据代表至少两次独立实验。
图6.调节性组分向不同的微生物组分离株中的转导
如先前所述，使用TFU测定来确定DOIN载体向微生物组分离物中的转导(TFU/ml)。使测试细菌培养物(MG1655(灰色柱)、BW25113(白色柱))生长以达到中间指数生长期，并与转导颗粒(经修饰的细菌噬菌体)的裂解物一起温育1小时，该转导颗粒含有表达GusRK125A_CRISPR的DOIN载体，用作调节性组分。将十倍系列稀释液一式两份地涂布在选择性平板上，只有被转导的细菌才能在该平板上生长。灰色水平虚线表示检测的测定限。数据代表至少两次独立实验。
图7.GusR R73和GusR Y164F突变体影响GUS酶的活性
在用编码GusR R73和GusR Y164F突变体的DOIN载体转导的大肠杆菌菌株BW25113(白色柱)和MG1655(灰色柱)中，根据GUS测定来确定GUS酶的比活性(任意单位)。对于每种菌株，使用三种培养物，一种含有空载体(载体)，第二种和第三种含有DOIN载体，分别表达GusRR73A突变体或Y164F突变体。在存在或不存在用作GUS酶的底物(GUS底物)的PNPG的情况下温育培养物。数据代表至少两次独立实验。
图8A至图8C.细菌细胞群体体外培养物的转化
图8A.本公开的平台的实施方案的示意图，包含两种不同的组分，调节性组分和选择性组分，各自在为经修饰的细菌噬菌体的递送媒介物中。两种噬菌体具有相同的结构并靶向相同的细菌，但它们的有效载荷不同。左侧调节组分(标记为“CRISPR”)包含编码GusR突变体K125A和CRISPR-Cas3系统(DOIN载体)的核酸序列；右侧(标记为“选择性”)是具有非复制型T7裂解性噬菌体的经修饰基因组的噬菌体。这些噬菌体依次起作用。调节性组分的CRISPR阵列特异性地靶向“选择性”噬菌体并从选择性组分中拯救含有这种双重GusR突变体-CRISPR调节组分的任何细菌。
图8B.大肠杆菌BW25113分离株的细菌培养物生长直至达到中期指数生长期(107CFU/ml)。在0小时的时间点，使用含有DOIN载体的“CRISPR”噬菌体以约0.1的MOI感染培养物。一小时后，在1小时的时间点，并且再次在24小时的时间点，使用“选择性”组分噬菌体以约10的MOI感染培养物。确定总细菌群体中表达GUS的细菌(浅灰色)和抑制GUS的细菌(深灰色)的比例(细菌％)。箭头所示的噬菌体指示感染的时间点。数据代表两次独立实验。
图8C.在0小时的时间点(在加入“CRISPR”噬菌体之前)和48小时的时间点从细菌培养物中取样并测量GUS活性。
图9.GusR突变体K125A降低SN38的细胞毒性
该图显示了GusR突变体K125A通过以底物浓度依赖性方式抑制失活的SN38G经细菌GUS代谢转化为SN38而降低SN38的细胞毒性。使用两种BW25113细菌培养物：表达空载体的载体细菌，和含有表达GusR突变体阻遏物K125A的DOIN载体的K125A细菌。将培养物与PNPG一起温育以诱导GUS操纵子，然后与指定浓度的SN-38G(SantaCruz，212931A)一起温育，随后裂解细菌。HL29(HTB-38TM)细胞根据制造商的说明书进行维护，并用不同的细菌提取物温育48小时。使用XTT活力测定，在三个独立的生物学重复中使用四组平行测定来测定与细菌裂解物一起温育的细胞的活力。
图10.由于GUS对SN38G代谢的降低，SN38的细胞毒性降低
柱状图显示了不同处理组中的细胞活力。GusR突变体K125A通过以酶浓度依赖性方式抑制细菌GUS对SN38G的代谢来降低SN38的细胞毒性。该研究如图所述进行，但有以下修改：将培养物与PNPG一起温育以诱导GUS操纵子，如所示稀释，接着与1μM SN-38G一起温育，随后裂解细菌。如上所述确定细胞的活力。
具体实施方式
本公开涉及操纵微生物组以调节药物和其他物质的代谢。这种调节产生多种效果，例如降低的药物毒性、改善的药物吸附、调节的稳定性以及增加的药物可用性和前药的摄取和活化。例如，本文所公开的基于噬菌体的转导颗粒可被合成工程化，并且宿主范围可被预先设计和定义。该特征使得能够以精确和独特的形式确定靶向的细菌群体，例如肠细菌群体。本文所公开的系统提供了至少两种组分，如本文作为非限制性实施方案所举例说明的，这两种组分可以是两种类型的基于噬菌体的转导颗粒，一种类型包括：包含并递送药物代谢调节组分(本文也称为药物代谢调节(DOIN))载体或还包含CRISPR-Cas系统或模块的本公开调节组分的转导颗粒，以及将选择性载体包装和/或递送至靶细胞内的转导颗粒。选择性载体包含：编码毒性产物的核酸序列，该毒性产物杀死、减弱、破坏或抑制细菌生长和/或功能；以及至少一个原间隔区，其序列与至少一个间隔区匹配，并因此被包含在调节性组分(DOIN载体)中的CRISPR阵列中的至少一个间隔区靶向。该系统能够调节药物代谢并持续富集其中含有调节性组分(DOIN载体或递送媒介物)和CRISPR的细菌群体。DOIN载体包含编码至少一种调节药物代谢的组分的核酸序列。递送该组分以提高个体所消耗的特定药物的活性或降低伴随该药物的使用的毒副作用。DOIN载体的CRISPR-Cas模块包含靶向选择性组分载体(递送媒介物)中匹配的原间隔区的至少一个间隔区。DOIN载体被递送到靶向的细菌群体中，例如在肠道中。一旦递送，递送媒介物的转导核酸序列就被表达并产生参与药物代谢的活性组分，从而提供调节性手段。这种组分的引入改变了肠道中现有细菌群体的能力，从而操纵这种微生物组细胞群体(例如，细菌群体)的活性。一旦在靶向的微生物组-微生物，特别是靶向的细菌中表达，上述元件是活性的和功能性的。在一些实施方案中，在将DOIN载体引入微生物组宿主(细菌宿主细胞)后，随后引入选择性组分。选择性组分的引入导致选择性杀死靶向的细菌宿主。然而，由于DOIN载体上的CRISPR靶向并消除了选择性载体，因此保持DOIN载体的细胞受到保护而不会被选择性载体杀死。上述含DOIN载体的细菌的主动选择的最终结果是产生了有利于保持和产生DOIN载体的细菌宿主细胞的选择压力。
因此，本公开的第一方面涉及用于通过修饰微生物组的微生物(例如，细菌细胞和/或细菌细胞群体)来调节药物代谢的系统。通过本公开的系统修饰的靶细胞(例如，细菌细胞或细胞群体)表现出至少一种药物的经修饰的代谢。更具体地，本公开的系统包括至少两个元件或组分。
所公开系统的一个组分、元件或部分(a)包含至少一种药物代谢调节组分。该组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，该至少一种核酸序列编码和/或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件。本文所公开的系统的第二组分、元件或部分(b)包含至少一种选择性组分，该至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区。应当注意的是，该选择性组分的该至少一个原间隔区被该调节性组分(a)的CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，从而灭活该选择性组分。
应当理解，所公开的系统在本文中也可称为试剂盒，该试剂盒包括所公开的至少两种组分。
本文所公开的系统在调节药物代谢中是有效的。更具体地，药物的代谢由所公开的系统的药物代谢调节性组分调节。如本文所用的药物代谢是指活生物体通常通过专门的酶系统对药物的代谢分解。更一般地，异生物质代谢是改变异生物质的化学结构的一组代谢途径，该异生物质是对于生物体的正常生物化学而言外来的化合物，诸如任何药物或毒物。这些反应通常用于解毒有毒化合物，尽管在一些情况下，异生物质代谢中的中间体本身可引起毒性作用。药物代谢的研究称为药代动力学。药物的代谢是药理学和医学的一个重要方面。例如，代谢率决定了药物药理作用的持续时间和强度。尽管代谢通常会灭活药物，但一些药物代谢物具有药理学活性，有时甚至比母体化合物更具活性。具有活性代谢物的无活性或弱活性物质被称为前药，特别是如果被设计成更有效地递送活性部分。
药物可通过氧化、还原、水解、水合、缀合、缩合或异构化来代谢；无论哪种方法，目标都是使药物更容易排泄。参与代谢的酶存在于许多组织中，但通常更集中在肝脏中。对于许多药物，代谢分两期进行。I期反应涉及形成新的或修饰的官能团或裂解(氧化、还原、水解)；这些反应是非合成的。II期反应涉及与内源物质(例如，葡糖醛酸、硫酸盐、甘氨酸)缀合；这些反应是合成的。在合成反应中形成的代谢物更具极性，因此比在非合成反应中形成的那些代谢物更容易被肾脏(在尿液中)和肝脏(在胆汁中)排泄。一些药物仅经历I期或II期反应；因此，期编号反映功能分类而不是顺序分类。I期代谢的最重要酶系统是细胞色素P-450(CYP450)，这是一种催化许多药物氧化的微粒体同工酶超家族。电子由NADPH-CYP450还原酶提供，这是一种黄素蛋白，将电子从NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的还原形式)转移到CYP450。CYP450酶可被许多药物和物质诱导或抑制，导致药物相互作用，其中一种药物增强毒性或降低另一种药物的治疗效果。例如与特定酶相互作用的药物。葡糖醛酸化是最常见的II期反应，也是唯一发生在肝微粒体酶系统中的反应。葡糖苷酸在胆汁中分泌并在尿液中消除。因此，缀合使得大多数药物更易溶解并且更容易被肾脏排泄。氨基酸与谷氨酰胺或甘氨酸缀合产生易于在尿液中排泄但不会在胆汁中大量分泌的缀合物。
更进一步，在如本文所用的药物代谢的一些调节中是指增加或减少各种代谢酶的作用，这些代谢酶可通过增加药物的活性、亲和力、稳定性、生物利用度、疗效、溶解度来活化药物，或者另选地通过降低药物的活性、亲和力、稳定性、生物利用度、疗效、溶解度来灭活药物。
更进一步，通过如本文所用的所公开系统或试剂盒对药物代谢的调节包括该药物的活性、亲和力、稳定性、生物利用度、疗效、溶解度中的至少一者的任何改变、诱导、增加和升高或者另选地减少、降低和减弱，或者另选地通过降低药物的活性、亲和力、稳定性、生物利用度、疗效、溶解度来灭活该药物。更具体地，如本文所用的“调节”是指药物的功能和/或活性、稳定性和/或结构、亲和力、稳定性、生物利用度、疗效、溶解度的扰动。在某些实施方案中，调节可涉及药物代谢的增加或减少，从而导致药物的功能和/或活性、稳定性和/或结构、亲和力、稳定性、生物利用度、疗效、溶解度的期望调节。更具体地，如本文所用的“正在增加”、“增加的”、“增加”“增强”或“活化”在本文中均用于一般表示统计学上显著量的增加；为了避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”“增强”或“活化”是指与药物的功能和/或活性、稳定性和/或结构、亲和力、稳定性、生物利用度、疗效、溶解度的参考水平相比增加至少10％。例如，与药物的功能和/或活性、稳定性和/或结构、亲和力、稳定性、生物利用度、疗效、溶解度的参考水平相比，至少约20％或至少约30％或至少约40％或至少约50％或至少约60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％或至多并且包括100％的增加或10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍或至少约3倍或至少约4倍或至少约5倍或至少约10倍增加或2倍至10倍或更大之间的任何增加。另选地，如本文所用的“抑制”、“缓和”、“降低”、“减少”或“减弱”、“预防”、“压制”、“阻遏”、“消除”在本文中均用于一般表示统计学上显著量的减少；为了避免任何疑问，术语“抑制”、“缓和”、“减少”、“降低”或“减弱”、“预防”、“压制”、“阻遏”、“消除”是指与药物的功能和/或活性、稳定性和/或结构、亲和力、稳定性、生物利用度、疗效、溶解度的参考水平相比降低至少10％。例如，与药物的功能和/或活性、稳定性和/或结构、亲和力、稳定性、生物利用度、疗效、溶解度的参考水平相比，至少约20％或至少约30％或至少约40％或至少约50％或至少约60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％或至多并且包括100％的降低或10％-100％之间的任何降低，或者与参考水平相比至少约2倍或至少约3倍或至少约4倍或至少约5倍或至少约10倍降低或2倍至10倍或更大之间的任何降低。
因此，在一些实施方案中，本公开的药物代谢组分由以增加和/或降低药物的功能和/或活性、稳定性和/或结构、亲和力、稳定性、生物利用度、疗效、溶解度中的至少一者的方式调节药物代谢的任何元件组成。
应当理解，在整个本说明书中，术语“药物代谢调节组分”、“药物代谢调节(DOIN)”、“调节性组分”、“调节组分”在本公开中可互换使用，并且均指在一些实施方案中包含核酸分子、至少一种cas基因和至少一种CRJSPR阵列的组分，该核酸分子编码和/或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件。
应当理解，具体地在本文所公开的系统的药物代谢调节组分的核酸序列调节参与靶药物代谢的至少一种靶元件的情况下，此类核酸序列可以是任何调节性核酸序列。调节核酸序列的示例可包括但不限于siRNA、miRNA、dsRNA、反义寡核苷酸、募集核酸酶的gRNA(例如，Cas/CRISPR系统)等，它们可直接或间接增强、降低或修饰参与靶药物代谢的靶元件。另选地，提供有调节性组分的该至少一种核酸序列可编码增强、阻遏、活化和/或灭活参与靶药物代谢的靶元件的任何元件。在一些实施方案中，调节组分的CRISPR系统进一步用于不仅提供选择性组分和调节组分之间的绝对连接，而且直接调节参与靶药物代谢的靶元件，例如消除(敲低，例如通过切割和/或破坏靶核酸序列，或通过募集抑制性元件，诸如转录阻遏物)靶元件，或增强和提高该组分(例如，当CRISPR系统募集活化物，例如转录活化物时)。因此，在此类具体且非限制性的实施方案中，编码或调节参与靶药物代谢的至少一种元件的该至少一种核酸序列包含在CRISPR阵列内(例如，特异性靶向参与靶药物代谢的靶元件的间隔区)。
更进一步，在本文所公开的系统的一些实施方案中，调节组分包含在至少一种递送媒介物中，该至少一种递送媒介物特异性靶向细胞和/或靶细胞群体(例如，细菌细胞群体)中的细胞。因此，这种递送媒介物与所需的靶细胞相容。应当理解，递送媒介物或载体，具体地包含本公开的组分(具体地，本文所公开的调节性组分和/或选择性组分)的基于细菌噬菌体的转导颗粒与靶细胞(例如，细菌细胞)相容。因此，在本公开的上下文中，术语“相容的”是指特定的递送媒介物可包含能够用特定靶细胞识别的特定合适的宿主识别元件。如本文所用的“识别”还包括递送媒介物结合、连接、吸收、渗透到靶细胞中。
在又一些另外的实施方案中，本公开的系统的选择性组分包含在至少一种递送媒介物内，该至少一种递送媒介物特异性靶向靶细胞和/或细胞群体中的靶细胞。更进一步，在一些实施方案中，选择性组分可包含影响细胞活力和/或活性的至少一种试剂。
如本文所用的“选择性组分”是指本发明系统的元件或组分，其能够实现、促进、导致和作用于、选择、挑选、选出或富集靶宿主细胞的特定群体，例如靶细菌细胞，具体地携带本公开的cas-CRISPR系统的细胞群体。更具体地，携带本发明的药物代谢调节组分的细菌细胞群体还在CRISPR阵列中含有针对选择性组分中的原间隔区的间隔区。因此，该选择性组分为所需群体提供了选择性优势，例如通过施加能够且仅允许所选择的所需群体(在具体实施方案中，携带本发明的药物代谢调节组分的任何群体或细胞)存活的条件。如本文所示，本公开的选择性组分包含杀死、抑制或降低靶细胞(例如，细菌细胞)生长、活力和/或功能的毒性元素。应当理解，如本文所提及的术语“抑制”、“缓和”、“减少”、“降低”或“减弱”、“预防”、“压制”、“阻遏”、“消除”涉及将进展(例如，生长、活力和/或功能)延缓、限制或减轻约1％至99.9％范围内的任一百分比，具体地，约1％至约5％、约5％至10％、约10％至15％、约15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％、约35％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约50％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约75％至80％、约80％至85％、约85％至90％、约90％至95％、约95％至99％，或约99％至99.9％、100％或更多。关于上述内容，应当理解，在提供的情况下，百分比值，诸如例如10％、50％、120％、500％等能够与“变化倍数”值互换，即分别为0.1、0.5、1.2、5等。
此外，本发明的CRISPR阵列的至少一个间隔区可编码与作为感兴趣的核酸序列包含在本发明的选择性组分或其任何系统中的核酸序列(或原间隔区)充分互补的序列，以便例如通过使用Cas核酸酶切割包含原间隔区的靶核酸序列来靶向和灭活该选择性组分。在一些实施方案中，“灭活”是指延迟、降低、抑制、消除、减弱或终止选择性组分的活性。应当注意的是，这种灭活使得包含药物代谢调节组分的细菌对本发明的选择性组分或其系统不敏感且具有抗性。应当理解，如本文所用的足够的互补性反映了约10％至100％之间的任何互补性，更具体地，约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的互补性。在某些实施方案中，“互补性”是指各自遵循锁-钥匙原理的两种结构之间的关系。在自然界中，互补性是DNA复制和转录的基本原理，因为它是两个DNA或RNA序列之间共有的性质，使得当它们彼此反向平行排列时，序列中每个位置的核苷酸碱基将是互补的(例如，A和T或U、C和G)。
在一些实施方案中，用于调节组分以及选择性组分的该至少一种递送媒介物是或包含至少一种遗传元件。应当理解，用于这至少两种组分的递送媒介物可以是相同的或不同的。在又一些另外的实施方案中，两种递送媒介物必须将调节性组分或选择性组分靶向并转导至相同的靶细胞。在一些非限制性实施方案中，这种遗传元件可以是以下中的至少一者：至少一种转导颗粒、至少一种细菌噬菌体、基于细菌噬菌体的、细菌噬菌体样转导颗粒和/或至少一种修饰的细菌噬菌体或其任何片段或部分，或者包含和/或编码调节组分和/或选择性组分的至少一种载体、质粒和/或构建体，以及它们的任何组合或混合物。
在又一些另外的实施方案中，用于该系统的调节性组分和/或选择性组分的递送媒介物是至少一种细菌噬菌体或任何细菌噬菌体样转导颗粒。
如本文所用的“媒介物”或“递送媒介物”包括载体或任何转导颗粒，诸如细菌噬菌体、细菌噬菌体样颗粒、质粒、噬菌粒、病毒、可整合的DNA片段和其他媒介物，其能够将核酸分子转移到期望的靶细胞中，并且在一些另外的实施方案中，导致转导的核酸分子在靶细胞中表达。如本文所用的转导颗粒或元件是指能够将核酸分子或任何货物转导并插入靶细胞或人工细胞系统中的任何载体或媒介物。
载体通常是自我复制的DNA或RNA构建体，这些构建体含有所需核酸序列和可操作地连接的遗传控制元件，这些遗传控制元件在合适的细胞中被识别并影响所需基因的翻译。一般地，遗传控制元件可包括原核启动子系统。这种系统通常包括转录启动子、转录增强子以提高RNA表达水平。载体通常含有复制起点，使载体能够独立于细胞进行复制。
因此，术语“控制和调控元件”包括启动子、终止子和其他表达控制元件。此类调控元件描述于Goeddel；[Goeddel.等人，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)]。例如，当与DNA序列可操作地连接时控制DNA序列表达的多种表达控制序列中的任一种表达控制序列可用于这些载体中，以使用本发明的方法表达编码任何所需蛋白质的DNA序列。
载体或递送媒介物可另外包括合适的限制性位点、抗生素抗性或用于选择含有载体的细胞的其他标志物。质粒是最常用的载体形式，但具有同等功能并且本领域已知或变得已知的其他的载体形式也适用于本文。参见，例如Pouwels等人，Cloning Vectors：Laboratory Manual(1985年及补编)，Elsevier，N.Y.；和Rodriquez等人，(编辑)Vectors：aSurvey of Molecular Cloning Vectors and their Uses，Buttersworth，Boston，Mass(1988年)。应当理解，递送媒介物的这种定义与本公开中所述的任何系统、方法或组合物相关。
更进一步，在一些实施方案中，当质粒或其他构建体/盒或其他遗传元件用作递送媒介物时，它们包含编码调节组分的核酸序列，或者另选地编码抑制和/或降低细胞活力和/或功能的毒性组分的核酸序列。
在又一些另外的实施方案中，本公开的递送媒介物可特别适用于特定靶细胞，例如，适用于特定细菌细胞，使得所公开的系统的调节性组分和/或选择性组分将主要被引入或转导至靶细胞(例如，微生物组中的特定细菌细胞类型)。
更进一步，在所公开的系统的选择性组分的一些实施方案中，递送媒介物可以是至少一种细菌噬菌体或任何细菌噬菌体样或基于细菌噬菌体的转导颗粒，该至少一种细菌噬菌体或任何细菌噬菌体样或基于细菌噬菌体的转导颗粒包含和/或编码杀死细菌细胞或破坏、减弱和/或抑制细菌生长和/或功能的至少一种毒性元素。这种毒性元件可由任何遗传元件提供、包含在任何遗传元件内和/或由任何遗传元件转导，遗传元件例如质粒、构建体、转座子、细菌噬菌体、经修饰的细菌噬菌体、基于噬菌体的元件。在一些实施方案中，选择性元件可作为裂解性噬菌体提供。
术语“细菌噬菌体”是指在原核生物诸如细菌内感染、复制和组装的病毒。应当注意的是，术语“细菌噬菌体”与术语“噬菌体”同义。噬菌体由包裹DNA或RNA基因组的蛋白质组成，这些基因组可仅编码几个或数百个基因，从而产生具有相对简单或复杂结构的病毒体。根据病毒分类国际委员会(ICTV)，考虑核酸的形态和类型(DNA或RNA，单链或双链，线性或环状)对噬菌体进行分类。迄今为止，已识别出感染细菌和/或古细菌(以前分类为古细菌的原核结构域)的大约19个噬菌体家族。许多细菌噬菌体对细胞的特定属或种或菌株具有特异性。应当理解，任何合适的噬菌体可用作本公开的方法、系统和组合物的递送媒介物。
在一些非限制性实施方案中，本发明公开的主题的细菌噬菌体属于有尾噬菌体目(Caudovirales)(例如，属于短尾噬菌体科(Podoviridae)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)或长尾噬菌体科(Siphoviridae))或属于线状病毒目(Ligamenvirales)(例如，属于脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)或古噬菌体科(Rudivirus))。本公开还涵盖来自其他科的噬菌体，例如壶腹病毒科(Ampullaviridae)、双尾病毒科(Bicaudaviridae)和棒状病毒科(Clavaviridae)，仅举几例。
在其他实施方案中，根据本公开的细菌噬菌体是(但不限于)细菌噬菌体短尾噬菌体科、肌尾噬菌体科或长尾噬菌体科、脂毛噬菌体科或古噬菌体科中的一者。
在某些具体实施方案中，根据本公开的细菌噬菌体是T7样病毒或T4样病毒中的至少一者。
在进一步的具体实施方案中，通过下文描述的本发明的方法、本公开的系统和组合物用作递送媒介物的噬菌体可以是T7样病毒，具体地肠杆菌属(Enterobacteria)噬菌体T7。细菌噬菌体T7是具有裂解生命周期的DNA病毒。
更具体地，根据本公开的噬菌体可以是大肠杆菌噬菌体T7(有尾噬菌体目的短尾噬菌体科的成员，如上文详述)。T7由在顶点之一处具有20nm短尾的二十面体衣壳组成。衣壳由外壳蛋白基因产物(gp)10形成，并包围40kb的DNA。由gp14、gp15和gp16组成的圆柱形结构存在于衣壳内，附着于由连接器形成的特殊顶点，即gp8的圆形十二聚体(8，10)。蛋白gp11和gp12形成尾部；gp13、gp6.7和gp7.3也已被证明是病毒体的一部分并且是感染所必需的，尽管它们的位置尚未确定。尾部的主要部分由gp12组成，gp12是一种大蛋白，其中存在六个拷贝；小gp11蛋白也位于尾部中。尾部附着有六条纤维，每条纤维含有gp17蛋白的三个拷贝。
