CN118121706A - 杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用 - Google Patents

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CN118121706A CN202410273195.0A CN202410273195A CN118121706A CN 118121706 A CN118121706 A CN 118121706A CN 202410273195 A CN202410273195 A CN 202410273195A CN 118121706 A CN118121706 A CN 118121706A
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Abstract

本发明属于抗生素协同治疗药物技术领域，涉及杜鹃素联合β‑内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用。本发明提供了杜鹃素联合β‑内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用。杜鹃素与β‑内酰胺类抗生素具有良好的体外协同治疗效果，可以增加金黄色葡萄球菌对β‑内酰胺类抗生素的敏感性，协助清除体内的金黄色葡萄球菌，本发明对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA感染提供了理论依据和新的治疗手段。

Description

杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌感 染所致疾病的药物中的应用
技术领域
本发明属于抗生素协同治疗药物技术领域，具体涉及杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是一种革兰氏阳性病原菌，广泛分布于自然界，在人和动物的皮肤以及与外界相通的腔道中都有存在。金葡菌能够引起心内膜炎、菌血症、肺炎以及皮肤和软组织感染等一系列疾病。青霉素的问世曾经有效地控制了由金葡菌感染引起的各种疾病。然而，随着抗生素的过度使用，细菌在巨大的选择压力下出现了各种不同的耐药机制，这些耐药机制最终导致了超级细菌的出现。这些超级细菌的传播不仅使得人类的死亡率急剧上升，还威胁到了经济动物，如牛、羊、猪和鸡，给畜牧业生产带来了巨大的经济损失。当前，金葡菌的耐药机制越来越复杂，对各种临床上一线抗菌药物都出现了耐药性。随着后抗生素时代的到来，抗菌药物已无法满足不断出现的耐药性细菌，因此，人们开始采取各种策略来对抗金葡菌。通过不断研究金葡菌耐药性的形成的分子机制，寻找小分子化合物来增强抗生素的活性，以协同治疗耐药菌感染。最初，人们倾向于开发直接针对耐药机制的药物，例如当β-内酰胺类抗生素被酶分解时，就开发了酶稳定性的抗生素。随着药物开发的难度不断加大，寻找相应酶的抑制剂与抗生素联用成为了一种有效的策略。然而，由于水解酶种类的多样性和酶抑制剂提供的选择压力，使得出现了抑制剂的突变体。因此寻找新的与抗生素协同治疗耐药菌感染的药物是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用。杜鹃素与β-内酰胺类抗生素具有良好的体外协同治疗效果，本发明对抗MRSA感染提供了理论依据和新的治疗手段。
本发明提供了杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用。
本发明还提供了杜鹃素在制备增强β-内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌敏感性的药物中的应用。
优选的是，所述β-内酰胺类抗生素包括氨苄西林、青霉素G、头孢西丁、拉氧头孢和头孢吡肟中的一种或两种以上。
本发明还提供了杜鹃素在制备β-内酰胺酶阳性抑制剂中的应用。
优选的是，所述β-内酰胺酶包括A类β-内酰胺酶。
优选的是，所述A类β-内酰胺酶包括BlaZ。
本发明还提供了杜鹃素在制备具有如①～⑧任一项或两项以上作用的药物中的应用：
①抑制pbp2a活性；
②减少金黄色葡萄球菌毒力因子的分泌；
③抑制金黄色葡萄球菌的溶血活性；
④抑制金黄色葡萄球菌群体感应系统；
⑤抑制金黄色葡萄球菌色素产生；
⑥降低金黄色葡萄球菌的抗氧化能力；
⑦提升β内酰胺类抗生素菌内ROS反应；
⑧下调CrtN的表达。
本发明还提供了杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌所致肺炎的药物中的应用。
本发明还提供了杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备减少金黄色葡萄球菌对上皮细胞内化的药物中的应用。
优选的是，所述β-内酰胺类抗生素包括头孢吡肟。
本发明提供了杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用。本发明发现杜鹃素与β-内酰胺类抗生素具有良好的体外协同效果。本发明系统地考察了杜鹃素对金黄色葡萄球菌协同效应，对金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶、PBP2a功能、色素、功能性膜微域和Agr系统的影响，并评估了杜鹃素与头孢吡肟联合治疗在小鼠肺炎模型中的疗效，揭示杜鹃素的协同抗菌作用机制，为对抗MRSA感染提供理论依据和新的治疗手段。
杜鹃素可以从宿主和细菌双方面进行调节，从而显著减少金黄色葡萄球菌引起的肺部损伤，并且杜鹃素还可以增加金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性，协助清除体内的金黄色葡萄球菌。相较于传统抗生素治疗，与杜鹃素联合使用可大幅度降低金黄色葡萄球菌对部分β内酰胺类抗生素的MIC。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的杀菌曲线测定杜鹃素与头孢吡肟联合抗USA300作用结果图；
图2为本发明提供的羟胺法测定克拉维酸与杜鹃素抑制金黄色葡萄球菌USA300β-内酰胺酶活性结果图；
图3为本发明提供的USA300和29213菌株中β-内酰胺酶类型检测结果图；
图4为本发明提供的BlaZ基因PCR扩增结果结果图；
图5为本发明提供的pET28a-BlaZ质粒的测序鉴定结果图；
图6为本发明提供的BlaZ蛋白表达及纯化结果图；
图7为本发明提供的荧光猝灭实验分析杜鹃素与BlaZ的结合亲和力结果图；
图8为本发明提供的分子对接揭示杜鹃素与BlaZ的相互作用结果图；
图9为本发明提供的杜鹃素对金黄色葡萄球菌色素的抑制作用结果图；
图10为本发明提供的过氧化氢杀伤实验结果图；
