CN118159665A - 用于基于lc-ms的核酸序列映射的样品制备 - Google Patents
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Abstract
本文公开了在靶核酸的下游分析之前淬灭该靶核酸的核酸酶消化的方法。具体地,提供了用于在靶核酸的序列分析之前控制核酸酶消化的终点的方法。本公开中核酸酶消化的淬灭采用与任选的还原剂组合的至少一种非离子或阴离子变性剂。本公开中提供的方法有助于保存包含靶核酸或其片段的样品的长期储存,并且确保在预处理步骤期间消除污染核酸酶的影响。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2021年10月8日提交的名称为″SAMPLEPREPARATION FOR LC-MSBASED SEQUENCE MAPPING OF NUCLEIC ACIDS″的美国临时专利申请第63/253,616号的优先权和权益,该美国临时专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及用于在下游分析之前淬灭核酸的核酸酶消化的方法。具体地讲,本文提供了用于在靶核酸的序列分析之前控制核酸酶消化的终点的方法。本公开中核酸酶消化的淬灭采用与任选的还原剂组合的至少一种非离子或阴离子变性剂。本公开还提供了用于在测序分析,具体地讲LC-MS分析之前控制靶核酸片段长度的方法。本公开还提供了用于减少/消除预处理步骤期间污染核酸酶的影响的方法。
背景技术
核酸序列的表征是基于RNA/DNA的药物开发和监管部门批准的关键方面。核酸的测序传统上通过Sanger测序或所谓的下一代测序来执行。然而,这些方法在它们能够阐明的分子细节方面受到限制。与这些技术组合,期望具有用于全景视图的正交方法。稳健的液相色谱(LC)方法和质谱(MS)方法已被用于确认同一性、观察一级序列以及精确测量修饰的残基和核酸的重要结构基序,诸如mRNA分子的5′端和polyA尾。
然而,样品制备技术极大地影响由这些正交方法获得的结果。在核酸的预处理及其储存期间,核酸有意地和无意地遇到核酸酶。例如,通常添加核酸酶以旨在在分析序列分析方法之前消化/片段化样品中的核酸。然而,当将核酸酶用作样品制备工具时,它们难以抑制和控制,并且这导致不期望的片段化,例如不合适用所选分析方法分析的非常短的片段。此外,人类皮肤是可意外地转移到表面和溶液中的核酸酶的丰富来源(Holley,R.W.;Apgar,J.;Merrill,S.H.J.Biol.Chem.1961,236,PC42-43.)此外,在样品制备期间使用的试剂经常被核酸酶污染(Hengen,P.N.Trends Biochem.Sci.1996,21,(3),112-113)。因此,如果没有适当地淬灭/控制,不管是有意添加还是无意添加,残留量的这些核酸酶可不利地影响方案中的下游步骤。(Pasloske,B.L.In Nuclease Methods and Protocols,Schein,C.H.编辑,Humana出版社:Totowa,N.J.,2001,第105-111页;Sweeney,R.Y.;Kelemen,B.R.Woycechowsky,K.J.;Raines,R.T.Anal.Biochem.2000,286,(2),312-314)。
发明内容
通常,本技术的一个目的是消除或减轻用于控制/灭活污染核酸酶和/或在下游分析方法之前在样品制备步骤期间添加的预期核酸酶的消化能力的先前方法的至少一个缺点。在一些实施方案中,下游分析方法是LC-MS方法,特别是离子配对反相液相色谱(IP-RPLC)-MS方法。
一般来讲,本技术的样品预处理方法可用于控制来自应用的核酸酶消化物的消化量(例如,消化终点)。作为控制或淬灭消化的结果,消化/预处理的样品可保存相当长的时间(例如,数天至数周),从而有利于重复分析和样品存档。本技术的淬灭技术与期望的正交下游分析诸如离子配对反相液相色谱(IP-RPLC)相容。
在一个方面,本文提供了一种用于样品中存在的靶核酸的序列分析的方法,该方法包括以下步骤:(a)用包含第一任选变性剂和任选金属螯合剂的无核酸酶缓冲液处理样品以使靶核酸变性;(b)将该样品与核酸酶一起温育预定量的时间,其中该核酸酶能够使该靶核酸片段化以产生一组核酸片段,该一组核酸片段各自含有对应于该靶核酸序列的序列;(c)通过添加第二变性剂和任选的二硫键还原剂来灭活该核酸酶的片段化能力;(d)将该核酸片段组进行单模式色谱或多模式色谱,然后进行质谱(MS)方法;以及(e)通过该质谱方法产生该核酸片段组的质量信号,由此由该质量信号确定该靶核酸的序列。
