CN118141915A - 聚集诱导发光工程线粒体在制备治疗癌症的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了聚集诱导发光工程线粒体在制备治疗癌症的药物中的应用。所述聚集诱导发光工程线粒体为聚集诱导发光材料修饰的线粒体。所述聚集诱导发光材料为DCPy。本发明提供了一种具有高效的细胞毒性ROS生成能力，可调节癌细胞代谢途径的基于工程生物活性线粒体的微波增敏剂，可用于微波动力与线粒体的协同治疗癌症。
Description
技术领域
本发明涉及癌症药物领域，特别涉及聚集诱导发光工程线粒体在制备治疗癌症的药物中的应用。
背景技术
癌症作为威胁人类健康的重大疾病之一，一直受到研究者的高度重视。随着发病率和死亡率的不断增加，癌症已经成为一个重大的全球公共卫生问题。目前癌症主要的治疗方式有手术，化疗，放疗，免疫治疗等，但是这些传统的治疗方式也存在着一些弊端，比如手术易复发，放疗因辐射抵抗的问题使得放疗效果不理想，化疗因药物选择性差会带来严重的副作用等。因此，生物治疗等新兴的癌症治疗方式为了解决现有技术中存在的问题也在不断涌现。
微波动态癌症疗法与传统癌症疗法相比，具有组织穿透深、肿瘤消融量大、手术痛苦小、副作用小等优点，可以在肿瘤区域产生ROS，并诱导癌细胞凋亡。在微波治疗中，适合的增敏剂是治疗顺利发挥效果的基础。在微波治疗中，不适当的增敏剂，如一些金属离子的毒性或高浓度增敏剂，可能会引起严重的副作用。聚合诱导发光(AIE)由唐本忠院士团队于2001年首次提出。由于聚合诱导发光剂(AIEgen)在聚合状态下具有独特的发光特性以及在细胞毒性ROS生成能力方面表现出的高效率，其作为微波动力疗法的增敏剂运用于癌症治疗领域，可以使微波动力治疗达到预期的杀伤癌细胞和治疗效果。
此外，除了增敏剂的作用外，癌细胞中线粒体功能失调导致的Bcl-2蛋白的过度表达会提高癌细胞的抗氧化能力，削弱癌细胞中ROS的破坏能力，从而使癌细胞的存活率明显提高，削弱了微波治疗的效果。此外，功能失调的线粒体可以通过Bcl-2蛋白的过度表达影响癌细胞的凋亡途径，从而维持癌细胞的增殖。它们还影响癌细胞的新陈代谢，使其能够打开类似缺氧的途径，导致细胞凋亡的减少和治疗的阻力。因此，线粒体功能失调将大大削弱微波治疗的效果，这是一个亟待解决的问题。因此，开发一种整合AIEgen增敏剂(DCPy)和生物活性线粒体的AIE工程生物活性线粒体(AEBM)用于微波动力协同治疗癌症，将具有良好的应用前景。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了聚集诱导发光工程线粒体在制备治疗癌症的药物中的应用，所述聚集诱导发光工程线粒体通过整合AIEgen增敏剂(DCPy)和生物活性线粒体，用于微波动力协同治疗癌症。
本发明提供聚集诱导发光工程线粒体在制备治疗癌症的药物中的应用；所述聚集诱导发光工程线粒体为聚集诱导发光材料修饰的线粒体。
进一步的，所述聚集诱导发光材料为DCPy。
进一步的，所述DCPy分子被嵌入线粒体的磷脂双分子层中。
进一步的，所述聚集诱导发光工程线粒体的制备方法如下：
S1：7-(二苯胺)-9-乙基-9H-(咔唑)-2-碳醛溶液在乙醇中加入1,4-二甲基碘化吡啶和哌啶，室温下回流3小时；当冷却到室温时，产品收集，洗涤，冷冻干燥，得到红色碘盐固体；
S2：用丙酮溶解所述红色碘盐固体，滴加六氟磷酸钾溶液；将制备好的混合物进一步充分搅拌纯化得到聚集诱导发光材料；
S3：将所述聚集诱导发光材料和线粒体裂解液与PBS溶液充分混合，超声，搅拌；把多余的细胞悬液过滤进入微孔管，离心，洗涤沉淀，得到聚集诱导发光工程线粒体。