通过本公开的方法、系统和组合物用作递送媒介物的噬菌体可包括短尾噬菌体科的其他组成员，例如但不限于T3噬菌体、Φ29、P22、P-SPP7、N4、ε15、K1E、K1-5和P37。
在一些具体的实施方案中，通过本公开的方法、系统和组合物用作递送媒介物的噬菌体可包括但不限于肠杆菌属噬菌体T7、肠杆菌属噬菌体13a、耶尔森氏菌属(Yersinia)噬菌体YpsP-G、肠杆菌属噬菌体T3、耶尔森氏菌属噬菌体YpP-R、沙门氏菌属(Salmonella)噬菌体phiSG-JL2、沙门氏菌属噬菌体Vi06、假单胞菌属(Pseudomonas)噬菌体gh-1、克雷伯氏菌属(Klebsiella)噬菌体K11、肠杆菌噬菌体phiEap-1、肠杆菌噬菌体E-2、克雷伯氏菌属噬菌体KP32、克雷伯氏菌属噬菌体KP34、克雷伯氏菌属噬菌体vB_KpnP_KpV289和假单胞菌属噬菌体phiKMV。
作为另一示例，这些细菌噬菌体包括但不限于能够感染细菌的那些细菌噬菌体，这些细菌包括但不限于变形菌门(proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacterioidetes)中的任一者。
作为进一步的示例，可用作所公开组分的递送媒介物的细菌噬菌体，或者另选地可用作适于靶细胞(例如，细菌细胞)的递送媒介物的异源宿主识别元件的来源的细菌噬菌体包括但不限于能够感染属于以下属的细菌的那些细菌噬菌体：大肠杆菌、假单胞菌属、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、沙门氏菌属、志贺氏菌属(Shigella)、梭菌属(Clostidium)、肠球菌属(Enterococcus)、克雷伯氏菌属、不动杆菌属(Acinetobacter)和肠杆菌属。
仅举几例，这些细菌噬菌体可包括但不限于对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有特异性的细菌噬菌体，特别是对以下中的至少一者具有特异性的噬菌体：vB_Sau.My D1、vB_Sau My 1140、vB_SauM142、Sb-1、vB_SauM 232、vB_SauS 175、vB_SauM 50、vB_Sau 51/18、vB_Sau.M.1、vB_Sau.M.2、vB_Sau.S.3、vB_Sau.M.4、vB_Sau.S.5、vB_Sau.S.6、vB_Sau.M.7、vB_Sau.S.8、vB_Sau.S.9、vB_Sau.M.10、vB_Sau.M.11。在又一些另外的实施方案中，对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)具有特异性的细菌噬菌体也可适用于本发明。在更具体的实施方案中，这些噬菌体可包括vB_Klp 1、vB_Klp 2、vB_Klp.M.1、vB_Klp.M.2、vB_Klp.P.3、vB_Klp.M.4、vB_Klp.M.5、vB_Klp.M.6、vB_Klp.7、vB_Klp.M.8、vB_Klp.M.9、vB_Klp.M.10、vB_Klp.P.11、vB_Klp.P.12、vB_Klp.13、vB_Klp.P.14、vB_Klp.15、vB_Klp.M.16。更进一步，在某些实施方案中，对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)具有特异性的细菌噬菌体可用作本发明的递送媒介物，或者另选地用作合适的递送媒介物的异源宿主识别元件的来源。此类细菌噬菌体的非限制性示例包括但不限于vB_Psa.Shis 1、vB_PsaM PAT5、vB_PsaP PAT14、vB_PsaM PAT13、vB_PsaM ST-1、vB_Psa cT27、vB_Psa cT 44 K、vB_PsacT 44 M、vB_Psa 16、vB_Psa Ps-1、vB_Psa 8-40、vB_Psa 35 K、vB_Psa 44、vB_Psa 1、vB_Psa 9、vB_Psa 6-131 M、vB_Psa cT 37、vB_Psa cT 45 S、vB_PsacT 45 M、vB_Psa cT 16 MU、vB_Psa cT 41、vB_Psa cT 44 MU、vB_Psa cT 43、vB_Psa cT 11K、vB_Psa 1638、vB_Psa Ps-2、vB_Psa 35 CT、vB_Psa 35 M、vB_Psa S.Ch.L、vB_Psa R1、vB_Psa SAN、vB_Psa L24、vB_Psa F8、vB_Psa BT-4、vB_Psa BT-2(8)、vB_Psa BT-1(10)、vB_Psa BT-4-16、vB_Psa BT-5、vB_Psa F-2、vB_Psa B-CF、vB_Psa Ph7/32、vB_PsaPh7/63、vB_Psa Ph5/32、vB_Psa Ph8/16、vB_Psa Ph11/1、vB_Psa、vB_Psa3、vB_Psa 4、vB_Psa 5、vB_Psa 6、vB_Psa 7、vB_Psa.P.15、vB_Psa.17、vB_Psa.M.18、vB_Psa.28、vB_Psa.M.2、vB_Psa.M 3、vB_Psa.23、vB_Psa.P.8、vB_Psa.M.PST7、vB_Psa.M.C5、vB_Psa.M D1038。在进一步的实施方案中，对鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)具有特异性的细菌噬菌体可适用于本发明。此类溶解性或温和噬菌体可包括vB_Aba B37、vB_Aba G865、vB_Aba G866、vB_Aba U7、vB_Aba U8、vB_Acb 1、vB_Acb 2中的任一者。在又一些另外的实施方案中，对肠杆菌属具有特异性的细菌噬菌体可用作本发明的递送媒介物，或者另选地，用作合适的递送媒介物的异源宿主识别元件的来源，具体地，vB_Eb 1、vB_Eb 2、vB_Eb 3、vB_Eb 4细菌噬菌体中的任一者。在又一些另外的实施方案中，可使用对粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)具有特异性的细菌噬菌体。几个非限制性示例包括vB_Ec 1、vB_Ec 2、vB_Enf.S.4、vB_Enf.S.5细菌噬菌体中的任一者。
在又一些另外的实施方案中，特异性感染炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的细菌噬菌体(例如，vB_BaK1、vB_BaK2、vB_BaK6、vB_BaK7、vB_BaK9、vB_BaK10、vB_BaK11、vB_BaK12、vB_BaGa4、vB_BaGa5、vB_BaGa6)也可应用于本发明。更进一步，对流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)具有特异性的细菌噬菌体例如Tb、vB_BraP IV、vB_BraP V、vB_BraPVI、vB_BraP VII、vB_BraP VIII、vB_BraP IX、vB_BraP X、vB_BraP XII、vB_BraP 12(b)、vB_BraP BA、vB_BraP 544、vB_BraP 141я、vB_BraP 141m、vB_BraP 19я、vB_BraP 19m、vB_BraP 9，对犬布氏杆菌(Brucella canis)具有特异性的细菌噬菌体具体地为vB_BrcP1066，对产气荚膜梭菌(Clostridiumperfigenes)A.B.C.D.E具有特异性的细菌噬菌体例如vB_CpPI、vB_CpII、vB_CpIII、vB_CpIV，对普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)具有特异性的细菌噬菌体具体地为vB_DvRCH1/M1、vB_DvH/P15、vB_DvH/M15，对粪肠球菌具有特异性的细菌噬菌体具体地为vB_Ec 1、vB_Ec 2、vB_Enf.S.4、vB_Enf.S.5，对大肠杆菌具有特异性的细菌噬菌体具体地为vB_Eschc.pod 9、vB_Eschc.Pod 4、vB_Eschc.Shis 7、vB_Eschc.Shis 14、vB_Eschc.Shis 5、vB_Eschc.My 2、PhI-1、PhI-2、PhI3、PhI4、PhI5、T2、T4、T5、DDII、DDVI、DDVII、vB_Eschc.Shis 7/20、vB_Eschc.Shis 1161、vB_Eschc.Shis 8963、vB_Eschc 4、vB_Eschc 11/24、vB_Eschc.Shis 18、vB_Shis 3/14、vB_Sau A、vB_Shis G、vB_Eschc.Shis W、vB_Shis GE25、vB_Eschc.Shis 8962、vB_Eschc 90/25、vB_Eschc 5/25、vB_Eschc 12/25、vB_Eschc H、T3、T6、T7、vB_Eschc 4、vB_Eschc 121、vB_Eschc BaK2、vB_Eschc L7-2、vB_Eschc L7-3、vB_Eschc L7-7、vB_Eschc L7-8、vB_Eschc L7-9、vB_EschcL7-10、vB_EschcΦ8、vB_Eschc.Shis 20、vB_Eschc.Shis 25、vB_Eschc.Shis 27、vB_Eschc.Shis MY、vB_Eschc 11、vB_Eschc 12、vB_Eschc 13、vB_Eschc17、vB_Eschc 18、vB_Eschc 19、vB_Eschc 20、vB_Eschc 21、vB_Eschc 22、vB_Eschc 23、vB_Eschc 24、vB_Eschc25、vB_Eschc 26、vB_Eschc 27、vB_Eschc 28、vB_Eschc 29、vB_Eschc 30、vB_Eschc 31、vB_Eschc 32、vB_Eschc 34、vB_Eschc 35、vB_Eschc 37、vB_Eschc 38、vB_Eschc 39、vB_Eschc 44、vB_Eschc 45、vB_Eschc 46、vB_E.coli.M.1、vB_E.coli.M.2、vB_E.coli.P.3、vB_E.coli.P.4、vB_E.coli.P.5、vB_E.coli.P.6、vB_E.coli.P.7、vB_E.coli.P.8，对副伤寒沙门氏菌(Salmonellaparatyphi)具有特异性的噬菌体具体地为vB_SPB Diag 1、vB_SPBDiag 2、vB_SPB Diag 3、vB_SPB Diag 3b、vB_SPB Diag Jersey、vB_SPB Diag Beecles、vB_SPB DiagTaunton、vB_SPB DiagB.A.O.R、vB_SPB Diag Dundee、vB_SPBDiagWorksop、vB_SPB Diag E、vB_SPB Diag D、vB_SPB Diag F、vB_SPB Diag H，对Salmonellatyphiabdominalis具有特异性的噬菌体为vB_Sta Diag A、vB_Sta Diag B1、vB_Sta Diag B2、vB_Sta Diag C1、vB_Sta Diag C2、vB_Sta Diag C3、vB_Sta Diag C4、vB_Sta Diag C5、vB_StaDiag C6、vB_Sta Diag C7、vB_Sta Diag D1、vB_Sta Diag D2、vB_StaDiag D4、vB_Sta Diag D5、vB_Sta Diag D6、vB_Sta Diag D7、vB_StaDiag D8、vB_StaDiag E1、vB_Sta Diag E2、vB_Sta Diag E5、vB_StaDiag E10、vB_Sta Diag F1、vB_StaDiag F2、vB_Sta Diag F5、vB_StaDiag G、vB_Sta Diag H、vB_Sta Diag J1、vB_Sta DiagJ2、vB_Sta Diag K、vB_Sta Diag L1、vB_Sta Diag L2、vB_Sta Diag M1、vB_Sta Diag M2、vB_Sta Diag N、vB_Sta Diag O、vB_Sta Diag T、vB_Sta Diag Vil、vB_Sta Diag27、vB_Sta Diag 28、vB_Sta Diag 38、vB_Sta Diag 39、vB_StaDiag 40、vB_Sta Diag 42、vB_StaDiag 46，对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)具有特异性的噬菌体具体地为vB_Stm.My 11、vB_Stm.My 28、vB_Stm.Shis 13、vB_Stm.My 760、vB_Stm.Shis 1、IRA、vB_Stm16、vB_Stm 17、vB_Stm 18、vB_Stm 19、vB_Stm 20、vB_Stm 21、vB_Stm 29、vB_Stm 512、vB_Stm Diag I、vB_Stm Diag II、vB_Stm Diag III、vB_Stm Diag IV、vB_Stm Diag V、vB_StmDiag VI、vB_Stm Diag VII、vB_Stm Diag VIII、vB_Stm Diag IX、vB_Stm Diag X、VB_StmDiag XI、vB_Stm Diag XII、vB_Stm Diag XIII、vB_Stm Diag XIV、vB_Stm Diag XV、vB_Stm Diag XVI、vB_Stm Diag XVII、vB_Stm Diag XVIII、vB_Stm DiagXIX、vB_Stm DiagXX、vB_Stm Diag XXI、vB_Stm Diag 1、vB_Stm Diag2、vB_Stm Diag 3、vB_Stm Diag 4、vB_Stm Diag 5、vB_Stm Diag 6、vB_Stm Diag 7、vB_Stm Diag 8、vB_Stm Diag 9、vB_StmDiag 10、vB_StmDiag 11、vB_Stm Diag 12、vB_Stm Diag 13、vB_Stm Diag 14、vB_StmDiag15、vB_Stm Diag 16、vB_Stm Diag 17、vB_Stm Diag 18、vB_StmDiag 19、vB_Stm Diag 20、vB_Stm Diag 21、vB_Stm Diag 22、vB_StmDiag 23、vB_Stm Diag 24、vB_Stm Diag 25、vB_Stm Diag 26、vB_StmDiag 27、vB_Stm Diag 28、vB_Stm Diag 29、vB_Stm Diag 30、vB_StmDiag 31、vB_Stm Diag 32、vB_Stm Diag 33、vB_Stm Diag 34、vB_StmDiag 35、vB_StmDiag 36、vB_Stm Diag 37、vB_Stm Diag 38、vB_StmDiag 39、vB_Stm Diag 40、vB_StmDiag 41、vB_Stm Diag 42、vB_StmDiag 43、vB_Stm Diag 44、vB_Stm Diag 45、vB_StmDiag 46、vB_StmDiag 47、vB_Stm Diag 48、vB_Stm Diag 49、vB_Stm Diag 50、vB_StmDiag51、vB_Stm Diag 52、vB_Stm Diag 53、vB_Stm Diag 54、vB_StmDiag 55、vB_Stm Diag 56、vB_Stm Diag 57、vB_Stm Diag 58、vB_StmDiag 59、vB_Stm Diag 60、vB_Stm Diag 61、vB_Stm Diag 62、vB_StmDiag 63、vB_Stm Diag 64、vB_Stm Diag 65、vB_Stm.P.1、vB_Stm.P.2、vB_Stm.P.3、vB_Stm.P.4，对宋内志贺菌(Shigellasonnei)具有特异性的噬菌体具体地为vB_Shs.Pod 3、vB_Eschc.Shis 7/20、vB_Eschc.Shis 1161、vB_Eschc.Shis8963、vB_Eschc.Shis 8962、vB_Shis GE25、vB_Eschc.Shis W、vB_Shis G、vB_Shis 3/14、vB_Eschc.Shis 18、vB_Shis 1188、vB_Shis 1188Γ、vB_Shis 1188 Y、vB_Shis 1188 X、vB_Shis 5514、vB_Shis L7-2、vB_Shis L7-4、vB_Shis L7-5、vB_Shis L7-11、vB_Shis K3、vB_Shis TuI A、vB_Shis Ox2、vB_Shis SCL、vB_Shis Bak C2、vB_Shis 4/1188、vB_Shis8962、vB_Shis 8963、vB_Shis XIV、vB_Shis 116、vB_Shis 106/8、vB_Shis20、vB_Shis 90/25、vB_Shis 87/25、vB_Shis 16/25、vB_Shs 7、vB_Shs 38、vB_Shs 92、vB_Shs 1391、vB_Shs.P.1、vB_Shs.P.2、vB_Shs.P.3。
应当理解，在一些实施方案中，本发明涵盖了本文列出和本文所公开的任何细菌噬菌体以及其任何变体或杂合体作为递送媒介物递送至本公开的组分(具体地调节组分和/或选择性组分)的用途。
在一些实施方案中，细菌噬菌体或细菌噬菌体样转导颗粒是T7样病毒、T7样病毒或任何噬菌体样颗粒或其转导颗粒。在一些实施方案中，细菌噬菌体或细菌噬菌体样转导颗粒是T4样病毒、T4样病毒或任何噬菌体样颗粒或其转导颗粒。在又一些另外的实施方案中，用作递送媒介物的细菌噬菌体可以是埃希氏菌属病毒λ。然而，应当注意的是，在一些实施方案中，由至少一种细菌噬菌体和任选地两种或更多种不同细菌噬菌体的至少部分序列(天然或经修饰或突变的序列)组成的任何细菌噬菌体、细菌噬菌体颗粒或任何杂合细菌噬菌体或基于细菌噬菌体的制品可在本文中用作本发明系统的该至少一种药物代谢调节组分和/或本发明系统的该至少一种选择性组分的合适递送媒介物。
更进一步，应当理解，可使用任何递送媒介物，具体地基于噬菌体的递送媒介物及其任何变体。更具体地，本文的“递送媒介物变体”可在它们的核酸序列的含量和/或它们的蛋白质的氨基酸序列方面彼此不同。递送媒介物变体可包含至少一种宿主识别元件，其可以是同源的或异源的、杂合的、天然的、突变的或它们的任何组合。具体地，这些变体可携带与感兴趣的靶细胞相容的所需宿主识别元件。
如本文所示，适用于转导本公开的系统中如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分的递送媒介物与靶细胞相容，靶细胞例如特定微生物组微生物，更具体地肠道微生物组细菌细胞。因此应当理解，在使用基于噬菌体的递送媒介物的情况下，可使用任何天然的、变体的、杂合的、突变的或修饰的细菌噬菌体。这种细菌噬菌体可携带与宿主细胞相容的经修饰的、杂合的或天然的宿主识别元件。在一些实施方案中，宿主识别元件可包含与宿主受体相互作用的至少一种蛋白质、至少两种蛋白质、至少三种蛋白质或更多种蛋白质，具体地天然的或经修饰的结构细菌噬菌体蛋白质。在一些具体实施方案中，这种结构细菌噬菌体蛋白质可以是位于细菌噬菌体尾部区域中的蛋白质。如本领域已知的，在细菌噬菌体中，尾部是存在于大多数噬菌体中的蛋白复合物，并且参与宿主识别和基因组递送。尾部结构共有两个主要特征：尾部具有中心管状结构，形成DNA喷射的通道，通道被纤维或尖峰围绕，这些纤维或尖峰在宿主识别的初始步骤中至关重要。例如，T7噬菌体的尾部由gp11(衔接子)的十二聚体(即12个拷贝)和gp12(喷嘴)的六聚体(即6个拷贝)组装而成，gp17的六个三聚体附着在其上。T7的六尾纤维附着在衔接子和喷嘴之间的界面处，从而与两种蛋白质接触。衔接子环负责通过与由gp8的12个亚基组成的门的相互作用将预先形成的尾部附着于前头部。位于细菌噬菌体尾端的细菌噬菌体组分可被分类为“尾蛋白”或“尾管蛋白”(例如，指gp11和gp12)和尾纤维(例如，指gp17)。如上所述，基于细菌噬菌体的递送媒介物的宿主识别元件可包含来源于本公开所公开的任何细菌噬菌体的这些蛋白质中的至少一种蛋白质。
因此，位于细菌噬菌体尾端的细菌噬菌体组分可被分类为尾蛋白(例如，指gp11和gp12)和尾纤维(例如，指gp17)。在具体实施方案中，用于本公开的基于噬菌体的递送媒介物的宿主识别元件可包含至少一种尾纤维或至少一种尾蛋白。
在一些实施方案中，存在于此类细菌噬菌体的尾部区域中的该至少一种蛋白可以是尾蛋白和纤维蛋白中的至少一者。
在具体实施方案中，本文所述的宿主识别元件可包含gp11、gp12和gp17中的至少一者或它们的任何组合。在一些具体和非限制性实施方案中，这些蛋白可以是但不限于T7gp17、gp11或gp12、如本文所述的其任何突变体或如下文解释的任何天然或突变的异源变体，或它们的任何组合。
如本文所定义的位于感染靶细胞的任何天然存在的细菌噬菌体的尾部区域中的任何蛋白质，具体地，与所需靶细胞相容的任何宿主识别元件，以及它们的任何组合被本公开所涵盖。
应当理解，包含或用作本公开的调节性或选择性组分的递送媒介物可以是经修饰的细菌噬菌体，其在本文中也可称为“经修饰的颗粒”、“转导颗粒”、“经编程的转导颗粒”、“转导媒介物”、“本发明的媒介物”、“细菌噬菌体或噬菌体颗粒”、“递送媒介物”等。
应当理解，在一些实施方案中，在基于细菌噬菌体的转导颗粒(例如，细菌噬菌体或杂合噬菌体或经修饰的噬菌体)情况下，此类组分还可包含至少一种包装信号和促进包装在递送媒介物中的任何其他合适的元件。如上所述，本发明提供的核酸序列包含包装信号。如本文所定义的术语“包装信号”是指例如病毒或细菌噬菌体基因组中的核苷酸序列，其在感染周期期间指导病毒或细菌噬菌体基因组包装到预先形成的衣壳(包膜)中。
在一些实施方案中，本公开的系统靶向微生物组细胞群体中的微生物组生物体。例如，细菌细胞存在于微生物组内。
在一些实施方案中，由所公开的系统靶向的细胞可以是细菌细胞和/或细胞群体。根据一些实施方案，靶细菌细胞被本公开的系统修饰和靶向，并且是肠道微生物组细胞群体或包含在肠道微生物组细胞群体内。还应当注意的是，该细胞群体包含变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门(Actinobacteria)和门中的至少一者的至少一种细菌，或分离物的任何突变体、变体或它们的任何组合。
在一些具体的和非限制性的实施方案中，通过本文所公开的系统修饰的靶细菌或细菌群体是γ变形菌(Gammaproteobacteria)纲的任何细菌。在又一些另外的实施方案中，通过本文所公开的系统修饰的靶细菌或细菌群体是肠杆菌目的任何细菌。在又一些另外的实施方案中，通过本文所公开的系统修饰的靶细菌或细菌群体是肠杆菌科的任何细菌。
应当注意的是，肠杆菌科是革兰氏阴性菌的大家族，其包括超过30个属和超过100个种。肠杆菌科除了许多无害的共生菌外，还包括许多更常见的病原体，诸如沙门氏菌属、大肠杆菌、克雷伯氏菌属和志贺氏菌属。