图11为本发明提供的杜鹃素对crtN基因的mRNA水平影响结果图；
图12为本发明提供的杜鹃素对金黄色葡萄球菌内PBP2a蛋白寡聚的影响结果图；
图13为本发明提供的杜鹃素对金黄色葡萄球菌溶血活性抑制作用结果图；
图14为本发明提供的RT-qPCR检测杜鹃素对agr系统相关转录水平的影响结果图；
图15为本发明提供的PCR扩增agrAC基因结果图；
图16为本发明提供的pET28a-SrtA质粒的测序鉴定结果图；
图17为本发明提供的SDS-PAGE检测AgrAC的表达及纯化结果图；
图18为本发明提供的细胞内热稳定迁移分析杜鹃素与agrAC的直接相互作用结果图；
图19为本发明提供的热稳定迁移分析杜鹃素与agrAC的相互作用结果图；
图20为本发明提供的凝胶迁移实验分析杜鹃素与agrAC的相互作用结果图；
图21为本发明提供的荧光淬灭分析杜鹃素与agrAC的相互作用结果图；
图22为本发明提供的分子对接揭示杜鹃素与AgrAC的结合模式及主要氨基酸位点结果图；
图23为本发明提供的杜鹃素联合杜鹃素联合头孢吡肟对MRSA感染小鼠生存率的影响结果图；
图24为本发明提供的杜鹃素联合杜鹃素联合头孢吡肟对MRSA感染小鼠肺部载菌量的影响结果图；
图25为本发明提供的杜鹃素联合头孢吡肟对MRSA感染小鼠肺部组织病理学变化结果图。
具体实施方式
本发明提供了杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用。杜鹃素可作为人或兽用的药物添加剂，辅助抗生素治疗金黄色葡萄球菌感染，大幅度减少抗生素的使用剂量；如杜鹃素可充当口服抗生素的佐剂，制备成口服类药物。杜鹃素体内的治疗效果，在金黄色葡萄球菌感染早期阶段，抑制agr系统和调节宿主细胞膜可以有效抑制内化过程，杜鹃素对金黄色葡萄球菌的群体感应系统的抑制，可以有效减少金黄色葡萄球菌造成的炎性损伤和扩散，防止金黄色葡萄球菌对上皮屏障的突破。在感染的初期抗生素未起到直接杀伤作用时，杜鹃素可以通过抑制金黄色葡萄球菌毒力系统的分泌来减少金黄色葡萄球菌对机体的损伤以及对免疫系统的破坏能力。本发明证实了杜鹃素可以下调hla和agr系统的表达，使金黄色葡萄球菌分泌的毒力因子下降，减少其对细胞屏障的损伤。除此之外，杜鹃素还可减少金黄色葡萄球菌对上皮细胞的内化。减少内化过程，使抗生素能够在细胞外接触到金黄色葡萄球菌，从而增强其杀伤作用。还能抑制金黄色葡萄球菌的溶血活性。其次，针对金黄色葡萄球菌的耐药性，杜鹃素可通过破坏pbp2a和抑制β-内酰胺酶的功能来抑制MRSA对抗生素的耐药性，增强金黄色葡萄球菌的敏感性。最后，杜鹃素的抑制作用还包括对金黄色葡萄球菌色素的抑制，可以使金黄色葡萄球菌难以逃避胞内ROS以及β-内酰胺类抗生素引起的ROS机制。
本发明还提供了杜鹃素在制备增强β-内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌敏感性的药物中的应用。在本发明中，所述β-内酰胺类抗生素优选包括氨苄西林、青霉素G、头孢西丁、拉氧头孢和头孢吡肟中的一种或两种以上。杜鹃素对于金黄色葡萄球菌的增敏作用主要来自于两部分，通过抑制β内酰胺酶和pbp2a的活性。杜鹃素能够抑制金黄色葡萄球菌的耐药水平，减少β-内酰胺类抗生素的使用剂量；将杜鹃素与β-内酰胺类抗生素联合使用能增强β-内酰胺类药物对金黄色葡萄球菌的敏感性。与杜鹃素联合使用可大幅度降低金黄色葡萄球菌对部分β内酰胺类抗生素的MIC。在本发明中，所述金黄色葡萄球菌优选包括MRSAUSA300和MSSA29213。在本发明所述药物中，杜鹃素的浓度为32μg/mL以上，β-内酰胺类抗生素的浓度为抗生素使用剂量的四分之一至二分之一。在上述浓度配比下，能够表现出协同抗菌作用。具体的，氨苄西林、青霉素G、头孢西丁、拉氧头孢、头孢吡肟与杜鹃素对USA300表现出协同抗菌作用；而对于29213，只有氨苄西林和青霉素G与杜鹃素合用才能表现出协同抗菌作用。说明杜鹃素和抗生素联用对MRSA有更广泛的保护，对普通金黄色葡萄球菌就只有氨苄西林和青霉素G这两种。试验结果表明，当MRSA(USA300)造成细菌感染时，头孢吡肟体内有效的杀菌浓度大于128μg/ml，而伴随杜鹃素的使用可以将抗生素使用浓度降低四倍以上，并且没有已知的任何毒性。
本发明还提供了杜鹃素在制备β-内酰胺酶阳性抑制剂中的应用。杜鹃素能抑制金黄色葡萄球菌破碎液中的β-内酰胺酶，且抑制程度与克拉维酸相似。在本发明中，所述β-内酰胺酶优选包括A类β-内酰胺酶。在本发明中，所述A类β-内酰胺酶优选包括BlaZ。细菌耐药的一部分来源是抗生素水解酶，通过使用相应的水解酶抑制剂可以减少抗生素使用剂量。试验结果表明，USA300菌株存在BlaZ、BlaZTEM-1、BlaCTX-M、BlaPER、BlaGES 5种青霉素酶，而29213菌株则仅存在BlaZ和BlaZTEM-1两种青霉素酶。因此，杜鹃素可能同时抑制USA300和29213菌株中的BlaZ和BlaZTEM-1两种青霉素酶，产生协同效应。进一步试验结果表明，杜鹃素通过与BlaZ中的ASN 132、ASN 170和ARG 244三个残基相互作用，实现与BlaZ的结合，进而抑制BlaZ酶活。杜鹃素在药物动力学方面的参数较为优秀，可以充当口服抗生素的佐剂之一。细菌耐药的一部分来源是抗生素水解酶，杜鹃素可通过抑制水解酶减少抗生素使用剂量。
本发明还提供了杜鹃素在制备具有如①～⑧任一项或两项以上作用的药物中的应用：
①抑制pbp2a活性；试验结果表明，PBP2a经过DSP在细菌内交联后可以形成三聚体，而经过杜鹃素处理后出现了寡聚降低，说明杜鹃素通过干扰pbp2a的功能，使MRSA变回敏感菌株。
②减少金黄色葡萄球菌毒力因子的分泌；在感染的初期抗生素未起到直接杀伤作用时，杜鹃素可以通过抑制金黄色葡萄球菌毒力系统的分泌来减少金黄色葡萄球菌对机体的损伤以及对免疫系统的破坏能力。杜鹃素减少金黄色葡萄球菌毒力因子分泌的作用是通过抑制群体感应系统来实现的。通过对杜鹃素处理后的α溶血素(α-hemolysinhla)分泌和相应系统转录水平的检测，以及杜鹃素与群体感应系统的组分蛋白的结合来说明杜鹃素抑制金黄色葡萄球菌毒力分泌的方式。
③抑制金黄色葡萄球菌的溶血活性；杜鹃素可以以剂量依赖性的方式降低USA300的溶血能力，并且在杜鹃素起到协同浓度下，USA300的溶血活性抑制率可达57.9％。在本发明中，所述协同浓度优选指的是64μg/mL。
④抑制金黄色葡萄球菌群体感应系统；杜鹃素可以以剂量依赖性的方式下调agr系统相关基因，其中agrA基因最高可下调5.3倍，hla基因最高可下调4.8倍，RNAⅢ基因最高可下调5.5倍。并且，杜鹃素能够显著降低agrAC蛋白的降解速度，明显影响agrAC蛋白的Tm值，且抑制agrAC蛋白与P3启动子的结合，杜鹃素与agrAC蛋白结合常数KA为2.943×104l/moL，杜鹃素能够与agrA蛋白SER-164、LEU-186和AGR-198等氨基酸以氢键结合，说明杜鹃素与agrAC蛋白存在相互作用。通过对金黄色葡萄球菌群体感应系统进行抑制，可减少金黄色葡萄球菌造成的炎性损伤和扩散、防止金黄色葡萄球菌对上皮屏障的突破。
