CN118109278A - 基于重力驱动和微量naa-lfd一体式的全封闭芯片及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于重力驱动和微量NAA‑LFD一体式的全封闭芯片及方法。补充液储存腔容纳补充液，上端有补充液加样口；反应液储存腔暂时性容纳核酸扩增反应液和待测样本溶液，上端设有反应液加样口；核酸扩增腔容纳核酸扩增反应液和待测样本溶液进行核酸扩增反应；试纸条检测腔用于试纸条检测，预先放置侧向层析试纸条；补充液储存腔和反应液储存腔之间通过通道连通构成第一环形循环通路；反应液储存腔、核酸扩增腔和试纸条检测腔中的每两个之间通过通道连通构成第二环形循环通路。本发明能够实现一体化的核酸扩增和微量核酸扩增液的试纸条检测，只需微量的核酸扩增试剂即可满足试纸条的使用要求，降低了检测成本。

Description

基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片及其方法

技术领域

本发明公开了一种用于核酸检测的基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片，涉及到一种核酸扩增(Nucleic Acid Amplification，NAA)、侧向层析试纸条(Lateral Flow Dipstick，LFD)和微流控技术联用的一体式芯片，属于微生物学和生化分析领域。

背景技术

核酸扩增(Nucleic Acid Amplification，NAA)是一大类技术方法的总称，包括常规PCR、实时荧光PCR、一系列等温核酸扩增技术等。自1985年Mullis等人提出聚合酶链式反应(PCR)，随着越来越多的工具酶被挖掘，新的核酸扩增技术不断被开发出来。目前，核酸扩增技术已被广泛应用于核酸检测领域。

侧向层析试纸条(Lateral Flow Dipstick，LFD)使用免疫层析的原理，通过毛细管作用使检测样本横向流过基质，使抗原与抗体结合，从而实现检测结果可视化。试纸条LFD通常由样品垫、包被了胶体金或微球标记抗体的结合垫、含有包被了抗原的T线和包被了对照抗体的C线的滤膜组成。侧向层析试纸条以大孔径的微孔滤膜(NC膜，硝酸纤维素膜)为载体，将特异性的抗原或抗体固定在NC膜上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用侧向移动，与结合垫上的胶体金或微球标记的试剂发生特异的免疫反应，再移动到NC膜上，被固定在NC膜表面的抗原或抗体捕获，聚集在检测带上，通过目测NC膜表面标记物(胶体金或乳胶颗粒)的光反射信号的密度得到直观的显色结果。其它未结合的标记物则越过检测带，流入吸水垫中，达到自动分离的目的。这项技术操作简便，能够快速提供检测结果，很好地替代实验室中进行的耗时的免疫分析和仪器检测，具有快速、简便、单人份检测、经济的优点。现已广泛应用于医学检测、食品质量监测、环境监测等领域。

不管是染料法还是探针法的核酸扩增，都需要依靠荧光发射和监测模块来反映扩增情况。而侧向层析试纸条的加入，使核酸扩增摆脱了笨重、昂贵的荧光模块。NAA和LFD这两种技术的联用推进了现场检测往更便捷、低成本的方向发展。但是，目前NAA-LFD技术还存在一些不足。例如，NAA扩增会产生大量的扩增子，在开盖取扩增产物到试纸条的过程中易引起气溶胶污染，造成后续检测结果的假阳性；取液的过程也增加了操作的复杂性，且需要借助滴管或移液枪头等耗材；浸润试纸条需要较多的核酸扩增试剂(约50-100微升)，成本较高。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明提出了一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片和相应的检测方法，可实现一体化的核酸扩增和微量核酸扩增液的试纸条检测。该芯片和检测方法只需微量的核酸扩增试剂即可满足试纸条的使用要求，降低了检测成本。此外，还解除了微流控芯片与检测试剂的捆绑，也简化了NAA-LFD核酸检测方法的操作流程。

本发明的技术方案如下：

一、一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片：

包括一个“L”形的补充液储存腔，用于容纳补充液，补充液储存腔的上端设有一个和芯片外部连通的补充液加样口，补充液加样口用于加入补充液；

包括一个反应液储存腔，用于暂时性容纳核酸扩增反应液和待测样本溶液，反应液储存腔上端设有一个和芯片外部连通的反应液加样口，反应液加样口用于加入反应液。反应液加样口的位置不受限制，可设置在芯片正面、背面或顶部。

