CN118201962A - 使用HLA-A2/WT1xCD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂治疗癌症 - Google Patents
使用HLA-A2/WT1xCD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂治疗癌症 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及癌症的治疗，特别地涉及使用HLA‑A2/WT1x CD3双特异性抗体和4‑1BB(CD137)激动剂对癌症的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及癌症的治疗，特别地涉及使用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂对癌症的治疗。
背景技术
T细胞活化双特异性抗体是一类有前景的癌症疗法，旨在让细胞毒性T细胞对抗肿瘤细胞。这种抗体与T细胞上的CD3以及与肿瘤细胞上表达的抗原的同时结合将迫使肿瘤细胞与T细胞之间产生暂时的相互作用，从而引起T细胞的活化和随后的肿瘤细胞的裂解。
WT1(Wilms肿瘤1，Wilms肿瘤蛋白)是一种致癌转录因子，涉及细胞增殖、分化以及细胞凋亡和器官发育，其在正常成人组织中的表达很少(Hinrichs和Restifo，NatBiotechnol(2013)31,999-1008)。然而，据报道，WT1在几种类型的血液恶性肿瘤和广泛的实体瘤中过度表达(Van Driessche等人，Oncologist(2012)17,250-259)。WT1为核蛋白，位于细胞内。细胞内蛋白质可以在蛋白酶体中降解，加工并通过主要组织相容性复合体(MHC)I作为T细胞表位呈递在细胞表面上，并由T细胞受体(TCR)识别。因此，WT1衍生肽在HLA-A2环境中呈递在细胞表面上，并且可以触发T细胞识别。
WO 2019/122052中已经描述靶向HLA-A2/WT1的T细胞活化双特异性抗体。此类T细胞活化双特异性抗体可用于例如治疗急性骨髓性白血病(AML)。HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体("WT1-TCB")目前正在复发性/难治性(r/r)AML患者的I期临床试验中进行研究(Augsberger等人,Blood(2021)doi:10.1182/blood.2020010477；NCT04580121)。
针对基于T细胞的免疫疗法的可能的免疫逃逸机制是由骨髓的肿瘤微环境(TME)通过共抑制T细胞或基质细胞，保护白血病细胞免受免疫效应细胞的影响并减少T细胞活化。
为了最大限度地提高HLA-A2/WT1靶向T细胞活化抗体的治疗效果，例如在AML中，因此需要克服TME的免疫抑制作用。
具体实施方式
本发明通过HLA-A2/WT1靶向T细胞活化双特异性抗体与向T细胞提供正性共刺激信号(4-1BBL)的4-1BB(CD137)激动剂(特别地为靶向诸如成纤维细胞活化蛋白(FAP)的基质抗原的4-1BB(CD137)激动剂)的组合治疗，来克服TME的上述免疫抑制作用并增强T细胞反应。在白血病细胞重新调节骨髓生态位后，FAP在癌症相关成纤维细胞上被上调，且因此4-1BB(CD137)激动剂的FAP特异性提供了严格限制于肿瘤生态位的T细胞共刺激。
本发明人已发现，与单独使用HLA-A2/WT1靶向T细胞活化双特异性抗体相比，HLA-A2/WT1靶向T细胞活化双特异性抗体与4-1BB(CD137)激动剂的组合导致在AML中的活性增强。
使用原发性AML细胞，发明人惊奇地发现，在表达FAP的成纤维细胞存在下由HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体诱导的肿瘤细胞裂解不仅得到恢复，甚至通过添加4-1BB激动剂FAP-4-1BBL而增强。
因此，在第一方面，本发明提供了一种在个体的癌症的治疗中供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体，其中该治疗包括施用HLA-A2/WT1x CD3双特异性抗体与4-1BB(CD137)激动剂的组合。
在进一步的方面，本发明提供了一种在个体的癌症的治疗中供使用的4-1BB(CD137)激动剂，其中该治疗包括施用4-1BB(CD137)激动剂与HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的组合。
在一个方面，本发明提供了HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体在制造用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中该治疗包括施用HLA-A2/WT1x CD3双特异性抗体与4-1BB(CD137)激动剂的组合。
在进一步的方面，本发明提供了4-1BB(CD137)激动剂在制造用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中该治疗包括施用4-1BB(CD137)激动剂与HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的组合。
在又一个方面，本发明提供了一种用于治疗个体的癌症的方法，该方法包括向该个体施用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂。
在一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括含有HLA-A2/WT1x CD3双特异性抗体的第一药物和含有4-1BB(CD137)激动剂的第二药物，并且任选地进一步包括包装插页，该包装插页包括针对施用第一药物与第二药物的组合以用于治疗个体的癌症的说明。
上述和本文所述的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、4-1BB(CD137)激动剂、方法、用途或试剂盒可以单独地或组合地包含下文描述的任何特征(除非上下文另有说明)。
本文中的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体是特异性结合CD3和HLA-A2/WT1、特别是HLA-A2/WT1RMF的双特异性抗体。本发明中特别有用的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体描述于例如在PCT出版物号：WO 2019/122052(其全文以引用方式并入本文)。
术语“双特异性”意指该抗体能够特异性结合至少两种独特的抗原决定簇。典型地，双特异性抗体包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每一个对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些方面，该双特异性抗体能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。在一个方面，抗原结合部分能够将其所附接的实体(例如第二抗原结合部分)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞。在另一个方面，抗原结合部分能够通过其靶抗原(例如T细胞受体复合物抗原)激活信号传导。抗原结合部分包括如本文进一步定义的抗体及其片段。特定的抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些方面，所述抗原结合部分可以包含如本文进一步定义的和本领域已知的抗体恒定区。可用的重链恒定区包括以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下两种同种型中的任一种：κ和λ。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个方面，抗原结合部分与不相关蛋白质的结合程度小于该抗原结合部分与抗原的结合程度的约10％，如例如通过SPR所测得的。在某些方面，与抗原结合的抗原结合部分，或包含该抗原结合部分的抗体具有以下解离常数(KD)：≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)。
“亲和力”是指分子(例如，受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，该固有结合亲和力反映了结合对(例如，抗原结合部分与抗原，或者受体与其配体)的成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域中已知的完善确立的方法(包括本文所述的那些方法)来测量。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
除非另外指明，否则“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工CD3，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个方面，CD3是人CD3，特别是人CD3的ε亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列以UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(144版)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1示出。还可参阅SEQ ID NO:27。食蟹猴[Macaca fascicularis]CD3ε的氨基酸序列以NCBI GenBank号BAB71849.1示出。还可参阅SEQ ID NO:28。
除非另外指明，“WT1”，也称为“Wilms肿瘤1”或“Wilms肿瘤蛋白质”，是指来自任何脊椎动物的任何原生WT1，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人类)、非人类灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工WT1，以及通过细胞中加工产生的任何形式的WT1。该术语还涵盖WT1的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个方面，WT1是人WT1，特别是SEQ ID NO:23的蛋白质。人WT1描述于UniProt(www.uniprot.org)登录号P19544(条目版本215)中，且人WT1的氨基酸序列也示于SEQ IDNO:23中。
“VLD”、“VLD肽”或“WT1VLD”意指具有氨基酸序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO:24；SEQ IDNO:23的WT1蛋白质的位置37-45)的WT1衍生肽。
“RMF”、“RMF肽”或“WT1RMF”意指具有氨基酸序列RMFRNAPYL(SEQ ID NO:25；SEQ IDNO:23的WT1蛋白质的位置126-134)的WT1衍生肽。
“HLA-A2”、“HLA-A*02”、“HLA-A02”或“HLA-A*2”(可互换使用)是指HLA-A血清型组中的人白细胞抗原血清型。HLA-A2蛋白(由各自的HLA基因编码)构成各自的I类MHC(主要组织相容性复合体)蛋白质的α链，其进一步包含β2微球蛋白亚基。具体的HLA-A2蛋白是HLA-A201(也称为HLA-A0201、HLA-A02.01或HLA-A*02:01)。在具体方面，本文所述的HLA-A2蛋白是HLA-A201。人HLA-A2的示例性序列在SEQ ID NO:26中给出。