在一些实施方案中,第一任选变性剂和第二变性剂独立地选自非离子和阴离子变性剂。
在一些实施方案中,第一任选变性剂和第二变性剂选自相同的化学试剂。
在一些实施方案中,不存在第一任选的变性剂。
在一些实施方案中,靶核酸选自单链DNA、双链DNA、cDNA、单链RNA、双链RNA、DNA/RNA杂交体和DNA/RNA嵌合核酸。
在一些实施方案中,该任选的二硫键还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、(三(2-羧乙基)膦)(TCEP)、N-乙基马来酰亚胺、半胱氨酸或谷胱甘肽。
在一些实施方案中,该核酸酶选自核酸内切酶和核酸外切酶。核酸内切酶选自限制性内切酶、RNA核酸内切酶、DNA核酸内切酶和非特异性磷酸二酯酶。在具体的实施方案中,RNA核酸内切酶是选择性或非选择性RNA核酸内切酶,并且靶核酸是单链RNA或双链RNA。具体地,RNA核酸内切酶选自RNA酶T1、RNA酶H、Cusativin、MazF或大肠杆菌素E(ColicinE)。
在一些实施方案中,第一任选的变性剂和第二变性剂独立地选自脲、硫脲、磺酰脲、氨基脲、酰肼、氨基硫脲、离液剂或它们的盐。具体地,第一任选的变性剂和第二变性剂独立地选自硫氰酸钠、硫氰酸钾、十二烷基硫酸钠(SDS)、脲、碘化钠、高氯酸钠、脲、洗涤剂或它们的盐。在一个实施方案中,第一任选的变性剂和第二变性剂包括脲或它们的盐。
在一些实施方案中,靶核酸的长度为约101至约105个单独核苷酸。在一些实施方案中,靶核酸的长度为约101至约104个单独核苷酸。在一些实施方案中,靶核酸的长度为约5至约100,000个单独核苷酸。在一些实施方案中,靶核酸的长度为约15至约10,000个单独核苷酸。在一些实施方案中,靶核酸的长度为约5至约2500个单独核苷酸。在一些实施方案中,靶核酸的长度为约101至约103个单独核苷酸。在一些实施方案中,靶核酸的长度为约10至约5000个单独核苷酸。在一些实施方案中,靶核酸的长度为约30至约2000个单独核苷酸。在某些实施方案中,靶核酸的长度为约50至约1500个单独核苷酸。在某些实施方案中,靶核酸的长度为约100至约1000个单独核苷酸。
在一些实施方案中,对该核酸片段组进行单模式色谱或多模式色谱,然后进一步进行本领域已知的一种或多种离子化和/或采样技术,以将该单模式色谱或多模式色谱结合到该质谱(MS)方法。
在一些实施方案中,之后进行质谱(MS)方法的单模式色谱或多模式色谱包括反相分离、阳离子交换分离、阴离子交换分离、离子对分离、正相分离、离子迁移率分离、尺寸排阻分离、手性分离、亲和分离、配体交换分离、极性非离子分离或它们的任何组合。在某些实施方案中,单模式色谱或多模式色谱为离子配对反相液相色谱(IP-RPLC)。在一些实施方案中,单模式色谱或多模式色谱与UV检测系统结合。
在一些实施方案中,质谱方法选自基质辅助激光解吸/电离-飞行时间(MALDI-TOF)、电喷雾-电离(ESI)、电荷检测质谱和傅里叶变换-离子回旋共振(FT-ICR)。在一些实施方案中,质谱方法与UV检测系统结合。
在一些实施方案中,第二变性剂的浓度介于约1M与约10M之间,约2M至约8M,或约4M至8M。在某些实施方案中,第二变性剂的浓度为约6M。
在一些实施方案中,第二变性剂的浓度大于第一任选变性剂的浓度。在一些实施方案中,第二变性剂的浓度比第一任选变性剂的浓度大至少10倍。在一些实施方案中,第二变性剂的浓度比第一任选变性剂的浓度大至少100倍。在一些实施方案中,第二变性剂的浓度处于或高于其饱和水平(例如,1M至约10M,约2M至约8M,或约4M至8M)。
在另一个方面,本文提供了在进行分析方法之前预处理存在于样品中的靶核酸的方法,该方法包括以下步骤:(a)将样品与核酸酶一起温育预定量的时间,其中核酸酶能够使靶核酸片段化以产生一组核酸片段,该一组核酸片段各自含有对应于靶核酸序列的序列;(b)通过添加变性剂和任选的二硫键还原剂来灭活或控制核酸酶的片段化能力;以及在进行分析方法之前将样品保存特定时间段。在某些实施方案中,变性剂为脲或它们的盐。
在一些实施方案中,温育样品可在冰上或在介于-30℃与70℃之间的任何温度下进行。样品可以在25℃下温育。