包括一个核酸扩增腔，用于容纳核酸扩增反应液和待测样本溶液进行核酸扩增反应；

包括一个试纸条检测腔，用于试纸条检测，腔内预先放置侧向层析试纸条；

补充液储存腔和反应液储存腔之间通过芯片内部的通道连通，构成一个位于芯片内部的近似矩形的第一环形循环通路；位于左侧的第一次循环通路使得补充液在补充液储存腔中的流动。

反应液储存腔、核酸扩增腔和试纸条检测腔中的每两个之间通过芯片内部的通道连通，构成一个位于芯片内部的第二环形循环通路；位于右侧的第二循环通路使得反应液从反应液储存腔到核酸扩增腔，再到试纸条检测腔的流动和补充液从补充液储存腔到核酸扩增腔，再到试纸条检测腔的流动，从而实现核酸扩增和试纸条检测的一体化。

这些所述环形循环通路使芯片内部气压自动平衡，液体在芯片内依靠芯片的翻转/旋转和自身重力流动，无需借助外部设备提供动力。

所述补充液储存腔的“L”形包括竖直部分和水平部分，其中竖直部分作为补充液的流道，竖直部分上端和补充液加样口连通，水平部分用于储存补充液。

所述反应液储存腔下端侧壁设置有弧形内凹面，弧形的设计能够利于反应液流入下方的核酸扩增腔。

所述的核酸扩增腔底面采用弧形内凹面，圆弧形的设计能够减少液体在此处的残留。

在初始状态下，反应液储存腔和试纸条检测腔整体均位于补充液储存腔底部和核酸扩增腔的上方，反应液储存腔位于补充液储存腔顶部和试纸条检测腔之间，反应液储存腔的顶部与补充液储存腔顶部持平，核酸扩增腔与补充液储存腔的底部持平，试纸条检测腔和反应液储存腔持平。

核酸扩增腔相靠近于反应液储存腔的一侧和反应液储存腔之间通过弧形的液体通道连接，核酸扩增腔另一侧与试纸条检测腔相远离于反应液储存腔的一侧之间通过液体通道连接，试纸条检测腔相靠近于反应液储存腔的一侧与反应液储存腔或者反应液加样口之间通过气体通道连接；所述补充液储存腔底部通过水平的毛细液体通道与核酸扩增腔和反应液储存腔之间的弧形通道中间交汇连通，且补充液储存腔顶部通过水平的气体通道与反应液储存腔连接。

所述核酸扩增腔和试纸条检测腔之间的液体通道设置为倒“L”形，这样倒“L”形液体通道利用其中的竖直部分能够阻止反应液在扩增之前提前流入试纸条检测腔。

所述反应液储存腔容积小于补充液储存腔容积。

所述芯片仅在补充液加样口和反应液加样口处和外界连通，在和外界连通时仅用于加样，在封闭补充液加样口和反应液加样口时所述芯片成为全封闭芯片。

二、一种重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片的使用方法：

S1、将侧向层析试纸条正面朝上、且试纸条的样品垫朝外放入试纸条检测腔底部。用胶带整面封住芯片的正面，留出适当的加样口备用。

使用时，初始状态下，芯片水平或竖直放置。具体而言，加样口位于芯片正面或背面时，芯片水平放置；加样口位于芯片顶部时，芯片竖直放置。

向反应液储存腔的补充液加样口加入15-35μL核酸扩增反应液，所述的核酸扩增反应液根据需要自行配制，所用的标记物应与试纸条相匹配，核酸扩增方法和检测目标对应匹配选择。

向补充液储存腔的反应液加样口加入容量大于核酸扩增反应液的补充液，补充液与核酸扩增反应液的总添加量满足试纸条的工作条件(50-100μL)；

所述的补充液可以是干净、未被污染的PBS缓冲液、Tris-EDTA缓冲液或纯水，并可根据需要加入适当的表面活性剂。

加样后将补充液加样口和反应液加样口的两个加样口用胶带密封；

S2、将芯片进行翻转或者不翻转，此时补充液储存腔和反应液储存腔中的液体因重力作用向下流动：若加样口在芯片背面或正面，加样后翻转芯片，使芯片的基准面垂直于地面。若加样口在芯片的顶部，则无需翻转。

补充液顺着“L”形的补充液储存腔的竖直部分流向并储存在水平部分，反应液顺着弧形液体通道，从反应液储存腔流向到核酸扩增腔中；

S3、然后用核酸扩增腔外侧的温控装置加热核酸扩增腔，进行核酸扩增反应；反应温度调节至所用核酸扩增方法的最适温度。扩增反应结束后，在核酸扩增腔内获得反应扩增液；

S4、将芯片进行翻转，具体地将芯片以垂直于基准面的方向为轴，顺时针旋转90°。此时补充液储存腔和核酸扩增腔中的液体因重力作用向下流动，最终流入翻转后试纸条检测腔的最低点，即试纸条检测腔相远离于反应液储存腔的一侧，补充液不断冲击或者推动核酸扩增液流入试纸条检测腔与之混合形成混合液，混合液通过毛细作用从样品垫向试纸条的吸水垫的方向侧向移动，最后根据试纸条上的C线和T线的显色判读检测结果。