“HLA-A2/WT1”是指HLA-A2分子和WT1衍生肽(本文也称为“WT1肽”)，具体是RMF或VLD肽(分别为“HLA-A2/WT1RMF”和“HLA-A2/WT1VLD”)的复合物。本发明中使用的双特异性抗体可以与HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD复合物特异性结合。
如本文所用，关于Fab分子等的术语“第一”、“第二”或“第三”在每种类型的部分多于一种时用于方便区分。除非明确说明，否则使用这些术语并不旨在赋予所述双特异性抗体特定的次序或取向。
如本文所用，术语“价”表示在抗体中存在指定数目的抗原结合位点。因此，术语“与抗原单价结合”表示在抗体中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，其包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，该分子包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参阅Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参阅例如Plückthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269至第315页(1994)；还可参阅WO 93/16185以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参阅美国专利号5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参阅例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人,Proc Natl Acad SciUSA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人,Nat Med9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些方面，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参阅例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化，以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参阅例如，Kindt等人,KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。如本文所用，与可变区序列有关的“Kabat编号”是指由Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和恒定结构域的氨基酸位置根据Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统进行编号，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”。具体地讲，将Kabat编号系统(参阅Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647页至第660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat EU索引编号系统(参阅第661页至第723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，这在本文中通过在此种情况下称为“根据Kabat EU索引编号”来进一步阐明。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并且确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。一般来讲，抗体包含六个CDR；三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，并且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)出现在以下氨基酸残基处的高可变环：26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))处发生的CDR；以及
(c)出现在以下氨基酸残基处的抗原接触点：27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)以及93-101(H3)(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另外指明，否则CDR根据出处同上的Kabat等人所述的方法确定。本领域的技术人员将理解，CDR名称也可以根据出处同上的Chothia所述的方法、出处同上的McCallum所述的方法或者任何其他在科学上接受的命名系统来确定。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常在VH(或VL)中以如下次序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白质。
所谓“交叉”Fab分子(也称为“Crossfab”)，意指以下Fab分子：其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域发生交换(即互相替换)，即交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1构成的肽链(VL-CH1，在N末端至C末端方向)，以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL构成的肽链(VH-CL，在N末端至C末端方向)。为清楚起见，在其中Fab轻链的可变结构域和Fab重链的可变结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。相反地，在其中Fab轻链的恒定结构域和Fab重链的恒定结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链可变结构域VH的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。
与之相比，所谓“常规”Fab分子，意指处于其天然形式的Fab分子，即，包含由重链可变结构域和恒定结构域构成的重链(VH-CH1，在N末端至C末端方向)，以及由轻链可变结构域和恒定结构域构成的轻链(VL-CL，在N末端至C末端方向)。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链构成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变区)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类型中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链C末端的一个或多个(特别是一个或两个)氨基酸的翻译后裂解。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子所产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的经切割变体。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引编号)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或可以不存在。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)来编号的，如在Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991(还可参阅上文)中所述。如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，“促进缔合的修饰”特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，这在融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合部分)不相同的意义上可能是不同的。在一些方面，所述促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在特定方面，所述促进缔合的修饰在Fc结构域的两个亚基中的每个亚基中包含单独的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列一致性％的值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective proteinsequence comparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人,(1997)Genomics 46:24-36,并且可公开地从http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml获得。或者，可以使用可在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出比对标头中给出氨基酸同一性百分比。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体：其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
“降低的结合”(例如降低的与Fc受体的结合)是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
所谓“融合”，意指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接地或经由一个或多个肽接头通过肽键链接。
HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第一抗原结合部分，以及与HLA-A2/WT1(特别地HLA-A2/WT1RMF)特异性结合的第二抗原结合部分。
在一个方面，第一抗原结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3；以及轻链可变区，其包含SEQ IDNO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3。
在一个方面，第二抗原结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3；以及轻链可变区，其包含SEQ IDNO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3。
在特定方面，该HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体包含
(i)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分与CD3特异性结合并且包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3；以及
