CN118103060A - 包括hla融合蛋白的组合药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗癌症的组合药物，其包括(人白细胞抗原)可溶性HLA重链多肽、以及CD47与信号调节蛋白SIRPα之间相互作用的抑制剂。本发明的进一步方面涉及CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其用于接受根据本发明的可溶性HLA重链多肽治疗的患者。
Description
技术领域
本发明要求2021年8月5日提交的欧洲专利申请EP21190003.0的优先权，其通过引用完全并入本文。
本发明涉及用于诊断患有癌症的患者的组合药物，所述癌症在本文中也称为恶性肿瘤性疾病。根据本发明的组合药物包括可溶性HLA(人白细胞抗原)重链多肽和CD47与信号调节蛋白α(SIRPα)之间相互作用的抑制剂。
背景技术
肿瘤微环境含有大量巨噬细胞，其可形成高达50％的肿瘤质量。重要的是，巨噬细胞进行免疫监视。因此，先天免疫和肿瘤相关巨噬细胞作为先天免疫治疗的靶标逐渐引起注意。然而，在肿瘤和巨噬细胞之间存在复杂的关系，在一些情况下，这实际上可以促进肿瘤生长或转移。
巨噬细胞的双重作用显示源自它们的巨大异质性和可塑性。巨噬细胞可大致分为二大类：1型或经典活化的(M1)、以及2型或替代活化的(M2)。在体外，M1细胞特征在于促炎表型并显示杀微生物活性，其导致肿瘤抑制，而M2巨噬细胞可促进组织修复、基质重塑和支持肿瘤发生的血管生成。不同的巨噬细胞表型具有不同的吞噬活性。在癌症的情况下，巨噬细胞快速检测肿瘤细胞上的膜分子，并能够通过吞噬作用吞没肿瘤细胞，吞噬作用是一种多步骤的细胞过程，包括靶细胞识别、细胞吞没、和溶酶体消化，由靶细胞和吞噬细胞之间的受体－配体相互作用调节。已经鉴定了存在于癌细胞中的多种抗吞噬信号，包含LILRB1和LILRB2。白细胞Ig样受体亚家族B(LILRB)是一组I型跨膜糖蛋白，其具有结合配体的胞外Ig样结构域和可招募酪氨酸磷酸酶SHP-1、SHP-2和肌醇磷酸酶SHIP的胞内ITIM。
巨噬细胞表达LILRB1和LILRB2受体，这些受体的激活下调肿瘤微环境中的巨噬细胞活性。使用体外模型，免疫细胞中LILRB1阻断已证明在实体癌和液体癌中有效。LILRB1信号传导，例如，可抑制单核细胞活化和巨噬细胞吞噬作用(Colonna M.etal.1997J.Exp.Med.186(1):1809)。LILRB2阻断将TAM重新编程为促炎表型，抑制T调节细胞浸润，并促进免疫检查点抑制剂的功效。此外，阻断LILRB2抑制受体介导的SHP-1/SHP-2的激活，并增强促炎反应(Alsina-Beauchamp D.et al.2018,J.Clin.Invest.128(12):5647)。
免疫治疗剂已经开发了基于人白细胞抗原(HLA)重链的分子，其结合LILRB1、LILRB2和KIR3DL1受体(参见例如WO2017153438A1)。
基于上述现有技术，本发明的目的是提供增强治疗性的基于HLA重链的分子的抗肿瘤效果的手段和方法。这个目的通过本说明书的独立权利要求的主题以及在本说明书的从属权利要求、实施例、附图和一般说明书中描述的进一步的有利实施方式来实现。
发明内容
抑制性CD47结合SIRPα的相互作用抑制吞噬作用，并且可以被结合CD47或SIRPα的检查点抑制剂靶向以改善免疫结果。本发明人以前开发的阻断性LILRB1/2免疫检查点抑制剂的HLA I类重链融合蛋白共有调节吞噬作用检查点的能力。本发明人设计了实验来评估抑制CD47与SIRPα结合的试剂是否能增强HLA融合蛋白对肿瘤细胞的巨噬细胞吞噬作用的促炎作用(图1)。结果证明，作为单一疗法，特别是与抗CD47和抗SIRP抗体组合，候选HLA融合蛋白iosH2增加人原代巨噬细胞针对实体癌和液体癌的吞噬活性。
本发明的第一方面涉及组合药物，所述组合包括：
1.可溶性I类MHC HLA重链多肽，其可选地通过与赋予增强的体内稳定性的多肽部分融合而稳定；和
2.CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂。
在特定实施方式中，可溶性HLA重链多肽作为HLA融合蛋白提供，其包括与免疫球蛋白可结晶片段(Ig Fc)多肽连接的HLA重链多肽(HLA重链的胞外结构域)。在组合药物的更特定实施方式中，HLA重链多肽选自HLA-B57、HLA-C08、HLA-A25、HLA-B58、HLA-B27、HLA-A30、HLA-B53、或HLA-C12。在其他特定实施方式中，所述HLA重链多肽是至少(≥)95％序列相似于如上定义的HLA重链的变体，具有相似的生物活性。
在某些特定实施方式中，HLA融合蛋白与β2微球蛋白(β2m)多肽结合。
另一方面涉及根据本发明的组合药物在治疗癌症，特别是实体瘤(恶性肿瘤疾病)中的用途。
本发明的另一方面涉及CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，当先于、组合于、或后于可溶性HLA重链多肽施用时，用于治疗癌症(本文中也称为恶性肿瘤疾病)，所述可溶性HLA重链多肽可选地通过与赋予增强的体内稳定性的多肽部分，特别是HLA融合蛋白，融合而稳定，如本文所述。
本发明的又另一方面涉及一种可溶性HLA重链多肽，其可选地通过与赋予增强的体内稳定性的多肽部分融合而稳定，当先于、组合于、或后于如本文所定义的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂施用时，用于治疗癌症，特别是实体瘤(恶性肿瘤疾病)。
术语和定义
为了解释本说明书，将应用以下定义，并且在任何适当的时候，以单数使用的术语也将包含复数，反之亦然。在以下阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文献冲突的情况下，将以所阐述的定义为准。
如本文所用，术语“包括”、“具有”、“含有”、和“包含”，以及其他类似形式及其语法等同形式旨在在含义上等效并且是开放式的，因为这些词语中的任一个之后的一个或多个项目并不意味着是这一个或多个项目的详尽列表，或者意味着仅限于所列出的一个或多个项目。例如，“包括”组分A、B、和C的物可由组分A、B、和C组成(即，仅含有)，或者可不仅含有组分A、B、和C，而且可包括一或更多个其他组分。因此，意图并理解的是，“包括”及其类似形式及其语法等同形式包含“基本上由……组成”或“由……组成”的实施方式的公开。
在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文另外明确规定，否则在所述范围的上限与下限之间的到下限的单位的十分之一的每一中间值，和在所述范围中的任意其他陈述的，或中间值涵盖在本发明内，但受所述范围中的任何特定排除的限制。在所述范围包含一个或二个限值的情况下，排除那些所包含的限值中的任一个或二个的范围也包含在本公开中。
本文提及的“约”值或参数包含(且描述)涉及该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包含“X”的描述。
如本文所用，包含在所附权利要求中，单数形式“一”、“或”和“所述”包含复数指代物，除非上下文另外清楚地指明。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)普通技术人员通常理解的相同的含义。标准技术使用于分子、遗传和生物化学方法(一般见Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,4th ed.(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology(2002)5th Ed,John Wiley&Sons,Inc.)以及化学方法。
在本说明书的上下文中，术语多肽涉及由50个或更多个氨基酸组成的分子，其形成直链，其中氨基酸通过肽键连接。多肽的氨基酸序列可以代表整个(如生理学上发现的)蛋白质或其片段的氨基酸序列。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且包含蛋白质及其片段。多肽在本文中公开为氨基酸残基序列。
氨基酸残基序列从氨基到羧基末端给出。序列位置的大写字母指单字母代码的L-氨基酸(Stryer,Biochemistry,3rd ed.p.21)。氨基酸序列位置的小写字母指相应的D-或(2R)-氨基酸。序列以从氨基到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列用三字母或单字母代码表示，如下所示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile、I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、和缬氨酸(Val，V)。
术语基因表达或表达，或者术语基因产物，可以指核酸(RNA)的产生或肽或多肽的产生，也分别称为转录和翻译，的过程——和其产物——中的一者、或二者，或调节遗传信息的加工以产生多肽产物的任何中间过程。术语基因表达也可应用于RNA基因产物，例如调节RNA或结构RNA(例如核糖体RNA)，的转录和加工。如果表达的多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包含在真核细胞中mRNA的剪接。表达可以在转录和翻译水平上，换句话说，mRNA和/或蛋白质产物上，进行测定。