在一些实施方案中,预处理存在于样品中的靶核酸是在用于靶核酸的序列分析的分析方法之前的样品制备方法的一部分。
在一些实施方案中,步骤(a)和步骤(b)同时进行,从而预定时间为零。
在一些实施方案中,预定时间为0.5秒至60.0分钟。
在一些实施方案中,该特定时间段为5分钟至6个月。在一些实施方案中,该特定时间段为5分钟至3个月。在一些实施方案中,该特定时间段为5分钟至6周。在一些实施方案中,该特定时间段为三天。在一些实施方案中,该特定时间段为一周。
在一些实施方案中,将样品保存特定时间段包括将样品保存在4℃至8℃的冰箱中。在一些实施方案中,将样品保存特定时间段包括将样品保存在-10℃至-90℃的冰箱中。
在一些实施方案中,灭活核酸酶的片段化能力的步骤(c)还包括在添加变性剂和任选的二硫键还原剂之前或之后的加热步骤。加热步骤包括将温度保持在30℃至80℃持续至少30秒或更长。在一些实施方案中,变性剂的浓度介于约2M与约8M之间。在一些实施方案中,变性剂为6M脲或它们的盐。
在一些实施方案中,在进行分析方法之前预处理样品中存在的靶核酸的方法还包括在步骤(a)之前用包含第一变性剂和金属螯合剂的无核酸酶缓冲液处理样品。在一些实施方案中,第一变性剂选自脲、硫脲、磺酰脲、氨基脲、酰肼、氨基硫脲、离液剂或它们的盐。在一些实施方案中,第一变性剂独立地选自阴离子变性剂。
在一个方面,本文提供了在LC-MS方法之前保存样品的方法,其中该样品包含一组核酸片段和核酸酶,该一组核酸片段各自含有对应于靶核酸序列的序列,该方法包括以下步骤:(a)向该样品添加变性剂和任选的二硫键还原剂;以及(b)在LC-MS方法之前将样品保存特定时间段。在一些实施方案中,变性剂为脲或其盐。
在一些实施方案中,变性剂的浓度介于约2M与约8M之间。在一些实施方案中,变性剂选自非离子或阴离子变性剂。具体地,在一些情况下,变性剂为脲或它们的盐。
在一些实施方案中,LC-MS方法是反相离子配对液相色谱(RPIP-LC)-MS方法。
在另一个方面,本文提供了一种在下游测序分析之前控制靶核酸的片段长度的方法,该方法包括以下步骤:(a)将样品与核酸酶一起温育预定量的时间,其中核酸酶能够使靶核酸片段化以产生一组核酸片段,该一组核酸片段各自含有对应于靶核酸序列的序列;以及(b)通过添加包含脲或其盐的变性剂和任选的二硫键还原剂来淬灭该核酸酶的片段化能力,从而控制该靶核酸的片段长度,其中该片段长度取决于该预定量的时间。
在一些实施方案中,预定时间量小于1秒。在一些实施方案中,温育和淬灭基本上同时发生。
在另一个方面,本文提供了一种在下游测序分析之前控制靶核酸的片段长度的方法,该方法包括以下步骤:(a)将样品与核酸酶一起温育预定量的时间,其中核酸酶能够使靶核酸片段化以产生一组核酸片段,该一组核酸片段各自含有对应于靶核酸序列的序列;以及(b)通过添加包含脲或其盐的变性剂和任选的二硫键还原剂来淬灭该核酸酶的片段化能力,从而导致该靶核酸序列内超过10%、20%、30%、40%、优选地50%的遗漏切割率。
在另一个方面,本文提供了一种用于样品中存在的完整核酸的序列分析的方法,该方法包括以下步骤:(a)用非离子或离子变性剂和任选的二硫键还原剂温育样品,其中该变性剂的浓度处于或高于其饱和水平,例如1M至约10M,约2M至约8M,或约4M至8M;(b)将该完整核酸进行单模式色谱或多模式色谱,然后进行质谱(MS)方法;以及(e)通过质谱方法产生该完整核酸的质量信号,由此由该质量信号确定该完整核酸的序列。
本文公开的方法有利地提供了在靶核酸或包含样品核酸的样品的预处理步骤期间淬灭核酸酶的不完全消化的方式。用于淬灭核酸酶的不完全消化的方法也可用于控制靶核酸的片段长度。
本公开中提供的方法对于灭活从细胞和组织、皮肤、空气传播的细菌和/或真菌分泌的污染核酸酶也是有利的。
本公开提供许多优点,包括控制核酸酶消化的终点和长时间保持样品状态,这将有利于重复分析和样品存档。本公开中提出的方法有效地阻止在消化步骤期间使用的核酸酶进一步水解靶核酸。其还帮助保存样品以用于长期储存,并确保污染的核酸酶也将在预处理步骤期间被灭活。
此外,用于本发明方法的组合物(例如非离子变性剂或离子变性剂和任选的二硫化物还原剂)与大多数下游分析方法(例如IP-RPLC分离)相容。
附图说明
通过以下结合附图所作的详细描述,将更充分地理解本技术,在附图中:
图1A、图1B和图1C提供了以三种不同方式预处理的荧光素酶mRNA分离的色谱图。图1A中示出的结果是用DMSO淬灭5分钟的RNA酶T1消化物的结果。图1B中示出的色谱图示出了使用盐酸胍进行预处理的结果。并且图1C中示出的结果说明了使用脲的本发明技术的预处理方法。通过比较图1A、图1B和图1C可以看出不同淬灭方法对IP-RPLC的影响。
图2A和图2B显示了在两个不同时间点获得的荧光素酶mRNA分离的色谱图。RNA酶T1消化物用脲和DTT淬灭。图2A示出了在样品制备的12小时内在ACQUITY H-Class BioBinary和Vion IMS QT上的样品分析。图2B示出了在8℃下储存3天后对ACQUITY I-ClassBinary FTN的分析。
具体实施方式
核酸酶不仅在所有环境(包括实验室)中普遍存在,而且当在分析方法(例如LC-MS序列分析方法)之前将它们用作样品制备工具时,它们难以抑制和控制。据信不存在用于控制核酸酶消化的终点和将有利于重复分析和样品存档的长时间(例如长达6周)保存样品状态的技术。最特别地,还没有建立可直接有利于LC-MS分析,例如离子配对反相液相色谱(IP-RPLC)分析的淬灭技术。
通过LC-MS对mRNA的序列映射可被视为与蛋白质的肽映射高度相似。在肽映射样品制备中,广泛实施的是通过改变消化混合物的pH来淬灭蛋白水解消化。胰蛋白酶消化通常通过添加酸诸如三氟乙酸或甲酸来淬灭。这用于为样品制备提供更加可重复的终点并使过度消化最小化。理想地,类似的实践将应用于核酸的核酸酶消化。然而,就其与优选的LC分离模式(IP-RPLC分离)的相容性而言,既没有设计也没有考虑用于实现有效的淬灭条件的技术。不建议改变消化混合物的pH,因为核酸在低pH值和高pH值下易于降解,如果不是以对磷酸酯主链水解的形式,就是以水解脱嘌呤的形式。因为应用于蛋白质样品制备的方法不适用,因此需要另选的淬灭程序。
在一个方面,本文提供了淬灭核酸酶消化和保存样品以用于重复分析或存档以及在准备分析样品组合物时使其产生。在一个方面,本文公开的方法采用高浓度(例如高于2M)的非离子或阴离子变性剂与任选添加还原剂的组合。
本文提供的方法暂时或永久地停止在预处理步骤中使用的核酸酶活性,该预处理步骤是分析方法之前的样品制备过程的一部分。本文提供的方法还可控制靶核酸的片段化,例如片段长度和/或切割点。核酸酶具有将核酸消化成片段的能力,该片段各自含有对应于靶核酸序列的序列。
如本文所用的,术语″抑制″核酸酶的活性意指与未应用本公开方法的类似样品中的活性相比,在应用本公开方法的样品中至少一核酸酶(例如至少一种RNA酶或至少一种DNA酶)的活性降低。抑制不限于给定核酸酶的完全抑制或灭活。在一个给定的应用中,可以容忍一些低水平的核酸酶活性,其不会对正在进行的下游分析的结果产生有害影响。
如本文所用,术语″变性剂″是指引起聚合物(例如核酸或蛋白质)部分或完全不折叠的任何化合物或材料。
如本文所用,术语″核酸酶灭活″或″核酸酶的灭活″表示在所使用的测定条件下没有可检测的样品DNA或RNA降解,并且核酸酶不可逆地失效。
如本文所用,术语″约″意指该数值是近似的,并且较小的变化不会显著影响所公开的实施方案的实践。在使用数值限制的情况下,除非上下文另外指明,否则″约″意指该数值可改变±10%并且仍然在所公开的实施方案的范围内。
如本文所用,术语″样品″是指包括待使用根据本公开的方法处理的分析物(例如mRNA)的任何介质。样品可选自农业样品、环境样品或生物样品。生物样品可包括但不限于例如临床标本(例如血液、血浆、血清、痰、组织、尿液、唾液、来自呼吸道的样品/流体等)以及化妆品和药学产品(例如洗剂、乳膏、软膏、溶液、药物、滴眼剂和滴耳剂等)。
如本文所用,本文可互换使用的术语″样品制备″和″预处理步骤″是指处理样品以用于靶核酸的下游分析的任何步骤或方法。样品制备可包括处理原始样品使得其适于进一步的分析方法(例如LC-MS方法)所需的各种程序。重要的是注意至少一个单一样品制备步骤应与下游检测方法相容以便获得最佳结果。
如果需要除去可能是有害的(例如毒素)、危险的(例如感染性)或可能干扰下游分析或该分析的灵敏度的物质(例如金属、盐、蛋白质、脂质),则可在样品制备期间在淬灭步骤之前或之后纯化核酸。纯化可涉及各种技术,诸如用盐、氯仿或苯酚化学萃取、沉降离心、色谱法或本领域普通技术人员已知的其他技术。
如本文所用,术语″靶核酸″是指包含待分析(例如检测)的″靶序列″的核酸。靶核酸可以是DNA或RNA,并且可以是单链或双链。靶核酸可包括可能不被分析的除靶序列之外的其他序列。典型的靶核酸包括病毒基因组,细菌基因组,真菌基因组,植物基因组,动物基因组,来自病毒、细菌或真核细胞的rRNA、tRNA或mRNA,线粒体DNA或染色体DNA。
