CN118059087A - 山奈素在制备治疗骨关节炎的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了山奈素在制备治疗骨关节炎的药物中的应用,涉及医药生物技术领域,本发明实施例的研究证明了KA在软骨细胞和大鼠中的抗炎和疾病缓解作用。这些结果证明KA有可能通过介导HIF‑1信号通路来抑制炎症介质的过度表达来保护软骨细胞。此外,本发明实施例还证实KA可以减缓木瓜蛋白酶诱导的OA大鼠的软骨和胶原变性。由此,本发明实施例提出山奈素可以应用于制备治疗骨关节炎的药物。
Description
技术领域
本发明实施例涉及医药生物技术领域,尤其涉及山奈素在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
背景技术
骨关节炎(OA)是一种严重的衰弱性退行性变性疾病,可能影响人体的所有关节,其病理生理特征包括软骨退化,软骨下骨硬化和滑膜肥大。主要临床表现为疼痛,肿胀和运动受限。OA的平均医疗费用约为15000美元。同时,骨关节炎对患者造成的伤害还会导致患者的工资损失,可能高达650亿美元。迄今为止,早期OA的主要治疗选择是姑息治疗,如非甾体类抗炎药和关节内局部注射糖皮质激素,旨在改善患者症状和改善关节功能。然而,目前还没有可以预防或限制OA进展的临床药物。
发明内容
本发明实施例提供了山奈素在制备治疗骨关节炎的药物中的应用,以提供一种可以预防或限制OA进展的临床药物。
本发明实施例提供了山奈素在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
可选地,所述山奈素通过介导HIF-1信号通路抑制炎症介质的表达和软骨降解。
可选地,所述山奈素通过抑制HIF-1信号通路的上游因子IFN-γ,影响与其相关的下游因子,减轻骨关节炎的进展。
可选地,所述山奈素通过抑制HIF-1α减少骨关节炎细胞模型中下游因子Tie2,PFKFB3,VEGF和iNOS的产生。
可选地,所述山奈素通过影响血管生成和葡萄糖代谢途径来影响OA治疗。
本发明实施例的研究证明了KA在软骨细胞和大鼠中的抗炎和疾病缓解作用。这些结果证明KA有可能通过介导HIF-1信号通路来抑制炎症介质的过度表达来保护软骨细胞。此外,本发明实施例还证实KA可以减缓木瓜蛋白酶诱导的OA大鼠的软骨和胶原变性。由此,本发明实施例提出山奈素可以应用于制备治疗骨关节炎的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中KA对骨关节炎的细胞毒性和细胞增殖实验结果;
图2是本发明实施例中KA对IL-1β诱导的SW1353细胞炎症介质的抑制作用分析结果;
图3是本发明实施例中KA减缓木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎(OA)的进展分析结果;
图4是本发明实施例中木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎的免疫组织化学染色结果;
图5是本发明实施例中木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎中的步态行为测试和机械撤退反应阈值检测结果;
图6是本发明实施例中SW1353细胞模型的转录组学分析结果;
图7是本发明实施例中KA处理的SW1353细胞模型中HIF-1和NF-κB信号传导途径的确证结果;
图8是本发明实施例中KA处理的SW1353细胞模型中HIF-1信号传导途径的确证结果;
图9是本发明实施例中KA与IFN-γ分子对接分析结果;
图10是本发明实施例中的KA对骨关节炎的作用效果探索路线示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市场购买获得的常规试剂产品。
骨关节炎的发病机制非常复杂,相关研究表明,某些关键的信号通路在维持健康的关节软骨方面发挥重要作用,如NF-κB信号传导构成一组转录因子(如基质金属蛋白酶(MMPs)、adamts4和ADAMTS5),并通过各种模式广泛参与OA病理学。相关研究表明,在小鼠OA关节软骨细胞和人膝关节OA软骨细胞中AMPK信号传导显著降低。相关研究还表明,mTOR对于软骨发育和生长的早期阶段是至关重要的,mTOR的表达在实验性小鼠OA模型的人OA软骨和关节软骨细胞中显著上调。此外,HIF途径、粘着斑途径、TGFβ/BMP途径、FGF途径以及Notch信号传导也可能影响OA的进展。