进一步的，所述聚集诱导发光工程线粒体使Bcl-2蛋白表达减少，pro-caspase3蛋白表达增加，从而重新激活凋亡途径。
进一步的，所述聚集诱导发光工程线粒体具有生成活性氧的能力。
进一步的，所述药物为微波增敏剂。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
本发明提供了聚集诱导发光工程线粒体的制备方法以及其作为癌症治疗药物的应用。所述癌症治疗药物具体可为一种微波动力治疗增敏剂，其发明设计的原料或试剂均为普通市售产片，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。因此，相较于目前的技术，本发明提供了一种合成方法简单，治疗效果良好的微波治疗增敏剂，能够产生很强的癌细胞杀伤效果，并可用于微波动力与线粒体的协同治疗癌症，无毒副作用，具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明AIE工程生物活性线粒体的制备及其在微波动力癌症治疗中的应用。GLUT1：葡萄糖转运体1，MDT：微波动力癌症治疗，OXPHOS：氧化磷酸化。
图2为(A,B)DCPy整合前后的线粒体TEM图像。比例尺为0.5μm。(C)呼吸链中DCPy修饰前后，分离的线粒体的复合物I的生物活性。(D)Mito、DCPy和Mito@DCPy的UV-Vis曲线和(E)荧光曲线。(F)DCPy与线粒体膜整合的分子模拟。(G)在微波辐射下，H2 DCF-DA与或不与DCPy和Mito@DCPy在PBS中的525nm处的荧光强度随时间的变化。(H)-OH和(I)O的EPR图谱。-OH和(I)1O2，是由Mito、DCPy和Mito@DCPy样品产生。
图3为(A)细胞对DCPy和Mito@DCPy的吸收。DCPy和Mito@DCPy在不同时间点的荧光图像。蓝色，Hoechst；红色，DCPy。(B)细胞共聚焦实验。(b-e)PANC-1细胞用以下染色剂染色的共聚焦图像：(b)Hoechst(c1)Mito-Tracker，(c2)ER-Tracker，(c3)Lyso-Tracker，(d1-d3)Mito@DCPy。(e1-e3)合并的共聚焦图像(c和d板)。(f1-f3)散点图图像代表c和d图像之间的校正因子指数。比例尺为20μm。
图4(A)与PBS、DCPy、Mito和Mito@DCPy共同培养后的细胞存活，有/无微波。(B)通过Western blotting检测四种不同处理下的原钙化酶3蛋白表达水平。(C)与DMEM、DCPy、Mito和Mito@DCPy共同培养时细胞的GLUT1浓度。(D)与DMEM、DCPy、Mito和Mito@DCPy共同培养时细胞的乳糖产量。
图5(A)注射后24小时，通过生物成像进行原发器官和肿瘤的图像。T代表肿瘤；K代表肾脏；Lu代表肺部；S代表脾脏；Li代表肝脏；H代表心脏；(B)通过平均荧光强度对DCPy和Mito@DCPy在实验性裸鼠体内的生物分布进行半定量分析。(C)给予PBS、DCPy、Mito、MW、Mito@DCPy和Mito@DCPy、5分钟MW后，实验性裸鼠的肿瘤体积变化。(D)给予PBS、DCPy、Mito、MW、Mito@DCPy和Mito@DCPy，5分钟MW后实验性裸鼠的体重变化。(E)给予PBS、Mito@DCPy L、Mito@DCPy L+B、Mito@DCPy MW和Mito@DCPy MW+B后裸鼠的肿瘤生长曲线。(F)实验小鼠在Mito@DCPy L、Mito@DCPy L+B、Mito@DCPy MW和Mito@DCPy MW+B后的体重变化(L代表白光，B代表3毫米猪肉屏障)。
图6为本发明线粒体的蛋白质浓度与分离的线粒体数量之间存在正相关。