(ii)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分与HLA-A2/WT1特异性结合并且包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3；该轻链可变区包含SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3。
在一个方面，所述第一抗原结合部分包含：与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个方面，所述第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQID NO:8的轻链可变区序列。
在一个方面，第二抗原结合部分包含：与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个方面，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ IDNO:16的轻链可变区序列。
在一些方面，所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分是Fab分子。在一些方面，所述第一抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区发生交换。在此类方面，第二抗原结合部分优选地是常规的Fab分子。
在其中所述双特异性抗体的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分都是Fab分子的一些方面，并且在所述抗原结合部分之一(特别是第一抗原结合部分)中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH互相替换，
i)在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)；或者
ii)在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
所述双特异性抗体不包含在i)和ii)中提及的两种修饰。具有VH/VL交换的抗原结合部分的恒定结构域CL和CH1不互相替换(即保持未交换)。
在一个更具体的方面，
i)在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)；或者
ii)在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个这样的方面，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在进一步的方面，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在优选方面中，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)；并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)，且位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)；并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)，且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)；并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)，且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在特定方面，如果根据上述方面的氨基酸取代在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行，则所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL是κ同种型。
在一些方面，该第一抗原结合部分和该第二抗原结合部分彼此融合，任选地经由肽接头融合。
在一些方面，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自为Fab分子并且(i)所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N端，或(ii)所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C端处融合至所述第二抗原结合部分的所述Fab重链的N端。
在一些方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体提供了与CD3的单价结合。
在特定方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体包含与CD3特异性结合的单个抗原结合部分，以及与HLA-A2/WT1特异性结合的两个抗原结合部分。因此，在一些方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体包含与HLA-A2/WT1特异性结合的第三抗原结合部分，特别是Fab分子，更特别是常规Fab分子。第三抗原结合部分可以单独或组合地并入本文描述的与第二抗原结合部分相关的所有特征(例如CDR序列、可变区序列和/或恒定区中的氨基酸取代)。在一些方面，第三抗原部分与第一抗原结合部分相同(例如也是常规Fab分子并且包含相同的氨基酸序列)。
在特定方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体进一步包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。在一个方面，Fc结构域是IgG Fc结构域。在特定方面，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个方面，所述Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在一个更具体的方面，所述Fc结构域是在位置S228(Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代(特别是氨基酸取代S228P)的IgG4Fc结构域。该氨基酸取代减少IgG4抗体的体内Fab臂交换(参阅Stubenrauch等人,DrugMetabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一个特定方面，Fc结构域是人Fc结构域。在特别优选的方面，Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。人IgG1 Fc区的示例性序列以SEQID NO:29给出。
在其中所述第一抗原结合部分、所述第二抗原结合部分和(在存在时的)所述第三抗原结合部分各自为Fab分子的一些方面，(a)(i)所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N端，并且所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端，或(ii)所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处融合至所述第二抗原结合部分的所述Fab重链的N末端，并且所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处融合至所述Fc结构域的第一亚基的N端；并且(b)所述第三抗原结合部分(在存在时的)在所述Fab重链的C末端处融合至所述Fc结构域的第二亚基的N末端。
在特定方面，所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在CH3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰是在Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体方面，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰是所谓的“杵臼结构”修饰，其包括Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的“臼”修饰。杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一些方面，所述Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内产生凸起，所述凸起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且所述Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的所述凸起可定位在所述空腔内。优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。
在一个具体的此类方面，在Fc结构域的第一亚基中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替换，并且在Fc结构域的第二亚基中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换，并且任选地，位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换，并且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换(根据Kabat EU索引编号)。在进一步的方面，在所述Fc结构域的第一亚基中，除此之外，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换)，并且在所述Fc结构域的第二亚基中，除此之外，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替换(根据Kabat EU索引编号)。在一个优选方面，所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一些方面，所述Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。
在特定方面，Fc受体为Fcγ受体。在一个方面，Fc受体是人Fc受体。在一个方面，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体方面，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，所述效应子功能为选自由以下项组成的组中的一种或多种：补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和细胞因子分泌。在特定方面，效应子功能为ADCC。
典型地，相同的一个或多个氨基酸取代存在于所述Fc结构域的两个亚基中的每个亚基中。在一个方面，所述一个或多个氨基酸取代降低了所述Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个方面，所述一个或多个氨基酸取代将所述Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。