⑤抑制金黄色葡萄球菌色素产生；杜鹃素通过抑制金黄色葡萄球菌色素产生，能够减少MRSA的耐药性和体内生存能力。当杜鹃素用于抑制金黄色葡萄球菌色素产生时，杜鹃素的浓度优选为64μg/mL以上。
⑥降低金黄色葡萄球菌的抗氧化能力；过氧化氢杀伤实验结果表明，杜鹃素显著的降低了金黄色葡萄球菌在氧化环境中的存活率。
⑦提升β内酰胺类抗生素菌内ROS反应；杜鹃素通过削减金葡菌抗氧化能力，从而增加了β内酰胺类抗生素的杀伤。
⑧下调CrtN的表达。杜鹃素以浓度依赖性降低CrtN的基因表达，使金黄色葡萄球菌色素合成减少。
本发明还提供了杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌所致肺炎的药物中的应用。在本发明中，所述β-内酰胺类抗生素优选包括头孢吡肟。杜鹃素兼备抗毒力和协同作用，并且有着良好的体内药物动力学参数，本发明将杜鹃素与头孢吡肟联合应用大幅度减少了两种药的使用剂量。
本发明还提供了杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备减少金黄色葡萄球菌对上皮细胞内化的药物中的应用。在本发明中，所述β-内酰胺类抗生素优选包括头孢吡肟。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
杜鹃素抑制细菌耐药水平，减少抗生素使用剂量：
1.1最小抑菌浓度测定(Minimal inhibitory concentration，简称MIC)
用微量肉汤稀释法测定杜鹃素和β-内酰胺抗生素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度。挑取需要测定MIC的单菌株，接种于LB液体培养基中，于200rpm/min37℃摇床中过夜培养，然后以1:100的比例接于CAMHB培养基中，培养至OD600＝0.8左右。药物用CAMHB培养基进行连续倍比稀释，然后每孔100μL填加到96孔板中。随后，每孔填加金黄色葡萄球菌悬液(1×106CFU/mL)，将微量平板置于37℃孵箱中孵育16h，用酶标仪(TECAN)测定OD600。
1.2联合抑菌指数测定
取无菌96孔板，纵向放置，纵轴代表中药单体的药物浓度，横轴代表抗生素的浓度。杜鹃素从四分之一的MIC倍最低抑菌浓度开始进行连续稀释，抗生素从MIC开始连续稀释，然后金黄色葡萄球菌如MIC所述接种和培养条件。根据分数抑制浓度指数(FICI)确定潜在的协同作用，该指数由以下公式计算得出：
(MIC combination)/(MIC alone)+(MIC antibiotic combination)/(MICantibiotic alone)；FICI≤0.5为协同作用；>0.5与≤2.0之间为相加；>2为拮抗作用。根据FICI值，选取合适的抗生素进行实验。
杜鹃素与β-内酰胺类抗生素对MRSAUSA300、ATCC29213的抗菌作用结果如下：
经过测定，发现杜鹃素对MRSAUSA300和MSSA29213的最小抑菌浓度均为512μg/mL。此外，杜鹃素仅在64μg/mL的浓度下表现出与其他抗生素的协同作用。其中，氨苄西林、青霉素G、头孢西丁、拉氧头孢、头孢吡肟与杜鹃素对USA300表现出协同抗菌作用；而对于29213，只有氨苄西林和青霉素G与杜鹃素合用才能表现出协同抗菌作用。杜鹃素可以协同β内酰胺类抗生素抗金葡菌。杜鹃素对耐药性更高的金葡菌，有着广泛的协同抗生素种类和效果。具体的MIC值以及FICI值见表1和表2。
表1杜鹃素与β-内酰胺类抗生素联合抗MRSAUSA300作用
表2杜鹃素与β-内酰胺类抗生素联合抗MSSA29213作用
1.3时间-杀菌曲线
时间杀菌曲线实验在CAMHB肉汤培养基中进行。在初始接种量为5×106CFU/mL的USA300中，同时加入亚MIC的β-内酰胺类抗生素(如1/8×MIC或1/4×头孢吡肟)或杜鹃素(1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC)。分别于37℃孵育0h、4h、8h、12h和24h进行菌落计数，协同效应定义为联合用药24h≥lg2(CFU/mL)低于最有效药物单独作用24h。
探讨杜鹃素与头孢吡肟联合对金黄色葡萄球菌USA300的杀菌效果。结果(图1，杀菌曲线测定杜鹃素与头孢吡肟联合抗USA300作用结果图)显示，单独使用1/16MIC的杜鹃素几乎没有抑菌效果；1/16MIC的头孢吡肟与1/8MIC的杜鹃素联合使用，在24h内持续抑制金黄色葡萄球菌生长；单独使用1/4MIC或1/8MIC的杜鹃素时，在前12h抑制效果较为明显，但24h几乎没有任何抑制效果；1/8MIC的杜鹃素与1/4MIC的头孢吡肟处理后，在前12h内金黄色葡萄球菌数量大幅度降低，并在24h持续作用；而1/4MIC的杜鹃素与1/4MIC的头孢吡肟处理后，在8h内就可以完全杀死金黄色葡萄球菌。
头孢吡肟在人类血药浓度峰值约为193μg/ml，并在大鼠模型中进行四倍剂量上给药，均未见该品对动物具有毒性或生育力和生殖有明显影响。杜鹃素在小鼠的药物动力学测试中，血药浓度峰值约为256μg/ml，无明显毒性。当MRSA造成细菌感染时，头孢吡肟体内有效的杀菌浓度大于128μg/ml，而伴随杜鹃素的使用可以将抗生素使用浓度降低四倍以上，并且没有已知的任何毒性。
1.4羟胺法测定杜鹃素对金黄色葡萄球菌USA300β-内酰胺酶活性影响
1.4.1β-内酰胺酶的提取
挑取USA300菌株单个菌落接种于BHI肉汤中，过夜培养。然后用新鲜的BHI肉汤按1:100的比例对其进行稀释培养，按1:1000的比例加入苯唑西林溶液，振荡培养4h。4000rpm4℃离心30min，收集菌体并用PBS缓冲液冲洗3次后重悬于PBS中，加入5μL(1mg/mL)溶葡萄球菌素37℃处理2h，超声破碎细菌。10000rpm 4℃离心1h。收集上清液即为酶溶液(粗提的酶液)于-80℃保存备用。
1.4.2青霉素G含量标准曲线的绘制
将青霉素G溶于柠檬酸钠-盐酸缓冲液，用容量瓶定容。从母液中分别取母液50～750μL加缓冲液至1mL。分别加入1mL中性羟胺和95％乙醇1mL，反应3min后，加入硫酸铁铵2mL，待反应液中气泡消失后用酶标仪测定515nm处的吸光度值。
1.4.3羟胺法测定杜鹃素和克拉维酸对青霉素酶活性的影响
将1.4.1粗提的酶液加入不同浓度的克拉维酸，杜鹃素室温反应10min，再加入青霉素G溶液(青霉素G终浓度为1000μg/mL)，于37℃下孵育30min。反应结束后，取1mL样品，其他步骤(与中性羟胺直接混合)与青霉素标准曲线的步骤一样，测值，根据标准曲线得出青霉素G的含量。