图7为(A)PBS中的Mito和(B)PBS中的Mito@DCPy的DLS大小分布。
图8为DCPy红色探针(10μg/mL)标记的线粒体分离后的荧光图像。
图9为不同浓度的分离线粒体培养后的细胞存活率。
图10为本发明Mito、DCPy和Mito@DCPy的Zeta电位。
图11为原钙蛋白酶3的表达水平(WB检测)。在微波照射(5瓦，5分钟)之前，用DMEM、Mito、DCPy和Mito@DCPy对PANC-1细胞进行了6小时的培养。然后，PANC-1被培养了24小时。得到不同条件下处理24小时后的细胞裂解液。
图12为Bcl-2蛋白的表达水平(WB检测)。用DMEM、Mito、DCPy和Mito@DCPy对PANC-1细胞进行了24小时的处理。
图13为通过Western blotting检测Bcl-2蛋白的表达水平。
图14为注射后1小时，通过生物成像进行原发器官和肿瘤的图像。T代表肿瘤；K代表肾脏；Lu代表肺部；S代表脾脏；Li代表肝脏；H代表心脏；(B)基于(A)的半定量生物分布在Balb/c裸体小鼠。
图15为本发明各种处理后第15天肿瘤的H&E染色。
图16为本发明对各自治疗后第15天从小鼠身上剥离的肿瘤进行TUNEL检测。绿色荧光代表由TUNEL检测试剂盒染色的凋亡细胞。蓝色荧光代表被DAPI染色的细胞核。
图17为本发明从不同组的心脏、肾脏、脾脏、肺脏、肝脏获得组织学数据(所有面板的比例尺为1毫米)。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
最近的研究发现，在癌细胞中，由代谢物(如乳酸等)调控的Bcl-2家族蛋白的表达被活跃的糖酵解所促进，以维持生存。因此，随着Bcl-2的表达减少，对癌症的治疗将更有效地杀死癌细胞。此外，线粒体功能失调可能导致对细胞凋亡和生存的抵抗，以及缺氧样途径的激活，从而形成肿瘤。基于上述事实，将正常细胞中的功能性线粒体移植到癌细胞中，让癌细胞恢复正常的线粒体功能，可能对癌症治疗有帮助。为达到更好的治疗效果，将正常细胞中的线粒体功能化后移植到癌细胞，让癌细胞恢复正常的线粒体功能，可以加强治疗的效果。
实施例1实验耗材和方法
(1)材料和试剂
本发明中使用的青霉素-链霉素、胎牛血清(简称FBS)、磷酸盐缓冲盐水(简称PBS)和DMEM均购自Gibco Life Technologies。二甲基亚砜和丙酮购自Aladdin。CCK-8购自中国的Beyotime公司。本发明中使用的其他材料和试剂都是分析试剂级的。
(2)实验仪器
透射电子显微镜(TEM)使用Tecnai G2 S-Twin的场发射枪进行记录。紫外-可见光吸收光谱分析是用U-3100分光光度计(日立)实现的。爱丁堡F900荧光光谱仪用氙气弧光灯进行光致发光(PL)光谱分析。体内荧光成像由In vivo Smart-LF获得。流动细胞的分析是通过流式细胞仪(BD Accuri C6)获得的。
(3)本发明的聚集诱导材料的制备
7-(二苯胺)-9-乙基-9H-(咔唑)-2-碳醛(1.28mmol,0.5g)溶液在15mL乙醇中加入1,4-二甲基碘化吡啶(1.16mmol,0.27g)和哌啶(1滴)在室温下回流3小时。当冷却到室温时，产品收集，洗涤3次，冷冻干燥，得到红色碘盐固体(80％，0.56g)，用丙酮溶解固体产物，滴加20mL KPF6溶液。将制备好的混合物进一步充分搅拌25分钟纯化得到最终产物DCPy(99％，0.57g)，也就是聚集诱导发光材料。
(4)线粒体的提取
按照制造商Beyotime的说明书，从Balb/c小鼠的肾脏问题中提取纯线粒体。为了量化提取的线粒体，用MitoTracker对肾脏细胞进行染色，MitoTracker被加入到DMEM培养基中并孵化30分钟。通过结合荧光强度检测和BCA蛋白测定(Beyotime)，计算出提取的线粒体的平均数量。
