CN118103402A - 双特异性抗flt3/cd3抗体及使用方法 - Google Patents

双特异性抗flt3/cd3抗体及使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体及其抗原结合片段，诸如特异性结合人类FLT3和人类CD3的抗体和片段。在一些方面，本文提供了优化的人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体及其抗原结合片段，任选地，具有赋予有利特性(例如，最佳抗原结合、可制造性和/或半衰期特性)的某些氨基酸取代。本文还提供了包含此类抗体或片段的药物组合物。本文还提供了此类抗体和片段的使用方法。

Description

双特异性抗FLT3/CD3抗体及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月17日提交的美国临时专利申请号63/234,226和2022年4月8日提交的美国临时专利申请号63/329,138的权益，所述专利申请各自通过引用整体并入本文。
电子序列表的引用
电子序列表(HEPH_002_002WO_SeqList_ST26.xml；大小：96,828字节；以及创建日期：2022年8月11日)的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
在一些方面，本发明涉及结合至FLT3和CD3的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及此类抗体的用途。
背景技术
FLT3
FLT3是Fms相关受体酪氨酸激酶3。FLT3也被称为胎肝激酶2(FLK2)。FLT3是III类酪氨酸激酶受体家族的成员，在正常造血祖细胞以及白血病母细胞中表达，并且在细胞增殖、分化和存活中起重要作用。FLT3配体对FLT3受体的激活会引起受体二聚化和磷酸化，以及下游信号传导通路的激活，所述信号传导通路包括Janus激酶(JAK)2信号转导子(JAK2)、信号转导子和转录激活子(STAT)5和有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路。据信在约40％的AML患者中发现的FLT3基因突变会促进其自身磷酸化和组成型激活，导致配体非依赖性增殖(Frankfurt O等,Current Opinion in Oncology(2007)19(6):635-649)。
正常FLT3表达主要局限于CD34+造血干细胞(HSC)、早期造血祖细胞(HP)和树突状细胞(DC)。通过结合FLT3配体(FLT3L)对FLT3的激活会促进下游血系的正常分化。
FLT3在多种血液恶性肿瘤中高表达，包括大多数AML患者中。大多数患有AML的患者的AML母细胞表达FLT3，并且认为这种表达会促进存活和增殖。已开发了酪氨酸激酶抑制剂(TKI)来特异性靶向FLT3；然而，导致FLT3抗性的二次突变仍然是一个主要障碍。
CD3
CD3是分化簇3(T细胞辅受体)。CD3一般在成熟T细胞的膜表面上表达，并且激活原初T细胞群体。CD3辅受体帮助激活细胞毒性细胞和T辅助细胞(即，CD8+T细胞和CD4+T细胞)。CD3是由四条不同链组成的蛋白质复合物。在哺乳动物中，复合物含有CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链，它们与T细胞受体(TCR)和ζ链缔合以在T淋巴细胞中产生激活信号。合在一起，TCR、ζ链和CD3分子构成TCR复合物。CD3的细胞内尾部含有保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，所述激活基序对于TCR的信号传导能力至关重要。ITAM磷酸化后，CD3链可以结合ZAP70(ζ相关蛋白)，一种参与T细胞信号传导级联的激酶。一旦激活，T细胞即分泌细胞因子并迅速协助免疫反应。
造血干细胞
造血干细胞是所有血细胞的共同祖先。作为多能细胞，它们可以分化成多个细胞谱系，但并非所有谱系都来源于三个胚层。造血干细胞分化产生淋巴和骨髓细胞谱系，这是造血的两个主要分支。(Kondo,M."Lymphoid and myeloid lineage commitment inmultipotent hematopoietic progenitors",Immunol.Rev.2010年11月；238(1):37-46)。淋巴谱系细胞包括T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞。骨髓谱系包括巨核细胞和红细胞(MegE)以及属于骨髓谱系的不同粒细胞亚组(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞(GM)(同上引用Kondo M等,Biology ofhematopoietic stem cells and progenitors:implications for clinicalapplication.Ann.Rev Immunol.2003；21:759-806,Weissman IL.Translating stem andprogenitor cell biology to the clinic:barriers and opportunities.Science(NewYork,NY.2000年2月25日；287(5457):1442-6)；还参见Iwaskaki,H.和Akashi,K."Myeloidlineage commitment from the hematopoietic stem cell",Immunity 26(6)2007年6月,726-40)。
HSC呈现出自我更新潜力和分化成血系的能力；即，当干细胞分裂时，平均50％的子细胞会形成细胞谱系，而其余50％不会分化。所述过程通过不对称细胞分裂来维持相同数目的干细胞，以使每个分裂的干细胞产生一个新的干细胞和一个分化的细胞。相比之下，在对称分裂中，干细胞产生100％相同的干细胞。(Gordon,M.Stem cells andhaemopoiesis.Hoffbrand,V.,Catovsky,D.,Tuddenham,E.G.,第5版BlackwellPublishing,(2005):Differential niche and Wnt requirements during acutemyeloid leukemia,第1-12页.New York.)。
淋巴和骨髓谱系在祖细胞水平上是可分离的。共同淋巴祖细胞(CLP)在生理条件下可以分化成所有类型的淋巴细胞，而没有明显的骨髓潜力(Kondo M,Scherer DC,Miyamoto T,King AG,Akashi K,Sugamura K.等Cell-fate conversion of lymphoidcommitted progenitors by instructive actions of cytokines.Nature.2000年9月21日；407(6802):383-6)，但视实验条件而定，CLP中可能会检测到一些骨髓相关基因(DeloguA,Schebesta A,Sun Q,Aschenbrenner K,Perlot T,Busslinger M.Gene repression byPax5 in B cells is essential for blood cell homeostasis and is reversed inplasma cells.Immunity.2006年3月；24(3):269-81)。
类似地，共同骨髓祖细胞(CMP)可以产生所有类别的骨髓细胞，而B细胞潜力不存在或水平极低(Akashi K,Traver D,Miyamoto T,Weissman IL.A clonogenic commonmyeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.Nature.2000年3月9日；404(6774):193-7)。另一种细胞类型，树突状细胞(DC)，没有明确分为淋巴或骨髓谱系，因为DC可以由CLP或CMP产生(Manz MG,Traver D,Miyamoto T,Weissman IL,AkashiK.Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloidprogenitors.Blood.2001年6月1日；97(11):3333-41,Traver D,Akashi K,Manz M,MeradM,Miyamoto T,Engleman EG等,Development of CD8alpha-positive dendritic cellsfrom a common myeloid progenitor.Science(New York,NY.2000年12月15日；290(5499):2152-4))。CMP可以增殖并分化成巨核细胞-红细胞(MegE)祖细胞和粒细胞-单核细胞(GM)祖细胞，进一步产生巨核细胞、红细胞、粒细胞、单核细胞等。(Iwasaki H,AkashiK.Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.Immunity.2007；26:726-740)。
转录因子表达水平的差异可能决定了分化细胞的谱系归属。转录因子PU.1和GATA-1分别与骨髓和红细胞/巨核细胞谱系分化有关(Gordon,M.Stem cells andhaemopoiesis.Hoffbrand,V.,Catovsky,D.,Tuddenham,E.G.,第5版BlackwellPublishing,(2005):Differential niche and Wnt requirements during acutemyeloid leukemia,第1-12页.New York.)。
HSC的表征
HSC是未分化的并且类似于小淋巴细胞。大部分HSC是静止的，处于细胞周期的G0期，这保护它们免受细胞周期依赖性药物的作用。干细胞的静止状态由转化生长因子β(TGF-β)维持。TGF-β的活性由p53介导，p53是一种调控细胞增殖并靶向细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的肿瘤抑制基因(Gordon,M.Stem cells and haemopoiesis.Hoffbrand,V.,Catovsky,D.,Tuddenham,E.G.,第5版Blackwell Publishing,(2005):Differentialniche and Wnt requirements during acute myeloid leukemia,第1-12页.New York.)。HSC的静止不仅对于保护干细胞区室和长时间维持干细胞库至关重要，而且对于最大限度地减少复制相关突变的积累也至关重要。发现许多维持HSC静止的内在转录因子与白血病相关。举例来说，在急性髓系白血病中已报道了导致FoxO和髓系/淋巴系白血病或混合谱系白血病融合的染色体易位(参见例如Sergio Paulo Bydlowski和Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development,Advancesin Hematopoietic Stem Cell Research,Rosana Pelayo博士(编),ISBN:978-953-307-930-1)。
大多数正常HSC存在于CD34+/CD38-/CD90+骨髓细胞部分中，在CD34-/Lin-细胞中也观察到一些HSC。CD34+/CD38+细胞部分含有一些具有短期再植活性的HSC。其它公认的标志物包括酪氨酸激酶受体c-kit(CD117)，与终末分化标志物(CD4和CD8)的缺乏相结合(Rossi等,Methods in Molecular Biology(2011)750(2):47-59)。
HSC的分类
造血干细胞库可以细分为三大类：(1)短期HSC，仅能够在4-6周内产生分化细胞的克隆体；(2)中期HSC，能够在灭绝前维持分化细胞子代6-8个月；以及(3)长期HSC，能够无限期地维持造血作用。(Testa U.Annals of Hematology(2011)90(3):245-271)。
造血作用
造血是一个高度协调的过程，其中HSC分化成由专门的调控微环境支持的成熟血细胞，所述微环境由控制干细胞和祖细胞的命运特化的组分组成，并通过提供必要的因子(“生态位”)维持其发育。如本文所用，术语“骨髓(BM)生态位”是指由在不同谱系的血细胞的存活、生长和分化中起重要作用的要素(例如，成骨细胞、破骨细胞、骨髓内皮细胞、基质细胞、脂肪细胞和细胞外基质蛋白(ECM))组成的组织良好的架构。骨髓生态位是重要的出生后微环境，在其中HSC增殖、成熟并产生骨髓和淋巴祖细胞。
骨髓(BM)存在于所有动物骨骼的髓腔中。它由多种前体细胞和成熟细胞类型组成，包括造血细胞(成熟血细胞的前体)和基质细胞(广泛的结缔组织细胞的前体)，这两种细胞似乎都能够分化成其它细胞类型。骨髓的单核部分含有基质细胞、造血前体和内皮前体。
与具有包括红髓和白髓在内的明显大体结构的次级淋巴器官(诸如脾)不同，除了含有成骨细胞的骨内膜外，BM没有明确的结构特征。内膜区域与钙化硬骨接触，并且提供维持HSC活性所必需的特殊微环境(Kondo M,Immunology Reviews(2010)238(1):37-46；Bydlowski和de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute MyeloidLeukemia Development,Advances in Hematopoietic Stem Cell Research,RosanaPelayo博士(编),ISBN:978-953-307-930-1)。
在生态位内，据信HSC接收来自多个来源的支持和生长信号，所述来源包括：成纤维细胞、内皮细胞和网状细胞、脂肪细胞、成骨细胞和间充质干细胞(MSC)。生态位的主要功能是整合营养物、氧气、旁分泌和自分泌信号的局部变化，并响应来自全身循环的信号而改变HSC的静止、运输和/或扩张(Broner,F.和Carson,MC.Topics in bonebiology.Springer.2009；4:第2-4页.New York,USA.)。
尽管真正的MSC的性质仍然被误解，但最近报道了表达CXC趋化因子配体12(CXCL12)的CD146 MSC是自我更新的祖细胞，所述祖细胞驻留在血窦表面上并有助于血窦壁结构的组织，产生血管生成素1(Ang-1)，并且能够产生形成骨内膜生态位的成骨细胞(Konopleva,MY和Jordan,CT,Biology and Therapeutic Targeting(2011)9(5):591-599)。这些CXCL12网状细胞可以用作HSC在成骨细胞与血管生态位之间穿梭的运输通路，在这些生态位中提供必要但不同的维持信号。
由骨髓MSC产生的细胞因子和趋化因子继发于不同的局部产生并通过细胞因子结合糖胺聚糖的作用而集中在特定的生态位中。其中，CXCL12/基质细胞衍生因子1α正向调控HSC归巢，而转化生长因子FMS样酪氨酸激酶3(Flt3)配体和Ang-1充当静止因子(参见例如Sergio Paulo Bydlowski和Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell inAcute Myeloid Leukemia Development,Advances in Hematopoietic Stem CellResearch,Rosana Pelayo博士(编),ISBN:978-953-307-930-1)。CXCL12-CXCR4信号传导参与个体发生期间HSC归巢至BM中以及集落形成祖细胞的存活和增殖。CXCR4选择性拮抗剂诱导的HSC动员至外周血中进一步指示CXCL12在造血器官中保留HSC方面的作用。BM植入涉及随后通过BMSC产生的复杂细胞外基质进行的细胞间相互作用。因此，血管细胞粘附分子1(VCAM-1)或纤连蛋白对于粘附至BM衍生的MSC至关重要。以这种方式，造血干细胞增殖动力学的控制对于调控正确的造血细胞产生是至关重要的。这些控制机制可以分为干细胞内在的或外在的，或两者的组合(参见例如Sergio Paulo Bydlowski和Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development,Advancesin Hematopoietic Stem Cell Research,Rosana Pelayo博士(编),ISBN:978-953-307-930-1)。
HSC的自我更新和分化可以受外部因素控制(外在控制)，诸如造血微环境中的细胞间相互作用或细胞因子，诸如SCF(干细胞因子)及其受体c-kit、Flt-3配体、TGF-β、TNF-α等。细胞因子通过多种信号转导通路的激活来调控多种造血细胞功能。与细胞增殖和分化相关的主要通路是Janus激酶(Jak)/信号转导子和转录激活子(STAT)、有丝分裂原激活蛋白(MAP)激酶和磷脂酰肌醇(PI)3-激酶通路(Sergio Paulo Bydlowski和Felipe de LaraJanz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development,Advances in Hema topoietic Stem Cell Research,Rosana Pelayo博士(编),ISBN:978-953-307-930-1)。
另外，其它转录因子，诸如干细胞白血病(SCL)造血转录因子；GATA-2；和参与细胞周期控制的基因产物，诸如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)pl6、p21和p27的表达已显示对于造血细胞从最早阶段的发育至关重要(内在控制)(Sergio Paulo Bydlowski和Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid LeukemiaDevelopment,Advances in Hematopoietic Stem Cell Research,Rosana Pelayo博士(编),ISBN:978-953-307-930-1)。
Notch-1-Jagged通路可能用来整合细胞外信号与细胞内信号传导和细胞周期控制。Notch-1是造血干细胞膜上的表面受体，所述受体结合至其在基质细胞上的配体Jagged。这会导致Notch-1的细胞质部分裂解，然后可以充当转录因子(Gordon,M.Stemcells and haemopoiesis.Hoffbrand,V.,Catovsky,D.,Tuddenham,E.G.,第5版BlackwellPublishing,(2005):Differential niche and Wnt requirements during acutemyeloid leukemia,第1-12页.New York.)。
使用BM/HSC移植治疗的病症
使用骨髓(BM)/造血干细胞(HSC)移植治疗的病症包括但不限于急性髓系白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)、神经母细胞瘤、非恶性遗传性和获得性骨髓病症(例如，镰状细胞性贫血、重型β地中海贫血、难治性戴蒙德-布莱克凡贫血(refractory Diamond-Blackfan anemia)、骨髓增生异常综合征、特发性严重再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、纯红细胞再生障碍、范可尼贫血(Fanconi anemia)、无巨核细胞增多症或先天性血小板减少症)、多发性骨髓瘤和严重联合免疫缺陷(SCID)。
造血系统恶性肿瘤
大多数造血系统恶性肿瘤包含功能异质细胞，其中只有一个亚组(称为癌症干细胞)负责肿瘤维持。癌症干细胞之所以如此命名，是因为它们具有类似于正常组织干细胞的品质，包括自我更新、延长存活时间以及产生具有更多分化特征的细胞的能力(Jones RJ和Armstrong SA,Biol Blood Marrow Transplant.2008年1月；14(增刊1):12-16)。
造血干细胞中的转化事件可以产生几种不同的恶性肿瘤，包括但不限于慢性髓系白血病、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病，并且甚至可能是急性淋巴细胞白血病，这取决于与致癌打击(oncogenic hit)相关的分化程度(Jones RJ和Armstrong SA,BiolBlood Marrow Transplant.2008年1月；14(增刊1):12-16)。
癌症干细胞概念是基于以下观点：特定组织的肿瘤常常似乎“试图”囊括起源组织中发现的细胞异质性，因此肿瘤中类似干细胞的细胞产生不同的细胞类型。关于这一假设的基本测试是肿瘤细胞是否可以分为具有肿瘤再生能力的细胞和不具有这种能力的细胞。这种细胞层次结构在急性骨髓性白血病中得到最清楚的证明，其中一些AML拥有具有独特免疫表型的细胞，这些细胞能够在免疫缺陷小鼠中引发白血病，而大多数细胞无法引发白血病发展。此外，引发白血病的细胞也会产生失去肿瘤引发活性的细胞，因此囊括原始肿瘤中发现的细胞异质性(Lapidot T等,Nature.1994；367:645-648；Bonnet D等,NatMed.1997；3:730-737)。
急性髓系白血病
急性髓系白血病(AML)是克隆性病症，其特征在于骨髓谱系的分化停滞与骨髓中不成熟祖细胞的积聚相结合，导致造血衰竭(Poll yea DA等,British Journal ofHaematology(2011)152(5):523-542)。白血病母细胞的外观存在很大的患者间异质性。急性髓系白血病(AML)中引发白血病的细胞的发现始于绝大多数AML母细胞不增殖并且只有一小部分能够形成新集落的发现(Testa U,Annals of Hematology(2011)90(3):245-271)。所有AML病例的共同特征是异常分化停滞，导致骨髓中超过20％的母细胞积聚(Gilliland,DG和Tallman MS,Cancer Cell(2002)1(5):417-420)。
超过80％的髓系白血病与至少一种染色体重排相关(Pandolfi PP,Oncogene(2001)20(40):5726-5735)，并且已克隆了超过100种不同的染色体易位(Gilliland,DG和Tallman MS,Cancer Cell(2002)1(5):417-420)。这些易位经常涉及编码转录因子的基因，这些转录因子已显示在造血谱系发育中起重要作用。因此，转录机制的改变似乎是导致分化停滞的常见机制(Pandolfi PP,Oncogene(2001)20(40):5726-5735；Tenen DG,NatureReviews of Cancer(2003)3(2):89-101)。
临床研究和实验动物模型表明，急性白血病的临床表现至少需要两种基因改变。根据Gilliland和Tallman(Cancer Cell(2002)1(5):417-420)提出的模型，I类激活突变与诱导分化终止的II类突变之间的合作产生AML。I类突变，诸如受体酪氨酸激酶基因FLT3和KIT、RAS家族成员的突变以及神经纤维蛋白1的功能丧失，赋予造血祖细胞增殖和/或存活优势，通常是信号转导通路异常激活的结果。II类突变经由干扰转录因子或辅激活子导致分化停止(Frankfurt O等,Current Opinion in Oncology(2007)19(6):635-649)。虽然白血病干细胞(LSC)似乎共享许多先前为HSC鉴定的细胞表面标志物，诸如CD34、CD38、HLA-DR和CD71，但多个小组已报告了在两个群体中差异性表达的表面标志物。举例来说，CD90或Thy-1已被描述为LSC区室的潜在特异性。当最原始的干细胞向祖细胞阶段进展时，Thy-1在正常造血中下调。(Hope KJ等,Archives of Medical Research(2003)34(6):507-514)。
白血病祖细胞上的CXCL12(基质细胞衍生因子1α)与其受体CXCR4之间的相互作用有助于它们归巢至骨髓微环境。CXCR4水平在来自AML患者的白血病细胞中显著升高，并且CXCR4表达与不良结果相关(Konopleva MY和Jordan CT,Biology and TherapeuticTargeting(2011)29(5):591-599)。
原代人类AML干细胞的核因子κβ(NF-kβ)通路I的组成型激活提供了以下证据：NF-kβ在LSC以及一般AML细胞类型的总体存活中起重要作用。(Konopleva MY和Jordan CT,Biology and Therapeutic Targeting(2011)29(5):591-599)。
AML患者临床预后较差并且治疗选择有限，其中清髓后进行造血干细胞移植(HSCT)是唯一的治愈性治疗。常用的调理方案不加区别地杀死所有高度增殖的细胞类型，导致危及生命的副作用，并且对静止的AML亚群也可能无效。
淋巴恶性肿瘤
当细胞进展至其正常的分化阶段时，大多数组织的自我更新能力就会丧失；例如，超出造血干细胞水平的骨髓谱系血细胞不再具有自我更新能力。分化相关的自我更新丧失的一个显著例外是淋巴系统，其中自我更新能力一直保留到记忆淋巴细胞阶段，以维持终生免疫记忆(Fearon DT等,Science.2001；293:248-250；Luckey CJ等,Proc Natl AcadSci US A.2006；103:3304-3309)。体细胞超突变是出现B细胞恶性肿瘤的分化阶段的标志物。一般来说，体细胞超突变的存在将肿瘤鉴定为在生发中心或生发中心后B细胞中出现，而突变的不存在则鉴定了生发中心前B细胞。与骨髓恶性肿瘤相反，但与谱系保留的自我更新能力一致，免疫球蛋白(lg)突变模式表明B细胞恶性肿瘤可以由B细胞分化的整个阶段的细胞产生(Lapidot T等,Nature.1994；367:645-648；Bonnet D和Dick JE,Nat Med.1997；3:730-737；Jones RJ等,J Natl Cancer Inst.2004；96:583-585)。
多发性骨髓瘤
一般认为多发性骨髓瘤(MM)是恶性浆细胞疾病，所述疾病的许多临床结果是由浆细胞块引起的。然而，正常浆细胞是终末分化的并缺乏自我更新能力，并且30多年已明朗，只有少数来自小鼠和人类MM的细胞是克隆源性的。这些罕见的克隆源性细胞被称为“肿瘤干细胞”(Park CH等,J Natl Cancer Inst.1971；46:411-422；Hamburger AW和Salmon SE,Science.1977；197:461-463)。MM浆细胞由一小群自我更新的癌症干细胞产生，这些干细胞类似于记忆B细胞。这些克隆型B细胞不仅在大多数患者中循环，而且还对许多标准抗MM剂具有抗性，因此似乎是大多数疾病复发的原因(Matsui WH等,Blood.2004；103:2332-2336；Kukreja A等,J Exp Med.2006；203:1859-1865；Jones RJ和Armstrong SA,Biol BloodMarrow Transplant.2008年1月；14(增刊1):12-16)。
霍奇金氏淋巴瘤
作为霍奇金氏淋巴瘤(HL)标志的里德-斯滕伯格(Reed-Sternberg，RS)细胞是除了浆细胞之外唯一偶尔表达CD138的血细胞(Carbone A等,Blood.1998；92:2220-2228)。已显示HL细胞系包括一小群细胞，这些细胞缺乏其余细胞上存在的RS标志物CD15和CD30，同时表达与记忆B细胞表型一致的标志物(Newcom SR等,Int J Cell Cloning.1988；6:417-431；Jones RJ等,Blood.2006；108:470)。这种小亚群的表型记忆B细胞具有HL细胞系内的所有克隆形成能力。大多数HL患者，包括患有早期疾病的那些患者，都具有与患者RS细胞具有相同克隆lg基因重排的循环记忆B细胞(Jones RJ等,Blood.2006；108:470；Jones RJ和Armstrong SA,Biol Blood Marrow Transplant.2008年1月；14(增刊1):12-16)。这些数据表明这些克隆型记忆B细胞可能代表HL干细胞。
血液恶性肿瘤的治疗
造血干细胞(HSC)用于骨髓移植以治疗血液恶性肿瘤以及非恶性病症(Warner等,Oncogene(2004)23(43):7164-7177)。在研究人员发现哪些细胞组分负责清髓患者中供体造血和免疫系统的植入之前，多年来，骨髓(BM)一直作为未分级细胞库进行移植(参见例如Sergio Paulo Bydlowski和Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell inAcute Myeloid Leukemia Development,Advances in Hematopoietic Stem CellResearch,Rosana Pelayo博士(编),ISBN:978-953-307-930-l)。患者进行骨髓/造血干细胞(BM/HSC)移植的准备或调理是程序的关键要素。它有两个主要目的：(1)它为患者提供足够的免疫抑制并在骨髓中为移植的HSC清除足够的生态位空间，从而允许移植的细胞在接受体中植入；以及(2)它常常有助于根除恶性肿瘤的根源。
传统上，患者的调理已通过施用最大耐受剂量的联合或不联合放射的化学治疗剂混合物来达成。混合物的组分常常被选择为具有不重叠的毒性。当前使用的所有准备方案都是有毒的，并且具有可能危及生命的严重副作用。这些副作用有粘膜炎、恶心和呕吐、脱发、腹泻、皮疹、外周神经病变、不孕、肺毒性和肝毒性。这些副作用中有许多对于老年和患病患者来说尤其危险，并且常常成为决定患者是否接受移植的决定性组成部分。
因此，需要准备或调理适合骨髓/造血干细胞(BM/HSC)移植而没有这些毒性的患者。
还需要在没有这些毒性的情况下治疗血液恶性肿瘤，诸如AML。
发明内容
本文提供了结合至FLT3和CD3或其抗原结合片段的双特异性抗体。本文还提供了包含此类抗体或片段的药物组合物。本文还提供了使用此类抗体或片段消除受试者中的造血干细胞/造血祖细胞(HSC/HP或一起为HSPC)和/或治疗受试者的癌症的方法。
在一些方面，本公开提供了一种结合至人类FLT3和人类CD3的双特异性人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含：
(i)第一轻链可变区(VL1)，所述第一轻链可变区包含VL1互补决定区(CDR)1、VL1CDR2和VL1 CDR3，所述VL1 CDR1、VL1 CDR2和VL1 CDR3是包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的轻链可变区(VL)的CDR；和/或
(ii)第一重链可变区(VH1)，所述第一重链可变区包含VH1互补决定区(CDR)1、VH1CDR2和VH1 CDR3，所述VH1 CDR1、VH1CDR2和VH1 CDR3是包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的重链可变区(VH)的CDR；
其中所述VL1和所述VH1结合至人类FLT3；并且
还包含结合至人类CD3的第二VL(VL2)和第二VH(VH2)。
在一些前述或相关方面，VL1 CDR1包含氨基酸序列QEISGY(SEQ ID NO:31)(或基本上由其组成或由其组成)，VL1 CDR2包含氨基酸序列AAS(SEQ ID NO:32)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL1 CDR3包含氨基酸序列LQYASYPLT(SEQ ID NO:37)(或基本上由其组成或由其组成)；并且VH1 CDR1包含氨基酸序列GFSLSRSTMG(SEQ ID NO:38)(或基本上由其组成或由其组成)，VH1 CDR2包含氨基酸序列IKWNDSK(SEQ ID NO:39)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH1 CDR3包含氨基酸序列ARIVYYS TYVGYFDV(SEQ ID NO:36)(或基本上由其组成或由其组成)。在这些实施方案中的一些实施方案中，CDR如由Kabat所确定。
在一些前述或相关方面，VL1 CDR1包含氨基酸序列RASQEIS GYLS(SEQ ID NO:71)(或基本上由其组成或由其组成)，VL1 CDR 2包含氨基酸序列AASTLHS(SEQ ID NO:72)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL1 CDR3包含氨基酸序列LQYASYPLT(SEQ ID NO:37)(或基本上由其组成或由其组成)；并且VH1 CDR1包含氨基酸序列GFSLSRSTMGVG(SEQ IDNO:73)(或基本上由其组成或由其组成)，VH1 CDR2包含氨基酸序列HIKWNDSKYYNPAL KS(SEQ ID NO:74)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH1 CDR3包含氨基酸序列IVYYSTYVGYFDV(SEQ ID NO:75)(或基本上由其组成或由其组成)。在这些实施方案中的一些实施方案中，CD R如由Martin(增强型Chothia)编号方案所定义，如http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中所描述，其通过引用整体并入本文。在这些实施方案中的一些实施方案中，CDR如由http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中的“Howto identify the CDRs by looking at a sequenc e”部分所定义，其通过引用整体并入本文。
在一些前述或相关方面，
(iii)VL2包含VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3，所述VL2CDR1、VL2 CDR2和VL2CDR3是包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VL的CDR：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:29；并且/或者
(iv)VH2包含VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3，所述VH2CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VH的CDR：SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22；其中所述VL2和所述VH2结合至人类CD3。
在一些前述或相关方面，
VL2 CDR1包含TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，VL2 CDR2包含GTN(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)、ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)和ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)；并且
VH2 CDR1包含GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含IRSKYNNYAT(SE Q ID NO:44)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:45)、VRH GNFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:48)、VRHGHFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:49)、VRHGMFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:50)和VRHGQFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:51)。在这些实施方案中的一些实施方案中，CDR如由Kabat所定义。
在一些前述或相关方面，
VL2 CDR1包含TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，VL2 CDR2包含GTN(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)、ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)和ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)；并且/或者
VH2 CDR1包含GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含IRSKYNNYAT(SE Q ID NO:44)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:83)、HGNFGT SYVSWFAY(SEQ ID NO:84)、HGHFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:85)、HGMFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:86)和HGQFGTSYVSW FAY(SEQ ID NO:87)。
在一些前述或相关方面，VL2 CDR1包含GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:76)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，VL2CDR2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：GTNKRSS(SEQ ID NO:77)、GTNKRVS(SEQ ID NO:78)和GTNKRSS(SEQ ID NO:79)和GTNKRAS(SEQ ID NO:80)；以及VL2 CDR3；并且VL2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)、ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)和ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)；并且/或者