采用羟胺法检测溶液中未分解的青霉素G含量。在苯唑西林诱导下，金黄色葡萄球菌表达的青霉素酶增加并释放出总β-内酰胺酶。柠檬酸钠缓冲液可使青霉素酶分解青霉素G。克拉维酸是一种被公认用于临床的β-内酰胺酶阳性抑制剂，对A类β-内酰胺酶有广谱抑制活性，本发明采用克拉维酸作为阳性对照。
实验结果(图2，羟胺法测定克拉维酸与杜鹃素抑制金黄色葡萄球菌USA300β-内酰胺酶活性结果图)表明，克拉维酸钾和杜鹃素都能抑制金黄色葡萄球菌破碎液中的β-内酰胺酶，且抑制程度相似。当克拉维酸浓度逐渐升高时，破碎液中青霉素酶活性直线降低，最高可保存80％的青霉素G不被分解，相对于PBS组，青霉素G保存含量提升3倍。类似地，杜鹃素处理组中，随着浓度逐渐增加，破碎液中青霉素活性直线下降，并且相对于PBS组，青霉素G含量提升了约3倍。因此，杜鹃素可能与克拉维酸抑制金黄色葡萄球菌中β-内酰胺酶的种类相同，均为A类β-内酰胺酶。
1.5USA300和29213菌株中β-内酰胺酶的检测
以USA300和29213菌株的基因组DNA为模板进行β-内酰胺酶基因扩增，这些β-内酰胺酶均以青霉素为优先底物。将扩增产物送至生工生物(上海)股份有限公司测序，结果利用NCBI网站BLAST工具进行序列比对。
杜鹃素可以抑制金黄色葡萄球菌破碎液中的β-内酰胺酶活性。因此，本发明对实验所使用的菌株进行了检测，以查看杜鹃素可以抑制哪些类型的β-内酰胺酶。本发明检测了9种常见的青霉素酶。结果如图3(USA300和29213菌株中β-内酰胺酶类型检测结果图，其中，M:takara 2000marker；1和10为BlaZ的阳性对照，2-9为BlaTEM-1、BlaCTX-M、BlaSHV、BlaOXA-2、BlaOXA-10、BlaVEB、BlaPER、BlaGES，其中A、B为以USA300基因组为模板扩增产物，C为以29213基因组为模板扩增产物)所示，将PCR产物按照相应片段预计大小切下，并送往库美公司测序，将测序成功的序列用blast进行比对。USA300菌株存在BlaZ、BlaZTEM-1、BlaCTX-M、BlaPER、BlaGES 5种青霉素酶，而29213菌株则仅存在BlaZ和BlaZTEM-1两种青霉素酶。因此，杜鹃素可能同时抑制USA300和29213菌株中的BlaZ和BlaZTEM-1两种青霉素酶，产生协同效应。
1.6BlaZ基因克隆及蛋白纯化表达
以USA300菌株基因组为模板，进行PCR方法扩增出771bp的BlaZ基因，并在两端引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点和保护性碱基，引物如下：BlaZ-FCGCGGATCCAAAGAGTTAAATGATTTA(SEQ ID NO.1)；BlaZ-RCCGCTCGAGTCAAAATTCCTTCTATACACT(SEQ ID NO.2)。扩增后经过凝胶回收、双酶切、与双酶切的pET28a载体连接、转化DH5α菌株、阳性单克隆经过测序验证后留存并提取质粒转化BL21菌株。将鉴定阳性的BL21菌株培养至OD600达0.8～1.0时，冰浴30min，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，16℃诱导9～12h。诱导表达完成后，收集菌体，用PBS冲洗两次，重悬于PBS，超声裂解菌体，低温离心，收集上清。将收集的上清液放于4℃冰箱进行蛋白纯化，将大量诱导表达的蛋白分别按照His亲和层析柱操作说明书进行纯化。用10kDa孔径的超滤浓缩管进行置换buffer与浓缩，减少对后续试验影响。
以USA300基因组为模板扩增BlaZ基因，扩增产物大小771bp，经测序比对后与GenBank中BlaZ基因序列同源性达100％，证明已成功扩增BlaZ基因。如图4，BlaZ基因PCR扩增结果结果图，其中，MarkerDL2000；1-2BlaZ扩增产物。
随后将BlaZ和pET28a载体分别进行双酶切，通过T4连接酶构建pET28a-BlaZ重组质粒，并转化至DH5α中，进行测序鉴定。测序结果与标准序列进行比对，结果如图5(pET28a-BlaZ质粒的测序鉴定结果图)所示，证明pET28a-BlaZ重组质粒构建成功。
将构建成功的pET28a-BlaZ重组质粒转化至BL21(DE3)中，诱导表达并纯化，经SDS-PAGE分析，结果如图6(BlaZ蛋白表达及纯化结果图，其中，M:赛维尔10-200kDa蛋白marker；1-5诱导后、5mM、15mM、100mM、400mM浓度咪唑洗脱液)所示，诱导后可明显的条带。经镍柱纯化后，可见单一的目的条带，大小约为29.7kDa，与预计大小一致。
1.7荧光淬灭
用PBS将纯化的重组蛋白稀释至500ng/mL。在石英比色皿中加入2.5mL稀释的靶蛋白，随后逐渐加入不同浓度的小分子抑制剂。在室温下孵育1min后，使用荧光分光光度计测量混合溶液的荧光光谱。激发和发射宽度为5.0nm，激发波长为280nm。记录280～400nm范围内的荧光发射光谱，按照如下公式计算KA值：
F0/F＝1+Ksv[Q]＝1+κqτ0[Q]
F0和F表示添加抑制剂(猝灭剂)前后重组蛋白的荧光强度，[Q]是猝灭剂的摩尔浓度，单位为mol/L，Ksv是斯特恩-沃尔默常数，κq是分子间猝灭速率常数，τ0是荧光寿命。为了计算亲和常数，绘制F0/F与[Q]的Stern-Volmer图，并通过线性回归计算亲和常数。
荧光淬灭是一种基于小分子与蛋白结合形成静态淬灭的原理来验证它们之间是否存在直接相互作用。结果如图7(荧光猝灭实验分析杜鹃素与BlaZ的结合亲和力结果图)所示，随着杜鹃素浓度的增加，BlaZ的荧光逐渐减弱，而且荧光强度与杜鹃素浓度呈线性相关。经计算KA值为3.1512×104l/moL，表明杜鹃素与BlaZ之间存在强烈的相互作用。
1.8β-内酰胺酶BlaZ与杜鹃素的分子对接
通过分子模拟揭示旨在进一步揭示杜鹃素与BlaZ结合的主要氨基酸位点。BlaZ蛋白的晶体结构(PDBID：1ALQ)由PDB网站提供https://www.rcsb.org/structure/1ALQ。杜鹃素的3D结构由ChemBioDraw Ultra和ChemBio3D Ultra软件绘制。AutoDockTools软件包用于生成对接输入文件。通过合并非极性氢原子和限定可旋转键来制备配体结构。然后进行MD研究以修正对接结果。