(5)DCPy修饰的线粒体(Mito@DCPy)的制备
将0.01～10mg/mL的DCPy和200μg/mL的Mito裂解液在PBS溶液中混合均匀，超声处理10分钟，搅拌1小时，将多余的细胞悬浮液过滤到Millipore管中(MWCO 100kDa；)，用离心机在3500rpm下离心20分钟，并将所得沉淀物洗涤数次。通过测量紫外线吸收，确定DCPy和Mito之间的最佳装载比例为1:9，单位为w/w。
(6)Mito@DCPy的生物测定
按照制造商的说明书(北京太阳神科技有限公司)检测呼吸链中复合物I的活性。
(7)细胞培养
PANC-1的细胞在含有10％ FBS和其他抗性成分的DMEM中培养，在37℃的条件下，使用5％的二氧化碳。
(8)体外ROS生成的电子顺磁共振(EPR)和荧光检测
为了检测ROS的产生，将DCPy或DMSO中的Mito@DCPy加入DCFH-DA中，并记录所产生的荧光。为了检测-OH和1O2，分别加入DCPy、Mito和Mito@DCPy的DMPO。实验方法包括微波照射后检测ROS；通过EPR记录-OH和1O2的信号。
(9)细胞存活率
在微波照射(5瓦，5分钟)之前，用Mito(0.01毫克/毫升)、PBS、DCPy(0.01毫克/毫升)和Mito@DCPy(0.1毫克/毫升)分别处理PANC-1细胞6小时。辐照后PANC-1培养24小时，用标准的CCK8检测法计算细胞的相对活力。
(10)细胞摄取
DCPy在线粒体上的位置通过共聚焦显微镜(Leica，德国)进行成像。PANC-1细胞以4×104个细胞mL-1在培养皿中培养2天。然后将DCPy和Mito@DCPy加入细胞中进行培养。在去除非结合的纳米颗粒并用新鲜的培养缓冲液清洗后收集细胞，然后用流式细胞仪观察或用Hoechst染色，进一步用共聚焦荧光成像。
(11)糖酵解试验
用Glycolysis Cell-based Assay Kit测量培养液中的乳酸浓度。未处理的细胞作为对照，然后分别加入分离的Mito、DCPy和Mito@DCPy，孵育24小时后，分别收集每孔的上清液，并根据说明书进行分析。
(12)蛋白质印迹和酶联免疫吸附试验
按照制造商Beyotime的说明书获得不同条件下24小时处理后的细胞裂解液，20μL在80～200V电压下进行SDS-PAGE(12％凝胶)。转移的PVDF膜被0.2％的I-Block缓冲液封锁。分离的样品与兔单克隆抗体β-肌动蛋白、原细胞分裂酶3和Bcl-2进行孵化，然后与相应的二抗进行孵化。荧光信号用增强化学发光(ECL)检测器成像。酶联免疫吸附法用于定量测量葡萄糖转运体-1在其蛋白水平上的表达模式。葡萄糖转运体-1的浓度是通过使用商业ELISA试剂盒，按照制造商的说明书进行测量。
(13)动物模型
动物材料选自广东省医学实验动物中心。Balb/c雄性健康裸鼠，5周龄。随后的小鼠实验严格按照实验指南和机构规范进行，参考指南。SIAT的实验动物护理指南。PANC-1肿瘤模型的建立：将PANC-1细胞皮下注射到Balb/c裸鼠体内，统一注射部位在小鼠右背。在体内实验中，当肿瘤体积增长到约100mm3时，观察治疗效果。
(14)体内抗肿瘤效果