中药是一种重要的补充和替代药,对于治疗OA至关重要。OA又称痹证,近年来,许多相关研究探讨了中医药治疗OA的作用,其主要机制涉及抗炎,抗细胞凋亡和抗分解代谢。山奈素(KA,3,5,7-三羟基-4’-甲氧基黄酮),是在节鞭山姜,飞机草,高良姜和沙棘属植物根茎中发现的天然黄烷醇化合物。KA由于其抗癌,抗心肌损伤,抗炎,抗氧化,抗菌和抗病毒特性而具有各种作用。然而,关于KA的抗关节炎作用知之甚少。
为了探索中药的分子和药理机制,可以将分子对接方法学应用于小分子药物和相关疾病靶点的计算机对接分析。本发明的发明人提出通过转录组学分析和分子对接,探索KA在骨关节炎中的分子靶点及其作用机制。
为使本领域技术人员更好地理解本发明,以下对具体的探索方法进行说明。
本发明实施例中使用的试剂如下:
购自Yuanye的山奈素(KA),购自Solarbio的地塞米松。使用的抗体如下:从Abcam产生IFN-γ,NF-κB,HIF-1α,VEGF,iNOS,MMP-2,MMP-3,MMP-13和ADAMTS-5。HIF-1α的激动剂DMOG,MedChemExpress产生的HIF-1α的抑制剂LW6。
细胞培养和建立软骨细胞OA模型方法如下:
本发明实施例中,所采用的SW1353细胞(人软骨肉瘤细胞系)购自中国科学院的细胞银行。根据相关技术中已有的成熟方案建立软骨细胞OA模型。简而言之,该方案包括:将细胞以每孔1×105个细胞的密度接种在6孔板中,然后与含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s改良Eagles培养基(DMEM)一起温育。将细胞置于37℃和5%CO2的潮湿室中,然后用10ng/mL IL-1β刺激24小时以体外模拟人OA软骨细胞。然后分为5组进行实验:单纯SW1353细胞对照组、OA组、OA低剂量(30μM)KA组、OA中剂量(60μM)KA组、OA高剂量(90μM)KA组,每组在37℃连续刺激细胞24h。
细胞活力测定方法如下:
将SW1353细胞接种于96孔板,密度为0.5×104个/孔。在37℃下与不同浓度的KA(1,15,30,60,90,120μm)孵育24小时后,测量每个孔在450nm处的吸光率。然后,绘制剂量反应曲线,计算KA抑制细胞生长的50%(ic50)浓度。
Western blot试验如下:
根据蛋白总量提取试剂盒的说明提取蛋白质,并使用BCA测定试剂盒测定每个样品的蛋白质浓度。此外,通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白总量,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,在5%脱脂奶粉中密封1小时,并与包括兔抗人IFN-γ,NF-κB,HIF-1α,VEGF,iNOS,MMP-2,MMP-3,MMP-13,ADAMTS-5,Tie2,PFKFB3,Phospho-p65,Phospho-IKBA和小鼠抗人β-肌动蛋白抗体。将这些抗体稀释并在4℃下加入到含有靶带的硝酸纤维素膜上过夜。在室温下使用辣根过氧化酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG和HRP缀合的山羊抗兔IgG1小时,并使用β-肌动蛋白作为内部对照。最后,用Image j软件分析灰度值。
RNA提取和qRT-PCR分析方法如下:
使用qRT-PCR定量相关基因的表达,并使用总RNA(1μg)提取试剂盒分离RNA。此外,用SuperScript III RT从总RNA合成互补DNA并扩增。使用的扩增条件如下:35秒95℃,然后是10秒95℃和30秒60℃的40个循环;15秒95℃,60秒60℃和15秒95℃的融化曲线。此外,β-肌动蛋白被用作内参。使用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达。每个cDNA样品重复一式三份。