针对现有技术的问题和缺陷，本发明提出了一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片，实现了核酸扩增和试纸条检测的一体化。该芯片具有一些独特的优势：第一，设置了两个分别容纳补充液和核酸扩增试剂的腔室，中间用毛细管阀隔开。由于引入了大体积的补充液，相比于现有的大体积的NAA-LFD方法，本发明的微量NAA-LFD大大减少了所需核酸扩增试剂的量，降低了检测成本。第二，相比于预埋检测试剂的核酸检测芯片，本发明芯片有连通外界的加样口，检测试剂现用现加，无需预先包埋进腔室中。核酸扩增方法和检测试剂的成分也不受限制，使用者可根据检测目标自行添加。第三，液体在该芯片中的流动是由液体自身重力驱动的，无需借助离心机、泵等外部设备。第四，该芯片集核酸扩增和试纸条检测于一体，扩增结束后旋转芯片，扩增液自动流入试纸条检测腔室，简化了的检测的操作流程。第五，待测样本和补充液加样完毕后，两个加样口用胶带等方式密封，整个芯片系统是密闭的，气溶胶无法释放到周围环境中，避免了后续检测结果的假阳性。第六，设置的通气通道除了能够平衡芯片内部的气压，使液体在密闭环境中顺畅流动。

本发明的有益效果是：

一、本发明的芯片及方法能够实现一体式的微量NAA用于LFD核酸检测。该芯片设置了两个分别容纳补充液和核酸扩增试剂的腔室，中间用毛细管阀隔开。由于引入了大体积的补充液，相比于现有的大体积的NAA-LFD方法，本发明的微量NAA大大减少了所需核酸扩增试剂的量，降低了检测成本。

二、为完成检测，使用者只需要进行两步简单的操作。第一是向补充液储存腔和反应液储存腔的加样口分别滴加一定量的补充液和反应液，然后封口；第二是待核酸扩增结束后旋转芯片，扩增液自动流入试纸条检测腔室，整个检测过程无需开盖、移液、手动混合，简化了的检测的操作流程。其中第二步骤的旋转操作也可以配备简单仪器，在扩增结束后自动完成。这样操作者只需加样一步即可。

三、相比于预埋检测试剂的核酸检测芯片，本发明芯片有单独连通外界的核酸反应腔，检测试剂现用现加，无需预先包埋进腔室中。核酸扩增方法和检测试剂的成分也不受限制，使用者可根据检测目标自行添加。

四、液体在该芯片中的流动由液体自身重力驱动，流动方向由腔室、流道精密控制，无需借助离心机、泵等外部设备。

五、待测样本和补充液加样完毕后，两个加样口用胶带密封，整个芯片系统是密闭的，气溶胶无法释放到周围环境中，避免了后续检测结果的假阳性。

六、设置的通气通道除了能够平衡芯片内部的气压，使液体在密闭环境中顺畅流动。

本发明的芯片结构简单、成本低。和已有的方法相比，本发明的芯片和方法属于试剂节约型、简单即用型。

附图说明

图1是本发明芯片的结构示意图。1、基准面，2、补充液储存腔，3、补充液加样口，4、反应液储存腔，5、反应液加样口，6、核酸扩增腔，7、试纸条检测腔，81、82、83、液体通道，91、92、气体通道。本图以加样口3、5设置在芯片顶部为例，实际上加样口的位置不受限制，可设置在储存腔的顶部、正面或背面。

图2是图1所示芯片中补充液储存腔2和液体通道81形成的毛细管阀结构。

图3是图1所示芯片中补充液和反应液受重力作用分别流入补充液储存腔2和核酸扩增腔6后的静态示意图，深灰色部分是流入的溶液。

图4是图3所示芯片以垂直于基准面的方向为轴，顺时针旋转90°后，补充液和扩增液流入试纸条检测腔7后的静态示意图，深灰色部分是流入试纸条检测腔7的溶液。

图5是实施例1的核酸层析试纸条的三种检测结果。a)阳性结果，b)阴性结果，c)无效检测结果。

图6是实施例2的双指标核酸层析试纸条的五种检测结果。a)靶标1、2全阳性，b)靶标1阳性、靶标2阴性，c)靶标2阳性、靶标1阴性，c)靶标1、2全阴性，c)无效检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施对本发明作进一步说明。