VH2 CDR1包含GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:81)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含RIRSKYNNYA TYYADSVKG(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:83)、HGNFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:84)、HGHFGTSYVSWF AY(SEQ ID NO:85)、HGMFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:86)和HGQFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:87)。在这些实施方案中的一些实施方案中，CDR如由Martin(增强型Chothia)编号方案所定义，如http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中所描述，其通过引用整体并入本文。在这些实施方案中的一些实施方案中，CDR如由http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中的“How to identify the CDRs by lookin g at a sequence”部分所定义，其通过引用整体并入本文。
在一些前述或相关方面，VL2 CDR1包含GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:76)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，VL2CDR2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：GTNKRSS(SEQ ID NO:77)、GTNKRVS(SEQ ID NO:78)和GTNKRSS(SEQ ID NO:79)和GTNKRAS(SEQ ID NO:80)；以及VL2 CDR3；并且VL2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)、ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)和ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)；并且/或者
VH2 CDR1包含GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:81)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含RIRSKYNNYA TYYADSVKG(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:45)、VRHGNFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:48)、VRHGHFG TSYVSWFAY(SEQ ID NO:49)、VRHGMFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:50)和VRHGQFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:51)。在这些实施方案中的一些实施方案中，CDR中的任一者如由Kabat所确定。
在一些前述或相关方面，
VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VL的CDR，并且/或者VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VH的CDR。在任何前述或相关方面，
VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)(或基本上由其组成或由其组成)，VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL2 CDR3包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)(或基本上由其组成或由其组成)；并且/或者
VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYN NYAT(SEQ ID NO:44)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2CDR3包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:45)(或基本上由其组成或由其组成)。在这些实施方案中的一些实施方案中，CDR如由Kabat所定义。在其它实施方案中，CDR如由Mart in(增强型Chothia)编号方案或http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中的“How to identify the CDRs by looking at a sequence”部分所定义。
在一些前述或相关方面，
VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VL的CDR，并且/或者VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)(或基本上由其组成或由其组成)，VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL2 CDR3包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)(或基本上由其组成或由其组成)；并且/或者
VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VH的CDR，并且/或者VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQID NO:83)(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，
VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VL的CDR，并且/或者VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)(或基本上由其组成或由其组成)，VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL CDR3包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)(或基本上由其组成或由其组成)；并且/或者
VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VH的CDR，并且/或者VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGNFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:48)(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，
VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VL的CDR，并且/或者VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)(或基本上由其组成或由其组成)，VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL CDR3包含氨基酸序列ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)(或基本上由其组成或由其组成)；并且/或者
VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VH的CDR，并且/或者VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGNFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:45)(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VL的CDR，并且/或者VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)(或基本上由其组成或由其组成)，VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL CDR3包含氨基酸序列ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)(或基本上由其组成或由其组成)；并且/或者
VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VH的CDR，并且/或者VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGHFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:49)(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VL的CDR，并且/或者VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)(或基本上由其组成或由其组成)，VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL CDR3包含氨基酸序列ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)(或基本上由其组成或由其组成)；并且/或者
VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VH的CDR，并且/或者VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGMFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:50)(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，
VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VL的CDR，并且/或者VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ IDNO:40)(或基本上由其组成或由其组成)，VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL CDR3包含氨基酸序列ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)(或基本上由其组成或由其组成)；并且/或者
VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VH的CDR，并且/或者VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGQFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:51)(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:29的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VL的CDR，并且/或者VL2CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)(或基本上由其组成或由其组成)，VL2CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL CDR3包含氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)(或基本上由其组成或由其组成)；并且/或者
VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VH的CDR，并且/或者VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)(或基本上由其组成或由其组成)，VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:45)(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些方面，本公开提供了一种结合至人类FLT3和人类CD3的双特异性人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含：
VL2，所述VL2包含VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3，所述VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2CDR3是包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VL的CDR：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:29；和/或VH2，所述VH2包含VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3，所述VH2CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)的VH的CDR：SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22；其中所述VL2和所述VH2结合至人类CD3；并且还包含结合至人类FLT3的VL1和VH1。
在一些前述或相关方面，VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)(或基本上由其组成或由其组成)，VL2CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VL2 CDR3包含氨基酸序列ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)或ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)(或基本上由其组成或由其组成)；并且/或者VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)，VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：VRHGNFGTSYVSFAY(SEQ ID NO:48)、VRHGHFGTSYVSFAY(SEQ ID NO:49)、VRHGMFGTSYVSFAY(SEQ ID NO:50)和VRHGQFGTSYVSFAY(SEQ ID NO:51)。
在一些前述或相关方面，VL1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，VH1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，本文所描述的双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体和片段包含单链可变片段(scFv)，其中所述scFv包含VL1和VH1，诸如本文所描述的任何VL1和VH1。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，本文所描述的双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中所述HC包含VL1、VH1和VH2。在一些实施方案中，VL1通过第一接头连接至VH1，并且VH1通过第二接头连接至VH2。在一些实施方案中，VL1的C末端通过第一接头连接至VH1的N末端，并且VH1的C末端通过第二接头连接至VH2的N末端。在一些实施方案中，第一接头和第二接头具有式(Gly3-4-Ser)1-4。在一些实施方案中，第一接头具有式(Gly4-Ser)4。在一些实施方案中，第二接头具有式(Gly4-Ser)3。
在一些前述或相关方面，本文所描述的双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体包含HC，所述HC包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57。
在一些实施方案中，HC包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些实施方案中，HC包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些实施方案中，HC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些实施方案中，HC包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些实施方案中，HC包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，本文所描述的双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体包含含有VH2的LC。
在一些前述或相关方面，LC包含选自由以下组成的组的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:29。
在一些实施方案中，LC包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些实施方案中，LC包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些实施方案中，LC包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些实施方案中，LC包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些实施方案中，LC包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些方面，本公开提供了一种结合至人类FLT3和人类CD3的双特异性人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含：
(i)第一轻链可变区(VL1)，其中所述VL1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；和/或
(ii)第一重链可变区(VH1)，其中所述VH1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；其中所述VL1和所述VH1结合至人类FLT3；并且还包含结合至人类CD3的第二轻链可变区(VL2)和第二重链可变区(VH2)。
在一些前述或相关方面，VL1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，本文所描述的双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体和片段包含单链可变片段(scFv)，其中所述scFv包含VL1和VH1，并且其中所述scFv包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，
(iii)VL2包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；并且/或者
(iv)VH2包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，VL2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，VL2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些方面，本公开提供了一种结合至人类FLT3和人类CD3的双特异性人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含：VL2，所述VL2包含SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；和/或VH2，所述VH2包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；其中所述VL2和所述VH2结合至人类CD3；并且还包含结合至人类FLT3的VL1和VH1。在一些实施方案中，VL2包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。在一些实施方案中，VL2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)，并且VH2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，抗体包含重链(HC)和/或轻链(LC)。在一些实施方案中，LC包含恒定结构域。在一些实施方案中，恒定结构域包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，HC包含Fc区。在一些实施方案中，Fc区是IgG。在一些实施方案中，IgG是人类IgG1、人类IgG2、人类IgG3或人类IgG4。在一些实施方案中，IgG是IgG1。
在一些前述或相关方面，Fc区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。在一些前述或相关方面，Fc区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，抗体包含LC，所述LC包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；和/或HC，所述HC包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，抗体包含LC，所述LC包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；和/或HC，所述HC包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，抗体包含LC，所述LC包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；和/或HC，所述HC包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，抗体包含LC，所述LC包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；和/或HC，所述HC包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，抗体包含LC，所述LC包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；和/或HC，所述HC包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，抗体包含LC，所述LC包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；和/或HC，所述HC包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，抗体包含LC，所述LC包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；和/或HC，所述HC包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，抗体包含LC，所述LC包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；和/或HC，所述HC包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，抗体包含LC，所述LC包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)；和/或HC，所述HC包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列(或基本上由其组成或由其组成)。
在一些前述或相关方面，双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或片段是单克隆抗体。在一些前述或相关方面，抗体或片段是纯化的。
在一些前述或相关方面，抗体或片段在人体内的半衰期是1天至14天。在一些前述或相关方面，抗体或片段在人体内的半衰期是4天至7天。
在一些方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的任一前述或相关方面的抗体或片段以及药学上可接受的赋形剂。在一些前述或相关方面，药物组合物还可以包含抗肿瘤剂。
在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的血液癌症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用(例如，治疗有效量的)：(i)任一前述或相关方面的抗体或片段，或(ii)任何前述或相关方面的药物组合物。
在一些方面，本公开提供了一种准备或调理有需要的受试者用于造血细胞移植的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用(例如，治疗有效量的)：(i)任一前述或相关方面的抗体或片段，(ii)任一前述或相关方面的药物组合物。在一些实施方案中，施用在造血细胞移植之前进行。在一些实施方案中，有需要的受试者患有血液癌症。
在方法的一些实施方案中，施用治疗有效量的抗体或片段使表达CD34、FLT3、CD33、CD11b、CD16、CD15和CD66b中的一者或多者的细胞群体降低至少90％。在一些实施方案中，施用治疗有效量的抗体或片段使表达CD34、FLT3中的一者或多者的细胞群体降低至少90％。
在方法的一些实施方案中，所述方法还包括在施用后对受试者进行造血细胞移植。在一些实施方案中，造血细胞移植包括向受试者移植造血干细胞和/或造血祖细胞。在一些实施方案中，在施用后5天至5周进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用后约2至3周进行造血细胞移植。
在方法的一些实施方案中，血液癌症是急性髓系白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性髓系白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤、非恶性遗传性或获得性骨髓病症、多发性骨髓瘤、树突状细胞肿瘤或母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，血液癌症是AML。在一些实施方案中，血液癌症是树突状细胞肿瘤。在一些实施方案中，血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，血液癌症是非恶性遗传性或获得性骨髓病症，并且其中所述非恶性遗传性或获得性骨髓病症选自镰状贫血、重型β-地中海贫血、难治性戴蒙德-布莱克凡贫血、骨髓增生异常综合征、特发性严重再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、纯红细胞再生障碍、范可尼贫血、无巨核细胞增多症或先天性血小板减少症。
在方法的一些实施方案中，向受试者施用的抗体或片段的量或治疗有效量为约0.01mg/kg至约2mg/kg。在一些实施方案中，向受试者施用的抗体或片段的量或治疗有效量为约0.1mg/kg至约0.3mg/kg。
在方法的一些实施方案中，施用是单剂量一次。
在方法的一些实施方案中，每1-14天施用一次，持续约1至4周。在方法的一些实施方案中，每3-7天施用一次，持续2至3周。
在方法的一些实施方案中，施用是静脉内施用(例如，通过输注至受试者体内)。
在药物组合物的一些实施方案中，所述组合物还包含检查点抑制剂。
在方法的一些实施方案中，所述方法还包括施用检查点抑制剂。
在一些前述或相关方面，检查点抑制剂是抗PD1拮抗剂、抗PD-L1拮抗剂和/或抗CTLA4拮抗剂(例如，拮抗性抗体)。在一些前述或相关方面，检查点抑制剂是抗PD1抗体。
在一些前述或相关方面，抗体或片段的施用与检查点抑制剂的施用同时进行。在一些前述或相关方面，抗体或片段的施用在检查点抑制剂的施用之前进行。在一些前述或相关方面，抗体或片段的施用在检查点抑制剂的施用之后进行。
在一些前述或相关方面，受试者是人。
定义
如本文所用，术语“约”当用于修饰数值时，指示高于和低于所述数值至多10％的偏差保持在所叙述值的预期含义内。
如本文所用，术语“VL”是指抗体的轻链可变区。
如本文所用，术语“VH”是指抗体的重链可变区。
如本文所用，相对于参考多肽序列的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“序列同一性百分比”被定义为候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。序列同一性百分比在比对序列并引入空位(如有必要)后确定，以达成最大序列同一性百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以通过本领域中已知的各种方式来达成。示例比对工具包括但不限于BLASTp、BLAST-2、ALIGN(例如，ALIGN-2)或Megalign(DNASTAR)软件。
附图说明
图1A-1C显示了118BA(图1A)、1B11E7(图1B)和281A(图1C)与表达FLT3的REH细胞系的结合亲和力。
图2A-2C显示了118BA、1B11E7和281A与表达FLT3的REH细胞系在经和未经10nMFLT3L预处理的情况下的结合亲和力。
图3A-3F分别显示了118BA的人源化变体1和5、1B11E7的人源化变体7和10以及281A的人源化变体1和5与表达FLT3的REH细胞系的结合亲和力。
图4A-4C显示了瞬时表达恒河猴FLT3(图4A)、人类FLT3(图4B)的HEK293T细胞和模拟(图4C)转染的细胞中281A变体1、1B11E7变体7和118BA变体1的结合概况。
图5A和图5B显示了抗FLT3人源化变体(281A变体1、1B11E7变体7和118BA变体1)与表达FLT3的CD34+人类和恒河猴骨髓细胞和CD34-对照骨髓细胞的结合。
图6显示了嵌合单克隆抗CD3 IgG SP34克隆体与原代人脐血T细胞的结合。
图7显示了单克隆抗CD3 IgG SP34克隆体的完全人源化变体2和6与Jurkat细胞的结合。
图8显示了单克隆抗CD3 IgG SP34克隆体的完全人源化变体2和6与外周血中约58％的恒河猴单核细胞的结合。
图9A-9D分别显示了281A#1、1B11E7#2、118BA#3和118BA#4双特异性抗体的结构，指示FLT3结合结构域和CD3结合结构域。
图10A-10D分别显示了281A#1、1B11E7#2、118BA#3和118BA#4与表达FLT3的REH细胞的结合亲和力。
图11A-11D分别显示了281A#1、1B11E7#2、118BA#3和118BA#4与表达FLT3的Jurkat细胞系的结合亲和力。
图12A-12D分别显示了随双特异性抗体281A#1、1B11E7#2、118BA#3和118BA#4的浓度而变的总凋亡和死亡靶REH细胞％。还指示了每种抗体对REH细胞的细胞毒性的EC50。
图12E显示了在存在和不存在效应T细胞的情况下在各种抗体浓度下对膜联蛋白V+7AAD+死细胞和膜联蛋白V+7AAD-凋亡细胞进行门控的CellTrace Violet-REH细胞的代表性流程图。
图12F显示了在存在和不存在REH靶细胞的情况下随双特异性抗体118BA#3的浓度的而变的激活FSC-A高T细胞％。
图12G显示了在存在和不存在靶REH细胞的情况下在各种抗体浓度下对FSC-A高激活T细胞进行门控的CellTrace Violet+T细胞的代表性流程图。
图13显示了118BA#3与表达FLT3的细胞系MOLM-13、OCI-AML、HL-60、NOMO-1、THP-1、MV4-11和REH的结合亲和力。将细胞归类为高(EC50<1nM)、中(1<EC50<4nM)和低(EC50>4nM)FLT3表达水平。
图14显示了随双特异性抗体118BA#3的浓度而变的总凋亡和死亡靶细胞(MOLM-13、OCI-AML、HL-60、NOMO-1、THP-1、MV4-11或REH细胞)％。还指示了针对每种靶细胞系的细胞毒性的EC50。
图15在线性标度(上部)和对数标度(下部)上显示了C57BL/6小鼠中118BA#3和FcRnKO变体118BA#5和118BA#6的半衰期。
图16A-16D分别显示了118BA#3及其三种变体118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C与表达FLT3的REH细胞系的结合亲和力。
图16E-16H分别显示了118BA#3及其三种变体118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C与表达CD3的人类T细胞的结合亲和力。
图17A-17D分别显示了随双特异性抗体118BA#3、118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C的浓度而变的总凋亡和死亡靶REH细胞％。如果进行确定，则还指示了每种抗体对REH细胞的细胞毒性的EC50。
图18A-18D分别显示了在存在和不存在REH靶细胞的情况下随双特异性抗体118BA#3、118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C的浓度而变的激活FSC-A高T细胞％。
图19A-19D分别显示了随双特异性抗体118BA#3、118BA#3a1、118BA#3a2和118BA#3a3的浓度而变的总凋亡和死亡靶REH细胞％。如果进行确定，则还指示了每种抗体对REH细胞的细胞毒性的EC50。
图20A-20D分别显示了在存在和不存在REH靶细胞的情况下随双特异性抗体118BA#3、118BA#3a1、118BA#3a2和118BA#3a3的浓度而变的激活FSC-A高T细胞％。
图21A和图21B分别显示了118BA#3和#3a1与表达FLT3的REH细胞系的结合亲和力。图21C和图21D分别显示了118BA#3和#3a1与表达CD3的原代人类T的结合亲和力。图21E显示了118BA#3和#3a1与重组人类CD3e包被的ELISA板的结合亲和力。
图22A-22E显示了NOG小鼠人源化和后续治疗时程的时间线。向3个治疗组和1个对照组施用总共3次剂量(22A)；第16天来自所有治疗组的股骨的代表性图像，其中细胞过少区域用箭头表示(22B)；人源化小鼠的股骨和胫骨的骨髓内单核细胞(MNC)的总数。每个数据点代表单只小鼠，并且将值归一化为未治疗对照内的平均计数(22C)；基于通过流式细胞术确定的频率，将总MNC分层为小鼠(左)和人类(右)。将值归一化为未治疗小鼠中的平均计数(22D)；以及来自人源化小鼠的股骨和胫骨的骨髓的人类CD34+HSPC总数(22E)。
图23A-23D显示了MOLM-13植入和使用0.1和0.01mg/kg剂量的118BA#3的后续治疗时程的时间线(23A)；所有治疗组的存活曲线(23B)；通过流式细胞术确定的指定治疗组随时间而变的EGFP+MOLM-13频率，以外周血中所有单核细胞的百分比表示。每条曲线代表单只小鼠，其中正方形代表死亡时间(23C)；并且每两周测量一次外周血中的人类T细胞频率(hCD45+、CD3+)，直至第30天通过流式细胞术测量(23D)。
图24A-24D显示了MV4-11异种移植和使用0.1和0.01mg/kg剂量的118BA#3的后续治疗时程的时间线(24A)；所有治疗组的存活曲线(24B)；通过流式细胞术确定的指定治疗组随时间而变的EGFP+MOLM-13频率，以外周血中所有单核细胞的百分比表示。每条曲线代表单只小鼠，其中正方形代表死亡时间(24C)；并且每两周测量一次外周血中的人类T细胞频率(hCD45+、CD3+)，直至第30天通过流式细胞术测量(24D)。
图25A-25F显示了NOG小鼠人源化继之以EGFP-MV4-11植入和治疗时程的时间线(25A)；所有治疗组的存活曲线(25B)；第4周和第6周EGFP-MV4-11细胞的外周血频率(25C)；以总单核细胞的频率表示的人类植入的外周血频率(25D)；异种移植后4周外周血中(hCD45+、CD3+)T细胞上的PD1表达的代表性直方图(25E)；和指定时间点的外周血T细胞频率(25F)。
图26A-26C显示了MV4-11异种移植和使用0.1和0.5mg/kg剂量的118BA#3变体的后续治疗时程的时间线(26A)；0.1mg/kg(上部)和0.5mg/kg(下部)的所有治疗组的存活曲线(26B)；对于0.1mg/kg(上部)和0.5mg/kg(下部)剂量在指定时间点的外周血(hCD45+、CD3+)T细胞频率(26C)。
图27显示了针对1B11sL3-1抗体进行的人类FLT3上的表位定位：比较FLT3+1B11sL3-1复合物与单独的FLT3之间的D20摄取差异的差异和摄取图。
图28示出了针对1B11sL3-1抗体进行的人类FLT3上的表位定位：比较FLT3+1B11sL3-1复合物与FLT3之间的D2O摄取的热图。
图29显示了针对1-18BAC1抗体进行的人类FLT3上的表位定位：比较FLT3+1-18BAC1复合物与FLT3之间的D20摄取差异的差异和摄取图。
图30示出了针对1-18BAC1抗体进行的人类FLT3上的表位定位：比较FLT3+1-18BAC1复合物与FLT3之间的D2O摄取的热图。
具体实施方式
本文提供了特异性结合至表达CD3和Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)的细胞的抗体或其抗原结合片段。不受理论的束缚，本文所描述的抗CD3/抗FLT3抗体结合并激活T细胞并且将这些T细胞靶向表达FLT3的靶细胞。
在一个方面，本文提供了特异性结合FLT3和CD3的双特异性抗体或其抗原结合片段(诸如免疫球蛋白、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、单链片段(诸如scFv)和其它片段)。在某些实施方案中，本文所提供的双特异性抗FLT3/CD3抗体及其抗原结合片段特异性结合人类和猴(例如，恒河猴)FLT3。在某些实施方案中，本文所提供的双特异性抗FLT3/CD3抗体及其抗原结合片段特异性结合人类FLT3。
本文还提供了包含本文所描述的双特异性抗FLT3/CD3抗体或其片段的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的双特异性抗体或片段(例如，用于准备受试者进行骨髓移植或用于治疗癌症的量)。
本文还提供了编码本文所描述的双特异性抗FLT3/CD3抗体及其抗原结合片段的核酸。还提供了制备此类抗体和片段的方法。