在本说明书的上下文中，术语序列同一性，序列相似性和序列同一性百分比是指代表通过逐个位置比较2个比对的多肽序列确定的序列比较结果的单一定量参数。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列排列可以通过Smith和Waterman,Adv.App.Math.2:482(1981)的局部同源算法、Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的全局排列算法、Pearson-Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.85:2444(1988)的搜索相似性方法，或这些算法的计算机化实施，包含但不限于：CLUSTAL、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。进行BLAST分析的软件是公众可获得的，例如通过国家生物技术信息中心(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。
用于氨基酸序列比较的一个实例是BLASTP算法，其使用默认设置：期望阈值：10；字长：3；查询范围中的最大匹配：0；矩阵：BLOSUM62；空位成本：存在11，延伸1；组成校正：条件组合分数矩阵调整。除非另有说明，本文提供的序列同一性值是指使用BLAST程序套件(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403–410(1990))用上述指明的默认参数用于蛋白质得到的值。
提及相同序列而没有指定百分比值暗示100％相同的序列(即相同序列)。
如本文所用，术语药物组合物是指可溶性HLA重链，特别是HLA融合蛋白，和或CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，以及至少一种药学可接受载体。在某些实施方式中，根据本发明的药物组合物以适于肠胃外给药，特别是可注射给药的形式提供。
如本文所用，术语药学上可接受的载体包含本领域技术人员已知的任何溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合(参见例如Remington:the Science and Practice of Pharmacy，ISBN0857110624)。
如本文所用，术语治疗或治疗任何疾病或病症(例如癌症)是指，在一实施方式中，改善疾病或病症(例如减缓或阻止或减少疾病、或其至少一种临床症状的发展，例如减缓或减少肿瘤生长)。在另一实施方式中，“治疗”或“治疗”是指减轻或改善至少一种身体参数，包含患者可能无法辨别的那些。在又另一实施方式中，“治疗”或“治疗”是指在身体上(例如，可辨别症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)、或在二者上调节疾病或病症。除非下文具体描述，否则评估疾病的治疗和/或预防的方法通常是本领域已知的。
术语“癌症”和“恶性肿瘤疾病”在本文中同义使用。本文公开的任何方面和实施方式的具体替代方式涉及本发明的组合在实体瘤治疗中的用途。本文公开的任何方面和实施方式的其他替代方式涉及本发明的组合在治疗液体癌中的用途，所述液体癌例如骨髓性或粒细胞白血病，特别是AML、淋巴细胞、或成淋巴细胞性白血病和淋巴瘤、真性红细胞增多症或红细胞血症。
在本说明书的上下文中，术语肽接头、或氨基酸接头是指用于连接二个多肽以产生单链多肽的可变长度的多肽。用于实施本文指定的本发明的接头的示例性实施方式是由1、2、3、4、5、10、20、30、40或50个氨基酸组成的寡肽链。氨基酸接头的非限制性实例是多肽GGGGSGGGGS(SEQ ID NO 003)，其将HLA重链多肽与稳定肽连接，例如，在HLA融合蛋白中将HLA-B57与IgG4 Fc多肽连接。
在本说明书的上下文中，术语人白细胞抗原(HLA)重链、HLA重链涉及由I类主要组织相容性(MHC)抗原基因，特别是经典的MHC1a类重链编码的蛋白质。在人类中，HLA重链可为单体，或形成包括具有非共价地结合至β2m轻链的三个胞外结构域(α1、α2、和α3)的重链的二聚体结构的一部分，或可选地，其中小肽在肽结合裂隙处缔合的三聚体结构。全长HLA重链多肽包括包括有α1、α2、和α3结构域的，胞外结构域、跨膜结构域、和胞内结构域。
被认为是根据本发明这一方面的术语的实施方式的天然存在的HLA重链的列表列于表1中。
表1：HLA重链等位基因列表
在本说明书的上下文中，术语变体涉及HLA重链多肽序列，其具有至少一个不同于天然存在的多肽序列的氨基酸残基的多肽。例如，变体HLA重链多肽，其中已经引入一个、或几个氨基酸取代，使得它不同于其来源的原始的、天然存在的HLA重链多肽序列。变体HLA重链多肽的特征在于与其来源的HLA重链的的天然存在的胞外结构域相比，至少(≥)95％，特别是≥98％的序列相似性。此外，改变的氨基酸不妨碍变体HLA重链与其配体相互作用的能力，使得变体具有与其来源的原始序列相似的生物活性。
变体HLA重链肽的生物活性可在掺入根据本发明的HLA融合蛋白的情况下评估，特别是通过测量结合配体LILRB2的能力。变体的相似的生物活性定义为，如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法所测量的，与等同的非变体序列相比，HLA融合蛋白中使用的变体HLA重链多肽结合LILRB2的能力的至少65％，特别是85％，或甚至95％。这可通过计算EC50来评估，即产生半数最大反应的融合蛋白的浓度，在这种情况下，半数最大反应是与生物素化LILRB2分子的结合。例如，对于在实施例中评估的变体HLA-B57重链－IgG4融合蛋白(图3)，基于等同非变体野生型HLA-B57的结构与LILRB2结合的EC50为21nM(纳摩尔/升)。因此，通过ELISA测量的具有大约65％生物功能的合适变体的EC50阈值为大约32nM，85％为大约29nM，且95％为大约22nM。
为了测定根据本发明的与LILRB2结合的EC50，用50μl在PBS缓冲液中的终浓度为5μg/ml的C端生物素化LILRB2(例如，从BPS Bioscience#100335获得)包被链霉亲和素蛋白包被的高结合容量96孔板。PBS和IgG同种型可用作阴性对照。HLA融合蛋白的系列稀释以滴定系列(例如，八个浓度点：10、2.5、1、0.25、0.1、0.025、0.01、0.0025μg/ml)应用，优选以50μl一式二份应用。然后，可以应用可检测融合蛋白的标记抗体(例如，在TBS 50μl中1∶100稀释的APC缀合的山羊抗人IgG抗体(Jackson Immuno Research#109-135-098))来检测HLA融合蛋白结合。最后，50μl TBS被加入到每个孔中，并在适当的波长(例如分别为650nm&660nm)下测量荧光激发和发射。基于三参数的log(激动剂)模型是一种确定结合LILRB2的HLA融合蛋白的EC50的合适手段。
在本说明书的上下文中，术语胞外结构域，当应用于HLA重链、或HLA重链的变体时，是指HLA重链蛋白(或其中氨基酸取代已经被引入天然存在的HLA重链蛋白序列的变体蛋白)的胞外部分。1a类HLA多肽的胞外部分包括α1结构域、α2结构域、和α3结构域，其对于介导根据本发明的用于所述用途的药物组合物中HLA融合蛋白的免疫调节效应的受体配体相互作用是必需的。胞外结构域不包括跨膜结构域、和胞内结构域。
在本说明书的上下文中，术语HLA融合蛋白指包括HLA重链的胞外结构域的重组多肽，所述胞外结构域可选地通过肽接头与稳定化结构域(特别是稳定化免疫球蛋白(Ig)Fc)连接。在本发明上下文中使用的特定融合蛋白公开于PCT/EP2016/052317，公开号为WO2016124661A1；PCT/EP2017/055373，公开号为WO2017153438A1；和PCT/EP2017/070255，公开为WO2018029284A1，所有这些文献通过引用并入本文。术语HLA融合蛋白涵盖与哺乳动物细胞培养物分泌的β2微球蛋白多肽复合的HLA融合蛋白，以及不与β2微球蛋白缔合的纯化的HLA融合蛋白。术语HLA融合蛋白可以指包括与单个稳定免疫球蛋白(Ig)Fc结构域连接的单个HLA多肽的单体，或通过第一HLA融合蛋白单体、和第二HLA融合蛋白单体的结合，特别是通过它们的Ig Fc结构域连接，而形成的二聚体。
在本说明书的上下文中，术语β2微球蛋白(β2m、B2m、B2M)、B2m多肽、或β2m多肽是指贝塔(β)链，也称为MHC I类异二聚体的轻链。术语β2微球蛋白首先，涵盖加工前的β2微球蛋白，其包括分泌信号，例如Uniprot P61769的序列，或序列SEQ ID NO 006，并且特别是所述蛋白的分泌后形式，其中蛋白的分泌信号部分在分泌过程中通过切割除去。
在本说明书的上下文中，术语分泌信号、分泌信号肽或信号序列是指起始多肽的开放阅读框(ORF)的N端前导序列，通常长度为约6–30个氨基酸。在罕见的情况下，分泌信号位于多肽的C端。有时将分泌信号称为靶向信号、定位信号、转运肽、前导序列、或前导肽。能够从细胞有效分泌多肽的分泌信号是本领域公知的，并且可以包含在重组蛋白的ORF中以促进多肽输出到基于细胞的多肽生产系统的上清液中，从而允许从细胞上清液中纯化多肽。在编码分泌信号的mRNA翻译后，其被介导mRNA－核糖体复合物转移到内质网(ER)中的通道蛋白的胞质蛋白识别。新合成的包括分泌信号肽的多肽通过通道蛋白易位至ER腔，进入细胞分泌通路。根据本发明的特定用途的信号序列是翻译后从最终多肽产物切割的那些，例如，SEQ ID NO 004。
结合；结合配体抗体：
术语特异性结合在本发明的上下文中是指配体以一定亲和力和靶标特异性结合其靶的特性。这种配体的亲和力由配体的解离常数表示。特异性反应性配体，当其结合至靶标时，具有≤10-7mol/L的解离常数，但在与具有与靶标总体相似的化学组成但具有不同的三维结构的分子相互作用中，具有高至少三个数量级的解离常数。
在本说明书的上下文中，术语解离常数(KD)以其在化学和物理学领域中已知的含义使用；它是指平衡常数，其测量由[主要是二种]不同组分组成的复合物可逆地解离成其组成组分的倾向。所述复合物可为例如由抗体Ab和抗原Ag组成的抗体－抗原复合物AbAg。KD以摩尔浓度[mol/l]表示，相当于[Ag]的一半结合位点被占据时的[Ab]浓度，换句话说，未结合的[Ab]浓度等于[AbAg]复合物的浓度。解离常数可以根据下式计算：
[Ab]：抗体浓度；[Ag]：抗原浓度；[AbAg]：抗体－抗原复合物浓度