在某些实施方案中,靶核酸的尺寸可以为5、15、50、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、10500、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000个或更多个连续的核苷酸,以及本文可导出的任何范围。
如本文所用,术语″二硫键还原剂″是指还原例如蛋白质、核酸中的二硫键的试剂。非限制性示例包括二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、(三(2-羧乙基)膦)(TCEP)、N-乙基马来酰亚胺、半胱氨酸或谷胱甘肽。
如本文所用,术语″金属螯合剂″可包括例如能够紧密结合或螯合游离金属离子的化学实体,其有时具有增加的特异性。非限制性示例包括EDTA、EGTA、BAPTA、柠檬酸盐、NTP和dNTP。
如本文所用,术语″洗涤剂″可包括例如离子或非离子表面活性剂。非限制性示例包括SDS、脱氧胆酸盐和N-月桂基肌氨酸、NP 40、Tween 20和Triton X-100。
如本文所用,术语″盐″可以为例如单价盐或多价盐。非限制性示例包括(NH)SO、NaCl、KCl和柠檬酸钠。
如本文所用,术语″离液剂″可包括例如可破坏水的结构和/或促进非极性物质在极性溶剂诸如水中的溶解度的化学品。离液剂的此类行为通常导致蛋白质或核酸的解折叠和灭活。非限制性示例包括SCN-、Li+、CIO-4和胍鎓。
如本文所用,术语″遗漏切割″是指作为预测切割位点的磷酸二酯键未经历切割。
如本文所用,术语″单模式色谱″是指基于单一物理特性的色谱方法,诸如电荷(离子交换色谱,IEX)、疏水性(疏水相互作用色谱,HIC)、尺寸(尺寸排阻色谱,SEC)、特异性相互作用(亲和色谱,AC)或金属螯合基团(固定化金属离子亲和色谱,IMAC)。
如本文所用,术语″多模式色谱″或″多峰色谱″是指利用固定相与分析物之间的多于一种形式的相互作用以便实现它们的分离的色谱方法。例如,离子和疏水相互作用可同时发生,这经常可增加选择性和特异性。
核酸酶
核酸酶能够降解核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)。核酸酶可以特异性降解RNA或DNA,或者可以是非特异性核酸酶,诸如S1核酸酶和微球菌核酸酶,并且降解RNA和DNA两者。本公开所包含的核酸酶包括核酸外切酶和核酸内切酶。
核糖核酸酶(RNA酶)
使用本公开抑制的核糖核酸酶的非限制性示例包括但不限于RNA酶A、RNA酶B、RNA酶C、RNA酶1、RNA酶T1、微球菌核酸酶、S1核酸酶或DNA酶1。附加的真核核糖核酸酶可以被灭活。诸如哺乳动物核糖核酸酶A超家族的成员(即核糖核酸酶1-8)、RNA酶H家族的成员、RNA酶L、嗜酸性粒细胞RNA酶、信使RNA核糖核酸酶(5′-3′核糖核酸外切酶、3′-5′核糖核酸外切酶)、脱盖酶和脱腺苷化酶。可通过本发明的方法抑制和/或灭活的附加核糖核酸酶包括大肠杆菌核糖核酸内切酶(RNA酶P、RNA酶III、RNA酶E、RNA酶I、RNA酶HI、RNA酶HII、RNA酶M、RNA酶R、RNA酶IV、F:RNA酶P2、O、PIV、PC、RNA酶N)、大肠杆菌核糖核酸外切酶(RNA酶II、PNPase、RNA酶D、RNA酶BN、RNA酶T、RNA酶PH、寡RNA酶、RNA酶R)、RNA酶Sa、RNA酶F1、RNA酶U2、RNA酶Ms和RNA酶St。
在一些实施方案中,RNA核酸内切酶选自RNA酶T1、RNA酶H、Cusativin、MazF或大肠杆菌素E。
核酸内切酶和核酸外切酶两者均可通过本公开的方法抑制。本领域技术人员可容易地采用本公开的方法和组合物来抑制和/或灭活除本文特别所述的那些以外的本领域已知的其他RNA酶。
脱氧核糖核酸酶(DNA酶)
可使用本公开抑制和/或灭活的脱氧核糖核酸酶的非限制性示例包括但不限于DNA酶1、S1核酸酶和微球菌核酸酶。本公开的方法可用于抑制核酸内切酶和核酸外切酶。本领域技术人员可容易地采用本文所公开的本技术的方法来抑制和/或灭活除本文特别所述的那些之外的本领域已知的其他DNA酶。