本发明利用分子对接技术，对USA300的β-内酰胺酶BlaZ与杜鹃素的相互作用模式进行了探究。BlaZ属于AmberA类β-内酰胺酶，其共同活性位点是保守序列I：Ser70.Thr71.Ser72.Lys73(STSK)中的Ser70。此外，BlaZ的催化腔中还存在着三个保守序列，分别为Serl30、Aspl3l-Asnl32(SDN)、Lys231、Ser232、Gly233(KSG)以及Asnl61-Pro180(Q-loop)。本发明发现，杜鹃素能够通过氢键的形式与BlaZ蛋白中的ASN 132，ASN 170和ARG 244三个残基相互作用。其中，与ASN 132相互作用的杜鹃素可作用于SDN序列，而ASN170则能够阻止β-内酰胺酶通过Q-loop序列进入催化腔。此外，杜鹃素还能够通过与ARG244的互作用，阻止由Tyr238-Ala239-Ser240-Ar924l-Asn242-Asp243构成的238-loop进入催化腔。值得注意的是，杜鹃素与ASN 132、ASN 170和ARG 244三个残基的相互作用处于三个受力方向，使得其在BlaZ腔内受力更为稳定(表3和图8，分子对接揭示杜鹃素与BlaZ的相互作用结果图)。可见，杜鹃素直接与BlaZ的结合来抑制其酶活的。
表3分子对接揭示杜鹃素与BlaZ的相互作用
Receptor PDBID Ligand PubchemCID Bindingenergy(kcal/mol)
BlaZ 1ALQ Farrerol 91144 -8.1
1.9杜鹃素对金黄色葡萄球菌色素抑制实验
挑取USA300单菌落过夜培养，然后以1:100接种于新鲜的BHI培养基中，每管5毫升并加入终浓度为0～256μg/mL的杜鹃素培养24h。取1.5mL细菌培养物离心，目测金黄色葡萄球菌的色素沉着情况。对照组(40μL二甲基亚砜)对金黄色葡萄球菌USA300菌株的生长和着色无明显影响。
1.10杜鹃素对金黄色葡萄球菌色素产量影响
挑取USA300单菌落过夜培养，然后以1:100接种于新鲜的BHI培养基中，并加入终浓度为0～256μg/mL的杜鹃素培养48h。取3mL菌液离心，PBS洗涤2次，用甲醇提取色素三次，每次提取用的甲醇体积分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，每次提取不少于30min，加完甲醇放置在摇床上震荡提取，最终将提取物混合使甲醇体积最终总容量为1mL。分光光度计在450nm处测定不同浓度的杜鹃素对金黄色葡萄球菌色素产生的吸光度值。计算不同浓度的化合物对金黄色葡萄球菌色素产生的抑制率，以不加化合物加入等体积的溶剂作为对照，并使用Prism软件计算IC50值，并用IC50值进行后续实验。
在色素抑制实验中，研究发现，杜鹃素呈现剂量依赖性的抑制金黄色葡萄球菌USA300的色素产生。当杜鹃素浓度为64μg/mL时，就能明显地抑制43％的色素生成；而当浓度增至256μg/mL时，可以抑制87％的色素产生。这些结果表明，杜鹃素可以有效地抑制MRSA中色素的合成。图9为杜鹃素对金黄色葡萄球菌色素的抑制作用结果图(**代表P<0.01；***代表P<0.001)。
1.11过氧化氢杀伤实验
挑取USA300单菌落过夜培养，然后以1:100接种于新鲜的BHI培养基中，在含或不含64μg/mL杜鹃素的培养液中培养24h。3mL菌液被离心收集并用PBS洗涤2次，并稀释浓度至1×107cfu/mL。将过氧化氢加入1.5％的最终浓度，并在37℃下以250rpm摇动孵化1h。加入1000U/mL外源过氧化氢酶使反应停止。细菌活力通过TSA平板上计数存活CFU的稀释度来评估。
金黄色葡萄球菌色素在金黄色葡萄球菌中充当还原性物质，当遭遇到活性氧化物质的伤害时，金黄色葡萄球菌色素就会中和这些活性氧，使金黄色葡萄球菌在各种氧化环境中存活。因此，本发明使用杜鹃素减少色素生成，查看是否可以使金黄色葡萄球菌逃避氧化能力下降。如图10(过氧化氢杀伤实验结果图(***代表P<0.001))所示，杜鹃素处理组更易被H2O2杀伤，金黄色葡萄球菌在control组和杜鹃素处理组的存活率分别为15.3％和1.09％，显著的降低了金黄色葡萄球菌在氧化环境中的存活率。
结果表明，杜鹃素可以减少MRSA的抗氧化能力，β内酰胺类抗生素在现如今的研究中已经被发现有其他的杀菌方式，不单单是与pbp蛋白结合减少细胞壁合成，也包括激活溶菌酶和菌内ROS反应，这里体现了对β内酰胺类抗生素菌内ROS反应的抵抗能力减弱。
1.12RT-qPCR检测杜鹃素对CrtN转录水平的影响
为检测金萄菌USA300的基因转录水平，将金黄色葡萄球菌USA300与DMSO或不同浓度的杜鹃素在BHI中培养，37℃，180rpm过夜培养至OD600值为2.0以上。用TRIzol法提取经不同浓度的杜鹃素处理的金黄色葡萄球菌USA300的总RNA，具体操作如下：12,000rpm离心1min收集菌体，将收集的菌体中加入1mL Trizol，在涡旋振荡器上充分混匀2min，4℃静置30min以充分裂解。接着加入200μL氯仿，混匀15s，冰上静置10min分层。4℃，12,000rpm离心15min，取上清至新的RNase free Ep管中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀15s，冰上静置10min。4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，留RNA沉淀。接着加入1mL 75％乙醇，将RNA沉淀重悬，4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，重复此步骤一次。乙醇洗后于通风橱中室温干燥，使乙醇挥发，最后加入DEPC水溶解RNA，NanoDrop2000c测定RNA浓度立即于-80℃冻存。用BeyoRTTMII First Strand cDNA Synthesis Kit按照说明反转录形成cDNA。使用PikoRealqPCR系统对基因CrtN进行分析。使用SYBR qPCR SuperMix Plus以预定的比例进行PCR反应。在将各基因的周期阈值(Ct)与管家基因(16sRNA)的Ct值归一化后，通过计算2-ΔCt获得各基因的相对表达量。
为了探究杜鹃素影响色素合成的机制，本发明对菌株内crtOPQMN操纵子表达进行了研究。本发明提取了不同浓度杜鹃素处理的USA300的总RNA，用RT-PCR测定其中CrtN基因的mRNA含量。如图11(杜鹃素对crtN基因的mRNA水平影响结果图(n.s.代表P>0.05；***代表P<0.001))所示，杜鹃素以浓度依赖性降低CrtN的基因表达，使金黄色葡萄球菌色素合成减少。杜鹃素浓度为64μg/mL时，CrtN的表达量至0.23，杜鹃素浓度为128μg/mL时，CrtN的表达下降至0.03。杜鹃素可显著下调CrtN的表达。
1.12杜鹃素对PBP2a寡聚作用的影响
1.12.1膜蛋白提取