转录组测序方法如下:
采用2100生物分析仪(安捷伦科技有限公司)检测条带分布。然后,根据制造商的说明,在cBot上对Illumina测序平台进行簇生成和第一方向测序引物杂交。此外,根据制造商的说明制备Illumina测序试剂,并使用图案化的流动单元来改进簇的产生。最后,使用Illumina软件进行配对末端测序,并进行实时数据分析。
生物信息学分析方法如下:
使用HISAT2(http://ccb.jhu.edu/software/HISAT2/index.shtml)过滤原始数据以获得用于数据分析的干净读数。此外,使用剪接作图算法hisat2预处理序列的基因组作图。使用StringTie软件(版本1.3.0)计数hisat2比较后对应于每个基因的片段的数目,然后针对每个基因的修剪平均m值(TMM)(每百万个映射读数的外显子模型的每千碱基片段,FKPM)。
使用edgeR r软件包比较分析样品组之间的差异表达基因。获得p值后,进行多重检验校正,通过控制错误发现率(FDR)确定p值阈值,并用q值表示。之后,根据FPKM值计算倍数变化(FC)。此外,q值≤0.05和FC≥的截断值用于筛选差异表达的基因。然后,将差异表达基因(DEGs)映射到GO数据库,并计算对应于每个条目的基因数目。对差异表达基因进行KEGG通路富集分析,将差异表达基因按log2FC值降序排列,筛选出前20个失调表达基因。最终,选择与具有大量差异表达基因的OA相关的KEGG途径,并选择在这些途径中富集的基因。
动物模型试验如下:
使用36只雄性Sprague Dawley大鼠(6~8周龄)构建动物模型。该模型是根据相关技术中成熟的方法建立的。简言之,该方法包括:将4%木瓜蛋白酶溶液(0.2mL)和0.03mol/l l-半胱氨酸(0.1mL)混合并使其静置0.5小时。之后,将混合物(20μl)注射到大鼠的右膝关节中。KA给药的剂量符合经验方程:剂量(大鼠,mg/kg)=剂量(细胞,μg/mL)×体积(mL/kg)/重量(kg)。
具体的,设置以下试验组:
假手术组(n=6):用等量生理盐水处理动物。
OA组(n=6):诱导OA和未治疗。
OA+地塞米松组(DXM)(n=6):关节腔内注射地塞米松(1mg/kg)诱导OA并治疗。
OA+高剂量山奈素组(hi-KA)(n=6):通过关节内注射诱导OA并用高剂量山奈素(3mg/kg)治疗。
OA+低剂量山奈素组(lo-KA)(n=6):通过关节内注射诱导OA并用低剂量山奈素(1.5mg/kg)治疗。
步态行为测试方法如下:
采用步态行为测试评估大鼠在术前、术后1周、2周、3周和4周5分钟内的行走距离和站立时间。具体的,在每个时间点将每只动物移动到测试区域,并用食品安全染料涂抹生殖器区域以避免分析。一旦染料干了,将老鼠放置在测试室,让它短暂地适应新的环境,同时安装软件和调整缓冲器,以保持动物在视野内。跑步机最初以10厘米/秒的速度开始,并允许动物调整到这个速度。速度逐渐增加到20厘米/秒的测试速度,此时开始记录。一旦捕获3-5秒的恒定步伐,跑步机和记录就停止,并且动物将被送回其家笼。
机械撤回反应阈值检测方法如下:
使用BME-404机械镇痛测试仪测定大鼠足爪缩回机械阈(PWMT)。具体的,将所有大鼠置于有网状地板的丙烯酸笼中,以帮助它们适应环境15分钟。测试探针对准右脚底,刺激3-6秒,观察老鼠是否有收缩反应。如果大鼠在刺激过程中快速收缩并舔或摇动脚,或者在去除细丝的过程中快速收缩并舔或摇动脚,就会产生正反应。产生阳性反应的最小纤维刺激力记录为PWMT,每只大鼠平均三次,间隔5分钟。
番红O-固绿染色方法如下:
石蜡切片经乙醇脱蜡分级后,用0.5% Fast Green染色20min,0.5%番红O染色5min,然后进行梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性胶封口。在显微镜下观察关节软骨组织。
Ankin评分方法如下:
番红O-Fast Green染色完成后,根据改良的Mankin评分原则,由两名独立观察者评分关节软骨损伤的程度。分数范围从0到14;分数越高,关节退化越严重。
免疫组织化学分析方法如下:
将石蜡切片(4μm)脱水梯度酒精,在柠檬酸盐缓冲液中于95℃温育15分钟,并与过氧化物酶阻断剂温育30分钟。COMP,IFN-γ,HIF-1α,VEGF,col2a1和MMP-13的一抗在4℃温育过夜。用PBS孵育的切片作为阴性对照。此外,将fitc标记的二抗温育1小时,用PBS洗涤后,显色DAB溶液。用自来水洗涤后,用苏木精复染,梯度酒精脱水,二甲苯澄清,然后用中性口香糖密封。每个切片的五个部分被拍摄和照片。最后,根据双盲原则,由两个个体对免疫组织化学平均光密度(MOD)进行定量。
酶联免疫吸附测定(ELISA)方法如下:
采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测软骨中COX-2、iNOS、LOX、ltb4和pge-2的水平。ELISA试剂盒购自Affinity。所有操作均严格按照制造商的说明进行。
试验结果如下:
1、KA对软骨细胞OA体外模型的影响
本发明实施例中,通过KA处理检测了IL-1β处理的SW1353细胞(软骨细胞OA模型)的活力。检测到1,5,10,30,60,90,120μM浓度的KA,没有低于120μm的细胞毒性。此外,30,60,90μmKA处理的OA模型显示出显著高于OA模型的细胞活力(均p<0.05),如图1所示,其示出了KA对骨关节炎的细胞毒性和细胞增殖实验结果,其中,A部分为不同浓度的KA对SW1353细胞的细胞毒性和细胞增殖实验结果,B部分为IL-1β处理的SW1353细胞上不同浓度的KA。
本发明实施例中,还用ELISA检测了COX-2,iNOS,PGE2,LOX和LTB4,发现KA治疗组的这些炎性细胞因子低于OA组。此外,90μmKA组的炎性细胞因子显著低于30μmKA组。如图2中A部分-E部分所示,图2示出了KA对IL-1β诱导的SW1353细胞炎症介质的抑制作用分析结果图,其中,A-E部分表示在IL-1β处理的SW1353细胞(OA模型)上用不同浓度的KA浓度测试COX-2,iNOS,PGE2,LOX和ltb4的水平的测试结果;F部分表示实时荧光定量PCR检测SW1353细胞模型中MMP-2、MMP-3、MMP-13、SOX9、ADAMTS-5、COL2A1、Aggrecan、HAS2mRNA表达水平;G部分表示SW1353细胞模型中MMP-2,MMP-3,MMP-13和ADAMTS-5的代表性Western blot结果;H部分表示来自G部分所示的Western blot结果的定量分析结果。
为了探讨KA对OA炎症反应的影响,本发明实施例中,采用qRT-PCR检测OA治疗24h后炎症因子MMP-2,MMP-3,MMP-13,SOX9,ADAMTS-5,COL2A1,Aggrecan,has2的表达。结果表明,KA治疗组的所有炎症因子均低于OA组(如图2中F部分所示)。然而,与胶原降解相关的SOX9,COL2A1,Aggrecan和has2在KA处理组中高于OA组(如图2中F部分所示)。此外,高剂量的KA表明在90μmKA中减少炎性细胞因子的效果比在30μmKA中更好(如图2中f部分所示)。在MMP-2,MMP-3,MMP-13和ADAMTS-5中也通过Western blot发现相同的结果(如图2中G部分和H部分所示)。
以上结果表明,在适宜浓度范围内,KA对细胞无毒性作用。KA处理的软骨细胞OA模型炎性细胞因子水平较低,且KA浓度越高,效果越好。
2、KA对活体内软骨细胞OA模型的影响
如图3所示,图3示出了KA减缓木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎(OA)的进展分析结果,其中,A部分示出了治疗4周后大鼠关节的宏观图像;B部分示出了处理4周后用番红O-Fast染色的组织学图像;C部分示出了Mankin在不同组中得分。
具体的,在上述动物模型试验中,各组大鼠的关节软骨表面的大体外观如图3中A部分所示。可以看出假手术组大鼠显示出光滑、完整的关节软骨表面。OA组大鼠损伤、糜烂、裂隙,表现为严重损伤,DXM组减轻了软骨丢失,较OA组有所改善,但是,病变仍然突出;hi-KA组也表现出糜烂的迹象,但不如DXM组和对照组明显;lo-KA组软骨表面有轻微损伤,与假手术组更为接近,表明具有协同软骨保护作用。