根据本公开的原核细胞涵盖细菌细胞。本上下文中的术语“细菌”(单数“细菌”)是指任何类型的单细胞微生物。本文中的术语“细菌”和“微生物”可互换。该术语在本文中包括根据其基本形状属于一般类别的细菌，即球形(球菌)、杆状(杆菌)、螺旋状(螺旋菌)、逗点状(弧菌)或螺旋形(螺旋体)，以及作为单细胞、成对、成链或成簇存在的细菌。
应当注意的是，如本文所用的术语“细菌”是指以单细胞或以单细胞簇或聚集体形式存在的任何原核微生物。在更具体的实施方案中，术语“细菌”具体地指革兰氏阳性、革兰氏阴性或抗酸生物体。革兰氏阳性菌可被识别为保留了在细菌分化的革兰氏染色法中使用的结晶紫染色，因此在显微镜下呈现紫色。革兰氏阴性菌不保留结晶紫，使得阳性鉴定成为可能。换句话讲，术语“细菌”在本文中应用于在细胞膜外的细胞壁中具有较厚肽聚糖层的细菌(革兰氏阳性)，以及其细胞壁中具有夹在胞质内膜和细菌外膜之间的簿肽聚糖层的细菌(革兰氏阴性)。该术语还适用于一些细菌，诸如异常球菌属(Deinococcus)，由于存在厚的肽聚糖层而染色为革兰氏阳性，但也具有细胞外膜，因此被建议作为单层(革兰氏阳性)和双层(革兰氏阴性)细菌之间过渡的中间体。抗酸生物体诸如分枝杆菌(Mycobacterium)在它们的细胞壁中含有大量称为分枝菌酸的脂类物质，其抵抗常规方法诸如革兰氏染色法的染色。还应当理解，本公开还涵盖任何微生物的“细胞”，具体地，存在于微生物组或受试者中的单细胞微生物。因此，该术语指大部分厌氧的革兰氏阳性菌株和革兰氏阴性菌株，以及真菌、原生动物和古细菌的任何菌株。应当理解，本公开的调节组分和/或选择性组分适用于调节微生物组(具体地，肠道微生物组)中任何生物体的药物代谢。
然而，应当理解，当提及“细胞”时，除了本发明举例说明和公开的任何原核细胞之外，在一些具体实施方案中，本发明还包括模拟或模仿细胞、人工细胞、囊泡等的其他系统。
在一些具体实施方案中，本发明的方法可用于操纵、编辑和改变有需要的受试者的微生物组。更具体地，如本文所述，调节微生物组以调节药物的代谢。
如本文所用的术语“微生物组”是指样本中共生体、共生或病原微生物的生态群落。可用于本公开的微生物组的示例包括但不限于肠道微生物组和口腔微生物组、胃肠道微生物组、皮肤微生物组、脐带微生物组、阴道微生物组、结膜微生物组、肠微生物组、胃微生物组、鼻微生物组和泌尿生殖道微生物组。
在一些实施方案中，本公开的系统、组合物、试剂盒和方法可适用于操纵受试者(例如，哺乳动物受试者，具体地，人类受试者)中的肠道微生物组。术语“肠道微生物组”(口语中的“肠道菌群”)包括生活在动物(在本例中为哺乳动物)消化道中的复杂微生物物种群落。在本上下文中，肠道与具有微生物群和微生物区系的肠和菌群同义。肠道微生物组是指肠道微生物群的基因组。尽管哺乳动物宿主很可能在没有肠道菌群的情况下生存，但两者之间的关系不仅仅是共生的(无害的共存)，而是互利的。哺乳动物肠道微生物区系履行多种有用的功能，包括消化未利用的能量底物、刺激细胞生长、阻遏有害微生物的生长、训练免疫系统仅对病原体做出反应以及防御某些疾病。然而，在某些条件下，一些物种能够通过产生感染或增加癌症风险而导致疾病。因此，通过靶向肠道微生物组的特定亚群，本发明提供了用于调节由作为肠道微生物组的一部分的某些微生物引起的病症的治疗性定制工具。在一些实施方案中，此类病症具体是与肠道微生物组的微生物对药物的代谢相关的病症。
哺乳动物肠道微生物组的组成主要由细菌(大部分是厌氧的革兰氏阳性菌株和革兰氏阴性菌株)，以及真菌、原生动物(包括单细胞微观动物的一个门或一组门，包括变形虫、鞭毛虫、纤毛虫、孢子虫和许多其他形式，属于原生生物界)和古细菌(构成缺少细胞核的单细胞生物的域，因此是原核生物)中的任一者组成。古细菌最初被分类为细菌，命名为古细菌(古细菌界)。古细菌细胞具有将它们与其他两个域(细菌和真核生物)区分开的独特性质。古细菌被进一步分为多个公认的门。应当理解，本公开的调节组分和/或选择性组分适用于调节微生物组(具体地，肠道微生物组)中任何生物体的药物代谢。因此，在一些实施方案中，本公开的系统、组合物、试剂盒和方法以影响和调节给定药物的代谢的方式靶向微生物组的任何微生物，例如肠道微生物组的任何微生物。具体地，本公开所公开的任何药物。本文适用的非限制性药物是表1所公开的任何药物。细菌物种的群体在不同个体之间差异很大，但在个体内随时间相对恒定，然而，随着生活方式、饮食和年龄的变化，可能发生一些改变。在人类个体的生活期间，已经观察到肠道微生物组的组成中常见的进化模式。肠道微生物组的组成和含量可在长期饮食后改变，并且这也取决于地理来源。
更具体地，当提及人微生物组或微生物群的组成或含量时，意指关于细菌的四个主要门，即厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门的组成，或者另选地关于主要细菌属，即拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属、梭杆菌属(Fusobacterium)、真细菌属(Eubacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的组成。具体地，最主要的拟杆菌属可能对宿主功能很重要。其他属诸如埃希氏菌属(Escherichia)和乳杆菌属(Lactobacillus)，尽管存在程度较低，但已被证明有助于宿主功能。
此外，与人肠道微生物组特别相关的是基于细菌生态系统的肠型分类，该分类与年龄、性别、体重或国家划分无关。存在三种人肠型：1型的特征在于高水平的拟杆菌(革兰氏阴性)；2型具有很少的拟杆菌属，但普雷沃氏菌属(Prevotella)(革兰氏阴性)很常见；并且3型具有高水平的瘤胃球菌属(革兰氏阳性)。然而，肠型会受到长期饮食的影响，例如，高蛋白和高脂肪饮食的人主要是肠型1型，并且如果将他们的饮食模式改变为高碳水化合物饮食-从长期来看会变成肠型2型。
因此，本公开的方法以及系统、组合物和试剂盒涉及构成哺乳动物肠道微生物组的整个细菌物种范围，包括其定性和定量方面。它们还涉及较不普遍存在的微生物组组分，诸如真菌的微生物组组分，已知的属包括念珠菌属(Candida)、酵母菌属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)，以及属于古细菌域(也称为古细菌界)的微生物，并且还涉及无法培养的未分类物种。
然而应当理解，尽管在一些实施方案中特别适用于人类受试者，但是本发明还涉及动物健康(特别是哺乳动物健康状况)，如兽医科学所涵盖的，并且因此提供调节任何微生物组群体(具体地，肠道微生物组生物体)的手段以调节施用于如本公开所公开的任何相关受试者的药物的代谢。
更进一步，在一些实施方案中，本发明的系统被设计用于通过调节至少一种药物代谢调节组分的细菌细胞和/或细菌细胞群体的靶向修饰来调节药物代谢。影响药物的活性、生物利用度、清除率、稳定性、毒性和吸收中的至少一者的组分。
在一些实施方案中，本文所公开的系统被具体地设计成调节直接或间接影响药物代谢的组分。如上文所示，该至少一种组分的修饰可影响药物的活性、生物利用度、清除率、稳定性、毒性和吸收中的至少一者。
在一些特定且非限制性的实施方案中，该调节可以是提供调节剂(例如，阻遇物或增强物)，该调节剂可阻遇代谢或者另选地增强代谢，从而通过靶酶活化或灭活药物。
在一些实施方案中，此类酶是参与细菌能量代谢的至少一种酶。在又一些另外的实施方案中，该酶可具体地为参与碳水化合物代谢的酶。
在又一些另外的实施方案中，参与该至少一种药物代谢的元件是至少一种葡糖苷酸酶。因此，根据这些实施方案，本文提供的系统的药物代谢调节组分靶向并调节参与至少一种药物代谢的至少一种元件。由本发明的调节组分调节的这种元件可以是至少一种葡糖苷酸酶。
葡糖苷酸酶通过哺乳动物尿苷二磷酸-葡糖醛酸基转移酶(UGT)产生，这些酶在称为葡糖醛酸化的过程中将葡糖醛酸附加到糖苷配基的羟基、羧酸酯和其他亲核官能团上。糖基水解酶是一类广泛存在的水解碳水化合物或其衍生物中糖苷键的酶。β-葡糖醛酸糖苷酶是从多种化合物中水解β-葡糖醛酸残基的糖基水解酶。
在更具体的实施方案中，本文所公开的系统的药物代谢调节组分可靶向并因此调节至少一种葡糖苷酸酶，该至少一种葡糖苷酸酶可以是至少一种β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)。
由GI微生物群表达的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)催化葡糖醛酸和葡糖苷酸之间的糖苷键的水解。葡糖醛酸然后进入Entner-Doudoroff途径，这是糖酵解的一种细菌替代途径，该途径分解糖酸并将产生的丙酮酸分流到TCA循环中。作为葡糖苷酸水解的副产物，细菌会再生被宿主消除的原始分子，促进肠道上皮的再摄取和血流中的再循环。
编码β-葡糖醛酸糖苷酶的基因gusA(以前称为uidA)最初从大肠杆菌中分离，现在广泛用作植物和其他生物体中的报道基因。在大肠杆菌gusA中形成GUS操纵子的一部分。gusA下游有两个基因，其中之一gusB编码葡糖苷酸特异性透性酶；第三个基因gusC作为非特异性外膜通道起作用。在gusA的上游且单独转录的是编码gus操纵子的特异性阻遏物的基因gusR。大肠杆菌GUS长603个氨基酸残基，与具有相同底物特异性的人GUS共有约50％的序列同一性。
更进一步，在一些实施方案中，如本文所用的GusA由SEQ ID NO：14所示的核酸序列编码。在又一些另外的实施方案中，GusA蛋白包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。更进一步，在一些实施方案中，如本文所用的GusB由SEQ ID NO：16所示的核酸序列编码。在又一些另外的实施方案中，GusB蛋白包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。更进一步，在一些实施方案中，如本文所用的GusC由SEQ ID NO：18所示的核酸序列编码。在又一些另外的实施方案中，GusC蛋白包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。Gus操纵子(GusR操纵子)的非编码调控区由SEQ ID NO：20表示。
大肠杆菌β-葡糖醛酸糖苷酶结构的非对称单元含有597个有序残基的两个单体，并且晶体学对称性产生功能相关的酶四聚体。N-末端的180个残基类似家族2糖基水解酶的糖结合结构域，而C-末端结构域(残基274至603)形成αβ桶并含有活性位点残基Glu413和Glu504。N-末端结构域和C-末端结构域之间的区域显示与其他家族糖基水解酶一致的免疫球蛋白样β-夹心结构域。
更进一步，在此类实施方案中，本文提供的系统的合适的调节组分可包含编码至少一种元件的核酸序列，该至少一种元件抑制和/或降低至少一种βGUS酶的表达和/或活性和/或稳定性。
在所公开系统的一些实施方案中，由调节组分的核酸序列编码的元件阻遏至少一种βGUS酶的转录。在又一些另外的实施方案中，该元件是Gus阻遇物(GusR)及其任何变体和突变体。
在又一些具体的实施方案中，如本文所用的GusR是细菌GusR。
最近确定的大肠杆菌和肠道沙门氏菌(S.enterica)(肠杆菌科的成员)GusR蛋白的晶体结构定义了TetR样配体调节的转录阻遏物。它是α-螺旋同源二聚体，其中每个单体由DNA结合结构域(α1结合结构域至α3结合结构域)和配体结合结构域(α4结合结构域至α10结合结构域-54至193)组成(在大肠杆菌中分别为残基11至193和54至193，参见如SEQ IDNO：3所示的GusR序列中的残基)。
大肠杆菌GusR DNA结合结构域(DBD)表现出与两个操纵子元件位点1和2结合的螺旋-转角-螺旋(HTH)DNA结合基序。位点1长度为30个碱基对(bp)，并且位于GUS操纵子的核糖体结合位点(rbs)上游200bp处，而位点2(40bp)距同一rbs仅50bp。GusR与DBD的结合取决于DBD的HTH基序中保守的TetR家族残基(Y49)和特定氨基酸序列(SCAI)。
大肠杆菌和肠道沙门氏菌蛋白的结构中的GusR配体结合结构域由α-螺旋(4至10)组成。配体口袋结构域使用与保守残基的氢键来识别结合配体的GlcA部分。似乎GusR表现出对特定配体的物种特异性偏好。对特定配体的亲和力可通过GusR效应物结合口袋内的单个残基变化来调节。
GusR的活性位点邻近环1(L1)和环2(L2)在长度和氨基酸组成方面表现出显著的可变性，并且这些区域用于对GusR蛋白进行分类，每一类别含有功能和细胞特化的GusR。重要的是，肠杆菌科仅编码L1 GUS酶。
在又一些另外的实施方案中，本文所公开的GusR是肠杆菌GusR。在更具体的实施方案中，本文提及的GusR是菌株BW25113的大肠杆菌GusR(DSMZ#27469)。
在一些实施方案中，如本文所用的GusR由包含SEQ ID NO：2所示的核酸序列或其任何变体或同源物的核酸序列编码。更进一步，在一些实施方案中，GusR可包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，或其任何变体或衍生物。
在所公开系统的又一些另外的实施方案中，在所公开系统的调节组分中使用的GusR表现出对至少一种GUS配体和/或底物的降低的或消除的亲和力。更具体地，表现出对任何Gus底物的降低或消除的亲和力并因此表现出增强的Gus阻遏从而调节Gus药物代谢的GusR突变体或变体可涉及与野生型GusR相比表现出约1％、2％、3％、4％、5％至约100％，具体地约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约35％至约40％、约40％至约45％、约45％至约50％、约50％至约55％、约55％至约60％、约65％至约70％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、约95％至约99.9％的降低的亲和力，更具体地约98％至约100％的降低的亲和力的GusR变体。更具体地，与野生型GusR相比，酶表现出约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、99.9999％或约100％的降低的亲和力。
更进一步，在一些实施方案中，在所公开的系统的调节组分中使用的GusR在形成GusR的配体结合口袋的残基中包含至少一个取代和/或其他修饰。这种变体的特征在于对至少一种GUS配体和/或底物表现出降低的或消除的亲和力。在又一些另外的实施方案中，可操纵形成和/或直接或间接参与配体结合的任何残基(例如，GusR的配体结合口袋)，以获得对可被本公开的系统的调节性组分使用的至少一种GUS配体和/或底物表现出降低的或消除的亲和力的GusR。更进一步，具体地在大肠杆菌中，结合的葡糖苷酸的糖部分与总共五个GusR残基(H126、K125、R69、E97和R73)进行六次接触。大肠杆菌GusR中另外的保守残基包括但不限于Y164、L160、T163和M87。因此，在一些具体的实施方案中，对至少一种GUS配体和/或底物表现出降低或消除的亲和力的GusR变体和/或突变体可以是具有如SEQ ID NO：3所示的GusR氨基酸序列的残基H126、K125、R69、E97和R73、Y164、L160、T163和M87中的至少一个残基的至少一个取代和/或置换的任何GusR变体，或其任何衍生物和变体，或它们的任何组合。
在所公开系统的一些具体实施方案中，包含在调节性组分内并由调节性组分提供的GusR在以下残基的至少一个残基中携带至少一个突变和/或取代。在一些实施方案中，野生型GusR(如SEQ ID NO：3所示)或其任何衍生物和变体的位置125中的赖氨酸(K)残基中的突变。在又一些另外的实施方案中，残基125中的突变将赖氨酸(K)残基125取代为丙氨酸(A)。此类突变的GusR在本文中被称为K125A GusR。更进一步，在一些实施方案中，K125AGusR可由包含SEQ ID NO：8所示的核酸序列或其任何衍生物和变体的核酸序列编码。在又一些另外的实施方案中，K125AGusR可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，或其任何衍生物和变体。
在一些实施方案中，如SEQ ID NO：3所示的野生型GusR的位置164中的酪氨酸(Y)残基中的突变，或其任何衍生物和变体。在又一些另外的实施方案中，残基164中的突变将酪氨酸(Y)残基164取代为苯丙氨酸(F)。此类突变的GusR在本文中被称为Y164F GusR。更进一步，在一些实施方案中，Y164F GusR可由包含SEQ ID NO：10所示的核酸序列或其任何衍生物和变体的核酸序列编码。在又一些另外的实施方案中，Y164FGusR可包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，或其任何衍生物和变体。
在一些实施方案中，如SEQ ID NO：3所示的野生型GusR的位置73中的精氨酸(R)残基中的突变。在又一些另外的实施方案中，残基73中的突变将精氨酸(R)残基73取代为丙氨酸(A)。此类突变的GusR在本文中被称为R73A GusR。更进一步，在一些实施方案中，R73AGusR可由包含SEQ ID NO：12所示的核酸序列的核酸序列编码。在又一些另外的实施方案中，R73A GusR可包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
应当理解，在一些实施方案中，所公开系统的调节性组分可包含所公开GusR突变体的任何组合，例如，K125A GusR和R73A、K125A GusR和Y164F GusR、R73A GusR和Y164FGusR，以及K125A GusR、Y164FGusR和R73A GusR。
在又一些另外的实施方案中，由本文所公开的系统调节的该至少一种药物是抗肿瘤剂、抗病毒剂、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、镇痛剂、抗高血压剂、抗疟剂、神经阻滞剂、降胆固醇剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、胆汁酸、抗凝血剂、铁螯合剂、抗菌剂、造血生长因子、抗震颤麻痹剂、激素、中枢神经系统抑制剂、抗胆碱能剂、副交感神经阻断剂、免疫抑制剂、阿片类解毒剂、抗哮喘剂、抗良性前列腺增生剂或抗痛风剂中的任一者。
在又一些另外的实施方案中，该药物可以是至少一种抗肿瘤剂。
如本文所用的术语“抗增殖治疗”或“抗肿瘤药物”是指旨在消除或破坏(杀死)癌细胞或任何其他增殖性病患的细胞的任何治疗。在一些实施方案中，这包括“化疗药物或药剂”(化疗)。
更具体地，“化疗药物或药剂”是用于治疗癌症和一些增殖性疾病的药物。使用这些药物的治疗旨在通过杀死细胞或阻止细胞分裂来阻止癌细胞或其他增殖细胞(恶性肿瘤和增殖性疾病)的生长。化疗可通过口服、注射或输注给予，或在皮肤上给予，具体取决于所治疗的癌症的类型和阶段。化疗可单独给予或与其他治疗诸如手术、放射疗法或生物疗法一起给予。一些化疗药物活性的潜在机制是基于破坏快速分裂的细胞，因为许多癌细胞比正常细胞生长和繁殖更快。由于它们的活性模式，化疗剂还损害在正常情况下快速分裂的细胞，例如骨髓细胞、消化道细胞和毛囊。损害或破坏正常细胞会导致化疗的常见副作用：骨髓抑制(血细胞生成减少，因此也会抑制免疫)、粘膜炎(消化道内层炎症)和秃头(脱发)。
某些化疗剂也已用于治疗癌症以外的病症，因此被认为具有“抗增殖”作用，包括强直性脊柱炎、多发性硬化症、血管瘤、克罗恩氏病、牛皮癣、牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎、狼疮和硬皮病。
化疗药物影响细胞分裂或DNA合成和功能，通常可根据其结构或生物功能分类。一些化疗剂被分类为烷化剂、抗代谢药、蒽环霉素、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂，以及其他抗肿瘤剂，诸如DNA烷化剂、抗肿瘤抗生素剂、微管蛋白稳定剂、微管蛋白去稳定剂、激素拮抗剂、蛋白激酶抑制剂、HMG-CoA抑制剂、CDK抑制剂、细胞周期蛋白抑制剂、半胱天冬酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、反义核酸、三螺旋DNA、核酸适体以及分子修饰的病毒、细菌或外毒素剂。
在一些任选的实施方案中，靶药物可以是至少一种拓扑异构酶抑制剂。在又一些另外的实施方案中，靶药物可以是至少一种拓扑异构酶I抑制剂(TopI)。
如本文所用的拓扑异构酶抑制剂是指阻断拓扑异构酶的作用的化合物。DNA拓扑异构酶(或者说拓扑异构酶)是催化DNA拓扑状态变化的酶，可将松弛和超螺旋形式、连接(链状)和非连接种类以及打结和未打结DNA相互转换。拓扑异构酶抑制剂可分为两大亚型：I型拓扑异构酶(TopI)和II型拓扑异构酶(TopII)。拓扑异构酶在细胞复制和DNA组织中起重要作用，因为它们介导单链和双链DNA的切割以在真核细胞中松弛超螺旋、解开连环蛋白并浓缩染色体。拓扑异构酶抑制剂影响这些重要的细胞过程。一些拓扑异构酶抑制剂防止拓扑异构酶进行DNA链断裂，而被视为拓扑异构酶毒物的其他拓扑异构酶抑制剂与拓扑异构酶-DNA复合物结合并且阻止拓扑异构酶机制的再连接步骤。这些拓扑异构酶-DNA-抑制剂复合物是细胞毒性剂，因为它们引起的未修复的单链和双链DNA断裂可导致细胞凋亡和细胞死亡。因此，拓扑异构酶抑制剂用于治疗感染性疾病和癌症病患。
如本文所示，在一些实施方案中，靶药物可以是TopI的抑制剂。如本文所用的TopI是在复制和转录期间松弛DNA超螺旋的蛋白质。在正常情况下，TopI攻击DNA的主链，形成短暂的TopI-DNA中间体，使切割的链围绕螺旋轴旋转。然后TopI再连接切割的链以重建双链体DNA。用TopI抑制剂治疗可稳定中间可裂解复合物，防止DNA再连接，并诱导致命的DNA链断裂。喜树碱衍生的TopI抑制剂来自喜树(Camptotheca acuminata)并且通过与TopI-DNA形成三元复合物而发挥作用，并且由于它们的平面结构而能够在切割位点两侧的碱基对之间堆积。因此，在一些实施方案中，由所公开的系统靶向的药物可以是任何喜树碱衍生的TopI抑制剂，例如，喜树碱-11(CPT-11，伊立替康)。
如本实施例所示，应将其视为本文所公开的非限制性实施方案作为概念证明，本发明的系统被设计成调节药物喜树碱-11(CPT-11，伊立替康)或其任何衍生物的代谢。
更进一步，在一些实施方案中，非喜树碱诸如茚并异喹啉和吲哚并咔唑也可被所公开系统靶向。这些药物与TopI本身结合，与通常赋予喜树碱抗性的残基形成氢键。适用于本公开的非CPT抑制剂可以是茚并异喹啉、菲啶和吲哚并咔唑中的任一者。
然而，应当注意的是，本发明的特定系统可适于调节作为任何βGUS酶的底物的任何药物的代谢。由肝酶(例如，进行葡糖醛酸化的酶，例如，UGT酶)灭活的药物的特定和非限制性实施方案。微生物组微生物(例如，细菌)对这些药物的再活化可能会导致不期望的作用。因此，在一些实施方案中，例如表1公开了可能被微生物组Gus酶代谢的药物，具体地阿巴卡韦、阿西美辛、对乙酰氨基酚、安贝生坦、双氢青蒿素、阿塞那平、阿托伐他汀、阿昔替尼、比克替拉韦、丁丙诺啡、卡格列净、坎地沙坦、坎地沙坦西酯、卡马西平、鹅去氧胆酸、氯氮平、可待因、赛庚啶、达比加群酯、达格列净、去铁酮、德拉沙星、双氯芬酸、二氟苯水杨酸、多替拉韦钠、艾曲波帕、恩西地平、恩他卡朋、表柔比星、埃罗替尼、埃格列净、雌二醇、雌二醇乙酸酯、苯甲酸雌二醇、环戊丙酸雌二醇、二庚酸雌二醇、戊酸雌二醇、依托度酸、依托泊苷、依泽替米贝、依佐加滨、氟硝西泮、氟比洛芬、氟伐他汀、格卡瑞韦、氟哌啶醇、氢吗啡酮、布洛芬、咪达那新、茚达特罗、吲哚美辛、厄贝沙坦、伊立替康、艾沙康唑、酚派丙酮、拉莫三嗪、莱特莫韦、利克飞龙、劳拉西泮、氯沙坦、洛伐他汀、罗美昔布、咪达唑仑、米格列奈、吗啡；硫酸吗啡、莫格他唑、麦考酚酸莫酯、麦考酚酸、纳地美定、纳美芬、纳曲酮、萘普生、那格列奈、氯羟氧二氮卓、帕立骨化醇、哌仑他韦、匹伐他汀、丙泊酚、雷特格韦、瑞戈非尼、利福平、卢卡帕尼、塞曲司特、西洛多辛、辛伐他汀、索拉非尼、磺胺甲噁唑、舒洛芬、他莫昔芬、他喷他多、丙酸睾酮、托匹司他、三氟拉嗪、曲格列酮、伐地美生、伐地考昔、丙戊酸、扎托布洛芬、齐多夫定或齐留通。在一些实施方案中，任何所公开的药物可被本公开的系统的调节组分靶向。