在又一个方面，本文提供了本文所描述的双特异性抗FLT3/CD3抗体及其抗原结合片段的使用方法。在一些实施方案中，本文提供了使用本文所描述的双特异性抗体和片段治疗血液恶性肿瘤(例如，AML)的方法(例如，通过向人类施用抗体或片段)。在一些实施方案中，本文提供了使用本文所描述的双特异性抗体和片段进行HSC移植调理的方法(例如，通过向人类施用抗体或片段)。在一些实施方案中，HSC移植调理方法之后可以进行造血细胞移植。
在本文所描述的任何实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体及其抗原结合片段可以是人源化双特异性抗体和片段(诸如包含介导FLT3结合和/或介导CD3结合的人源化VH和/或VL的抗体和片段)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或其抗原结合片段包含介导FLT3结合的人源化VH(诸如本文所描述的任何VH)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或其抗原结合片段包含介导FLT3结合的人源化VL(诸如本文所描述的任何VL)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或其抗原结合片段包含介导FLT3结合的人源化VH和人源化VL(诸如本文所描述的任何VH和VL)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或其抗原结合片段包含介导CD3结合的人源化VH(诸如本文所描述的任何VH)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或其抗原结合片段包含介导CD3结合的人源化VL(诸如本文所描述的任何VL)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或其抗原结合片段包含介导CD3结合的人源化VH和人源化VL(诸如本文所描述的任何VH和VL)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或其抗原结合片段包含介导FLT3结合的人源化VH和人源化VL以及介导CD3结合的人源化VH和人源化VL(诸如本文所描述的任何VH和VL)。
抗体
本文提供了结合至FLT3和CD3的双特异性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，双特异性抗体或片段结合人类和/或恒河猴FLT3。在一些实施方案中，双特异性抗体或片段结合人类和/或恒河猴CD3。在一些实施方案中，双特异性抗体或片段结合人类FLT3和人类CD3。在一些实施方案中，本文提供了特异性结合人类FLT3和人类CD3的抗体及其片段。本文所描述的抗体和片段可以表现出与来自一种或多种其它物种(除了人类和恒河猴之外)的FLT3和/或CD3的交叉反应性。在一些实施方案中，还涵盖了特异性结合人类和/或猴(例如，恒河猴)FLT3和CD3并且不表现出与来自其它物种的FLT3的交叉反应性的抗体及其片段。
在一些实施方案中，所涵盖的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体和片段包含本文所描述的任何CDR。在一些实施方案中，所涵盖的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体和片段包含本文所描述的任何轻链可变区和/或本文所描述的任何重链可变区。在一些实施方案中，所涵盖的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体和片段包含本文所描述的任何scFv。在一些实施方案中，所涵盖的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体包含本文所描述的任何重链和/或轻链。在一些实施方案中，所涵盖的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体包含本文所描述的任何恒定结构域。
在一些实施方案中，所涵盖的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体和片段包含与本文所描述的任何CDR具有至少95％同一性(例如，氨基酸同一性)的CDR。在一些实施方案中，所涵盖的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体和片段包含与本文所描述的任何轻链可变区和/或本文所描述的任何重链可变区具有至少95％同一性(例如，氨基酸同一性)的本文所描述的轻链可变区和/或任何重链可变区。在一些实施方案中，所涵盖的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体和片段包含与本文所描述的任何scFv具有至少95％同一性(例如，氨基酸同一性)的scFv。在一些实施方案中，所涵盖的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体包含与本文所描述的任何重链和/或轻链具有95％同一性(或至少95％同一性)的重链和/或轻链。在一些实施方案中，所涵盖的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体包含与本文所描述的任何恒定结构域具有95％同一性(或至少95％同一性)的恒定结构域。
通篇提及的“片段”是指本文所描述的抗体的抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段不与FLT3配体竞争结合至FLT3。
在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在FLT3和CD3两者上都是二价的。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段二价地结合至FLT3和/或CD3。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段包含6个介导与FLT3的结合的CDR(3个VL和3个VH)和/或包含6个介导与CD3的结合的CDR(3个VL和3个VH)，其中CDR可以是本文所描述的任何CDR。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段二价地结合至FLT3和CD3。
在本文所描述的任何实施方案中，抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段可以是人源化抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段。术语“人源化”的含义是本领域中众所周知的。人源化抗体或片段包括人类框架区和一个或多个来自非人类(例如，小鼠、大鼠或合成序列)的CDR。
在一些实施方案中，本文提供了抗FLT3 1-18BA-v1 scFv(此种scFv的序列描述于本文中，参见序列表中的相应序列或SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，本文提供了抗CD3humSP34-v6 VL(此种VL的序列描述于本文中，参见序列表中的相应序列或SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，本文提供了抗CD3 humSP34-v6 VH(此种VH的序列描述于本文中，参见序列表中的相应序列或SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，本文提供了抗CD3 humSP34-v2VL(此种VL的序列描述于本文中，参见SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，本文提供了抗CD3humSP34-v2 VH(此种VH的序列描述于本文中，参见序列表中的相应序列或SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，本文提供了与以下任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％氨基酸同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列的抗体：抗FLT3 1-18BA-v1 scFv、抗CD 3humSP34-v6 VL、抗CD3 humSP34-v6 VH、抗CD3humSP34-v2VL、抗CD3 humSP34-v2 VH。在一些实施方案中，氨基酸取代是保守取代。在一些实施方案中，氨基酸取代不在CDR区中。
在一些实施方案中，本文提供了抗体118BA#3WT(在本文中也被称为#3或#3WT)或其任何抗原结合片段(此种抗体及其片段(包括VH、VL和scFv)的序列如本文所描述，参见例如序列表中的相应序列，例如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，本文提供了抗体118BA 3A(在本文中也被称为3A或#3A)或其任何抗原结合片段(此种抗体及其片段(包括VH、VL和scFv)的序列如本文所描述，参见例如序列表中的相应序列，例如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:13)。在一些实施方案中，本文提供了抗体118BA 3B(在本文中也被称为3B或#3B)或其任何抗原结合片段(此种抗体及其片段(包括VH、VL和scFv)的序列如本文所描述，参见例如序列表中的相应序列，例如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:13)。在一些实施方案中，本文提供了抗体118BA 3C(在本文中也被称为3C或#3C)或其任何抗原结合片段(此种抗体及其片段(包括VH、VL和scFv)的序列如本文所描述，参见例如序列表中的相应序列，例如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:13)。在一些实施方案中，本文提供了抗体118BA 3a2(在本文中也被称为3a2或#3a2)或其任何抗原结合片段(此种抗体及其片段(包括VH、VL和scFv)的序列如本文所描述，参见例如序列表中的相应序列，例如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19)。在一些实施方案中，本文提供了抗体118BA 3a1(在本文中也被称为3a1或#3a1)或其任何抗原结合片段(此种抗体及其片段(包括VH、VL和scFv)的序列如本文所描述，参见例如序列表中的相应序列，例如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21)。在一些实施方案中，本文提供了抗体118BA 3a3(在本文中也被称为3a3或#3a3)或其任何抗原结合片段(此种抗体及其片段(包括VH、VL和scFv)的序列如本文所描述，参见例如序列表中的相应序列，例如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中，本文提供了抗体118BA#6(在本文中也被称为#6)或其任何抗原结合片段(此种抗体及其片段(包括VH、VL和scFv)的序列如本文所描述，参见例如序列表中的相应序列，例如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:28)。在一些实施方案中，本文提供了抗体118BA#5(在本文中也被称为#5)或其任何抗原结合片段(此种抗体及其片段(包括VH、VL和scFv)的序列如本文所描述，参见例如序列表中的相应序列，例如SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:28)。本文还提供了这些抗体中的任一者的6个CDR，包括以下任一者的6个CDR：本文所描述的#3WT、3A、3B、3C、3a2、3a1、3a3、#6和#5抗体。此类CDR可以在不同的可变区框架中使用并且具有与#3WT、3A、3B、3C、3a2、3a1、3a3、#6和#5中的任一者不同的恒定结构域(例如，具有本文所描述或本领域中已知的其它可变区框架和/或一个或多个恒定结构域)。在一些实施方案中，本文提供了具有与以下任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％氨基酸同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列的抗体：本文所描述的#3WT、3A、3B、3C、3a2、3a1、3a3、#6和#5抗体。在一些实施方案中，氨基酸取代是保守取代。在一些实施方案中，氨基酸取代不在CDR区中。
互补决定区
在一些实施方案中，根据Chothia系统定义抗体的CDR。Chothia系统是基于免疫球蛋白结构环区域的位置(参见例如Tramontano A等,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；Chothia C和Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917；美国专利号7,709,226；Al-Lazikani B等,(1997)JMol Biol 273:927-948；和Chothia C等,(1992)J Mol Biol 227:799-817)。术语“Chothia CDR”和类似术语是本领域中公认的并且是指如根据Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.,196:901-917的方法所确定的抗体CDR序列(还参见例如美国专利号7,709,226和Martin,A.,"Protein Sequence and Structure Analysis of AntibodyVariable Domains",Antibody Engineering,Kontermann和Diibel编,第31章,第422-439页,Springer-Verlag,Berlin(2001))。在一些实施方案中，使用Chothia系统确定本文所描述的抗体的CDR。
在一些实施方案中，根据AbM系统定义抗体的CDR。AbM系统是基于高变区，所述高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折中，并且其中使用Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(Oxford Molecular Group,Inc.)确定CDR。在一些实施方案中，使用AbM编号系统确定本文所描述的抗体的CDR。
在一些实施方案中，根据IMGT系统定义抗体的CDR(参见"国际ImMunoGeneTics information/>website imgt.org，创始人兼董事：Marie-PauleLefranc,Montpellier,France；参见例如Lefranc,M.-P.等,1999,Nucleic Acids Res.,27:209-212，和Lefranc,M.-P.,1999,The Immunologist,7:132-136，和Lefranc,M.-P.等,1999,Nucleic Acids Res.,27:209-212)。在一些实施方案中，使用IMGT系统确定本文所描述的抗体的CDR。
在一些实施方案中，根据Contact系统定义抗体的CDR。Contact定义是基于对可用的复杂晶体结构的分析(bioinf.org.uk/abs)(参见例如Martin A."Protein Sequenceand Structure Analysis of Antibody Variable Domains",Antibody Engineering,Kontermann和Diibel编,第31章,第422-439页,Springer-Verlag,Berlin(2001)，和MacCallum RM等,(1996)J Mol Biol 5:732-745)。在一些实施方案中，使用Contact系统确定本文所描述的抗体的CDR。
Kabat、Chothia、AbM、IMGT和/或Contact CDR位置可以视抗体而变化，并且可以根据本领域中已知的方法来确定。
在一些实施方案中，根据Martin(增强型Chothia)编号方案定义抗体的CDR，如http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中所描述，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，根据http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中的“How to identifythe CDRs by looking at asequence”部分(其通过引用整体并入本文)定义抗体的CDR。在一些实施方案中，CDR-L1大约起始于残基24，并且长度为10至17个残基；CDR-L2位于CDR-L1末端之后16个残基，并且长度为7个残基；CDR-L3在CDR-L2末端之后的33个残基处开始，并且长度为7至11个残基；CDR-H1大约起始于残基26，并且长度为10至12个残基；CDR-H2在Kabat编号所确定的CDR-H1末端之后的15个残基处开始，并且长度为16至19个残基；CDR-H3在CDR-H2末端之后的30或33个残基处开始，并且长度为3至25个残基。在一些实施方案中，使用http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中所描述的任何系统确定本文所描述的抗体的CDR。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗FLT3轻链可变区CDR(能够结合至FLT3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗FLT3重链可变区CDR(能够结合至FLT3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQID NO:38的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，CDR如由Kabat所定义。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗FLT3轻链可变区CDR(能够结合至FLT3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗FLT3重链可变区CDR(能够结合至FLT3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQID NO:73的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，CDR如http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中所描述的Martin(增强型Chothia)编号方案所定义，或如http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中的“How to identify theCDRs by looking at asequence”部分所确定。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID No:45或48中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在这些实施方案中的一些实施方案中，CDR-H3包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在这些实施方案中的一些实施方案中，CDR-H3包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，CDR如由Kabat所定义。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:46或47的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQID NO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID No:48-51中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，CDR如由Kabat所定义。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID No:48中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，CDR如由Kabat所定义。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID No:49中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，CDR如由Kabat所定义。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID No:50中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，CDR如由Kabat所定义。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID No:51中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，CDR如由Kabat所定义。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID No:45中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，CDR如由Kabat所定义。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:42、46或47中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID NO:83-87中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，CDR如由Kabat所定义。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:77-80中的任一者的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:42-47中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ IDNO:82的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID NO:83-87中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，CDR如http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中所描述的Martin(增强型Chothia)编号方案所定义，或如http://bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid中的“How to identify the CDRs by looking at a sequence”部分所确定。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含氨基酸序列QEISGY(SEQ ID NO:31)的VL CDR1、包含氨基酸序列AAS(SEQ ID NO:32)的CDR2和包含氨基酸序列LQYASYPLT(SEQ ID NO:37)的CDR3；和/或(ii)包含氨基酸序列GFSLSRSTMG(SEQ ID NO:38)的VH CDR1、包含氨基酸序列IKWNDSK(SEQID NO:39)的CDR2和包含氨基酸序列ARIVYYSTYVGYFDV(SEQ ID NO:36)的CDR3。
在一些实施方案中，本文提供了人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含氨基酸序列RASQEISGY LS(SEQ ID NO:71)的VL CDR1、包含氨基酸序列AASTLHS(SE Q ID NO:72)的CDR2和包含氨基酸序列LQYASYPLT(SEQ ID NO:37)的CDR3；和/或(ii)包含氨基酸序列GFSLSRSTMGVG(SEQ ID NO:73)的VH CDR1、包含氨基酸序列HIKWNDSKYYNPALKS(SEQ ID NO:74)的CDR2和包含氨基酸序列IVYYSTYVGYFDV(SEQ IDNO:75)的CDR3。
在一些实施方案中，本文提供了人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含氨基酸序列TGAVTTSN Y(SEQ ID NO:40)的VL CDR1、包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)的CDR2和包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的CDR3：ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)、ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)和ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)；和/或(ii)包含氨基酸序列GFTF NTYA(SEQ ID NO:43)的VH CDR1、包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)的CDR2和包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的CDR3：HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:83)、HGNFGTS YVSWFAY(SEQ ID NO:84)、HGHFGTSYVSWFAY(SEQID NO:85)、HGMFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:86)和HGQFGTSYVSWF AY(SEQ ID NO:87)。
在一些实施方案中，本文提供了人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:76)的氨基酸序列的VL2 CDR1，包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL2 CDR2：GTNKRSS(SEQ ID NO:77)、GTN KRVS(SEQID NO:78)和GTNKRSS(SEQ ID NO:79)和GTNKRA S(SEQ ID NO:80)，和包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL 2CDR3：ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)、ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)和ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)；和/或(ii)包含GFTF NTYAMN(SEQ ID NO:81)的氨基酸序列的VH2 CDR1、包含RIRS KYNNYATYYADSVKG(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列的VH2 CD R2和包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH2 CDR3：HGNF GNSYVSWFAY(SEQ ID NO:83)、HGNFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:84)、HGHFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:85)、HGMFGTSYVS WFAY(SEQID NO:86)和HGQFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:87)。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID NO:83中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID NO:48中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID NO:45中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID NO:50中的任一者的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)以下抗CD3轻链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、两者或三者：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)、包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)，和/或(ii)以下抗CD3重链可变区CDR(能够结合至CD3的CDR)中的一者、二者或三者：包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)、包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段包含全部6个这些CDR。在一些实施方案中，双特异性抗FLT3/CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含本文中单独和组合描述的任何VL和VH的CDR。
额外CDR公开内容
在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗FLT3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗FLT3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ IDNO:72的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)。
在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗FLT3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗FLT3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ IDNO:74的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗FLT3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。
在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有选自包括以下的组的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)：SEQ ID NO:77-80。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ IDNO:80的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)。
在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有选自包括以下的组的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)：SEQ ID NO:83-87。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ IDNO:85的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。
在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的人源化抗FLT3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的人源化抗FLT3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的人源化抗FLT3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗FLT3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-L3)。
在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的人源化抗FLT3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的人源化抗FLT3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的人源化抗FLT3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗FLT3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的人源化抗FLT3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。
在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的人源化抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-L1)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的人源化抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的人源化抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-L2)。
在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的人源化抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的互补决定区1(CDR-H1)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的人源化抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的互补决定区2(CDR-H2)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的人源化抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ IDNO:50的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的互补决定区3(CDR-H3)。
在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗FLT3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:31、32和37的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在某些实施方案中，抗FLT3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗FLT3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:38、39和36的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在某些实施方案中，抗FLT3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了人源化双特异性抗体或其片段，所述抗体或其片段包含：包含氨基酸序列QEISGY(SEQ ID NO:31)的VL CDR1、包含氨基酸序列AAS(SEQ IDNO:32)的CDR2和包含氨基酸序列LQYASYPLT(SEQ ID NO:37)的CDR3；和包含氨基酸序列GFSLSRSTMG(SEQ ID NO:38)的VH CDR1、包含氨基酸序列IKWNDSK(SEQ ID NO:39)的CDR2和包含氨基酸序列ARIVYYSTYVGYFDV(SEQ ID NO:36)的CDR3。
在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗FLT3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:71、72和37的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在某些实施方案中，抗FLT3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗FLT3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:73、74和75的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在某些实施方案中，抗FLT3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了人源化双特异性抗体或其片段，所述抗体或其片段包含：包含氨基酸序列RASQEISGYLS(SEQ ID NO:71)的VL CDR1、包含氨基酸序列AASTLHS(SEQ ID NO:72)的CDR2和包含氨基酸序列LQYASYPLT(SEQ ID NO:37)的CDR3；和包含氨基酸序列GFSLSRSTMGVG(SEQ ID NO:73)的VH CDR1、包含氨基酸序列HIKWNDSKYYNPALKS(SEQID NO:74)的CDR2和包含氨基酸序列IVYYSTYVGYFDV(SEQ ID NO:75)的CDR3。