挑取USA300单菌落过夜培养，然后以1:100接种于新鲜的BHI培养基中，在含或不含用Ibandronate(100μM))，杜鹃素(64μg/mL)分别处理下37℃振荡培养24h，离心收获细菌，用PBS洗涤两次，悬浮在含有1mMphenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)和完全蛋白酶抑制剂(Roche)的PBS缓冲液中，每50mL菌液可以提取出30mg左右的膜蛋白。样品在细胞裂解和分离前用0.5mM的DSP(约为0.2mg/mL)，进行交联室温交联30min以上或冰浴2h以上(用20mL/40mLWT交联1h以上)。注：DSP为水敏感试剂，必须现用现配，配制之前需要用室温平衡30min，用无水DMSO溶解，一般配制的浓度为10mg/mL。交联后反复冻融三次，1mg/mL溶葡萄球菌素15μL处理1h，细胞悬浮液高压破碎(french类似仪器)两次。通过离心法(10min，10,000g，4℃)去除未破碎的细胞和碎片，再通过上清液超速离心(1h，70000g)分离膜组分并测得总蛋白浓度。膜蛋白用100～200μL裂解液重悬。裂解液配方为：50mMNaCl，50mMimidazole/HCl，pH＝7(不能含有K+或者高浓度盐粒子)。注：膜蛋白要保存的话，最适保存溶液为250mM的蔗糖溶液或10％甘油，于-80℃保存。
1.12.2Blue Native PAGE
将膜组分(80μg)用含0.5％DDM的1×Native PAGE样品缓冲液(Invitgen)增溶(4℃过夜)。溶解的膜组分加入1μL 5％考马斯染料G-250混合，在具有3％-12％聚丙烯酰胺梯度(Invitgen)的天然凝胶上进行电泳。阴极和阳极电泳缓冲液参见溶液配置表，阴极缓冲液用之前需要加入0.02％的考马斯染料G-250并在电泳完成三分之一后换成0.002％的考马斯染料G-250。
1.12.3Westernblot实验
PVDF膜在甲醇中敏化后，与转印滤纸一起浸泡在含有电转液的平皿中5min，然后组装成三明治结构，即6层滤纸/胶/PVDF膜/6层滤纸，并用电转缓冲液湿润后直接放置于电转仪的正负极之间。施加15V、2h的恒压电流，待转膜完成后用PBST洗膜3次，每次10min，然后室温封闭2h。随后，立即加入1:3000倍稀释的鼠抗PBP2a抗体，室温摇床上缓慢摇动孵育2h。回收一抗，然后加入PBST洗涤液，洗涤3次，每次10min。接着加入1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗，室温孵育2h，回收二抗，然后再用PBST洗涤液洗涤3次，每次10min。最后加入ECL显色液，在显影仪下曝光并记录结果。
在最新的研究中，FMMs(functional membrane microdomains，功能性膜微域)与PBP2a之间的关系已经被联系起来。FMM的成分缺失会造成PBP2a无法在膜上形成三聚体。本发明测试了杜鹃素是否也能使PBP2a寡聚减少，结果如图12(杜鹃素对金黄色葡萄球菌内PBP2a蛋白寡聚的影响结果图，其中，1：蛋白Marker；2：金黄色葡萄球菌USA300组；3：Ibandronate处理金黄色葡萄球菌；4：杜鹃素处理金黄色葡萄球菌组)所示。其中，Ibandronate已被证实能干预金黄色葡萄球菌PBP2a聚合，为阳性对照。从中可以得出PBP2a经过DSP(dithiobis(succinimidylpropionate)，DSP二硫键交联)在细菌内交联后可以形成三聚体，而经过ispA(ispA为一种负责葡萄黄素底物合成的基因)抑制剂和杜鹃素处理后均出现了不同程度的寡聚降低。说明杜鹃素通过干扰pbp2a的功能，使MRSA变回敏感菌株。
实施例2
抑制细菌群体感应系统(Accessorygene regulatoragr系统)，减少细菌毒力因子分泌：
2.1溶血实验
将金黄色葡萄球菌USA300在TSB培养基中培养至OD600为0.3。加入0～64μg/mL的杜鹃素，对照组加入等体积的DMSO，37℃过夜培养。离心收集菌体，然后取100μL上清液加入875μL的PBS和25μL的脱纤维兔血。分别用PBS和Triton X-100设定为阴性和阳性对照。在37℃下孵育30min后，4000g离心3min观察不同浓度的杜鹃素的溶血情况。然后，将上清液移入96孔板中，用微孔板阅读器测量OD543nm处的吸光度。通过吸光度计算各组的溶血百分比，将Triton X-100处理组设定为100％溶血。实验独立重复三次。
杜鹃素对USA300的溶血活性抑制能力如图13(杜鹃素对金黄色葡萄球菌溶血活性抑制作用结果图(n.s.代表P>0.05；***代表P<0.001))，杜鹃素可以以剂量依赖性的方式降低USA300的溶血能力，并且在杜鹃素起到协同浓度下，USA300的溶血活性抑制率可达57.9％。这些数据表明，在协同浓度(64μg/mL)的杜鹃素起到协同作用辅助抗生素时，也可抑制USA300产生的溶血活性。
2.2RT-qPCR检测杜鹃素对agr系统相关转录水平的影响
为检测金萄菌USA300的基因转录水平，将金黄色葡萄球菌USA300与DMSO或不同浓度的杜鹃素在BHI中培养，37℃，180rpm过夜培养至OD600值为2.0以上。用TRIzol法提取经不同浓度的杜鹃素处理的金黄色葡萄球菌USA300的总RNA，具体操作如下：12,000rpm离心1min收集菌体，将收集的菌体中加入1mL Trizol，在涡旋振荡器上充分混匀2min，4℃静置30min以充分裂解。接着加入200μL氯仿，混匀15s，冰上静置10min分层。4℃，12,000rpm离心15min，取上清至新的RNase free Ep管中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀15s，冰上静置10min。4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，留RNA沉淀。接着加入1mL 75％乙醇，将RNA沉淀重悬，4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，重复此步骤一次。乙醇洗后于通风橱中室温干燥，使乙醇挥发，最后加入DEPC水溶解RNA，NanoDrop2000 c测定RNA浓度立即于-80℃冻存。用BeyoRTTMII First Strand cDNA Synthesis Kit按照说明反转录形成cDNA。使用PikoRealqPCR系统对基因Hla、RNAⅢ、AgrA进行分析。使用SYBR qPCR SuperMix Plus以预定的比例进行PCR反应。在将各基因的周期阈值(Ct)与看家基因(16sRNA)的Ct值归一化后，通过计算2-ΔCt获得各基因的相对表达量。
利用RT-qPCR检测杜鹃素处理后是否影响agr系统相关基因转录水平，本发明选取agrA、hla、RNAⅢ基因设计RT-qPCR实验。结果如图14(RT-qPCR检测杜鹃素对agr系统相关转录水平的影响结果图，(n.s.代表P>0.05；*代表P<0.05；***代表P<0.001))所示，杜鹃素可以以剂量依赖性的方式下调agr系统相关基因，其中agrA基因最高可下调5.3倍，hla基因最高可下调4.8倍，RNAⅢ基因最高可下调5.5倍。所以可以说明杜鹃素可以通过抑制agr系统相关基因表达从而下调hla相关基因。
