CN118055780A - Best1功能丧失突变和功能获得突变的挽救策略 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于挽救基因功能以及治疗和预防疾病或病症(例如，bestrophin病(bestrophinopathy))的方法、组合物和系统。具体地，本公开提供了包括以下的系统：成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)‑Cas系统，或编码CRISPR‑Cas系统的一种或多种核酸，其配置为敲除或至少部分沉默靶内源基因的两个等位基因，其中CRISPRi系统包含：(a)至少一种Cas蛋白，(b)至少一种gRNA，其中每种gRNA配置为与编码靶内源基因的核酸序列的一部分杂交，以及(c)转录阻遏物；和编码靶内源基因的外源功能性形式的核酸。进一步公开了使用该系统来挽救Bestropin‑1(BEST1)功能丧失突变和功能获得突变的方法。

Description

BEST1功能丧失突变和功能获得突变的挽救策略
对相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月13日提交的美国临时申请号63/174,090的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开涉及用于挽救基因功能以及治疗和预防疾病或病症(例如，bestrophin病)的方法、组合物和系统。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在由美国国家卫生研究院授予的EY028758和GM127652下的政府支持下完成的。政府具有本发明中的一定权利。
序列表声明
随附提交的标题为“40036-601_序列表_ST25”，创建于2022年4月13日，文件大小为2,086字节的计算机可读序列表的文本，在此通过引用以其整体并入。
发明背景
人BEST1基因编码主要在视网膜色素上皮(RPE)中表达的Ca2+激活的Cl-通道(BEST1)，该基因的基因突变导致一系列视网膜退行性病症，通常称为bestrophin病(bestrophinopathy)。迄今为止，BEST1突变的病理机制仍不清楚，因此，没有有效的治疗或预防策略。
发明内容
本文提供了用于挽救基因功能以及治疗和预防疾病和病症(例如，bestrophin病)的方法。在一些实施方案中，方法包括将有效量的以下引入到细胞中：成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)-Cas系统，或编码CRISPR-Cas系统的一种或多种核酸，其被配置为敲除或至少部分沉默靶内源基因的两个等位基因；以及编码靶内源基因的外源功能性形式的核酸。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统包含至少一种Cas蛋白和至少一种gRNA，其中每种gRNA配置为与编码靶内源基因的核酸序列的一部分杂交。在一些实施方案中，该至少一种gRNA配置为不与靶内源基因的外源功能性形式杂交。在一些实施方案中，靶内源基因的外源功能性形式包含与靶内源基因的核酸序列不同的核酸序列，并且编码多肽，该多肽包含与靶内源基因的野生型形式的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该一种或多种核酸包括一种或多种信使RNA、一种或多种载体、或其组合。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是CRISPR干扰(CRISPRi)系统。在一些实施方案中，CRISPRi系统包含：至少一种Cas蛋白；至少一种gRNA，其中每种gRNA配置为与编码靶内源基因的核酸序列的一部分杂交；以及转录阻遏物。在一些实施方案中，Cas蛋白和转录阻遏物作为融合蛋白或编码其的核酸提供。在一些实施方案中，转录阻遏物和Cas蛋白或至少一种gRNA各自包含来自募集系统的结合对的一半。在一些实施方案中，Cas蛋白是无催化活性的。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9、Cas12a和Cas14。
在一些实施方案中，Cas蛋白、至少一种gRNA以及转录阻遏物(当包含时)在单个核酸上提供。在一些实施方案中，单个核酸是载体。在一些实施方案中，单个核酸是杆状病毒载体或慢病毒载体。
在一些实施方案中，靶内源基因是疾病相关联的基因。在一些实施方案中，靶内源基因的至少一个等位基因具有功能获得突变。在一些实施方案中，靶内源基因的至少一个等位基因具有功能丧失突变。在一些实施方案中，靶内源基因是BEST1。在一些实施方案中，BEST1基因包含D203A突变、I205T突变或Y236C突变。
在一些实施方案中，细胞是体内的。在一些实施方案中，引入到细胞中包括施用至受试者。
在一些实施方案中，受试者患有或疑似患有眼部疾病或眼部病症。在一些实施方案中，受试者患有或疑似患有神经退行性疾病。在一些实施方案中，疾病或病症包括Best卵黄状黄斑营养不良(BVMD)、常染色体隐性bestrophin病(ARB)、成人发病的卵黄状营养不良(AVMD)、常染色体显性玻璃体视网膜脉络膜病变(ADVIRC)、或色素性视网膜炎(RP)。在一些实施方案中，该方法治疗或预防受试者中的疾病或病症。
本文还提供了包括以下的系统：成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)-Cas系统，或编码CRISPR-Cas系统的一种或多种核酸，其被配置为敲除或至少部分沉默靶内源基因的两个等位基因；以及编码靶内源基因的外源功能性形式的核酸。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统包括至少一种Cas蛋白和至少一种gRNA，其中每种gRNA配置为与编码靶内源基因的核酸序列的一部分杂交。在一些实施方案中，该至少一种gRNA配置为不与靶内源基因的外源功能性形式杂交。在一些实施方案中，靶内源基因的外源功能性形式包含与靶内源基因的核酸序列不同的核酸序列，并且编码多肽，该多肽包含与靶内源基因的野生型形式的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该一种或多种核酸包括一种或多种信使RNA、一种或多种载体、或其组合。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是CRISPR干扰(CRISPRi)系统。在一些实施方案中，CRISPRi系统包括：至少一种Cas蛋白；至少一种gRNA，其中每种gRNA配置为与编码靶内源基因的核酸序列的一部分杂交；以及转录阻遏物。在一些实施方案中，Cas蛋白和转录阻遏物作为融合蛋白或编码其的核酸提供。在一些实施方案中，转录阻遏物和Cas蛋白或至少一种gRNA各自包含来自募集系统的结合对的一半。在一些实施方案中，Cas蛋白是无催化活性的。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9、Cas12a和Cas14。
在一些实施方案中，Cas蛋白、至少一种gRNA以及转录阻遏物(当包含时)在单个核酸上提供。在一些实施方案中，单个核酸是载体。在一些实施方案中，单个核酸是杆状病毒载体或慢病毒载体。
在一些实施方案中，靶内源基因是疾病相关联的基因。在一些实施方案中，靶内源基因的至少一个等位基因具有功能获得突变。在一些实施方案中，靶内源基因的至少一个等位基因具有功能丧失突变。在一些实施方案中，靶内源基因是BEST1。在一些实施方案中，BEST1基因包含D203A突变、I205T突变或Y236C突变。
本文进一步提供了在有此需要的受试者中延迟发作、治疗、预防和/或治愈神经退行性疾病的方法，其包括将有效量的一种或多种包含CRISPR系统的病毒载体，以及编码内源基因的野生型等位基因的核酸施用至受试者，其中该CRISPR系统沉默内源基因的两个等位基因。本文进一步提供了恢复基因功能的方法，其包括施用有效量的一种或多种包含CRISPR系统的病毒载体，以及编码内源基因的野生型等位基因的核酸，其中该CRISPR系统沉默内源基因的两个等位基因。
在一些实施方案中，该基因是BEST1。在一些实施方案中，受试者具有内源基因中的功能获得突变。在一些实施方案中，受试者具有内源基因中的功能丧失突变。
在一些实施方案中，病毒载体是杆状病毒或慢病毒。在一些实施方案中，功能获得突变是D203A、I205T或Y236C。在一些实施方案中，包含CRISPR系统的病毒载体包含基于杆状病毒的沉默(BVSi)载体，其含有CMV启动子驱动的dCas9-KRAB-MeCP2-T2A-GFP表达盒，以及U6启动子驱动的gRNA表达盒。
在一些实施方案中，CRISPR系统靶向BEST1基因的外显子3，并且gRNA具有序列CTCACCCAGCACGAAGGAAA(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，包含编码野生型等位基因杆状病毒的核酸的病毒载体包含对CRISPR系统的gRNA识别具有抗性的摆动WT BEST1-mCherry。
考虑到以下详细描述和附图，本公开的其他方面和实施方案将是显而易见的。
附图简述
图1A-1H显示了BEST1功能丧失突变体在HEK293细胞中的功能性影响。图1A是在存在1.2μM[Ca2+]i的条件下，表达以下的HEK293细胞中群体稳定状态电流密度-电压关系的图：仅BEST1 WT-CFP(黑色)，WT-CFP:WT-YFP＝1:1(灰色)，或WT-CFP:WT-YFP＝1:4(浅灰色)，对于每个点n＝5-6。图1B-1H是在存在1.2μM[Ca2+]i的条件下，与仅表达突变体(红色)或WT(圆形)的HEK293细胞相比，表达BEST1 WT-CFP:突变体-YFP＝1:1(青色)，WT-CFP:突变体-YFP＝1:1(品红色)的HEK293细胞中群体稳定状态电流密度-电压关系的图，对于每个点n＝5-6。突变体是BEST1 A10T(图1B)、R218H(图1C)、L234P(图1D)、A243T(图1E)、Q293K(图1F)、D302A(图1G)和P274R(图1H)。此图中所有误差条均代表s.e.m.。
图2A-2D显示了BEST1功能获得突变体在HEK293细胞中的功能性影响。图2A-2C(左图)是在不存在(空心)或存在(实心)1.2μM[Ca2+]i的条件下，与仅表达WT(WT-CFP:WT-YFP＝1:1，灰色)的HEK293细胞相比，共表达WT-CFP:突变体-YFP＝1:1(青色)的HEK293细胞中群体稳定状态电流密度-电压关系的图，对于每个点n＝5-6。图2A-2C(右图)是在不存在(空心)或存在(实心)1.2μM[Ca2+]i的条件下，与仅表达突变体(红色)的HEK293细胞相比，共表达WT-CFP:突变体-YFP＝4:1(蓝色)的HEK293细胞中群体稳定状态电流密度-电压关系的图，对于每个点n＝5-6。突变体是BEST1 D203A(图2A)、I205T(图2B)和Y236C(图2C)。此图中所有误差条均代表s.e.m.。WT或突变体BEST1-YFP-His与WT BEST1-CFP-Myc在HEK293细胞中共表达，并在细胞裂解物(输入)中通过免疫印迹直接进行检测，或在共免疫沉淀之后进行检测(图2D)。
图3A-3E显示了，在hPSC-RPE中，BEST1负责传导Ca2+依赖性Cl-电流。图3A是在WThPSC-RPE中通过全细胞膜片钳测量出的Ca2+依赖性Cl-电流。左图，在1.2μM[Ca2+]i下记录的代表性电流描线图。嵌入图，用于引发电流的电压方案。比例尺，1nA，140ms。中图，在1.2μM[Ca2+]i下，与来自WT iPSC-RPE(灰色)的群体稳定状态电流密度-电压关系相比，WT hPSC-RPE(黑色)中的群体稳定状态电流密度-电压关系，对于每个点n＝5-6。右图，与来自WTiPSC-RPE(灰色)的稳定状态电流密度相比，来自WT hPSC-RPE(黑色)的在+100mV下绘制记录的稳定状态电流密度与游离[Ca2+]i，对于每个点n＝5-6。将图拟合至希尔方程。图3B-3E分别显示了BEST1-/-(图3B)、TMEM16A-/-(图3C)、TMEM16B-/-(图3D)或LRRC8A-/-(图3E)hPSC-RPE细胞中，通过全细胞膜片钳测量的Ca2+依赖性Cl-电流。左图，在1.2μM[Ca2+]i下，分别记录的代表性电流描线图。中图，在1.2μM[Ca2+]i下，与来自WT hPSC-RPE细胞(圆形)的群体稳定状态电流密度-电压关系相比，敲除hPSC-RPE细胞(三角形)的群体稳定状态电流密度-电压关系，对于每个点n＝5-6。右图，与来自WT hPSC-RPE的图(黑色虚线)相比，与来自敲除(红色)和补充WT BEST1的hPSC-RPE细胞(图3B中Kd上方的三角形)在+100mV下绘制记录的稳定状态电流密度与游离[Ca2+]i，对于每个点n＝5-6。将图拟合至希尔方程。使用双尾非配对学生t检验，与WT细胞相比，*P<0.05。此图中所有误差条均代表s.e.m.。