在一些实施方案中，本公开的系统适用于调节至少一种拓扑异构酶I抑制剂的代谢。在又一些另外的实施方案中，本公开涵盖适用于调节任何拓扑异构酶I抑制剂的调节性组分，例如，CPT-11，在本文中也表示为(4S)-4，11-二乙基-3，4，12，14-四氢-4-羟基-3，14-二氧代-1H-吡喃并[3′，4′：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-9-基[1，4′-联哌啶]-1′-羧酸酯盐酸盐。CPT-11或伊立替康以Camptosar等商品名销售，是一种用于治疗结肠癌和小细胞肺癌的药物。对于结肠癌，它单独使用或与氟尿嘧啶一起使用。对于小细胞肺癌，它与顺铂一起使用。它通过缓慢注射到静脉中来给予。其IUPAC名称为S)-4，11-二乙基-3，4，12，14-四氢-4-羟基-3，14-二氧代-1H-吡喃并[3′，4′：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-9-基[1，4′-联哌啶]-1′-羧酸酯，其唯一成分标识符(UNII)为7673326042(CAS号97682-44-5)。伊立替康进一步由式I公开：
更进一步，在一些实施方案中，本文所公开的系统的药物代谢调节组分抑制或降低所述CPT-11的非活性代谢物即SN38葡糖苷酸(SN38G)通过细菌GUS再活化和/或转化为CPT-11的活性代谢物即SN38。
在又一些另外的实施方案中，本文提供的系统可包含编码修饰靶药物的酶的任何核酸序列作为药物代谢调节组分。例如，活化或者另选地灭活靶药物或以其他方式调节至少一种药物的活性、生物利用度、清除率、稳定性、毒性和吸收的任何酶。
在一些非限制性实施方案中，该系统可通过采用前药方法来改善药物的药代动力学。该方法可用于将肠道中的前药转化为活性母体药物，从而克服ADME(吸收、分布、代谢和排泄)挑战，例如口服吸收低、稳定性差、位点特异性不足等。在该系统中，系统的药物代谢调节组分促进前药的活化，从而以及时和位点特异性的方式释放游离母体药物，以增加药物的有用性。通过向靶向的靶细胞(例如，靶向的细菌，其在一些实施方案中存在于微生物组中并且是微生物组群体的一部分)引入核酸序列来实现调节，该核酸序列编码至少一种酶，该至少一种酶催化此类前药转化为药物，或者转化为活性或改善的或有效的代谢物。这种酶可由细菌产生并分泌到肠道内腔中。在肠道中，引入的酶可识别前药上存在的特异性接头，将其消化并释放活性药物。
本公开的系统和方法的组分包含编码调节组分或选择性组分或者另选地作为调节组分或选择性组分的核酸序列。术语“多核苷酸”或“核酸序列”或“核酸分子”在本文中是指核酸的聚合物，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。如本文所用，“核酸”(或也称核酸分子或核苷酸)是指任何DNA或RNA多核苷酸、寡核苷酸、通过聚合酶链反应(PCR)产生的片段和通过连接、切断、内切核酸酶作用和外切核酸酶作用中的任一者产生的片段，无论是单链还是双链。核酸分子可由为天然存在的核苷酸(诸如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的α-对映体形式)或经修饰的核苷酸或它们的任何组合的单体组成。本文中，该术语还涵盖cDNA，即通过逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)的作用从RNA模板产生的互补或拷贝DNA。
如上文所示，在某些实施方案中，本发明的药物代谢调节组分可包含至少一个CRISPR间隔区，该至少一个CRISPR间隔区靶向包含在选择性组分内的至少一种核酸序列(在一些实施方案中，其可以是包含原间隔区或裂解性细菌噬菌体的必需基因的细菌噬菌体编码毒素)。在又一些另外的实施方案中，CRISPR阵列还可用作调节组分。例如，除了包含靶向选择性组分中的原间隔区的间隔区之外，CRISPR阵列还可包含靶向包含在所述至少一个基因内的核酸序列的至少一个CRISPR间隔区，所述至少一个基因编码参与药物代谢的蛋白(例如，GusA蛋白)。以这种方式，本发明的药物代谢调节组分可靶向和/或灭活选择性组分(例如，裂解性噬菌体，或抑制或降低细胞活力和/或功能的其他递送媒介物或包含毒性元件的遗传元件)和参与感兴趣的药物的代谢的元件。在又一些另选的实施方案中，调节组分可包含：适于一种类型的Cas核酸酶的至少一个间隔区，该Cas核酸酶靶向包含在选择性组分内的至少一个原间隔区；和适于另一种类型的Cas蛋白质的至少一个其他间隔区，该Cas蛋白质表现出降低或消除的核酸酶活性，与在一些实施方案中可募集转录激活物的其他活性结构域融合，该转录激活物导致参与药物代谢的元件的转录增加，或与修饰靶核酸序列从而调节参与药物代谢的元件的任何其他核酸修饰部分融合。此类修饰部分可以是甲基转移酶、甲基化DNA结合因子、转录因子、转录阻遏物、染色质重塑因子、聚合酶、脱甲基酶、乙酰基转移酶、脱乙酰酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶、解旋酶和它们的任何组合中的任一者。
所公开的系统、组合物、试剂盒和方法的调节性组分利用CRISPR-Cas系统。如本文所用，CRISPR阵列也称为SPIDR(间隔穿插直接重复)，构成了通常对特定细菌物种具有特异性的DNA基因座家族。CRISPR阵列是一类独特的短散在重复序列(SSR)，首次在大肠杆菌中被识别。在随后的几年中，在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)以及其他细菌和古细菌中发现了类似的CRISPR阵列。应当理解，本发明设想使用任何已知的CRISPR系统，特别是本文所公开的CRISPR系统。
如本文所用，短语“CRISPR阵列多核苷酸”是指包含足够的CRISPR重复序列使得其能够下调(例如消除、靶向)互补基因的DNA或RNA片段。
根据一个实施方案，包含在本公开的系统的调节组分内的CRISPR阵列多核苷酸包含至少2个重复序列，它们之间具有1个间隔区。在又一些另外的实施方案中，本发明的药物代谢调节组分的CRISPR阵列可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多，具体地，110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个间隔区。还应当理解，本发明的药物代谢调节组分的间隔区可以是相同或不同的间隔区。在更多的实施方案中，这些间隔区可靶向相同或不同的靶原间隔区和/或编码参与特定药物代谢的蛋白质的基因。在又一些其他的实施方案中，这种间隔区可靶向至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个不期望的基因。
在示例性实施方案中，CRISPR阵列多核苷酸包含所有CRISPR重复序列，其起始于第一个CRISPR重复序列的第一个核苷酸，并且终止于最后一个(末端)重复序列的最后一个核苷酸。
如本文所用，术语“间隔区”是指在CRISPR阵列的多个短直接重复序列(即CRISPR重复序列)之间发现的非重复间隔区序列。在一些实施方案中，CRISPR间隔区位于两个相同的CRISPR重复序列之间。
在一些实施方案中，CRISPR间隔区天然存在于回文的两个相同的短直接重复序列之间。应当注意的是，本发明的间隔区可位于或存在于两个相同或不同的重复序列之间，并且此外，这些间隔区编码靶向致病或不期望的细菌基因内的原间隔区和/或选择性组分内的原间隔区的crRNA。
如本文所用，术语“cas基因”是指通常与编码Cas蛋白质的侧翼CRISPR阵列偶联、相关联或接近或在其附近的基因。
CRISPR阵列通常存在于命名为cas1至cas4的四个基因附近。这些基因的最常见排列是cas3-cas4-cas l-cas2。Cas3蛋白质似乎是解旋酶，而Cas4类似于核酸外切酶的RecB家族，并含有富含半胱氨酸的基序，提示DNA结合。cas1基因(NCBI COG数据库代码：COG1518)是特别值得注意的，因为它用作CRISPR系统的通用标记(连接到除Pyrococcusabyssii之外的所有CRISPR系统)。cas2仍有待表征。casl-4的典型特征在于它们与CRISPR基因座紧密接近，并且它们在细菌和古细菌物种中广泛分布。尽管不是所有casl-4基因都与所有CRISPR基因座相关联，但它们都存在于多种亚型中。
更进一步，描述了三种主要类型的CRISPR-Cas系统：I型、II型和III型。应当理解，封装在本发明的经修饰的细菌噬菌体内的目的核酸可包含衍生自任何类型的CRISPR-Cas系统的CRISPR系统(例如，编码cas蛋白质和间隔区的基因)。
更具体地，I型CRISPR-Cas系统除了含有编码可能形成具有不同组成的级联样复合物的蛋白质的基因之外，还含有编码具有分开的解旋酶和DNA酶活性的大蛋白质的cas3基因。这些复合物含有许多已经包含在重复序列相关联神秘蛋白质(RAMP)中的蛋白质，这些蛋白质形成Cas蛋白质的大超家族，并且含有至少一个RNA识别基序(RRM；也称为铁氧还蛋白-折叠结构域)和特征性富含甘氨酸的环。基于广泛的序列和结构比较，RAMP超家族包括大的Cas5和Cas6家族。此外，Cas7(COG1857)蛋白质代表RAMP超家族中的另一个独特的大家族。
I型CRISPR-Cas系统似乎靶向DNA，其中靶切割由Cas3的HD核酸酶结构域催化。由于Cas4的RecB核酸酶结构域在几个I型CRISPR-Cas系统中与Cas1融合，因此Cas4反而可潜在地在间隔区获取中发挥作用。应当注意的是，任何I型CRISPR-Cas系统均可用于本发明，具体地，I-A、B、C、D、E和F型中的任一种。
II型CRISPR-Cas系统包括“HNH”型系统(链球菌样；也称为Nmeni亚型，用于脑膜炎奈瑟氏菌血清群A str.Z2491，或CASS4)，其中除了普遍存在的Cas1和Cas2之外，Cas9，一种单一的非常大的蛋白质，似乎足以产生crRNA并切割靶DNA。Cas9含有至少两个核酸酶结构域，即靠近氨基末端的RuvC样核酸酶结构域和在蛋白质中间的HNH(或McrA样)核酸酶结构域，但这些结构域的功能仍待阐明。然而，由于HNH核酸酶结构域在限制性酶中是丰富的并且具有内切核酸酶活性，因此它可能负责靶切割。
II型系统通过不寻常的机制切割前crRNA，该机制涉及tracrRNA和前crRNA中部分重复序列之间的双链形成；前crRNA加工途径中的第一次切割随后发生在该重复序列区域中。这种切割在存在Cas9的情况下由管家双链RNA特异性RNA酶III催化。更进一步，II型系统包含cas9、cas1、cas2、csn2和cas4基因中的至少一种。应当理解，任何II型CRISPR-Cas系统均可用于本发明，特别是II型-A或B中的任一种。
III型CRISPR-Cas系统含有聚合酶和RAMP模块，其中RAMP中的至少一些似乎参与间隔区重复序列转录物的加工，类似于级联复合物。III型系统可进一步分为亚型III-A(也称为Mtube或CASS6)和III-B(也称为聚合酶RAMP模块)。亚型III-A系统可靶向质粒，如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)在体内所证明的，并且似乎在该亚型(COG1353)中编码的聚合酶样蛋白质的HD结构域可能参与靶DNA的切割。有强有力的证据表明，至少在体外，III-B型CRISPR-Cas系统可靶向RNA，如对于来自furiosus的III-B亚型系统所示。应当理解，属于III型CRISPR系统的任何cas基因均可用于本发明的目的，例如cas6、cas10、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cas1和cas2中的任一种。更进一步，III-A型或III-B型系统中的任一种可用于本发明的系统、组分和方法。特别感兴趣的是，特别是在本发明的系统和方法靶向内源致病或不期望的基因的情况下，可使用III-B型系统。在一些具体实施方案中，用作本发明的媒介物中的目的核酸序列的CRISPR-Cas系统中的该至少一种cas基因可以是I-E型CRISPR系统的至少一种cas基因。“IE型CRISPR”系统是指天然的K型大肠杆菌。已显示其会抑制噬菌体感染、治愈质粒、防止接合元件转移和杀死细胞。该CRISPR机制可用于以可诱导的和靶向的方式降解特定的细胞内DNA，从而留下完整的剩余DNA。
更进一步，V型系统的Cas蛋白质也可应用于本文所公开的调节组分中。V型CRISPR-Cas系统的特征在于单个RNA引导的含RuvC结构域的核酸酶。与II型CRISPR-Cas系统一样，如本文所用的CRISPR V型系统需要包含两种基本组分：gRNA和CRISPR相关联内切核酸酶(CasX/Cas14/CasF)。
应当注意的是，任何CRISPR/Cas蛋白质可用于本公开，这种Cas蛋白质可以是Cas9、CasX、Cas12、Cas13、Cas14、Cas6、Cpf1、CMS1蛋白质或它们的衍生自或表达自以下的任何变体：海沼甲烷球菌C7、白喉棒状杆菌、有效棒杆菌YS-314、谷氨酸棒杆菌(ATCC13032)、谷氨酸棒杆菌(ATCC 13032)、谷氨酸棒杆菌R、克罗彭施泰特棒杆菌(DSM 44385)、脓肿分枝杆菌(ATCC 19977)、皮疽诺卡氏菌IFM10152、红平红球菌PR4、贾斯汀红球菌RFIA1、浑浊红球菌B4(uid36573)、嗜酸纤维素分解菌11 B、氯酚节杆菌A6、克里贝拉福拉替达菌(DSM 17836)、弯曲高温单孢菌(DSM43183)、齿双歧杆菌Bd1、长双岐杆菌DJO10A、还原天芥菜碱斯奈克氏菌(DSM 20476)、海珀尔女神菌EX H 1、脆弱拟杆菌NCTC 9434、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(DSM 7271)、嗜冷黄杆菌JIP0286、嗜黏蛋白阿克曼菌(ATCC BAA 835)、光合玫瑰菌(DSM 13941)、玫瑰弯菌RS1、集胞藻PCC6803、迷踪菌Pei191、未培养的白蚁群1细菌种系型Rs D17、产琥珀酸丝状杆菌S85、蜡样芽孢杆菌(ATCC 10987)、英诺克李斯特氏菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳桿菌GG、唾液乳杆菌UCC118、无乳链球菌-5-A909、无乳链球菌NEM316、无乳链球菌2603、停乳链球菌似马亚种GGS 124、马链球菌兽瘟亚种MGCS10565、解没食子酸链球菌UCN34(uid46061)、戈登链球菌查利斯变种CH1、变形链球菌NN2025(uid46353)、变形链球菌、酿脓链球菌M1 GAS、酿脓链球菌MGAS5005、酿脓链球菌MGAS2096、酿脓链球菌MGAS9429、酿脓链球菌MGAS 10270、酿脓链球菌MGAS6180、酿脓链球菌MGAS315、酿脓链球菌SSI-1、酿脓链球菌MGAS10750、酿脓链球菌NZ131、嗜热链球菌CNRZ1066、嗜热链球菌LMD-9、嗜热链球菌LMG 18311、肉毒杆菌A3Loch Maree、肉毒杆菌B Eklund 17B、肉毒杆菌Ba4657、肉毒杆菌FLangeland、解纤维素梭菌H10、大芬戈尔德菌(ATCC 29328)、直肠真杆菌(ATCC33656)、鸡毒支原体、运动支原体163K、穿透支原体、鸡滑液囊支原体53、链杆菌、念珠棘虫(DSM 12112)、慢生根瘤菌BTAil、汉氏硝化细菌X14、沼泽红假单胞菌BisB18、沼泽红假单胞菌BisB5、食清洁剂细小棒菌DS-1、恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌。DFL 12、固氮醋杆菌Pal 5FAPERJ、固氮醋杆菌Pal 5 JGI、固氮螺菌B510(uid46085)、深红红螺菌(ATCC 11170)、Diaphorobacter TPSY(uid29975)、艾森氏蠕形杆菌EF01-2、脑膜炎奈瑟氏菌053442、脑膜炎奈瑟氏菌α14、脑膜炎奈瑟氏菌Z2491、需盐脱硫弧菌DSM 2638、空肠弯曲杆菌德莱亚种269 97、空肠弯曲杆菌德莱亚种81116、空肠弯曲杆菌德莱亚种、红嘴鸥弯曲杆菌RM2100、肝螺杆菌、产琥珀酸沃廉菌、Tolumonas auensis DSM 9187、大西洋假交替单胞菌T6c、乌贼希瓦氏菌(ATCC 700345)、嗜肺军团杆菌巴黎株、产琥珀酸放线杆菌130Z、多杀巴斯德菌、新凶手土拉弗朗西斯菌U112、土拉弗朗西斯菌holarctica、土拉弗朗西斯菌FSC 198、土拉弗朗西斯菌、土拉弗朗西斯菌WY96-3418或齿垢密螺旋体(ATCC 35405)。
应当理解，本公开在其进一步方面进一步包括本文所公开的任何组分，以及编码所公开组分的任何核酸序列及其任何构建体、盒或载体。更具体地，在一些实施方案中，本公开包括本文所公开的药物代谢调节组分中的任一者，具体地，至少一种组分，其在一些实施方案中可以是核酸分子、至少一种cas基因和至少一种CRISPR阵列，该核酸分子包含编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件的至少一种核酸序列。在又一些另外的实施方案中，本公开进一步包括包含所公开的调节性组分的任何构建体、质粒或递送媒介物。在又一些另外的实施方案中，本公开进一步包括包含本文所公开的调节性组分的任何基于噬菌体的转导颗粒或基于细菌噬菌体的载体(例如，能够将调节组分转导到靶细胞中的细菌噬菌体)。在又一些另外的实施方案中，本公开进一步包括如本公开中所公开的选择性组份中的任一者。具体地，在一些实施方案中，选择性组分包含被调节性组分的CRISPR阵列识别的至少一个原间隔区。选择性组分进一步包含和/或编码至少一种毒性元素，该毒性元素杀死细菌细胞或破坏、减弱和/或抑制细菌生长和/或功能。在一些实施方案中，本公开进一步提供了编码所讨论的选择性组分的核酸分子以及包含这种选择性组分的任何构建体、质粒、盒、载体或媒介物。在又一些另外的实施方案中，本公开进一步包括包含所公开的选择性组分的任何基于噬菌体的转导颗粒或基于细菌噬菌体的载体(例如，能够将调节组分转导到靶细胞中的细菌噬菌体)。
本公开的另外方面涉及用于调节细菌细胞和/或细菌细胞群体的药物代谢的方法。在一些实施方案中，该方法包括以下步骤中的至少一者：
在一些实施方案中可以是第一步骤的一个步骤(a)涉及使细胞或包含细胞的任何细胞群体与至少一种药物代谢调节组分接触，该至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种CRISPR阵列，该至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物代谢的至少一种元件。在一些实施方案中可以是第二步骤的另一步骤(b)涉及使细胞或包含细胞的任何细胞群体与包含至少一个原间隔区的至少一种选择性组分接触。应当理解，该至少一个原间隔区被(a)的CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活选择性组分。
使靶细胞和/或细胞群体暴露和/或接触药物代谢调节组分和/或选择性组分和/或包含(a)和(b)组分中的至少一者的任何系统或组合物，导致调节靶细菌细胞的药物代谢，并且此外，获得、选择和/或富集表现出至少一种药物的经修饰的代谢的细菌细胞群体。
在一些实施方案中，靶细胞与系统和/或其任何组分(具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分，或包含这些组分的任何递送媒介物)的“接触”是指将细胞或细胞所处的环境暴露于这些系统和/或其任何组分中的一者或多者。更进一步，“接触”是指系统和/或其任何组分，具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分，或包含这些组分的任何递送媒介物(例如，细菌噬菌体)的定位，使得它们与靶细胞(例如，细菌细胞)直接或间接接触。应当理解，在一些实施方案中，术语“接触”包括将细胞体内以及体外暴露于本文所公开的组分或组合物。因此，在一些实施方案中，“接触”包括向个体施用该至少一种系统和/或其任何组分，具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分，或包含这些组分的任何递送媒介物，或任何细胞或细胞群体(例如，细菌细胞)或它们的任何组合物。
在一些实施方案中，编码或调节参与药物代谢的至少一种元件的该至少一种核酸序列包含在CRISPR阵列中。
在一些实施方案中，使靶细胞与本公开的系统或与如本公开所提供的其任何组分接触的步骤在一些实施方案中可涉及将本公开的系统的组分的核酸序列转化和/或转导至靶细胞，例如靶细菌细胞。“转化”和“转染”意指通过核酸介导的基因转移将核酸例如本文所定义的裸DNA或递送媒介物引入受体细胞中。
“转导”是指通过病毒或病毒载体将外源DNA引入细胞中的过程。示例是DNA从一个细菌到另一个细菌的病毒转移，因此是水平基因转移的示例。
在又一些另外的实施方案中，由本文所公开的方法使用的调节组分包含在至少一种递送媒介物中，该至少一种递送媒介物特异性靶向细胞和/或细菌细胞群体中的细胞。
在又一些另外的实施方案中，由本文所公开的方法使用的选择性组分包含在至少一种递送媒介物中，该至少一种递送媒介物特异性靶向细胞和/或细菌细胞群体中的细胞。在一些实施方案中，选择性组分包含至少一种影响细胞活力和/或活性的试剂。
在又一些另外的实施方案中，包含由本文所公开的方法使用的选择性组分的该至少一种递送媒介物是或包含至少一种遗传元件。更具体地，在一些实施方案中，这种遗传元件是包含和/或编码调节组分和/或选择性组分以及它们的任何组合或混合物中的至少一者的以下项中的至少一者：至少一种转导颗粒、至少一种细菌噬菌体或其任何片段或部分、至少一种基于细菌噬菌体或细菌噬菌体样的转导颗粒和/或至少一种经修饰的细菌噬菌体、至少一种载体、质粒和/或构建体。
在一些实施方案中，所公开系统的选择性组分的递送媒介物可以是基于细菌噬菌体的颗粒，其包含杀死细菌细胞或破坏、减弱和/或抑制细菌生长的内源或外源毒性元素。
在一些实施方案中，选择性组分的递送媒介物可以是细菌噬菌体或基于细菌噬菌体的转导颗粒，其内源性地包含杀死细菌细胞或破坏、减弱和/或抑制细菌生长的毒性元素。在一些实施方案中，此类细菌噬菌体或基于细菌噬菌体的转导颗粒可用作所公开系统的选择性组分。在一些实施方案中，用作选择性组分或用于递送选择性组分的细菌噬菌体或基于细菌噬菌体的转导颗粒可以是裂解性细菌噬菌体。在一些实施方案中，这种裂解性细菌噬菌体可以是经修饰的、重组的或未经修饰的细菌噬菌体，或者另选地，是基于裂解性噬菌体的颗粒。
在又一些另外的实施方案中，选择性组分的递送媒介物可以是质粒、构建体或任何其他遗传元件，其包含编码杀死细菌细胞或破坏、减弱和/或抑制细菌生长和/或功能的毒性元素的核酸序列。
在又一些另外的实施方案中，包含由本文所公开的方法使用的系统的组分中的至少一者的递送媒介物是至少一种细菌噬菌体或任何细菌噬菌体样转导颗粒或基于细菌噬菌体的转导颗粒，其包含和/或编码杀死细菌细胞或破坏、减弱和/或抑制细菌生长和/或功能的至少一种毒性元素。
在一些实施方案中，细菌噬菌体或细菌噬菌体样转导颗粒是T7样病毒、T4样病毒或埃希氏菌属λ(Escherichia virus Lambda)。