由本发明技术的方法使用以便预处理靶核酸的化合物(例如化学分子)可以呈液体形式或固体形式,诸如包含固定化核酸酶抑制剂的基质。如果使用液体形式,则该组合物可以是例如用于分子生物学的试剂。可用于本发明的代表性试剂包括但不限于水、三-乙二胺四乙酸缓冲液(TE缓冲液)、氯化钠/柠檬酸钠缓冲液(SSC)、3-(N-吗啉醇)丙磺酸(MOPS)、Tris缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、核酸杂交缓冲液、乙酸钠缓冲液、DNA酶或RNA酶消化缓冲液和核酸储存缓冲液。本领域技术人员将理解,本发明的方法可与除上述化合物之外的化合物一起使用。
在本公开中使用的核酸酶可引起靶核酸酶的消化,从而产生一组核酸片段,其含有可与靶序列同源或互补的序列。如果必要,将靶序列片段化成多个片段以产生一组均匀或不均匀长度的片段。核酸片段的尺寸为约2至约1,000个核苷酸长,优选地约10至约200个核苷酸长,还更优选地约12至约100个核苷酸长。在约2、3、4、5、10、12、15、18、20、24、26、30和35范围内的尺寸可用于进行核酸靶的短区域的小规模分析。25、50、75、125、150、175、200、250、450、650个核苷酸和更大范围内的片段尺寸可用于快速分析更大的靶序列。
在某些实施方案中,核酸片段的尺寸可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500或更多个连续的核苷酸,以及本文可导出的任何范围。
实施例
包括以下实施例以展示本发明的优选实施方案。然而,按照本公开,本领域技术人员应当理解,在不偏离该技术的精神和范围的情况下,可以在所公开的具体实施方案中作出许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例1:用IP-RPLC的相容淬灭步骤对不相容淬灭步骤进行的RNA酶T1消化
将浓度为1mg/mL的萤光素酶mRNA的10mM Tris 0.1mM EDTA pH 7.5无核酸酶缓冲液以10μL体积与20μL 8M脲的10mM Tris 0.1mM EDTA pH 7.5无核酸酶缓冲液混合。向该混合物中,添加10μL稀释的100U/μL RNA酶T1(Worthington),并使该反应在37℃下进行5分钟。然后用三种不同条件淬灭重复的消化反应,添加40μL二甲基亚砜(DMSO)、30mg盐酸胍或额外添加30mg脲。样品的最终浓度范围为大约0.15mg/mL至0.20mg/mL。
LC条件
A洗脱液:1%六氟异丙醇、0.1%二异丙基乙胺的18.2MΩ水溶液
B洗脱液:0.075%六氟异丙醇、0.0375%二异丙基乙胺的35:6518.2MΩ水/乙腈溶液
样品:0.2mg/mL RNA酶T1消化的mRNA
LC系统:Acquity H-Class Bio Binary Plus(Waters TechnologiesCorporation,Milford,MA)
柱:ACQUITYPREMIERBEH C181.7μm2.1×150mm柱(Waters TechnologiesCorporation,Milford,MA)
流速:0.4mL/min
梯度:在60分钟内3%-50%B
检测:260nm下UV
柱温=70℃
进样体积:5μL
实施例1的结果指示,在无核酸酶的Tris和EDTA pH 7.5缓冲液中消化的10μgmRNA必须被淬灭,特别考虑到样品组合物与下游IP-RPLC分析的相容性。当用DMSO或盐酸胍淬灭时,LC注射导致穿透并且没有样品保留。参见,例如图1A和图1B。相反,当添加额外量的脲以获得淬灭效果时,样品组分被很好地保留并溶解,使得可进行通过LC-MS的序列映射。(参见,图1C)。
已经发现脲优于DMSO和盐酸胍,因为它有利于装载到IP-RPLC分离上。本技术不限于仅使用脲(例如,应用于淬灭核酸酶消化的高浓度脲);可潜在地应用其他非离子或潜在地甚至阴离子变性剂(如硫氰酸盐)。如通过尝试使用胍所例示的,应避免阳离子变性剂。阳离子变性剂将竞争与核酸的离子配对相互作用并且对IP-RPLC样品保留有害。
实施例2:使用脲和DTT淬灭步骤进行的RNA酶T1消化
将浓度为1mg/mL的萤光素酶mRNA的10mM Tris 0.1mM EDTA pH 7.5无核酸酶缓冲液以10μL体积与20μL 8M脲的10mM Tris 0.1mM EDTA pH 7.5无核酸酶缓冲液的混合。向该混合物中,添加10μL稀释的100U/μL RNA酶T1(购自Worthington),并在室温下使该反应进行10分钟。然后通过添加30mg脲和5μL体积的1M二硫苏糖醇(DTT)淬灭消化反应。样品的最终浓度范围为约0.15mg/mL至0.20mg/mL。