在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:40、41和42的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQID NO:40、41和46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:40、41和47的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在某些实施方案中，抗CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:43、44和45的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQID NO:43、44和48的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:43、44和49的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:43、44和50的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:43、44和51的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在某些实施方案中，抗CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了人源化双特异性抗体或其片段，所述抗体或其片段包含：包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)的VL CDR1、包含氨基酸序列GTN(SEQID NO:41)的CDR2和包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的CDR3：ALWYSNLWV(SEQ IDNO:42)、ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)和ALWYSNHW V(SEQ ID NO:47)；和包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)的VH CDR1、包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)的CDR2和包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的CDR3：HGNF GNSYVSWFAY(SEQ ID NO:83)、HGNFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:84)、HGHFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:85)、HGMFGTSYVS WFAY(SEQID NO:86)和HGQFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:87)。
在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:76、77和42的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQID NO:76、78和42的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:76、79和42的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:76、80和42的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:76、77和46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:76、78和46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:76、79和46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:76、80和46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ IDNO:76、77和47的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:76、78和47的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:76、79和47的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，本文提供了具有轻链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:76、80和47的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在某些实施方案中，抗CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:43、44和45的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQID NO:43、44和48的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:43、44和49的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:43、44和50的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:43、44和51的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在某些实施方案中，抗CD3抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:81、82和45的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQID NO:81、82和48的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:81、82和49的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:81、82和50的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，本文提供了具有重链可变区的抗CD3抗体或其片段，所述重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:81、82和51的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在某些实施方案中，抗CD3抗体或片段是人源化的。
在某些实施方案中，本文所涵盖的任何抗体或片段可以包含任何上述CDR。在一些实施方案中，任何此类抗体或片段可以是人源化抗体或片段。在一些实施方案中，任何此类抗体或片段可以是抗FLT3/CD3双特异性抗体或片段。在一些实施方案中，任何此类抗体或片段可以是人源化和抗FLT3/CD3双特异性抗体或片段。
VL和VH
在一些实施方案中，双特异性人源化抗体或抗原结合片段结合至人类FLT3和人类CD3，其中所述抗体或片段包含：
(i)第一轻链可变区(VL1)；和
(ii)第一重链可变区(VH1)；其中所述VL1和所述VH1结合至人类FLT3；并且还包含结合至人类CD3的第二VL(VL2)和第二VH(VH2)。
在一些实施方案中，本文所涵盖的人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段包含本文所描述的任何VL。
在一些实施方案中，本文所涵盖的人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段包含本文所描述的任何VH。
在一些实施方案中，本文所涵盖的人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段包含选自SEQ ID NO:1和9的抗FLT3 VL。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)VL1，所述VL1包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。
在一些实施方案中，抗FLT3轻链可变区(VL)包含以下突变中的一者或多者：SEQID NO:1中的L36Y、G41E、I44P、R46S、Q55H、R66G、S69T、Y71F、F95L、T116A(例如，如SEQ IDNO:9中)。
在一些实施方案中，本文所涵盖的人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段包含选自SEQ ID NO:2和10的抗FLT3 VH。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)VH1，所述VH1包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。
在某些实施方案中，本文提供了人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段，所述抗体和片段包含：(i)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的第一重链可变区(VH1)，和/或(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第一轻链可变区(VL1)。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)VH1，所述VH1包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)VL1，所述VL1包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)VH1，所述VH1包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)，和/或(ii)VL1，所述VL1包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段(例如，scFv)，所述抗体或其片段包含含有本段中指定的序列的VH1和VL1两者。在一些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段。
在一些实施方案中，抗FLT3重链可变区(VH)包含以下突变中的一者或多者：SEQID NO:2中的T157R、L180K、R186Y、S190A、T198S、K204N、T244L(例如，如SEQ ID NO:10中)。
在一些实施方案中，本文所涵盖的人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段包含选自SEQ ID NO:4、6、14、16、24和29的抗CD3 VL。在一些实施方案中，VL包含与选自SEQ IDNO:4、6、14、16、24和29的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:14的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:16的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:24的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:29的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD3轻链可变区(VL)包含以下突变中的一者或多者(任何组合或全部中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16者)：SEQ ID NO:4中的L10F、S11T、T41K、G48T、R56K、S57H、S58P、G59W、V60T、D62A、D71G、I76L、T77S、A81P、D82E、S85A和D86E(例如，如SEQ ID NO:6中)。
在一些实施方案中，轻链可变区(VL)包含以下一种或多种突变：相对于SEQ IDNO:4的S57V、Y94F和L97H(例如，如SEQ ID NO:14中)。
在一些实施方案中，轻链可变区(VL)包含以下一种或多种突变：相对于SEQ IDNO:4的Y94F和L97H(例如，如SEQ ID NO:16中)。
在一些实施方案中，轻链可变区(VL)包含以下一种或多种突变：相对于SEQ IDNO:4的S67A和L97H(例如，如SEQ ID NO:29中)。
在一些实施方案中，本文所涵盖的人源化双特异性抗FLT3/CD3抗体和片段包含选自SEQ ID NO:5、7、12、18、20和22的抗CD3 VH。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:5的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:12的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:18的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:20的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含与SEQ ID NO:22的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD3重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:5中的突变N79S(例如，如SEQ ID NO:7中)。
在一些实施方案中，抗CD3重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:5中的突变N106T(例如，如SEQ ID NO:12中)。
在一些实施方案中，抗CD3重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:5中的N103H和/或N106T突变(如SEQ ID NO:18中)。
在一些实施方案中，抗CD3重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:5中的N103M和/或N106T突变(如SEQ ID NO:20中)。
在一些实施方案中，抗CD3重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:5中的N103Q和/或N106T突变(例如，如SEQ ID NO:22中)。
在一些实施方案中，VL2包含选自由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2包含选自由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段包含(i)包含SEQID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的第一轻链(VL1)可变区；和/或(ii)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的第一轻链可变区(VH1)；其中所述VL1和所述VH1结合至人类CD3；并且还包含结合至人类FLT3的VL2和VH2。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段包含(i)包含SEQID NO:4的氨基酸序列的第一轻链可变区(VL1)；和/或(ii)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第一轻链可变区(VH1)；其中所述VL1和所述VH1结合至人类CD3；并且还包含结合至人类FLT3的VL2和VH2。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段包含(i)包含SEQID NO:6的氨基酸序列的第一轻链可变区(VL1)；和/或(ii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的第一轻链可变区(VH1)；其中所述VL1和所述VH1结合至人类CD3；并且还包含结合至人类FLT3的VL2和VH2。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或片段包含可变区序列，其中所述可变区包含以下顺序的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60的接头、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:26的接头和SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，双特异性人源化抗体包含SEQ ID NO 53的氨基酸序列。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或片段包含可变区序列，其中所述可变区包含以下顺序的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60的接头、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:26的接头和SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，双特异性人源化抗体包含SEQ ID NO 54的氨基酸序列。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或片段包含可变区序列，其中所述可变区包含以下顺序的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60的接头、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:26的接头和SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，双特异性人源化抗体包含SEQ ID NO 55的氨基酸序列。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或片段包含可变区序列，其中所述可变区包含以下顺序的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60的接头、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:26的接头和SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，双特异性人源化抗体包含SEQ ID NO 56的氨基酸序列。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或片段包含可变区序列，其中所述可变区包含以下顺序的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60的接头、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:26的接头和SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，双特异性人源化抗体包含SEQ ID NO 57的氨基酸序列。
LC和HC
在一些实施方案中，本文所描述的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体包含重链(HC)和轻链(LC)。在一些实施方案中，本文所描述的双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或片段包含重链(HC)。在一些实施方案中，本文所描述的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体或片段包含轻链(LC)。
在一些实施方案中，LC包含恒定结构域(诸如本领域中已知或本文所描述的任何恒定结构域)。在一些实施方案中，本文提供了包含轻链恒定结构域的抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述轻链恒定结构域包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链恒定结构域包含与SEQ ID NO:58具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HC包含恒定结构域(诸如本领域中已知或本文所描述的任何恒定结构域)。在一些实施方案中，HC包含Fc区(诸如本领域中已知或本文所描述的任何Fc区)。在一些实施方案中，Fc区是IgG(例如，人类IgG)。在一些实施方案中，Fc区是IgG1(例如人类IgG1)、IgG2(例如，人类IgG2)、IgG3(例如，人类IgG3)或IgG4(例如，人类IgG4)。在一些实施方案中，Fc区是IgG1(例如，人类IgG1)。在一些实施方案中，Fc区包含与人类IgG1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供了包含重链恒定结构域的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述重链恒定结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链恒定结构域包含与SEQ ID NO:59具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性(例如，至少95％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含重链恒定结构域的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述重链恒定结构域包含以下氨基酸突变中的一者或多者(例如，2者或3者)：SEQ ID NO:59中的I136A、S137A和H318A(例如，如SEQ ID NO:27中)。在一些实施方案中，本文提供了包含重链恒定结构域的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述重链恒定结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供了包含轻链的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述轻链包含选自SEQ ID NO:8、15、17、25和30中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含轻链的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述轻链包含SEQID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含轻链的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述轻链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含轻链的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述轻链包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含轻链的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述轻链包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含轻链的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述轻链包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些实施方案中，轻链包含本文所描述的任何可变轻链(VL)，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:4的可变轻链，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:14的可变轻链，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:16的可变轻链，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:24的可变轻链，并且轻链恒定结构域包含SEQ IDNO:58。在一些实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，轻链包含SEQ IDNO:29的可变轻链，并且轻链恒定结构域包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:30。
在一些实施方案中，本文提供了包含重链的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述重链包含选自SEQ ID NO:53、54、55、56或57中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含重链的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述重链包含SEQID NO:53的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含重链的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述重链包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含重链的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其片段，所述重链包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含重链的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述重链包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含重链的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述重链包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重链包含本文所描述的任何VH，并且重链恒定结构域包含SEQID NO:59。在一些实施方案中，重链包含本文所描述的任何VH，并且重链恒定结构域包含SEQ ID NO:27。
在一些实施方案中，本文所涵盖的双特异性抗体或片段包含重链，所述重链包含以下顺序的以下结构域：FLT3 VL-接头-FLT3 VH-接头-CD3 VH-HC恒定结构域。在一些实施方案中，重链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:9-接头--SEQ ID NO:10-接头--SEQ ID NO:5--SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，重链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:9-接头--SEQ ID NO:10-接头--SEQ ID NO:12--SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，重链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:9-接头--SEQ ID NO:10-接头--SEQ ID NO:18--SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，重链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:9-接头--SEQ ID NO:10-接头--SEQ ID NO:20--SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，重链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:9-接头--SEQ ID NO:10-接头--SEQ ID NO:22--SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，重链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:9-接头--SEQ ID NO:10-接头--SEQ ID NO:5--SEQ ID NO:27。接头可以是本领域中已知或本文所描述的任何接头。在一些实施方案中，接头具有SEQ ID NO:60。在一些实施方案中，接头具有SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，第一接头(按顺序)具有SEQ ID NO:60并且第二接头具有SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，重链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:9--SEQ ID NO:60的接头--SEQ ID NO:10--SEQ ID NO:26的接头--SEQID NO:5--SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，上文所指示的任何结构域可以被本文所描述的相同结构域的另一种型式(例如，突变型式)置换。
在一些实施方案中，本文所涵盖的双特异性抗体或片段包含轻链，所述轻链包含以下顺序的以下结构域：CD3 VL-LC恒定结构域。在一些实施方案中，轻链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:4--SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，轻链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:14--SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，轻链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:16--SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，轻链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:24--SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，轻链包含以下顺序的以下氨基酸序列：SEQ ID NO:29--SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，上文所指示的任何结构域可以被本文所描述的相同结构域的另一种型式(例如，突变型式)置换。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗体包含重链，其中所述重链包含以下顺序的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60的接头、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:26的接头、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:59。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC，和/或(ii)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有本段中指定的序列的HC和LC两者。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗体包含重链，其中所述重链包含以下顺序的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60的接头、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:26的接头、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC，和/或(ii)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有本段中指定的序列的HC和LC两者。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC，和/或(ii)包含氨基酸序列的LC SEQ ID NO:15的序列。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ IDNO:13的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ IDNO:15的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有本段中指定的序列的HC和LC两者。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC，和/或(ii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有本段中指定的序列的HC和LC两者。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗体包含重链，其中所述重链包含以下顺序的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60的接头、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:26的接头、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:59。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HC，和/或(ii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有本段中指定的序列的HC和LC两者。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗体包含重链，其中所述重链包含以下顺序的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60的接头、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:26的接头、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:59。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HC，和/或(ii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有本段中指定的序列的HC和LC两者。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗体包含重链，其中所述重链包含以下顺序的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60的接头、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:26的接头、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:59。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HC，和/或(ii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有本段中指定的序列的HC和LC两者。
在一些实施方案中，双特异性人源化抗体包含重链，其中所述重链包含以下顺序的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:60的接头、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:26的接头、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:27。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HC，和/或(ii)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LC。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有本段中指定的序列的HC和LC两者。
在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HC，和/或(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的LC。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)HC，所述HC包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)，和/或(ii)LC，所述LC包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，本文提供了双特异性人源化抗FLT3/抗CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有本段中指定的序列的HC和LC两者。
抗体的抗原结合片段
在一些实施方案中，本文提供了本文所描述的人源化抗FLT3和抗CD3抗体的片段。在某些实施方案中，本文提供了包含本文所描述的任何VH和/或VL，包括本文所描述的任何VH和VL对(包括介导与FLT3的结合的那些和介导与CD3的结合的那些)的scFv片段。制备单链可变片段抗体的方法是本领域中已知的。举例来说，抗体的scFv可以通过将重链可变区(VH)与轻链可变区经由短肽接头融合来制备。适合的短肽接头是本领域中已知的，并且示例性接头描述于本文中。