在一些实施方案中，被所公开的系统靶向的靶细胞是细菌细胞。在又一些另外的实施方案中，被本文所公开的方法靶向的细菌细胞和/或细胞群体是肠微生物组细胞群体或包含在该肠微生物组细胞群体内。更进一步，在一些实施方案中，细胞群体包含变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和门中的至少一种细菌或分离物的任何突变体、变体或它们的任何组合。
在一些实施方案中，由本文所公开的方法使用的药物代谢调节组分影响药物的活性、生物利用度、清除、稳定性、毒性和吸收中的至少一者。
在又一些另外的实施方案中，参与被本文所公开的方法使用的调节组分靶向的至少一种药物的代谢的元件是至少一种葡糖苷酸酶。
在更具体的实施方案中，葡糖苷酸酶是至少一种β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)。
更进一步，在一些实施方案中，调节组分包含编码抑制至少一种β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)转录的至少一种元件的核酸序列。
在一些实施方案中，由调节组分的核酸序列编码的元件抑制所述βGUS酶的转录。在又一些另外的实施方案中，该元件是Gus阻遏物(GusR)。
在一些实施方案中，GusR对至少一种GUS配体和/或底物表现出降低的或消除的亲和力。在一些实施方案中，在所公开的方法的系统的调节组分中使用的GusR在形成GusR的配体结合袋的残基中包含至少一个取代和/或其他修饰。因此，在又一些另外的实施方案中，可操纵形成和/或参与GusR的配体结合袋的任何残基以获得对至少一种GUS配体和/或底物表现出降低的或消除的亲和力的GusR。具体地，包括H126、K125、R69、E97、R73、Y164、L160、T163和M87中的至少一者中的取代的任何GusR可应用于本发明的调节组分。
更进一步，在一些实施方案中，GusR在以下项中的至少一者中携带至少一个突变：
赖氨酸(K)125至丙氨酸(A)，酪氨酸(Y)164至苯丙氨酸(F)，和精氨酸(R)73至丙氨酸(A)，以及它们的任何组合。。应当理解，可用于本公开的所公开的GusR突变体及其任何组合也适用于本文所公开的任何方法。
在又一些另外的实施方案中，由本文所公开的方法使用的系统调节的至少一种药物是抗肿瘤剂、抗病毒剂、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、镇痛剂、抗高血压剂、抗疟剂、神经阻滞剂、降胆固醇剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、胆汁酸、抗凝血剂、铁螯合剂、抗菌剂、造血生长因子、抗震颤麻痹剂、激素、中枢神经系统抑制剂、抗胆碱能剂、副交感神经阻断剂、免疫抑制剂、阿片类解毒剂、抗哮喘剂、抗良性前列腺增生剂或抗痛风剂中的任一者。
在又一些另外的实施方案中，该药物是至少一种抗肿瘤剂，任选地，至少一种拓扑异构酶I抑制剂。
应当理解，由如本文结合本公开的其他方面所公开的由Gus酶代谢的任何药物也适用于该方面。
在更具体的实施方案中，通过本文所公开的方法调节的药物是至少一种拓扑异构酶I抑制剂。在又一些另外的实施方案中，拓扑异构酶I抑制剂是喜树碱-11(CPT-11，伊立替康)，或其任何衍生物、代谢物或生物相似物。在一些实施方案中，该药物也被命名为(4S)-4，11-二乙基-3，4，12，14-四氢-4-羟基-3，14-二氧代-1H-吡喃并[3′，4′：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-9-基[1，4′-联哌啶]-1′-羧酸酯盐酸盐。
在一些实施方案中，由本文所公开的方法使用的药物代谢调节组分抑制或降低CPT-11的非活性代谢物通过GUS(特别是细菌GUS)再活化和/或转化为活性代谢物。更具体地，在一些实施方案中，本公开的调节性组分降低或抑制通过GUS的酶促反应，具体地，伊立替康的非活性代谢物SN38G水解成活性代谢物SN38。
在一些实施方案中，本文所公开的方法的步骤(b)，具体地，使细胞和/或细胞群体与本文所公开的系统的选择性组分接触，可重复一次或甚至数次。例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多次。在一些实施方案中，该选择性步骤重复至少两次以富集表现出至少一种药物的经调节代谢的所述经修饰的细胞群体。
在一些实施方案中，本文所公开的调节方法可在有需要的受试者中进行。因此，在一些实施方案中，如本文所用的接触步骤可涉及将所公开的系统的组分或其任何组合物和试剂盒施用给接受治疗的受试者。
在一些实施方案中，这种施用在施用至少一种药物之前、同时或之后进行。
本公开的另外方面涉及至少一种细胞和/或所述细胞的群体，或它们的任何组合物或产品。在一些实施方案中，这些细胞是细菌细胞或包含所述细菌细胞的细胞群体。所公开的细胞或包含这些细胞的细胞群体的特征在于和/或表现出至少一种药物的经修饰的代谢。这些细胞与本文所公开的系统的该至少一种组分(调节性组分、选择性组分或两者)接触，因此表现出至少一种药物的经修饰的代谢。药物的经修饰的代谢意指药物代谢的任何改变，例如，引起或另选地，防止影响其稳定性、活性和/或生物利用度的药物的任何酶或化学修饰。在一些实施方案中，细胞和/或细胞群体通过包括以下步骤中的至少一者的方法制备。在一个步骤(a)(在一些实施方案中可以是第一步骤)中，该方法涉及使细胞或包含靶细胞的任何细胞群体与至少一种药物代谢调节组分接触，该至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种CRISPR阵列，该至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物代谢的至少一种元件。在另一步骤(b)(在一些实施方案中可以是下一步骤或第二步骤(b))中，使细胞或包含细胞的任何细胞群体与包含至少一个原间隔区的至少一种选择性组分接触。应当理解，至少一个原间隔区被(a)的CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分。
在一些实施方案中，本文所公开的细胞和/或细胞群体是细菌细胞和/或细胞群体。更进一步，在一些实施方案中，本发明提供的细菌细胞和/或包含细胞的群体通过如本公开所公开的方法制备。
在又一些另外的实施方案中，用于制备本文所公开的细胞和/或群体(例如，细菌细胞)的方法中的调节组分包含编码至少一种压制抑制和/或降低至少一种β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的表达和/或活性和/或稳定性的元件的核酸序列。
在又一些另外的实施方案中，由本文所公开的用于制备细胞和/或细胞群体(例如，细菌细胞)的方法中使用的调节组分的核酸序列编码的元件可以是抑制所述βGUS酶的转录的元件。在又一些另外的任选的实施方案中，该元件可以是Gus阻遏物(GusR)。
更进一步，在所公开的细胞和/或包含这种细胞的群体的一些实施方案中，GusR对至少一种GUS配体和/或底物表现出降低的或消除的亲和力。在又一些另外的任选的实施方案中，这种GusR在以下项中的至少一者中携带至少一个突变：赖氨酸(K)125、酪氨酸(Y)164和/或精氨酸(R)73。更具体地，由调节组分的核酸序列编码的GusR突变体可以是携带以下项中的至少一个取代的至少一种GusR：赖氨酸(K)125至丙氨酸(A)，酪氨酸(Y)164至苯丙氨酸(F)，和精氨酸(R)73至丙氨酸(A)，以及它们的任何组合。。在一些具体的和非限制性的实施方案中，由用于制备所公开的细胞或细胞群体的调节组分的核酸序列编码的GusR突变体可分别包含SEQ ID NO：9、11、13中的任一项的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所公开的细胞和/或细胞群体(例如，细菌细胞)表现出至少一种药物的经修饰的代谢，该至少一种药物可以是至少一种抗肿瘤剂。在一些任选的实施方案中，该药物是至少一种拓扑异构酶I抑制剂。
更进一步，在一些实施方案中，本文所公开的细胞和/或细胞群体(例如，细菌细胞)表现出喜树碱-11(CPT-11、伊立替康)或其任何衍生物的经调节代谢。
在又一些另外的实施方案中，细胞和/或细胞群体表现出抑制的或降低的CPT-11的非活性代谢物SN38G通过GUS再活化和/或转化为所述CPT-11的活性代谢物SN38。例如，通过细菌GUS。
本公开的另外方面涉及组合物和/或试剂盒，具体地，药物组合物、组合的组合物和/或试剂盒，包含至少一种药物和导致所公开的组合物的药物的经调节代谢的本发明的系统中的至少一者，或表现出药物的调节代谢的任何细胞或细胞群体。在更具体的实施方案中，本文所公开的组合物或试剂盒可包含：
(I)至少一种药物；和以下项中的至少一者：
(II)至少一种药物代谢调节系统，该至少一种药物代谢调节系统包含以下项中的至少一者：(a)至少一种药物代谢调节组分，该至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，该至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；和(b)至少一种选择性组分，该至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区。应当注意的是，其中所述至少一个原间隔区被(a)的CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分。在一些另选的或另外的实施方案中，该组合物可进一步包含或除该药物之外还可包含(III)、至少一种细菌细胞和/或这些细菌细胞的群体或它们的任何组合物或产品，表现出该至少一种药物的经修饰的代谢。更进一步，在一些实施方案中，该组合物任选地进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和添加剂中的至少一者。
更进一步，在如本文所公开的试剂盒的情况下，根据一些实施方案，该试剂盒的这些元件中的每一者，具体地，元件(I)、(II)、(III)可以第一、第二和/或第三剂型提供。在又一些另外的实施方案中，该试剂盒可进一步包含容器，该容器包含试剂盒的各种元件，例如各种剂型。
在一些实施方案中，本文所公开的组合物的系统可以是由本公开所定义的系统中的任一者。更进一步，本文所公开的组合物的细胞或细胞群体可如本公开所定义。
在又一些另外的实施方案中，包含在本文所公开的组合物或试剂盒中并被本文所公开的组合物或试剂盒靶向的该至少一种药物是抗肿瘤剂、抗病毒剂、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、镇痛剂、抗高血压剂、抗疟剂、神经阻滞剂、降胆固醇剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、胆汁酸、抗凝血剂、铁螯合剂、抗菌剂、造血生长因子、抗震颤麻痹剂、激素、中枢神经系统抑制剂、抗胆碱能剂、副交感神经阻断剂、免疫抑制剂、阿片类解毒剂、抗哮喘剂、抗良性前列腺增生剂或抗痛风剂中的任一者。
在又一些另外的实施方案中，该药物是至少一种抗肿瘤剂。在一些任选的实施方案中，该药物可以是至少一种拓扑异构酶I抑制剂。
在又一些具体的和非限制性的实施方案中，该药物是喜树碱-11(CPT-11、伊立替康)或其任何衍生物。
更进一步，应当理解，本公开中结合本发明的其他方面公开的药物中的任一者也适用于本方面。
在又一些另选的实施方案中，本公开的组合物以及所公开的系统及其任何组分，具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分，或包含该调节性组分和/或选择性组分的任何细胞或细胞群体(例如，细菌细胞)，可被配制为可注射剂型。在又一些另外的实施方案中，本文所公开的组合物可被配制成可注射的剂量单位形式。
在一些实施方案中，口服剂型可例如作为溶液(例如，糖浆)或作为粉末、片剂、胶囊等口服施用。在某些实施方案中，本发明的组合物可被配制成适于添加到固体、半固体或液体食品、饮料、食品添加剂、食品补充剂、医疗食品、植物药物、药物和/或任何类型的药物化合物中的制剂。
在一些实施方案中，包含所公开的系统和/或其任何组分，具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分，或包含这些组分的任何递送媒介物，或包含它们的任何细胞或细胞群体(例如，细菌细胞)的根据本公开的附加组合物可被配制为食品添加剂、食品补充剂或医疗食品。在其他实施方案中，本发明的这种附加组合物可进一步与药物或任何类型的药物产品一起添加或组合。如本文所用，术语“附加物”是指该至少一种系统和/或其任何组分的组合物或剂量单位形式，具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分，或包含这些组分的任何递送媒介物，或包含本公开的相同组分的任何细胞或细胞群体(例如，细菌细胞)，其可被添加到现有化合物、组合物或材料(例如，食品或饮料)中，增强或调节其期望的特性，或另选地，向现有化合物、组合物、食品或饮料添加特定期望的特性。
更具体地，在某些实施方案中，该至少一种系统和/或其任何组分，具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分，或包含这些组分的任何递送媒介物，或本公开的任何细胞或细胞群体(例如，细菌细胞)，或它们的任何剂型或组合物可以是食品补充剂的附加物，或另选地，可用作食品补充剂。由欧洲食品和饲料安全委员会(European Commissionfor Food and Feed Safety)创造的术语食品补充剂或由FDA采用的类似术语饮食补充剂涉及具有营养或生理作用的任何种类的天然或合成物质，其目的是补充正常或限制性饮食。在这个意义上，该术语还包括食品添加剂和饮食成分。此外，在美国联邦立法的成文法1994年膳食补充剂健康和教育法(DSHEA)下，术语饮食补充剂被定义为旨在补充饮食的产品，其具有或含有以下饮食成分中的一者或多者：维生素、矿物质、草药或其他植物性药材，由受试者使用以通过增加总饮食摄入量来补充饮食的饮食物质，或前述成分中的任一者的浓缩物、代谢物、构成、提取物或组合食品或饮食补充剂以丸剂、胶囊、粉末、饮料和能量棒的形式以及其他剂型销售。然而，与药物不同，它们主要是未调节的，即，在没有有效性或安全性证据的情况下销售。因此，欧洲和美国法律在与涵盖“常规”食品和药物产品的那些不同的一组法规下规定饮食补充剂。据此，饮食补充剂必须被标记为用于摄取，并且必须不被表示为用作常规食品或作为膳食或饮食的唯一项目。然而，可将包含这些系统和/或其任何组分，具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分，或包含这些组分的任何递送媒介物，或本文所提供的任何细胞或细胞群体(例如，细菌细胞)的添加剂型或组合物添加到受试者所食用的膳食或饮料中。
在又一些另外的实施方案中，根据本公开的系统和/或其任何组分，具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分，或包含这些组分的任何递送媒介物，或任何细胞或细胞群体(例如，细菌细胞)或它们的任何组合物，可以是医疗食品的附加物或可作为医疗食品被食用。就这一点而言还应提及医疗食品，这些医疗食品是专门配制的并且旨在用于具有单独正常饮食不能满足的独特营养需求的疾病的饮食管理的食品。特别要关注的是，所公开的组分的附加制剂、包含所公开的组分(调节组分和/或选择性组分)系统的递送媒介物、和/或细胞，可被配制为药物(具体地，本公开所公开的任何药物(例如，表1中))的附加制剂。更具体地，作为伊立替康或其任何衍生物和生物相似物的附加制剂。
更具体地，根据本发明的药物组合物，可方便地以单位剂型存在，可根据制药工业中熟知的常规技术制备。此类技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂相关联的步骤。一般来讲，通过使活性成分，具体地，本公开的核酸递送媒介物(例如，所公开的系统的调节性组分和/或选择性组分)与液体载体或细分散的固体载体或两者均匀且紧密地相关联，然后如果需要，使产物成型来制备制剂。组合物可被配制成许多可能的剂型中的任一者，诸如但不限于片剂、丸剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、喷雾剂、基质、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可被配制为在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水悬浮液可进一步含有增大悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可含有稳定剂。本发明的药物组合物还包括但不限于乳剂和含有脂质体的制剂。
另外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。药物组合物可被配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气雾剂。活性剂在施用后可以影响全身，或者可通过使用区域施用、壁内施用或使用用于将活性剂保留在植入部位的植入物来定位。活性剂(例如，其调节组分和/或选择性组分和系统)可被配制用于即时活性，或者其可被配制用于缓释。
应当理解，所公开的系统和/或其任何组分的组合物，具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分，或包含这些组分的任何递送媒介物，或任何细胞或细胞群体(例如，细菌细胞)，可被配制成任何合适的制剂。
如本文可互换使用的，“剂量单位”、“剂型”、“口服或可注射剂量单位”、“剂量单位形式”、“口服或可注射剂量单位形式”等是指本领域已知的固体剂型或液体剂型。这些剂型旨在经口使用，即由有此需要的受试者吞咽(摄入)，或甚至注射或以任何其他方式施用，或通过医师施用。本文可互换使用的术语“活性物质”或“活性成分”是指治疗或生理学活性物质，具体地，其系统和/或任何组分，具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分，或包含这些组分的任何递送媒介物，或本文所公开的任何细胞或细胞群体(例如，细菌细胞)，其向患者提供治疗/生理学效果，并且还可以是指其至少两种的混合物。
如本文所述，本文所公开的组合物或任何剂型或剂量单位形式可以可注射制剂提供。如本文所用，术语“注射”或“可注射”是指弹丸式注射(施用离散量的该至少一种系统和/或其任何组分，具体地，如本文所公开的调节性组分和/或选择性组分或包含这些组分的任何递送媒介物或本文所公开的任何细胞或细胞群体(例如细菌细胞)，用于提高其在体液中的浓度)、数分钟内的缓慢弹丸式注射或延长输注或以间隔开的间隔给予的数次连续注射/输注。每次单次施用的此类间隔注射在本文中也称为“每次施用注射”，或换言之，单次施用可包括数次注射或延长输注。可使用药物-装置组合，例如机械或机电装置，更优选机电输注泵，施用如本文所定义的用于非全身性施用给有此需要的受试者的可注射水性制剂。例如，该机电泵包括用于容纳药物的储存器、具有偶联到该泵的近端部分且具有适于将药物施用至期望部位的远端部分的导管。
本公开的另外方面涉及用于调节有此需要的受试者的至少一种药物的代谢的方法。更具体地，该方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的系统、经修饰的细菌细胞或细胞群体、它们的任何组合物或试剂盒或含有至少一种药物的其任何组合中的至少一者的步骤。更具体地，在一些实施方案中，向接受治疗的受试者施用以下的至少一者：(I)至少一种药物代谢调节系统，该至少一种药物代谢调节系统包含以下项中的至少一者：(a)至少一种药物代谢调节组分，该至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，该至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；和(b)至少一种选择性组分，该至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区。该至少一个原间隔区被(a)的CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分。另选地，或另外地，将(II)至少一种细菌细胞和/或细菌细胞的群体或它们的任何组合物或产品施用给接受治疗的受试者，表现出该至少一种药物的经修饰的代谢。另选地，或另外地，将(III)包含(I)和(II)中的至少一者的至少一种组合物、试剂盒或系统施用给接受治疗的受试者。更进一步，在一些实施方案中，可给受试者施用(IV)，(I)、(II)和(III)中的至少一者与该至少一种药物的任何组合。
在一些实施方案中，被本文所公开的方法使用的系统靶向的靶细胞是接受治疗的受试者的至少一个微生物组的一部分。因此，所公开的方法靶向接受治疗的受试者的微生物组中的细胞，从而导致微生物组细胞对特定药物代谢的调节。
在一些实施方案中，本文所公开的方法可使用如本公开所定义的任何系统，所述方法所使用的细胞或细胞群体如本文所定义，并且所述组合物如本公开所定义。
在一些实施方案中，本文所公开的方法、系统和组合物靶向作为至少一种微生物组，具体地，接受治疗的受试者的一部分的细菌。在一些实施方案中，细菌是肠道微生物组的细菌。然而，应当理解，受试者的任何微生物组的任何细菌可被本文所公开的系统、组合物和方法靶向。
在一些实施方案中，当系统被引入受试者时，对所公开的药物的代谢进行体内调节。在一些实施方案中，为了获得表现出至少一种药物的经修饰的代谢的富集的微生物组细胞群体，选择性步骤可重复至少两次。具体地，根据需要，选择性组分向接受治疗的受试者的施用可进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、00次或更多次。在又一些另外的实施方案中，两种组分(调节组分(a)和选择性组分(b))的施用可对接受治疗的受试者进行两次或更多次。
在一些实施方案中，在从受试者或供体受试者获得的细胞或细胞群体中进行离体调节，并且向受试者施用有效量的至少一种微生物组细菌细胞群体，所述至少一种微生物组细菌细胞群体表现出或特征在于该至少一种药物的经修饰的代谢。
更进一步，在另外方面，本发明提供了用于治疗、预防、改善、降低或延迟有此需要的受试者的至少一种病理性病患的发作的方法。更具体地，该方法包括向受试者施用有效量的至少一种药物、本文所公开的系统、经修饰的细菌细胞或细胞群体、它们的任何组合物或试剂盒或含有至少一种药物的其任何组合中的至少一者的步骤。更具体地，在一些实施方案中，向接受治疗的受试者施用以下的至少一者：(I)至少一种药物代谢调节系统，该至少一种药物代谢调节系统包含以下项中的至少一者：(a)至少一种药物代谢调节组分，该至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种CRISPR阵列，该至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；和(b)至少一种选择性组分，该至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区，该至少一个原间隔区被(a)的CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活选择性组分。另选地，或另外地，将(II)至少一种细菌细胞和/或细菌细胞的群体或它们的任何组合物或产品施用给接受治疗的受试者，表现出该至少一种药物的经修饰的代谢。另选地，或另外地，给接受治疗的受试者施用：(III)包含(I)和(II)中的至少一者的至少一种组合物、试剂盒或系统；和(IV)所述(I)、(II)和(III)中的至少一者与该至少一种药物的任何组合。