在本说明书的上下文中，术语“解离速率”(Koff；[1/秒])和“结合速率”(Kon；[L/秒*mol])以其在化学和物理学领域中已知的含义使用；它们是指测量5种抗体与其靶抗原的解离(Koff)或结合(Kon)的速率常数。Koff和Kon可以使用本领域已知的方法通过实验确定。测定抗体的Koff和Kon的方法采用表面等离子体共振。这是诸如或/>系统的生物传感器系统背后的原理。它们也可用于通过使用下式确定解离常数KD：
结合速率Kon的固有上限为109L/(秒*mol)。
在本说明书的上下文中，术语抗体指完整抗体，包含但不限于G型(IgG)、A型(IgA)、D型(IgD)、E型(IgE)或M型(IgM)免疫球蛋白、其任何抗原结合片段或单链以及相关或衍生的构建体。完整抗体是包括通过二硫键相互连接的至少二条重链(H)和二条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。IgG的重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分。类似地，所述术语涵盖所谓的纳米抗体或单结构域抗体，一种由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。
在本说明书的上下文中，术语抗体样分子是指能够以高亲和力特异性结合至另一分子或靶标的分子，其中Kd≤10-8mol/l。抗体样分子与靶标结合，类似于抗体的特异性结合。术语抗体样分子涵盖重复蛋白，例如设计的锚蛋白重复蛋白(苏黎世MolecularPartners)、表现出高度特异性和高亲和力靶蛋白结合的工程化抗体模拟蛋白(参见US2012142611、US2016250341、US2016075767和US2015368302，所有这些通过引用并入本文)。术语抗体样分子还涵盖，但不限于，衍生自Armadillo重复蛋白的多肽、衍生自富含亮氨酸的重复蛋白的多肽和衍生自四肽重复蛋白的多肽。术语抗体样分子还涵盖衍生自蛋白A结构域、纤连蛋白结构域FN3、共有纤连蛋白结构域、脂质运载蛋白(参见Skerra,BiochimBiophys Acta2000,1482(1–2):337–50)、衍生自锌指蛋白的多肽(参见Kwan etal.Structure 2003，11(7):803–813)、src同源性结构域2(SH2)或src同源性结构域3(SH3)、PDZ结构域、γ-晶体蛋白、泛素、半胱氨酸结多肽或knottin、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、Sac7d、三螺旋卷曲螺旋(也称为α体)、Kunitz结构域或Kunitz型蛋白酶抑制剂和碳水化合物结合模块32-2的特异性结合多肽。
术语源自蛋白A结构域的多肽是指一种分子，其是蛋白A的衍生物，并且能够特异性结合免疫球蛋白的Fc区和Fab区。
术语armadillo重复蛋白是指包括至少一个armadillo重复的多肽，其中armadillo重复的特征在于形成发夹结构的一对α螺旋。
本说明书上下文中的术语人源化骆驼科抗体是指，仅由重链或重链的可变区(VHH域)组成的抗体，并且其氨基酸序列已经被修饰以增加其与在人类中天然产生的抗体的相似性，因此当施用于人时表现出降低的免疫原性。骆驼科抗体人源化的一般策略见Vinckeet al.“General strategy to humanize a camelid single-domain antibody andidentification of auniversal humanized nanobody scaffold”,J Biol Chem.2009Jan30；284(5):3273–3284、和US2011165621A1。
在本说明书的上下文中，术语免疫球蛋白可结晶片段(Fc)区、或Ig Fc是指抗体或免疫球蛋白(Ig)的一部分，其由CH2和CH3结构域组成。Ig Fc涵盖包括通过二硫键共价连接的二个Ig Fc的单体、或二聚体。在根据本发明的HLA融合蛋白中，二硫键可连接二个HLA融合蛋白分子，每个分子均包括Ig Fc域。HLA融合蛋白中Ig Fc的存在促进溶解性、稳定性、亲合力、半衰期的增加，并且从技术角度来看，促进哺乳动物系统中成本有效的生产和纯化(蛋白A或G纯化)。
在本说明书的上下文中，术语CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂涵盖能够破坏CD47与SIRPα之间的抑制性信号级联反应、限制吞噬细胞活化的任何试剂。这包含能够特异性结合CD47或SIRPα的抗体、抗体片段和抗体样分子。它还包含或可溶的重组蛋白，所述重组蛋白掺入CD47、或SIRPα的胞外配体结合结构域
术语信号调节蛋白α(SIRPα，Uniprot P78324)是指CD47的免疫球蛋白样表面受体(Uniprot Q08722)。CD47和SIRPα的连接介导吞噬作用的负调节。
具体实施方式
本发明的第一方面涉及组合药物，特别是其用于治疗癌症。所述组合药物包括：
1.可溶性HLA重链分子，其可选地被稳定为HLA融合蛋白，和
2.CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂。
在一些实施方式中，这二种药剂存在于单一药物组合物中。在其他实施方式中，所述可溶性HLA重链分子(特别是作为HLA融合蛋白提供的)被提供用于正在接受包括所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的药物的患者。换句话说，提供了一种HLA融合蛋白用于癌症患者，所述患者计划在随后的数周、或数月内，或最近在之前的数周、或数月内，接受CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂。或者，二种药剂可以以重叠剂量方案施用。
本文提及的任何根据本发明的组合药物涵盖具有相同限制的特定权利要求、项、方面或实施方式的再配制，其针对如说明书中所用的HLA重链或HLA融合蛋白，与CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂组合施用。
HLA融合蛋白
根据本发明的用于所述用途的组合药物的HLA融合蛋白组分、或根据本发明的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，包括HLA重链多肽，其是HLA重链的胞外结构域。对于药物用途，HLA重链通过与蛋白质部分融合而受益于稳定化，蛋白质部分赋予增强的药物可制造性和稳定性，和增强的血浆半衰期。在特别有利的实施方式中，本发明人发现将HLA重链连接至免疫球蛋白可结晶片段(Ig Fc)多肽可赋予这些益处。本发明进一步描述了具有IgG Fc结构域的这种融合蛋白，但是技术人员认识到，其他形式的稳定化也可以用来赋予类似的益处。
同源配体相互作用不需要的HLA重链蛋白的某些结构域，不一定包含在根据本发明的用于所述用途的组合药物中包括的HLA融合蛋白的HLA多肽部分中。在特定实施方式中，HLA重链多肽中不存在胞内结构域、和跨膜结构域。
在根据本发明的产生HLA融合蛋白、或分离的HLA融合蛋白的方法的特定实施方式中，包括在HLA融合蛋白中的变体HLA-B57多肽包含天然存在的HLA重链蛋白的α1、α2和α3结构域，其区域对于介导根据本发明的HLA融合蛋白的免疫调节效应的受体配体相互作用是必需的。
在根据本发明的产生HLA融合蛋白、或分离的HLA融合蛋白的方法的更特定实施方式中，变体HLA-B57多肽蛋白是天然存在的HLA重链蛋白的α1、α2和α3结构域，除了C端异亮氨酸－缬氨酸二肽，前面是胞外结构域的苏氨酸－缬氨酸－脯氨酸残基，在有时被注释或称为“连接肽”的跨膜结构域前面的HLA-B57区域内。
结构数据表明HLA-B57通过远离跨膜区的区域与配体如杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和白细胞免疫球蛋白样受体(LILR)相互作用。靠近膜的氨基酸通常不与受体相互作用。此外，发明人推测，天然HLA重链序列胞外结构域的5C端氨基内的高含量疏水氨基酸，可能将不期望的特性，如蛋白聚集的趋势，引入重组蛋白，这可能影响下游生产过程中的生产、纯化、稳定性和毒性。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，HLA融合蛋白组分的HLA重链胞外结构域多肽包括HLA重链蛋白序列的胞外部分的核心结构，其包括α1、α2、和α3结构域，因为这部分赋予HLA融合蛋白与靶细胞上的表面分子相互作用的能力。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的某些实施方式中，HLA融合蛋白的HLA重链多肽部分具有表1中列出的天然存在的HLA重链的胞外结构域的多肽序列。在特定实施方式中，HLA重链胞外结构域是具有免疫调节性质的天然存在的HLA重链的胞外结构域，所述免疫调节性质例如特异性结合至改变先天和适应性免疫细胞功能的调节性KIR3DL1、LILRA和LILRB1/2细胞表面蛋白。
在某些实施方式中，HLA融合蛋白的HLA重链部分源自HLA-B58的胞外结构域。在特定实施方式中，所述组合药物包括可溶性HLA重链多肽，其为具有序列SEQ ID NO 010的HLA-B58融合蛋白多肽。
在某些实施方式中，HLA融合蛋白的HLA重链部分源自HLA-A30的胞外结构域。在特定实施方式中，所述组合药物包括可溶性HLA重链多肽，其为具有序列SEQ ID NO 011的HLA-B58融合蛋白多肽。
在某些实施方式中，HLA融合蛋白的HLA重链部分衍生自、或基本上为，HLA-B27的胞外结构域。
在某些实施方式中，HLA融合蛋白的HLA重链部分衍生自、或基本上为，HLA-B44的胞外结构域。
在某些实施方式中，HLA融合蛋白的HLA重链部分衍生自、或基本上为，HLA-B81的胞外结构域。