将患有PANC-1肿瘤的小鼠分为6大组，每组5只。PBS(100μL)；DCPy(100μL，20mg/kg)；Mito(100μL，20mg/kg)；微波5W，5分钟+PBS(100μL)；微波5W，5分钟+DCPy(100μL，20mg/kg)；微波5W，5分钟+Mito@DCPy(20mg/kg，100μL)。将不同的溶液注入这些小鼠体内，并将小鼠培养12小时，在微波下对肿瘤部位进行照射。每隔3天，记录小鼠的肿瘤大小和体重的变化。在第15天终止它们进行组织学分析。在微波治疗深部肿瘤的实验中，将PANC-1肿瘤宿主Balb/c裸鼠分为五个不同的小组，其中每组包括5只。对照组。PBS(100μL)；Mito@DCPy(100μL，20mg/kg)+(白光5分钟，每平方厘米90mW光强)；Mito@DCPy(100μL，20mg/kg)+(白光5分钟，每平方厘米90mW光强，3mm Pork屏障)。Mito@DCPy(100μL)+(微波5W，5分钟)；Mito@DCPy(100μ，20mg/kg)+(微波5W，5分钟，3mm Pork屏障)。12小时后，将微波相关组的肿瘤部位在微波下照射，每隔三天记录小鼠肿瘤形态的变化情况。
(15)统计学分析
所有的结果都以平均值±SD表示。除非另有说明，每个实验均以一式三份进行。采用t检验进行验证。(**p<0.01,*p<0.05,***p<0.001)。
实施例2结果和分析
正常的小鼠肝脏提供了本发明所需的健康线粒体。本发明使用BCA蛋白检测试剂盒和流式细胞仪，通过分析收集到的标记的线粒体颗粒来弄清线粒体数量和蛋白含量之间的关联。从结果来看，线粒体蛋白浓度和分离的线粒体数量之间存在良好的关系(图6)。本发明还应用动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)来评估DCPy整合前后线粒体的大小。结果显示，DCPy修饰并不影响线粒体结构的完整性，因为自由线粒体和线粒体@DCPy的流体力学直径没有明显差异(图2A，B，6)。此外，通过拍摄线粒体(图2A)和线粒体@DCPy(图2B)的TEM图像表明，DCPy修饰并没有导致线粒体的变形和解体。为了产生能量，线粒体利用OXPHOS用酶氧化营养物质，释放的能量用于ATP合成。在呼吸链中，OXPHOS过程包含四个呼吸链复合体(I-IV)和ATP生成。为了确定分离的Mito和Mito@DCPy的生物活性，本发明选择测试复合物I的酶活性，它是还原分子进入OXPHOS过程的主要入口。结果显示，与分离的Mito相比，Mito@DCPy表现出强大的酶活性，而且酶活性随着浓度的增加而增强(图2C)。上述结果都表明，DCPy修饰具有生物相容性，因为它没有破坏线粒体原有的生物活性和结构整合。本发明还实施了紫外-可见吸收和荧光光谱来分析Mito@DCPy的光学特性。如图2D、E所示，Mito@DCPy的吸收带很宽，在450nm处达到峰值，宽而最大强度的发射带在650nm处。此外，本发明通过分子模拟来确定DCPy分子如何与线粒体膜结合。分子模拟的结果显示，DCPy分子被嵌入磷脂双分子层中(图2F)。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，DCPy的Zeta电位为+18.1mV(图9)，因此可以推断，其正电荷特性有利于通过静电作用吸附负的Mito。Mito的Zeta电位为-10.8mV，而Mito@DCPy的表面电荷相对减少，为-5.1mV，表明DCPy被加载到Mito上(图9)。此外，图2G表明，DCPy和Mito@DCPy在MW辐射下表现出良好的ROS生成效率。本发明还通过应用非常可靠的EPR(电子顺磁共振)来分析ROS的产生，成功地证实了Mito@DCPy强大的ROS生成能力，因为ROS具有较短的寿命和高的化学活性(图2H，I)。因此，人工修饰的Mito@DCPy明显含有生物成分和合成的MW致敏剂的治疗效果。