如图1所示，芯片内部包含四个相互独立的腔室，分别为补充液储存腔2、反应液储存腔4、核酸扩增腔6和试纸条检测腔7，以及将这些腔相连的通道81、82、83、91、92。补充液储存腔2设有一个加样口3。反应液储存腔4设有一个加样口5。加样口的位置不受限制，可设置在储存腔的顶部、正面或背面。

包括一个“L”形的补充液储存腔2，用于容纳补充液，补充液储存腔2的上端设有一个和芯片外部连通的补充液加样口3，补充液加样口3用于加入补充液。补充液加样口的位置不受限制，可设置在芯片正面、背面或顶部。补充液储存腔2的“L”形包括竖直部分和水平部分，其中竖直部分作为补充液的流道，竖直部分上端和补充液加样口3连通，水平部分用于储存补充液。

包括一个反应液储存腔4，用于暂时性容纳核酸扩增反应液和待测样本溶液，反应液储存腔4上端设有一个和芯片外部连通的反应液加样口5，反应液加样口5用于加入反应液。反应液加样口5的位置不受限制，可设置在芯片正面、背面或顶部。反应液储存腔4下端侧壁设置有弧形内凹面，弧形的设计能够利于反应液流入下方的核酸扩增腔6。

包括一个核酸扩增腔6，用于容纳核酸扩增反应液和待测样本溶液进行核酸扩增反应；核酸扩增腔6底面采用弧形内凹面，圆弧形的设计能够减少液体在此处的残留。核酸扩增腔6外侧设有用于加热的温控装置。

包括一个试纸条检测腔7，用于试纸条检测，腔内预先放置侧向层析试纸条；

补充液储存腔2和反应液储存腔4之间通过芯片内部的通道连通，构成一个位于芯片内部的近似矩形的第一环形循环通路；反应液储存腔4、核酸扩增腔6和试纸条检测腔7中的每两个之间通过芯片内部的通道连通，构成一个位于芯片内部的第二环形循环通路。

如图1所示，以芯片的基准面1垂直于地面来描述各腔室的具体位置。所述的补充液储存腔2位于芯片内的左下侧。反应液储存腔4位于补充液储存腔2的右上侧，最高处与补充液储存腔2最高处持平。核酸扩增腔6位于反应液储存腔4的右下侧，加入的反应液顺着弧形液体通道82从反应液储存腔4流向并储存在核酸扩增腔6。将芯片以垂直于基准面1的方向为轴，顺时针旋转90°。此时，补充液储存腔2和核酸扩增腔6位于试纸条检测腔7的左上方，补充液储存腔2和核酸扩增腔6中的液体因重力作用向下流动，最终流入试纸条检测腔7的最低点。腔室亦可用左右镜面对称后的布局来排布，只要保证补充液储存腔2和试纸条检测腔7的液体流入口位于核酸扩增腔6的不同侧。

补充液储存腔2和反应液储存腔4之间通过三条芯片内部的通道81、82、91连通，构成一个位于芯片内部的近似矩形的循环通路。反应液储存腔4、核酸扩增腔6和试纸条检测腔7两两通过芯片内部的通道82、83、92连通，构成一个位于芯片内部的循环通路。两大循环通路使芯片内部气压自动平衡，液体在芯片内依靠自身重力流动，无需借助外部设备提供动力。

核酸扩增腔6相靠近于反应液储存腔4的左侧和反应液储存腔4之间通过弧形的液体通道82连接，核酸扩增腔6相远离于反应液储存腔4的右侧与试纸条检测腔7相远离于反应液储存腔4的右侧之间通过液体通道83连接，试纸条检测腔7相靠近于反应液储存腔4的左侧与反应液储存腔4或者反应液加样口5之间通过气体通道92连接，以此形成了循环通路，保持气压平衡。

核酸扩增腔6和试纸条检测腔7之间的液体通道设置为倒“L”形，这样倒“L”形液体通道利用其中的竖直部分能够阻止反应液在扩增之前提前流入试纸条检测腔7。

“L”形的补充液储存腔2“L”形底部的水平部分通过水平的毛细液体通道81与核酸扩增腔6和反应液储存腔4之间的弧形通道中间交汇连通，且补充液储存腔2顶部通过水平的气体通道91与反应液储存腔4连接。以此形成了上述腔室间的循环通路。

需要重点介绍的是补充液储存腔2与右侧的核酸扩增腔6和反应液储存腔4之间的弧形通道连接所用的毛细液体通道。通过这条狭窄的毛细液体通道的左侧与大体积的补充液储存腔2右侧构成了毛细管阀结构，这样截留住了从交汇处流入的反应液，实现了当芯片处于竖直状态时补充液和反应液的分隔。