本发明实施例中,还采用Mankin结构评分评估OA的损伤,其结果显示手术膝关节内侧股骨髁的结构软骨损伤评分显著高于治疗组(如图3中B部分和C部分所示)具体可以看出,未经治疗的OA组大鼠股骨外侧软骨显示出严重的软骨丢失,暴露出钙化的软骨下骨表面,不同于正常软骨细胞取向的对照光滑关节软骨表面,DXM和KA处理明显减少软骨损失,番红O-固绿强度降低,胶原纤维浓缩,表层纤维化和细胞死亡。此外,Hi--KA组和lo-KA组的Mankin评分低于DXM组(如图3中C部分所示)。此外,免疫组织化学显示KA处理减轻了II型胶原蛋白的损失和IFN-γ,HIF1α,VEGF和MMP13的减少(如图4中A部分和B部分所示)。图4示出了木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎的免疫组织化学染色结果。其中,A部分示出了软骨组织中Collagen II,IFN-γ,HIF1α,VEGF和MMP13蛋白具有代表性的免疫组织化学染色结果,B部分示出了软骨组织中Collagen II,IFN-γ,HIF1α,VEGF和MMP13蛋白的定量数据。
本发明实施例中,还探讨了步态结果,如图5所示,图5示出了木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎中的步态行为测试和机械撤退反应阈值检测结果。其中,A部分示出了在0w时检测到步态行为测试和机械撤退响应阈值检测结果;B部分示出了在4w时检测到步态行为测试和机械撤回响应阈值检测结果;C部分示出了4W期间步态行为测试和机械撤退反应阈值检测的变化。具体的,本发明实施例发现在基线(0w)时,手术组之间的步态参数没有显著差异(如图5中A部分所示)。在4周时,DXM和KA处理的OA大鼠表现出比OA大鼠更长的距离运行和更多的站立时间(如图5中B部分所示)。此外,与DXM组相比,hi-KA组显示出更好的长跑效果和相同的站立时间效果。然而,在0w或4w时,治疗的OA组与OA组之间没有显著性差异。因此,上述所有结果表明KA可能减轻OA的病理损伤并促进步态行为(如图5中C部分所示)。
3、KA对OA的转录组学分析
图6示出了SW1353细胞模型的转录组学分析结果,其中,A部分为维恩图:三种颜色代表三个不同的数据源,红色图表示IL-1β(OA模型)组与对照组之间的DEGs;蓝色图表示OA模型组与KA治疗组之间的DEGs;绿色图表示对照组与KA治疗组之间的DEGs;B部分示出了OA模型组和KA治疗组之间的GO功能富集分析结果,蓝色条表示BP注释图;红色条表示MF注释图;C部分示出了OA模型组与KA处理组之间的KEGG注释图;D部分示出了涉及基因的潜在KEGG途径;E部分示出了参与HIF-1途径的DEGs;F部分示出了hsa04066的GSEA结果;G部分示出了通过实时定量PCR检测SW1353细胞模型中SLC2A1、ENO2、PDK1、egln3和il6的mRNA水平。为了进一步探讨KA在IL-1β处理后的SW1353细胞(软骨细胞OA模型)中的机制,本发明实施例中还进行了RNA测序分析,以获得来自正常组、OA组和具有KA的OA组的样品的DEGs(如图6中A部分所示)。分析显示,当p<0.05时,前20个GO条目从KA调节的230个DEGs中富集(如图6中B部分所示)。共有14个生物学过程项目,包括细胞对氧气水平的反应、细胞对缺氧的反应、细胞对氧气水平降低的反应、对缺氧的反应、对氧气水平的反应等;共有6个分子功能项目,主要包括细胞因子活性、细胞因子受体结合、生长因子受体结合、受体-配体活性、信号受体活化剂活性和水通道活性(如图6中B部分所示),其中细胞因子受体结合的增长系数最大。KEGG通路富集分析进一步在KA调节的DEGs上进行。最后,结果显示前20个信号通路(p<0.05),其中主要包括HIF-1信号通路(如图6中C部分和D部分所示)。此外,DEGs显示下调基因SLC2A1,ENO2,PDK1,EGLN3,IL6,PFKFB3和Tie-2(如图6中E部分所示)。在目前的研究结果中,HIF-1信号通路上的GSEA显示28个基因聚集在hsa04066的前沿(NES=-2.0483,p<0.01)(如图6中F部分所示)。聚焦于HIF-1信号通路的关键作用,随后的RT-PCR验证确证了在mRNA表达水平观察到的影响。值得注意的是,与未治疗的OA组相比,在KA治疗后,SLC2A1,ENO2,PDK1,egln3和il6在OA组内表达显著降低(p<0.05)(如图6中G部分所示)。