在确定分离出的线粒体具有生物活性后，本发明接着研究了Mito@DCPy的细胞调节作用。结果表明，游离的Mito可以通过内吞作用、巨噬细胞和膜纳米管的隧道作用实现细胞间的转移。因此，选择人胰腺癌细胞(PANC-1)作为目标细胞系来研究细胞与线粒体的相互作用。用特异性的线粒体追踪剂DCPy对分离出的Mito进行染色。如图8所示，线粒体追踪剂DCPy显示的红色荧光信号清晰而强烈，这表明DCPy可以有效地标记线粒体。用Mito@DCPy培养后，PANC-1细胞中DCPy的红色荧光在最初1小时内没有明显增加，荧光强度低于DCPy处理的细胞(图3A)。孵化4小时后，细胞中游离的DCPy的荧光强度与Mito@DCPy的荧光强度相当，表明DCPy和Mito@DCPy在4小时内都被有效地内化到PANC-1细胞中。由于线粒体的尺寸是亚微米级的，因此就细胞吸收率而言，线粒体@DCPy与自由DCPy分子相比要慢一些。此外，为了检查Mito@DCPy在活体癌细胞中的亚细胞位置(图3B)，Mito@DCPy和不同类型的商业细胞器特异性荧光染色剂被用来共同染色PANC-1细胞。结果显示，MitoTracker Green的绿色信号和Mito@DCPy的红色信号之间有很强的共位，而LysoTracker Green和ERTrackerGreen的绿色信号之间有轻微的共位(其中结果显示Mito的皮尔逊系数为0.860，内质网为0.675，(溶酶体为0.689)。上述研究表明，Mito@DCPy进入了PANC-1细胞，并在线粒体中广泛积累。
因此，本发明调查了Mito对癌细胞增殖的影响。随着添加到PANC-1细胞中的游离线粒体浓度的增加，细胞增殖逐渐被抑制，揭示了分离出的健康线粒体被癌细胞吸收后对细胞增殖有抑制作用(图9)。在使用DCPy的MDT中，由于活性氧的有效产生，MW照射下的癌细胞被杀死约80％，而在无微波组中，对癌细胞的杀伤力有限，表明DCPy的暗毒性可以忽略不计。在没有微波的情况下，纯Mito@DCPy也能杀死癌细胞，表明活性Mito的抗癌影响仍然存在。此外，在含有Mito@DCPy的MDT中，用微波照射导致癌细胞的死亡最为明显。
然后，本发明研究了有丝分裂抑制癌细胞生长和增强MDT的机制。众多证据表明，有氧糖酵解的主要原因可能是癌细胞中线粒体的缺陷。此外，癌细胞中有氧糖酵解的增加可能进一步促进癌细胞的侵袭和转移，以及肿瘤微环境的酸化。然而，通过移植正常的线粒体来抑制癌症中的有氧糖酵解是一个可行的选择，从而不仅促进药物敏感性的提高，还能有效地减少癌细胞的生长。癌细胞中有氧糖酵解的最终产物是L-乳酸，由于其浓度可以直接表明糖酵解的程度，因此可以通过测量来确定糖酵解的程度。因此，收集细胞培养基，并测量用Mito和Mito@DCPy处理的细胞培养物中的L-乳酸浓度。如图4A所示，在用Mito@DCPy和Mito处理的PANC-1细胞中，L-乳酸的产生被有效减少，表明细胞的糖酵解在生物活性Mito的控制下被削弱。此外，本发明还分析了葡萄糖转运体1(GLUT1)的表达，它是一种单体蛋白，可以在整个哺乳动物细胞的质膜上运输葡萄糖。图4C中ELISA的结果显示，与未处理的细胞相比，用DCPy处理的细胞中GLUT1的表达没有明显变化，而用Mito和Mito@DCPy培养的细胞中GLUT1的表达明显下降。这些发现表明，通过将内源性的Mito移植到癌细胞中，可以将原本浪费的细胞能量代谢途径糖酵解转变为正常的OXPHOS，同时降低GLUT1的表达，从而减少葡萄糖的摄取，表现出突出的抗癌效果。