图4A-4F显示了，携带BEST1功能获得突变的hPSC-RPE细胞中的Ca2+依赖性Cl-电流。图4A是在不存在Ca2+的情况下，BEST1I205T/WT hPSC-RPE的代表性电流扫描线。比例尺，1nA，140ms。图4B是，与不存在Ca2+的情况下具有WT BEST1增强的细胞(空心蓝色三角形)相比，在不存在(空心红色三角形)或存在(实心红色三角形)1.2μM[Ca2+]i的情况下，BEST1I205T/WT hPSC-RPE中的群体稳定状态电流密度-电压关系的图，对于每个点n＝5-8。使用双尾非配对学生t检验，与在不存在Ca2+的情况下没有增强的细胞相比，*P<0.05。图4C是与BEST1WT/WT hPSC-RPE细胞(圆形)的稳定状态电流密度与游离[Ca2+]i相比，在BEST1I205T/WThPSC-RPE(三角形)中的在+100mV下绘制记录的稳定状态电流密度与游离[Ca2+]i，对于每个点n＝5-6。图4D-4F以与图4A-4C相同的格式分别显示了BEST1Y236C/WT的数据。使用双尾非配对学生t检验，与在不存在Ca2+的情况下没有基因增强的细胞相比，*P<0.05，对于每个点n＝5-10。此图中所有误差条均代表s.e.m.。
图5A-5F显示了hPCS-RPE细胞中BEST1功能获得突变的敲低和挽救。图5A是在1.2μM[Ca2+]i下，与BVSi 3-8(红色圆形)或BVSi 5-4(蓝色三角形)处理的细胞中的群体稳定状态电流密度-电压关系相比，用BVSi-Ctrl处理的WT hPSC-RPE细胞(黑色方形)中的群体稳定状态电流密度-电压关系的图，对于每个点n＝5-17。使用双尾非配对学生t检验，与BVSi-ctrl处理的细胞相比，*P<0.05。图5B是在1.2μM[Ca2+]i下，与未处理细胞(黑色)中的群体稳定状态电流密度-电压关系相比，用BVSi 3-8加摆动WT BEST1处理的WT hPSC-RPE细胞(灰色)中的群体稳定状态电流密度-电压关系图，对于每个点n＝5-6。图5C-5D是在1.2μM[Ca2 +]i下，单独用BVSi3-8(红色圆形)或BVSi3-8加摆动WT BEST1(蓝色三角形)处理的BEST1I205T/WT(图5C)或BEST1Y236C/WT(图5D)hPSC-RPE细胞中的群体稳定状态电流密度-电压关系图，对于每个点n＝5-9。使用双尾非配对学生t检验，与单独用BVSi 3-8处理的细胞相比，*P<0.05。图5E-5F是与未处理WT hPSC-RPE(黑点)中的稳定状态电流密度与游离[Ca2+]i相比，用BVSi 3-8加摆动WT BEST1(蓝色三角形)处理的BEST1I205T/WT(图5E)或BEST1Y236C/WT(图5F)hPSC-RPE细胞中在+100mV下绘制记录的稳定状态电流密度与游离[Ca2+]i的图，对于每个点n＝5-6。将图拟合至希尔方程。此图中所有误差条均代表s.e.m.。
图6A和6B显示了BEST1功能丧失突变的电生理学分析。图6A是显示了在1.2μM[Ca2 +]i下，HEK293细胞中1:1共表达BEST1 WT-CFP和WT/突变体-YFP的在+100mV下的群体稳定状态电流密度的柱状图；对于每个点n＝5-6。图6B是显示在1.2μM[Ca2+]i下，HEK293细胞中1:4共表达BEST1WT-CFP和WT/突变体-YFP的在+100mV下的群体稳定状态电流密度的柱状图；对于每个点n＝5-6。使用双尾非配对学生t检验，仅与WT相比，*P<0.05。此图中所有误差条均代表s.e.m.。
图7A和7B显示了BEST1功能获得突变的电生理学分析。图7A是显示了在不存在(空心)或存在(实心)1.2μM[Ca2+]i的条件下，HEK293细胞中1:1共表达BEST1 WT-CFP和WT/突变体-YFP的在+100mV下的群体稳定状态电流密度的柱状图；对于每个点n＝5-6。使用双尾非配对学生t检验，分别与在不存在或存在Ca2+的情况下的仅WT相比，*#P<0.05。图7B是显示在不存在(空心)或存在(实心)1.2μM[Ca2+]i的条件下，HEK293细胞中4:1共表达BEST1 WT-CFP和WT/突变体-YFP的在+100mV下的群体稳定状态电流密度的柱状图；对于每个点n＝5-6。使用双尾非配对学生t检验，分别与在不存在或存在Ca2+的情况下的仅WT相比，*#P<0.05。此图中所有误差条均代表s.e.m.。
图8A和8B是Western印迹，其显示了hPSC-RPE(图8A)和iPSC-RPE(图8B)细胞中的RPE特异性蛋白BEST1、RPE65、CRALBP和加载对照β肌动蛋白的表达。从每个PSC-RPE的相同细胞裂解物中制备两个凝胶/印迹，以分别检测BEST1+β肌动蛋白以及RPE65+CRALBP。
图9A-9C显示了在hPSC-RPE细胞中，CaCC的mRNA水平。图9A是RT-PCR，其检测了WT幼稚RPE、iPSC-RPE和hPSC-RPE细胞中的BEST1和对照β肌动蛋白mRNA。在PCR反应中，将携带相应的全长cDNA的质粒用作阳性对照。图9B是RT-PCR，其检测了WT幼稚RPE、iPSC-RPE和hPSC-RPE细胞中TMEM16A、TMEM16B和LRRC8A的mRNA。在PCR反应中，将携带相应的全长cDNA的质粒用作阳性对照。图9C是RT-PCR，其检测了WT和敲除hPSC-RPE细胞中的BEST1和对照β肌动蛋白mRNA。
图10A-10D显示了iPSC-RPE和hPSC-RPE细胞中的Ca2+依赖性Cl-电流。图10A是在患者衍生的无BEST1 iPSC-RPE中通过全细胞膜片钳测量的Ca2+依赖性Cl-电流。在1.2μM[Ca2 +]i下记录的代表性电流扫描线。比例尺，1nA，140ms。图10B是在1.2μM[Ca2+]i下，与WT iPSC-RPE(灰色圆形)中的群体稳定状态电流密度-电压关系相比，无BEST1 iPSC-RPE(红色三角形)中的群体稳定状态电流密度-电压关系的图，对于每个点n＝5-6。使用双尾非配对学生t检验，与WT细胞相比，*P<0.05。图10C是与WT iPSC-RPE(灰色)相比，来自无BEST1(红色三角形)和补充有WT BEST1的无BEST(蓝色三角形)的在+100mV下记录的稳定状态电流密度与游离[Ca2+]i的图，对于每个点n＝5-6。将图拟合至希尔方程。图10D是柱状图，其显示了在1.2μM[Ca2+]i下，hPSC-RPE细胞中在+100mV下的群体稳定状态电流密度，对于每个点n＝5-6。记录了来自每个基因型的两个克隆性hPSC-RPE细胞。黑色，WT。灰色，敲除突变体或敲入突变体。此图中所有误差条均代表s.e.m.。
图11A-11D显示了CRISPR/Cas9介导的基因沉默与基因增强的组合。通过免疫印迹在hPSC-RPE细胞中检测增强的BEST1-GFP和内源BEST1(图11A)。图11B是BVSi载体的示意图。图11C是Western印迹，其显示了在WT hPCS-RPE细胞中，使用BVSi载体对内源BEST1表达的敲低以及使用摆动BEST1-mCherry的增强。图11D是Western印迹，其显示了在携带BEST1功能获得突变的hPCS-RPE细胞中，使用BVSi 3-8对内源BEST1表达的敲低以及使用摆动BEST1-mCherry的增强。
图12A和12B显示了，同源模型中患者衍生的BEST1突变。显示了BEST1五聚体的反向面对(144°)的原聚体的带状图，其中细胞外侧位于顶部。在图12A中，示出了颈部和缝隙的位置。在图12B中，显示了侧链并突出了携带显性(红色)和隐性(蓝色)功能丧失突变和功能获得突变(洋红色)的残基。在图12C中，显示了侧链并突出了颈部(I76、F80和F84，浅橙)和缝隙(I205，洋红色)处的残基。
图13A和13B分别是图2D和图8的未裁剪的印迹。
发明详述
本公开提供了用于挽救基因功能以及治疗和预防疾病或病症(例如，bestrophin病(bestrophinopathy))的方法。如本文所示，开发了挽救BEST1功能获得突变的组合方法；内源BEST1基因(包括突变体和WT等位基因)由CRISPR/Cas9介导的基因沉默抑制，而功能性BEST1基因的外源拷贝同时得到增强。为了基因沉默，采用了由在C末端与二分KRAB-MeCP2阻遏结构域融合的无核酸酶活性Cas9(dCas9)构成的可编程转录阻遏物(dCas9-KRABMeCP2)。
为了同时递送完整的CRISPR机制，构建了基于杆状病毒的沉默(BVSi)载体，其含有CMV启动子驱动的dCas9-KRAB-MeCP2-T2A-GFP表达盒，以及U6启动子驱动的BEST1特异性gRNA表达盒。为了在BVSi存在的情况下增强BEST1，生成了携带对gRNA的识别具有抗性的摆动WT BEST1-mcherry的杆状病毒。当携带BEST1功能获得突变的RPE细胞用BVSi和摆动WTBEST1-mcherry杆状病毒同时进行感染时，BEST1的细胞功能得到恢复。
当突变体BEST1和WT BEST1在HEK293细胞中以不同比率共表达时，确定了不同类别的患者衍生的突变对该通道的功能性影响。引人注目的是，六种常染色体显性功能丧失突变都以与WT BEST1 1:1的比率隐性表现，并且需要4:1的比率才能展示出突变体表型，这表明它们以显性失活方式而非典型的显性方式发挥作用，这阐明了基因增强足以挽救常染色体显性功能丧失突变的结果。与此发现一致的是，在患者衍生的RPE细胞中，突变体BEST1等位基因在比WT等位基因的更高水平下进行转录。与此形成鲜明对比的是，三种常染色体显性功能获得突变都展示出显性表现，即使在与WT BEST1的较低的1:4比率下。由于其强显性效应，BEST1功能获得突变不可以单独通过基因增强来挽救，而需要与基因增强组合的CRISPR/Cas9介导的内源BEST1沉默，以恢复RPE细胞中Ca2+依赖性Cl-电流。此外，BEST1作为真正的Ca2+依赖性Cl-电流(CaCC)的生理作用在RPE中得到了证实。总而言之，该结果揭示了功能丧失突变和功能获得突变之间的差异，并为所有BEST1突变提供治疗策略。
如本文所公开的，BEST1患者衍生的功能突变丧失和功能获得突变需要不同的突变体:野生型(WT)分子比率来表现表型，这是它们在bestrophin病进展中不同的表观遗传要求的基础，并且表明一些此前定义的常染色体显性突变实际上以显性失活的方式表现。重要的是，与经由相同方法有效挽救功能丧失突变相反，BEST1功能获得突变的强显性效应阻止了通过基因增强恢复RPE细胞中BEST1依赖性Cl-电流。通过组合基因增强与CRISPR/Cas9介导的内源BEST1表达的敲低，挽救了功能获得突变，这为所有bestrophin病患者(无论其突变类型)提供了通用的治疗策略。
因此，本文提供了用于治疗和预防疾病和病症(例如眼部疾病或神经变性疾病，例如与功能获得突变相关的那些)的治疗方法。本文还提供了用于治疗和预防与BEST1功能获得突变相关的bestrophin病的治疗方法，其还适合于功能丧失突变。
如本节和本文的全部公开中使用的节标题仅出于组织目的，并非旨在作为限制。
定义
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”及其变体旨在是不排除额外行为或结构的可能性的开放式的过渡性短语、术语或词语。单数形式“一”、“和”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。本公开还考虑了“包含本文呈现的实施方案或元素”、“由本文呈现的实施方案或元素组成”和“基本上由本文呈现的实施方案或元素组成”的其他实施方案，无论是否明确阐述。
对于本文的数字范围的叙述，明确考虑了其间具有相同精确度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外，还考虑了数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
除非本文另有定义，与本公开有关的所使用的科学和技术术语应具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。例如，与本文所述的分子生物学、免疫学以及蛋白质和核酸化学有关地使用的任何命名法，以及本文所述的分子生物学、免疫学以及蛋白质和核酸化学的技术是本领域众所周知和常用的那些。术语的含义和范围应当是清楚的；然而，如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。此外，除非语境另有需要，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。
如本文所用，术语“施用”、“提供”和“引入”在本文可互换地使用，并且指通过导致至少部分定位期望的部位的方法或途径放置到受试者中。施用可以通过导致递送至受试者中的期望位置的任何适当的途径进行。