4、KA治疗OA后HIF-1信号通路的表达变化及其确证
图7示出了KA处理的SW1353细胞模型中HIF-1和NF-κB信号传导途径的确证结果。其中,A部分示出了实时荧光定量PCR检测SW1353细胞模型中IFN-γ、NF-κB、HIF-1α、VEGF和iNOS的mRNA表达水平;B部分示出了SW1353细胞模型中IFN-γ,NF-κB,HIF-1α,VEGF和iNOS的代表性Western blot结果;C部分示出了来自B部分和D部分的Western blot数据的定量。D部分示出了SW1353细胞模型中IFN-γ,NF-κB,HIF-1α,VEGF和iNOS的代表性免疫荧光结果;E部分示出了来自D部分和F部分的免疫荧光数据的定量。F部分示出了SW1353细胞模型中Tie2和PFKFB3的mRNA水平;G部分示出了SW1353细胞模型中Tie2,PFKFB3,p-p65和p-IκBα的代表性Western blot结果;H示出了来自G部分的Western blot数据的定量。
从图7可以看出,与OA组相比,KA组IFN-γ,NF-κB,HIF-1α,VEGF,iNOS,Tie2和PFKFB3的mRNA表达水平降低(p<0.05)(如图7中A部分和F部分所示);这表明解释KA如何减少OA损伤的机制可能与上述靶点和信号传导途径有关。
此外,HIF-1信号通路中关键靶基因(IFN-γ,NF-κB,HIF-1α,VEGF,iNOS,Tie2和PFKFB3)的蛋白表达在OA组中均显著增加对照组,然后随着KA治疗而降低(p<0.05)(如图7中B部分、C部分、G部分和H部分所示)。免疫荧光也证明HIF-1信号通路中的关键蛋白在OA组中显著增加,并且KA可以降低该表达(如图7中D部分和E部分所示)。因此,这证实了KA减少OA损伤的机制可能与HIF-1信号通路有关。
为了证实NF-κB的作用,p65,p-p65,IKBα和p-IKBα蛋白的表达,发明人发现KA可能减少p65和IKBα磷酸化的影响(如图7中G部分和H部分所示)。
接下来,为了证实HIF-1信号传导途径的作用,本发明使用外源性IFN-γ和抗IFN-γ抗体Emapalumab。图8示出了KA处理的SW1353细胞模型中HIF-1信号传导途径的确证,其中,A部分示出了在用外源性IFN-γ或Emapalumab或IFN-γ+KA或Emapalumab+KA处理的SW1353细胞模型中IFN-γ,NF-κB,HIF-1α,VEGF和iNOS的mRNA水平;B部分示出了用外源IFN-γ或Emapalumab或IFN-γ+KA或Emapalumab+KA处理的SW1353细胞模型中IFN-γ,NF-κB,HIF-1α,VEGF和iNOS的Western blot数据的定量;C部分示出了来自B部分和D部分的Western blot数据的定量,D部分示出了用DMOG或LW6或DMOG+KA或LW6+KA处理的SW1353细胞模型中HIF-1α,VEGF,iNOS,Tie2和PFKFB3的mRNA水平;E部分示出了用DMOG或LW6或DMOG+KA或LW6+KA处理的SW1353细胞模型中HIF-1α,VEGF,iNOS,Tie2和PFKFB3的Western blot数据的定量;F.部分示出了来自E部分的Western blot数据的定量,实验中使用的浓度如下:KA(90μM),Emapalumab(2pmol/l),IFN-γ(1ng/mL),IL-1β(10ng/mL),LW6(10μM)和DMOG(90μM)。
由图8可见,用外源性IFN-γ处理,IFN-γ,NF-κB,HIF-1α,VEGF和iNOS的mRNA和蛋白的表达均增加,然后随着KA或Emapalumab的处理而降低(如图8中A-C部分所示)。此外,KA和Emapalumab联合治疗显著降低了这些基因的mRNA和蛋白质的表达(如图8中A-C部分所示)。