此外，还分析了不同处理后PANC-1细胞中凋亡相关蛋白的表达。在本发明的研究系统中，研究了由Bcl-2蛋白系以及caspase-3组成的凋亡级联激活的米托相关凋亡途径。作为一种抗凋亡蛋白，Bcl-2在癌细胞中的过量表达不仅使癌细胞表现出抗凋亡特性，帮助癌细胞增殖和防御，而且还使其具有抗氧化特性，保护癌细胞免受氧化损伤。值得注意的是，在图12中，发现自由生活的米托舱和基于DCPy的MDT可以潜在地减少PANC-1细胞中Bcl-2的表达。一般来说，作为下游核心效应物的caspase-3通常以procaspase的形式存在，由pro-caspase3形成的cleaved-caspase-3可以诱导细胞凋亡并在裂解后激活凋亡级联。由于Bcl-2可以抑制caspase级联的激活，Mito@DCPy引起的Bcl-2的明显下调诱发了pro-caspase-3表达的明显下降(图11)。这些结果表明，健康的Mito@DCPy移植不仅可以自行下调Bcl-2的过度表达，下调pro-caspase-3的表达，还可以增强MW照射产生ROS的治疗效果，使MDT的治疗效率更加协同。
随后，在上述体外实验结果的前提下，本发明进行了动物实验，研究Mito@DCPy作为微波增敏剂在体内实施的可能性。首先，对携带PANC-1肿瘤的小鼠进行了Mito@DCPy微波增敏剂的体内生物分布的评估(图5A)。在注射后的适当时间点，使用小动物生物成像系统观察Mito@DCPy在动物体内的明亮荧光信号的生物分布图像。此外，在24小时后处决了这组小鼠，并收集了组织成像所需的材料：其主要器官和肿瘤样本。在肿瘤中，Mito@DCPy组的信号比DCPy组强，这可能是对Mito@DCPy优越靶向能力的进一步验证。为了研究Mito@DCPy的治疗能力，实验中随机选取了有以下实验性肿瘤的实验小鼠：(1)PBS(0.1毫升)；(2)DCPy(20毫克公斤-1，0.1毫升)；(3)Mito(20毫克公斤-1，0.1毫升)；(4)PBS(0.1毫升)+(微波5W，300秒)；(5)DCPy(20毫克公斤-1，0.1毫升)+(微波5W，300秒)；(6)Mito@DCPy(20毫克公斤-1，0.1毫升)+(微波5W，300秒)。在注射各种治疗剂12小时后，小鼠(治疗4,5,6)肿瘤区被照成MW(5W，300s)。在15天的治疗中，记录了各种治疗中的肿瘤体积和体重。在图5C，D中，肿瘤的体积迅速扩大，在所有四个处理(PBS，DCPy，Mito和MW)中，肿瘤的生长趋势几乎相同，表明与对照组相比，DCPy、Mito单独或MW都不能延缓肿瘤的生长趋势。可能是由于DCPy的浓度有限，在DCPy+MW治疗中可以观察到更好的治疗效果(仅针对MDT)。令人鼓舞的是，Mito@DCPy+微波治疗的肿瘤抑制效率最高。在这个实验中，得到了与体外实验相同的结果：PANC-1肿瘤在治疗后被切除，15天后没有发现复发。为了检查肿瘤的生殖活性，采用免疫组化染色、苏木精染色和曙红染色试验。与其他治疗方法相比，Mito@DCPy+微波组显示出最明显的肿瘤组织凋亡，如图(14，15)所示。这些体内结果令人信服地验证了Mito@DCPy通过与MDT和工程生物活性线粒体的协同处理，抑制了PANC-1癌细胞的增殖并引发了肿瘤组织的凋亡。此外，在此期间，由于所有实验组的体重都在缓慢增加，因此没有出现明显的副作用(图5C)。本发明对主要器官进行了H&E染色，结果进一步证实，Mito@DCPy具有良好的生物安全性(图15)。此外，为了进一步评估Mito@DCPy对深部肿瘤的治疗能力，对患有肿瘤的实验小鼠随机进行了以下实验。(1)PBS(100μL)；(2)白光照射(90mW cm-2，300s)+Mito@DCPy(100μL，20mg kg-1)；(3)白光照射(90mW cm-2，300s)+Mito@DCPy(20mg kg-1，100μL)+(3mm猪肉屏障)。(4)微波照射(5W，300s)+Mito@DCPy(100μL)；(5)微波照射(5W，300s)+Mito@DCPy(20mg kg-1，100μL)+(3mm猪肉屏障)。注射后12小时，小鼠的肿瘤区接受以下处理：90mWcm-2的白光照射300s(处理2,3)，5W的MW照射300s(处理4,5)。