在一些实施方案中，本文提供了本文所描述的抗体的片段，所述片段包含介导与FLT3的结合的任何VH和/或VL(包括本文所描述任何VH和VL对)和介导与CD3的结合的VH。在一些实施方案中，本文提供了本文所描述的抗体的片段，所述片段按以下顺序包含：介导与FLT3的结合的VH和VL(包括本文所描述的任何VH和VL对，由本文所描述或本领域中已知的任何接头结合)、接头(诸如本文所描述或本领域中已知的任何接头)和介导与CD3的结合的VH(诸如本文所描述的任何抗CD3 VH)。
在一些实施方案中，本文提供了抗FLT3 scFv片段，所述片段包含与选自SEQ IDNO:3和52中的任一者的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了抗FLT3 scFv片段，所述片段包含与选自SEQ IDNO:3和52中的任一者的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。
在某些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的抗FLT3 scFv片段。在某些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的抗FLT3 scFv片段。
在一些实施方案中，本文提供了抗FLT3/CD3片段，所述片段包含与选自SEQ IDNO:53、54、55、56和57中的任一者的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失在CDR之外的区域中(即，在框架区中)发生。在某些实施方案中，本文提供了抗FLT3 scFv片段，所述片段包含与选自SEQ ID NO:53、54、55、56和57中的任一者的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中在框架区中具有至少95％(或至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性并且在CDR区中具有至少97％同一性(或至少98％、99％或100％同一性)。
在某些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的抗FLT3/CD3片段。在某些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的抗FLT3/CD3片段。在某些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的抗FLT3/CD3片段。在某些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的抗FLT3/CD3片段。在某些实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的抗FLT3/CD3片段。
可用于连接抗体片段(例如，scFv中)的接头
在一些实施方案中，本公开提供了包含一个或多个连接VH和VL的接头的抗FLT3和/或抗CD3单链可变片段(例如，scFv)。“接头”是共价连接两个或更多个多肽或核酸以使它们彼此连接的官能团。接头可以是本领域中已知的任何接头。在一些实施方案中，接头包含亲水性氨基酸。在一些实施方案中，接头包含甘氨酸和丝氨酸。
在一些实施方案中，接头具有式(Gly3-4-Ser)1-4。在一些实施方案中，接头是Gly4Ser接头，重复1至4次。在一些实施方案中，接头是Gly3Ser接头，重复1至4次。在一些实施方案中，接头包含Gly4Ser和Gly3Ser，各自重复1至4次。
在某些实施方案中，接头的长度为4至25个氨基酸。在某些实施方案中，接头的长度为4至21个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为5个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为10个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为15个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为19个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为20个氨基酸。
在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID 61的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，结合至人类FLT3和人类CD3的双特异性抗FLT3/CD3抗体或其抗原结合片段包含：
(i)第一轻链可变区(VL1)；和
(ii)第一重链可变区(VH1)，其中所述VL1和所述VH1结合至人类FLT3；并且还包含结合至人类CD3的第二VL(VL2)和第二VH(VH2)。在一些实施方案中，VL1通过第一接头连接至VH1，并且其中VH1通过第二接头连接至VH2。在一些实施方案中，VL1的C末端通过第一接头连接至VH1的N末端。在一些实施方案中，VH1的C末端通过第二接头连接至VH2的N末端。在一些实施方案中，第一接头具有式(Gly4-Ser)4。在一些实施方案中，第二接头具有式(Gly4-Ser)3。在一些实施方案中，第一接头具有SEQ ID NO:60或61，并且/或者第二接头具有SEQID NO:26。
在一些实施方案中，结合至人类FLT3和人类CD3的双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其抗原结合片段包含：
(i)第一轻链可变区(VL1)；和
(ii)第一重链可变区(VH1)，其中所述VL1和所述VH1结合至人类FLT3并且通过包含式(Gly4-Ser)4的第一接头连接；并且还包含结合至人类CD3并且通过包含式(Gly4-Ser)3的第二接头连接的第二VL(VL2)和第二VH(VH2)。
额外抗FLT3/抗CD3双特异性抗体、片段和特征
在一些实施方案中，本文所描述的双特异性抗FLT3/抗CD3抗体或片段是纯化的抗体。在这些实施方案中的一些实施方案中，抗体或片段是人源化的。
在一些实施方案中，本文描述了抗FLT3/抗CD3双特异性抗体，其中所述抗体是包含本文所描述的任何VH和VL区的免疫球蛋白。在一些实施方案中，本文所描述的双特异性抗体包含重链(HC)。在一些实施方案中，本文所描述的抗体的重链(HC)包含Fc区。可以使用的免疫球蛋白分子属于任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgY、IgA)。可以使用的免疫球蛋白分子属于任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。可以使用的免疫球蛋白分子属于任何亚类。在一些实施方案中，HC的免疫球蛋白(即，Fc区)是IgG。在一些实施方案中，HC的IgG是人类IgG1。在一些实施方案中，HC的IgG是人类IgG2。在一些实施方案中，HC的IgG是人类IgG3。在一些实施方案中，HC的IgG是人类IgG4。
在一些实施方案中，本文描述了单结构域抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或片段，所述抗体或片段具有结合至FLT3的仅重链或仅轻链(包含本文所描述的任何VH或VL)。在一些实施方案中，本文描述了单结构域抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或片段，所述抗体或片段具有结合FLT3的仅重链(包含本文所描述的任何VH)。
在一些实施方案中，本文描述了单结构域抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或片段，所述抗体或片段具有结合CD3的仅重链或仅轻链(包含本文所描述的任何VH或VL)。在一些实施方案中，本文描述了单结构域抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或片段，所述抗体或片段具有结合CD3的仅重链(包含本文所描述的任何VH)。
在一些实施方案中，本文描述了抗FLT3/抗CD3双特异性抗体的抗原结合片段，所述抗原结合片段包括但不限于Fv片段、Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段或二硫键连接的Fv(sdFv)。在一些实施方案中，抗FLT3/抗CD3双特异性抗体的抗原结合片段是Fv片段。在一些实施方案中，抗FLT3/抗CD3双特异性抗体的抗原结合片段是Fab片段。在一些实施方案中，抗FLT3/抗CD3双特异性抗体的抗原结合片段是F(ab')片段。在一些实施方案中，抗FLT3/抗CD3双特异性抗体的抗原结合片段是F(ab')2片段。在一些实施方案中，抗FLT3/抗CD3双特异性抗体的抗原结合片段是二硫键连接的Fv(sdFv)。
在一些实施方案中，本文描述了嵌合抗FLT3/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述嵌合抗体具有本文所描述的任何CDR、鼠类可变区和另一个物种(例如，人类)的恒定区。
在一些实施方案中，本文描述了抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段，所述抗体及其片段对FLT3蛋白的结合亲和力的EC50为约0.1nM至100nM、0.5nM至50nM或1nM至10nM。在一些实施方案中，本文描述了抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段，所述抗体及其片段对FLT3蛋白的结合亲和力的EC50小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1nM。在一些实施方案中，本文描述了抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段，所述抗体及其片段对FLT3蛋白的结合亲和力的EC50小于15nM、小于10nM、小于5nM或小于2.5nM。
在一些实施方案中，本文描述了抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段，所述抗体及其片段对CD3蛋白的结合亲和力的EC50为约0.1nM至100nM、0.5nM至50nM或1nM至10nM。在一些实施方案中，本文描述了抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段，所述抗体及其片段对CD3蛋白的结合亲和力的EC50小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1nM。在一些实施方案中，本文描述了抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段，所述抗体及其片段对CD3蛋白的结合亲和力的EC50小于15nM、小于10nM、小于5nM或小于2.5nM。
在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段不与FLT3配体竞争结合至FLT3。
在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在FLT3和CD3两者上都是二价的。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段二价地结合至FLT3和/或CD3。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段与6个与FLT3结合的CDR(3个VL和3个VH)和/或6个与CD3的结合的CDR(3个VL和3个VH)结合，其中CDR可以是本文所描述的任何CDR。
在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期为约1至约14天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期为约2天至约12天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期为约3天至约10天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期为约4天至约8天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期为约4天至约7天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期为约5天至约7天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期为约5天至约6天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期大于1天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期大于2天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期大于3天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期大于4天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期大于5天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期大于6天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期小于14天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期小于12天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期小于10天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期大于8天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期大于7天。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期为约1周。在一些实施方案中，本文所描述的抗FLT3/抗CD3双特异性抗体及其片段在人体内的半衰期为至多2周。
核酸、载体和细胞
在一些方面，本公开提供了编码本文所描述的任何人源化双特异性抗体及其抗原结合片段的核酸。在一些方面，本公开提供了包含编码本文所描述的任何人源化双特异性抗体及其抗原结合片段的核酸的载体。还提供了表达此类核酸用于产生本文所描述的任何人源化双特异性抗体及其抗原结合片段的细胞，以及制备此类抗体和片段的方法。
抗体的制备
本文所描述的人源化双特异性抗体及其抗原结合片段可以通过本领域中已知和/或本文所描述的任何方法来制备。
制备单克隆抗体的方法是本领域中已知的，例如，使用杂交瘤技术。参见例如Harlow E和Lane D,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,第2版1988)；Hammerling GJ等,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563(Elsevier,NY,1981)，或Kohler G和Milstein C,1975,Nature 256:495；Goding JW(编),Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986)。在使用杂交瘤技术时，可以用靶蛋白(例如，FLT3)对小鼠或另一种适当的宿主动物进行免疫，以引发淋巴细胞产生将特异性结合至靶蛋白的抗体，然后将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。然后使杂交瘤细胞在培养基中生长并且测定抗体的产生。通过这种方法产生的抗体的结合特异性可以通过本领域中已知的方法来确定，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀或放射免疫测定(RIA)。可以进一步纯化单克隆抗体。
还可以使用重组和噬菌体展示技术以及使用人源化小鼠来制备单克隆抗体。参见例如Brinkman U等,1995,J.Immunol.Methods182:41-50；Ames RS等,1995,JImmunol.Methods 184:177-186；Laffleur等,2012,Methods Mol.Biol.901:149-59；Persic L.等,1997,Gene 187:9-18。
制备嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如Morrison SL,1985,Science229:1202-7；Gillies SD等,1989,J.Immunol.Methods125:191-202；Oi VT和Morrison SL,1986,BioTechniques 4:214-221。当制备嵌合抗体时，使一个物种(例如鼠类)的可变区与另一个物种(例如，人类)的恒定区连接。
制备人源化抗体的方法是本领域中已知的，包括但不限于通过CDR移植。参见例如Padlan EA(1991)Mol Immunol 28(4/5):489-498；Studnicka GM等,(1994)ProtEngineering 7(6):805-814；和Roguska MA等,(1994)PNAS 91:969-973；Tan P等,(2002)JImmunol 169:1119-25；Caldas C等,(2000)Protein Eng.13(5):353-60；Morea V等,(2000),Methods 20(3):267-79；Baca M等,(1997)J Biol Chem 272(16):10678-84；Roguska MA等,(1996)Protein Eng 9(10):895 904；Couto JR等,(1995)Cancer Res.55(23增刊):5973s-5977s；Couto JR等,(1995)Cancer Res 55(8):1717-22；Sandhu JS(1994)Gene 150(2):409-10；Pedersen JT等,(1994)J Mol Biol 235(3):959-73。
制备人类抗体的方法是本领域中已知的并且包括使用来源于人类免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见例如国际公布号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。
制备抗体片段(包括单链Fv(scFv))的方法也是本领域中已知的。参见例如Ahmad等,2012,Clinical and Developmental Immunology,doi:10.1155/2012/980250；Wang等,2006,Anal.Chem.78,997-1004；Pansri等,2009,BMC Biotechnology 9:6。举例来说，可以通过将重链和轻链可变区经由短多肽接头融合(使用重组表达技术)来构建scFv，并且可以通过本领域中已知的方法选择具有所需抗原结合特性的scFv抗体。此外，可以分别使用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶通过免疫球蛋白分子的蛋白水解裂解来产生Fab和F(ab')2片段。
制备单结构域抗体(例如，无轻链)的方法也是本领域中已知的。参见例如Riechmann L和Muyldermans S,1999,J Immunol.231:25-38；Nuttall SD等,2000,CurrPharm Biotechnol.1(3):253-263；Muyldermans S,2001,J Biotecnol 74(4):277-302。
制备双特异性抗体的方法是本领域中众所周知的。参见例如Konterman,2012,MAbs 4:182-197；Gramer等,2013,MAbs 5:962-973。
制备小鼠抗FLT3抗体的方法描述于美国专利公布号20190137464和美国专利公布号20190389955中，所述专利各自整体并入本文并具体描述小鼠抗FLT3抗体的制备。
抗体的亲和力成熟、优化和诱变的方法是本领域中众所周知的。
重组产生抗体的方法也是本领域中已知的。在一些实施方案中，为了重组产生抗FLT3/抗CD3抗体(或其抗原结合片段)，分离编码所述抗体(或其抗原结合片段)的核酸并且将其插入一个或多个用于在宿主细胞中表达的载体中。在一些实施方案中，提供了一种制备抗FLT3/抗CD3抗体的方法，其中所述方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体，以及任选地进一步纯化所述抗体。在一些实施方案中，提供了一种制备抗FLT3/抗CD3抗体的抗原结合片段的方法，其中所述方法包括在适合于表达片段的条件下培养包含编码所述片段的核酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收片段，以及任选地进一步纯化所述片段。
药物组合物
本文提供了包含本文所描述的任何双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其片段和药学上可接受的载体的药物组合物。适当药学上可接受的载体，包括但不限于赋形剂和稳定剂，是本领域中已知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)MackPublishing Co.,Easton,PA)。
在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括但不限于等渗剂、缓冲剂、悬浮剂、分散剂、乳化剂、润湿剂、掩蔽剂、螯合剂、pH缓冲剂、溶解增强剂、抗氧化剂、麻醉剂和/或抗微生物剂。在一些实施方案中，载体选自但不限于以下一者或多者：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等、淀粉、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、丙烯、硅胶、硬脂酸钠和右旋糖以及它们的组合。在一些实施方案中，药学上可接受的载体还包含辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，所述辅助物质增强结合蛋白的保存期或有效性。
在一些实施方案中，当肠道外施用时，药学上可接受的载体包括但不限于生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、含有剂(诸如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇或其它剂)的溶液。
在一些实施方案中，药物组合物被配制为在施用后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。用于在施用后提供活性成分的快速、持续或延迟释放的制剂是本领域中已知的(Mishra,M.K.(2016).Handbook of encapsulation and controlled release.BocaRaton,CRC Press,Taylor&Francis Group,CRC Press is an imprint of the Taylor&Francis Group,an Informa business，通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，本文所提供的药物组合物包含药学上可接受的载体中的本文所描述的任何双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其片段和一种或多种其它治疗剂(例如，抗癌剂)。
在一些实施方案中，药物组合物被配制用于向受试者施用的任何途径。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于注射并制备成液体溶液、悬浮液、乳液或适合在注射前制成溶液或悬浮液的固体形式。
在一些实施方案中，本文所描述的双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其片段以治疗有效量存在于药物组合物中。通过本领域中已知的临床技术确定治疗有效量。
治疗方法
在一些实施方案中，本文所描述的方法包括向受试者施用本文所描述的任何双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段结合至细胞(例如靶细胞，诸如HSC、HPC、树突状细胞或癌细胞)的FLT3表位。在一些实施方案中，本文所描述的方法包括向受试者施用本文所描述的任何双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段结合至癌细胞(例如，AML细胞)的FLT3表位。在一些实施方案中，本文所描述的方法包括向受试者施用本文所描述的任何双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其片段，所述抗体或其片段结合至T细胞的CD3表位。在一些实施方案中，本文所描述的方法包括向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段，所述抗体或其片段结合至靶细胞(诸如本文所描述的靶细胞)的CD3表位(例如，在诸如T细胞的免疫细胞上)和FLT3表位。
癌症治疗
在一些实施方案中，本公开提供了治疗癌症的方法，所述方法包括施用本文所描述的任何双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其片段或包含此种抗体/片段的药物组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗对一种或多种其它癌症疗法(例如，疫苗、化学疗法、放射疗法、小分子疗法或免疫疗法(诸如用另一种抗体治疗))具有抗性的癌症的方法。在一些实施方案中，癌症对疫苗疗法具有抗性。在一些实施方案中，癌症对化学疗法具有抗性。在一些实施方案中，癌症对放射疗法具有抗性。在一些实施方案中，癌症对小分子疗法具有抗性。在一些实施方案中，癌症对免疫疗法具有抗性。
本文所描述的方法适合于治疗预期、已知或确定在其细胞表面上表达FLT3的癌症。
在一些实施方案中，根据本文所描述的方法施用本文所描述的任何双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其片段或其药物组合物当与一种或多种本文所描述的额外疗法组合时达成或引起以下一者或多者：(i)癌细胞频率或数目减少，(ii)癌症生长减少或癌细胞数目增加，(iii)癌细胞生长的进展受抑制，(iv)癌症消退，(v)癌症复发受抑制，(vi)癌症根除，(vii)癌症的一种或多种症状的严重性或持续时间减少或改善，(viii)与癌症相关的一种或多种症状的发展或发作受抑制，(ix)另一种抗癌疗法的治疗作用增强或改善，(x)受试者的预期寿命或存活期增加，(xi)受试者的住院治疗(例如住院时长)减少，(xii)受试者的生活质量改善，(xiii)死亡率降低，(xiv)受试者的无复发存活期或缓解时长增加。在一些实施方案中，进行施用以达成或引起肿瘤负荷减少。
在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其片段当单独使用或与另一种疗法组合使用时有效治疗受试者的癌症(例如，降低肿瘤负荷、癌细胞频率或数目，减少癌细胞生长或增殖，增加预期寿命或存活期，根除癌症，或改善癌症的一种或多种症状)。
在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段或本文所描述的药物组合物有效降低癌细胞的细胞频率或数目，或消除癌细胞。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段或本文所描述的药物组合物有效地使癌细胞的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的癌细胞水平)降低至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段或本文所描述的药物组合物有效地使癌细胞的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的癌细胞水平)降低至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段或本文所描述的药物组合物有效地使癌细胞的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的癌细胞水平)降低至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段或本文所描述的药物组合物有效地使癌细胞的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的癌细胞水平)降低至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。
在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效增加受试者的存活期。在一些实施方案中，相对于未治疗或用安慰剂治疗的受试者，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效增加受试者的中位存活期。在一些实施方案中，相对于用标准护理疗法治疗的受试者，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效增加受试者的中位存活期。
使用本文所描述的方法可以减少数目或消除的癌细胞的实例包括但不限于急性髓系白血病(AML)的母细胞、急性淋巴细胞白血病(ALL)的淋巴母细胞或白血病母细胞、慢性髓系白血病的髓母细胞(CML)、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)的母细胞。
根据一些实施方案，双特异性人源化抗体有效消除造血干细胞(HSC)、早期造血祖细胞(HP)和癌细胞中的一者或多者。在一些实施方案中，HPC、HP和癌细胞中的一者或多者表达FLT3。在一些实施方案中，有需要的受试者是有资格、将要接受或正在接受骨髓(BM)/HSC/PC移植的患者。癌细胞的实例包括但不限于急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓系白血病(BC-CML)的母细胞危象期和慢性淋巴细胞白血病(CLL)的母细胞。根据一些实施方案，双特异性抗体有效调理经历骨髓(BM)/造血干细胞(HSC)移植的患者。根据一些实施方案，HSC/HP移植用于治疗血液恶性肿瘤或过度增殖性病症，例如，急性髓系白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤、非恶性遗传性和获得性骨髓病症(例如，镰状细胞性贫血、重型β地中海贫血、难治性戴蒙德-布莱克凡贫血、骨髓增生异常综合征、特发性严重再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、纯红细胞再生障碍、范可尼贫血、无巨核细胞增多症或先天性血小板减少症)、多发性骨髓瘤或严重联合免疫缺陷(SCID)。
造血细胞移植
在一些实施方案中，本公开提供了准备或调理有需要的受试者用于造血细胞移植的方法。在一些实施方案中，有需要的受试者是有资格、将要接受或正在接受骨髓(BM)造血干细胞和/或造血祖细胞移植的患者。在一些实施方案中，需要造血细胞移植的受试者患有癌症(诸如本文所描述的任何癌症)。
在一些实施方案中，本公开提供了准备或调理有需要的受试者用于造血细胞移植的方法，其中向所述受试者施用本文所描述的任何双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其片段或包含此种抗体/片段的药物组合物。在一些实施方案中，准备或调理受试者的方法包括向受试者施用本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段，所述抗体或片段结合至造血干细胞上的FLT3表位。在一些实施方案中，准备或调理受试者的方法包括向受试者施用本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段，所述抗体或片段结合至造血祖细胞上的FLT3表位。在一些实施方案中，准备或调理受试者的方法包括向受试者施用本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段，所述抗体或片段结合至树突状细胞上的FLT3表位。在一些实施方案中，准备或调理受试者的方法包括向受试者施用本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段，所述抗体或片段结合至骨髓细胞上的FLT3表位。在一些实施方案中，准备或调理受试者的方法包括向受试者施用本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段，所述抗体或片段结合至淋巴细胞上的FLT3表位。
在一些实施方案中，本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效地显著降低细胞频率或数目，或消除造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)(例如，早期造血祖细胞)。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效地使HSC和/或HPC(例如，早期HPC)的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效地使HSC和/或HPC(例如，早期HPC)的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效地使HSC和/或HPC(例如，早期HPC)的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效地使HSC和/或HPC(例如，早期HPC)的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在这些实施方案中的一些实施方案中，正在治疗的受试者的骨髓中(例如，骨髓单核细胞中)的HSC和/或HPC(例如，早期HPC)减少。
在一些实施方案中，本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效地显著降低细胞频率或数目，或消除多能祖细胞(MPP)和/或共同祖细胞(CP)。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效地使MPP和/或CP的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效地使MPP和/或CP的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效地使MPP和/或CP的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物有效地使MPP和/或CP的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在这些实施方案中的一些实施方案中，正在治疗的受试者的骨髓中(例如，骨髓单核细胞中)的MPP或CP减少。
在一些实施方案中，治疗有效量减少表达CD34、FLT3、CD33、CD11b、CD16、CD15和CD66b中的一者或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)的细胞群体。在一些实施方案中，治疗有效量使表达CD34、FLT3、CD33、CD11b、CD16、CD15和CD66b中的一者或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)的细胞群体减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些实施方案中，治疗有效量使表达CD34、FLT3、CD33、CD11b、CD16、CD15和CD66b中的一者或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)的细胞群体减少至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，治疗有效量使表达CD34、FLT3、CD33、CD11b、CD16、CD15和CD66b中的一者或多者(例如，2、3、4、5、6或7者)的细胞群体减少至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％。
在一些实施方案中，治疗有效量减少表达CD34和FLT3的细胞群体。在一些实施方案中，治疗有效量使表达CD34和FLT3的细胞群体减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些实施方案中，治疗有效量使表达CD34和FLT3的细胞群体减少至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，治疗有效量使表达CD34和FLT3的细胞群体减少至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％。在一些实施方案中，治疗有效量减少表达CD33的细胞群体(例如，减少本段或前一段中提到的任何百分比)。在一些实施方案中，治疗有效量减少表达CD11b的细胞群体(例如，减少本段或前一段中提到的任何百分比)。在一些实施方案中，治疗有效量减少表达FLT3的细胞群体(例如，减少本段或前一段中提到的任何百分比)。在一些实施方案中，治疗有效量减少表达CD16的细胞群体(例如，减少本段或前一段中提到的任何百分比)。在一些实施方案中，治疗有效量减少表达CD15的细胞群体(例如，减少本段或前一段中提到的任何百分比)。在一些实施方案中，治疗有效量减少表达CD66b的细胞群体(例如，减少本段或前一段中提到的任何百分比)。本文所描述的任何降低可以相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)。