如本文所用，“CRISPR-Cas系统”总体地指涉及CRISPR相关联的“(Cas”)基因的表达和/或指导其活性的转录物和其他元件，其包括编码来自CRISPR基因座的Cas基因、Cas蛋白、cr(CRISPR)序列(例如，crRNA或活性的部分crRNA)的序列，或其他序列和转录物。在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件衍生自I型、II型或III型CRISPR系统。
术语“基因”指DNA序列，其包含产生具有非编码功能的RNA(例如核糖体RNA或转运RNA)、多肽或任何前述物的前体所必需的控制序列和编码序列。RNA或多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保持期望的活性或功能。因此，“基因”指编码在生物体中具有功能性作用的多肽或RNA链的DNA或RNA，或其部分。出于本公开的目的，无论此类调控序列是否与编码序列和/或转录序列相邻，都可以认为基因包括调控产生基因产物的区域。因此，基因包括但不一定限于，启动子序列、终止子、翻译调控序列诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。
如本文所用，“核酸”指嘧啶和/或嘌呤碱基，优选地分别是胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶、以及腺嘌呤和鸟嘌呤的聚合物或寡聚物(参见Albert L.Lehninger,Principles ofBiochemistry,at 793-800(Worth Pub.1982))。本技术考虑了任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分，及其任何化学变体，诸如这些碱基的甲基化形式、羟甲基化形式或糖基化形式等。聚合物或寡聚物可以是在组成中异质的或同质的，并且可以分离自天然存在的来源或者可以人工地产生或合成地产生。另外，核酸可以是DNA或RNA，或其混合物，并且可以以单链形式或双链形式永久或暂时存在，包括同源双链状态、异源双链状态和杂交状态。术语“核酸”还可以涵盖包含可以展示出与天然核苷酸相同的功能的非天然核苷酸、修饰的核苷酸和/或非核苷酸构建单元(例如，“核苷酸类似物”)的链。此外，如本文所用，术语“核酸”指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸、及其片段或部分，以及指基因组或合成起源的DNA或RNA，核酸可以是单链的或双链的，并且可以代表有义链或反义链。
如本文所用，“百分比序列同一性”、“百分比同一性”等等，指在将两个序列进行比对并引入空位(如有必要)以实现达到最大百分同一性之后，与参考序列中相应的核苷酸或氨基酸相同的核酸序列中的核苷酸或核苷酸类似物，或氨基酸序列中的氨基酸的百分比。因此，如果根据本技术的核酸比参考序列长，那么在确定序列同一性时，不考虑核酸中不与参考序列比对的额外核苷酸。用于获得两个或更多个序列之间的最佳比对和计算同一性的许多数学算法是已知的并且被并入许多可获得的软件程序中。此类程序的实例包括CLUSTAL-W、T-Coffee和ALIGN(用于比对核酸和氨基酸序列)、BLAST程序(例如BLAST2.1、BL2SEQ及其更高版本)和FASTA程序(例如FASTA3x、FASTM和SSEARCH)(用于序列比对和序列相似性检索)。序列比对算法还公开在以下文献中：例如Altschul等人,J.MolecularBiol.,215(3):403-410(1990),Beigert等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,106(10):3770-3775(2009),Durbin等人,编,Biological Sequence Analysis:Probabilistic Models ofProteins and Nucleic Acids,Cambridge University出版社,Cambridge,UK(2009),Soding,Bioinformatics,21(7):951-960(2005),Altschul等人,Nucleic Acids Res.,25(17):3389-3402(1997),以及Gusfield,Algorithms on Strings,Trees and Sequences,Cambridge University出版社,Cambridge UK(1997))。
“多肽”、“蛋白质”或“肽”是通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的连接序列。多肽可以是天然的、合成的、或天然和合成的修饰或组合。肽和多肽包括蛋白质，诸如结合蛋白、受体和抗体。可以通过添加不包括在氨基酸链中的糖、脂质或其他部分来修饰蛋白质。术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“预防”指部分或完全延迟疾病、病症和/或病况的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或病况的进展；和/或降低进展出与疾病、病症和/或病况相关联的病理学的风险。
如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”，等等，意指减缓、停止或逆转疾病或病症的进展。该术语还意指逆转此类疾病或病症的进展。因此，“治疗”意指将本文所述的方法或装置施用至受试者，其中该受试者患有疾病或疾病的症状，其中目的是治愈、康复、减轻、缓解、改变、补救、改善(ameliorate)、改善(improve)或影响疾病或疾病的症状。
“受试者”或“患者”可以是人或非人，并且可以包括，例如用作用于研究目的的“模型系统”的动物品系或物种，诸如如本文所述的小鼠模型。同样，患者可以包括成年或者未成年(例如儿童)。此外，患者可以意指可以受益于施用本文考虑的装置和系统的任何活的生物体，优选哺乳动物(例如，人或非人)。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人，非人灵长类，诸如黑猩猩、以及其他猿类和猴物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，诸如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠，等等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟类、鱼类，等等。在本文提供的方法和组合物的一个实施方案中，哺乳动物是人。
“载体”或“表达载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、病毒或黏粒，其上可以附着或并入另一个DNA片段，例如“插入片段”，从而引起附着片段在细胞中的复制。
术语“野生型”指当分离自天然存在的来源时，具有基因或基因产物的特征的该基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常见的基因，并且因此被任意指定为该基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“突变体”或“多态的”指当与野生型基因或基因产物相比时，在序列和/或功能性特性中展示出修饰(即，改变的特征)的基因或基因产物。值得注意的是，可以分离天然存在的突变体；通过与野生型基因或基因产物相比时，它们具有改变的特征的事实来鉴定这些突变体。
尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，优选的方法和材料如下所述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，通过引用以其整体并入。本文公开的材料、方法和实施例仅是说明性的而非旨在是限制性的。
方法
本公开提供了用于恢复细胞中的靶内源基因的功能的方法。本公开还提供了用于延迟发作、治疗、预防和/或治愈受试者中的疾病或病症的方法。
在一些实施方案中，方法包括将有效量的以下引入到细胞中：成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)-Cas系统，或编码CRISPR-Cas系统的一种或多种核酸，其被配置为敲除或至少部分沉默靶内源基因的两个等位基因；以及编码靶内源基因的外源功能性形式的核酸。
在一些实施方案中，靶内源基因是疾病相关联的基因。术语“疾病相关联的基因”指与获自未受影响个体的组织或细胞相比，其基因产物在获自疾病影响的个体的细胞中在异常水平下或以异常形式表达的任何基因或多核苷酸。疾病相关联的基因可以在异常高水平下或在异常低水平下表达，其中改变的表达与该疾病的发生和/或进展相关。疾病相关联的基因还指突变或遗传变异与负责疾病病因的基因直接相关或与其连锁不平衡的基因。在一些实施方案中，靶内源基因的至少一个等位基因具有功能获得突变。在一些实施方案中，靶内源基因的至少一个等位基因具有功能丧失突变。
负责此类“单个基因”或“单基因”疾病的基因的实例包括但不限于腺苷脱氨酶、α-1抗胰蛋白酶、囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)、β-血红蛋白(HBB)、眼皮肤白化病II(OCA2)、亨廷顿蛋白(HTT)、肌强直性营养不良蛋白激酶(DMPK)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、载脂蛋白B(APOB)、神经纤维瘤蛋白1(NF1)、多囊肾病1(PKD1)、多囊肾病2(PKD2)、凝血因子VIII(F8)、抗肌萎缩蛋白(DMD)、X-连锁的调节磷酸盐的内肽酶同源物(PHEX)、甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)和Y-连锁的泛素特异性肽酶9Y(USP9Y)。其他单个基因疾病或单基因疾病是本领域已知的并且描述于例如：Chial,H.Rare Genetic Disorders:Learning AboutGenetic Disease Through Gene Mapping,SNPs,和Microarray Data,Nature Education1(1):192(2008)；Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)(ncbi.nim.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝OMIM)；和人类基因突变数据库(HGMD)(hgmd.cf.ac.uk)。
在本领域中，由多个缺乏简单(例如孟德尔法则的)遗传模式的基因的贡献引起的疾病称为“多因素”疾病或“多基因”疾病。多因素疾病或多基因疾病的实例包括但不限于哮喘、糖尿病、癫痫、高血压、双向情感障碍和精神分裂症。某些发育异常也可以以多因素模式或多基因模式遗传，并且包括例如唇裂/腭裂、先天性心脏缺陷、以及神经管缺陷。因此，在一些实施方案中，可以使用所公开的方法恢复多于一个(例如2个、3个、4个或更多个)靶内源基因的功能。
在一些实施方案中，靶内源基因是BEST1。在一些实施方案中，BEST1的至少一个等位基因具有功能获得突变。在一些实施方案中，BEST1的至少一个等位基因具有功能丧失突变。在一些实施方案中，BEST1包含D203A突变、I205T突变或Y236C突变。
在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是体外的。在一些实施方案中，细胞是体内的。在一些实施方案中，引入到细胞中包括施用至受试者。
在一些实施方案中，受试者患有或疑似患有神经退行性疾病。在一些实施方案中，受试者患有或疑似患有眼部疾病。因此，在一些实施方案中，所公开的方法可用于在受试者中延迟发作、治疗、预防和/或治愈眼部疾病或神经退行性疾病。
在一些实施方案中，该疾病或病症是bestrophin病。bestrophin病是由人BEST1基因中遗传突变引起的一组五种视网膜变性病症，即best卵黄状黄斑营养不良(BVMD)、常染色体隐性bestrophin病(ARB)、成人发病的卵黄状营养不良(AVMD)、常染色体显性玻璃体视网膜脉络膜病变(ADVIRC)、和色素性视网膜炎(RP)。bestrophin病的临床表型包括浆液性视网膜脱离、类似蛋黄或卵黄样的病变以及可以导致失明的进展型视力丧失。然而，已经从bestrophin病患者鉴定出超过250种不同的BEST1突变。大多数的BEST1突变是常染色体显性的，然而常染色体隐性的BEST1突变大多与ARB有关。
从功能上讲，由BEST1编码的蛋白质卵黄状黄斑病蛋白1(Bestropin-1，BEST1)，是主要在视网膜色素上皮(RPE)中表达的Ca2+激活的Cl-通道(CaCC)。bestrophin病患者衍生的RPE细胞展示出异常的Ca2+依赖性Cl-电流，尽管不能排除其他候选CaCC的贡献，这仍然强调了在RPE中BEST1作为CaCC的不可或缺的作用。在结构上，虽然人BEST1结构尚未解析，但来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(KpBEST)、鸡(cBEST1)和牛(bBEST2)的三种同源物的高分辨率结构表明，该通道是具有花瓶形离子传导途径的高度保守的五聚体。