在一些实施方案中，本文所公开的治疗方法可使用如本公开所定义的任何系统，所述方法所使用的细胞或细胞群体如本文所定义，并且所述组合物如本公开所定义。
在一些实施方案中，本文所公开的方法可适用于治疗任何病理病患。在一些实施方案中，该病患可以是通过药物治疗的任何病患。在又一些另外的实施方案中，此类病患可以是肿瘤性病患、病毒感染、炎性病患、免疫细胞介导的病患、代谢病患和自体免疫病患中的至少一者。
在本文所公开的治疗方法的又一些另外的实施方案中，通过这些方法使用和/或调节的药物是抗肿瘤剂、抗病毒剂、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、镇痛剂、抗高血压剂、抗疟剂、神经阻滞剂、降胆固醇剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、胆汁酸、抗凝血剂、铁螯合剂、抗菌剂、造血生长因子、抗震颤麻痹剂、激素、中枢神经系统抑制剂、抗胆碱能剂、副交感神经阻断剂、免疫抑制剂、阿片类解毒剂、抗哮喘剂、抗良性前列腺增生剂或抗痛风剂中的任一者。
更进一步，在一些实施方案中，通过本文所公开的方法治疗的受试者是患有至少一种肿瘤性病患的受试者。
在又一些另外的实施方案中，该药物是至少一种抗肿瘤剂。在又一些任选的实施方案中，通过所公开的方法使用和调节的药物可以是至少一种拓扑异构酶I抑制剂。
更进一步，在一些实施方案中，通过本发明的治疗方法使用和/或调节的药物是喜树碱-11(CPT-11，伊立替康)或其任何衍生物。
在一些实施方案中，由所公开的方法使用的调节组分的核酸序列编码的元件可抑制βGUS酶的转录。在一些任选的实施方案中，该元件是Gus阻遏物(GusR)。
在一些实施方案中，GusR对至少一种GUS配体和/或底物表现出降低的或消除的亲和力。
在又一些另外的实施方案中，GusR在以下项中的至少一者中携带至少一个突变：赖氨酸(K)125、酪氨酸(Y)164和/或精氨酸(R)73。更具体地，由调节组分的核酸序列编码的GusR突变体可以是携带以下项中的至少一个取代的至少一种GusR：赖氨酸(K)125至丙氨酸(A)，酪氨酸(Y)164至苯丙氨酸(F)，和精氨酸(R)73至丙氨酸(A)，以及它们的任何组合。。在一些具体的和非限制性的实施方案中，由用于制备所公开的细胞或细胞群体的调节组分的核酸序列编码的GusR突变体可分别包含SEQ ID NO：9、11和13中的任一项的氨基酸序列。
本公开提供了用于治疗肿瘤性病患或癌症的治疗方法。
本公开可适用于任何增殖性病患，这些增殖性病患在一些实施方案中可以是任何肿瘤性疾病。更具体地，由于导致细胞数量增加的不受控制的或异常的细胞生长而形成的任何异常组织块，在本文中也称为肿瘤。在一些实施方案中，本公开的方法可适用于任何肿瘤，即良性肿瘤、原位肿瘤或恶性肿瘤。如本文用于描述本发明的，“增殖性病患”、“癌症”、“肿瘤”和“恶性肿瘤”全部等价地涉及组织或器官的增生。如果组织是淋巴或免疫系统的一部分，则恶性细胞可包括循环细胞的非实体肿瘤。其他组织或器官的恶性肿瘤可产生实体瘤。一般来讲，本发明的方法、组合物和系统可适用于患有非实体瘤和实体瘤中的任一者的患者。
本发明所考虑的恶性肿瘤可以是癌、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤中的任一者。因此，在一些实施方案中，本文所公开的本发明的方法(具体地，治疗方法)、系统和组合物中的任一者可适用于本公开所公开的恶性肿瘤中的任一者。
更具体地，如本文所用的癌是指由转化的上皮细胞组成的侵袭性恶性肿瘤。另选地，它是指由未知组织发生的转化细胞组成的恶性肿瘤，但其具有与上皮细胞相关联的特定分子或组织学特征，诸如细胞角蛋白或细胞间桥的产生。
如本文所用的黑素瘤是黑素细胞的恶性肿瘤。黑素细胞是产生深色色素黑色素的细胞，黑色素是造成皮肤颜色的原因。它们主要存在于皮肤中，但也存在于身体的其他部分，包括肠和眼。黑素瘤可发生在含有黑素细胞的身体的任何部位。
白血病是指造血器官的进行性恶性疾病，并且通常特征在于血液和骨髓中白细胞及其前体的增殖和发育异常。白血病通常在临床上基于以下进行分类：(1)急性或慢性疾病的持续时间和特征；(2)所涉及的细胞类型；髓样(髓细胞性)、淋巴样(成淋巴的)或单核细胞；和(3)白血病或白细胞缺乏(亚白血病)血液中异常细胞数量的增加或不增加。
肉瘤是由转化的结缔组织细胞产生的癌症。这些细胞起源于形成骨、软骨和脂肪组织的胚胎中胚层或中间层。这与起源于上皮的癌形成对比。上皮衬在全身结构的表面，并且是乳腺癌、结肠癌和胰腺癌的起源。
如本文所提及的骨髓瘤是浆细胞的癌症，浆细胞是通常负责产生抗体的一类白细胞。异常细胞的集合积聚在骨中，在骨中它们引起骨损害，并且积聚在骨髓中，在骨髓中它们干扰正常血细胞的产生。大部分骨髓瘤病例的特征还在于产生副蛋白，一种异常抗体，其可引起肾脏问题并干扰导致免疫缺陷的正常抗体的产生。经常遇到高钙血症(高钙水平)。
淋巴瘤是免疫系统的淋巴细胞中的癌症。通常，淋巴瘤作为淋巴样细胞的实体瘤存在。这些恶性细胞通常起源于淋巴结，表现为淋巴结的扩大(肿瘤)。它也可以影响其他器官，在这种情况下被称为结外淋巴瘤。淋巴癌的非限制性示例包括霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤。
在一些实施方案中，本公开的方法可适用于任何实体瘤。在更具体的实施方案中，本文所公开的方法可适用于可影响任何体腔中的任何器官或组织的任何恶性肿瘤，例如，腹膜腔(例如，脂肪肉瘤)、胸膜腔(例如，间皮瘤、侵入性肺脏)、不同器官中的任何肿瘤，例如，膀胱癌、卵巢癌和脑膜的肿瘤。适用于本公开内容的方法、组合物和系统的肿瘤的特定和非限制性实施方案可包括但不限于结肠直肠癌、小细胞肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、脑肿瘤和任何相关病症以及任何转移病症、其组织或器官中的至少一者。
应当理解，本公开的方法、组合物、试剂盒和系统适用于本文所讨论的任何类型和/或阶段和/或等级的任何恶性病患或其任何转移。更进一步，必须理解，本发明的方法、组合物和系统可适用于侵袭性以及非侵袭性癌症。当提及“非侵袭性”癌症时，应当注意的是不生长进入或侵入原发位置内或之外的正常组织的癌症。当提及“侵袭性癌症”时，应当注意的是在正常、健康的邻近组织中侵入和生长的癌症。
更进一步，在一些实施方案中，本公开的方法、组合物、试剂盒和系统适用于任何类型和/或阶段和/或等级的任何转移、转移性癌症或本文所公开的任何癌性病症的状态。
如本文所用，术语“转移性癌症”或“转移性状态”是指已从其最初开始的位置(原发性癌症)扩散至体内另一位置的癌症。由起源于原发性肿瘤或其他转移性肿瘤的转移性癌细胞形成的瘤(其使用血液和/或淋巴系统扩散)在本文中称为转移性肿瘤或转移瘤。
可用于本发明的另外恶性肿瘤可包括但不限于血液恶性肿瘤(包括淋巴瘤、白血病、骨髓增生性病患、急性淋巴细胞白血病；急性髓性白血病)、发育不全和再生不良性貧血(病毒诱导的和自发性的两者)、骨髓增生异常综合征、所有类型的副癌综合征(免疫介导的和自发性的两者)和实体瘤(包括胃肠道、结肠、肺、肝、乳腺、前列腺、胰腺和卡波西肉瘤。本发明也可用于治疗或抑制实体瘤，诸如以下部位的肿瘤：唇和口腔、咽、喉、鼻旁窦、大唾液腺、甲状腺、食道、胃、小肠、结肠、结肠直肠、肛管、肝、胆囊、肝外胆管、法特氏壶腹、外分泌胰腺、肺、胸膜间皮瘤、骨、软组织肉瘤、皮肤癌和恶性黑素瘤、乳腺、外阴、阴道、子宫颈、子宫体、卵巢、输卵管、妊娠滋养细胞肿瘤、阴茎、前列腺、睾丸、肾、肾盂、尿管、膀胱、尿道、眼皮癌、结膜癌、结膜恶性黑素瘤、葡萄膜恶性黑素瘤、成视网膜细胞瘤、泪腺癌、眼眶肉瘤、脑、脊髓、血管系统、血管肉瘤、肾上腺皮质瘤；AIDS相关癌症；AIDS相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤，儿童小脑或大脑；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；脑干神经胶质瘤；脑肿瘤；脑肿瘤，小脑星形细胞瘤；脑肿瘤，大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤；脑肿瘤，脑室膜瘤；脑肿瘤，髓母细胞瘤；脑肿瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤；脑肿瘤，视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；乳腺癌；支气管腺瘤/类癌瘤；柏基特淋巴瘤；类癌瘤，儿童；类癌瘤，胃肠道；未知原发的癌；中枢神经系统淋巴瘤，原发性；小脑星形细胞瘤，儿童；大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，儿童；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；慢性骨髓增生性病患；结肠癌；皮肤T细胞淋巴瘤；促结缔组织增生小圆形细胞肿瘤；子宫内膜癌；脑室膜瘤；食管癌；尤因肿瘤家族中的尤因肉瘤；颅外胚细胞性肿瘤，儿童；性腺外胚细胞性肿瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑素瘤；眼癌，成视网膜细胞瘤；胆囊癌；胃部(胃)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；胚细胞性肿瘤：颅外、性腺外或卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；脑干的神经胶质瘤；神经胶质瘤、儿童大脑星形细胞瘤；儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；胃类癌；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；肝细胞(肝)癌；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视觉通路神经胶质瘤，儿童；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤；肾癌(肾细胞癌)；喉头癌；白血病；白血病，急性淋巴细胞(也称为急性淋巴性白血病)；白血病，急性髓样(也称为急性髓细胞性白血病)；白血病，慢性淋巴细胞性(也称为慢性淋巴细胞白血病)；白血病，慢性髓细胞性(也称为慢性髄样白血病)；白血病，毛细胞；唇癌和口腔癌；肝癌(原发性)；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴瘤；淋巴瘤，AIDS相关；淋巴瘤，柏基特；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，霍奇金；淋巴瘤，非霍奇金(除霍奇金淋巴瘤外所有淋巴瘤的旧分类)；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；Marcus Whittle，致命疾病；巨球蛋白血症，Waldenstrom；骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤；髓母细胞瘤，儿童；黑素瘤；黑素瘤，眼内(眼)；Merkel细胞癌；间皮瘤，成人恶性肿瘤；间皮瘤，儿童；潜隐原发转移性鳞状颈部癌症；口癌；多发性内分泌瘤病综合征，儿童；多发性骨髓瘤/浆细胞瘤；蕈样肉芽肿；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；髓细胞性白血病，慢性；髓样白血病，成人急性；髓样白血病，儿童急性；骨髓瘤，多发性(骨髓癌)；骨髓增生性病患，慢性；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌(表面上皮-间质肿瘤)；卵巢胚细胞性肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，胰岛细胞；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；松果体星形细胞瘤；松果体胚细胞瘤；松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童；垂体腺瘤；浆细胞瘤形成/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞癌(肾癌)；肾盂和输尿管癌，移行细胞癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤，儿童；唾液腺癌；肉瘤，尤因肿瘤家族；肉瘤，卡波西；肉瘤，软组织；肉瘤，子宫；塞扎里综合征；皮肤癌(非黑素瘤)；皮肤癌(黑素瘤)；皮肤癌，Merkel细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌-参见皮肤癌(非黑素瘤)；具有潜隐原发鳞状颈部癌症，转移性；胃癌；幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童；T细胞淋巴瘤，皮肤(蕈样肉芽肿和塞扎里综合征)；睾丸癌；喉癌；胸腺瘤，儿童；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；甲状腺癌，儿童；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养层肿瘤，妊娠；未知原发灶，成人癌；未知原发灶，儿童癌症；输尿管和肾盂，移行细胞癌；尿道癌；子宫癌，子宫内膜；子宫肉瘤；阴道癌；视觉通路和下丘脑神经胶质瘤，儿童；外阴癌；Waldenstrom巨球蛋白血症和肾母细胞瘤(肾癌)。更进一步，在一些实施方案中，本公开的方法、系统、组合物和试剂盒适用于结肠癌。在一些具体实施方案中，本公开提供了用于治疗任何所公开的病状，并且具体地通过靶药物治疗的任何病状的治疗方法。例如，拓扑异构酶I抑制剂，具体地，伊立替康。
结肠直肠癌(CRC)，也称为肠癌、结肠癌或直肠癌，是从结肠癌或直肠癌发展而来的。体征和症状可包括便血、排便变化、体重减轻和疲劳。大部分结肠直肠癌归因于老年和生活方式因素，其中仅少数病例归因于潜在的遗传病患。危险因素包括饮食、肥胖、吸烟和缺乏体力活动.因此，在一些实施方案中，本公开具体地提供了用于治疗结肠直肠癌的治疗方法。
在一些实施方案中，本公开的方法、系统、组合物和试剂盒适用于小细胞肺癌。肺的小细胞癌也被称为小细胞肺癌(SCLC)或燕麦细胞癌，因为癌细胞在显微镜下可能看起来像燕麦。小细胞癌是一种癌症，其可出现在身体的各个部分中，但最常见地出现在肺中。它可非常快速地生长并扩散到其他器官。约10％至15％的肺癌是小细胞癌。吸烟是最重要的危险因素。有多种类型的小细胞癌。组合的小细胞肺癌与其他类型的肺癌诸如鳞状细胞癌或腺癌一起出现。在一些实施方案中，本公开具体地提供了用于治疗小细胞肺癌(SCLC)的治疗方法。
更进一步，必须理解的是，在一些实施方案中，本公开的方法、系统、组合物和试剂盒适用于任何所公开的病患，以及其任何症状、病症和并发症。此类症状可包括例如腹泻(皮肤的粪便染色、失去水样便)和血性腹泻(黑色粘性粪便)、体重减轻或增加等。
所谓“患者”或“有此需要的受试者”意指可能需要至少一种药物并且期望本文所述的系统和方法的任何生物体，包括人、家养和非家养哺乳动物(诸如犬科动物和猫科动物受试者，牛、猿、马和鼠受试者)、啮齿动物、家禽、水产养殖、鱼和外来观赏鱼。应当理解，接受治疗的受试者也可以是任何爬行动物或动物园动物。更具体地，本发明的系统和方法旨在用于哺乳动物。应当注意的是，具体地在非人受试者的情况下，本发明的方法可经由注射、饮用水、饲料、喷雾、口腔灌洗液直接施用给有此需要的受试者的消化道中来进行。
应当理解，如本文所用的术语“治疗”或其形式是指预防、改善或延迟患有病理病患的受试者的疾病活动的一种或多种临床指征的发作。治疗是指治疗性治疗。需要治疗的受试者是患有病理性病患的受试者。特别地，提供“防护性治疗”(以预防)或“预防性治疗”以保护性方式起作用，以防御或预防某物，特别是病症或疾病。如本文所用的术语“治疗或预防”是指向受试者施用的完全范围的治疗积极效果，包括抑制、降低、缓解和缓解涉及至少一种短期细胞应激病症/过程和任何相关联病症、病、症状、不期望的副作用或有关病患的病理性病患。更具体地，治疗或防止疾病恶化或复发包括防止或延缓疾病的发展、防止或延缓症状的发展，以及/或者降低将要发展或预期将要发展的此类症状的严重性。这些还包括改善现有症状、防止额外的症状，以及改善或防止症状的潜在代谢原因。应当理解，如本文所提及的术语“抑制”、“缓和”、“减少”、“降低”或“减弱”涉及将进展延缓、限制或减轻约1％至99.9％范围内的任一百分比，具体地，约1％至约5％、约5％至10％、约10％至15％、约15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％、约35％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约50％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约75％至80％、约80％至85％、约85％至90％、约90％至95％、约95％至99％，或约99％至99.9％、100％或更多。
关于上述内容，应当理解，在提供的情况下，百分比值，诸如例如10％、50％、120％、500％等能够与“变化倍数”值互换，”分别为0.1、0.5、1.2、5等。
如本文所提及的，术语“改善”涉及由根据本发明的组合物和方法引起的症状减少和受试者病况好转，其中所述好转可表现为以下形式：抑制与本文所述的病患相关联的病理过程、显著降低其程度，或者使患病受试者的生理状态好转。
术语“抑制”和该术语的所有变型形式旨在涵盖限制或禁止病理症状的进展和恶化，或者所述病理过程症状或进展与之相关联的病理过程进展。
术语“消除”涉及任选地根据本文所述的本发明的方法，基本上根除或清除病理症状和可能的病理病因。
术语“延迟”、“延迟发病”、“延缓”以及它们的所有变型形式旨在涵盖减缓与该至少一种短期细胞应激病症/过程相关联的病患以及它们的症状的进展和/或恶化，减缓这些病患以及它们的症状的进展、进一步恶化或发展，以便比不存在根据本发明的治疗时更迟地出现。
如上所述，由本发明提供的方法和组合物可用于治疗“病理病患”，即涉及至少一种短期细胞应激状况/过程的病理病患或病症，该病理病患或病症是指其中存在正常功能紊乱的病症、对受影响的人或与该人接触的人造成不适、功能障碍或痛苦的身体或精神的任何异常病症。应当注意的是，术语“疾病”、“病患”、“病症”和“病”在本文中等同地使用。
应当理解，由本发明所述的任何方法、系统和组合物可适用于治疗和/或改善本文所公开的任何病患或与其相关联的任何病症。应当理解，当在本文中提及病状时，可互换使用的术语“相关联的”、“联结的”和“相关的”意指具有以下特征中的至少一者的疾病、病患、病症或任何病状：共有因果关系，以高于巧合的频率共存，或者其中至少一种疾病、病患、病症或病状引起第二种疾病、病患、病症或病状。更具体地，如本文所用，“疾病”、“病患”、“病症”、“病状”等在涉及受试者的健康状况时可互换使用，并且具有属于每个和所有此类术语的含义。
如本文所定义和使用的所有定义均应当理解为优先于字典定义、以引用方式并入的文档中的定义，以及/或者所定义术语的普通含义。
如本文所用，术语“约”表示可以比所提及的值最多向上或向下偏离1％、更具体地5％、更具体地10％、更具体地15％，并且在一些情况下最多向上或向下偏离20％的值，该偏离范围包括构成连续范围的整数值，如果适用的话，还包括非整数值。在一些实施方案中，术语“约”是指±10％。
除非明确指示相反的含义，否则如本文在说明书和权利要求书中所用的不定冠词“一个”和“一种”应当理解为意指“至少一个/种”。必须注意，如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地说明并非如此。
如本文在说明书和权利要求书中所用的短语“和/或”应当理解为意指如此结合的要素(即，在一些情况下结合地存在，而在其他情况下分离地存在的要素)中的“任一者或两者”。用“和/或”列出的多个要素应当以相同的方式来解释，即，如此结合的要素中的“一者或多者”。可以任选地存在不同于由“和/或”条款具体指明的要素的其他要素，无论其与具体指明的那些要素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性示例，在一个实施方案中，当与开放式语言诸如“包括”结合使用时，提到“A和/或B”可以仅指代A(任选地包括不同于B的要素)；在另一个实施方案中，仅指代B(任选地包括不同于A的要素)；在又一个实施方案中，指代A和B两者(任选地包括其他要素)；等等。
如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应当理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或者“和/或”应当被解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个要素，但也包括其中的多于一个要素，并且任选地包括附加的未列出的项目。只有术语清楚地表明相反的含义，诸如“……中的仅一者”或“……中的只有一者”，或者当在权利要求中使用时，“由……组成”才会指代包括多个要素或要素列表中的只有一个要素。一般来讲，如本文所用的术语“或”当在权利要求书中使用时，当后面有排他性术语诸如“……中的任一者”、“……中的一者”、“……中的仅一者”或“……中的只有一者”时，应当仅被解释为指示排他性替代方案(即，“一者或另一者，但不是两者皆有”)。“基本上由……组成”当在权利要求书中使用时，应当具有其在专利法领域中所使用的普通含义。
如本文在说明书和权利要求书中所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应当理解为意指选自该要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括在该要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一者，也不排除该要素列表中的要素的任何组合。该定义还允许可以任选地存在不同于在短语“至少一个”所指的要素列表内具体指明的要素的一些要素，无论其与具体指明的那些要素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性示例，在一个实施方案中，“A和B中的至少一者”(或等同地，“A或B中的至少一者”，或等同地，“A和/或B中的至少一者”)可以指代至少一个、任选地包括多于一个A，而不存在B(并且任选地包括不同于B的要素)；在另一个实施方案中，指代至少一个、任选地包括多于一个B，而不存在A(并且任选地包括不同于A的要素)；在又一个实施方案中，指代至少一个、任选地包括多于一个A，以及至少一个、任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)；等等。
还应当理解，除非清楚地相反指示，否则在本文要求权利的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不必限于该方法的步骤或动作被记载的顺序。