在一个方面，所述Fc结构域在选自包括E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，所述Fc结构域在选自包括L234、L235和P329(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一些方面，所述Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个此类方面，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个方面，Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个方面，Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代，并且在选自E233、L234、L235、N297和P331(根据Kabat EU索引编号)的位置处包含另外的氨基酸取代。在一个更具体的方面，另外的氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定方面，所述Fc结构域在位置P329、L234和L235(根据Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代。在更特定的方面，所述Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地讲，在优选的方面，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，位置234处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L234A)，位置235处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L235A)，并且位置329处的脯氨酸残基被甘氨酸残基替换(P329G)(根据Kabat EU索引编号)。在一个此类方面，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。
在优选的方面中，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体包含
(i)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分特异性结合CD3并且包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ IDNO:6的LCDR3，其中第一抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区(特别是可变区)发生交换；
(ii)与HLA-A2/WT1特异性结合的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3，其中第二抗原结合部分和第三抗原结合部分各自为Fab分子，特别是常规Fab分子；
(iii)Fc结构域，其由第一亚基和第二亚基构成，
其中所述第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N末端，并且所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端融合至所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端，并且其中所述第三抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端。
在一个方面，所述第一抗原结合部分包含：与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个方面，所述第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQID NO:8的轻链可变区序列。
在一个方面，所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分包含：与SEQ IDNO:15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个方面，第二抗原结合部分和第三抗原结合部分包含SEQ ID NO:15的重链可变区和SEQ ID NO:16的轻链可变区。
根据上述方面的Fc结构域可以单独地或组合地结合上文关于Fc结构域描述的所有特征。
在一个方面，抗原结合部分和Fc区通过肽接头(特别是通过如以SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20所示的肽接头)彼此融合。
在一个方面，在(ii)下的所述第二Fab分子和所述第三Fab分子的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(特别是被精氨酸(R))取代(根据Kabat编号)；并且在(ii)下的所述第二Fab分子和所述第三Fab分子的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)，且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体包含以下多肽(特别是两种多肽)：包含的序列与SEQ ID NO:17的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；包含的序列与SEQ ID NO:18的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；包含的序列与SEQ ID NO:19的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；以及包含的序列与SEQ ID NO:20的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。
在一个方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体包含以下多肽(特别是两种多肽)：包含SEQ ID NO:17的序列的多肽、包含SEQ ID NO:18的序列的多肽、包含SEQ ID NO:19的序列的多肽，以及包含SEQ ID NO:20的序列的多肽。
本文的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体与4-1BB(CD137)激动剂组合使用。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“4-1BB”或“CD137”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然4-1BB，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工4-1BB，以及通过细胞中加工产生的任何形式的4-1BB。该术语还涵盖4-1BB的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。人4-1BB的氨基酸序列示出于UniProt登录号Q07011(条目版本185)。
“4-1BBL”或“4-1BB配体”或“CD137L”是共刺激TNF配体家族成员，能够共刺激T细胞的增殖和细胞因子产生。共刺激TNF家族配体可以在与其相应的TNF受体相互作用后共刺激TCR信号，并且与其受体的相互作用导致TNFR相关因子(TRAF)的募集，从而启动导致T细胞活化的信号级联反应。4-1BBL为II型跨膜蛋白。已经描述了具有显示于UniProt登录号P41273(条目版本153)的氨基酸序列的完整或全长度4-1BBL在细胞表面形成三聚体。三聚体的形成能通过4-1BBL胞外域的特定目的促成。所述目的在本文中被指定为“三聚化区域”。人4-1BBL序列(SEQ ID NO:30)的氨基酸50-254形成了4-1BBL的胞外域，但即使是其片段也能够形成三聚体。
“胞外域”为膜蛋白质延伸到细胞外空间(即细胞外的空间)的结构域，也称为“细胞外结构域”。如本文所定义的4-1BBL的胞外域是指4-1BBL蛋白质、特别地人4-1BBL蛋白质(UniProt登录号P41273(条目版本153))延伸至细胞外空间(细胞外结构域)的部分，但也包括负责三聚化和负责与相应受体4-1BB结合的较短部分或其片段。
因此，术语“4-1BBL的胞外域或其片段”是指4-1BBL的细胞外结构域结构域或其能够结合4-1BB并且能够三聚化的部分。在本发明的具体方面中，术语“4-1BBL胞外域或其片段”是指具有选自SEQ ID NO:34(人4-1BBL的氨基酸52-254)、SEQ ID NO:31(人4-1BBL的氨基酸71-254)、SEQ ID NO:33(人4-1BBL的氨基酸80-254)、SEQ ID NO:32(人4-1BBL的氨基酸85-254)、SEQ ID NO:35(人4-1BBL的氨基酸71-248)、SEQ ID NO:36(人4-1BBL的氨基酸85-248)、SEQ ID NO:37(人4-1BBL的氨基酸80-248)和SEQ ID NO:38(人4-1BBL的氨基酸52-248)的氨基酸序列的多肽。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指与抗原决定簇特异性结合的分子。抗原结合分子的示例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
“成纤维细胞活化蛋白(FAP)”也称为脯氨酰内肽酶FAP或Seprase(EC 3.4.21)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工FAP，以及通过细胞中加工产生的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。人FAP的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(条目版本197)中。人FAP的细胞外结构域(ECD)从氨基酸位置26处延伸至位置760处。如本文所用的结合FAP的抗原结合部分优选结合FAP的细胞外结构域。示例性抗FAP结合分子描述于例如PCT申请号第WO 2012/020006中。
本发明中特别有用的供使用的4-1BB(CD137)激动剂描述于例如在PCT申请号：WO2016/075278或PCT申请号：WO 2016/156291中(其全文以引用方式并入本文)。
在一个方面，4-1BB(CD137)激动剂包含4-1BBL(特别地人4-1BBL)或其片段，特别地4-1BBL的胞外域或其片段。在一个方面，4-1BB(CD137)激动剂包含4-1BBL的三个胞外域或其片段(即4-1BBL的第一胞外域、第二胞外域和第三胞外域或其片段)。在一个方面，4-1BBL的胞外域或其片段包含与选自由以下项组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。在一个方面，4-1BBL的胞外域或其片段包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，4-1BBL的胞外域或其片段包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列。在一个方面，4-1BBL的胞外域或其片段由SEQ ID NO:35的氨基酸序列组成。
在特定方面，4-1BB(CD137)激动剂是包含4-1BBL的三个胞外域或其片段的分子，其中4-1BBL的胞外域或其片段包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列(或由其组成)。