位于左侧的循环通路保证了补充液在补充液储存腔2中的流动。位于右侧的循环通路保证了反应液从反应液储存腔4到核酸扩增腔6，再到试纸条检测腔7的流动和补充液从补充液储存腔2到核酸扩增腔6，再到试纸条检测腔7的流动，从而实现核酸扩增和试纸条检测的一体化。图2是图1所示芯片中大体积的补充液储存腔2与狭窄的液体通道81构成了毛细管阀结构，截留住了从液体通道82流入的反应液，实现了补充液和反应液的分隔。液体通道82和83的弯折部分设计为弧形是为了使液体顺畅流动。

补充液储存腔2、反应液储存腔4和核酸扩增腔6的体积，可根据补充液和反应液的添加量进行调整。而补充液和反应液的总体积应尽量满足试纸条的工作条件50-100μL。

芯片仅在补充液加样口3和反应液加样口5处和外界连通，在和外界连通时仅用于加样，在堵上补充液加样口3和反应液加样口5时芯片成为全封闭芯片。

本发明的上述芯片的工作过程如下：

液体在芯片内的流动由各腔室和通道精密控制。若加样口在芯片背面或正面，加样后翻转芯片，使芯片的基准面1垂直于地面。若加样口在芯片的顶部，则无需翻转。

从补充液加样口3向补充液储存腔2中加入大量的成本更低的补充液，从反应液加样口5向反应液储存腔4中加入少量的成本更高的核酸扩增反应液和待测样本溶液，加液后，补充液储存腔2和反应液储存腔4中的液体因重力作用向下流动，补充液顺着补充液储存腔2“L”形的竖直部分流向并储存在底部的水平部分。反应液再顺着弧形的液体通道，从反应液储存腔4流向并储存在核酸扩增腔6进行扩增反应。

扩增反应结束后，将芯片以垂直于基准面1的方向为轴，顺时针旋转90°。旋转后此时，补充液储存腔2和核酸扩增腔6中的液体因重力作用向下流动，最终流入试纸条检测腔7右侧的最低点。

当添加的核酸扩增液较多的情况下，核酸扩增液充满整个核酸扩增腔6，因重力较大且不存在表面张力先行从核酸扩增腔6流入试纸条检测腔7，核酸扩增液先积聚在试纸条检测腔7右侧，补充液随后从补充液储存腔2流入，随后核酸扩增液由于更大体积补充液的不断冲击进而被补充液混匀，最后以毛细作用慢慢吸入试纸条。

当添加的核酸扩增液较少情况下，核酸扩增液未充满核酸扩增腔6，因重力较小且存在表面张力(核酸扩增液较少的时候，核酸扩增腔没有被填满，这样核酸扩增腔6右边的液体通道83中是没有液体的，这样在转动后，液体需克服毛细管力才能进到液体通道83中；而当核酸扩增液较多时，在转动前，核酸扩增腔6右边的液体通道83中已经有了液体，这样转动后，就无需克服毛细管力)无法自行经液体通道流入试纸条检测腔7，此时核酸扩增液被补充液推动流入试纸条检测腔7(转动后，补充液在核酸扩增液的上面，向下流动式自然就会推动下面的核酸扩增液一起流动)，补充液边推动变冲击核酸扩增液，从而两者混匀，最后使得液体以毛细作用慢慢吸入试纸条。

图3和图4分别显示了液体受重力作用流动后的静止状态。若加样口在芯片背面或正面，加样后翻转芯片，使芯片的基准面垂直于地面。若加样口在芯片的顶部，则无需翻转。补充液顺着“L”形补充液储存腔2的竖直部分流向并储存在水平部分，反应液顺着弧形液体通道81，从反应液储存腔4流向并储存在核酸扩增腔6(如图3所示)。将芯片以垂直于基准面1的方向为轴，顺时针旋转90°后，补充液顺着液体通道81、82、83流入试纸条检测腔7的最低点，扩增液顺着液体通道83流入试纸条检测腔7的最低点。

补充液储存腔2和毛细液体通道的设置以及补充液的存在不仅使微量NAA与LFD联用成为可能，减少扩增试剂的使用；还在流动到试纸条检测腔7的过程中推动微量核酸扩增液的流动，与核酸扩增液混匀；并带走残留在腔室和通道中的核酸扩增液。