此外,使用HIF-1α激动剂DMOG和HIF-1α抑制剂LW6进一步证实HIF-1α在KA中的作用。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)信号通路的mRNA和蛋白表达在DMOG作用下增加,而在KA作用下显著降低(如图8中D部分、F部分所示)。此外,LW6显著降低HIF-1α途径中mRNA和蛋白的表达,并且随着KA的使用,表达进一步降低(如图8中D部分、F部分所示)。因此,发明人得出这样的结论:HIF-1是KA治疗OA的主要信号通路。
为了进一步确认KA与IFN-γ之间的亲和力,本发明实施例中进行了分子对接分析。发现KA与IFN-γ之间的相互作用能量为-5.7千卡/摩尔,表明两者之间存在强烈的结合活性。本发明实施例的对接分析揭示了KA与IFN-γ活性位点的关键残基,如LYS55、ASN217、LYS175和LYS178之间存在特定的氢键相互作用(参见图9)。
基于上述实施例的探索研究,发明人提出:山奈素(KA)作为一种多方面的天然黄烷醇化合物,由于其多样的药理学特征,在骨关节炎(OA)治疗中显示出显著的潜力。具体而言,KA可能通过显著下调炎性细胞因子,特别是MMP-2和MMP-3等来减轻OA损伤,并能增强大鼠的步态行为。MMPs是OA进展中的一类蛋白水解酶,其促进软骨基质成分的降解,例如胶原蛋白II,这是平衡关节软骨ECM的合成和降解的关键因素。KA可以有效地抵抗IL-1β诱导的MMPs和其他炎性细胞因子,如LOX,iNOS,PGE2,ltb4和COX-2,最终抑制胶原降解,这表明其通过炎性细胞因子抑制的抗分解代谢作用。这强调了KA在减轻与OA相关的软骨细胞功能不良方面的潜力。
本发明实施例还利用活体OA动物模型来彻底研究KA的保护作用。形态学和超微结构观察表明,KA显著降低木瓜蛋白酶诱导的OA大鼠的软骨降解并降低Mankin组织学评分。结果还表明,KA大大促进了大鼠的步态行为。因此,研究结果提示KA在OA治疗中具有潜在的应用价值。
此外,通过转录组学研究探讨了KA在骨关节炎治疗中的作用机制。发明人发现在KA参与的OA组中,与OA组相比,SLC2A1,ENO2,PDK1,EGLN3,IL6,Tie2和PFKFB3。这表明KA减少OA损伤的机制可能与HIF-1信号通路有关。HIF-1信号通路中关键靶基因(IFN-γ,NF-κB,HIF-1α,VEGF,iNOS,Tie2,PFKFB3)的mRNA或蛋白表达与正常组相比,OA组均有显著改善,且随着KA的治疗而降低。先前的证据表明HIF-1信号通路中的HIF-1α广泛定位于早期软骨形成,主要在去分化的软骨细胞中表达,并影响sox9在骨骼发生过程中的表达。与本发明实施例的研究一致,OA模型中的后处理显示这些基因的水平降低以及SOX9,COL2A1和聚集蛋白聚糖的高表达。这表明HIF-1信号通路在KA对OA的治疗作用中的潜在显著性。值得一提的是,Tie2是血管内皮生长因子受体的关键类型,PFKFB3是磷酸果糖激酶/果糖-2,6-二磷酸酶的关键亚型。先前的研究表明Tie2在通过HIF-1α调节的炎症和血管生成途径中的关键参与,这可以解释KA在减少OA损伤中的功效。另一方面,PFKFB3在葡萄糖代谢调节中起着关键作用。过去的研究表明,抑制PFKFB3可以通过调节糖酵解途径来抑制tnf-α诱导的大鼠OA。本发明实施例的研究表明,KA显著降低SW1353细胞模型中Tie2和PFKFB3的表达水平。因此,研究表明KA可能通过影响血管生成和葡萄糖代谢途径来影响OA治疗。
基于这些发现,本发明实施例进一步深入探讨了KA对OA影响的调节机制,重点关注IFN-γ作为HIF-1信号传导途径中关键介质的作用。IFN-γ作为关键的炎症介质,在免疫调节,抗病毒防御和抗肿瘤活性中起作用。鉴于OA是一种炎症性疾病,本发明实施例继续研究IFN-γ的调节。本发明实施例的研究结果揭示了IFN-γ在HIF-1信号通路中关键基因表达的重要性,证明了其在KA介导的OA治疗中作为上游因子的潜力。为了直接验证IFN-γ在KA抑制OA中的作用,本发明实施例采用分子对接的方法预测KA与IFN-γ的结合作用。提示KA可能通过抑制HIF-1信号通路的上游因子IFN-γ,从而影响与其相关的下游因子,减轻骨关节炎的进展。