在一个方面，4-1BB(CD137)激动剂包含4-1BBL的三个胞外域或其片段(即，4-1BBL的第一胞外域、第二胞外域和第三胞外域或其片段)，其中4-1BBL的第一胞外域和第二胞外域或其片段彼此融合，任选地经由肽接头彼此融合(即，4-1BBL的第一胞外域和第二胞外域或其片段在同一多肽上)，以及4-1BBL的第三胞外域或其片段不与4-1BBL的第一胞外域或第二胞外域或其片段融合(即，4-1BBL的第三胞外域或其片段位于与4-1BBL的第一胞外域和第二胞外域或其片段分开的多肽上)。
在一个方面，4-1BB(CD137)激动剂为分子，该分子包含：包含4-1BBL的第一胞外域和第二胞外域或其片段的第一多肽，以及包含4-1BBL的第三胞外域或其片段的第二多肽。在一个方面，4-1BBL的第一胞外域和第二胞外域或其片段经由肽接头、特别地(G4S)2肽接头融合。在一个方面，第一多肽和第二多肽通过二硫键连接。在一个方面，第一多肽包含与SEQID NO:47的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，第一多肽包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一个方面，第二多肽包含与SEQ IDNO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，第二多肽包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在进一步的方面，4-1BB(CD137)激动剂包含特异性结合肿瘤相关抗原、特别地肿瘤基质抗原(即与肿瘤基质相关的抗原)、更特别地肿瘤成纤维细胞抗原(即，在癌症相关成纤维细胞上表达的抗原)的抗原结合部分。
在优选的方面，抗原结合部分特异性结合成纤维细胞活化蛋白(FAP)，特别地人FAP。
在一个方面，抗原结合部分是Fab分子，特别地常规Fab分子。
因此，在特定方面，4-1BB(CD137)激动剂是抗原结合分子，该抗原结合分子包含4-1BBL的三个胞外域或其片段，以及特异性结合肿瘤相关抗原的至少一个抗原结合部分，特别地特异性结合FAP的抗原结合部分。
在一个方面，特异性结合FAP的抗原结合部分包含：含有SEQ ID NO:39的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:40的HCDR2和SEQ ID NO:41的HCDR3的重链可变区(VH)；以及含有SEQID NO:42的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:43的LCDR2和SEQ ID NO:44的LCDR3的轻链可变区。
在一个方面，特异性结合FAP的抗原结合部分包含：与SEQ ID NO:45的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:46的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个方面，特异性结合FAP的抗原结合部分包含SEQ ID NO:45的重链可变区序列和SEQ ID NO:46的轻链可变区序列。
在进一步的方面，4-1BB(CD137)激动剂包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
包含在4-1BB(CD137)激动剂中的Fc结构域可以单独或组合地并入上文描述的与HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体中包含的Fc结构域有关的所有特征。
特别地，在一个方面，4-1BB(CD137)激动剂中包含的Fc结构域是IgG Fc结构域。在特定方面，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个特定方面，Fc结构域是人Fc结构域。在特别优选的方面，Fc结构域是人IgG1Fc结构域。
在特定方面，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰(诸如“杵臼结构”修饰)，如上文关于HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体所描述的。
在进一步特定的方面，Fc结构域包含减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代(诸如“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”氨基酸取代)，如上文关于HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体所描述的。
在特别优选的方面，4-1BB(CD137)激动剂中包含的Fc结构域是人IgG1 Fc结构域，其中Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，4-1BBL(CD137)激动剂为抗原结合分子，该抗原结合分子包含：
(i)4-1BBL的三个胞外域或其片段；
(ii)特异性结合FAP的抗原结合部分，特别地其中抗原结合部分是Fab分子；以及
(iii)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，特别地，其中Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰和/或减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。
在特定方面，4-1BBL(CD137)激动剂为抗原结合分子，该抗原结合分子包含
(i)4-1BBL的第一胞外域、第二胞外域和第三胞外域或其片段；
(ii)与FAP特异性结合的抗原结合部分，其中该抗原结合部分为Fab分子；
(iii)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，特别地，其中Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰和/或减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代；
(iv)CL结构域和CH1结构域；
其中抗原结合分子由以下所构成：
(a)第一多肽，其包含：(a1)4-1BBL的第一胞外域或其片段，其在C末端融合至4-1BBL的第二胞外域或其片段的N末端，(a2)4-1BBL的第二胞外域或其片段，其在C末端融合至CL结构域的N末端，(a3)CL结构域，其在C末端融合至Fc结构域的亚基中的一者(例如第一亚基)的N末端，和(a4)Fc结构域的亚基中的一者(例如第一亚基)；
(b)第二多肽，其包含：(b1)4-1BBL的第三胞外域或其片段，其在C末端融合至CH1结构域的N末端，和(b2)CH1结构域；
(c)第三多肽，其包含：(c1)Fab分子的重链，其在C末端融合至Fc结构域的亚基中的另一者(例如第二亚基)的N末端，和(c2)Fc结构域的亚基中的另一者(例如第二亚基)；以及
(d)第四多肽，其包含Fab分子的轻链。
抗原结合分子的各个结构域之间的融合优选地经由肽接头进行，肽接头还可以包含免疫球蛋白铰链区或由(部分)免疫球蛋白铰链区构成。特别地，4-1BBL的第一胞外域和第二胞外域或其片段是经由肽接头、特别地(G4S)2接头融合。
在一个方面，第一多肽和第二多肽通过二硫键，特别地CL结构域与CH1结构域之间的二硫键彼此连接。
在一个方面，在第一多肽的CL结构域中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)；并且在第二多肽的CH1结构域中，位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)，且位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，在第一多肽的CL结构域中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)；并且在第二多肽的CH1结构域中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)，且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在特定方面，在第一多肽的CL结构域中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)；并且在第二多肽的CH1结构域中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)，且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在特定方面，如果根据上述方面的氨基酸取代发生在第一多肽和第二多肽的CL和CH1结构域中，则第一多肽的CL结构域是κ同种型。
在一个方面，CL结构域为人CL结构域，特别地κ同种型的人CL结构域。在进一步的方面，CH1结构域为人CH1结构域，特别地γ同种型的人CH1结构域，最特别地γ1同种型的人CH1结构域。
在一个方面，第一多肽包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，第二多肽包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，第三多肽包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，第四多肽包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，4-1BBL(CD137)激动剂为抗原结合分子，该抗原结合分子包含：包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的第一多肽，包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的第二多肽，包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的第三多肽，包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的第四多肽。
在可选择的方面，4-1BB激动剂可以为抗4-1BB抗体，特别是抗FAP/抗4-1BB双特异性抗体。
术语“癌症”是指哺乳动物中通常以细胞增殖不受调控为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。癌症的更多非限制性示例包括血液癌症，诸如白血病、膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、胆道癌、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、肉瘤、骨癌和肾癌。其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经系统(中枢和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌转移。
在本发明的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、4-1BB(CD137)激动剂、方法、用途和试剂盒的一些方面，癌症是血液癌症。血液癌症的非限制性示例包括白血病(例如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL))、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤(MM))、骨髓增生异常综合征(MDS)和骨髓增生性疾病。