下面介绍本发明的具体检测实施过程：

1、试纸条的放置和补充液、反应液的添加

将侧向层析试纸条正面朝上、样品垫朝外放入试纸条检测腔7。用胶带封住芯片的正面备用。使用时，初始状态下，芯片水平或竖直放置。具体而言，加样口位于芯片正面或背面时，芯片水平放置；加样口位于芯片顶部时，芯片竖直放置。向反应液储存腔4的加样口5加入15-35μL核酸扩增反应液。所述的核酸扩增反应液根据需要自行配制，所用的标记物应与试纸条相匹配。向补充液储存腔2的加样口3加入补充液，补充液与反应液的总添加量应尽量满足试纸条的工作条件(50-100μL)。所述的补充液可以是干净、未被污染的PBS缓冲液、Tris-EDTA缓冲液或纯水，可根据需要加入适当表面活性剂。加样后将两个加样口3、5用胶带密封。

2、核酸扩增反应

若加样口在芯片背面或正面，加样后翻转芯片，使芯片的基准面1垂直于地面。若加样口在芯片的顶部，则无需翻转。此时，补充液储存腔2和反应液储存腔4中的液体因重力作用向下流动。补充液顺着“L”形补充液储存腔2的竖直部分流向并储存在水平部分。反应液顺着弧形液体通道81，从反应液储存腔4流向并储存在核酸扩增腔6。用核酸扩增腔6外侧的温控装置加热核酸扩增腔6，进行核酸扩增反应。反应温度调节至所用核酸扩增方法的最适温度。

3、扩增产物的侧向层析试纸条检测

扩增反应结束后，在核酸扩增腔6内获得反应扩增液。将芯片以垂直于基准面1的方向为轴，顺时针旋转90°。此时，补充液储存腔2和核酸扩增腔6中的液体因重力作用向下流动，最终流入试纸条检测腔7的最低点。补充液不断冲击扩增液，与之混合。混合液通过毛细管作用从样品垫向吸水垫的方向侧向移动。最后根据试纸条上的C线和T线的显色判读检测结果。

本发明的实施实例：

1、非洲猪瘟病毒的PCR扩增及单指标侧向层析试纸条检测

该实施例所用芯片的结构如图1所示。芯片所使用的材料为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板材，板材的厚度为4毫米，利用机械加工的方式在板材上加工成图1所示的结构(尺寸以下面的文字说明为准)。

芯片内部包含一个补充液储存腔2、一个反应液储存腔4、一个核酸扩增腔6和一个试纸条检测腔7，以及将这些腔相连的通道81、82、83、91、92。补充液储存腔2顶部有一个加样口3。反应液储存腔4顶部有一个加样口5。补充液储存腔2位于芯片内的左下侧。反应液储存腔4位于补充液储存腔2的右上侧，最高处与补充液储存腔2最高处持平。核酸扩增腔6位于反应液储存腔4的右下侧，与补充液储存腔2大致持平。试纸条检测腔7位于核酸扩增腔6的上方和反应液储存腔的右侧。所述的腔室亦可用左右镜面对称后的布局来排布，只要保证补充液储存腔2和试纸条检测腔7的液体流入口位于核酸扩增腔6的不同侧。

“L”形的补充液储存腔2的竖直部分宽4mm、长23mm，水平部分宽3mm、长28mm。补充液加样口3宽3mm、长4mm。反应液储存腔4宽3mm、长11mm。反应液加样口5宽3mm、长4mm。圆弧形核酸扩增腔6的弦长7.5mm。矩形的试纸条检测腔7宽4mm、长65mm。以上腔室均2mm深。液体通道81的截面尺寸为0.3x0.3 mm，与截面尺寸为2x3 mm的补充液储存腔2构成了毛细管阀结构，截留住了从液体通道82流入的反应液，实现了补充液和反应液的分隔。液体通道82的截面尺寸为0.5x0.5 mm，太细会使反应液流动不顺畅，太粗会残留较多的反应液。液体通道83的截面尺寸为0.5x0.5 mm。气体通道91、92宽0.3mm、深0.3mm。各通道的长度及形状根据实际需要设置。液体通道的82、83的拐角设计为圆润的弧形是便于液体在通道内流动。若想使溶液在芯片中流动得更快速、顺畅，可以在补充液和反应液中添加表面活性剂。

本实施例以非洲猪瘟病毒的检测为例，以非洲猪瘟病毒中的P72基因为靶标，进行PCR扩增及侧向层析试纸条检测。

将侧向层析试纸条正面朝上、样品垫朝外放入试纸条检测腔7。该试纸条检测线处包被有亲和素(SA)，乳胶微球上标记有抗FAM抗体，通过夹心法检测同时含有Biotin和FAM标记的核酸扩增产物。用PMMA胶带整面封住芯片的正面。初始状态下，芯片竖直放置。向反应液储存腔4的加样口5加入25μL核酸扩增反应液。向补充液储存腔2的加样口3加入50μL纯水。加样后将两个加样口3、5用PMMA胶带密封。