每种BEST1突变如何具体影响通道活性bestrophin病，最终导致视网膜变性，很大程度上是未知的。绝大多数测试的患者衍生的突变展示出功能丧失表型，因为与WT BEST1相比，由突变体通道介导的Cl-电流显著减少。一些功能获得突变在HEK293细胞中瞬时表达时增强了通道活性，但仍然引起bestrophin病，这表明维持正常BEST1功能的生理重要性。然而，尽管迄今为止已知的大多数功能丧失突变和所有功能获得突变都是常染色体显性的，但在WT BEST1存在下，它们是否具有如人们在杂合子携带者中所期望的那样的不同的影响通道活性的能力，仍然难以捉摸。一般来说，功能获得突变通常比功能丧失突变展示出更强的显性效应，但尚未针对BEST1进行它们之间的并排比较。
已经成功地将CRISPR-Cas系统利用于编辑各种生物体，包括但不限于细菌、人、果蝇、斑马鱼和植物的基因组。本发明不受所利用的CRISPR-Cas蛋白或系统的类型的限制。CRISPR-Cas系统目前分成两种类别(1-2)、六种类型(I-VI)和数十种亚型，这取决于伴随CRISPR阵列的特征和辅助基因。本方法和系统的CRISPR-Cas系统不受类别、类型或亚型限制。在一些实施方案中，本系统可衍生自1类(例如，I型、III型、VI型)或2类(例如，II型、V型或VI型)CRISPR-Cas系统。
在一些实施方案中，在不存在外源提供的供体核酸分子的情况下，CRISPR-Cas系统可用于通过切割靶内源基因，并允许宿主细胞修复所切割的序列来从靶内源基因中使核酸缺失。以这种方式缺失核酸序列可以用于，例如造成基因敲除或敲低。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统包含CRISPR干扰(CRISPRi)系统和/或编码其的一种或多种核酸。因此，使用CRISPR干扰(CRISPRi)系统，允许通过抑制转录来沉默基因，通常通过阻断转录起始或者延伸。
在一些实施方案中，CRISPRi系统包含以下的至少一种或所有；向导RNA(gRNA)，其配置为与编码靶内源基因的核酸序列的一部分杂交；Cas蛋白；以及转录阻遏物。在一些实施方案中，至少一种gRNA、Cas蛋白以及转录阻遏物在单个核酸上提供。在一些实施方案中，至少一种gRNA、Cas蛋白和转录阻遏物在多于一个核酸上提供。
Cas蛋白在例如Haft等人,PLoS Comput.Biol.,1(6):e60(2005)中进行了进一步详细的描述，该文献通过引用并入本文。Cas蛋白可以是任何Cas内切核酸酶。在一些实施方案中，Cas内切核酸酶是2类Cas内切核酸酶。在一些实施方案中，Cas内切核酸酶是V型Cas内切核酸酶。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9、Cas12a(也称为Cpf1)和Cas14。
在一个实施方案中，Cas9蛋白是野生型Cas9蛋白。Cas9蛋白可以从任何合适的微生物获得，并且许多细菌表达Cas9蛋白直系同源物或变体。在一些实施方案中，Cas9来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。其他物种的Cas9蛋白是本领域已知的(参见例如美国专利申请公开2017/0051312，其通过引用并入本文)并且可以与本公开联系使用。来自多种物种的Cas蛋白的氨基酸序列可通过GenBank和UniProt数据库公开获得。
在一些实施方案中，Cas9蛋白是Cas9切口酶(Cas9n)。野生型Cas9具有两个促进双链DNA断裂的催化核酸酶结构域。Cas9切口酶蛋白通常通过催化核酸酶结构域之一中的失活点突变来进行工程化，这导致Cas9使用其余的活性核酸酶结构域仅切割或酶促断裂两条DNA链之一。Cas9切口酶是本领域已知的(参见例如美国专利申请公开2017/0051312，其通过引用并入本文)并且包括，例如在D10或H840处具有点突变的化脓性链球菌。在选择的实施方案中，Cas9切口酶是化脓性链球菌Cas9n(D10A)。
在一些实施方案中，Cas蛋白是无催化活性的Cas，诸如dCas9、dCas12a/dCpf1、dCas14、无活性的Cascade复合物、或其他。例如，无催化活性的Cas9本质上是DNA结合蛋白，通常由于其催化核酸酶结构域之内的两个或多个突变，这导致该蛋白具有非常小的催化核酸酶活性或没有催化核酸酶活性。可以通过D10，以及E762、H840、N854、N863或D986中的至少一处(通常是H840和/或N863)的突变而导致化脓性链球菌Cas9无催化活性(参见例如美国专利申请公开2017/0051312，其通过引用并入本文中)。相应的直系同源物中的突变是已知的，诸如金黄色葡萄球菌Cas9中的N580。通常，此类突变导致无催化活性的Cas蛋白具有不超过3％的正常核酸酶活性。
向导RNA(gRNA)可以是crRNA、crRNA/tracrRNA(或单向导RNA、sgRNA)。gRNA可以是非天然存在的gRNA。术语“gRNA”、“向导RNA”和“向导序列”在全文可互换地使用，并且指包含决定Cas蛋白的结合特异性的序列的核酸。gRNA与靶内源基因的一部分部分地或完全地杂交和/或互补。
与靶内源基因(靶位点)杂交的gRNA或其部分可以是选择性杂交所必需的任何长度。gRNA或sgRNA的长度可以在约5个和约100个核苷酸之间，或更长(例如，长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸，或更长)。
为了促进gRNA设计，已经开发了许多计算工具(参见Prykhozhij等人(PLoS ONE,10(3):(2015))；Zhu等人(PLoS ONE,9(9)(2014))；Xiao等人(Bioinformatics.Jan 21(2014))；Heigwer等人(Nat Methods,11(2):122–123(2014))。Zhu(Frontiers inBiology,10(4)pp 289-296(2015))讨论了用于向导RNA的方法和工具，该文献通过引用并入本文。此外，有许多可用于促进sgRNA的设计的可公开获得的软件工具；包括但不限于Genscript Interactive CRISPR gRNA Design Tool、WU-CRISPR和Broad Institute GPPsgRNA Designer。还有可公开获得的预先设计的gRNA序列，其靶向许多物种(人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫)的基因组之内的许多基因和位置，包括但不限于IDT DNA预先设计的Alt-RCRISPR-Cas9向导RNA、Addgene验证的gRNA靶序列以及GenScript Genome-widegRNA数据库。
在一些实施方案中，两个或更多个gRNA(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)针对每个靶内源基因。gRNA可以是非天然存在的gRNA。
如本文所用，术语“转录阻遏物”指直接或间接与特定DNA序列相互作用，以阻止RNA聚合酶对基因或基因的组的启动子位点的活性的蛋白质或多肽，其中该特定DNA序列与感兴趣的基因组基因座或基因相关联。转录阻遏物可以是可以降低基因表达的具有阻遏物功能的哺乳动物细胞内源蛋白，来自其他物种诸如病毒、微生物或植物的阻遏物、它们的部分变体或突变体变体、工程化阻遏物、或者阻遏物的其他形式。示例性阻遏物包括但不限于：具有Krüppel相关联的盒(KRAB)结构域的阻遏物(例如KOX1/ZNF10、KOX8/ZNF708、ZNF43、ZNF184、ZNF91、HPF4、HTF10和HTF34)、lac阻遏物、色氨酸阻遏物和RE-1沉默转录因子(REST)。
在一些实施方案中，转录阻遏物融合至Cas蛋白。在一些实施方案中，转录阻遏物包含融合至Cas蛋白的两个或更多个转录效应子结构域(例如，转录阻遏物结构域)。两个或更多个效应结构域可以以任何方向融合至Cas蛋白，并且可以用氨基酸接头彼此分隔。
在一些实施方案中，转录阻遏物和Cas蛋白各自包含来自募集系统的结合对的一半。在一些实施方案中，转录阻遏物和至少一种gRNA各自包含来自募集系统的结合对的一半。
募集系统可以包含任何两个结合对。例如，募集系统可以包含适配体和适配体结合蛋白。在一些实施方案中，适配体序列是核酸(例如，RNA适配体)序列。在一些实施方案中，向导RNA还包含一个或多个RNA适配体的序列，或可以募集并结合另一分子种类适体分子(诸如核酸或蛋白质)的不同的RNA二级结构或序列。可以选择任何已知的RNA适配体/适配体结合蛋白对，并将其与本公开联系使用(参见，例如，Jayasena,S.D.,ClinicalChemistry,1999.45(9):p.1628-1650；Gelinas,等人,Current Opinion in StructuralBiology,2016.36:p.122-132；和Hasegawa,H.,Molecules,2016；21(4):p.421,这些文献通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，适配体序列是肽适配体序列。在一些实施方案中，Cas蛋白包含适配体序列，并且转录阻遏物包含适配体结合蛋白。在一些实施方案中，转录阻遏物包含适配体序列，并且Cas蛋白包含适配体结合蛋白。肽适配体序列或适配体结合蛋白可以以任何方向进行融合(例如，N末端至C末端、C末端至N末端、N末端至N末端)。肽适配体序列或适配体结合蛋白可以通过接头区域进行融合。合适的接头区域是本领域已知的。接头可以是柔性的，或被配置为允许功能性以及具有减小的空间位阻的与DNA或其他蛋白质的缔合。接头序列可以提供多肽的非结构区域或线性区域，例如包含一个或多个甘氨酸残基和/或丝氨酸残基。接头序列的长度可以是至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。
肽适配体可以是由亲和剂特异性识别的天然存在的或合成的肽。此类适配体包括但不限于c-Myc亲和标签、HA亲和标签、His亲和标签、S亲和标签、甲硫氨酸-His亲和标签、RGD-His亲和标签、7x His亲和标签、FLAG八肽、链球菌标签或链球菌标签II、V5标签或VSV-G表位。相应的适配体结合蛋白是本领域众所周知的并且包括例如一抗、生物素、affimer、单结构域抗体和抗体模拟物。
为了允许靶内源基因的外源功能性形式的有效表达，靶基因的外源功能性形式不是该CRISPR-Cas系统的靶标。在一些实施方案中，至少一种gRNA可以靶向外源功能性形式中未发现的内源基因区域或突变。在一些实施方案中，该至少一种gRNA配置为不与靶内源基因的外源功能性形式杂交。
替代性地或额外地，靶内源基因的外源功能性形式可以包含与靶内源基因的核酸序列不同的核酸序列。在一些实施方案中，与内源基因序列的核苷酸相比，靶内源基因的外源功能性形式包含5个或更多个(例如，多于5个、多于10个、多于15个、多于20个、多于25个、多于30个、多于35个、多于35个、多余40个、多于45个、多于50个)核苷酸变化。在一些实施方案中，靶内源基因的外源功能性形式和靶内源基因在以下序列中不同：gRNA结合的区域、致病突变的位置、与gRNA结合或突变无关的区域、或其任何组合。在选择的实施方案中，靶内源基因的外源功能性形式和靶内源基因在gRNA结合的区域中的序列中不同，使得gRNA不会以任何足够的量结合至靶内源基因的外源功能性形式。
在一些实施方案中，靶内源基因的外源功能性形式对包含以下的多肽进行编码：与靶内源基因的野生型形式的氨基酸序列至少90％(至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，靶内源基因的外源功能性形式对靶内源基因的功能性变体进行编码。功能性变体应保持野生型基因产物大于50％的活性。电生理学测定可以用于容易地确定感兴趣的功能性变体。
本公开的核酸可以包含本领域已知的许多启动子中的任一种，其中该启动子是组成型的、可调节的或诱导型的、细胞类型特异性的、组织特异性的或物种特异性的。除了足以指导转录的序列之外，本发明的启动子序列还可以包括涉及调节转录的其他调控元件的序列(例如增强子、科扎克序列和内含子)。用于驱动基因组成型表达的许多启动子/调节序列是本领域可获得的，并且包括但不限于例如CMV(巨细胞病毒启动子)、EF1a(人延伸因子1α启动子)、SV40(猿空泡病毒40启动子)、PGK(哺乳动物磷酸甘油酸激酶启动子)、Ubc(人泛素C启动子)、人β-肌动蛋白启动子、啮齿动物β-肌动蛋白启动子、CBh(鸡β-肌动蛋白启动子)、CAG(含有CMV增强子、鸡β肌动蛋白启动子和兔β球蛋白剪接受体的混合启动子)、TRE(四环素响应元件启动子)、H1(人聚合酶III RNA启动子)、U6(人U6小核启动子)，等等。可用于表达本系统的组分的额外的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒LTR诸如劳斯肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR、Maloney鼠白血病病毒(MMLV)LTR、骨髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)LTR、脾病灶形成病毒(SFFV)LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、单纯疱疹tk病毒启动子、具有或不具有延伸因子1-α(EF1-α)内含子的EF1-α启动子。额外的启动子包括任何组成型活性启动子。替代性地，可以使用任何可调节的启动子，使得可以在细胞内调节其表达。