在某些方面，癌症选自由以下项组成的组：血液癌症(诸如白血病)、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌和前列腺癌。
在特定方面，癌症是血液癌症，特别地白血病，最特别地急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性骨髓性白血病(AML)。
在优选的方面，癌症是急性骨髓性白血病(AML)。
在进一步特定的方面，癌症是骨髓增生异常综合征(MDS)。
在一些方面，癌症是WT1阳性癌症。所谓“WT1阳性癌症”或“表达WT1的癌症”，意指以癌细胞中表达或过表达WT1为特征的癌症。WT1的表达可以例如通过定量实时PCR(测量WT1 mRNA水平)、免疫组织化学(IHC)或蛋白质印迹测定来确定。在一个方面，癌症表达WT1。在一个方面，如使用对WT1具有特异性的抗体通过免疫组织化学(IHC)确定的，癌症在至少20％、优选地至少50％或至少80％的肿瘤细胞中表达WT1。
在一些方面，癌症包含表达FAP的细胞(例如成纤维细胞)。在一些方面，癌症表达FAP，特别地在肿瘤基质中。
本文中的“患者”、“受试者”或“个体”是正在经历或已经历过癌症的一种或多种体征、症状或其他指标的有资格接受治疗的任何单个人类受试者。在一些方面，患者患有癌症或已被诊断患有癌症。患者可能先前已用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体或另一种药物治疗过，或者没有这样治疗过。在特定方面，患者之前没有用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体治疗过。在开始HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体疗法之前，患者可能已用包括一种或多种除HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体之外的药物的疗法治疗过。在特定方面，患者携带HLA-A2等位基因，特别地HLA-A*02:01等位基因。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体诸如治疗(treat)或治疗(treating))是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或可以在临床病理学过程中执行的临床干预措施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。
以有效量施用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂。
药剂(例如药物组合物)的“有效量”是指能够以必需的剂量在必需的时段内有效地实现期望的治疗或预防结果的量。
在一个方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的施用导致T细胞，特别是细胞毒性T细胞的活化，特别是在癌症部位处。所述活化可以包括T细胞增殖、T细胞分化、T细胞分泌细胞因子、从T细胞释放细胞毒性效应分子、T细胞的细胞毒性活性，以及T细胞表达活化标志物。在一个方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的施用导致T细胞，特别是癌症部位处的细胞毒性T细胞的数量增加。
在上文和此处所述的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、4-1BB(CD137)激动剂、方法、用途或试剂盒的一些方面，与单独施用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体或使用其治疗相比，用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂的治疗或施用导致T细胞、特别是细胞毒性T细胞、特别是在癌症部位处的活化增加。在特定方面，活化包括T细胞的细胞毒性活性(特别是癌细胞的裂解)和/或T细胞分泌细胞因子(特别是IL-2、TNF-α和/或干扰素-γ)。
在上文和此处所述的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、4-1BB(CD137)激动剂、方法、用途或试剂盒的一些方面，与单独施用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体或使用其治疗相比，用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂的治疗或施用导致初始T细胞向记忆T细胞、特别是在癌症部位处的增殖增加。在一个方面，通过测量CD45RA表达来检测分化，例如使用流式细胞术。
在上文和此处所述的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、4-1BB(CD137)激动剂、方法、用途或试剂盒的一些方面，用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂的治疗或施用可导致个体的反应。在一些方面，该反应可以是完全反应。在一些方面，该反应可以是治疗停止后的持续反应。在一些方面，该反应可以是在治疗停止后持续的完全反应。在其他方面，该反应可以是部分反应。在一些方面，该反应可以是在治疗停止后持续的部分反应。在一些方面，与用单独的HLA-A2/WT1x CD3双特异性抗体治疗或施用相比(即没有4-1BB(CD137)激动剂)，用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂治疗或施用可以改善反应。
在一些方面，与用单独的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体(即没有4-1BB(CD137)激动剂)治疗的相应患者群体相比，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂的治疗或施用可以增加患者群体的反应率。
本发明的组合疗法包括施用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂。
如本文所用，“组合(combination)”(及其语法变体诸如“组合(combine)”或“组合(combining)”)涵盖了根据本发明的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-a 1BB(CD137)激动剂的组合，其中HLA-A2/WT1x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂在相同或不同的容器中、在相同或不同的药物制剂中、一起施用或分开施用、同时施用或按顺序(以任何次序)施用，以及通过相同或不同的途径施用，前提是HLA-A2/WT1x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂可以同时在体内发挥其生物学作用。例如，将根据本发明的HLA-A2/WT1 xCD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂“组合”可以意指首先在特定的药物制剂中施用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体，之后在另一种药物制剂中施用4-1BB(CD137)激动剂，或将次序颠倒。
HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂可以以本领域已知的任何合适的方式施用。在一个方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂按顺序(在不同时间)施用。在另一个方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂同时(在相同时间)施用。不希望受理论的束缚，在HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体之前和/或与之同时施用4-1BB(CD137)激动剂可能是有利的。在一些方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体处于与4-1BB(CD137)激动剂分离的组合物中。在一些方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体处于与4-1BB(CD137)激动剂相同的组合物中。
HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂可以通过任何合适的途径施用，并且可以通过相同的施用途径或不同的施用途径施用。在一些方面，HLA-A2/WT1 xCD3双特异性抗体通过静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、透皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在特定方面，HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体静脉内施用。在一些方面，4-1BB(CD137)激动剂通过静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、透皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在特定方面，4-1BB(CD137)激动剂静脉内施用。可以施用有效量的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂来预防或治疗疾病。HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和/或4-1BB(CD137)激动剂的适当的施用途径和剂量可以基于以下各项来确定：待治疗的疾病类型、HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的类型、4-1BB(CD137)激动剂的类型、疾病的严重性和进程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的反应，以及主治医师的判断。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂适宜一次性地或在一系列治疗中施用于患者。
本发明的组合可以单独使用或连同其他药剂一起用于治疗。例如，本发明的组合可以与至少一种附加治疗剂共同施用。在某些方面，另外的治疗剂是抗癌剂，例如化疗剂、肿瘤细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞凋亡激活剂。本发明的组合还可以与放射疗法结合。
本文提供的试剂盒典型地包括一个或多个容器，以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。该容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是将用于本发明的组合中的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体。另一种活性剂是将用于本发明的组合中的4-1BB(CD137)激动剂，其可以与双特异性抗体在相同的组合物和容器中，或者可以在不同的组合物和容器中提供。该标签或包装插页指出组合物用于治疗所选择的病症，诸如癌症。