15天的疗程后，记录不同处理下的肿瘤体积和体重。在图5中，用Mito@DCPy和白光照射处理的小鼠对肿瘤生长表现出明显的抑制作用。通过对正位肿瘤的真实建模，为了增强穿透深度，肿瘤表面覆盖了3毫米厚的外猪肉。结果发现，虽然Mito@DCPy+MW+猪肉的肿瘤生长抑制率近似退步到4.4％左右，但在Mito@DCPy+白光+猪肉组中，可以预见几乎可以忽略的抑制效果，说明MW的穿透深度要优于白光。因此，可以得出结论，Mito@DCPy+MW增强的抗癌效果是由于纳米粒子的肿瘤保留率升高，MW的渗透深度，以及MW诱导的MDT。综上所述，Mito@DCPy MW增敏剂介导的MW动态癌症治疗效果不仅表现出对肿瘤生长的良好抑制，而且毒性也很小。
综上，为了解决PDT对深部肿瘤的低渗透性和治疗效果，本发明设计了一种基于AIE工程生物活性线粒体的新型微波动力癌症疗法。在不影响线粒体的完整性和生物活性的前提下，本发明设计的有机小分子DCPy可以在线粒体的膜上快速标记，同时。此外，固定在线粒体上的DCPy的松散的分子内包装和受限的移动有助于光敏剂产生明亮的荧光和高效的ROS。微波的深层穿透力也可以使该疗法在深层次上对肿瘤有效。内化后，健康的Mito可以通过降低GLUT1的表达来减少葡萄糖的吸收，从而将癌细胞原本浪费的有氧糖酵解能量代谢途径改变为正常的OXPHOS。此外，移植的Mito影响了Bcl-2蛋白和pro-caspase3蛋白的表达，使前者减少，后者增加，从而重新激活了凋亡途径。基于DCPy的MW疗法由于Mito促进细胞凋亡的作用而实现了对癌细胞的增强杀伤。合成分子和分离的活细胞器之间的整合产生了新的协同作用，以解决复杂的生物问题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.聚集诱导发光工程线粒体在制备治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述聚集诱导发光工程线粒体为聚集诱导发光材料修饰的线粒体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚集诱导发光材料为DCPy。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述DCPy分子被嵌入线粒体的磷脂双分子层中。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚集诱导发光工程线粒体的制备方法如下：
S1：7-(二苯胺)-9-乙基-9H-(咔唑)-2-碳醛溶液在乙醇中加入1,4-二甲基碘化吡啶和哌啶，室温下回流3小时；当冷却到室温时，产品收集，洗涤，冷冻干燥，得到红色碘盐固体；
S2：用丙酮溶解所述红色碘盐固体，滴加六氟磷酸钾溶液；将制备好的混合物进一步充分搅拌纯化得到聚集诱导发光材料；
S3：将所述聚集诱导发光材料和线粒体裂解液与PBS溶液充分混合，超声，搅拌；把多余的细胞悬液过滤进入微孔管，离心，洗涤沉淀，得到聚集诱导发光工程线粒体。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚集诱导发光工程线粒体使Bcl-2蛋白表达减少，pro-caspase3蛋白表达增加，从而重新激活凋亡途径。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚集诱导发光工程线粒体具有生成活性氧的能力。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为微波增敏剂。
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