在本说明书和随后的实施例和权利要求书中自始至终，所有过渡性短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等应当理解为是开放式的，即，意味着包括但不限于。具体地，应当理解，暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。仅过渡性短语“由……组成”和“基本上由……组成”应当分别为美国专利局专利审查程序手册中所提出的封闭式或半封闭式过渡性短语。更具体地，术语“包含”、“含有”、“包括”、“具有”以及它们的词形变化均意味着“包括但不限于”。术语“由……组成”意味着“包括并限于”。术语“基本上由……组成”意味着组合物、方法或结构可以包括附加的成分、步骤和/或部分，但仅仅是在这些附加的成分、步骤和/或部分不会实质上改变要求权利的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征时。
应当注意的是，本发明的各种实施方案可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁起见，而不应被解释为对本方面的范围的非灵活限制。因此，对范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围，以及该范围内的各个数值。例如，对诸如从1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及在该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，这都适用。每当本文指示数值范围时，都意在包括在所指示范围内的任何所引用数字(分数数字或整数数字)。第一指示数字与第二指示数字“之间的范围”和“从”第一指示数字“到”第二指示数字的“范围”这两个加引号短语在本文中可互换使用，意在包括第一指示数字和第二指示数字，以及两者之间的所有分数数字和整数数字。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或者由这些领域的从业者已知的方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
应当理解，为清晰起见在各独立实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可以组合形式提供在单个实施方案中。相反，为简明起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供，或者在适当时，在本发明的任何其他所述实施方案中提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方案的基本特征，除非该实施方案在没有那些要素的情况下就无法实施。
如上文所描述以及如下面的权利要求书部分中所要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中得到实验支持。
所公开和描述的，应当理解，本发明不限于本文所公开的具体实施例、方法步骤和组合物，因为此类方法步骤和组合物都可以稍微改变。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅受到所附权利要求书及其等同物的限制。
以下实施例代表了由本发明人在进行本发明的多个方面时所采用的技术。应当理解，尽管这些技术是用于实践本发明的优选实施方案的示例，但是根据本公开，本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的实质和预期范围的情况下，可以进行许多修改。
实施例
无需进一步详细描述，据信本领域技术人员可使用前面的描述最大程度地利用本发明。因此，以下优选的具体实施方案应被解释为仅仅是说明性的，并且不以任何方式限制所要求保护的发明。
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下列药物显示被人UGT酶代谢并且潜在地被细菌GUS酶代谢和影响。这些药物用于本公开中(实施例6)。
表1：被人UGT酶代谢并潜在地受微生物组GUS酶影响的药物
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实验程序
表达GusR_K125A的载体(DOIN载体)的构建：
用限制性酶XbaI和PsiI消化pYF57主链(如SEQ ID NO：I所示)，并使用商业凝胶提取试剂盒从凝胶中纯化。
合成GusR_K125A并验证其序列(核酸序列如SEQ ID NO：2所示，并且氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)。所测序的靶侧接XbaI和PsiI限制性位点。
用XbaI和PsiI消化GusR_K125A片段并从凝胶中纯化。
使用标准实验室连接程序将GusR_K125A连接到pYF57主链中。
通过菌落-PCR筛选阳性克隆，并通过测序验证正确的克隆。
噬菌体裂解物的制备：
噬菌体被设计为靶向产生肠大肠杆菌GUS的细菌群体。
将大肠杆菌K12 BW25113菌株(DSM 27469)用作所有类型噬菌体繁殖的宿主细胞。
宿主细胞含有编码尾部基因(TCl如SEQ ID NO：4所示或TC20如SEQ ID NO：5所示)的质粒，以促进完整活性噬菌体的增殖。
两种不同类型的宿主细胞用于制备两种不同类型的基于噬菌体的颗粒：
i)为了制备含有表达GusR_K125A的DOIN载体的噬菌体，宿主细胞还含有具有包装信号的质粒和包装到颗粒中的DOIN编码序列(图1)。该质粒被转导到靶向细菌中。
ii)为了制备含有选择性载体(核酸序列如SEQ ID NO：6所示)的噬菌体，宿主细胞还含有具有包装信号的质粒和包装到颗粒中的细菌毒素编码序列(图2)。该质粒被转导到靶向细菌中。
宿主细胞的过夜培养在补充有适当抗生素的LB中在37℃和220RPM搅拌下生长。
在第二天，更新细胞，并且使培养物生长直至达到0.6的OD600。
然后用T7辅助噬菌体(核酸序列如SEQ ID NO：7所示)以大约1的感染复数(MOI)感染培养物。所使用的T7辅助噬菌体的基因组缺少编码噬菌体尾部模块的三个必需结构基因。
在感染后三小时，向培养物中加入氯仿，随后短暂涡旋。
裂解物滴度使用转导形成单位(TFU)测定法测定，如先前在别处所述。
测定GusR_K125A对GUS活性的体外作用：
检查两种不同的细菌菌株：大肠杆菌K-12 BW25113和大肠杆菌K12 MG1655(ATCC700926)。这些菌株显示定殖在人肠中并具有GUS操纵子。
所制备的裂解物用于转导每种上述细菌宿主，并且通过TFU测定法测定每种菌株的转导效率。
选择表现出最高转导效率的菌株用于体外GUS活性测定。
GUS活性如前所述在其他地方进行，包括所有所需的测定对照。简言之，细菌培养物生长达到0.6的OD600。一旦达到靶向生长阶段，就用表达GusR_K125A的载体转导培养基。在一小时后，将细菌培养物与底物(PNPG)和测定缓冲液一起加入到测定反应中。将测定反应在37℃下温育6小时，并通过测量410nm处的吸光度，通过水解产物(PNP)的存在来监测GUS操纵子的活性。GUS操纵子比活性的任意单位计算如下：
在一系列随访研究中，使用选择性载体来证明抑制GUS的细菌群体随时间的富集。
证明CTP-11减轻了抑制GUS的细菌的细胞毒性
使用如上所述的PNPG使细菌(产生WT和GUS抑制剂的细菌)生长并进行诱导。在诱导后，裂解细菌，并将提取物与SN-38G或PNPG一起温育。在温育期结束时，取出温育PNPG的细菌提取物以测定GUS的活性。与此同时，将温育SN-38G的细菌提取物加入到HT29细胞培养物中以测定细胞毒性和CC50。
使用MTT测定法测定不同测试项目的CC50。简言之，将含有2×104个活细胞/ml的细胞悬浮液接种到96孔微量滴定板中。在温育48小时之后，用含有各种化合物或细菌提取物的培养基替换该培养基，并暴露48小时。通过以2mg/ml向每个孔中加入50μl MTT使板显色并再温育3小时。将板以450g离心10分钟，并小心地吸取上清液。将甲臜晶体溶于200μl的DMSO中，并测量570nm处的吸光度，其中在620nm处进行背景校正。
测定GusR_K125A减轻CTP-11毒性的体内作用：
使用适当肠动物模型来证明体内功效。为此目的，进行两个预备步骤以建立动物模型：(a)靶细菌细胞的慢性定殖建立；和(b)，用于治疗的基于噬菌体的颗粒的生物利用度的表征。一旦建立了动物模型，就进行功效研究。在以下实验步骤中使用以下两个模型：
Sprague Dawley大鼠(250克至290克)和6至8周龄雌性Balb/cJ小鼠
在每种动物模型中，将动物分成四个实验组：组1-载体对照，组2-用含有表达GusR_K125A的载体的基于噬菌体的颗粒和用含有选择性载体的基于噬菌体的颗粒以预定方案处理，组3-CPT-11注射的CPT-11(50mg/kg/天)和组4-CPT-11注射的并用上述基于噬菌体的颗粒处理。
-研究终点是体重、腹泻(皮肤的粪便染色，失去水样便)和血性腹泻(黑色粘性粪便)的临床参数。在研究期间(11天)监测这些参数。
-在研究结束时，对大肠样本进行组织病理学检查，并根据预定义参数确定每个样本的组织学评分。
实施例1
使用突变体抑制GUS活性
作为概念的证明，使用微生物组GUS酶，证明了本公开操纵细菌群体并由此调节在含有经修饰的细菌群体的接受治疗的受试者中药物代谢的能力。首先检查CPT-11的代谢调节。CPT-11(伊立替康)是用于结肠癌的三种常用化疗剂之一。CPT-11是前药，在肝中被羧酸酯酶(CE)活化为SN-38，一种抗肿瘤拓扑异构酶I毒物。通过UDP-葡糖醛酸基转移酶(UGT)将肝SN-38灭活为SN-38G并送到肠中。一旦在肠中，SN-38G就作为原位再活化SN-38的GUS酶的底物，并且肠腔中的活性SN-38产生CPT-11剂量限制性副作用。
GUS是gusA基因的产物，在GUS操纵子中其后是内膜G1cA特异性转运蛋白gusB和非特异性外膜通道gusC基因。肠杆菌科中的GUS操纵子受转录阻遏物GusR的控制。只有人肠相关联变形菌门的肠杆菌科(包括埃希氏菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属、耶尔森氏鼠疫杆菌属和痢疾志贺菌属)维持GUS操纵子。
更具体地，GUS操纵子大部分(但不是普遍地)保留在人肠相关联肠杆菌科中，因为编码GusR的肠杆菌科的所有测序菌株维持完整的操纵子，除了一个克雷伯氏菌和两个志贺氏菌菌株(其具有截短的GUS操纵子基因)。
已经确定了GusR的晶体结构，并表征了对蛋白质结构和作用重要的结构域。据发现，GusR在不存在配体的情况下作为结合DNA的转录阻遏物起作用，并且一旦存在合适的葡糖苷酸配体就从DNA释放。体外研究显示，GusR的释放去抑制GUS操纵子，允许gusA表达和GUS酶的增加(图3A至图3B)。
各种GusR突变体的活性分析显示，用羧酸盐接触的残基的丙氨酸[K125A]取代赖氨酸(包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO：8所示的核酸序列编码)]产生对GUS配体具有显著较低亲和力的GusR变体。此外，显示含有K125A GusR变体的表达质粒的细菌细胞即使在用1mM PNPG(结合配体的GUS)诱导时也不显示GUS活性。由于GUS在存在配体的情况下在含有空载体的细胞中是有活性的(由于内源GusR)，因此K125A变体对GUS活性的抑制在仍保留其内源GusR蛋白质的细胞中是显性失活的(图3C)。
降低诱导CPT-11的肠毒性并且不会妨碍CPT-11的治疗功效也不会破坏天然微生物群的有效和特异性GUS抑制剂具有极大的临床价值。此外，大肠杆菌GUS与人GUS共有50％氨基酸序列同一性且具有高度保守的活性位点，而人GUS是降解糖胺聚糖的重要溶酶体酶。因此，特异性抑制细菌GUS而不是人GUS也是重要的。
使用特定的基于噬菌体的颗粒作为用于本公开的系统的两种组分的递送媒介物，进行了具有显性阴性GUS突变体变体抑制子(GUS_K125A)的表达GUS的肠细菌细胞。灭活GUS肠活性的显性失活突变体的表达因此降低了肠中微生物GUS介导的SN-38再活化(图3C)。
因此进行以下步骤：
-将含有表达GusR_K125A的载体以及至少一个CRISPR阵列(在本公开中也称为调节组分)的转导颗粒递送到胃肠道中，并且在那里它们特异性地靶向产生GUS的宿主细胞(例如，大肠杆菌细胞)。
-用表达GusR_K125A的载体转导靶宿主细胞(例如，大肠杆菌)，这导致GUS操纵子的转录抑制。
-在用含有表达GusR_K125A的载体的颗粒处理后，通过用选择性组分(例如，基于噬菌体的颗粒，其编码毒性元件，但也包含由调节组分的CRISPR阵列识别的至少一个原间隔区处理来实现维持靶细胞对GUS操纵子的抑制的选择压力。
-仅保持GusR_K125A酶和CRISPR阵列的宿主细胞在选择性颗粒的致死攻击下存活。
-使用选择性压力重复富集循环，有利于抑制GUS的细菌群体，导致肠中GUS产生的抑制，减轻了SN-38 GUS介导的毒性。
使用GusR_K125A突变体抑制GUS活性
本发明人接下来评价了使用GusR_K125A突变体抑制GUS活性。更具体地，使用两种大肠杆菌细菌宿主：BW25113和MG1655。将表达突变体阻遏物K125A的质粒引入这些宿主(BW25113 K125A和MG1655 K125A)中的每一者中。在GUS操纵子诱导物PNPG不存在(-)或存在(+)的情况下确定GUS操纵子的活性。如上所述计算具体单位。如图4所示，在两种细菌宿主中，在存在显性失活突变体阻遏物K125A的情况下，GUS活性被抑制。
本发明人接下来评价了GusR突变体在另外的微生物组分离物中抑制GUS酶活性的能力。因此，接下来检查大肠杆菌MG1655和Nissle1917菌株。选择这些菌株用于测试，因为与所公开的系统的intendent使用相关，发现两种菌株均存在于人微生物组中[WallaceBD，W.H.(2010年)，Science，11月5日；第330卷第6005期：第831-835页；Turnbaugh PJ，L.R.-L.(2007年)，Nature，10月18日；第449卷第7164期：第804-810页]。此外，Nissle1917被认为是微生物组模型生物，并且其作为生物治疗剂被临床研究[U.，S.(2016年)FEMSMicrobiol Lett.，十月；第363卷第19期：fnw212]。
图5示出了K125A GusR突变体也显著抑制两种细菌菌株中的GUS活性(降低至1/8至1/18)。
这些结果清楚地证明了细胞的有效且成功的靶向，并建立了修饰GUS底物代谢的可行性。更重要的是，这些结果证实，K125A GusR突变体适用于多种宿主，该宿主是人微生物组中的共生细菌，从而建立所公开的系统的潜在治疗应用。
如上所述，本发明人首先建立了GusR突变体向靶细胞的成功递送，并证明了在含有GusR_K125A突变体的细菌细胞中对GUS活性的有效抑制。更具体地，如上所述制备基于噬菌体的颗粒裂解物。如前所述，使用TFU测定法测定颗粒针对上述细菌宿主的转导效率，并示于表2中。用于转导的尾部是TC1(TC1如SEQ ID NO：4所示)。
表2.质粒向细菌宿主的转导功效
宿主 TFU/ml
BW25113 2.3*107
MG1655 1.1*107
图6证明了调节GusR突变体-CRISPR有效载荷向微生物组分离物的另一成功转导。如上所述，使用TFU测定法测定TBX201有效负载向不同微生物组宿主菌株中的转导效率。
实施例2
细菌GUS酶被两种另外的GusR突变的变体抑制
为了评价GusR的不同变体的抑制能力，接下来构建大肠杆菌GusR阻遏物蛋白质的两个另外变体，R73A(包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，通过如SEQ ID NO：12所示的核酸序列编码)突变体和Y164F(包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，通过如SEQ IDNO：10所示的核酸序列编码)突变体。这两种突变体表现出对GUS操纵子调节区的不同亲和力。更具体地，由于预计这两种突变体变体对GUS底物具有更高的亲和力，因此预计抑制能力更低。将两种另外的突变体作为改善转导细菌的适应性的手段进行检查，因为它们对糖细菌代谢显示出更温和的作用。图7示出，虽然R73A突变体显著抑制两种测试细菌中的GUS酶(降低至1/8至1/386)，但Y164F突变体的抑制能力是菌株依赖性的。具体地，在BW25113细菌中，GUS活性降低至1/34，但在MG1655细菌中，活性仅降低约1/1.5。这些发现表明，与K125A突变体相比，Y164F突变体在MG1655细菌中降低的抑制可能是由于Y164F突变体的更强的底物亲和力。
实施例3
体外PoC细菌群体的成功转化
为了证明抑制GUS的细菌群体的超过99％的体外持续转化，本公开的系统已经用于抑制靶细菌中的GUS并且富集具有期望的抑制GUS的群体的细菌培养物。
更具体地，本公开的平台(在本文中也称为系统)由在两个转导颗粒(例如噬菌体)中提供的两种组分、调节组分(在本文中也称为“GusR突变体-CRISPR”或“CRISPR”)和选择性组分(在本文中也称为“选择性”)组成，它们被顺序使用(图8A)。在第一步骤中，“CRISPR”噬菌体转导GusR突变体有效负载，其抑制细菌GUS并表达CRISPR系统。此后，使用“选择性”组分噬菌体杀死未用GusR突变体有效负载转导的剩余细菌。调节性组分中的CRISPR系统与GusR突变体有效负载一起使得成功转导的细菌免受“选择性”噬菌体的侵害。该系统产生富含抑制GUS的细菌的细菌群体。
该系统的PoC在图8B、图8C中示出。将中指数BW25113细菌培养物与编码GusR突变体和CRISPR阵列(在本文中也称为“CRISPR”噬菌体)的调节组分在0小时的时间点一起温育。两小时后，在时间点2小时处，培养基中大约0.1％的细菌含有GusR突变体-CRISPR有效负载，并变成抑制GUS的。在2小时和24小时的时间点，“选择性”噬菌体用于选择性杀死未被“GusR突变体-CRISPR噬菌体”转导的剩余的表达GUS的细菌。“选择性”噬菌体的选择性杀死富集了期望的细菌群体，并导致持续的抑制GUS的细菌培养物。如图8B所示，在研究结束时(时间点48小时)，大部分(＞99％)细菌群体由抑制GUS的细菌组成。
应当注意的是，尽管只有0.1％的细菌群体最初被本发明的调节组分“CRISPR”噬菌体转导，但所公开的平台成功地选择并富集了期望的抑制GUS的细菌群体。“CRISPR”噬菌体向大部分细菌群体的转导以及“选择性”噬菌体的重复使用因此使功效最大化。
为了确定细菌群体的转化如何影响细菌GUS酶活性，在转化之前和之后对培养物进行测试。如图8C所示，与转化前的细菌培养物相比，在转化后的细菌培养物中观察到GUS活性的显著降低(至1/16)。
这些结果证明了细菌群体的有效转化和由转导的细菌菌株的酶表现的酶活性的成功操纵，从而调节了微生物组群体的组成和功能。
实施例4
细菌中的GUS抑制成功地降低了伊立替康细胞毒性
为了证明抑制靶细菌宿主中的细菌GUS防止了灭活的SN38G转化为活性SN38形式，GUS测定如上所述使用SN38G作为反应底物而不是实验底物PNPG进行。样本中SN38G通过细菌GUS转化为SN38的速率取决于反应条件(例如GUS酶活性、底物浓度等)，因此所得样本含有不同浓度的SN38。然后将样本与HL29、人结肠直肠腺癌细胞系一起温育，并测定细胞的活力。检查不同浓度的SN38G和细菌以评价它们对SN38细胞毒性的作用。图9证明了使用不同浓度的SN38G时细菌GUS抑制对细胞活力的影响。当使用最高浓度SN38G(1μM)时，与表达载体的细菌一起温育的细胞死亡，而在相同浓度下，与表达K125A的细菌一起温育的细胞的60％被拯救。随着SN38G浓度的降低，细胞的活力增加，尽管在所有情况下，当与来自表达K125A的细菌的样本一起温育时，与来自表达空载体的细菌的样本一起温育的细胞相比，细胞活力更高。在最低浓度的SN38G(0.1μM)下，H29T细胞与从表达K125A GusR的细菌获得的样本一起温育。用这些样本温育细胞显示它们完全从SN38的毒性作用中拯救出来。
该研究证明，调节性组分，具体地，GusR突变体K125A对细菌GUS的抑制阻碍了灭活的伊立替康代谢物SN-38G向对细胞显示毒性作用的活性SN-38代谢物的转化，从而降低了SN-38对人细胞的细胞毒性作用。此外，这些结果表明，从SN-38细胞毒性中拯救细胞的能力取决于细菌反应中SN-38G的初始浓度，用作细菌GUS的底物的SN-38G越多，其被酶转化为SN-38越多，因此样本对细胞的毒性越大。
还检查了细菌浓度以及因此GUS酶浓度对SN-38G的转化率和细胞活力的影响。在该测定法中，在加入SN-38G(1μM)之前，稀释细菌以测试不同的GUS浓度。
如图10所示，当使用最高细菌浓度时(未稀释的)，当在与图9中所示相同的条件下测试时获得相同的结果(SN38G 1μM)。细菌浓度稀释得越多(即，GUS稀释得越多)，与表达K125A的细菌样本一起温育的细胞的活力增加，而与表达载体的细菌样本一起温育的细胞没有存活。当细菌被6倍稀释时，达到了显著地从SN38毒性中拯救几乎100％的细胞的最大效果。
在小鼠中，据发现，SN38的峰值浓度为约1μg/克组织重量，在以80mg/kg的剂量施用伊立替康后2小时达到(Li K、Wang S.s.l.：AAPS PharmSciTech.，2016年卷，12月；第17卷第6期：第1450-1456页)。考虑到小鼠的大肠重量为约1克(Ogiolda L、Wanke R、RottmannO、Hermanns W、Wolf E.s.l.：Anat Rec.，1998年卷，3月；第250卷第3期：第292-299页)，肠SN38的总量为1μg，大约为其此处所用底物SN38G量的两倍。此外，肠中靶细菌的浓度(每克肠含量约108个细菌)与上述实验中使用的浓度(每ml为108个细菌)相似。(Macfarlane GT、Macfarlane S、Gibson GR.s.l.：Microb Ecol.，1998卷。3月，第35卷第2期：第180-187页)，合理的是假设本文在体外测试的实验条件与在体内动物肠中发生的那些相当类似。
为了证实K125A样本的减轻的细胞毒性确实是由这些细菌中GUS的抑制引起的，如上所述进行GUS测定法，从而测试这些样本中酶的活性。事实上，表达K125A的细菌中的GUS比活性比表达空载体的细菌中的低至约1/10。
总体来看，如本文所证实的，通过本公开的调节组分对细菌GUS的抑制通过防止SN38G转化为伊立替康的毒性代谢物SN38(伊立替康)而降低了人细胞系中的伊立替康细胞毒性。此外，显示伊立替康毒性的减轻是依赖于细菌GUS抑制能力的剂量。
实施例5
所公开的系统-体内动物模型的功效
使用熟知的动物模型来评估本公开的系统对伊立替康(CPT-11)毒性的作用[WangH，等人，Science，2010年卷，11月5日；第330卷第6005期：第831-835页；Bhatt AP等人]。简言之，将Sprague Dawley大鼠(250克至290克)随机分配至以下研究组(n＝8)：组1，无CPT-11且无本公开的调节系统；组2，CPT-11且无本公开的调节系统；组3，无CPT-11且具有本公开的调节系统；组4，具有CPT-11且具有本公开的调节系统。使所有组的大鼠适应环境。
为了能够直接施用噬菌体，经由肠切开术将硅橡胶管(插管)插入到动物体的空肠中。使动物从手术中恢复，然后通过空肠插管将媒介物或Trobix生物噬菌体直接施用到胃肠道中，每天一次，连续三天。然后腹膜内注射CPT-11(50mg/kg/天)或盐水，连续10天。
每天监测大鼠的腹泻体征、体重和食品消耗。