2.3AgrAC基因克隆及蛋白纯化表达
以USA300菌株基因组为模板，进行PCR方法扩增出309bp的agrAC基因，并在两端引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点和保护性碱基。扩增后经过凝胶回收、双酶切、与双酶切的pet28a载体连接、转化DH5α菌株、阳性单克隆经过测序验证后留存并提取质粒转化BL21菌株。将鉴定阳性的BL21菌株培养至OD600达0.8～1.0时，冰浴30min，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，16℃诱导9～12h。诱导表达完成后，收集菌体，用PBS冲洗两次，重悬于PBS，超声裂解菌体，低温离心，收集上清。将收集的上清液放于4℃冰箱进行蛋白纯化，将大量诱导表达的蛋白分别按照His Trap FF亲和层析柱操作说明书进行纯化。用10kDa孔径的超滤浓缩管进行置换buffer与浓缩，减少对后续试验影响。
如图15(PCR扩增agrAC基因结果图，其中，MarkerDL2000；1agrAc扩增产物；2水对照)PCR结果表明，从金黄色葡萄球菌USA300基因组中分别获取了目的基因agrAC大小约为309bp。
将重组质粒pET28a-AgrAC重组质粒转化至DH5α中，进行测序鉴定。测序结果与标准序列进行比对，结果如图16(pET28a-SrtA质粒的测序鉴定结果图)所示，证明pET28a-AgrAC重组质粒构建成功。
将鉴定正确的重组质粒pET28a-AgrAC转入BL21(DE3)，诱导后，经过SDS-PAGE分析，AgrAC蛋白表达成功，如图17(SDS-PAGE检测AgrAC的表达及纯化结果图)，纯化AgrAC蛋白大小与预期15kDa大小一致。
2.4细胞热稳定迁移实验(CETSA)
培养BL21-pET28a-agrAC，并诱导其表达蛋白。经过超声粉碎和离心，从上清液中获得总蛋白。取600μL上清液分别用64μg/mL杜鹃素或DMSO处理，在37℃下孵育1h，混合物在1,8000g下离心20min后，将上清液分成6管，每管60μL，分别在不同温度下孵育5min。agrAC蛋白的温度梯度为25℃、35℃、39.7℃、43.4℃、43.7℃及50℃。孵育后将样品在18,000g下离心20min，得到上清液。所有样品通过SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色检测各温度下agrAC的蛋白含量。实验独立重复三次。
利用CETSA实验，检测agrAC蛋白在25～50℃的温度范围内降解速率不断增加。当温度增加至43.7℃后，DMSO和64μg/mL杜鹃素组的agrAC蛋白降解比例有明显差异(图18，细胞内热稳定迁移分析杜鹃素与agrAC的直接相互作用结果图)。杜鹃素显著性地降低了agrAC蛋白的降解速度，可初步证明杜鹃素与agrAC蛋白存在相互作用。
2.5热稳定迁移实验(TSA)
在PCR管中加入agrAC蛋白(终浓度0.04mg/mL)、100×SYPRO orange、杜鹃素(128μg/mL)和TSA缓冲液的至总体系50μL。使用实时PCR检测系统，并以1℃/min的速度从25℃加热到90℃，记录蛋白随温度变化时的荧光强度。
如图19(热稳定迁移分析杜鹃素与agrAC的相互作用结果图)，在TSA实验中，agrAC蛋白的降解温度(Tm)为47℃。128μg/mL杜鹃素处理后，蛋白降解温度变化至50℃，ΔTm>2℃，表明杜鹃素可明显影响agrAC蛋白的Tm值。
2.6凝胶迁移实验(EMSA)
首先退火连接形成双链P3启动子：P3-F(50μM)2μL，P3-R(50μM)2μL，T4DNALigasebuffer2μL，DEPC H2O 14μL，95℃变性3min，慢慢降至室温，-20℃保存。用纯化的agrAC、杜鹃素素和带有3'6-荧光素的P3 DNA探针进行EMSA。20μM的agrAC与DMSO或不同浓度的杜鹃素在反应缓冲液中于25℃孵育20min。然后，加入各加入1μLP3 DNA双链并继续孵育20min。样品在TBE缓冲液中避光进行8％Native PAGE。
EMSA实验中，具有荧光素酶标记的P3启动子是一段较短的DNA双链，能够在凝胶电泳中有较快的迁移速率。当agrAC蛋白与P3启动子结合后，P3启动子的迁移速率大大减慢，仅有微弱的荧光强度。在16～64μg/mL浓度范围内的杜鹃素处理下，P3启动子处的荧光强度逐渐增高，表明杜鹃素抑制了agrAC蛋白与P3启动子的结合，而消失的荧光可能是与蛋白之间发生了静态淬灭(图20所示，图20为凝胶迁移实验分析杜鹃素与agrAC的相互作用结果图)。
2.7荧光淬灭揭示杜鹃素与AgrAC的直接相互作用
如图21(荧光淬灭分析杜鹃素与agrAC的相互作用结果图)，荧光淬灭实验观察到在不同浓度的杜鹃素处理后，agrAC蛋白在300～400nm波长范围内的荧光强度逐渐下降，结合常数KA为2.943×104l/moL。进一步表明杜鹃素与agrAC蛋白有较强的结合作用。
2.8AgrA与杜鹃素的分子对接
通过分子模拟揭示旨在进一步揭示杜鹃素与AgrA结合的主要氨基酸位点。AgrA蛋白的晶体结构(PDBID:3BS1)由PDB网站提供https://www.rcsb.org/structure/3BS1。杜鹃素的3D结构由ChemBioDraw Ultra和ChemBio3D Ultra软件绘制。AutoDockTools软件包用于生成对接输入文件。通过合并非极性氢原子和限定可旋转键来制备配体结构。然后进行MD研究以修正对接结果。
分子模拟对接进一步分析了杜鹃素与agrAC的结合位点。如图22所示，杜鹃素能够与agrA蛋白SER-164、LEU-186和AGR-198等氨基酸以氢键结合，可以阻碍agrA蛋白与DNA的结合，经计算对接分数为-7.0kcal/mol(图22，分子对接揭示杜鹃素与AgrAC的结合模式及主要氨基酸位点结果图)。因此，杜鹃素可与agrAC蛋白结合，从而抑制agrA与P3启动子的结合。
实施例3
显著提高抗生素体内治疗效果
3.1菌悬液的制备
挑取金黄色葡萄球菌USA300单菌落在BHI液体培养基中37℃过夜培养。将过夜培养物按1:100接于500mL BHI培养基培养至OD600达1.0，离心收集菌体，PBS洗涤两次，最后重悬于0.75mLPBS中，备用。
3.2致死率实验
使用少量乙醚预先麻醉小鼠，滴鼻给予30μL金黄色葡萄球菌(2×109CFUs)，保持小鼠的直立状态，使菌液自然吸入，吸入后继续保持直立30s，再将小鼠放平，待其自然苏醒。致死率实验中，每只小鼠滴鼻给予2×109CFUs的金黄色葡萄球菌；病理组织学研究中，每只小鼠滴鼻给予1×109CFUs的金黄色葡萄球菌。