此外，可以通过将编码此类分子的核酸置于诱导型启动子/调控序列的控制之下来实现诱导型表达。还考虑了与本发明一起使用的，本领域众所周知的启动子，其可以响应于诱导剂诸如金属、糖皮质激素、四环素、激素等等，而被诱导。因此，将理解，本公开包括使用本领域已知的能够驱动与启动子/调控序列可操作地连接的期望的蛋白质的表达的任何启动子/调控序列。
本公开还提供了含有该核酸的载体和含有该核酸或其载体的细胞。载体可以用于在合适的细胞中增殖核酸和/或用于允许从该核酸(例如，表达载体)进行表达。本领域普通技术人员将意识到，可用于核酸序列的增殖和表达的各种载体。
在某些实施方案中，在使用哺乳动物表达载体的哺乳动物细胞中，本公开的载体可以驱动一种或多种序列的表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,Nature(1987)329:840,其通过引用并入本文)和pMT2PC(Kaufman,等人,EMBO J.(1987)6:187,其通过引用并入本文)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常由一种或多种调控元件提供。例如，常用的启动子衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40和本文公开的和本领域已知的其他。用于原核细胞和真核细胞两者的其他合适的表达系统，参见例如Sambrook,等人,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL.第二版,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory出版社,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989的16章和17章,其通过引用并入本文。
本公开的载体可以指导核酸在特定细胞类型中的表达(例如，使用组织特异性调控元件来表达核酸)。此类调控元件包括可以是组织特异性的或细胞特异性的启动子。术语“组织特异性的”当其应用于启动子时是指，能够在相对不存在不同类型组织中的感兴趣的核苷酸序列的表达的情况下，将感兴趣的相同核苷酸序列的选择性表达引导至特定类型的组织(例如种子)的启动子。术语“细胞类型特异性的”当应用于启动子时是指，能够在相对不存在相同组织之内的感兴趣的核苷酸序列的表达的情况下，在特定类型的细胞中指导感兴趣的相同核苷酸序列的选择性表达的启动子。术语“细胞类型特异性的”当应用于启动子时还指，能够促进感兴趣的核苷酸序列在单一组织之内的区域中选择性表达的启动子。启动子的细胞类型特异性可以使用本领域众所周知的方法，例如免疫组织化学染色来评估。
另外，载体可以含有例如以下的一些或全部：用于在宿主细胞中选择稳定转染子或瞬时转染子的可选择标志物基因；转录终止信号和RNA加工信号；5’-非翻译区和3’-非翻译区；内部核糖体结合位点(IRES)、多功能多克隆位点；和用于评估嵌合受体的表达的报告基因。用于产生含有转基因的载体的合适的载体和方法是本领域众所周知的且可获得的。可选择标志物包括氯霉素抗性、四环素抗性、大观霉素抗性、新霉素抗性、链霉素抗性、红霉素抗性、利福平抗性、博来霉素抗性、热适应卡那霉素抗性、庆大霉素抗性、潮霉素抗性、甲氧苄啶抗性、二氢叶酸还原酶(DHFR)、GPT；酿酒酵母的URA3、HIS4、LEU2和TRP1基因。
当被引入到细胞中时，载体可以维持为自主复制序列或染色体外元件，或者可以整合到宿主DNA中。
因此，本公开进一步提供了细胞，其包含如本文所公开的序列特异性转录激活系统、如本文所公开的核酸或载体。
基于常规病毒和非病毒的基因转移方法，可以用于将核酸引入到细胞、组织或受试者中。此类方法可以用于将核酸施用至培养物中的细胞，或宿主生物体中。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、黏粒、RNA(例如本文所述的载体的转录物)、核酸、和与递送媒介物复合的核酸。
病毒载体递送系统包括DNA病毒和RNA病毒，它们在递送至细胞后具有附加体基因组或者整合基因组。多种病毒构建体可用于将本发明的核酸递送至细胞、组织和/或受试者。病毒载体包括，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和单纯疱疹病毒载体。此类重组病毒的非限制性实例包括重组腺相关病毒(AAV)、重组腺病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒、重组单纯疱疹病毒、重组杆状病毒、重组痘病毒、噬菌体等。本公开提供了能够在宿主基因组中进行整合的载体，诸如逆转录病毒或慢病毒。参见例如Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1989；Kay,M.A.,等人,2001Nat.Medic.7(1):33-40；和Walther W.和SteinU.,2000Drugs,60(2):249-71,其通过引用并入本文。
根据本公开的载体可以进行转化、转染或以其他方式引入到多种宿主细胞中。转染指由细胞摄取载体，无论实际上是否表达任何编码序列。许多转染的方法是普通技术人员已知的，例如脂质体转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、DEAE-右旋糖酐处理、显微注射、病毒感染和本领域已知的其他方法。转导指病毒进入到细胞中和由病毒载体基因组递送的序列的表达(例如，转录和/或翻译)。在重组载体的情况下，“转导”通常指重组病毒载体进入到细胞中和由载体基因组递送的感兴趣的核酸的表达。
将载体递送至细胞的方法是本领域众所周知的，并且可以包括DNA电穿孔或RNA电穿孔、转染试剂诸如脂质体或纳米颗粒以递送DNA或RNA；通过机械变形递送DNA、RNA或蛋白质(参见，例如，Sharei等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2013)110(6):2082-2087，其通过引用并入本文)；或病毒转导。在一些实施方案中，通过病毒转导将载体递送至宿主细胞。核酸可以作为较大构建体如质粒或病毒载体的一部分进行递送，或者直接进行递送，例如通过电穿孔、脂质囊泡、病毒转运蛋白、显微注射和基因枪法(高速颗粒轰击)。相似地，含有一种或多种转基因的构建体可以通过任何适合于将核酸引入到细胞中的方法来递送。在一些实施方案中，编码本发明的系统的组分的构建体或核酸是DNA分子。在一些实施方案中，编码本发明的系统的组分的核酸是DNA载体并且可以电穿孔至细胞。在一些实施方案中，编码本发明的系统的组分的核酸是RNA分子，其可以电穿孔至细胞。
此外，可以使用诸如基于纳米颗粒的和基于脂质的递送系统的递送媒介物。递送媒介物的进一步实例包括慢病毒载体、核糖核蛋白(RNP)复合物、基于脂质的递送系统、基因枪、流体动力学、电穿孔或核转染显微注射和基因枪法。Nayerossadat等人(Adv BiomedRes.2012；1:27)和Ibraheem等人(Int JPharm.2014Jan 1；459(1-2):70-83)详细讨论了各种基因递送方法，其通过引用并入本文。
因此，本公开提供了分离的细胞，其包含本文公开的载体或核酸。优选的细胞是可以容易且可靠地生长、具有合理快的生长率、具有良好表征的表达系统、并且可以容易且高效地转化或转染的那些。合适的原核细胞的实例包括但不限于，来自芽孢杆菌属(诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短芽孢杆菌(Bacillus brevis))、埃希氏菌属(诸如大肠杆菌)、假单胞菌属、链霉菌属、沙门氏菌属和欧文氏菌属(Envinia)的细胞。合适的真核细胞是本领域已知的，并且包括例如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。合适的酵母细胞的实例包括来自克鲁维酵母属、毕赤酵母属、鼻孢子菌属、酵母属和裂殖酵母属的那些。示例性昆虫细胞包括Sf-9和HIS(Invitrogen,Carlsbad,Calif)并且描述于例如以下文献中：Kitts等人,Biotechniques,14:810-817(1993)；Lucklow,Curr.Opin.Biotechnol.,4:564-572(1993)；和Lucklow等人,J.Virol.,67:4566-4579(1993)，其通过引用并入本文。期望地，细胞是哺乳动物细胞，并且在一些实施方案中，细胞是人细胞。许多合适的哺乳动物和人宿主细胞是本领域已知的，并且许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,Va.)获得。合适的哺乳动物细胞的实例包括但不限于,中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC号CCL61)、CHO DHFR细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:4216-4220(1980))、人胚肾(HEK)293或293T细胞(ATCC号CRL1573)、以及3T3细胞(ATCC号CCL92)。其他合适的哺乳动物细胞系是猴COS-1(ATCC号CRL1650)和COS-7细胞系(ATCC号CRL1651)、以及CV-1细胞系(ATCC号CCL70)。进一步的示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长类、啮齿类和人细胞系，包括转化的细胞系。正常二倍体细胞、衍生自原代组织体外培养物的细胞株以及原代外植体也是合适的。其他合适的哺乳动物细胞系包括但不限于，小鼠神经母细胞瘤N2A细胞、HeLa、HEK、A549、HepG2、小鼠L-929细胞、以及BHK或HaK仓鼠细胞系。
用于选择合适的哺乳动物细胞的方法和用于细胞转化、培养、扩增、筛选和纯化的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是体外的。在一些实施方案中，细胞是离体的。
“有效量”指足以引发期望的生物响应(例如，治疗病况)的量。如本领域技术人员将理解的，有效量可以不同，这取决于诸如以下的因素：期望的生物学终点、药代动力学、正在治疗的病况、施用的模式，以及受试者的年龄和健康。有效量涵盖治疗性治疗和预防性治疗。
“治疗有效量”是足以在病况的治疗中提供治疗益处，或延迟或最小化与病况相关联的一种或多种症状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是足以在病况的治疗中提供治疗益处、或最小化与病况相关联的一种或多种症状的量。治疗有效量意指单独或与以其他疗法组合地在病况的治疗中提供治疗益处的量。术语“治疗有效量”可以涵盖改善总体疗法、减少或避免病况的症状或原因、或增强另一种治疗剂的治疗疗效的量。
在本文公开的方法中，可以通过本领域已知的促进全身地/外周地或在期望作用的部位处施用的那些方法的任何一种进行施用，这些方法包括但不限于经口的(例如通过咽下)；经外部的(包括例如透皮、鼻内、眼部、颊和舌下)；经肺部的(例如，通过使用例如气雾剂的吸入疗法或吹入疗法，例如通过嘴或鼻)；经直肠的；经阴道的；经肠胃外的(例如，通过注射，包括皮下的、皮内的、肌内的、静脉内的、动脉内的、心内的、鞘内的、脊柱内的、囊内的、囊下的、眶内的、腹膜内的、气管内、表皮下的、关节内的、蛛网膜下的和胸骨内的注射)；或通过植入储库(depot)，例如皮下地或肌内地。在一些实施方案中，施用是外部的、局部眼部的(例如，结膜下的、眼球后的、前房内的、玻璃体内的)或全身的。
系统
本发明还针对包括以下的组合物或系统：成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)-Cas系统，或编码CRISPR-Cas系统的一种或多种核酸，其被配置为敲除或至少部分沉默靶内源基因的两个等位基因，以及编码靶内源基因的外源功能性形式的核酸。本文别处提供的对CRISPR-Cas系统、靶内源基因和核酸的描述适用于所公开的组合物和系统。
在一些实施方案中，该系统包括CRISPR干扰(CRISPRi)系统，和/或编码其的一种或多种核酸，其配置为敲除或至少部分沉默靶内源基因的两个等位基因。在一些实施方案中，CRISPRi系统包含转录阻遏物。