PCR反应液的体系如下表：

翻转芯片，使芯片的基准面1垂直于地面。此时，补充液储存腔2和反应液储存腔4中的液体因重力作用向下流动。纯水顺着“L”形补充液储存腔2的竖直部分流向并储存在水平部分。反应液顺着弧形液体通道81，从反应液储存腔4流向并储存在核酸扩增腔6。利用外加的温控装置对核酸扩增腔6外侧进行加热，所配置的温控装置需要能够在50度到95度间进行温度循环。

扩增反应结束后，在核酸扩增腔6内获得反应扩增液。将芯片以垂直于基准面1的方向为轴，顺时针旋转90°。此时，补充液储存腔2和核酸扩增腔6中的液体因重力作用向下流动，最终流入试纸条检测腔7的最低点。补充液不断冲击扩增液，与之混合。混合液通过毛细管作用从样品垫向吸水垫的方向侧向移动。最后根据试纸条上的C线和T线的显色判读检测结果。若C线和T线均显色，则说明所测样本含有P72基因(图5a)。若C线显色，T线未显色，则说明所测样本不含P72基因或含量低于试纸条的检出限(图5b)。若C线和T线均显色，则说明操作失误或试纸条已变质失效。在此情况下，应排除问题并重新测试(图5c)。

2、乙肝病毒(HBV)和甲肝病毒(HCV)的双重LAMP扩增和双指标试纸条检测

该实施例的结构如图1所示，芯片结构及加工方式同实施例1。

嗜肝病毒中乙肝病毒(HBV)和甲肝病毒(HCV)的传染性最强，本实施例以HBV和HCV的检测为例，进行双重LAMP扩增及双指标试纸条检测。

将侧向层析试纸条正面朝上、样品垫朝外放入试纸条检测腔7。该双指标试纸条检测线T1处包被有抗FITC抗体，检测线T2处包被有抗Digoxin抗体，部分乳胶微球上标记有链霉亲合素，部分乳胶微球上标记有抗TAMRA抗体，通过夹心法检测含有相应标记的核酸扩增产物。用PMMA胶带整面封住芯片的正面。初始状态下，芯片竖直放置。向反应液储存腔4的加样口5加入20μL核酸扩增反应液。向补充液储存腔2的加样口3加入70μL Tris-EDTA缓冲液。加样后将两个加样口3、5用PMMA胶带密封。

LAMP反应液体系如下：

翻转芯片，使芯片的基准面1垂直于地面。此时，补充液储存腔2和反应液储存腔4中的液体因重力作用向下流动。补充液顺着“L”形补充液储存腔2的竖直部分流向并储存在水平部分。反应液顺着弧形液体通道81，从反应液储存腔4流向并储存在核酸扩增腔6。利用外加的温控装置对核酸扩增腔6外侧进行加热，温度控制在65度左右，反应30分钟。

扩增反应结束后，在核酸扩增腔6内获得反应扩增液。将芯片以垂直于基准面1的方向为轴，顺时针旋转90°。此时，补充液储存腔2和核酸扩增腔6中的液体因重力作用向下流动，最终流入试纸条检测腔7的最低点。补充液不断冲击扩增液，与之混合。混合液通过毛细管作用从样品垫向吸水垫的方向侧向移动。最后根据试纸条上的C线、T1线和T2线的显色判读检测结果。若C线、T1线和T2线均显色，则说明检测有效且所测样本同时含有HBV和HCV病毒(图6a)。若C线和T1线显色，且T2线不显色，则说明检测有效且所测样本含有HBV、不含HCV(图6b)。若C线和T2线显色，且T1线不显色，则说明检测有效且所测样本含有HCV、不含HBV(图6c)。若C线显色，T1线和T2线不显色，则说明检测有效且所测样本不含HBV和HCV(图6d)。若C线不显色，则说明操作失误或试纸条已变质失效。在此情况下，应排除问题并重新测试(图6e)。

Claims (10)

1.一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片，其特征在于：

包括一个“L”形的补充液储存腔(2)，用于容纳补充液，补充液储存腔(2)的上端设有一个和芯片外部连通的补充液加样口(3)，补充液加样口(3)用于加入补充液；

包括一个反应液储存腔(4)，用于暂时性容纳核酸扩增反应液和待测样本溶液，反应液储存腔(4)上端设有一个和芯片外部连通的反应液加样口(5)，反应液加样口(5)用于加入反应液。