在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物显著降低表达FLT3的细胞的数目或频率。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物使表达FLT3的细胞的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物使表达FLT3的细胞的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少60％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物使表达FLT3的细胞的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少70％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物使表达FLT3的细胞的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少80％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物使表达FLT3的细胞的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少90％。在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的药物组合物使表达FLT3的细胞的数目或频率相对于对照或基线(例如，相对于施用这种疗法之前受试者中的细胞水平)降低至少95％。
在这些实施方案中的一些实施方案中，正在治疗的受试者的骨髓中(例如，骨髓单核细胞中)表达FLT3的细胞减少。在这些实施方案中的一些实施方案中，正在治疗的受试者的循环血细胞中表达FLT3的细胞减少。在这些实施方案中的一些实施方案中，表达FLT3的细胞的减少是正在治疗的受试者中癌细胞的减少。
在一些实施方案中，本公开提供了消除或减少造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HP)的方法。在一些实施方案中，本公开提供了消除或减少造血干细胞和/或祖细胞的方法，所述方法包括施用本文所描述的双特异性人源化抗体。在一些实施方案中，所述方法包括选择需要消除或减少HSC/HP的患者，以及向所述患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含结合至HSC/HP表达的人类FLT3并结合至T细胞表达的人类CD3的双特异性人源化抗体，其中所述双特异性人源化抗体重定向T细胞以消除患者的HSC/HP。
在一些实施方案中，准备或调理有需要的受试者用于造血细胞移植的方法用于患有本文所描述的任何癌症的受试者。
在一些实施方案中，本文所描述的方法还包括造血干细胞(HSC)/造血祖细胞(HP)移植。在一些实施方案中，HSC/HP移植包括供体HSC/HP细胞的移植。
在一些实施方案中，本公开提供了在受试者中进行造血干细胞/造血祖细胞移植的方法，所述方法包括：
(i)通过向受试者施用本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的任何药物组合物来减少造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HP)，
(ii)在受试者的HSC/HP细胞群体减少后将供体HSC/HP移植至受试者。
在一些实施方案中，本公开提供了在受试者中进行造血干细胞/造血祖细胞移植的方法，所述方法包括：
(i)通过向受试者施用本文中描述为118BA#3WT(在本文中也被称为#3或#3WT)、118BA 3A(在本文中也被称为3A或#3A)、118BA 3B(在本文中也被称为3B或#3B)、118BA 3C(在本文中也被称为3C或#3C)、118BA 3a2(在本文中也被称为3a2或#3a2)、118BA 3a1(在本文中也被称为3a1或#3a1)、118BA 3a3(在本文中也被称为3a3或#3a3)、118BA#6(在本文中也被称为#6)或118BA#5(在本文中也被称为#5)的抗体或其任何抗原结合片段来减少造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HP)，
(ii)在受试者的HSC/HP细胞群体减少后将供体HSC/HP移植至患者。
在一些实施方案中，本公开提供了在受试者中进行造血干细胞/造血祖细胞移植的方法，所述方法包括：
(i)通过向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段来减少造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HP)，
(ii)施用检查点抑制剂疗法，以及
(iii)在受试者的HSC/HP细胞群体减少后将供体HSC/HP移植至患者。
在一些实施方案中，本公开提供了在受试者中进行造血干细胞/造血祖细胞移植的方法，所述方法包括：
(i)通过向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段来减少造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HP)，
其中所述双特异性人源化抗体使HSC/HP群体减少至少90％，
(ii)施用检查点抑制剂疗法，以及
(iii)在受试者的HSC/HP细胞群体减少后将供体HSC/HP移植至患者。
待治疗的癌症
可以根据本文所描述的方法治疗癌症。在一些实施方案中，待治疗的癌症是血液癌症。根据本文所描述的方法治疗的血液癌症的实例包括但不限于急性髓系白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性髓系白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤、非恶性遗传性或获得性骨髓病症、多发性骨髓瘤或树突状细胞肿瘤。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，癌症是急性髓系白血病(AML)。在一些实施方案中，癌症是急性淋巴母细胞白血病(ALL)。在一些实施方案中，癌症是慢性髓系白血病(CML)。在一些实施方案中，癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一些实施方案中，癌症是母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，癌症是外周T细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是滤泡性淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是神经母细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是非恶性遗传性或获得性骨髓病症。在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是树突状细胞肿瘤。
在一些实施方案中，癌症是非恶性遗传性或获得性骨髓病症的结果。根据本文所描述的方法治疗的非恶性遗传性或获得性骨髓病症的实例包括但不限于镰状贫血、重型β-地中海贫血、难治性戴蒙德-布莱克凡贫血、骨髓增生异常综合征、特发性严重再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、纯红细胞再生障碍、范可尼贫血、无巨核细胞增多症或先天性血小板减少症。在一些实施方案中，非恶性遗传性或获得性骨髓病症是镰状细胞性贫血。在一些实施方案中，非恶性遗传性或获得性骨髓病症是重型β-地中海贫血。在一些实施方案中，非恶性遗传性或获得性骨髓病症是难治性戴蒙德-布莱克凡贫血。在一些实施方案中，非恶性遗传性或获得性骨髓病症是骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，非恶性遗传性或获得性骨髓病症是特发性严重再生障碍性贫血。在一些实施方案中，非恶性遗传性或获得性骨髓病症是阵发性睡眠性血红蛋白尿症。在一些实施方案中，非恶性遗传性或获得性骨髓病症是纯红细胞再生障碍。在一些实施方案中，非恶性遗传性或获得性骨髓病症是范可尼贫血。在一些实施方案中，非恶性遗传性或获得性骨髓病症是无巨核细胞增多症。在一些实施方案中，非恶性遗传性或获得性骨髓病症是先天性血小板减少症。
施用方法
本文所描述的双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或片段(和包含此类抗体的药物组合物)可以通过任何适合的方式向受试者施用，所述方式包括但不限于肠道外(例如，静脉内、动脉内、肌内、骨内、脑内、脑室内、鞘内、皮下)、腹膜内、瘤内、肺内、皮内、经皮、结膜、眼内、鼻内、气管内、口服和局部病灶内施用途径。在一些实施方案中，静脉内、动脉内、腹膜内或瘤内施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段。
在一些实施方案中，静脉内(例如，通过推注或连续输注)施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段。在一些实施方案中，腹膜内施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段。在一些实施方案中，肌内施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段。在一些实施方案中，皮下施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段。在一些实施方案中，瘤内(例如通过注射至正在治疗的癌症的肿瘤中)施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段。在一些实施方案中，静脉内、腹膜内或瘤内施用本文所描述的双特异性人源化抗体或片段。
涵盖本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段(和包含此类抗体的药物组合物)的各种给药时程，包括单次施用或在一段时间内多次施用。施用方法包括但不限于推注施用、脉冲输注和连续输注。
在一些实施方案中，施用本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物施用一次。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物当静脉内施用一次(例如，无需进一步重复施用)时在本文所描述的方法中是有效的。
在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物每约1至7天施用一次，持续约1至8周。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物每约1至7天施用一次，持续约1至4周。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物每约3至7天施用一次，持续约2至3周。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物每约3天施用一次，持续约2周，至每约7天施用一次，持续约3周。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物每约2至4天施用一次，持续约2至3周(例如，2周或3周)。
在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物每周1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用(例如，每周一次、每周两次、每隔一天或每天)。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物施用1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物施用少于6周、少于5周、少于4周、少于3周或少于2周。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物每两天施用一次或以更低频率施用(例如，持续1至3周)。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物每三天施用一次或以更低频率施用(例如，持续1至3周)。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物每四天施用一次或以更低频率施用(例如，持续1至3周)。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物每五天施用一次或以更低频率施用(例如，持续1至3周)。在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物每周施用一次或以更低频率施用(例如，持续1至3周)。
在一些实施方案中，(本文所描述的抗体、片段或组合物的)施用每3天一次，持续约2周。在一些实施方案中，每4天施用一次，持续约2周。在一些实施方案中，每5天施用一次，持续约2周。在一些实施方案中，每7天施用一次，持续约2周。在一些实施方案中，每3天施用一次，持续约3周。在一些实施方案中，每4天施用一次，持续约3周。在一些实施方案中，每5天施用一次，持续约3周。在一些实施方案中，每7天施用一次，持续约3周。
在一些实施方案中，每周施用一次，持续1周、2周、3周、4周、5周或6周。在一些实施方案中，每周施用两次，持续1周、2周、3周、4周、5周或6周。在一些实施方案中，每周施用三次，持续1周、2周、3周、4周、5周或6周。在一些实施方案中，每周施用四次，持续1周、2周、3周、4周、5周或6周。在一些实施方案中，每周施用五次，持续1周、2周、3周、4周、5周或6周。在一些实施方案中，每周施用六次，持续1周、2周、3周、4周、5周或6周。在一些实施方案中，每周施用七次，持续1周、2周、3周、4周、5周或6周。
在一些实施方案中，施用是每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次或每六周一次。在一些实施方案中，施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次或二十次(例如，在治疗过程中)。
本文所描述的施用包括如下方案：其中本文所描述的任何疗法的初始剂量之后是一个或多个较低剂量，或者其中初始剂量之后是一个或多个较高剂量。在一些实施方案中，初始剂量之后是一个或多个较低剂量。在一些实施方案中，初始剂量之后是一个或多个较高剂量。
在一些实施方案中，初始治疗期(其中施用本文所描述的任何疗法，例如每月一次、每两周一次、每周一次、每周两次或每周三次)之后是停药期，其中不施用疗法(持续例如一周、两周、三周、四周、六周、两个月、三个月、四个月、六个月或一年)，然后是第二治疗期(其中施用疗法，例如每月一次、两周一次、每周一次、每周两次或每周三次)。此种初始治疗期和此种第二治疗期可以持续例如两周、三周、四周、六周(其中初始治疗期可以与第二治疗期相同或不同)。这个治疗过程(具有初始治疗期、停药期和第二治疗期)可以重复两次、三次、四次、五次、六次、十次或十次以上。
在一些实施方案中，向受试者或患者施用治疗有效量的本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段或药物组合物。治疗有效量取决于所使用的方法、所治疗的癌症、所治疗的癌症的严重性、施用途径、靶位点、患者的状况(例如，年龄、体重、健康状况)、治疗的反应性、患者使用的其它药物以及进行治疗的开业医生酌情考虑的其它因素。
在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或其片段的剂量为约0.01mg/kg至约10mg/kg患者体重。在一些实施方案中，剂量为约0.01mg/kg至约2mg/kg患者体重。在一些实施方案中，剂量为约0.05mg/kg至约1mg/kg患者体重。在一些实施方案中，剂量为约0.1mg/kg至约0.5mg/kg患者体重。在一些实施方案中，剂量为约0.1mg/kg至约0.3mg/kg患者体重。在一些实施方案中，剂量为约0.01mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg或约2mg/kg患者体重。在一些实施方案中，剂量为约0.1mg/kg患者体重。在一些实施方案中，剂量为约0.2mg/kg患者体重。在一些实施方案中，剂量为约0.3mg/kg患者体重。
在一些实施方案中，在施用双特异性人源化抗体或片段或包含其的药物组合物后5天至5周进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段或包含其的药物组合物后约2至3周进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用后约1周至4周进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用后约10天至25天进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用后约10天至20天进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用后约2周进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用后约3周进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用后至少5天或1周进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用后至少2周进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用后小于3周进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用后小于4周进行造血细胞移植。在一些实施方案中，在施用后小于5周进行造血细胞移植。
患者群体
在一些实施方案中，用本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段治疗患者或受试者。在一些实施方案中，患者或受试者是哺乳动物，例如，人、非人灵长类动物、狗、猫、兔、牛、马、山羊、绵羊或猪。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有癌症。用于癌症诊断的方法是本领域中已知的。在一些实施方案中，癌症是早期癌症。在一些实施方案中，癌症是晚期癌症。在一些实施方案中，癌症是高级别肿瘤。在一些实施方案中，癌症是低级别肿瘤。
在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有造血癌症。在一些实施方案中，造血癌症是急性髓系白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)、慢性髓系白血病(CML)、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤或多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有急性髓系白血病(AML)。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有急性淋巴母细胞白血病(ALL)。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有慢性髓系白血病(CML)。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有外周T细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有滤泡性淋巴瘤。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有弥漫性大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有神经母细胞瘤。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有树突状细胞肿瘤。
在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有非恶性遗传性获得性骨髓病症。在一些实施方案中，非恶性遗传性获得性骨髓病症是镰状细胞性贫血、重型β-地中海贫血、难治性戴蒙德-布莱克凡贫血、骨髓增生异常综合征、特发性严重再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、纯红细胞再生障碍、范可尼贫血、无巨核细胞增多症、先天性血小板减少症或严重联合免疫缺陷(SCID)。
在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有镰状细胞性贫血。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有重型β-地中海贫血。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有难治性戴蒙德-布莱克凡贫血。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有特发性严重再生障碍性贫血。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有阵发性睡眠性血红蛋白尿症。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有纯红细胞再生障碍。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有范可尼贫血。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有无巨核细胞增多症。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有先天性血小板减少症。在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的患者或受试者已被诊断为患有严重联合免疫缺陷(SCID)。
在一些实施方案中，用本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段治疗需要消除造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞的患者或受试者。在一些实施方案中，用本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段治疗的需要消除造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞的患者或受试者罹患以下一者或多者：急性髓系白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)、慢性髓系白血病(CML)、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非血液恶性肿瘤(诸如神经母细胞瘤)、非恶性遗传性和获得性骨髓病症(例如，镰状细胞性贫血、重型β-地中海贫血、难治性戴蒙德-布莱克凡贫血、骨髓增生异常综合征、特发性严重再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、纯红细胞再生障碍、范可尼贫血、无巨核细胞增多症或先天性血小板减少症)、多发性骨髓瘤、严重联合免疫缺陷(SCID)和使用骨髓(BM)/造血干细胞(HSC)移植治疗的其它病症。
在一些实施方案中，正在治疗的患者或受试者先前已经历一种或多种癌症疗法(例如，疫苗、小分子靶向疗法、化学疗法、放射疗法或免疫疗法)，并且已对一种或多种先前的癌症疗法产生抗性。在一些实施方案中，正在治疗的患者或受试者对化学疗法具有抗性。在一些实施方案中，正在治疗的患者或受试者对小分子靶向疗法具有抗性。在一些实施方案中，正在治疗的患者或受试者对另一种免疫疗法具有抗性。在一些实施方案中，正在治疗的患者或受试者对疫苗具有抗性。
在一些实施方案中，患者或受试者患有已知或预期在其细胞表面上表达FLT3的癌症类型。在一些实施方案中，正在治疗的受试者患有一种类型的癌症，其细胞表达FLT3的一种或多种剪接变体。
在一些实施方案中，正在治疗的患者或受试者患有已使用本领域中已知的技术确定的在其细胞表面上表达FLT3的癌症，所述细胞可以被双特异性人源化抗体或其片段靶向。在一些实施方案中，患者或受试者患有已使用本领域中已知的技术确定的在其细胞表面上表达FLT3剪接变体的癌症，所述细胞可以被双特异性人源化抗体或其片段靶向。
组合疗法和药盒
在一些实施方案中，将本文所描述的任何双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或其片段与一种或多种抗癌疗法组合施用于受试者。在一些实施方案中，抗癌疗法是化学疗法、放射疗法、免疫疗法、抗体疗法、小分子疗法或本领域中已知的另一种抗癌疗法。
在一些实施方案中，将本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段与化学疗法组合施用于受试者。可以用于本文所描述的方法中的化学治疗剂类型的实例包括但不限于烷化剂、亚硝基脲剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、芳香酶抑制剂、抗肿瘤抗生素、来源于植物的生物碱、激素拮抗剂、P-糖蛋白抑制剂和铂络合物衍生物。可以用于本文所描述的方法中的化学治疗药物的具体实例包括但不限于紫杉醇(taxol)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、白蛋白结合型太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨(gemcitabine)、柔红霉素(daunorubicin)、秋水仙素(colchicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、他莫昔芬(tamoxifen)、环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、白消安(busulfan)、乌莫司汀(uramustine)、二氯甲二乙胺(mustargen)、异环磷酰胺(ifosamide)、苯达莫司汀(bendamustine)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)、链佐星(streptozocin)、塞替派(thiotepa)、丝裂霉素(mitomycin)、地吖醌(diaziquone)、四嗪(tetrazine)、六甲蜜胺(altretamine)、米托唑胺(mitozolomide)、替莫唑胺(temozolomide)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine)、六甲蜜胺、克瘤灵(hexalen)、曲磷酰胺(trofosfamide)、雌莫司汀(estramustine)、曲奥舒凡(treosulfan)、甘露舒凡(mannosulfan)、三亚胺醌(triaziquone)、卡波醌(carboquone)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、磺胺(sulfanilamide)、氟嘧啶、硫嘌呤、硫鸟嘌呤、巯嘌呤、克拉屈滨(cladribine)、卡培他滨(capecitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、氟达拉滨(fludarabine)、羟基脲、奈拉滨(nelarabine)或氯法拉滨(clofarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、地西他滨(decitabine)、普拉曲沙(pralatrexate)、氟尿苷(floxuridine)、硫喹宁(thioquanine)、阿扎胞苷(azacitidine)、克拉屈滨(cladribine)、喷司他丁(pentostatin)、巯嘌呤、伊马替尼(imatinib)、放线菌素D(dactinomycin)、司比定(cerubidine)、放线菌素(actinomycin)、藤黄霉素(luteomycin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、普卡霉素(plicamycin)、长春新碱(vincristin)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)、太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、蔓长春花(periwinkle)、长春花(vinca)、紫杉烷(taxane)、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、喜树碱(camptothecin)、替尼泊苷(teniposide)、吡柔比星(pirarubicin)、新生霉素(novobiocin)、美巴龙(merbarone)、阿克拉霉素(aclarubicin)、安吖啶(amsacrine)、抗雄激素、抗雌激素、比卡鲁胺(bicalutamide)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、氟甲孕酮(fluoxymesterone)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、雌二醇(estrace)、奥曲肽(octreotide)、甲地孕酮(megestrol)、雷洛昔芬(raloxifene)、托瑞米芬(toremifene)、氟维司群(fulvestrant)、泼尼松(prednisone)、氟他胺(flutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、戈舍瑞林(goserelin)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、睾内酯(testolactone)、阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、伏罗唑(vorozole)、福美坦(formestane)、法屈唑(fadrozole)、雄烯(androstene)、白藜芦醇(resveratrol)、麦司明(myosmine)、儿茶素(catechin)、芹菜素(apigenin)、圣草酚(eriodictyol)、异甘草素(isoliquiritigenin)、倒捻子素(mangostin)、胺碘酮(amiodarone)、阿奇霉素(azithromycin)、卡托普利(captopril)、克拉霉素(clarithromycin)、环孢素(cyclosporine)、胡椒碱(piperine)、槲皮素(quercetine)、奎尼丁(quinidine)、奎宁(quinine)、利血平(reserpine)、利托那韦(ritonavir)、塔立奇达(tariquidar)、维拉帕米(verapamil)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、反铂(transplatin)、奈达铂(nedaplatin)、沙铂(satraplatin)、三铂(triplatin)和卡铂(carboplatin)。
在一些实施方案中，抗肿瘤剂选自但不限于本领域技术人员已知的适合的抗肿瘤剂，并且包括蒽环类(例如，道诺霉素(daunomycin)和多柔比星(doxorubicin))、澳瑞他汀(auristatin)、甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)、长春地辛(vindesine)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、顺铂(cis-platinum)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、5-氟尿苷、美法仑(melphalan)、蓖麻毒素(ricin)和加利车霉素(calicheamicin)，包括组合化学疗法，诸如多柔比星、博莱霉素(bleomycin)、长春花碱(vinblastine)和达卡巴嗪(dacarbazine)(ABVD)、BEACOPP或升级型BEACOPP(博莱霉素、依托泊苷、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松)和斯坦福V(Stanford V)(多柔比星、长春花碱、氮芥、长春新碱、博莱霉素、依托泊苷和泼尼松)。抗肿瘤剂还可以是免疫疗法(例如，抗CD20抗体利妥昔单抗(rituximab))、免疫毒素(例如，维布妥昔单抗(Brentuximab vedotin，SGN-35)是由连接至抗微管蛋白剂单甲基澳瑞他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)的CD-30定向抗体组成的免疫毒素)、过继性免疫疗法(细胞毒性T淋巴细胞)、程序性死亡1(PD-1)阻断(例如，纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab))。
在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的任何药物组合物与适用于癌症的化学疗法药物组合施用于患有所述癌症的受试者，所述化学疗法药物可以任选地以适用于所述癌症(例如，AML或ALL)的剂量和/或施用方案施用。
在一些实施方案中，本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的任何药物组合物与免疫疗法组合施用于受试者。在一些实施方案中，免疫疗法包括施用检查点抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗PD1拮抗剂、抗PD-L1拮抗剂和抗CTLA4拮抗剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗PD1拮抗剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗PD-1抗体(诸如拮抗性抗PD-1抗体)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗PD-L1拮抗剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗PD-L1抗体(诸如拮抗性抗PD-L1抗体)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗CTLA4拮抗剂(例如，拮抗性抗CTLA4抗体)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是Lag3拮抗剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是Tim3拮抗剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是TIGIT拮抗剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是OX40拮抗剂。
在一些实施方案中，抗PD1拮抗剂选自但不限于纳武单抗、派姆单抗、PDR001、帕博利珠单抗(Pembrolimumab)(Bio X Cell)、Bi o X Cell Clone J116(目录号BE0188)、西米普利单抗(cemiplimab)和匹地利珠单抗(pidilizumab)。在一些实施方案中，抗PD-L1拮抗剂选自但不限于阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、YW243.55.S70、MPDL3280A、MDX-1105和BMS-936559。在一些实施方案中，抗CTLA4拮抗剂选自但不限于伊匹木单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)。
在一些实施方案中，本文所描述的任何疗法与放射疗法(例如，x射线、γ射线、电子束)组合施用于受试者。
在一些实施方案中，在施用本文所描述的任何人源化双特异性抗体或片段之前施用检查点抑制剂。在一些实施方案中，与本文所描述的任何人源化双特异性抗体或片段同时施用检查点抑制剂。在一些实施方案中，在施用本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段之前施用检查点抑制剂。
在一些实施方案中，在第二疗法之前、期间或之后向受试者施用本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段。
在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的受试者在施用本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段之前尚未接受抗癌疗法。在一些实施方案中，将本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段施用于在施用所述抗体或片段之前已接受抗癌疗法的受试者。在一些实施方案中，将本文所描述的双特异性人源化抗体或其片段施用于从免疫抑制疗法中恢复或接受免疫抑制疗法的受试者。
在一些实施方案中，根据本文所描述的方法治疗的受试者在施用本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的任何药物组合物之前尚未接受抗癌疗法。在一些实施方案中，将本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的任何药物组合物施用于在施用所述抗体或片段之前已接受抗癌疗法的受试者。在一些实施方案中，将本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的任何药物组合物施用于从免疫抑制疗法中恢复或接受免疫抑制疗法的受试者。
在一些实施方案中，本文提供了包括双特异性人源化抗体或其片段和一种或多种额外癌症剂的药盒。在一些实施方案中，本文提供了药盒，所述药盒包括(i)双特异性人源化抗体或其片段(例如，治疗有效量)，和(ii)治疗有效量的一种或多种化学治疗药物，所述治疗有效量可以小于当不与双特异性人源化抗体一起使用时一种或多种药物的治疗量。
在一些实施方案中，本文提供了包括双特异性人源化抗体或其片段和一种或多种额外检查点抑制剂的药盒。在一些实施方案中，本文提供了药盒，所述药盒包括(i)双特异性人源化抗体或其片段(例如，治疗有效量)，和(ii)治疗有效量的一种或多种检查点抑制剂，所述治疗有效量可以小于当不与双特异性人源化抗体一起使用时一种或多种药物的治疗量。在一些实施方案中，本文提供了药盒，所述药盒包括(i)本文所描述的任何双特异性人源化抗体或片段或本文所描述的任何药物组合物，和(ii)一种或多种抗PD1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA4抗体(例如，治疗有效量，所述治疗有效量可以小于当不与所述抗体或片段一起使用时一种或多种药物的治疗量)。
在一些实施方案中，还涵盖了包括本文所描述的任何双特异性人源化抗FLT3/CD3抗体或片段和一种或多种额外抗癌剂的药盒。
提供了以下实施例以作说明而非限制。鉴于本文所提供的一般性描述，可以实施本发明的各种其它实施方案。