LC条件
A洗脱液:1%六氟异丙醇、0.1%二异丙基乙胺的在18.2MΩ水溶液
B洗脱液:0.075%六氟异丙醇、0.0375%二异丙基乙胺的35:65 18.2MΩ水/乙腈溶液
样品:0.2mg/mL RNA酶T1消化的mRNA
LC系统:Acquity H-Class Bio Binary Plus(Waters TechnologiesCorporation,Milford,MA)
柱:ACQUITYPREMIERBEH C181.7μm2.1×150mm柱(Waters TechnologiesCorporation,Milford,MA)
流速:0.4mL/min
梯度:在60分钟内3%-50%B
检测:260nm下UV
柱温=70℃
进样体积:5μL
在该实施例中,RNA酶T1消化通过额外添加脲连同小等分试样浓缩还原剂(即二硫苏糖醇(DTT))淬灭。如图2A和图2B所示,在两个不同的LC-MS仪器上跨越3天的跨度分析该样品,并且每次运行观察到相当的指纹图谱。结果示出本公开中提出的方法如何能够允许长时间保持样品状态,这将有利于重复分析和样品存档。
虽然本公开已经参考其示例性实施方案具体示出和描述,但是本领域技术人员将理解,在不脱离所附权利要求所涵盖的本技术的范围的情况下,可以在形式和细节上进行各种改变。例如,可以使用其它色谱系统或检测系统。
Claims (29)
1.一种用于样品中存在的靶核酸的序列分析的方法,所述方法包括以下步骤:
a.用包含第一任选的非离子或阴离子变性剂和任选的金属螯合剂的无核酸酶缓冲液处理样品以使所述靶核酸变性;
b.将所述样品与核酸酶一起温育预定量的时间,其中所述核酸酶能够使所述靶核酸片段化以产生一组核酸片段,所述一组核酸片段各自含有对应于所述靶核酸序列的序列;
c.通过添加第二非离子或阴离子变性剂和任选的二硫键还原剂来灭活所述核酸酶的片段化能力;
d.将所述核酸片段组进行单模式色谱或多模式色谱,然后进行质谱(MS)方法;以及
e.通过所述质谱方法产生所述核酸片段组的质量信号,由此由所述质量信号确定所述靶核酸的所述序列。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶核酸选自单链DNA、双链DNA、cDNA、单链RNA、双链RNA、DNA/RNA杂交体和DNA/RNA嵌合核酸。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述任选的二硫键还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、(三(2-羧乙基)膦)(TCEP)、N-乙基马来酰亚胺、半胱氨酸或谷胱甘肽。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述核酸酶选自核酸内切酶和核酸外切酶。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述核酸内切酶选自限制性内切酶、RNA核酸内切酶、DNA核酸内切酶和非特异性磷酸二酯酶。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述RNA核酸内切酶是选择性或非选择性RNA核酸内切酶,并且所述靶核酸是单链RNA或双链RNA。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述RNA核酸内切酶选自RNA酶T1、RNA酶H、Cusativin、MazF或大肠杆菌素E。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一任选的非离子或阴离子变性剂和所述第二非离子或阴离子变性剂独立地选自脲、硫脲、磺酰脲、氨基脲、酰肼、氨基硫脲、离液剂或它们的盐。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述第一任选的非离子或阴离子变性剂和所述第二非离子或阴离子变性剂独立地选自硫氰酸钠、硫氰酸钾、十二烷基硫酸钠(SDS)、脲、碘化钠、高氯酸钠、脲、洗涤剂或它们的盐。