在一个方面，本发明提供了旨在用于治疗癌症的试剂盒，其包括在相同的容器或单独的容器中的(a)HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和(b)4-1BB(CD137)激动剂，并且任选地进一步包括(c)包装插页，该包装插页包括指导使用该组合治疗作为治疗癌症的方法的印刷说明。此外，该试剂盒可以包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中该组合物包含HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体；(b)其中装有组合物的第二容器，其中该组合物包含4-1BB(CD137)激动剂；以及任选地(c)其中装有组合物的第三容器，其中该组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的这些方面的试剂盒可以进一步包括包装插页，该包装插页指出组合物可以用于治疗癌症。替代性地或除此之外，所述试剂盒可以还包括第三(或第四)容器，所述容器装有药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。药盒可进一步包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
氨基酸序列
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附图说明
图1.(A)实例中使用的HLA-A2/WT1靶向T细胞双特异性(TCB)抗体分子的示意图(“WT1 TCB”)。该分子包含针对CD3的单个抗原结合部分、针对HLA-A2/WT1的两个抗原结合部分和Fc结构域。(B)实例中使用的FAP靶向4-1BB(CD137)激动剂的示意图(“FAP-4-1-BBL”)。该分子包含4-1BBL胞外域三聚体、针对FAP的抗原结合部分和Fc结构域。黑点：Fc结构域中促进异二聚体化的修饰。*：将具有相反电荷的氨基酸引入CH和CL结构域中。
图2.在表达不同水平的人FAP的NIH-3T3细胞系存在下，FAP-4-1BBL增强了WT1-TCB介导的特异性裂解HLA-A*02+AML细胞(n＝6)。柱条代表平均值±SEM。
图3.WT1-TCB与FAP-4-1BBL的组合中改善了T细胞增殖(n＝6)。柱条代表平均值±SEM。(A)CD3+T细胞增殖对比第0天，(B)CD8+T细胞增殖对比第0天，(C)CD4+T细胞增殖对比第0天。
图4.(A-B)在表达FAP的NIH-3T3细胞系存在下，WT1-TCB与FAP-4-1BBL的组合中CD3+T细胞上T细胞活化标志物CD25(A)和4-1BB(B)的表达增加。(C)WT1-TCB对PD-1的上调未被FAP-4-1BBL修饰(n＝6)。(D-F)WT1-TCB与FAP-4-1BBL的组合中粒酶B(D)、IFNγ(E)和TNFα(F)的分泌增加(n＝4)。柱条代表平均值±SEM。
图5.(A)使用WT1-TCB以及使用和不使用FAP-4-1BBL的长期培养系统中监测T细胞功能的示意图。(B-C)如通过增加CD8+T细胞的细胞毒性和增殖观察到的，与FAP-4-1BBL共刺激延长T细胞功能(n＝2-5)。柱条代表平均值±SEM。统计测试：使用Tukey的多重比较测试进行双向ANOVA。*p<0.05。
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他方面。
WT1-TCB与FAP-4-1BBL的组合
实验设置
对患者样品进行细胞毒性测定
初始诊断的原发性HLA-A*02+AML患者样品在十二孔板中以1.5x106细胞/mL的浓度，在每孔1.2x105个鼠MS5细胞(用60Gy照射)的饲养层上预培养2天。对于细胞毒性评估，随后将4.0x104 AML细胞与8.0x104健康供体T细胞(使用Pan T细胞分离试剂盒进行阴性分离，人；Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)在96孔板中与在不同水平(3T3 huFAP高或者3T3 huFAP低)稳定表达人FAP的NIH-3T3成纤维细胞系一起培养。包括缺乏FAP表达的野生型NIH-3T3细胞作为对照。用50Gy照射NIH-3T3细胞系，且每孔添加1.0x104个细胞。用1μg/mL WT1-TCB和2nM FAP-4-1BBL培养共培养物。包括与非靶向对照抗体构建体(DP47-TCB和DP47-41BBL)的组合作为对照。96小时后，对细胞毒性测定进行了分析：(1)AML细胞的特异性裂解、(2)T细胞增殖、(3)T细胞激活化和(4)T细胞的细胞因子分泌。
基于通过流式细胞术确定的活AML细胞计数，相对于含有DP47-TCB的相应对照，计算WT1-TCB对AML细胞的特异性裂解。基于活T细胞计数，相对于第0天计算96小时后T细胞的增殖。通过分析CD25、4-1BB(CD137)和PD-1(CD279)的表达来监测T细胞活化。相对于同种型染色对照计算中位荧光强度(MFI)比率。根据制造商的说明，使用LEGENDplex Human CD8/NK panel(Biolegend，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)对细胞毒性测定的细胞培养上清液中分泌的细胞因子进行分析。
长期培养实验中的FAP-4-1BBL
对于14天的长期培养系统，用50Gy照射3T3 huFAP高细胞，在实验开始前一天，并将3.0x105个细胞接种在6孔板中作为饲养层。随后，将1.8x106个健康供体T细胞(使用Pan T细胞分离试剂盒进行阴性分离，人；Miltenyi Biotec)与AML细胞系SKM1(3.6x106个细胞)和0.1μg/mL WT1-TCB±2nM FAP-4-1BBL一起添加。培养三天后，补充SKM1细胞、WT1-TCB和FAP-4-1BBL。在第七天，通过用人CD33微珠(Miltenyi Biotec)耗尽靶细胞，从培养物中分离出T细胞，并按如下所述进行功能测试。如上所述，将剩余的T细胞与SKM1、WT1-TCB和FAP-4-1BBL在3T3 huFAP高细胞上再培养七天。
为了进行功能测试，在第0、7和14天分离的T细胞与SKM1细胞在0.01μg/mL WT1-TCB或对照抗体(DP47-TCB)存在下以1:2的效应子：靶标比率共培养。72小时后对SKM1细胞的特异性裂解和T细胞增殖进行功能测定分析。基于通过流式细胞术确定的活SKM1细胞计数，相对于含有DP47-TCB的相应对照，计算WT1-TCB对SKM1细胞的特异性裂解。基于活T细胞计数，相对于第0天计算72小时后T细胞的增殖。(另请参阅图5A实验设置的示意图)。
结果
共培养4天后，我们观察到由健康供体T细胞和WT1-TCB介导的原发性AML细胞的平均特异性裂解为53.6±8.3％。值得注意的是，在NIH-3T3细胞存在的情况下，该值降低至21.8±4.5％。然而，在3T3-huFAP高细胞存在的情况下，通过添加FAP-4-1BBL，AML细胞裂解不仅得到恢复，而且得到增强(67.4±6.5％)(图1和表1)。重要的是，WT1-TCB与FAP-4-1BBL的组合引起改善了T细胞增殖，尤其是CD8+T细胞(第4天与第0天的倍数变化：6.6±1.5与3.0±0.8)(图2)。同时，FAP-4-1BBL引起活化分子CD25(MFI比率：18.4±5.6与11.9±2.8)(图3A)和4-1BB(MFI比率：8.6±5.0与3.0±1.2)(图3B)在CD3+T细胞上的表达增加。FAP-4-1BBL与WT1-TCB组合使用时不会调节共抑制受体PD-1的表达(图3C)。此外，裂解还伴随着颗粒酶B(1.4x103±1.0x103pg/mL与6.1x101±2.2x101pg/mL),IFNγ(6.0x103±3.3x103pg/mL与3.1x102±2.0x102pg/mL)和TNFα(1.7x102±1.1x102pg/mL与3.7x101±2.5x101pg/mL)的分泌增加(图3D-F)。在3T3-huFAP低细胞存在的情况下得到了总体相似的观察结果，支持在AML中WT1-TCB和FAP-4-1BBL的组合疗法。
表1.在表达不同水平的人FAP的NIH-3T3细胞系存在下，FAP-4-1BBL增强了WT1-TCB介导的特异性裂解HLA-A*02+AML细胞(n＝6)。
在AML细胞系的长期培养实验中，我们观察到由新鲜分离的健康供体T细胞和WT1-TCB介导的SKM1细胞平均特异性裂解为62.9±12.4％(±SEM，n＝3)。在用WT1-TCB慢性刺激7天后，观察到的T细胞特异性裂解相当(64.0±15.7％)，且刺激14天后降至27.4±7.8％。值得注意的是，如果用FAP-4-1BBL额外刺激T细胞，T细胞的细胞毒性能力显著提高并延长(第7天和第14天的平均特异性裂解：分别为91.8±5.3％和75.6±8.0％，n＝5)(图5B)。与仅WT1-TCB相比，通过添加FAP-4-1BBL改善的细胞毒性还伴随着CD8+T细胞的增殖的改善(第7天的平均倍数变化：10.6±3.1与6.1±1.6，n＝3)(图5C)。
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尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实施方案相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实施方案不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。
Claims (26)
1.一种在个体的癌症的治疗中供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体，其中所述治疗包括施用所述HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体与4-1BB(CD137)激动剂的组合。
2.一种在个体的癌症的治疗中供使用的4-1BB(CD137)激动剂，其中所述治疗包括施用所述4-1BB(CD137)激动剂与HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的组合。
3.HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体在制造用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中所述治疗包括施用所述HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体与4-1BB(CD137)激动剂的组合。
4.4-1BB(CD137)激动剂在制造用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中所述治疗包括施用所述4-1BB(CD137)激动剂与HLA-A2/WT1x CD3双特异性抗体的组合。
5.一种用于治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体和4-1BB(CD137)激动剂。
6.一种试剂盒，其包括含有HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的第一药物和含有4-1BB(CD137)激动剂的第二药物，并且任选地进一步包括包装插页，所述包装插页包括针对施用所述第一药物与所述第二药物的组合以用于治疗个体的癌症的说明。