在某些实施方式中，HLA融合蛋白的HLA重链部分衍生自、或基本上为，HLA-C08的胞外结构域。在特定实施方式中，所述组合药物包括可溶性HLA重链多肽，其为具有序列SEQID NO 009的HLA-C08融合蛋白多肽。
在进一步实施方式中，HLA融合蛋白的HLA重链部分衍生自、或基本上为，HLA-C12的胞外结构域。
在特定实施方式中，HLA融合蛋白的HLA重链部分衍生自、或基本上为，HLA-B57的胞外结构域。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的进一步实施方式中，HLA融合蛋白包括变体HLA重链胞外结构域多肽。所述变体HLA重链多肽的特征在于与HLA重链的非变体胞外结构域至少(≥)95％的序列相似性，并具有相似的生物活性(如术语相似的生物活性所定义的)。在特定实施方式中，变体HLA重链与其来源的天然存在的HLA重链胞外结构域≥98％相似。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，HLA融合蛋白与β2微球蛋白(β2m)多肽缔合。使用β2m缔合HLA融合蛋白赋予了免疫调节性HLA融合蛋白的产量提升的优点，因为产生这产物不会导致在β2m解离步骤中发生的蛋白损失(图2)。在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的一些实施方式中，β2m多肽通过肽接头连接至HLA融合蛋白。在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，β2m多肽与所述HLA融合蛋白非共价缔合。在特定实施方式中，HLA融合蛋白以3∶5至7∶5的摩尔比与β2m分子缔合。在更特定实施方式中，所述比例为4∶5至6∶5。换句话说，HLA融合蛋白和β2m多肽以1比1的比例，或接近1比1的比例存在。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，HLA融合蛋白包括变体HLA-B57重链胞外结构域多肽，其特征在于至少一个、或二个氨基酸取代，所述取代不同于天然存在的MHC1a类重链胞外结构域多肽的多肽序列。HLA-B57重链基因家族目前涵盖221种已知的具有独特核酸序列的变体，编号为HLA-B*57:01至HLA-B*57:141，编码几十种独特的蛋白序列。其蛋白质序列是已知的，并且可以例如通过将检索术语“B*57”输入欧洲生物信息学研究所免疫多态性数据库提供的MGT/HLA等位基因查询形式中来检索，Robinson J et al.2013Nucleic Acids Res.41:D1234，https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html)。在更特定实施方式中，所述HLA重链多肽是HLA-B57重链多肽序列的天然存在的胞外结构域的变体，其中进行了一个、或二个氨基酸取代，使得其特征在于位置46处的E和位置97处的R(编号从G、S、H基序指定，指示胞外结构域的起始)。换句话说，第46位的E以外的氨基酸被E取代，且/或第97位的R以外的氨基酸被R取代。这些氨基酸的编号指从起始缺乏分泌信号的分泌的HLA-B57部分的胞外结构域的G、S、H基序开始的整数指定，其具有1、2、和3号。发明人发现这些取代与所得基于变体的HLA融合蛋白与野生型序列相比的高产率相关(图2)。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，与HLA融合蛋白缔合的β2m多肽具有序列SEQ ID NO 006。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的更特定实施方式中，HLA融合蛋白的HLA重链多肽部分包括变体HLA-B57序列SEQ ID NO001。在还更特定实施方式中，HLA重链多肽基本上由序列SEQ ID NO 001组成。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的进一步特定实施方式中，HLA融合蛋白的HLA重链多肽和Ig Fc多肽通过肽接头连接。在特定实施方式中，肽接头的长度在5和20个氨基酸之间。在更特定实施方式中，这连接肽接头具有序列SEQ ID NO 003。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，HLA融合蛋白包括具有序列SEQ ID NO 005的多肽。在其他实施方式中，HLA融合蛋白还包括序列SEQ ID NO 005上游的分泌信号。在特定实施方式中，HLA融合蛋白多肽上游的分泌信号为SEQ ID NO 004。在其他实施方式中，HLA融合蛋白基本上由SEQ IDNO 004的分泌信号与SEQ ID NO 005的多肽连接组成。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的更特定实施方式中，HLA融合蛋白基本上由序列SEQ ID NO 005(包括与IgG4 Fc融合的HLA-B57的变体胞外结构域)组成，与β2m多肽缔合。
在人类细胞的内质网中表达的天然HLA分子在经历转运并在细胞表面上展示之前与肽表位相关联。认为肽与HLA类分子的结合改变了它们的构象，这可能影响与结合配偶体如LILRB1和LILRB2的相互作用。与β2m多肽缔合而不与肽表位进一步缔合的HLA-B57多肽的结合亲和力和免疫调节效应在实施例的图4中显示。在根据本发明的药物组合物的特定实施方式中，HLA多肽不与肽表位缔合。换句话说，由HLA多肽的α1和α2结构域形成的抗原结合槽、或抗原结合裂隙不与小的抗原肽结合。
HLA融合蛋白稳定连接肽
本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的HLA融合部分，还包括在表达和纯化过程中赋予稳定性的多肽。HLA融合蛋白的稳定部分的存在通过减少HLA融合蛋白的降解和寡聚化以及增加表达所述融合蛋白的细胞的生存力而增加产量和溶解度。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，HLA融合蛋白的稳定多肽是人Ig Fc多肽。Ig Fc部分也可以通过与再循环受体结合而延长分子的体内半衰期。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，HLA融合蛋白的稳定多肽是同种型IgG Fc。IgG Fc稳定肽结构域通过能够被蛋白A或G包被的表面吸收，在HLA融合蛋白的纯化过程中提供额外的优势。发明人考虑如果代替Ig Fc附着至功能性HLA多肽可提供类似益处的可能替代物可为牛血清白蛋白。本发明人的先前工作已经确定白蛋白分子，如牛血清白蛋白，也可以用作稳定多肽。还已知聚乙二醇化可以增加蛋白质在循环中的半衰期，因此是另一种可行的稳定肽。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，HLA融合蛋白包括IgG4多肽，由于其低细胞毒性，其是治疗性融合蛋白中期望的同种型。在用于所述用途的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的还更特定实施方式中，HLA融合蛋白包括具有序列SEQ ID NO 002的改变的IgG4S228P.dk分子。其特征在于IgG4铰链区中的突变，其中脯氨酸(P)取代了原始IgG4抗体第228位的丝氨酸(S)，dK表示原始IgG4序列上最后一个氨基酸赖氨酸(K)缺失。这些变化赋予IgG4形式稳定性和更低的异质性。这二种变化都是充分确定的且通常用于多样的Fc构建体。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的某些实施方式中，HLA融合蛋白包括通过肽接头与IgG多肽连接作为单一多肽链的一部分的HLA多肽，所述肽接头是长度为5、10、15、或20个残基的短序列。在特定实施方式中，肽接头是非免疫原性序列，例如富含丝氨酸和甘氨酸残基的序列。在更特定实施方式中，肽接头具有序列SEQ ID NO 003。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，HLA融合蛋白为二聚体形式。所述二聚体包括第一单体和第二单体，并且每个单体独立于另一单体包括HLA融合蛋白，即与Ig Fc部分融合的HLA重链胞外结构域多肽，Ig Fc部分可通过二硫键缔合。根据本发明的每个单体可另外与β2m多肽缔合。在特定实施方式中，HLA I类成分都不与肽表位缔合。
CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂
临床前和临床试验中所述的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，涵盖能够破坏限制吞噬细胞激活的CD47和SIRPα之间的抑制信号级联的各种试剂(Zhang W.et al.2020,Front.Immunol.11(19)doi:10.3389/fimmu.2020.00018)。这包含能够结合CD47或SIRPα，取消它们与配体相互作用的抗体、抗体片段、抗体样分子或天然配体受体，或掺入CD47或SIRPα的胞外配体结合结构域的重组蛋白。
本领域已知的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂包含ALX148(ALX oncology)、TTI-662或TTI-621(Trillium Therapeutics)、Hu5F9-G4(Stanford University 47)、TI-061(Arch Oncology)、SRF231(Surface Oncology)、SHR-1603(恒瑞)、NI-1701、NI-1801(Novimune TG Therapeutics)、IBI188(Innovent Biologics)、CC-90002(CelibRx Gene)、AO-176(Arch Oncologology)、来佐利单抗/TJC4(I-MAB Biopharma)、SY102(赛远)、SL-172154(Shattuck Labs)、PSTx-23(Paradigm Shift Therapeutics)、PDL1/CD47BsAb(Hannex Pharmaceuticals)、MBT-001(Morphiex)、LYN00301(Lynkcell)、IMM2504、IMM2502、IMM03(ImmuneOnco Biopharma)、和IMC-002(ImmuneOncia Therapeutics)。