在一些实施方案中，至少一种gRNA、Cas蛋白以及转录阻遏物的一种或所有在单个核酸上提供。在一些实施方案中，至少一种gRNA、Cas蛋白和转录阻遏物的每种均在多于一个核酸上提供。
在一些实施方案中，如上所述，Cas蛋白和转录阻遏物作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，如上所述，转录阻遏物和Cas蛋白或至少一种gRNA各自包含来自募集系统的结合对的一半。
试剂盒
还在本公开的范围之内的是试剂盒，其包含以下至少一种或全部：CRISPR-Cas系统的组分(例如，向导物、Cas蛋白、转录阻遏物，和/或编码其的一种或多种核酸)和/或编码靶内源基因的外源功能性形式的核酸、如本文所述的组合物、或为了促进产生任何先前列出的组分的载体和材料(例如，细胞和递送系统)。
试剂盒还可以包含使用该试剂盒的组分的说明书。说明书是与该试剂盒有关的相关材料或方法。这些材料可以包括以下内容的任意组合：背景信息、组分列表、使用组合物的简要方案或详细方案、故障排除、参考文献、技术支持和任何其他相关文档。说明书可以与试剂盒一起提供，或者作为单独的成员组分提供，可以作为纸质形式或者可以在计算机可读存储设备上提供或从互联网网站下载的电子形式提供，或作为记录的演示提供。
应当理解，所公开的试剂盒可以与所公开的方法联系使用。试剂盒可以包括用于本文所述的任何方法的说明书。
本文提供的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、柔性包装，等等。
本公开还提供了用于体外进行该方法或产生该组分的试剂盒。任选的试剂盒的组分包括以下一种或多种：缓冲液、细胞培养基或其用于生成本文公开的细胞的组分、核酸序列、测序引物，等等。
实施例
材料和方法
生成人iPSC使用了CytoTuneTM-iPS 2.0 Sendai Reprogramming试剂盒(ThermoFisher Scientific,A16517)以将供体提供的皮肤成纤维细胞重编程成多能干细胞(iPSC)。按照此前公布的方案进行免疫细胞荧光测定以对iPSC多能性进行评分(Li,Y.,等人,Methods Mol Biol 1353,77-88,doi:10.1007/7651_2015_225(2016),通过引用以其整体并入本文)。通过检测四种标准多能性标志物(SSEA4、Tra-1-60、SOX2和Nanog)对来自本研究中登记的所有受试者的iPSC细胞进行表征。通过Hoechst染色检测细胞核。所有iPSC系每3-6天传代一次，同时维持在mTeSR-1培养基(STEMCELL Technologies,85850)中。紧密监测形态学和核/质比，以确保iPSC系的稳定性。寄送所有iPSC系用于在Cell Line Genetics(Wisconsin,USA)通过G带进行核型分析，以验证基因组完整性。
将iPSC和hPSC系分化成RPE细胞iPSC和hPSC系在用1:50稀释基质胶(matrigel)(CORNING,356230)预处理的6孔培养皿中培养至汇合。在前14天，分化培养基由以下组成：Knock-Out(KO)DMEM(Thermo Fisher Scientific,10829018)、15％ KO血清替代品(ThermoFisher Scientific,10829028)、2mM谷氨酰胺(Thermo Fisher Scientific,35050061)、50U/ml青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,10378016)、1％非必需氨基酸(ThermoFisher Scientific,11140050)和10mM烟酰胺(Sigma-Aldrich,N0636)。在分化的第15-28天期间，用100ng/ml人激活素-A(PeproTech,120-14)补充分化培养基。从第29天开始，再次使用未补充激活素A的分化培养基，直到分化完成。大约8-10周之后，格式化分散的色素扁平簇(flatten cluster)并将其手动挑选至基质胶包被的皿中。如前所述，将这些细胞保存在RPE培养基中(Maminishkis,A.等人Investigative ophthalmology&visual science47,3612-3624,doi:10.1167/iovs.05-1622(2006),其通过引用以其整体并入本文)。它们需要培养另外6-8周，以形成功能性单层，这将为功能测定做好准备。除了建立良好的经典成熟RPE标志物(bestrophin1、CRALBP和RPE65)之外，还使用了另外两种标志物(PAX6和MITF)来验证细胞的RPE命运。本研究中的所有iPSC-RPE细胞均处于第1代。使用DNA测序来证实突变体iPSC-RPE细胞中的基因组突变。
细胞系HEK293细胞惠赠自Columbia University的Henry Colecraft博士。由于HEK293在国际细胞系认证委员会(International Cell Line AuthenticationCommittee)经常误认的细胞系名单上，所以本研究中使用的细胞通过短串联重复序列(STR)DNA图谱进行了验证，并测试了支原体污染呈阴性。培养基是补充有100μg/ml青霉素-链霉素和10％胎牛血清的DMEM(4.5g/L葡萄糖，Corning 10013CV)。H1-iCas9细胞购自StemCell Research Facility of Memorial Sloan Kettering Cancer Center。培养基是含有补充剂的mTeSR1(STEMCELL Technologies,85850)。
电生理学在RPE细胞分裂或HEK293细胞转染后24-72小时，利用由Patchmaster(HEKA)控制的EPC10膜片钳放大器(HEKA Electronics)进行全细胞记录。微量移液管从1.5mm薄壁玻璃使用细丝(WPI Instruments)拉制并成形，并填充含有以下(以mM计)的内部溶液：130CsCl、10EGTA、1MgCl2、2MgATP(新添加的)、10HEPES(pH 7.4，通过CsOH调节)和CaCl2以获得期望的游离Ca2+浓度(maxchelator.stanford.edu/CaMgATPEGTA-TS.htm)。串联电阻通常为1.5-2.5MΩ。未使用电子串联电阻补偿。外部溶液含有(以mM计)：140NaCl、15葡萄糖、5KCl、2CaCl2、1MgCl2和10HEPES(pH 7.4，用NaOH调节)。溶液同渗浓摩在310至315之间。使用一系列跨步电压(从0mV的保持电压开始的-100至+100mV)来生成I-V曲线。电流以25kHz进行采样并以5或10kHz进行滤波。以4s的重复间隔获取轨迹。本研究中的所有实验均在环境温度(23±2℃)下进行。
免疫印迹通过补充有蛋白酶抑制剂(Roche,04693159001)的M-PER哺乳动物蛋白提取试剂(Thermo Fisher Scientific,78501)提取细胞沉淀，并通过Bio-Rad蛋白读数器定量蛋白浓度。95℃变性5min后，在室温下,样品(20μg)在4％-15％梯度SDS-PAGE凝胶上运行，并在4℃下，湿转移到硝酸纤维素膜上。将膜在含有5％(w/v)脱脂奶的封闭缓冲液中在室温下孵育1小时，并随后在补充有一抗的封闭缓冲液中在4℃下孵育过夜。使用了针对以下蛋白质的一抗：CRALBP(1:500Abcam,ab15051),RPE65(1:1,000Novus Biologicals,NB100-355),β肌动蛋白(1:2,000Abcam,ab8227),BEST1(1:500Novus Biologicals,NB300-164),His(1:1,000Fisher Scientific,PA1983B)和Myc(1:1,000Fisher Scientific,PA1981)。在1:10,000的浓度下，使用了荧光基团缀合的小鼠和兔二抗(LI-CORBiosciences，分别为925-68070和925-32213)，并且在室温下孵育1小时，然后进行红外成像。
免疫沉淀按照制造商的标准使用手册，使用PolyJetTM In Vitro DNATransfection Reagent(SignaGen Laboratories,SL100688)，将培养在6cm皿上的HEK293细胞与pBacMam-BEST1(WT)-CFP-Myc和pBacMam-BEST1(突变体或WT)-YFP-His以1:1的比率进行共转染。转染后48h，在室温下通过在1000x g下离心5分钟收获细胞。将细胞沉淀在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche,04693159001)的预冷的裂解缓冲液(150mM NaCl、50mMTris、0.5％CA-630，pH 7.4)中冰上裂解30min，并然后在4℃下，在13,000rpm下离心12min。收集上清液(300μg)并与2μg Myc单克隆抗体(Thermo Fisher Scientific,MA1-980)混合。在4℃下旋转过夜后，将混合物与Dynabeads M-280绵羊抗小鼠IgG(ThermoFisher Scientific,11202D)在4℃下孵育5小时。彻底清洗珠子之后，通过在75℃下加热10min，在1x SDS样品缓冲液(Biorad,1610747)中洗脱结合级分。然后通过SDS-PAGE解析蛋白质并通过免疫印迹进行分析。
杆状病毒产生和转导携带BVSi 5-4-GFP、BVSi 3-8-GFP、BVSi-Ctrl-GFP或摆动BEST1-mcherry的BacMam杆状病毒如前所述(Goehring,A.等人,Nature protocols 9,2574-2585,doi:10.1038/nprot.2014.173(2014),其通过引用以其整体并入本文)进行内部地生成。将病毒添加至新鲜分裂的hPSC-RPE细胞的培养基中用于转导。
分子克隆BEST1中的点突变是通过定点诱变PCR使用In-fusion Cloning试剂盒(Clontech)进行的。完全测序所有构建体。
测量等位基因转录水平用PureLink RNA Mini试剂盒(ThermoFisher,12183020)从细胞沉淀中提取总RNA，并使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒(ThermoFisher K1621)进行cDNA合成。将所得cDNA用作含有突变/多态性的靶标BEST1区域的PCR扩增模板，并且使用TOPO Cloning试剂盒(ThermoFisher,451245)对PCR产物进行亚克隆，以用于测序。
H1-iCas9细胞中的敲除/敲入将多西环素(2μg/mL)补充到培养基中以诱导Cas9表达，并在培养基中维持3天。添加多西环素后24h，如前所述用gRNA(+用于敲入的ssDNA)转染细胞(Zhu,Z.,等人,Methods in enzymology 546,215-250,doi:10.1016/B978-0-12-801185-0.00011-8(2014),其通过引用以其整体并入本文)。恢复至约50％汇合之后，通过TrypLE(ThermoFisher,12604013)处理提起细胞，并分别以1,000个细胞/板和2,000个细胞/板接种到2x10cm新板。10-12天之后，单菌落变得可见，并将其挑入到96孔板上的单个孔中。扩增之后，通过Sanger测序对每个单菌落进行基因分型。为了敲除BEST1、TMEM16A、TMEM16B和LRRC8A，设计gRNA以靶向编码基因组序列的N端部分，使得在残留翻译产物(如果存在)中消除全部或大部分跨膜结构域，导致功能性无效。
用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑/沉默的gRNA设计gRNA使用在线软件(IDTdna.com)设计并汇总在表1中。
表1：用于CRISPR/Cas9的gRNA序列
转染转染前20-24小时，在室温下将HEK293细胞与0.25％胰蛋白酶一起孵育5分钟，并在近似50％汇合下分到新的3.5厘米培养皿中。使用PolyJet转染试剂(SignaGenSL100688)转染携带WT BEST1或期望突变体的质粒(1μg)。6-8h之后去除转染混合物，并用PBS冲洗细胞一次并在补充的DMEM中培养。转染后24h，通过胰蛋白酶处理再次提起细胞，并分到纤连蛋白包被的玻璃盖玻片上，用于膜片钳。
电生理数据和统计分析用Patchmaster(HEKA)、Microsoft Excel和Origin离线分析膜片钳数据。使用Origin中的内置函数进行统计分析。对于两组之间的比较，使用学生t检验确定平均值之间的统计显著差异(P<0.05)。数据呈现为平均值±s.e.m
人BEST1的同源性建模使用Swiss-Model服务器从鸡BEST1晶体结构生成BEST1的同源性模型(参见,Kane Dickson,V.,等人,Nature 516,213-218,doi:10.1038/nature13913(2014))。结构图在PyMOL中制作。