实施例
实施例1：三种嵌合单克隆抗FLT3抗体118BA、1B11E7和281A的结合特性的评估
使用表达高水平FLT3的REH细胞来测试抗FLT3嵌合单克隆抗体与FLT3(具有小鼠重链和轻链可变区以及人类恒定结构域)的结合亲和力。用PBS+2％BCS+2mM EDTA(流动缓冲液)中制备的多种浓度的嵌合单克隆抗体将REH细胞染色。用流动缓冲液洗涤细胞五次，并且用缀合至荧光素的抗人IgG Fc抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories,109-095-008)染色。用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend 420404)将细胞染色，然后进行流式细胞术分析。对于118BA(在US20190389955中公开为具有SEQ ID NO:25的VL和SEQ IDNO:27的VH，其中US20190389955通过引用整体并入本文)、1B11E7(在US20190389955中公开为具有SEQ ID NO:21的VL和SEQ ID NO:23的VH)和281A(在US20190389955中公开为具有SEQ ID NO:17的VL和SEQ ID NO:19的VH)，确定结合EC50分别为0.77nM、0.66nM和0.66nM，如图1A-1C中所示。
实施例2：FLT3配体(FLT3L)与三种嵌合单克隆抗FLT3抗体118BA、1B11E7和281A竞争结合FLT3的评估。
在人源化之前，评估嵌合抗FLT3抗体与FLT3配体(FLT3L)的竞争性结合。将REH细胞与10nM重组人类FLT3L(R&Dsystems)一起孵育20分钟，并且用PBS+2％ BCS+2mM EDTA(流动缓冲液)洗涤。然后用流动缓冲液中制备的多种浓度的嵌合单克隆抗体将细胞染色。用流动缓冲液洗涤细胞五次，并且用缀合至Alexa Fluor 488的抗人IgG Fc抗体(JacksonImmunoresearch Laboratories,109-545-008)染色。用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend 420404)将细胞染色，然后进行流式细胞术分析。嵌合抗体118BA(在US20190389955中公开为具有SEQ ID NO:25的VL和SEQ ID NO:27的VH)和1B11E7(在US20190389955中公开为具有SEQ ID NO:21的VL和SEQ ID NO:23的VH)与REH的结合不受FLT3L对细胞的预处理所影响，而281A(在US20190389955中公开为具有SEQ ID NO:17的VL和SEQ ID NO:19的VH)结合在FLT3L预处理下显著降低，如图2A-2C中所示。这表明281A抗体与FLT3L竞争结合至FLT3，但118BA和1B11E7抗体不与FLT3L竞争结合至FLT3。
实施例3：抗FLT3单克隆抗体克隆体的人源化变体118BA(变体1和5)、1B11E7(变体7和10)和281A(变体1和5)的结合特性的评估。
118BA变体1也被称为18BA-v1，并且其VL和VH序列分别以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2提供。118BA变体5也被称为18BA-v5，并且其VL和VH序列分别以SEQ ID NO:88和SEQ IDNO:89提供。本文还提供了1B11E7(变体7和10)和281A(变体1和5)的VL和VH序列(参见序列表)。用PBS+2％BCS+2mM EDTA(流动缓冲液)中制备的多种浓度的人源化118BA变体1和5、人源化1B11E7变体7和10以及人源化281A变体1和5将REH细胞染色。用流动缓冲液洗涤细胞五次，并且用缀合至Alexa Fluor 488的抗人IgG Fc抗体(Jackson ImmunoresearchLaboratories,109-545-008)染色。用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend 420404)将细胞染色，然后进行流式细胞术分析。对于人源化118BA变体1和5、1B11E7变体7和10以及281A变体1和5，确定结合的EC50分别为0.4nM、0.72nM、0.92nM、0.62nM、0.17nM和0.18nM(图3A-3F)。所使用的抗体如实施例1中所述。
实施例4：人源化抗FLT3抗体克隆体与恒河猴FLT3的交叉反应性的评价
用编码人类FLT3或恒河猴FLT3的质粒DNA转染HEK293T细胞或进行对照模拟转染。转染后24小时，用PBS+2％BCS+2mM EDTA(流动缓冲液)中制备的多种浓度的人源化抗FLT3抗体281A变体1、1B11E7变体7和118BA变体1将细胞染色。用流动缓冲液洗涤细胞五次，并且用抗人IgG APC二次抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories)染色。用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend 420404)将细胞染色，然后进行流式细胞术分析。结合表达恒河猴FLT3的细胞和表达人类FLT3的细胞的EC50极为类似，表明抗体的FLT3表位在人类与恒河猴之间是保守的，如图4A-4B中所示。此外，抗体克隆体不结合模拟转染的HEK293T细胞，表明抗体的FLT3特异性结合(图4C)。
FLT3通常在CD34+造血干祖细胞(HSPC)和分化程度更高的造血祖细胞(HP)中表达。为了测试人源化抗体是否结合至CD34+人类和恒河猴骨髓HSPC和HP上表达的FLT3，将来自恒河猴和人类骨髓的单核细胞与PBS+2％BCS+2mM EDTA缓冲液中制备的1μg/mL人源化抗FLT3抗体281A变体1、1B11E7变体7、118BA变体1或仅缓冲液一起孵育，并且用缓冲液洗涤3次。将细胞与在缓冲液中以1:20稀释度制备的对人类和恒河猴CD34具有特异性的PE缀合CD34抗体(StemCell Technologies)和在缓冲液中以1:200稀释度制备的抗人IgG APC二次抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories)一起孵育。将细胞洗涤一次并用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend 420404)染色，并且通过流式细胞术进行分析。对于所测试的所有条件，确定CD34+和CD34-细胞群体的APC通道相对于单独二次抗体的平均荧光强度的变化百分比。相较于显示MFI变化百分比最小的CD34-细胞，在所有三种变体存在下，CD34+细胞显示MFI的增加百分比显著较高。在所测试的三种变体中，对于人类和恒河猴CD34+细胞两者，281A变体显示MFI的增加百分比最小。对于人类和恒河猴CD34+细胞两者，118BA和1B11E7变体的MFI具有类似的增加百分比(图5A和图5B)。这些结果表明，所有三种人源化抗体都结合至两个物种中的CD34+骨髓HSPC和HP上表达的FLT3，并且相较于281A变体，118BA和1B11E7变体对CD34+细胞具有更优越的结合特性。
实施例5：嵌合和人源化单克隆抗CD3 IgG SP34克隆体与CD3的结合特性的评估
使用从脐血中分离的表达高水平CD3的原代人类泛T细胞(来源：纽约血液中心(New York Blood Center))来测试嵌合单克隆SP34抗体与T细胞(包含小鼠重链和轻链可变区和人类恒定结构域)的表面上的CD3的结合亲和力。用PBS+2％BCS+2mM EDTA(流动缓冲液)中制备的多种浓度的嵌合单克隆抗体将泛T细胞染色。用流动缓冲液洗涤细胞五次，并且用缀合至Alexa Flour 488的抗人IgG Fc抗体(Jackson ImmunoresearchLaboratories,109-095-008)染色。用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend 420404)将细胞染色，然后进行流式细胞术分析。确定结合EC50为3.2nM，如图6中所示。
将SP34克隆体的小鼠重链和轻链可变区人源化，并且在表达高水平CD3的Jurkat细胞(ATCC)中测试两种人源化变体与CD3的结合亲和力。用PBS+2％BCS+2mM EDTA(流动缓冲液)中制备的多种浓度的人源化SP34变体2和6(变体2VH和VL分别为SEQ ID NO:67和68；变体6VH和VL分别为SEQ ID NO:69和70)抗体将Jurkat细胞染色。用流动缓冲液洗涤细胞五次，并且用缀合至Alexa Flour488的抗人IgG Fc抗体(Jackson ImmunoresearchLaboratories,109-095-008)染色。用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend420404)将细胞染色，然后进行流式细胞术分析。对于118BA变体2和6，确定结合EC50分别为2.38nM和3.2nM，如图7中所示。
外周血含有约45-70％的表达高水平CD3的T细胞。为了测试人源化抗体是否与恒河猴发生交叉反应，将来自恒河猴外周血的CD3单核细胞与PBS+2％BCS+2mM EDTA缓冲液中制备的1μg/ml人源化抗CD3 SP34变体2和6或仅缓冲液一起孵育，并且用缓冲液洗涤3次。将细胞与缀合至Alexa Flour 488的抗人IgG Fc抗体(Jackson ImmunoresearchLaboratories,109-095-008)一起孵育。用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend 420404)将细胞染色，然后进行流式细胞术分析。两种人源化变体均显示出与约58％的总单核细胞的结合，如图8中所示，表明与T细胞上的恒河猴CD3的结合，所述T细胞一般占外周血中总单核细胞的约45-70％。
实施例6：CD3 x FLT3双特异性抗体281A#1、1B11E7#2、118BA#3和118BA变体#4与REH细胞中的FLT3和Jurkat细胞中的CD3的结合特性的评估
用PBS+2％BCS+2mM EDTA(流动缓冲液)中制备的多种浓度的281A#1、1B11E7#2、118BA#3(包含SEQ ID NO:8和53)和118BA#4(图9A-9D)双特异性抗体将FLT3+REH细胞和CD3+Jurkat细胞染色。用流动缓冲液洗涤细胞五次，并且用缀合至FITC的抗人IgGλ抗体(Southern Biotech 2070-02)染色。用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend 420404)将细胞染色，然后进行流式细胞术分析。确定281A#1、1B11E7#2、118BA#3和118BA#4双特异性抗体与REH细胞结合的EC50分别为1.08nM、0.84nM、0.5nM和0.98nM，如图10A-10D中所示。确定281A#1、1B11E7#2、118BA#3和118BA#4双特异性抗体与Jurkat细胞结合的EC50分别为17.48nM、10nM、4.18nM和75.12nM，如图11A-D中所示。
实施例7：CD3 x FLT3双特异性抗体281A#1、1B11E7#2、118BA#3和118BA#4对FLT3+REH细胞的体外细胞毒性和T细胞激活
使用T细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies)分离来自脐血的T细胞(来源：纽约血液中心)，并且用CellTrace Violet(ThermoFisher)进行标记。在0nM至100nM范围内的多种浓度的281A#1、1B11E7#2、118BA#3和118BA#4双特异性抗体存在下，将T细胞与表达FLT3的REH细胞(急性淋巴细胞白血病细胞系)以3:1效应子与靶标(E:T)比率共培养。在所有条件下也单独培养REH和T细胞。添加重组人类IL2(50ng/ml)以促进T细胞存活。3天后，用FITC缀合的膜联蛋白V(细胞凋亡标志物)和7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend420404)(活力染料)将细胞染色，并且通过流式细胞术进行分析。以每种条件下死亡或凋亡的靶REH细胞(CellTrace Violet阴性)％来测量细胞毒性。确定281A#1、1B11E7#2和118BA#3对REH细胞的细胞毒性的EC50分别为0.011nM、0.027nM、0.006nM，如图12A-12G中所示。118BA#4抗体对REH的细胞毒性显著较低，因此对于所述抗体测试的浓度范围不足以计算细胞毒性的EC50。发现118BA#3抗体是所测试的四种双特异性抗体中最有效的。当REH细胞在不存在T细胞的情况下与双特异性抗体一起培养时，没有观察到毒性。通过测量每种条件下被鉴定为CellTrace Violet阳性和FSC-A高的激活T细胞％来确定118BA#3双特异性抗体对T细胞的激活，如图12E-12G中所示。仅在靶细胞存在下，118BA#3双特异性抗体才能以剂量依赖性方式显著激活T细胞。
实施例8：CD3 x FLT3 118BA#3双特异性抗体在多种FLT3+白血病细胞系中的结合亲和力
用PBS+2％ BCS+2mM EDTA(流动缓冲液)中制备的多种浓度的118BA#3双特异性抗体将MOLM-13、OCI-AML、HL-60、NOMO-1、THP-1、MV4-11和REH细胞染色。用流动缓冲液洗涤细胞五次，并且用缀合至FITC的抗人IgGλ抗体(Southern Biotech 2070-02)染色。用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend 420404)将细胞染色，然后进行流式细胞术分析。确定118BA#3双特异性结合MOLM-13、OCI-AML、HL-60、NOMO-1、THP-1、MV4-11和REH的EC50分别为0.40nM、1.86nM、1.02nM、6.75nM、5.74nM、6.33nM和0.87nM，如图13中所示。双特异性抗体与细胞的结合应与FLT3表达直接相关。因此，基于细胞的结合概况，将细胞归类为高(EC50<1nM)、中(1<EC50<4nM)和低(EC50>4nM)FLT3表达水平。
实施例9：CD3 x FLT3双特异性抗体对多种白血病细胞系的体外细胞毒性。
使用T细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies)分离来自脐血的T细胞(来源：纽约血液中心)，并且用CellTrace Violet(ThermoFisher)进行标记。在0nM至100nM范围内的多种浓度的118BA#3双特异性抗体存在下，将T细胞与表达FLT3的靶MOLM-13、OCI-AML、HL-60、NOMO-1、THP-1、MV4-11或REH细胞以3:1效应子与靶标(E:T)比率共培养。在所有条件下也单独培养FLT3+靶细胞和T细胞。添加重组人类IL2(50ng/ml)以促进T细胞存活。3天后，用FITC缀合的膜联蛋白V(细胞凋亡标志物)和7-AAD(活力染料)将细胞染色，并且通过流式细胞术进行分析。以每种条件下死亡或凋亡的靶细胞(CellTrace Violet阴性)％来测量细胞毒性。确定针对MOLM-13、OCI-AML、HL-60、NOMO-1、THP-1、MV4-11和REH细胞的细胞毒性的EC50分别为0.0157nM、0.002nM、0.014nM、0.003nM、0.00025nM、0.022nM和0.01nM，如图14中所示。这些结果显示，118BA#3双特异性抗体对多种来源于白血病母细胞的细胞系具有细胞毒性。118BA#3抗体介导的靶细胞杀伤并不总是与抗体与所测试的靶细胞的结合亲和力相关，这表明其它因素可能影响抗体对特定靶细胞的杀伤潜力。当靶细胞在不存在T细胞的情况下与双特异性抗体一起培养时，没有观察到毒性。
实施例10：C57BL/6小鼠的外周血的血浆中双特异性抗体半衰期的测量
向来自Taconic的6-8周龄C57BL/6小鼠静脉内注射25μg双特异性抗体118BA#3(其序列在本文中提供并在上文提及)和FcRnKO变体118BA#5(包含SEQ ID NO:30和28)和118BA#6(包含SEQ ID NO:25和28)抗体。对于118BA#5和118BA#6在0-72小时之间并且对于118BA#3在0-168小时之间的不同时间点，通过下颌下放血从小鼠收集血液。通过AlphaScreen(放大发光邻近均相测定)确定小鼠血浆中的抗体浓度。将血浆与重组His标记的人类Flt-3/Flk-2 Fc嵌合体蛋白和抗CH1美洲驼抗体-生物素缀合物(ThermoScientific7103202100)一起孵育，以形成生物素缀合物-双特异性抗体-FLT3复合物。然后添加AlphaScreen抗His受体珠粒，所述珠粒通过结合至重组His标记的FLT3与蛋白质复合物相互作用。然后将结合至复合物中的生物素的AlphaScreen链霉亲和素缀合供体珠粒添加至溶液中。最后，使用读板器检测680nm激发后的发射(520-620nm)信号。由于双特异性抗体的存在使受体和供体珠粒非常接近，因此供体珠粒的激发促使从受体珠粒的发射，并且信号与双特异性抗体的浓度成正比。将已知浓度的双特异性抗体在对照小鼠血浆中稀释并且用作测定中的标准品。通过测量达到在0小时(抗体注射后3分钟)时间点外周血中观察到的抗体浓度的50％所需的时间来确定抗体的半衰期。118BA#3、118BA#5和118BA#6在C57BL/6小鼠中的半衰期分别为48小时、4.26小时和4.38小时，如图15中所示。
实施例11：118BA#3、118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C双特异性抗体的结合特性的评估
用PBS+2％ BCS+2mM EDTA(流动缓冲液)中制备的多种浓度的118BA#3(包含SEQID NO:8和53)及其三种变体118BA#3A(包含SEQ ID NO:8和13)、118BA#3B(包含SEQ ID NO:15和13)和118BA#3C(包含SEQ ID NO:17和13)双特异性抗体将FLT3+REH细胞和CD3+人类T细胞染色。用流动缓冲液洗涤细胞五次，并且用缀合至FITC的抗人IgGλ抗体(SouthernBiotech 2070-02)染色。用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend 420404)将细胞染色，然后进行流式细胞术分析。确定118BA#3、118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C双特异性抗体与REH细胞结合的EC50分别为0.6nM、1.18nM、1.23nM和0.9nM，如图16A-16D中所示。确定118BA#3、118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C双特异性抗体与T细胞结合的EC50分别为13.8nM、15.5nM、13.56和32.0nM，如图16E-16H中所示。
实施例12：CD3 x FLT3双特异性抗体118BA#3、118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C对FLT3+REH细胞的体外细胞毒性和T细胞激活
使用T细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies)分离来自脐血的T细胞(来源：纽约血液中心)，并且用CellTrace Violet(ThermoFisher)进行标记。在0nM至100nM范围内的多种浓度的118BA#3及其三种变体118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C双特异性抗体存在下，将T细胞与表达FLT3的REH细胞(急性淋巴细胞白血病细胞系)以3:1效应子与靶标(E:T)比率共培养。在所有条件下也单独培养REH和T细胞。添加重组人类IL2(50ng/ml)以促进T细胞存活。3天后，用膜联蛋白V(细胞凋亡标志物)和7-AAD(活力染料)将细胞染色，并且通过流式细胞术进行分析。以每种条件下死亡或凋亡的靶REH细胞(CellTrace Violet阴性)％来测量细胞毒性。确定118BA#3、118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C对REH细胞的细胞毒性的EC50分别为0.01nM、0.013nM、0.017nM和0.013nM，如图17A-17D中所示。当REH细胞在不存在T细胞的情况下与双特异性抗体一起培养时，没有观察到毒性。
通过测量每种条件下被鉴定为CellTrace Violet阳性和FSC-A高的激活T细胞％来确定118BA#3、118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C双特异性抗体对T细胞的激活，如图18A-18D中所示。仅在靶细胞存在下，使用双特异性抗体118BA#3、118BA#3A、118BA#3B和118BA#3C才能观察到T细胞的剂量依赖性激活。
实施例13：CD3 x FLT3双特异性抗体118BA#3A及其三种变体118BA#3a1、118BA#3a2和118BA#3a3对FLT3+REH细胞的体外细胞毒性和T细胞激活
使用T细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies)分离来自脐血的T细胞(来源：纽约血液中心)，并且用CellTrace Violet(ThermoFisher)进行标记。在0nM至100nM范围内的多种浓度的118BA#3及其三种变体118BA#3a1(包含SEQ ID NO:17和19)、118BA#3a2(包含SEQ ID NO:17和21)和118BA#3a3(包含SEQ ID NO:17和23)双特异性抗体存在下，将T细胞与表达FLT3的REH细胞(急性淋巴细胞白血病细胞系)以3:1效应子与靶标(E:T)比率共培养。在所有条件下也单独培养REH和T细胞。添加重组人类IL2(50ng/ml)以促进T细胞存活。3天后，用FITC缀合的膜联蛋白V(细胞凋亡标志物)和7-AAD(活力染料)将细胞染色，并且通过流式细胞术进行分析。以每种条件下死亡或凋亡的靶REH细胞(CellTrace Violet阴性)％来测量细胞毒性。确定118BA#3和118BA#3a1对REH细胞的细胞毒性的EC50分别为0.01nM、0.33nM，如图19A-19D中所示。相较于118BA#3和118BA#3a1，118BA#3a3和#3a2的活性显著较低，并且对于118BA#3a2和#3a3所测试的浓度范围不允许确定细胞毒性的EC50。当REH细胞在不存在T细胞的情况下与双特异性抗体一起培养时，没有观察到毒性。
通过测量每种条件下被鉴定为CellTrace Violet阳性和FSC-A高的激活T细胞％来确定118BA#3、118BA#3a1、118BA#3a2和118BA#3a3双特异性抗体对T细胞的激活，如图20A-20D中所示。仅在靶细胞存在下，使用双特异性抗体118BA#3和118BA#3a1才能观察到T细胞的剂量依赖性激活，但对于118BA#3a2和118BA#3a3没有观察到。
实施例14：118BA#3a1双特异性抗体的结合特性的评估
用PBS+2％BCS+2mM EDTA(流动缓冲液)中制备的多种浓度的118BA#3和118BA#3a1双特异性抗体将FLT3+REH细胞和CD3+原代T细胞染色。用流动缓冲液洗涤细胞五次，并且用缀合至FITC的抗人IgGλ抗体(Southern Biotech 2070-02)染色。用7-AAD(7-AAD活力染色溶液，Biolegend 420404)将细胞染色，然后进行流式细胞术分析。确定118BA#3和118BA#3a1双特异性抗体与REH结合的EC50分别为0.87nM和1.17nM，如图21A-21B中所示。对于给定的一组数据点，确定118BA#3与T细胞结合的EC50为14.23nM，而118BA#3a1则未确定(图21C-21D)。
通过ELISA测试118BA#3和118BA#3a1的CD3e结合。将高亲和力蛋白结合96孔板(ThermoFisher，编号44-2404-21)用PBS(Caisson Labs，编号PBL06)中的1μg/mL重组人类CD3εFc嵌合体蛋白(R&D，编号9850-CD-050)包被，并且在4℃下孵育过夜。用洗涤缓冲液(PBS(Caisson Labs，编号PBL06)+0.05％ Tween20(ThermoFisher，编号28320))洗涤板。在室温(RT)下用封闭缓冲液(PBS(Caisson Labs，编号PBL06)+1％(w/v)BSA(Rockland，编号BSA-50)+0.05％ Tween20(ThermoFisher，编号28320))将板封闭两小时。用洗涤缓冲液将板洗涤两次。在PBS中以2.5×10-3至1×104ng/mL范围内的浓度制备118BA#3和118BA#3a1抗体的稀释液，并且将100μL稀释液在板上的每孔中一式两份在室温下孵育两小时。用洗涤缓冲液将板洗涤4次。将板与每孔100μL的1:200山羊抗人λ-HRP二次抗体(SouthernBiotech，编号2070-05)在室温下孵育一小时。用洗涤缓冲液将板洗涤4次。将板与每孔100μL的TMB底物(ThermoFisher目录号34029)避光孵育20分钟。将终止溶液(2N H2SO4)添加至每个孔中。在Envision读板器(PerkinElmer)上在450nm处记录孔的吸光度。图表显示了相对于抗体浓度绘制的吸光度。将可变斜率(四个参数)曲线与数据进行拟合，并且使用EC50来比较结合亲和力。118BA#3具有11.02ng/ml(0.06nM)的EC50，并且118BA双特异性#3a1具有33.07ng/ml(0.16nM)的EC50(图21E)。
实施例15：118BA#3人源化小鼠骨髓调理
将免疫受损小鼠(NOG,Taconic)在移植人脐血CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)前24小时用白消安进行预调理。通过尾静脉注射将总共1x 105CD34+HSPC进行静脉内移植，并且基于通过流式细胞术对人源化小鼠外周血中多谱系(人类CD45+、CD3+、CD19+、CD33+)人血细胞(>1％)的检测进行完全植入25周。移植后25周，每隔一天用0.0、0.1、0.5和1.0mg/kg浓度的118BA#3的总共3次剂量治疗人源化小鼠。治疗后16天处死所有组以分析骨髓中的人造血细胞植入(图22A)。
观察到来自用所有浓度的118BA#3治疗的小鼠的骨髓具有细胞过少区域，表明骨髓细胞的显著损失(图22B)。细胞计数和流式细胞术确认，相较于对照，所有治疗组中人骨髓细胞(人类CD45+)特异性减少(图22C和图22D)。对人类CD34+HSPC(hCD45+、谱系-、CD34+、CD38-)的进一步检查也揭示了相较于未接受118BA#3的小鼠，所有治疗组中的显著降低(图22E)。由于大多数表达FLT3的细胞在HSPC区室内，因此这个数据表明，用118BA#3治疗将调理人源化小鼠的骨髓。
实施例16：118BA#3针对MOLM-13AML细胞系的体内功效
将表达EGFP的MOLM-13AML细胞异种移植至外周血单核细胞(PBMC)人源化小鼠模型中，所述模型不会发生GvHD，从而允许长期存活研究和抗白血病T细胞活性。每周用0.1mg/kg或0.01mg/kg剂量的118BA#3治疗异种移植的小鼠3次，持续6周。当体重减轻20％和/或发生后腿麻痹时处死小鼠。每两周或在处死时通过流式细胞术追踪人类T细胞和EGFP-MOLM的外周血频率(图23A)。
基于外周血频率，用0.1mg/kg的118BA#3治疗显著延迟MOLM-13细胞的进展，这与相较于对照的中位存活期增加17天相关(图23B和图23C)。相较于对照，在较低剂量下没有观察到存活率的显著差异。尽管所有组之间的平均人类T细胞频率保持类似，但来自0.1mg/kg组的一部分小鼠截至第30天表现出与MOLM-13进展导致的死亡相关的T细胞植入的显著下降(图23D)。
实施例17：118BA#3针对MV4-11 AML细胞系的体内功效
将表达EGFP的MV4-11 AML细胞异种移植至外周血单核细胞(PBMC)人源化小鼠模型中，所述模型不会发生GvHD，从而允许长期存活研究和抗白血病T细胞活性。每周用0.1mg/kg或0.01mg/kg剂量的118BA#3治疗异种移植的小鼠3次，持续2周。当体重减轻20％和/或发生后腿麻痹时处死小鼠。每两周或在处死时通过流式细胞术追踪人类T细胞和EGFP-MOLM的外周血频率(图24A)。
与MOLM-13AML细胞的实验类似，相较于0.01mg/kg和对照组，用0.1mg/kg的118BA#3治疗显著延迟MV4-11细胞的进展，这意味着中位存活期增加28天(图24B和图24C)。所有治疗组之间的平均人类T细胞频率保持类似，但确实随着时间推移而下降(图24D)，这可能是由于独立于118BA#3治疗的PBMC植入的限制。
实施例18：与PD1抑制剂的组合治疗
将免疫受损小鼠(NOG,Taconic)在移植人脐血CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)前24小时用白消安进行预调理。通过尾静脉注射将总共1x 105CD34+HSPC进行静脉内移植，并且基于通过流式细胞术对人源化小鼠外周血中多谱系(人类CD45+、CD3+、CD19+CD33+)人血细胞(>1％)的检测进行完全植入35周。移植后35周，向小鼠异种移植EGFP-MV4-11，然后用0.1mg/kg 118BA#3和/或100μg抗PD1进行治疗。为了防止通过调理而致死，在治疗后1周向人源化小鼠移植同源小鼠BM细胞(图25A)。每两周或在处死时通过流式细胞术追踪人血液植入和EGFP-MV4-11细胞的外周血频率。
使用抗FLT3-CD3双特异性抗体治疗可能会导致T细胞在完全根除AML细胞前耗竭。为了防止T细胞耗竭并改善双特异性功效，将118BA#3与抗PD1组合以抑制通过PD-L1的信号传导。118BA#3治疗使得EGFP-MV4-11细胞的外周血频率降低，但仅适度改善中位存活期(5天)(图25B和图25C)。相比之下，抗FLT3-CD3双特异性抗体(即，118BA#3)与抗PD1的共同治疗显著降低MV4-11的负荷并且相对于对照(12天)增加中位存活期(图25B和图25C)。此外，在人源化小鼠中单独施用或与PD1一起施用118BA#3也促使从小鼠骨髓中有效消除人类造血区室(图25D)。单独使用或与118BA#3一起使用抗PD1的治疗与治疗后3周PD1表达的减少相关，这表明组合治疗的功效改善是由于防止T细胞耗竭。然而，由于118BA#3靶向人类HSPC，因此在第4周PD1治疗的小鼠中人类T细胞的频率显著较低(图25E-F)。
实施例19：118BA#3变体的体内比较
将表达EGFP的MOLM-13AML细胞异种移植至外周血单核细胞(PBMC)人源化小鼠模型中，所述模型不会发生GvHD，从而允许长期存活研究和抗白血病T细胞活性(图26A)。每周用0.1mg/kg或0.5mg/kg剂量的118BA#3变体(即，3A、3B和3C)治疗异种移植的小鼠3次，持续2周。当体重减轻20％和/或发生后腿麻痹时处死小鼠。通过流式细胞术追踪人类T细胞和EGFP-MOLM的外周血频率。
在体内比较118BA#3中影响结合亲和力和可制造性的变体，以确定每种变体如何影响针对AML的细胞毒性。与未治疗的对照小鼠相比，所有变体都改善存活率并且在0.1mg/kg的剂量下功效是类似的(图26B)。在0.5mg/kg的剂量下，除3C之外的所有变体都导致存活率相对于较低剂量有所降低(图26B)。两种剂量的118BA#3变体之间的平均T细胞频率似乎是类似的(图26C)。相较于其它变体，0.5mg/kg的118BA#3C表现出存活率的显著改善。
实施例20：制备本文所描述的人源化抗体的方法
为了产生本文所描述的人源化抗体和单链可变片段，使用以下方法。
材料和方法
可变结构域分析和CDR识别
出于识别CDR并分析最接近匹配的种系序列的目的，使用IMG T Domain Gapalign工具：http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi。
分子建模
使用软件基于与先前公布的抗体晶体结构的同源性为VH和VL结构域建立分子模型。
基因合成与克隆
可变重结构域和可变轻结构域(对于FLT3)在5'和3'末端设计有适当的限制性位点，以便能够克隆至Absolute Antibody克隆和表达载体中。将可变结构域序列针对在人类细胞中的表达进行密码子优化。基因合成后，将可变结构域克隆至适当物种和类型的Absolute Antibody载体中。通过桑格测序(Sanger sequencing)并使用DNASTARLasergene软件分析原始数据来验证正确的序列。一旦确认，就进行适当大小的质粒DNA制备，以产生足够数量的高质量DNA用于转染。
表达和纯化
一旦产生质粒，就将CHO(中国仓鼠卵巢)哺乳动物细胞传代至瞬时转染的最佳阶段。用重链和轻链表达载体瞬时转染细胞并再培养6天。通过以4000rpm离心收获培养物并通过0.22μM过滤器过滤。通过蛋白A亲和色谱法进行纯化的第一步，其中使用柠檬酸盐pH3.0缓冲液洗脱，然后用0.5M Tris(pH 9.0)中和。然后使用脱盐柱将洗脱的蛋白质经缓冲液交换至PBS中。通过UV光谱法确定抗体浓度并根据需要浓缩抗体。
抗体分析
通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)和HPLC(高效液相色谱法)确定抗体纯度。在Agilent 1100系列仪器上使用适当的尺寸排阻柱(SEC)进行SEC-HPLC。通过蛋白A HPLC确定抗体表达滴度。
鼠类抗FLT3的人源化
序列分析
将使用美国专利公布号20190389955(其全部内容通过引用并入本文)中描述的方法产生的1-18BA的VH和VL序列(本文所描述的人源化1-18BA抗体的鼠类型式，在美国专利公布号20190389955中公开)通过IGMT Gap Align工具运行，以针对所有已知的抗体种系序列进行分析。使用IMGT定义对CDR区域进行分配。序列与小鼠的比对最为清晰，特别是VH的IGHV8-8家族和VL的IGKV9-124。
分子建模
为了能够实现结构引导的人源化，为1-18BA鼠类VH和VL序列建立模型。
种系选择
将VH和VL序列与人类种系序列的Absolute Antibody数据库进行比对。
CDR移植
为了使抗体人源化，通过CDR移植算法运行VH和VL序列，以将CDR从鼠类抗体1-18BA转移至所选人类种系序列上。尽管CDR被定义为主要负责与抗原结合，但这些区域之外的氨基酸(即，所谓的框架区)可能直接参与结合或在正确定位CDR中发挥作用。使用结构引导的方法来确定哪些框架氨基酸保留在原始小鼠氨基酸中，以保持结合完整性。
序列责任分析
为了确保人源化序列中没有引入极不需要的序列责任，通过Absolute Antibody序列责任工具运行原始小鼠和人源化序列。
抗体产生和分析
抗体克隆
如上文所描述，总共设计了4条人源化重链和3条人源化轻链。这些链中的每一者都是单独合成的，并且克隆为人类IgG1和scFv。在转染时，对人源化序列进行所有可能的组合，以产生总共12种不同的人源化IgG和12种人源化scFv。
抗体表达和纯化
所有抗体都以小规模表达，然后通过蛋白A或镍色谱法纯化蛋白质。所有纯化产物在非还原和还原SDS-PAGE下看似都符合预期。
聚集分析
通过SEC-HPLC分析纯化的IgG的聚集和片段化。所选抗体显示大于95％的单体纯度。
鼠类抗CD3的人源化
序列分析
将SP34的VH和VL序列(本文所描述的人源化抗CD3抗体的鼠类型式，在Pessano等,1985,EMBO J.4(2):337-344中公开)通过IGMT Gap Align工具运行，以分析所有已知的抗体种系序列。使用IMGT定义对CDR区域进行分配。序列与小鼠的比对最为清晰，特别是VH的IGHV10-1家族和VL的IGLV1。
分子建模
为了能够实现结构引导的人源化，为SP34鼠类VH和VL序列建立模型。
种系选择
将VH和VL序列与人类种系序列的Absolute Antibody数据库进行比对。
CDR移植
为了使抗体人源化，通过CDR移植算法运行VH和VL序列，以将CDR从鼠类抗体SP34转移至所选人类种系序列上。尽管CDR被定义为主要负责与抗原结合，但这些区域之外的氨基酸(即，所谓的框架区)可能直接参与结合或在正确定位CDR中发挥作用。使用结构引导的方法来确定哪些框架氨基酸保留在原始小鼠氨基酸中，以保持结合完整性。
序列责任分析
为了确保人源化序列中没有引入极不需要的序列责任，通过Absolute Antibody序列责任工具运行原始小鼠和人源化序列。
抗体产生和分析
抗体克隆
如上文所描述，总共设计了4条人源化重链和3条人源化轻链。这些链中的每一者都是单独合成的，并且分别克隆至人类IgG1重链和人类λ轻链表达载体中。在转染时，对人源化序列进行所有可能的组合，以产生总共12种不同的人源化抗体。
抗体表达和纯化
所有抗体都以小规模表达，然后通过蛋白A或镍色谱法纯化蛋白质。所有纯化产物在非还原和还原SDS-PAGE下看似都符合预期。
聚集分析
通过SEC-HPLC分析纯化的抗体的聚集和片段化。
诱变
抗体诱变的方法是本领域中众所周知的。
实施例21：表位定位
通过氢交换质谱法(HDXMS)对1B11sL3-1(分别包含SEQ ID NO:97和98的VH和VL)和1-18BAC1(分别包含SEQ ID NO:10和9的VH和VL)(两者都是人源化全长抗体)进行人类FLT-3的表位定位。(参见Balasubramaniam等,Biochem.2015年3月3日；54(8):1673-1680；和Coales等,Rapid Commun.Mass Spectrom.2009年3月；23(5):639-47)。结果示于图27-30中。对于1B11sL3-1：在Flt3中的残基ALRPQSSGTVYEAAAVEVDVS(41-60)(SEQ ID NO:94)和MTETQAGEY(107-115)(SEQ ID NO:95)处观察到与1B11sL3-1结合后氘摄取减少。对于1-18BAC1：在Flt-3中的残基ALRPQSSG TVYEAAAVEVDVS(41-60)(SEQ ID NO:94)、MTETQAGEY(107-115)(SEQ ID NO:95)和FTVSIRNTL(131-138)(SEQ ID NO:96)处观察到与1-18BAC1结合后氘摄取减少。
序列表
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Claims (99)

1.一种结合至人类FLT3和人类CD3的双特异性人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含：
(i)第一轻链可变区(VL1)，所述第一轻链可变区包含VL1互补决定区(CDR)1、VL1 CDR2和VL1 CDR3，所述VL1 CDR1、VL1CDR2和VL1 CDR3是包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的CDR；和/或
(ii)第一重链可变区(VH1)，所述第一重链可变区包含VH1互补决定区(CDR)1、VH1CDR2和VH1 CDR3，所述VH1 CDR1、VH1CDR2和VH1 CDR3是包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区(VH)的CDR；
其中所述VL1和所述VH1结合至人类FLT3；并且
还包含结合至人类CD3的第二VL(VL2)和第二VH(VH2)。