在本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂结合CD47或SIRPα的胞外结构域，解离常数(Kd)为至少10-7M-。在进一步特定实施方式中，这种相互作用的Kd为至少10-8M，或甚至10-9M。
在根据本发明的的用于所述用途的组合药物、或根据本发明的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的一些特定实施方式中，所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂包括抗体、抗体片段、或抗体样分子。在其他特定实施方式中，所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂基本上是抗体、抗体片段、或抗体样分子。
在根据本发明的组合药物，或根据本发明的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂包括抗体。在特定实施方式中，CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂特征在于特异性结合CD47的抗体。在更特定实施方式中，CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂是抗体，其特征在于特异性结合WO2020/068752A1中公开的CD47，特别是CC-90002(Celgene)。在某些特定实施方式中，CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂特征在于与SIRPα特异性结合的抗体。
抗体片段可为抗体的Fab结构域或可变片段(Fv)结构域、或单链抗体片段，其是由通过肽接头连接的抗体轻链和重链可变区组成的融合蛋白。抗体也可为单结构域抗体，其由来自重链或轻链的分离的可变结构域组成。另外，抗体也可为仅由重链组成的重链抗体，例如在骆驼科中发现的抗体。抗体样分子可为重复蛋白，例如设计的锚蛋白重复蛋白(Molecular Partners，Zürich)。
所有片段必须保留特征在于与要么CD47、或者SIRPα特异性结合的抗原结合部分，以根据本发明发挥功能。在其他具体实施方式中，抑制剂是包括特征在于特异性结合CD47的抗原结合部分的抗体片段。在其他特定实施方式中，抑制剂是包括特征在于特异性结合SIRPα的抗原结合部分的抗体片段。在根据本发明的组合药物、或根据本发明的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的其他特定实施方式中，所述CD47和SIRPα之间相互作用的抑制剂包括、或基本上为，融合蛋白，所述融合蛋白包括与Ig Fc融合的，CD47或SIRPα的配体结合胞外结构域、或CD47或SIRPα的配体结合胞外结构域变体。在特定实施方式中，抑制剂融合蛋白基本上是SIRPα多肽胞外结构域、和Ig Fc域。在特定实施方式中，CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂选自ALX148、TTI-622、或TTI-621。ALX148是修饰的SIRPαD1结构域与结合CD47的灭活人IgG1 Fc的融合体，Kd为1×10-9M(Kauder S.etal.2018，PloS One 13(8):e0201832)。TTI-662和TTI-621是分别与IgG4、或IgG1 Fc(Trillium Therapeutics)融合的人SIRPα的胞外结合结构域。
可用作SIRPα抑制剂的抗SIRPα抗体进一步包含，例如，KWAR23(Ring et al.,2017,Proc Natl Acad Sci 114(49):E10578–E10585)、CC-95251(Celgene)、Bl 765063(也称为OSE-172；OSE Immunotherapeutics)。抗SIRPα抗体的进一步实例描述于WO 2019/023347、WO 2013/056352、和WO 2018/190719中。
其他这样的抗体包含，但不限于，GS-0189(Giled，以前称为FSI-189)、ES-004、ADU1805(Voets et al.,J Immunother Cancer.2019Dec 4；7(1):340)。
在某些实施方式中，SIRPα抑制剂是可溶性CD47多肽，例如如US2010/0239579中所述。在某些实施方式中，可溶性CD47多肽包括CD47的胞外结构域，包含信号肽(WO 2016/118754的SEQ ID NO:2)，使得CD47的胞外部分通常为142个氨基酸长度，并具有WO 2016/118754的SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。本文所述的可溶性CD47多肽还包含CD47胞外结构域变体，其包括至少65％–75％、75％–80％、80–85％、85％–90％、或95％–99％(或未具体列举的65％至100％之间的任何百分比同一性)的氨基酸序列，所述变体保留结合SIRPα而不刺激SIRPα信号传导的能力。
在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，所述组合首先包括由SEQ ID NO005的二聚体二种多肽组成的HLA B57I类融合蛋白，其中每个HLA重链部分的特征在于与β2m多肽缔合，且缺乏与肽表位缔合，其次包括SIRPαIg融合蛋白ALX148。
在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，所述组合首先包括由SEQ ID NO005的二聚体二种多肽组成的HLA B57I类融合蛋白，其中每个HLA重链部分的特征在于与β2m多肽缔合，且缺乏与肽表位缔合，其次包括SIRPαIg融合蛋白TTI-662。
在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，所述组合首先包括由SEQ ID NO005的二聚体二种多肽组成的HLA B57I类融合蛋白，其中每个HLA重链部分的特征在于与β2m多肽缔合，且缺乏与肽表位缔合，其次包括SIRPαIg融合蛋白TTI-621。
在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，所述组合首先包括由SEQ ID NO005的二聚体二种多肽组成的HLA B57I类融合蛋白，其中每个HLA重链部分的特征在于与β2m多肽缔合，且缺乏与肽表位缔合，其次包括抗CD47抗体Hu5F9-G4。
在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，所述组合首先包括由SEQ ID NO005的二聚体二种多肽组成的HLA B57I类融合蛋白，其中每个HLA重链部分的特征在于与β2m多肽缔合，且缺乏与肽表位缔合，其次包括抗CD47抗体TI-061。
在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，所述组合首先包括由SEQ ID NO005的二聚体二种多肽组成的HLA B57I类融合蛋白，其中每个HLA重链部分的特征在于与β2m多肽缔合，且缺乏与肽表位缔合，其次包括抗CD47抗体IBI188。
在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，所述组合首先包括由SEQ ID NO005的二聚体二种多肽组成的HLA B57I类融合蛋白，其中每个HLA重链部分的特征在于与β2m多肽缔合，且缺乏与肽表位缔合，其次包括抗CD47抗体CC-90002(Inhibrx)。
在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，所述组合首先包括由SEQ ID NO005的二聚体二种多肽组成的HLA B57I类融合蛋白，其中每个HLA重链部分的特征在于与β2m多肽结合，且缺乏与肽表位缔合，其次包括抗CD47抗体AO-176(Arch Oncology)。
在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，所述组合首先包括由SEQ ID NO005的二聚体二种多肽组成的HLA B57I类融合蛋白，其中每个HLA重链部分的特征在于与β2m多肽缔合，且缺乏与肽表位缔合，其次包括抗CD47抗体来佐利单抗/TJC4(I-MABBiopharma)。
在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，所述组合首先包括由SEQ ID NO005的二聚体二种多肽组成的HLA B57I类融合蛋白，其中每个HLA重链部分的特征在于与β2m多肽缔合，且缺乏与肽表位缔合，其次包括双特异性抗CD47抗体SL-172154(ShattuckLabs)。
在根据本发明的组合药物的特定实施方式中，所述组合首先包括由SEQ ID NO005的二聚体二种多肽组成的HLA B57I类融合蛋白，其中每个HLA重链部分的特征在于与β2m多肽缔合，且缺乏与肽表位缔合，其次包括抗CD47抗体IMC-002(ImmuneOnciaTherapeutics)。
在一些实施方式中，本发明中使用的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂在结合CD47或SIRPα时能够空间阻断与其结合配偶体的相互作用。在其他实施方式中，此相互作用是非激动剂相互作用。