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述第一任选的非离子或阴离子变性剂和所述第二非离子或阴离子变性剂包含脲或它们的盐。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶核酸的长度为约5至约100000个单独核苷酸。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述单模式色谱或所述多模式色谱包括反相分离、阳离子交换分离、阴离子交换分离、离子对分离、正相分离、离子迁移率分离、尺寸排阻分离、手性分离、亲和分离、配体交换分离、极性非离子分离或它们的任何组合。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述单模式色谱或所述多模式色谱与UV检测系统结合。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述质谱方法选自基质辅助激光解吸/电离-飞行时间(MALDI-TOF)、电喷雾-电离(ESI)、电荷检测质谱和傅里叶变换-离子回旋共振(FT-ICR)。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述第二变性剂的浓度介于约2M与约8M之间。
16.一种在进行分析方法之前预处理样品中存在的靶核酸的方法,所述方法包括以下步骤:
a.将所述样品与核酸酶一起温育预定量的时间,其中所述核酸酶能够使所述靶核酸片段化以产生一组核酸片段,所述一组核酸片段各自含有对应于所述靶核酸序列的序列;
b.通过添加包含脲或其盐的变性剂和任选的二硫键还原剂来灭活所述核酸酶的片段化能力;以及
c.在进行所述分析方法之前将所述样品保存特定时间段。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述预定时间为0.5秒至60.0分钟。
18.根据权利要求16所述的方法,其中所述特定时间段为5分钟至6个月。
19.根据权利要求16所述的方法,其中灭活所述核酸酶的片段化能力的步骤(c)还包括在添加所述变性剂和任选的二硫键还原剂之前或之后的加热步骤。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述加热步骤包括将温度保持在30℃至80℃至少30秒或更长时间。
21.根据权利要求16所述的方法,其中所述变性剂的浓度介于约2M与约8M之间。
22.根据权利要求16所述的方法,所述方法还包括在步骤(a)之前用包含第一变性剂和金属螯合剂的无核酸酶缓冲液处理所述样品。
23.一种在LC-MS方法之前保存样品的方法,其中所述样品包含一组核酸片段和核酸酶,所述一组核酸片段各自含有对应于靶核酸序列的序列,所述方法包括以下步骤:
a.向所述样品添加包含脲或其盐的变性剂和任选的二硫键还原剂;以及
b.在所述LC-MS方法之前将样品保存特定时间段。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述变性剂的浓度介于约2M与约8M之间。
25.根据权利要求23所述的方法,其中LC-MS方法是反相离子配对液相色谱(RPIP-LC)-MS方法。
26.一种在下游测序分析之前控制靶核酸片段长度的方法,所述方法包括以下步骤:
a.将所述样品与核酸酶一起温育预定量的时间,其中所述核酸酶能够使所述靶核酸片段化以产生一组核酸片段,所述一组核酸片段各自含有对应于所述靶核酸序列的序列;
b.通过添加包含脲或其盐的变性剂和任选的二硫键还原剂来淬灭所述核酸酶的片段化能力,从而控制所述靶核酸的片段长度,其中所述片段长度取决于所述预定量的时间。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述预定时间量小于1秒。
28.根据权利要求26所述的方法,其中温育和淬灭基本上同时发生。
29.一种在下游测序分析之前控制靶核酸片段长度的方法,所述方法包括以下步骤:
a.将所述样品与核酸酶一起温育预定量的时间,其中所述核酸酶能够使所述靶核酸片段化以产生一组核酸片段,所述一组核酸片段各自含有对应于所述靶核酸序列的序列;
b.通过添加包含脲或其盐的变性剂和任选的二硫键还原剂来淬灭所述核酸酶的片段化能力,从而导致所述靶核酸序列内超过50%的遗漏切割率。
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