2.如权利要求1所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL1 CDR1包含氨基酸序列QEISGY(SEQ ID NO:31)，所述VL1 CDR2包含氨基酸序列AAS(SEQ ID NO:32)，并且所述VL1CDR3包含氨基酸序列LQYASYPLT(SEQ ID NO:37)；并且
所述VH1 CDR1包含氨基酸序列GFSLSRSTMG(SEQ ID NO:38)，所述VH1 CDR2包含氨基酸序列IKWNDSK(SEQ ID NO:39)，并且所述VH1 CDR3包含氨基酸序列ARIVYYSTYVGYFDV(SEQID NO:36)。
3.如权利要求1所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL1 CDR1包含氨基酸序列RASQEISGYLS(SEQ ID NO:71)，所述VL1 CDR2包含氨基酸序列AASTLHS(SEQ ID NO:72)，并且所述VL1 CDR3包含氨基酸序列LQYASYPLT(SEQ IDNO:37)；并且
所述VH1 CDR1包含氨基酸序列GFSLSRSTMGVG(SEQ ID NO:73)，所述VH1 CDR2包含氨基酸序列HIKWNDSKYYNPALKS(SEQ ID NO:74)，并且所述VH1 CDR3包含氨基酸序列IVYYSTYVGYFDV(SEQ ID NO:75)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
(iii)所述VL2包含VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3，所述VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2CDR3是包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL的CDR：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:29；并且
(iv)所述VH2包含VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3，所述VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2CDR3是包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH的CDR：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22；
其中所述VL2和所述VH2结合至人类CD3。
5.如权利要求4所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL2 CDR1包含TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列，所述VL2 CDR2包含GTN(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列，并且所述VL2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)、ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)和ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)；并且
所述VH2 CDR1包含GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列，所述VH2 CDR2包含IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列，并且所述VH2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:83)、HGNFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:84)、HGHFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:85)、HGMFG TSYVSWFAY(SEQ ID NO:86)和HGQFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:87)。
6.如权利要求4所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL2 CDR1包含GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:76)的氨基酸序列，所述VL2 CDR2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列:GTNKRSS(SEQ ID NO:77)、GTNKRVS(SEQ ID NO:78)和GTNKRSS(SEQ ID NO:79)和GTNKRAS(SEQ ID NO:80)；以及所述VL2 CDR3；并且所述VL2CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)、ALWFSNHWV(SEQID NO:46)和ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)；并且
所述VH2 CDR1包含GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:81)的氨基酸序列，所述VH2 CDR2包含RIRSKYNNYATYYADSVKG(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列，并且所述VH2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:83)、HGN FGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:84)、HGHFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:85)、HGMFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:86)和HGQFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:87)。
7.如权利要求4所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VL的CDR，并且/或者所述VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)，所述VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)，并且所述VL2 CDR3包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)；并且
所述VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH的CDR，并且/或者所述VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)，所述VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)，并且所述VH2 CDR3包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:83)。
8.如权利要求4所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VL的CDR，并且/或者所述VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)，所述VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)，并且所述VL CDR3包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:42)；并且
所述VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH的CDR，并且/或者所述VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)，所述VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)，并且所述VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGNFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:48)。
9.如权利要求4所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL的CDR，并且/或者所述VL2CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)，所述VL2CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)，并且所述VL CDR3包含氨基酸序列ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)；并且
所述VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH的CDR，并且/或者所述VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)，所述VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)，并且所述VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGNFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:45)。
10.如权利要求4所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL的CDR，并且/或者所述VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)，所述VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)，并且所述VL CDR3包含氨基酸序列ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)；并且
所述VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH的CDR，并且/或者所述VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)，所述VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)，并且所述VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGHFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:49)。
11.如权利要求4所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL的CDR，并且/或者所述VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)，所述VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)，并且所述VL CDR3包含氨基酸序列ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)；并且
所述VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH的CDR，并且/或者所述VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)，所述VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)，并且所述VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGMFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:50)。
12.如权利要求4所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL的CDR，并且/或者所述VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)，所述VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)，并且所述VL CDR3包含氨基酸序列ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)；并且
所述VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH的CDR，并且/或者所述VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)，所述VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)，并且所述VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGQFGTSYVSWFAY(SEQ ID NO:51)。
13.如权利要求4所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3是包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL的CDR，并且/或者所述VL2CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)，所述VL2CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)，并且所述VL CDR3包含氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)；并且
所述VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3是包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH的CDR，并且/或者所述VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)，所述VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)，并且所述VH2 CDR3包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:45)。
14.一种结合至人类FLT3和人类CD3的双特异性人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含：
VL2，所述VL2包含VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2 CDR3，所述VL2 CDR1、VL2 CDR2和VL2CDR3是包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL的CDR：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:24和SEQ ID NO:29；和
VH2，所述VH2包含VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2 CDR3，所述VH2 CDR1、VH2 CDR2和VH2CDR3是包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH的CDR：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22；
其中所述VL2和所述VH2结合至人类CD3；并且
还包含结合至人类FLT3的VL1和VH1。
15.如权利要求14所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
所述VL2 CDR1包含氨基酸序列TGAVTTSNY(SEQ ID NO:40)，所述VL2 CDR2包含氨基酸序列GTN(SEQ ID NO:41)，并且所述VL2CDR3包含氨基酸序列ALWFSNHWV(SEQ ID NO:46)或ALWYSNHWV(SEQ ID NO:47)；并且
所述VH2 CDR1包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:43)，所述VH2 CDR2包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:44)，并且所述VH2 CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：VRHGNFGTSYVSFAY(SEQ ID NO:48)、VRHGHFGTSYVSFAY(SEQ ID NO:49)、VRHGMFGTSYVSFAY(SEQ ID NO:50)和VRHGQFGTSYVSFAY(SEQ ID NO:51)。
16.如权利要求1-15中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述VL1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
17.如权利要求1-16中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述VH1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
18.如权利要求1-17中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，所述抗体或片段包含单链可变片段(scFv)，其中所述scFv包含所述VL1和所述VH1，并且其中所述scFv包含SEQID NO:52的氨基酸序列。
19.如权利要求1-18中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述抗体或片段包含重链(HC)和轻链(LC)，其中所述HC包含所述VL1、所述VH1和所述VH2。
20.如权利要求19所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述VL1通过第一接头连接至所述VH1，并且其中所述VH1通过第二接头连接至所述VH2；任选地，其中所述VL1的C末端通过第一接头连接至所述VH1的N末端，并且其中所述VH1的C末端通过第二接头连接至所述VH2的N末端。
21.如权利要求20所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述第一接头和所述第二接头具有式(Gly3-4-Ser)1-4。
22.如权利要求21所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述第一接头具有式(Gly4-Ser)4。
23.如权利要求21或22所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述第二接头具有式(Gly4-Ser)3。
24.如权利要求19所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述HC包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQID NO:57。
25.如权利要求24所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述HC包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
26.如权利要求24所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述HC包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
27.如权利要求24所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述HC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
28.如权利要求24所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述HC包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
29.如权利要求24所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述HC包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
30.如权利要求19-29中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述LC包含所述VH2。
31.如权利要求30所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述LC包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:29。
32.如权利要求31所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述LC包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
33.如权利要求31所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述LC包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
34.如权利要求31所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述LC包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
35.如权利要求31所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述LC包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
36.如权利要求31所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述LC包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
37.一种结合至人类FLT3和人类CD3的双特异性人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含：
(i)第一轻链可变区(VL1)，其中所述VL1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和/或
(ii)第一重链可变区(VH1)，其中所述VH1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
其中所述VL1和所述VH1结合至人类FLT3；并且
还包含结合至人类CD3的第二轻链可变区(VL2)和第二重链可变区(VH2)。
38.如权利要求37所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述VL1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述VH1具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
39.如权利要求37所述的双特异性人源化抗体或片段，所述抗体或片段包含单链可变片段(scFv)，其中所述scFv包含所述VL1和所述VH1，并且其中所述scFv包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
40.如权利要求37-39中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，其中：
(iii)所述VL2包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列；并且
(iv)所述VH2包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
41.如权利要求40所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述VL2具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且所述VH2具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
42.如权利要求40所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述VL2具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述VH2具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
43.一种结合至人类FLT3和人类CD3的双特异性人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含：
(i)VL1，所述VL1包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列；和
(ii)VH1，所述VH1包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
其中所述VL1和所述VH1结合至人类CD3；并且
还包含结合至人类FLT3的VL2和VH2。
44.如权利要求43所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述VL1具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且所述VH1具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
45.如权利要求43所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述VL1具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述VH1具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
46.如权利要求37-45中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述抗体或片段包含重链(HC)和轻链(LC)。
47.如权利要求19-36和46中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述LC包含恒定结构域。
48.如权利要求47所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述恒定结构域包含SEQID NO:58的氨基酸序列。
49.如权利要求19-36和46-48中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述HC包含Fc区。
50.如权利要求49所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述Fc区是IgG。
51.如权利要求50所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述IgG是人类IgG1、人类IgG2、人类IgG3或人类IgG4。
52.如权利要求49所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述Fc区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
53.如权利要求49所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述Fc区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
54.如权利要求1或4所述的双特异性人源化抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC。
55.如权利要求1或4所述的双特异性人源化抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC和含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC。
56.如权利要求1或4所述的双特异性人源化抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LC和含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC。
57.如权利要求1或4所述的双特异性人源化抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC和含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC。
58.如权利要求1或4所述的双特异性人源化抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:17氨基酸序列的LC和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HC。
59.如权利要求1或4所述的双特异性人源化抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HC。
60.如权利要求1或4所述的双特异性人源化抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:17氨基酸序列的LC和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HC。
61.如权利要求1或4所述的双特异性人源化抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LC和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HC。
62.如权利要求1或4所述的双特异性人源化抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的LC和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HC。
63.如权利要求1-62中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，所述抗体或片段是单克隆抗体。
64.如权利要求1-63中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述抗体或片段是纯化的。
65.如权利要求1-64中任一项所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述抗体或片段在人体中的半衰期为1天至14天。
66.如权利要求65所述的双特异性人源化抗体或片段，其中所述抗体或片段在人体中的半衰期为4天至7天。
67.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1-66中任一项所述的抗体或片段和药学上可接受的赋形剂。
68.如权利要求67所述的药物组合物，所述药物组合物还包含抗肿瘤剂。
69.一种治疗有需要的受试者的血液癌症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的：(i)权利要求1-66中任一项所述的抗体或片段，或(ii)权利要求67或68所述的药物组合物。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述血液癌症是急性髓系白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性髓系白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤、非恶性遗传性或获得性骨髓病症、多发性骨髓瘤、树突状细胞肿瘤或母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述血液癌症是AML。
72.如权利要求69所述的方法，其中所述血液癌症是树突状细胞肿瘤。
73.如权利要求69所述的方法，其中所述血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)。
74.如权利要求69所述的方法，其中所述血液癌症是非恶性遗传性或获得性骨髓病症，并且其中所述非恶性遗传性或获得性骨髓病症选自镰状贫血、重型β-地中海贫血、难治性戴蒙德-布莱克凡贫血、骨髓增生异常综合征、特发性严重再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、纯红细胞再生障碍、范可尼贫血、无巨核细胞增多症或先天性血小板减少症。
75.一种准备或调理有需要的受试者用于造血细胞移植的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的：(i)权利要求1-66中任一项所述的抗体或片段，或(ii)权利要求67或68所述的药物组合物；并且其中所述施用在所述造血细胞移植之前进行。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述治疗有效量使表达CD34、FLT3、CD33、CD11b、CD16、CD15和CD66b中的一者或多者的细胞群体减少至少90％。
77.如权利要求75所述的方法，其中所述治疗有效量使表达FLT3和CD34的细胞群体减少至少90％。
78.如权利要求75和77中任一项所述的方法，其中有需要的所述受试者患有血液癌症。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述血液癌症是急性髓系白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性髓系白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤、非恶性遗传性或获得性骨髓病症、多发性骨髓瘤、树突状细胞肿瘤或母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)。
80.如权利要求78所述的方法，其中所述血液癌症是AML。
81.如权利要求78所述的方法，其中所述血液癌症是树突状细胞肿瘤。
82.如权利要求78所述的方法，其中所述血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)。
83.如权利要求78所述的方法，其中所述血液癌症是非恶性遗传性或获得性骨髓病症，并且其中所述非恶性遗传性或获得性骨髓病症选自镰状贫血、重型β-地中海贫血、难治性戴蒙德-布莱克凡贫血、骨髓增生异常综合征、特发性严重再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、纯红细胞再生障碍、范可尼贫血、无巨核细胞增多症或先天性血小板减少症。
84.如权利要求75-83中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述施用后对所述受试者进行造血细胞移植。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述造血细胞移植包括向所述受试者移植造血干细胞和/或造血祖细胞。
86.如权利要求84或85所述的方法，其中所述造血细胞移植在所述施用后5天至5周进行。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述造血细胞移植在所述施用后约2至3周进行。
88.如权利要求69-87中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是约0.01mg/kg至约2mg/kg的所述抗体或片段的量。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述治疗有效量是约0.1mg/kg至约0.3mg/kg的所述抗体或片段的量。
90.如权利要求69-89中任一项所述的方法，其中所述施用是单剂量一次。
91.如权利要求69-89中任一项所述的方法，其中所述施用是每1-14天一次，持续约1至4周。
92.如权利要求69-89中任一项所述的方法，其中所述施用是每3-7天一次，持续2至3周。
93.如权利要求69-92中任一项所述的方法，其中所述施用是静脉内施用。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述静脉内施用是通过输注至所述受试者中。
95.如权利要求69-94中任一项所述的方法，所述方法还包括施用检查点抑制剂。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD1拮抗剂、抗PD-L1拮抗剂和/或抗CTLA4拮抗剂。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD1抗体。
98.如权利要求95-97中任一项所述的方法，其中所述施用与所述检查点抑制剂的所述施用同时或之后进行。
99.如权利要求69-98中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
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