HLA融合蛋白药物组合物的剂量和施用
本发明的进一步方面涉及一种药物组合物，特别是用于治疗一种形式的癌症或恶性肿瘤疾病，所述组合物包括如在HLA融合蛋白部分中所述的HLA融合蛋白，用于接受使用CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂治疗的患者。
根据本发明，特别是用于治疗癌症的药物组合物包括与β2m多肽缔合的HLA融合蛋白，且通常被配制成药物剂型以提供药物的容易控制的剂量并给予患者雅致且容易处理的产品。所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。在进一步实施方式中，组合物包括至少二种药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物的剂量方案将根据已知因素而变化，例如特定药剂的药效学特征及其施用模式和途径；接受者的物种、年龄、性别、健康、医学状况、和体重；症状的性质和程度；并行治疗的种类；治疗频率；给药途径、患者的肾和肝功能、以及所需的效果。在某些实施方式中，本发明的药物组合物可以以单次日剂量施用，或者总日剂量可以以每日二次、三次、或四次的分份剂量施用。在特定实施方式中，每1、2或3周施用所述组合药物。
许多制备药物组合物的流程和方法是本领域已知的，参见例如L.Lachman etal.The Theory and Practice of Industrial Pharmacy,4th Ed,2013(ISBN8123922892)。
联合施用涵盖CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂和包括HLA融合蛋白的药物组合物同时施用、或于分开的制剂中施用，或一种物质是在施用第二种物质之前紧接着(例如在之前一周内，或至少在之前一个月内)、或之后紧接着(例如之后一周内，或至多在之后一个月内)施用。
本发明的另一方面，是用于治疗癌症的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，先于、组合于、或后于HLA融合蛋白施用。
独特的剂型
在某些实施方式中，所述联合治疗包括二种不同的剂型，例如，其中所述包括HLA融合蛋白的药物组合物作为用于肿瘤内递送、或肿瘤附近局部递送的剂型提供，例如，通过皮下注射、或肿瘤内注射至实体瘤，而所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂作为用于全身性递送，特别是通过静脉内注射，的剂型提供。然而，二种药剂也可以以二种类似的剂型递送。
在根据本发明的组合药物，或根据本发明的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂以适于全身递送的剂型提供。
在根据本发明的组合药物，或根据本发明的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，所述HLA融合蛋白以适于全身递送的剂型提供。
一个共同剂型
本发明还涵盖施用作为单一剂型的可溶性HLA重链多肽，其可选地通过与赋予增强的体内稳定性的多肽部分融合而稳定，以及CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂。
医学治疗和制造方法
提供了根据本发明的组合药物、或CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其用于治疗各种形式的癌症。对其他形式的类似LILBR2定向抗肿瘤治疗的临床前研究已证明在肾癌、和卵巢癌中有效。目前，在与化疗组合并靶向多种实体器官癌(间皮瘤、三阴性乳腺癌、卵巢癌、肺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌、胃癌)的临床试验(ClinicalTrials.Gov识别号：NCT03564691)中，正在研究靶向LILRB2的抗体MK-4830的安全性和耐受性。这些适应症中的每一种都可用根据本发明的LILRB2 bining HLA融合蛋白组合药物可行地治疗。
在根据本发明的组合药物、或CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂的特定实施方式中，提供了其用于治疗血液癌的用途。本发明人考虑了特征性T细胞耗竭、循环血癌细胞对T细胞的可接近性，和由根据本发明的药物组合物诱导的巨噬细胞活化，这意味着这组合可能是有效的。在具体的此类实施方式中，提供了组合药物用于诊断患有多发性骨髓瘤的患者，如RPMI-8226细胞系所模拟的(图4)。
在其他特定实施方式中，提供了用于根据本发明的组合药物、或用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其用于诊断为实体癌、或实体癌转移的患者。在其他特定实施方式中，提供了组合用于诊断患有乳腺癌形式的患者。在更特定实施方式中，癌症是雌激素受体阳性的。在其他特定实施方式中，癌症是孕酮受体阳性的。在其他特定实施方式中，癌症是人类表皮生长因子受体2阳性的。
类似地，本发明范围内的是治疗癌症患者的方法，包括给予患者根据本发明的组合药物、或CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂。作为另外的替代方面，本发明进一步涵盖如上详述的组合药物的组分的用途，其用于制备用于治疗或预防癌症的药物的方法中。
剂型可为肠胃外给药，例如皮下、静脉内、肝内或肌内注射形式。可选地，可以存在药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明还涵盖以下项：
项1.一种用于治疗恶性肿瘤性疾病的组合药物，其包括：
a.人类白细胞抗原(HLA)融合蛋白，其包括
-HLA重链多肽，其选自：
·HLA重链的胞外结构域，特别是选自HLA-B57、HLA-C08、HLA-A25、HLA-B58、HLA-B27、HLA-A30、HLA-B53、或HLA-C12的HLA重链；或
·HLA重链的所述胞外结构域的变体，其中所述变体的特征在于至少(≥)95％，特别是≥98％的序列相似性，和相似的生物活性；和
-免疫球蛋白可结晶片段(Ig Fc)多肽，特别是IgG Fc多肽，更特别是IgG4 Fc多肽；和
a.CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂。
项2.根据项1所述的用于所述用途的组合药物，其中所述HLA融合蛋白与β2m多肽缔合。
项3.根据项1或2所述的用于所述用途的组合药物，其中所述HLA融合蛋白以3∶5至7∶5，更特别是4∶5至6∶5，更特别是1∶1的比例与β2m多肽非共价缔合。
项4.根据项3所述的用于所述用途的组合药物，其中所述HLA重链多肽是HLA-B57胞外结构域的变体，
并且其中所述HLA重链多肽的特征在于第46位的E、和第97位的R。
项5.根据项1至4任一所述的用于所述用途的组合药物，其中所述HLA重链多肽包括序列SEQ ID NO 001、或基本上由其组成。
项6.根据项1或5任一所述的用于所述用途的组合药物，其中所述HLA融合蛋白包括：
a.根据项1至5任一所述的HLA重链多肽；
b.IgG Fc多肽，特别是IgG4 F多肽，更特别是具有序列SEQ ID NO 002的IgG4 Fc多肽，和/或
c.将HLA重链多肽连接至IgG Fc多肽的肽接头，特别是长度为5至20个氨基酸的肽接头，更特别是具有序列SEQ ID NO 003的肽接头；
项7.根据项1至6任一所述的用于所述用途的组合药物，其中所述HLA融合蛋白包括序列SEQ ID NO 005、或基本上由其组成。
项8.根据项1或7任一所述的用于所述用途的组合药物，其中所述HLA融合蛋白包括分泌信号，特别是其中所述分泌信号长度为16至30个氨基酸，更特别是其中所述分泌信号在从细胞分泌的过程中通过切割去除，还更特别是其中所述分泌信号具有序列SEQ IDNO 004。
项9.根据项1至8任一所述的用于所述用途的组合药物，其中所述HLA融合蛋白为二聚体形式，所述二聚体包括第一HLA单体和第二HLA单体、或基本上由其组成；
-其中所述第一HLA单体基本上由根据项1至8任一所述的第一HLA融合蛋白、和第一β2m多肽组成；且
-其中所述第二HLA单体基本上由根据项1至8任一所述的第二HLA融合蛋白、和第二β2m多肽组成；
特别是其中第一和第二HLA单体相同。
项10.一种用于治疗恶性肿瘤疾病的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述用于治疗恶性肿瘤疾病的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂先于、组合于、或后于根据项1至9任一所述的HLA融合蛋白施用。
项11.根据项1至8任一所述的用于所述用途的组合药物、或根据项10所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂结合CD47或SIRPα，其解离常数为至少10-7M-1。
项12.根据项1至8、或11任一所述的用于所述用途的组合药物、或根据项10或11所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂包括、或基本上为，抗体、抗体片段、或抗体样分子。
项13.根据项1至8、11或12任一所述的用于所述用途的组合药物、或根据项10至12任一所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂包括融合蛋白、或由其组成，所述融合蛋白包括：
-SIRPα的多肽胞外结构域；和
-Ig Fc结构域；
特别是其中所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂选自ALX148、TTI-622、或TTI-621。