人样品皮肤活检样品获自健康对照供体和患者，并如前所述进行加工和培养(Li,Y.,等人,Methods Mol Biol 1353,77-88,doi:10.1007/7651_2015_225(2016),通过引用以其整体并入本文)。对于这些程序，所有这些程序均由Columbia UniversityInstitutional Review Board(IRB)协议AAAF1849批准，供体和患者提供了书面知情同意书。所有方法均按照相关法规和指南进行。供体幼稚RPE分离自人尸检眼壳，该眼壳购自Eye-Bank for Sight Restoration(New York,NY,10005)。
实施例1
BEST1功能丧失突变以剂量敏感的方式影响Cl-电流。
为了定量评估在模仿内源基因剂量的条件下BEST1突变对通道活性的影响，将七种YFP标签化BEST1功能丧失突变体，包括六种常染色体显性的(A10T、R218H、L234P、A243T、Q293K和D302A)和一种常染色体隐性的(P274R)，分别与CFP标签化WT BEST1以1:1的比率混合，并引入到HEK293细胞中进行膜片钳记录。令人惊讶的是，在存在1.2μM游离的细胞内Ca2+([Ca2+]i)的条件下，其中BEST1传导峰值电流，来自共表达突变体BEST1和WT BEST1的细胞的Cl-电流与来自单独表达WT BEST1的细胞的Cl-电流相似(图1A-1H和6A)，无论突变是常染色体显性的还是隐性的。因此，虽然在遗传学上被定义为常染色体显性的，但是这六种功能丧失突变在体外并不展示出显性表现。
为了测试显性失活效应是否起作用，将突变体BEST1与WT BEST1分别以4:1比率共转染至HEK293细胞中，用于膜片钳分析。在1.2μM[Ca2+]i下，来自常染色体显性突变体BEST1和WT BEST1的共表达的Cl-电流显著小于仅来自WT的Cl-电流，并且与仅来自突变体的电流相似(图1B-1G和6B)。相比之下，来自共表达WT BEST1和常染色体隐性P274R突变体的细胞的电流，仍然与来自仅表达WT BEST1的细胞的电流相似(图1H和6B)。因此，六种此前识别出的常染色体显性突变在体外事实上是显性阴性的，然而常染色体隐性P274R突变实际上是隐性的。
实施例2
人RPE中BEST1等位基因的不平衡的转录
来自瞬时转染的HEK293细胞的膜片钳结果预测出，在患者RPE中常染色体显性突变体等位基因相较于WT等位基因以更高水平表达，从而显示出显性失活效应。为了测试这一假设，从患者衍生的iPSC分化的RPE(iPSC-RPE)提取mRNA，并通过逆转录PCR(RT-PCR)和TOPO克隆测量了来自突变体BEST1和WT BEST1等位基因的转录物的比率。值得注意的是，在所有12个BVMD患者衍生的iPSC-RPE克隆(来自每个患者的两个克隆)中，突变体基因型显示出比WT多最高3-4倍(表2)，这表明突变体等位基因的转录水平比这些患者的RPE细胞中的WT等位基因的转录水平高3-4倍。
表2：RPE细胞中BEST1转录物的测序。
#1-6是患者衍生的iPSC-RPE细胞，其携带与图1中的瞬时转
染的HEK293细胞中分析的突变相同的一组BEST1突变。#7是
来自健康供体的天然人RPE细胞，其在BEST1基因中携带了
SNP。
为了进一步验证幼稚RPE中两个BEST1等位基因是否具有不平衡转录，从携带BEST1单核苷酸多态性(rs767552540)杂合的死后供体收集了RPE细胞。与来自iPSC-RPE的结果一致，在这些人幼稚RPE细胞中，来自一个等位基因的转录物在数量上超出来自另一个等位基因的转录物约3倍(表2)。
总之，该结果表明BEST1转录的等位基因不平衡有助于常染色体显性突变的显性失活效应。重要的是，这为在携带BEST1功能丧失常染色体显性突变的iPSC-RPE细胞中通过基因增强来恢复Ca2+依赖性Cl-电流提供了解释：只要增强的BEST1 WT蛋白相较于内源BEST1以相似或更高水平表达，突变体蛋白就不再是显性失活的，从而表现出WT表型，如在瞬时转染的HEK293细胞中所见(图1B-1G)。
实施例3
BEST1功能获得突变在体外是真正显性的。
此前鉴定出三种BEST1功能获得突变，即D203A、I205T和Y236C，其中所有均为常染色体显性的。为了测试它们的体外表现是否是显性的，每个突变体分别在HEK293细胞中与WT以1:1共表达，并进行膜片钳分析。在没有Ca2+的情况下，来自共表达WT BEST1和任一种突变体的细胞的Cl-电流显著大于来自仅表达WT BEST1的细胞的Cl-电流；在1.2μM[Ca2+]i下，共表达D203A/WT和Y236C/WT的细胞展示出比仅WT显著更大的电流(图2A-2C，左图和图7A)；在两种条件下，来自共表达突变体/WT BEST1的细胞的电流类似于来自仅表达突变体的细胞的电流(图2A-2C，左图和图7A)。这些结果表明，与六种功能丧失突变的显性失活表现相反，这三种功能获得突变实际上是显性的。
由于BEST1大概是基于已知bestrophin结构的五聚体，因此在五聚体组装中，仅仅一个功能获得突变单体就可以改变通道功能是可能的。HEK293细胞与突变体/WT BEST1以1:4比率共转染用于膜片钳分析。在这个条件下，来自功能获得突变体BEST1和WT BEST1的共表达的Ca2+依赖性Cl-电流仍然与仅来自突变体的Cl-电流相似(图2A-2C，右图和图7B)。这些结果表明，功能获得突变的强力显性效应：仅一个突变体单体就足以使五聚体通道的功能呈显性。为了证实功能获得突变体单体和WT单体之间的相互作用，突变体BEST1-YFP-His和WT BEST1-CFP-Myc在HEK293细胞中进行共表达，然后用针对Myc的抗体进行免疫沉淀，并分别用针对His和Myc的抗体进行免疫印迹。瞬时转染后，所有三种功能获得突变体均以与WT BEST1相似的水平表达，并保持了与WT BEST1的相互作用(图2D)，与先前的观察一致，即BEST1单体之间的相互作用不受功能丧失常染色体显性突变的影响。
实施例4
对hPSC-RPE细胞中的BEST1功能获得突变进行建模
WT基因增强足以恢复具有BEST1功能丧失突变的iPSC-RPE细胞中的Ca2+依赖性Cl-电流，其中外源BEST1以与内源蛋白相当的水平进行表达。由于即使在1:4比率下，BEST1功能获得突变相对于WT仍是显性的(图2A-2C，右图和图7B)，这提出了关于基因增强的功效的重要问题。然而，由于缺乏患者样品，携带功能获得突变的iPSC-RPE细胞目前无法获得。
为了克服这一障碍，从携带诱导型Cas9盒(H1-iCas9)的H1背景hPSC系生成同基因RPE细胞(hPSC-RPE)，其允许高效的基因组编辑。hPSC-RPE细胞的RPE状态通过包括细胞内色素和六边形形状在内的形态学特征来识别，并通过用RPE特异性标志物蛋白RPE65(视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白)和CRALBP(细胞视黄醛结合蛋白)进行的免疫印迹来证实(图8A)，这与来自供体衍生的iPSC-RPE的结果一致(图8B)。在0和1.2μM[Ca2+]i下，BEST1WT/WThPSC-RPE细胞的质膜上的Ca2+依赖性Cl-电流分别记录为4±1pA/pF和267±79pA/pF，这与来自供体衍生的BEST1WT/WT iPSC-RPE的结果一致(图3A)。为了评价RPE细胞中Ca2+依赖性Cl-电流对BEST1的遗传依赖性，在H1-iCas9系中，分别敲除BEST1和三种其他的CaCC，即TMEM16A、TMEM16B和LRRC8A(表2)，并生成相应的敲除hPSC-RPE细胞，用于膜片钳分析。应当指出的是，在WT PSC-RPE或供体幼稚RPE细胞中只能检测到BEST1的mRNA，而不能检测到其他三种CaCC的mRNA(图9A-9B)。值得注意的是，与来自TMEM16A-/-、TMEM16B-/-或LRRC8A-/-hPSC-RPE细胞的WT样电流(图3C-3E和10D)相反，在BEST1-/-hPSC-RPE和患者衍生的无BEST1(基因型)iPSC-RPE中，完全消除了Ca2+依赖性Cl-电流(图3B和图10A-10D)。一致地，在BEST1-/-hPSC-RPE细胞中，消除了BEST1的蛋白质和mRNA水平，但在TMEM16A-/-、TMEM16B-/-或LRRC8A-/-hPSC-RPE细胞中不受影响(图8A和9C)。此外，在BEST1-/-hPSC-RPE和患者衍生的无BEST1iPSC-RPE中，当WT BEST1从杆状病毒载体表达时，Ca2+依赖性Cl-电流得到完全挽救(图3B和10C)。总而言之，这些结果验证了hPSC-RPE作为研究BEST1功能的模型系统，并表明BEST1(而非TMEM16A、TMEM16B或LRRC8A)是人RPE中传导Ca2+依赖性Cl-电流的CaCC。
为了对功能获得突变进行建模，分别将杂合I205T和Y236C突变引入到H1-iCas9系中的BEST1基因，生成BESTI205T/WT和BESTY236C/WT hPSC细胞，然后其分别分化为BEST1I205T/WT和BEST1Y236C/WT hPSC-RPE细胞，用于膜片钳分析(图8A)。与来自瞬时转染的HEK293细胞的结果一致，在不存在Ca2+的情况下，来自BEST1I205T/WT hPSC-RPE的Cl-电流显著大于来自WT的Cl-电流，但在存在Ca2+的情况下相似(图4A-4C和10D)。另一方面，在所有测试的[Ca2+]i中，来自BEST1Y236C/WT hPSC-RPE的Ca2+依赖性Cl-电流显著大于来自WT的Ca2+依赖性Cl-电流(图4D-4F和10D)。这些结果再次证实了RPE中的BEST1 I205T和Y236C突变的功能获得和显性表现。
实施例5
hPCS-RPE中的BEST1功能获得突变无法通过基因增强来挽救。
为了测试携带BEST1功能获得突变的hPSC-RPE中的异常Ca2+依赖性Cl-电流能否通过基因增强挽救，用表达WT BEST1-GFP的杆状病毒感染BEST1I205T/WT和BEST1Y236C/WT hPSC-RPE细胞，并进行膜片钳分析。值得注意的是，在不存在Ca2+的情况下进行基因增强后，这些突变体hPSC-RPE细胞中的Ca2+依赖性Cl-电流仍然异常(图4B和4E)，尽管外源WT BEST1以高于内源BEST1的水平的水平表达(图11A)。这与BEST1-/-或使用相同方法的功能丧失突变体RPE细胞中的Ca2+依赖性Cl-电流的恢复形成鲜明对比(图3B和11A)。因此，该结果表明单独的基因增强不足以挽救BEST1功能获得突变。
实施例6
通过与增强组合的无偏见的CRISPR/Cas9介导的基因沉默来挽救BEST1功能获得突变
为了靶向沉默的内源BEST1，采用了由与C末端的二分KRAB-MeCP2阻遏物结构域融合的无核酸酶活性Cas9(dCas9)构成的可编程转录阻遏物(dCas9-KRAB-MeCP2)。为了同时递送完整的CRISPR机制，构建了基于杆状病毒的沉默(BVSi)载体，其含有CMV启动子驱动的dCas9-KRAB-MeCP2-T2A-GFP表达盒，以及U6启动子驱动的gRNA表达盒(图11B)。通过核酸酶测量仪测定筛选了靶向BEST1的外显子3和5的多个向导，并且将最高效的向导与非特异性扰乱向导一起分别构建到BVSi骨架中，用于病毒产生(表1)。所得BEST1靶向病毒(BVSi 3-8和BVSi 5-4)和对照病毒(BVSi-Ctrl)用于感染WT hPSC-RPE细胞。免疫印迹显示出，与BVSi5-4病毒相比，BVSi 3-8病毒的更好的BEST1敲低效率(图11C)。一致地，在1.2μM[Ca2+]i时，与来自BVSi 5-4感染的细胞的Ca2+依赖性Cl-电流相比，来自BVSi 3-8感染细胞的Ca2+依赖性Cl-电流更有效地减弱(图5A)，其中RPE细胞展示出峰值Cl-电流振幅。这些结果表明BVSi3-8设计的高沉默功效，这可用于沉默/增强策略的后续步骤。
为了在BVSi 3-8存在的情况下增强WT BEST1，生成了携带对gRNA 3-8的识别具有抗性的摆动WT BEST1-mcherry的杆状病毒(图11C)。当共表达摆动WT BEST1-mCherry时，BVSi 3-8处理的WT hPSC-RPE细胞中的减弱的Ca2+依赖性Cl-电流在1.2μM[Ca2+]i下得到完全挽救(图5B)，这验证了WT hPSC-RPE细胞中的沉默/增强系统。为了测试这种用于挽救功能获得突变的策略，在BEST1I205T/WT和BEST1Y236C/WT hPSC-RPE细胞中进行了同一组实验。值得注意的是，在1.2μM[Ca2+]i下，在突变体hPCS-REP细胞中，用BVSi 3-8处理减弱了内源性BEST1蛋白(图11D)，同时在这些细胞中消除了Ca2+依赖性Cl-电流(图5C-5D)，而在所有测试的[Ca2+]i下，摆动WT BEST1-mCherry的共表达恢复了Cl-电流(图5C-5F和11D)，这为治愈与BEST1功能获得突变相关联的Best疾病提供了概念验证。