将C57BL/6J小鼠随机分为5组，每组10只，分别为金黄色葡萄球菌USA300感染组(WT+DMSO)、杜鹃素治疗组(WT+FA)、头孢吡肟治疗组(WT+Cef)、杜鹃素和头孢吡肟联合组(WT+FA+Cef)、空白对照组(生理盐水+0.5％DMSO)。在滴鼻感染金黄色葡萄球菌后2h经腹腔注射给药，其中杜鹃素治疗组腹腔注射50mg/kg的杜鹃素，每12h给药一次。以12h为间隔，记录96h内小鼠的死亡情况，计算致死率。
为了研究杜鹃素联合头孢吡肟在体内对抗金黄色葡萄球菌的效果，本发明首先建立了金黄色葡萄球菌诱导的小鼠肺炎模型，并评估了各组对小鼠肺炎感染死亡率的影响。每组7周龄的小鼠鼻内接种了致死剂量的金黄色葡萄球菌USA300(2×109CFU)，感染后2h通过腹腔注射给予50mg/kg的杜鹃素或腹腔给予50mg/kg头孢吡肟进行治疗，之后每隔12h再次给药，间隔96h评估感染动物的死亡率。根据图23(杜鹃素联合杜鹃素联合头孢吡肟对MRSA感染小鼠生存率的影响结果图)的结果显示，在感染最初的24h内，小鼠死亡率极高，WT组死亡率达到了70～80％，而联合组则有70％的存活率明显高于其他组别。并且在随后的48h内WT组合陆续全部死亡，杜鹃素组和头孢吡肟组只有30％的存活率，联合组在36h后几乎不再死亡，表明杜鹃素与头孢吡肟联合可以明显提高急性肺炎感染小鼠的生存率，尤其是在感染初期。
3.3肺部组织载菌量测定
取各组小鼠肺部组织用无菌生理盐水冲洗后，称重，研磨，稀释于无菌生理盐水中，随后进行倍比稀释涂于BHI固体平板，置于37℃温箱培养至出现菌落，进行肺部菌落计数。
小鼠感染金黄色葡萄球菌48h后，将肺部组织研磨涂板，统计菌落数。结果如图24(杜鹃素联合杜鹃素联合头孢吡肟对MRSA感染小鼠肺部载菌量的影响结果图，(***代表P<0.001))所示，WT组小鼠肺部含有大量的细菌，为8.68±0.70CFU/g。杜鹃素组与头孢吡肟组相比于WT组，肺部组织的载菌量显著降低，为5.54±0.65CFU/g和6.34±0.73log10 CFU/g。杜鹃素在之前的研究中就被用于慢性支气管炎的治疗，并被证实可以通过调节细胞信号通路来减少金黄色葡萄球菌对上皮细胞内化的作用，本发明的研究中还发现杜鹃素对金黄色葡萄球菌Agr系统也有抑制作用。使用杜鹃素单独治疗小鼠肺炎也有不错的效果，可以使肺部载菌量明显降低。联合组相比于WT组，可大幅度降低肺部载菌量，有着良好的治疗效果，载菌量为4.03±0.99CFU/g，且联合组也优于杜鹃素组与头孢吡肟组，这可能是两者联合机制杀伤的效果。首先，杜鹃素对上皮细胞及细菌的调节，使金黄色葡萄球菌内化到细胞的菌株减少，头孢吡肟在胞外对金黄色葡萄球菌进行杀伤。其次杜鹃素对MRSA产生的耐药性有着极大的抑制作用，通过影响β-内酰胺酶和FMMs使体内清除MRSA所需的抗生素浓度减少。最后杜鹃素对金黄色葡萄球菌色素的抑制也可以使金黄色葡萄球菌难以逃避胞内ROS以及β-内酰胺类抗生素引起的细菌内的ROS机制。
3.4病理组织学研究
将C57BL/6J小鼠随机分为5组，每组5只，金黄色葡萄球菌USA300感染组(WT+DMSO)、杜鹃素治疗组(WT+FA)、头孢吡肟治疗组(WT+Cef)、杜鹃素和头孢吡肟联合组(WT+FA+Cef)、空白对照组(生理盐水+0.5％DMSO)。滴鼻给金黄色葡萄球菌，2h后给药，给药量和给药方式与致死率实验相同，12h后再次给药。24h后，颈椎脱臼处死小鼠，取出小鼠的左肺，观察肺部变化、采集图片。随后无菌取小鼠左肺置于4％甲醛中固定。将肺部组织依次进行脱水、石蜡包埋、切片、H&E染色等程序，在光学显微镜下拍照并记录图片。
3.5肺炎切片的制作
(1)样品处理：用镊子轻轻的从固定液中取出肺部组织，用流水缓慢冲洗3次。
(2)组织脱水处理：将肺组织放于包埋盒内，置于脱水机中，设定脱水模式，由70％乙醇至100％乙醇逐渐脱去肺脏中水分，用二甲苯透明后，再浸蜡，完成后将包埋盒取出，备用。
(3)石蜡包埋：将肺组织切块后置于模具中，缓慢滴加蜡后置于石蜡冷冻板上，待其充分凝固。
(4)切片制作：用组织切片机对肺部组织进行切片，将其平铺于40℃水中，选取肺组织固定于载玻片一端，于60℃温箱中烘干，使载玻片上石蜡脱落。
(5)染色：将切片放在玻片架上染色，首先用二甲苯脱蜡，随后依次进行100％乙醇至70％乙醇，经蒸馏水冲洗后进行苏木精-伊红染色。
(6)封片：将玻片自然晾干，缓慢滴加中性树胶，随后盖上盖玻片置于晾片架上晾干，备用。
(7)切片观察：将肺脏组织切片置于显微镜下观察，取完整、清晰的结构进行图像采集。
本发明分析了杜鹃素联合治疗对金黄色葡萄球菌USA300诱导的肺炎病理变化，结果如图25(杜鹃素联合头孢吡肟对MRSA感染小鼠肺部组织病理学变化结果图)所示，联合组的小鼠肺部组织呈粉红色，海绵状，局部感染较少，而未经治疗的小鼠肺组织呈深红色，感染较严重。随后进行H&E染色及病理组织分析显示，金黄色葡萄球菌USA300感染组小鼠肺部组织大多数肺泡腔被炎性细胞浸润，而杜鹃素和头孢吡肟单独治疗后小鼠肺部炎性细胞浸润现象明显减少。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性劳动的前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染所致疾病的药物中的应用。
2.杜鹃素在制备增强β-内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌敏感性的药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述β-内酰胺类抗生素包括氨苄西林、青霉素G、头孢西丁、拉氧头孢和头孢吡肟中的一种或两种以上。
4.杜鹃素在制备β-内酰胺酶阳性抑制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述β-内酰胺酶包括A类β-内酰胺酶。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述A类β-内酰胺酶包括BlaZ。
7.杜鹃素在制备具有如①～⑧任一项或两项以上作用的药物中的应用：
①抑制pbp2a活性；
②减少金黄色葡萄球菌毒力因子的分泌；
③抑制金黄色葡萄球菌的溶血活性；
④抑制金黄色葡萄球菌群体感应系统；
⑤抑制金黄色葡萄球菌色素产生；
⑥降低金黄色葡萄球菌的抗氧化能力；
⑦提升β内酰胺类抗生素菌内ROS反应能力；
⑧下调CrtN的表达。
8.杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备治疗金黄色葡萄球菌所致肺炎的药物中的应用。
9.杜鹃素联合β-内酰胺类抗生素在制备减少金黄色葡萄球菌对上皮细胞内化的药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述β-内酰胺类抗生素包括头孢吡肟。
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