项14.根据项1至8、或11至13任一所述的用于所述用途的组合药物、或根据项10至13任一所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述HLA融合蛋白、或所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，以适于全身递送的剂型提供。
项15.根据项1至8、或11至14任一所述的用于所述用途的组合药物，或根据项10至14任一所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述恶性肿瘤疾病是
a.血细胞衍生的癌症、骨髓瘤，或
b.实体瘤，特别是乳腺癌，更特别是导管细胞癌的形式。
通过以下实施例和附图进一步说明本发明，从中可以得出其他实施方式和优点。这些实施例旨在说明本发明而不是限制其范围。
附图说明
图1：(A)显示SIRPα和LILRB2在巨噬细胞上的相互作用如何与其在肿瘤细胞上的天然配体结合，产生免疫抑制信号。(B)显示实验设计测试的总结，通过HLA融合蛋白候选iosH2阻断LILRB1/2来释放巨噬细胞杀伤癌细胞的制动，是否可以与抗体或天然配体阻断SIRPα/CD47轴结合来增强杀肿瘤活性。
图2：显示HLA-B57(A46E/V97R)IgG4融合蛋白的优异细胞存活力和HLA融合蛋白表达特性。基于细胞生存力(A)和表达的蛋白效价(B)，从用HLA B57.β2m(DGC8-T39、DGC8-T64和DGC8-73)和HLA-B57(A46E/V97R)·β2m(DGC8-T54、DGC8-T75和DGC8-91)转染的克隆表达融合蛋白。表中总结了在不同转染率下测试的产量。HLA-B57(A46E/V97R)IgG4融合蛋白和(C)CHO细胞克隆中载体表达的β2m的等价RNA图谱。
图3：显示通过ELISA测量的LILRB2与非β2m缔合HLA-B57、或HLA-B57(A46E/V97R)融合蛋白，和HLA-B57(A46E/V97R).β2m的结合亲和力的定量估计。无β2m的HLA-B57的EC50为21nM，HLA-B57(A46E/V97R).β2m的EC50为8.3nM，HLA-B57(A46E/V97R).β2m的EC50为5.72nM，证明氨基酸取代不降低HLA-B57重链与LILRB2的结合。
图4：显示使用HLA-B57(A46E/V97R).β2m(iosh2)与抗SIRPα或抗CD47抗体组合时，(A)使用RPMI8226多发性骨髓瘤细胞的液体癌、和(B)使用BT474乳腺癌细胞的实体癌的吞噬作用增加。将源自实体瘤和液体瘤的癌细胞系与人原代巨噬细胞共培养，并用IncuCyte活细胞成像系统测量吞噬作用36小时。使用至少2个生物学上独立的样品重复实验。IgG1 10μg/ml、IgG4 20μg/ml、iosh2 20μg/ml、抗CD47抗体10μg/ml、MK4830 10μg/ml、抗SIRPα抗体10μg/ml。误差条，SEM的n＝2生物学重复，其中每个含有2个技术重复。统计分析使用双向重复测量ANOVA，然后Dunnett事后分析，来进行。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001
实施例
实施例1：HLA融合蛋白的产生
在本发明人的先前工作中，通过将HLA-B57:01:01多肽的重链胞外结构域连接至IgG4 Fc多肽(SEQ ID NO 002)而设计HLA融合蛋白(iosH1)。为了增加此HLA融合蛋白的产量，通过将第46位的丙氨酸(A)残基取代为谷氨酰胺(E)，并将第97位的缬氨酸(V)取代为精氨酸(R)，改变在天然HLA-B57胞外结构域氨基酸序列中鉴定的抑制性氨基酸，提供变体HLA-B57多肽(SEQ ID NO 001)。通过连接肽(SEQ ID NO 003)将其与IgG4多肽融合，以提供变体HLA-B57融合蛋白(SEQ ID NO 005，IosH2)。将编码重组HLA-B57(A46E/V97R)融合蛋白和天然HLA-B57衍生的融合蛋白对照(缺乏二个突变)的cDNA克隆到商业表达载体(Probiogen)中编码分泌信号(SEQ ID NO 004)的核酸序列的下游。使用NEON转染试剂盒(LifeTechnologies#MPK10096)通过微孔化(MP)将表达HLA-B57-Fc和HLA-B57(A46E/V97R)-Fc的载体构建体与包括编码β2m蛋白(SEQ ID NO 006)的核酸的质粒一并共转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，。以HLA融合蛋白与β2m质粒的不同比例(4∶1、2∶1、1∶1、1∶2)转染CHO-DG44起始细胞。将选择的克隆库在标准化摇瓶中生长，并在125mL添加了PBG-CD-C4的培养基中以4E5 vc/mL的确定的细胞接种密度培养，所述培养基包含嘌呤霉素和甲氨蝶呤。在用抗生素调节选择压力后，选择单个克隆库用于分析。利用Vi-CELL XR系统和台盼蓝细胞排除方法进行活力和活细胞密度的测量。使用Octect RED机器(ForteBio，Pall Division)和蛋白A生物传感器在不同的时间点(天)测量效价定量。
对表达HLA-B57或变体融合蛋白的克隆的分析证明，野生型HLA-B57.β2m细胞的生存力和效价显著低于HLA-B57(A46E/V97R)·β2m(图2B和C)。天然HLA-B57或改变的HLA-B57(A46E /V97R)相对于β2m的等摩尔RNA水平在所选克隆细胞克隆中得到证实(图2C和D)，表明氨基酸修饰驱动增加的表达。
然后通过亲和柱纯化从过滤的CHO细胞上清液中分离HLA-B57(A46E/V97R).β2m复合物。在酸性条件下进行蛋白质的纯化和β2m的去除作为二步纯化方案。第一步，用蛋白GSepharose[(4Fast Flow)Sigma，#GE-17-0618-01)]珠从上清液中捕获与β2m缔合的HLA-B57(A46E/V97R)。在摇床上4度过夜孵育后，回收的珠在PBS中洗涤，随后使用标准IgG洗脱缓冲液(pH2.8)(PierceTMIgG洗脱缓冲液，Thermo Fischer#21004)洗脱HLA-B57(A46E/V97R)融合蛋白，其中每个HLA多肽仍与β2m缔合。第二步，进行基于大小排阻层析的纯化以在酸性条件下从β2m分离HLA-B57(A46E/V97R)，以提供非β2m缔合HLA融合蛋白。用在柠檬酸钠(100mM，pH 3.0)中预平衡的Superdex 10/300凝胶过滤柱分离。注射0.5ml浓度为2.0mg/ml的蛋白，所需的HLA-B57(A46E/V97R)蛋白在12.7ml处洗脱出峰，β2m在22.0ml处洗脱出峰。
实施例2：LILRB2与非β2m缔合或β2m缔合HLA融合蛋白的相互作用的定量
发明人继续剖析与HLA-B57(A46E/V97R)形式相关的肿瘤免疫最相关的免疫特性，所有形式均缺乏与融合蛋白的HLA I类结构域的肽结合槽相关的肽表位的缔合。LILRB2与缺少β2m的野生型HLA-B57融合蛋白(二聚体)、缺少β2m的HLA-B57(A46E/V97R)融合蛋白(二聚体)、和仍结合β2m的HLA-B57(A46E/V97R)融合蛋白二聚体相互作用的亲和力，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测量。平底PierceTM链霉亲和素蛋白包被的高结合能力96孔板(Pierce#15500)用50μl的以5μg/ml终浓度固定在PBS缓冲液中的C端生物素化抗原分子(LILRB2，BPSBioscience#100335)包被。PBS和IgG同种型用作阴性对照。一式二份施用(50μl)HLA-B57、或缺乏β2m的HLA-B57(A46E/V97R)、和HLA-B57(A46E/V97R).β2M的系列稀释液(八个浓度点：10、2.5、1、0.25、0.1、0.025、0.01、0.0025μg/ml)。用在TBS(50μl)中1∶100稀释的APC偶联的山羊抗人IgG抗体(Jackson Immuno Research#109-135-098)。最后，在每个孔中加入50μl的TBS，并分别用650nm&660nm的APC激发和发射波长进行荧光扫描。使用Graphpad Prismv9.1.2和基于三参数的log(激动剂)vs.反应模型来确定相互作用的EC50。观察到变体HLA-B57融合蛋白与LILRB2的结合改善，或者是缺乏与β2m缔合的HLA-B57(A46E/V97R)，特别是当与β2m缔合时，表明所述变体具有高的免疫调节潜力(图3)。
实施例3：体外肿瘤细胞杀伤的增加
接下来，评估了与PBS、IgG1(Biomencion；目录号403502)和IgG4(Biomencion；目录号403702)同种型对照和基准抗LILRB2抗体(MK4830)(基于US2018/0298096A1中的序列内部产生)相比，β2m缔合的HLA-B57(A46E,V97R)IgG4Fc融合蛋白(称为iosH2)诱导人原代巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，针对液体(RPMI8226多发性骨髓瘤，DSMZ目录号ACC402)和实体(BT474乳腺导管癌，DSMZ目录号ACC64)癌细胞。此外，为了研究调节吞噬细胞活化的二种通路的联合抑制是否可以增强iosh2的效果(图1)，评估了用抗CD47抗体(LubioScience；目录号BE0019-1)或抗SIRPα抗体(基于WO 2020068752A1中的序列，SEQ ID NO 007的重链和SEQ ID NO 008的轻链，自制)的同时治疗。