7.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、方法或试剂盒，其中所述HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体包含
(i)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分与CD3特异性结合并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3；以及
(ii)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分与HLA-A2/WT1特异性结合并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3。
8.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、用途、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、方法或试剂盒，其中所述HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体包含与HLA-A2/WT1特异性结合的第三抗原结合部分和/或由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
9.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、方法或试剂盒，其中所述HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体包含
(i)与CD3特异性结合的第一抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQID NO:6的LCDR3，其中所述第一抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区发生交换；
(ii)与HLA-A2/WT1特异性结合的第二抗原结合部分和第三抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:9的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2和SEQ ID NO:11的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:13的LCDR2和SEQ ID NO:14的LCDR3，其中所述第二抗原结合部分和所述第三抗原结合部分各自为Fab分子，特别是常规Fab分子；
(iii)Fc结构域，其由第一亚基和第二亚基构成，
其中所述第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至所述第一抗原结合部分的所述Fab重链的N末端，并且所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端融合至所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端，并且其中所述第三抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端。
10.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、用途、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、方法或试剂盒，其中所述HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的所述第一抗原结合部分包含重链可变区序列和轻链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，且/或所述HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的所述第二抗原结合部分和(在存在时的)所述第三抗原结合部分包含重链可变区序列和轻链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
11.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中所述HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的所述第一抗原结合部分为交叉Fab分子，其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变区发生交换，并且其中所述HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的所述第二抗原结合部分和(在存在时的)所述第三抗原结合部分为常规Fab分子，其中在恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)，且位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中所述HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体的所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基的缔合的修饰，且/或所述Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。
13.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中所述4-1BB(CD137)激动剂包含4-1BBL的胞外域或其片段，特别是4-1BBL的三个胞外域或其片段。
14.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中4-1BBL的胞外域或其片段包含与选自由SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所组成的组的氨基酸序列、特别是SEQ IDNO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中所述4-1BB(CD137)激动剂包含与肿瘤相关抗原、特别是成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的抗原结合部分。
16.根据权利要求15所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中与FAP特异性结合的所述抗原结合部分包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:39的重链CDR(HCDR)1、SEQ ID NO:40的HCDR2和SEQID NO:41的HCDR3；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:42的轻链CDR(LCDR)1、SEQ ID NO:43的LCDR2和SEQ ID NO:44的LCDR3。
17.根据权利要求15或16所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中与FAP特异性结合的所述抗原结合部分包含：与SEQ ID NO:45的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:46的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中所述4-1BB(CD137)激动剂包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
19.根据权利要求18所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中4-1BB(CD137)激动剂的所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基的缔合的修饰，且/或所述Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。
20.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中所述4-1BB(CD137)激动剂为抗原结合分子，所述抗原结合分子包含
(i)4-1BBL的第一胞外域、第二胞外域和第三胞外域或其片段；
(ii)与FAP特异性结合的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分为Fab分子；
(iii)Fc结构域，其由第一亚基和第二亚基构成；
(iv)CL结构域和CH1结构域；
其中所述抗原结合分子由以下所构成：
(a)第一多肽，其包含：(a1)4-1BBL的所述第一胞外域或其片段，其在C末端融合至4-1BBL的所述第二胞外域或其片段的N末端，(a2)4-1BBL的所述第二胞外域或其片段，其在C末端融合至所述CL结构域的N末端，(a3)所述CL结构域，其在C末端融合至所述Fc结构域的所述亚基中的一者(例如所述第一亚基)的N末端，和(a4)所述Fc结构域的所述亚基中的一者(例如所述第一亚基)；
(b)第二多肽，其包含：(b1)4-1BBL的所述第三胞外域或其片段，其在C末端融合至所述CH1结构域的N末端，和(b2)所述CH1结构域；
(c)第三多肽，其包含：(c1)所述Fab分子的重链，其在C末端融合至所述Fc结构域的所述亚基中的另一者(例如所述第二亚基)的N末端，和(c2)所述Fc结构域的所述亚基中的另一者(例如所述第二亚基)；以及
(d)第四多肽，其包含所述Fab分子的轻链。
21.根据权利要求20所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中在所述第一多肽的CL结构域中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)；并且在所述第二多肽的CH1结构域中，位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)，且位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
22.根据权利要求20或21所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，且所述第四多肽包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
23.根据权利要求1至12中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中所述4-1BB(CD137)激动剂为抗4-1BB抗体，特别是抗FAP/抗4-1BB双特异性抗体。
24.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中所述癌症为WT1阳性癌症。
25.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的HLA-A2/WT1 x CD3双特异性抗体、供使用的4-1BB(CD137)激动剂、用途、用途、方法或试剂盒，其中所述癌症为急性骨髓性白血病(AML)。
26.如前所述的本发明。
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