使用范围为0至3的腹泻严重程度对指数进行分级：
0-指示固体粪便(即，正常大便)
1-表示轻微湿润和软便(轻微腹泻)
2-指示湿润和未成形的粪便，伴有皮毛中等的肛周染色(中等腹泻)
3-指示水样便，伴有皮毛严重肛周染色(严重腹泻)
在研究结束时，处死后，收获并固定空肠、回肠和结肠样本。将制备的载玻片染色用于组织病理学评价。
实施例6
代谢GUS的药物体外和体内实验
被人UGT酶代谢并且被微生物组GUS酶潜在地影响的药物的示例以及它们的治疗类别在以上表1中详细描述。
对以下GUS底物药物中的每一者进行如实施例4和5中对伊立替康所述的体外细胞毒性测定和体内动物研究：阿巴卡书、阿西美辛、对乙酰氨基酚、安贝生坦、双氢青蒿素、阿塞那平、阿托伐他汀、阿昔替尼、比克替拉韦、丁丙诺啡、卡格列净、坎地沙坦、坎地沙坦西酯、卡马西平、鹅去氧胆酸、氯氮平、可待因、赛庚啶、达比加群酯、达格列净、去铁酮、德拉沙星、双氯芬酸、二氟苯水杨酸、多替拉韦钠、艾曲波帕、恩西地平、恩他卡朋、表柔比星、埃罗替尼、埃格列净、雌二醇、雌二醇乙酸酯、苯甲酸雌二醇、环戊丙酸雌二醇、二庚酸雌二醇、戊酸雌二醇、依托度酸、依托泊苷、依泽替米贝、依佐加滨、氟硝西泮、氟比洛芬、氟伐他汀、格卡瑞韦、氟哌啶醇、氢吗啡酮、布洛芬、咪达那新、茚达特罗、吲哚美辛、厄贝沙坦、伊立替康、艾沙康唑、酚派丙酮、拉莫三嗪、莱特莫韦、利克飞龙、劳拉西泮、氯沙坦、洛伐他汀、罗美昔布、咪达唑仑、米格列奈、吗啡；硫酸吗啡、莫格他唑、麦考酚酸莫酯、麦考酚酸、纳地美定、纳美芬、纳曲酮、萘普生、那格列奈、氯羟氧二氮卓、帕立骨化醇、哌仑他韦、匹伐他汀、丙泊酚、雷特格韦、瑞戈非尼、利福平、卢卡帕尼、塞曲司特、西洛多辛、辛伐他汀、索拉非尼、磺胺甲噁唑、舒洛芬、他莫昔芬、他喷他多、丙酸睾酮、托匹司他、三氟拉嗪、曲格列酮、伐地美生、伐地考昔、丙戊酸、扎托布洛芬、齐多夫定或齐留通，也公开在表1中。
下表3在所附序列表中列出了本公开所公开的所有序列：
表3：本公开的序列
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Claims (60)

1.一种用于通过修饰靶细胞和/或包含所述靶细胞的细胞群体来调节药物代谢的系统，包含：
(a)至少一种药物代谢调节组分，所述至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，所述至少一种核酸序列编码和/或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；和
(b)至少一种选择性组分，所述至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区，其中所述至少一个原间隔区被(a)的所述CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，从而灭活所述选择性组分。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述调节组分包含在至少一种递送媒介物中，所述至少一种递送媒介物特异性靶向所述细胞和/或细胞群体中的所述细胞。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述选择性组分包含在至少一种递送媒介物中，所述至少一种递送媒介物特异性靶向所述细胞和/或细胞群体中的所述细胞，所述选择性组分包含影响细胞活力和/或活性的至少一种试剂。
4.根据权利要求2和3中任一项所述的系统，其中所述至少一种递送媒介物是或包含至少一种遗传元件，所述遗传元件是包含和/或编码所述调节组分和/或选择性组分以及它们的任何组合或混合物中的至少一者的以下项中的至少一者：至少一种转导颗粒、至少一种细菌噬菌体或其任何片段或部分、至少一种基于细菌噬菌体或细菌噬菌体样的转导颗粒和/或至少一种经修饰的细菌噬菌体、至少一种载体、质粒和/或构建体。
5.根据权利要求3至4中任一项所述的系统，其中所述递送媒介物是至少一种细菌噬菌体或任何细菌噬菌体样或基于细菌噬菌体的转导颗粒，所述至少一种细菌噬菌体或任何细菌噬菌体样或基于细菌噬菌体的转导颗粒包含和/或编码杀死细菌细胞或破坏、减弱和/或抑制细菌生长和/或功能的至少一种毒性元素。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的系统，其中所述靶细胞是细菌细胞，并且其中所述细菌细胞和/或细胞群体是或包含在肠道微生物组细胞群体中，所述细胞群体包含变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门和门中的至少一种细菌或分离物的任何突变体、变体或它们的任何组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的系统，其中所述药物代谢调节组分影响所述药物的所述活性、生物利用度、清除、稳定性、毒性和吸收中的至少一者。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的系统，其中参与所述至少一种药物的所述代谢的所述元件是至少一种葡糖苷酸酶。
9.根据权利要求8所述的系统，其中所述至少一种葡糖苷酸酶是至少一种β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述调节组分包含编码抑制和/或降低至少一种βGUS酶的表达和/或活性和/或稳定性的至少一种元件的核酸序列。
11.根据权利要求10所述的系统，其中由所述调节组分的所述核酸序列编码的所述元件抑制所述βGUS酶的转录，任选地，其中所述元件是Gus阻遏物(GusR)。
12.根据权利要求11所述的系统，其中所述GusR对至少一种GUS配体和/或底物表现出降低的或消除的亲和力。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述GusR在以下项中的至少一者中携带至少一个突变：
赖氨酸(K)125至丙氨酸(A)，酪氨酸(Y)164至苯丙氨酸(F)，和精氨酸(R)73至丙氨酸(A)，以及它们的任何组合。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的系统，其中所述至少一种药物是抗肿瘤剂、抗病毒剂、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、镇痛剂、抗高血压剂、抗疟剂、神经阻滞剂、降胆固醇剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、胆汁酸、抗凝血剂、铁螯合剂、抗菌剂、造血生长因子、抗震颤麻痹剂、激素、中枢神经系统抑制剂、抗胆碱能剂、副交感神经阻断剂、免疫抑制剂、阿片类解毒剂、抗哮喘剂、抗良性前列腺增生剂或抗痛风剂中的任一者。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述药物是至少一种抗肿瘤剂，任选地，至少一种拓扑异构酶I抑制剂。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述药物是至少一种拓扑异构酶I抑制剂，并且其中所述拓扑异构酶I抑制剂是喜树碱-11(CPT-11，伊立替康)或其任何衍生物、代谢物或生物相似物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的系统，其中所述药物代谢调节组分抑制或降低所述CPT-11的非活性代谢物即SN38葡糖苷酸(SN38G)通过细菌GUS再活化和/或转化为所述CPT-11的活性代谢物即SN38。
18.一种用于调节靶细胞和/或包含所述靶细胞的细胞群体的药物代谢的方法，所述方法包括以下项中的至少一者：
(a)使所述细胞或包含所述细胞的任何细胞群体与至少一种药物代谢调节组分接触，所述至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种CRISPR阵列，所述至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；以及
(b)使所述细胞或包含所述细胞的任何细胞群体与包含至少一个原间隔区的至少一种选择性组分接触，其中所述至少一个原间隔区被(a)的所述CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分：
从而调节所述细菌细胞的药物代谢和/或获得对至少一种药物表现出经修饰的代谢的细菌细胞群体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述调节组分包含在至少一种递送媒介物中，所述至少一种递送媒介物特异性靶向所述细胞和/或细胞群体中的所述细胞。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述选择性组分包含在至少一种递送媒介物中，所述至少一种递送媒介物特异性靶向所述细胞和/或细菌细胞群体中的所述细胞，所述选择性组分包含影响细胞活力和/或活性的至少一种试剂。
21.根据权利要求20中任一项所述的方法，其中所述至少一种递送媒介物是或包含至少一种遗传元件，所述遗传元件是包含和/或编码所述调节组分和/或选择性组分以及它们的任何组合或混合物中的至少一者的以下项中的至少一者：至少一种转导颗粒、至少一种细菌噬菌体或其任何片段或部分、至少一种基于细菌噬菌体或细菌噬菌体样的转导颗粒和/或至少一种经修饰的细菌噬菌体、至少一种载体、质粒和/或构建体。
22.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中所述递送媒介物是至少一种细菌噬菌体或任何细菌噬菌体样或基于细菌噬菌体的转导颗粒，所述至少一种细菌噬菌体或任何细菌噬菌体样或基于细菌噬菌体的转导颗粒包含和/或编码杀死细菌细胞或破坏、减弱和/或抑制细菌生长和/或功能的至少一种毒性元素。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是细菌细胞，并且其中所述细菌细胞和/或细胞群体是或包含在肠道微生物组细胞群体中，所述细胞群体包含厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门中的至少一种细菌或分离物的任何突变体、变体或它们的任何组合。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的方法，其中所述药物代谢调节组分影响所述药物的所述活性、生物利用度、清除、稳定性、毒性和吸收中的至少一者。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中参与所述至少一种药物的所述代谢的所述元件是至少一种葡糖苷酸酶。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一种葡糖苷酸酶是至少一种β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述调节组分包含编码抑制和/或降低至少一种β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的表达和/或活性和/或稳定性的至少一种元件的核酸序列。
28.根据权利要求27所述的方法，由所述调节组分的所述核酸序列编码的元件抑制所述βGUS酶的转录，任选地，其中所述元件是Gus阻遏物(GusR)。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述GusR对至少一种GUS配体和/或底物表现出降低的或消除的亲和力。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述GusR在以下项中的至少一者中携带至少一个突变：
赖氨酸(K)125至丙氨酸(A)，酪氨酸(Y)164至苯丙氨酸(F)，和精氨酸(R)73至丙氨酸(A)，以及它们的任何组合。
31.根据权利要求18至30中任一项所述的方法，其中所述至少一种药物是抗肿瘤剂、抗病毒剂、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、镇痛剂、抗高血压剂、抗疟剂、神经阻滞剂、降胆固醇剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、胆汁酸、抗凝血剂、铁螯合剂、抗菌剂、造血生长因子、抗震颤麻痹剂、激素、中枢神经系统抑制剂、抗胆碱能剂、副交感神经阻断剂、免疫抑制剂、阿片类解毒剂、抗哮喘剂、抗良性前列腺增生剂或抗痛风剂中的任一者。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述药物是至少一种抗肿瘤剂，任选地，至少一种拓扑异构酶I抑制剂。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述药物是至少一种拓扑异构酶I抑制剂，并且其中所述拓扑异构酶I抑制剂是喜树碱-11(CPT-11，伊立替康)或其任何衍生物、代谢物或生物相似物。
34.根据权利要求18至33中任一项所述的方法，其中所述药物代谢调节组分抑制或降低所述CPT-11的非活性代谢物通过细菌GUS再活化和/或转化。
35.根据权利要求18至34中任一项所述的方法，其中将步骤(b)重复至少两次以富集表现出至少一种药物的经调节代谢的所述经修饰的细胞群体。
36.至少一种细胞和/或所述细胞的群体，或它们的任何组合物或产品，表现出至少一种药物的经修饰的代谢，其中所述细胞和/或细胞群体通过包括以下项中的至少一者的方法制备：
(a)使所述细胞或包含所述细胞的任何细胞群体与至少一种药物代谢调节组分接触，所述至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种CRISPR阵列，所述至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；以及
(b)使所述细胞或包含所述细胞的任何细胞群体与包含至少一个原间隔区的至少一种选择性组分接触，其中所述至少一个原间隔区被(a)的所述CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分。
37.根据权利要求36所述的细胞和/或包含所述细胞的群体，其中所述细胞或群体通过根据权利要求18至35中任一项所述的方法制备。
38.根据权利要求36至37中任一项所述的细胞和/或包含所述细胞的群体，其中所述调节组分包含编码抑制和/或降低至少一种β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的表达和/或活性和/或稳定性的至少一种元件的核酸序列。
39.根据权利要求38所述的细胞和/或包含所述细胞的群体，由所述调节组分的所述核酸序列编码的元件抑制所述βGUS酶的转录，任选地，其中所述元件是GusR。
40.根据权利要求39所述的细胞和/或包含所述细胞的群体，其中所述GusR对至少一种GUS配体和/或底物表现出降低的或消除的亲和力，任选地，其中所述GusR在以下项的至少一者中携带至少一个突变：
赖氨酸(K)125至丙氨酸(A)，酪氨酸(Y)164至苯丙氨酸(F)，和精氨酸(R)73至丙氨酸(A)，以及它们的任何组合。
41.根据权利要求36至40中任一项所述的细胞和/或包含所述细胞的群体，其中所述药物是至少一种抗肿瘤剂，任选地，至少一种拓扑异构酶I抑制剂。
42.根据权利要求41所述的细胞和/或包含所述细胞的群体，其中所述药物是至少一种拓扑异构酶I抑制剂，并且其中所述拓扑异构酶I抑制剂是喜树碱-11(CPT-11，伊立替康)或其任何衍生物、代谢物和生物相似物。
43.根据权利要求42所述的细胞和/或包含所述细胞的群体，其中所述细胞表现出抑制的或降低的所述CPT-11的非活性代谢物即SN38G通过GUS再活化和/或转化为所述CPT-11的活性代谢物即SN38。
44.一种药物组合物或试剂盒，包含：
(I)至少一种药物；和以下项中的至少一者：
(II)至少一种药物代谢调节系统，所述至少一种药物代谢调节系统包含以下项中的至少一者：
(a)至少一种药物代谢调节组分，所述至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，所述至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；和
(b)至少一种选择性组分，所述至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区，其中所述至少一个原间隔区被(a)的所述CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分：和
(III)至少一种细菌细胞和/或所述细菌细胞的群体，或它们的任何组合物或产物，表现出所述至少一种药物的经修饰的代谢；
所述组合物任选地进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和添加剂中的至少一者。
45.根据权利要求34所述的药物组合物或试剂盒，其中所述系统根据权利要求1至17中任一项所述，并且其中所述细胞或细胞群体根据权利要求36至43中任一项所述。
46.根据权利要求44至45中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其中所述至少一种药物是抗肿瘤剂、抗病毒剂、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、镇痛剂、抗高血压剂、抗疟剂、神经阻滞剂、降胆固醇剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、胆汁酸、抗凝血剂、铁螯合剂、抗菌剂、造血生长因子、抗震颤麻痹剂、激素、中枢神经系统抑制剂、抗胆碱能剂、副交感神经阻断剂、免疫抑制剂、阿片类解毒剂、抗哮喘剂、抗良性前列腺增生剂或抗痛风剂中的任一者。
47.根据权利要求46所述的药物组合物或试剂盒，其中所述药物是至少一种抗肿瘤剂，任选地，至少一种拓扑异构酶I抑制剂。
48.根据权利要求47所述的药物组合物，其中所述药物是喜树碱-11(CPT-11，伊立替康)或其任何衍生物、代谢物和生物相似物。
49.一种用于调节有此需要的受试者的至少一种药物的代谢的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下项中的至少一者的步骤：
(I)至少一种药物代谢调节系统，所述至少一种药物代谢调节系统包含以下项中的至少一者：
(a)至少一种药物代谢调节组分，所述至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，所述至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件；和
(b)至少一种选择性组分，所述至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区，其中所述至少一个原间隔区被(a)的所述CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分；
(II)至少一种细胞和/或所述细胞的群体，或它们的任何组合物或产物，表现出所述至少一种药物的经修饰的代谢；
(III)至少一种组合物、试剂盒或系统，所述至少一种组合物、试剂盒或系统包含(I)和(II)中的至少一者；和
(IV)所述(I)、(II)和(III)中的至少一者与所述至少一种药物的任何组合。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述系统根据权利要求2至17中任一项所述，所述细胞或细胞群体根据权利要求36至43中任一项所述，并且所述组合物根据权利要求44至48中任一项所述。
51.一种用于治疗、预防、改善、降低或延迟有此需要的受试者的至少一种病理性病患的发作的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种药物和以下项中的至少一者的步骤：
(I)至少一种药物代谢调节系统，所述至少一种药物代谢调节系统包含以下项中的至少一者：
(a)至少一种药物代谢调节组分，所述至少一种药物代谢调节组分包含至少一种核酸序列、至少一种cas基因和至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)阵列，所述至少一种核酸序列编码或调节参与至少一种药物的代谢的至少一种元件：和
(b)至少一种选择性组分，所述至少一种选择性组分包含至少一个原间隔区，其中所述至少一个原间隔区被(a)的所述CRISPR阵列的至少一个间隔区靶向，以灭活所述选择性组分；
(II)至少一种细菌细胞和/或所述细菌细胞的群体，或它们的任何组合物或产物，表现出所述至少一种药物的经修饰的代谢；
(III)至少一种组合物、试剂盒或系统，所述至少一种组合物、试剂盒或系统包含(I)和(II)中的至少一者；和
(IV)所述(I)、(II)和(III)中的至少一者与所述至少一种药物的任何组合。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述系统根据权利要求2至17中任一项所述，所述细胞或细胞群体根据权利要求36至43中任一项所述，并且所述组合物或试剂盒根据权利要求44至48中任一项所述。
53.根据权利要求51和52中任一项所述的方法，其中所述病理性病患是肿瘤性病患、病毒感染、炎性病患、免疫细胞介导的病患、代谢病患和自体免疫病患中的至少一者。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所述至少一种药物是抗肿瘤剂、抗病毒剂、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、镇痛剂、抗高血压剂、抗疟剂、神经阻滞剂、降胆固醇剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、胆汁酸、抗凝血剂、铁螯合剂、抗菌剂、造血生长因子、抗震颤麻痹剂、激素、中枢神经系统抑制剂、抗胆碱能剂、副交感神经阻断剂、免疫抑制剂、阿片类解毒剂、抗哮喘剂、抗良性前列腺增生剂或抗痛风剂中的任一者。
55.根据权利要求51至54中任一项所述的方法，其中所述受试者患有至少一种肿瘤性病患。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述药物是至少一种抗肿瘤剂，任选地，至少一种拓扑异构酶I抑制剂。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述药物是至少一种拓扑异构酶I抑制剂，并且其中所述拓扑异构酶I抑制剂是喜树碱-11(CPT-11，伊立替康)或其任何衍生物。
58.根据权利要求51至57中任一项所述的方法，其中由所述调节组分的所述核酸序列编码的所述元件抑制所述βGUS酶的转录，任选地，所述元件是Gus阻遏物(GusR)。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述GusR对至少一种GUS配体和/或底物表现出降低的或消除的亲和力。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述GusR在以下项中的至少一者中携带至少一个突变：
赖氨酸(K)125至丙氨酸(A)，酪氨酸(Y)164至苯丙氨酸(F)，和精氨酸(R)73至丙氨酸(A)，以及它们的任何组合。
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