将源自所示液体瘤和实体瘤的癌细胞系与人原代巨噬细胞共培养，并使用IncuCyte培养箱和活细胞成像系统(Vitaris AG，MCO-230AICUVH-PE)根据制造商的说明书监测肿瘤细胞的吞噬36小时。用CellTraceTMCFSE(ThermoFisher)根据制造商的说明书对癌细胞进行染色，随后将1000个细胞/孔与1000–5000个原代T细胞一起铺板在平底96孔板(Greiner)中。培养基含有250nM Cytototox Red(Sartorius)。使用Incucyte S3活细胞分析系统(Sartorius)进行活细胞成像。用Incucyte软件v2020C分析每孔4个不相邻的图像。CFSE信号在绿色对象中被分段，并且每个对象被计数为癌细胞。用在红色对象体中分割的细胞凋亡信号鉴定死细胞。通过绿色和红色物体的共定位检测癌细胞死亡。
图4中的结果证明，HLA-B57(A46E,V97R).β2m(iosH2)在共培养3小时后显著并迅速地增加巨噬细胞的吞噬作用。尽管不同细胞系的吞噬作用速率和动力是不同的，但iosh2的作用不依赖于癌细胞的类型。IosH2刺激也优于基准抗LILRB2抗体MK4830诱导的作用，后者引起乳腺癌的延迟吞噬作用，但对骨髓瘤细胞没有作用。抗CD47抗体、或抗SIRPα抗体作为单剂药物对骨髓瘤吞噬率无影响；然而，iosH2与抗CD47抗体的组合导致骨髓瘤吞噬率升高，而用抗CD47抗体和MK4830组合未观察到这种情况。对于乳癌细胞系BT474，抗CD47抗体也增强IosH2诱导的吞噬作用，尽管单独作用很小。与所有测试的单一和组合疗法相比，抗SIRPα抗体与iosH2一起在乳腺癌中显示最高吞噬率，然而，其在治疗骨髓瘤细胞系中没有作用。
序列：
SEQ ID NO 001变体HLA-B57:01胞外结构域A46E V97R (人工)
SEQ ID NO 002优化IgG4 Fc (人工)
SEQ ID NO 003肽接头 (人工)
GGGGSGGGGS
SEQ ID NO 004分泌信号 (人工)
AAAMNFGLRLIFLVLTLKGVQC
SEQ ID NO 005变体HLA-B57:01胞外结构域A46E V97RIgG4融合蛋白 (人工)
变体HLA-B57胞外结构域，肽接头(下划线)、IgG4 Fc(斜体)
SEQ ID NO 006β2微球蛋白 (智人)
SEQ ID NO 007抗SIRPα抗体重链 (人工)
SEQ ID NO 008抗SIRPα抗体轻链 (人工)
SEQ ID NO 009HLA-CW0802融合蛋白 (人工)
HLA-CW0802胞外结构域，肽接头(下划线)、IgG4 Fc(斜体)
SEQ ID NO 010HLA-B58融合蛋白 (人工)
HLA-B58:01胞外结构域，肽接头(下划线)、IgG4 Fc(斜体)
SEQ ID NO 011HLA-A30:01融合蛋白 (人工)
HLA-A30:01胞外结构域，肽接头(下划线)、IgG4 Fc(斜体)
引用：
Colonna M.et al.1997J.Exp.Med.186(1):1809；Ring et al.,2017,Proc NatlAcad Sci 114(49):E10578–E10585)；WO2017153438A1；WO2016124661A1；WO2018029284A1；WO 2019/023347；WO 2013/056352；WO 2018/190719；US2010/0239579
本说明书中引用的所有科学出版物和专利文献均引入本文作为参考。
Claims (21)
1.一种组合药物，其包括：
a.可溶性人白细胞抗原(HLA)重链多肽，
特别是，其中HLA重链多肽选自：
·HLA重链的胞外结构域，选自HLA-B57、HLA-C08、HLA-A25、HLA-B58、HLA-B27、HLA-A30、HLA-B53、或HLA-C12；或
·HLA重链的所述胞外结构域的变体，其中所述变体的特征在于与选自HLA-B57、HLA-C08、HLA-A25、HLA-B58、HLA-B27、HLA-A30、HLA-B53、或HLA-C12的HLA重链的胞外结构域，至少(≥)95％、特别是≥98％的序列相似性，和与各自HLA重链的相似的生物活性；和
b.CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂。
2.根据权利要求1所述的组合药物，其中所述HLA重链多肽包括HLA融合蛋白、特别是由其组成，所述HLA融合蛋白包括
-HLA重链结构域，其选自：
·HLA重链的胞外结构域，特别是选自HLA-B57、HLA-C08、HLA-A25、HLA-B58、HLA-B27、HLA-A30、HLA-B53、或HLA-C12的HLA重链；或
·HLA重链的所述胞外结构域的变体，其中所述变体的特征在于与各自的HLA重链至少(≥)95％，特别是≥98％的序列相似性，和相似的生物活性；和
-免疫球蛋白可结晶片段(Ig Fc)多肽，特别是IgG Fc多肽，更特别是IgG4 Fc多肽。
3.根据权利要求1或2所述的组合药物，其中所述HLA重链多肽与β2m多肽缔合。
4.根据权利要求3所述的组合药物，其中所述HLA重链多肽以3∶5至7∶5，更特别是4∶5至6∶5，更特别是1∶1的比例与所述β2m多肽非共价缔合。
5.根据前述权利要求任一所述的组合药物，其中所述HLA重链多肽、或HLA重链结构域是HLA-B57胞外结构域的变体，
并且其中HLA-B57胞外结构域的变体特征在于第46位的E、和第97位的R。
6.根据权利要求1至5任一所述的组合药物，其中所述HLA重链多肽、或所述HLA重链结构域包括序列SEQ ID NO 001、或基本上由其组成。
7.根据前述权利要求2至6任一所述的组合药物，
其中所述HLA融合蛋白包括IgG Fc多肽，特别是IgG4 Fc多肽，更特别是具有序列SEQID NO 002的IgG4 Fc多肽；
并且其中肽接头将HLA重链结构域连接至IgG Fc多肽，特别是长度为5至20个氨基酸的肽接头，更特别是具有序列SEQ ID NO 003的肽接头。
8.根据权利要求2至7任一所述的组合药物，其中所述HLA重链结构域位于所述Ig Fc多肽的N端。
9.根据权利要求2至8任一所述的组合药物，其中所述HLA融合蛋白包括序列SEQ ID NO005。
10.根据权利要求2至9任一所述的组合药物，其中所述HLA融合蛋白包括分泌信号，特别是其中所述分泌信号的长度为16至30个氨基酸，更特别是其中所述分泌信号在从所述细胞分泌的过程中通过切割去除，还更特别是其中所述分泌信号具有序列SEQ ID NO 004。
11.根据权利要求2至10任一所述的组合药物，其中所述HLA融合蛋白为二聚体的形式，所述二聚体包括第一HLA单体和第二HLA单体、或基本上由其组成；
-其中所述第一HLA单体基本上由根据权利要求2至10任一所述的第一HLA融合蛋白、和第一β2m多肽组成；且
-其中所述第二HLA单体基本上由根据权利要求2至10任一所述的第二HLA融合蛋白、和第二β2m多肽组成；
特别是其中第一和第二HLA单体相同。
12.根据权利要求1至11任一所述的组合药物，其中所述HLA重链多肽不与肽表位缔合。
13.一种用于治疗癌症的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，
其中CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂先于、组合于、或后于根据权利要求1至12任一所述的可溶性HLA重链多肽施用，特别是其中所述可溶性HLA重链多肽作为根据权利要求2至12任一所述的HLA融合蛋白存在。
14.根据权利要求1至12任一所述的组合药物、或根据权利要求13所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂以10-7mol/L或更低(更高亲和力)的解离常数结合CD47或SIRPα。
15.根据权利要求1至12、或14任一所述的组合药物、或根据权利要求13或14所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂包括、或基本上为，抗体、抗体片段、或抗体样分子；
特别是其中所述抗体选自由Hu5F9-G4、TI-061、IBI188、CC-90002、来佐利单抗/TJC4、SL-172154、IMC-002、GS-0189、ADU1805组成的组。
16.根据权利要求1至12、14或15任一所述的组合药物、或根据权利要求13至15任一所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂包括融合蛋白、或由其组成，所述融合蛋白包括：
-SIRPα多肽的胞外结构域；和
-Ig Fc结构域；
特别是其中所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂选自ALX148、TTI-622、或TTI-621。
17.一种根据前述权利要求任一所述的组合药物，其用于治疗癌症。
18.根据权利要求17所述的用于所述用途的组合药物、或根据权利要求13至16任一所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述癌症是实体瘤，特别是癌。
19.根据权利要求17所述的用于所述用途的组合药物、或根据权利要求13至16任一所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述癌症是液体癌，特别是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
20.根据权利要求17至19任一所述的用于所述用途的组合药物、或根据权利要求13至16、18或19任一所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述可溶性HLA重链多肽、或所述CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，以适于全身递送的剂型提供。
21.根据权利要求17或18任一所述的用于所述用途的组合药物、或根据权利要求13至16、18或20任一所述的用于所述用途的CD47与SIRPα之间相互作用的抑制剂，其中所述癌症是实体瘤，特别是乳腺癌，更特别是导管细胞癌的形式。
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