在本研究中，比较了10种患者衍生的BEST1突变(包括一种常染色体隐性突变、六种常染色体显性功能丧失突变和3种常染色体显性功能获得突变)对瞬时转染的HEK293细胞中的BEST1的通道活性的影响。尽管隐性突变和功能获得突变分别展示出其预期的隐性表现和显性表现，但常染色体显性功能丧失突变仅在优异的4:1比率下相对于WT BEST1呈显性，而在典型的1:1比率下非显性(图1)。因为超过250种有记录的BEST1致病突变中的大多数都是常染色体显性的，并且在体外测试时展示出功能丧失，所以该结果表明等位基因特异性表观遗传控制在bestrophin病的进展中的重要作用。为了有力支持这个观点，在供体衍生的iPSC-RPE和幼稚RPE细胞中检测到两个内源BEST1等位基因的不平衡转录(表2)，这与先前的观察一致，即在人视网膜转录组中，BEST1是具有等位基因表达不平衡(AEI)的遗传性视网膜疾病基因之一。
已经证明AEI是哺乳动物中的常见现象。一项基于SNP阵列的研究调查了602个人基因，并发现一半的基因展示出AEI，而一项通过分析小鼠转录组的研究揭示，约20％的基因易于以组织特异性方式进行AEI。此外，体细胞突变的AEI在癌症中已得到充分记录，这代表了肿瘤发生的重要机制。然而，AEI在遗传性单基因疾病中的意义仍然理解不充分。没有需要AEI的任何遗传变异用于发病机制的先前的报道。在此，表明了人RPE细胞中BEST1的显性突变引起的Best疾病可以充当解决孟德尔病症中的AEI的影响的范例。
通常，在bestrophin病患者中，当突变仅存在于两个BEST1等位基因之一上时，鉴定出常染色体显性突变。然而，这个定义只考虑了基因组基因剂量，而未考虑等位基因转录/表达水平。例如，当以1:1的比率与WT BEST1进行共转染时，在HEK293细胞中，本研究中测试的六种常染色体显性功能丧失突变均隐性地表现，然而，在患者衍生的iPSC-RPE细胞中，显著降低的BEST1通道活性与突变等位基因相较于WT等位基因的更高转录水平相关联，这反映了显性失活效应而非典型的显性效应。因此，至少一部分先前定义的常染色体显性突变实际上是隐性的，但当它们的表达超过WT BEST1等位基因的表达时，其表现出显性失活表型。这与此前的发现一致，即基因增强足以挽救BEST1功能丧失突变，无论它们在遗传上归类为常染色体显性还是隐性，并且为携带相同BEST1突变的患者中的不完全外显率和可变的临床表达性提供了解释。
BEST1作为CaCC的内在功能、在RPE中的生理定位以及与视网膜退行性bestrophin病的病理学相关性强烈表明BEST1是RPE中的主要CaCC。与这一观点一致，此前报道过BEST1在供体衍生的iPSC-RPE细胞中生成Ca2+依赖性Cl-电流中不可或缺的作用。然而，其他候选物，包括TMEM16A和TMEM16B，也已经被认为是猪或原代小鼠RPE和人RPE衍生的ARPE-19细胞中的生理CaCC。来自同基因敲除的hPSC-RPE细胞的结果显示，BEST1-/-细胞中的Ca2+依赖性Cl-电流减弱，并且TMEM16A-/-、TMEM16B-/-或LRRC8A-/-细胞中则保持完整(图3)。因此，得出以下结论：BEST1是人RPE中真正的CaCC。
此前建立了“皿中疾病”模型，其中iPSC系重编程自不同BEST1突变携带者的皮肤细胞，并然后分化成相应的iPSC-RPE细胞，用于功能研究(图3A)。这种基于iPSC-RPE的模型保持了患者的遗传背景，并因此具有与BEST1相关联的视网膜疾病的直接相关性，但受到患者样品可用性的限制。例如，一些BEST1突变比其他突变更罕见，并且携带者可能不愿意提供样品或提供样品在逻辑上不可行。在此，基于工程化hPSC系(H1-iCas9)，“皿中疾病”模型已经进一步扩展，该模型允许经由CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术来引入期望的BEST1突变，生成可以分化成同基因hPSC-RPE细胞的同基因hPSC系(图3-4)。重要的是，BEST1WT/WThPSC-RPE传导与来自BEST1WT/WT iPSC-RPE的Ca2+依赖性Cl-电流几乎相同的Ca2+依赖性Cl-电流(图3A)，这将hPSC-RPE验证为对BEST1突变进行建模的的多功能工具。
由于BEST1通道是五聚体组装物，所以展示表型所需的突变体原聚体的数量理论上可以是1、2、3、4或5种。有趣的是，已经记录了bestrophin病的五种亚型，这强调了突变的“强度”与所得的疾病之间的潜在相关性。支持这一假设的是，ARB由BEST1常染色体隐性突变引起，其代表了“最弱的”类别，其需要通道五聚体中的五个突变体原聚体以呈现表型(图1H和6)。另一方面，功能获得突变诸如D203A、I205T和Y236C代表“最强的”类别，即使在1:4比率下(大概每个通道一个原聚体，图2A-2C和7B)，其也相对于WT BEST1呈显性，尽管仍然不清楚它们是否特定地关联至某种类型的bestrophin病。常染色体显性功能丧失突变似乎代表“中间的”类别，其需要BEST1通道中的2-4个原聚体才能展示出突变体表型。例如，本研究中测试的6个功能丧失突变(A10T、R218H、L234P、A243T、Q293K和D302A)可能代表4突变体原聚体类别，因为在HEK293细胞中，它们仅在与WT的4:1比率下呈显性失活，而Y85H、R92C、R218S和G299E可以代表2/3-突变体原聚体类别，因为此前在HEK293细胞中显示出，它们在1:1比率下相对于WT呈显性。然而，应当注意的是，具有常染色体显性突变的bestrophin病患者的RPE中内源BEST1突变体与WT分子比率仍不清楚，因为大多数BEST1突变都是错义的，使得在免疫印迹中抗体不能区分WT蛋白和突变蛋白。
功能获得突变通常具有很强的显性效应，这与它们即使在1:4比率下也抑制WT的结果一致(图2A-2C和7B)。这表明，对于有效的基因增强疗法，内源功能性BEST1和外源提供的功能性BEST1的组合蛋白水平必须比内源突变体BEST1的蛋白水平至少高四倍。然而，显示即使使用强CMV启动子(与内源BEST1的蛋白水平相比，其产生的外源BEST1蛋白水平显而易见地更高)，BEST1I205T/WT和BEST1Y236C/WT hPSC-RPE细胞中的功能获得表型也不能得到挽救(图4B、4E和11A)。因此，单独通过基因增强来挽救BEST1功能获得突变可能是不切实际的，因为临床应用将大概需要幼稚BEST1启动子，该启动子甚至比CMV启动子更弱。在结构上，三个功能获得突变(D203A、I205T和Y236C)位于或紧邻通道的颈部或缝隙(图12)，并涉及这两个Ca2+依赖性门中至少一个的打开。相比之下，功能丧失突变位于通道的各个区域。
使用基于CRISPR/Cas9的基因沉默载体(BVSi)来抑制内源BEST1表达，本研究中组合应用了对两个内源等位基因的无偏见抑制与WT基因增强。由于BVSi识别的BEST1基因组基因座没有任何已报道的致病突变或多态性，所以无论其突变位于何处，该BVSi设计普遍适合于bestrophin病患者的BEST1沉默。值得注意的是，虽然单独的基因增强容易足以挽救功能丧失突变，但同时抑制内源性BEST1并不会干扰功能性恢复。因此，将沉默+增强组合策略考虑为用于治疗bestrophin病的最佳方法。
应当理解，前述详细描述和所附实施例仅是说明性的，并且不应被视为对本公开的范围的限制，本公开的范围仅由所附权利要求及其等同物限定。
对所公开的实施方案的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且可以在不脱离其精神和范围的情况下进行。
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序列表
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<120> BEST1功能丧失突变和功能获得突变的挽救策略
<130> COLUM-40036.601
<150> US 63/174,090
<151> 2021-04-13
<160> 9
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
ctcacccagc acgaaggaaa 20
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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gctggcctgc gcggtcccac 20
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<211> 20
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tccttggtga cccacttaca 20
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tgtatacaca ggtgaggact 20
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gccctgggtg tggtttgcca acctgtcaat gaaggcgtgg cttggaggtc gaattcggga 60
ccctaccctg ctccagagcc tgctgaacgt gagcccactg tacagacagg gctgccgcag 120
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 9
tcagtgtgga cacctgtatg cctacgactg gattagtatc ccactggtgt gtacacaggt 60
gaggactagt ctggtgaggc tgcccttttg ggaaactgag gctagaagga ccaaggaagc 120

Claims (15)

1.方法，其包括
将有效量的以下引入到细胞中：
成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)干扰(CRISPRi)系统，或编码所述CRISPRi系统的一种或多种核酸，其配置为敲除或至少部分沉默靶内源基因的两个等位基因，其中所述CRISPRi系统包含：(a)至少一种Cas蛋白，(b)至少一种gRNA，其中每种gRNA配置为与编码所述靶内源基因的核酸序列的一部分杂交，和(c)转录阻遏物；以及
编码所述靶内源基因的外源功能性形式的核酸。
2.权利要求1所述的方法，其中所述Cas蛋白和所述转录阻遏物作为融合蛋白或编码其的核酸提供。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述Cas蛋白是无催化活性的。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9、Cas12a和Cas14。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白、所述至少一种gRNA和所述转录阻遏物在单个核酸上提供。
6.权利要求5所述的方法，其中所述单个核酸是杆状病毒载体或慢病毒载体。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述靶内源基因是疾病相关联的基因。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞是体内的。
9.权利要求8所述的方法，其中引入到细胞中包括施用至受试者。
10.权利要求9所述的方法，其中所述受试者患有或疑似患有选自由神经退行性疾病和眼部疾病组成的组的疾病或病症。
11.权利要求10所述的方法，其中所述疾病或病症包括Best卵黄状黄斑营养不良(BVMD)、常染色体隐性bestrophin病(ARB)、成人发病的卵黄状营养不良(AVMD)、常染色体显性玻璃体视网膜脉络膜病变(ADVIRC)、或色素性视网膜炎(RP)。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述靶内源基因是BEST1。
13.权利要求12所述的方法，其中所述BEST1包含D203A突变、I205T突变或Y236C突变。
14.系统，其包括：
成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)-Cas系统，或编码所述CRISPR-Cas系统的一种或多种核酸，其配置为敲除或至少部分沉默靶内源基因的两个等位基因，其中所述CRISPRi系统包含：(a)至少一种Cas蛋白，(b)至少一种gRNA，其中每种gRNA配置为与编码所述靶内源基因的核酸序列的一部分杂交，和(c)转录阻遏物；以及
编码所述靶内源基因的外源功能性形式的核酸。
15.权利要求14所述的系统，其中所述靶内源基因是BEST1。
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