为了进一步证明本发明实施例中的发现,本发明实施例进行了额外的实验,验证了HIF-1途径中另一个关键因子HIF-1α的参与。近年来,HIF-1α被认为是维持正常软骨细胞功能的保护因子,主要通过促进软骨细胞代谢,分化和基质分泌。尽管HIF-1α在ECM合成中具有重要意义,但由于HIF-1α信号传导的病理性增加干扰细胞生物能和生物合成,因此骨骺软骨细胞需要HIF-1α的失活以避免骨骼发育不良。在本发明实施例的研究中,发现KA可以通过抑制HIF-1α来减少骨关节炎细胞模型中Tie2,PFKFB3,VEGF和iNOS等下游因子的产生。这个实验验证证了我们关于KA对OA影响中HIF-1信号通路的发现。
除了HIF-1信号通路及其潜在的相关因子之外,本发明实施例进一步深入研究了NF-κB通路的参与。本发明实施例中Western blot数据强调了KA对p65和IκBα磷酸化水平的影响。这些发现强调了KA显著抑制p65和IκBα磷酸化的能力,与观察到的炎症因子合成减少相一致。这进一步证实了KA对与OA炎症相关的关键途径的多方面影响。
如图10所示,其示出了本发明实施例的探索路线示意图,本发明实施例中,第一部分旨在探讨山奈素在体内外抗骨关节炎的效果,涉及构建SW1353人软骨肉瘤细胞体外炎性软骨细胞模型和木瓜蛋白酶诱导的OA大鼠模型,并验证KA对这些模型的影响;第二部分旨在探讨山奈素抗骨关节炎相关机制的体内外研究,通过转录组测序及生物信息学分析,寻找KA可能的作用靶点及其下游分子。
综上所述,本发明实施例的研究证明了KA在软骨细胞和大鼠中的抗炎和疾病缓解作用。这些结果证明KA有可能通过介导HIF-1信号通路来抑制炎症介质的过度表达来保护软骨细胞。此外,我们还证实KA可以减缓木瓜蛋白酶诱导的OA大鼠的软骨和胶原变性。总的来说,KA可以成为OA患者的有益治疗药。
简而言之,发明人研究证明了山奈素在骨关节炎治疗中的潜力,强调了它的抗炎和疾病缓解作用。KA通过影响HIF-1信号传导途径有效地减少炎症和软骨降解。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
以上对本发明所提供的一种山奈素在制备治疗骨关节炎的药物中的应用,进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本发明的思想,在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处,综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (8)
1.山奈素在制备治疗骨关节炎的药物中的应用,其特征在于,所述山奈素为3,5,7-三羟基-4’-甲氧基黄酮。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述山奈素通过介导HIF-1信号通路抑制炎症介质的表达和软骨降解。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述山奈素抵抗IL-1β诱导的MMPs、LOX,iNOS,PGE2,ltb4和COX-2,抑制胶原降解。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述山奈素通过下调炎性细胞因子MMP-2和MMP-3减轻骨关节炎损伤。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述山奈素通过抑制HIF-1信号通路的上游因子IFN-γ,影响与其相关的下游因子,减轻骨关节炎的进展。
6.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述山奈素通过抑制HIF-1α减少骨关节炎细胞模型中下游因子Tie2,PFKFB3,VEGF和iNOS的产生。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述山奈素通过影响血管生成和葡萄糖代谢途径来影响OA治疗。
8.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述山奈素抑制p65和IκBα磷酸化的能力。
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