包括一个核酸扩增腔(6)，用于容纳核酸扩增反应液和待测样本溶液进行核酸扩增反应；

包括一个试纸条检测腔(7)，用于试纸条检测，腔内预先放置侧向层析试纸条；

补充液储存腔(2)和反应液储存腔(4)之间通过芯片内部的通道连通，构成一个位于芯片内部的第一环形循环通路；

反应液储存腔(4)、核酸扩增腔(6)和试纸条检测腔(7)中的每两个之间通过芯片内部的通道连通，构成一个位于芯片内部的第二环形循环通路。

2.根据权利要求1所述的一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片，其特征在于：所述补充液储存腔(2)的“L”形包括竖直部分和水平部分，其中竖直部分作为补充液的流道，竖直部分上端和补充液加样口(3)连通，水平部分用于储存补充液。

3.根据权利要求1所述的一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片，其特征在于：所述反应液储存腔(4)下端侧壁设置有弧形内凹面。

4.根据权利要求1所述的一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片，其特征在于：所述的核酸扩增腔(6)底面采用弧形内凹面。

5.根据权利要求1所述的一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片，其特征在于：在初始状态下，反应液储存腔(4)和试纸条检测腔(7)均位于补充液储存腔(2)底部和核酸扩增腔(6)的上方，反应液储存腔(4)位于补充液储存腔(2)顶部和试纸条检测腔(7)之间，反应液储存腔(4)的顶部与补充液储存腔(2)顶部持平，核酸扩增腔(6)与补充液储存腔(2)的底部持平，试纸条检测腔(7)和反应液储存腔(4)持平。

6.根据权利要求1所述的一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片，其特征在于：核酸扩增腔(6)相靠近于反应液储存腔(4)的一侧和反应液储存腔(4)之间通过弧形的液体通道连接，核酸扩增腔(6)另一侧与试纸条检测腔(7)相远离于反应液储存腔(4)的一侧之间通过液体通道连接，试纸条检测腔(7)相靠近于反应液储存腔(4)的一侧与反应液储存腔(4)或者反应液加样口(5)之间通过气体通道连接；所述补充液储存腔(2)底部通过水平的毛细液体通道与核酸扩增腔(6)和反应液储存腔(4)之间的弧形通道中间交汇连通，且补充液储存腔(2)顶部通过水平的气体通道与反应液储存腔(4)连接。

7.根据权利要求6所述的一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片，其特征在于：所述核酸扩增腔(6)和试纸条检测腔(7)之间的液体通道设置为倒“L”形。

8.根据权利要求1所述的一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片，其特征在于：所述反应液储存腔(4)容积小于补充液储存腔(2)容积。

9.根据权利要求1所述的一种基于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片，其特征在于：所述芯片仅在补充液加样口(3)和反应液加样口(5)处和外界连通，在封闭补充液加样口(3)和反应液加样口(5)时所述芯片成为全封闭芯片。

10.应用于权利要求1-9任一所述全封闭芯片的于重力驱动和微量NAA-LFD一体式的全封闭芯片的使用方法，其特征在于：

S1、将侧向层析试纸条正面朝上、且试纸条的样品垫朝外放入试纸条检测腔(7)底部，向反应液储存腔(4)的补充液加样口(3)加入15-35μL核酸扩增反应液，向补充液储存腔(2)的反应液加样口(5)加入容量大于核酸扩增反应液的补充液，补充液与核酸扩增反应液的总添加量满足试纸条的工作条件；加样后将补充液加样口(3)和反应液加样口(5)的两个加样口用胶带密封；

S2、将芯片进行翻转或者不翻转，此时补充液储存腔(2)和反应液储存腔(4)中的液体因重力作用向下流动：补充液顺着“L”形的补充液储存腔(2)的竖直部分流向并储存在水平部分，反应液顺着弧形液体通道，从反应液储存腔(4)流向到核酸扩增腔(6)中；

S3、然后用核酸扩增腔(6)外侧的温控装置加热核酸扩增腔(6)，进行核酸扩增反应；扩增反应结束后，在核酸扩增腔(6)内获得反应扩增液；

S4、将芯片进行翻转，此时补充液储存腔(2)和核酸扩增腔(6)中的液体因重力作用向下流动，最终流入翻转后试纸条检测腔(7)的最低点，补充液不断冲击或者推动核酸扩增液流入试纸条检测腔(7)与之混合形成混合液，混合液通过毛细作用从样品垫向试纸条的吸水垫的方向侧向移动，最后根据试纸条的显色判读检测结果。