CN118026951A - 一种akt3抑制剂、药物组合物及其应用 - Google Patents

一种akt3抑制剂、药物组合物及其应用 Download PDF

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丁辉勇
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Abstract

本申请适用于生物医药技术领域，提供了一种AKT3抑制剂、药物组合物及其应用，所述AKT3抑制剂包括化合物2279‑4216或其药学上可接受的对映异构体、盐或溶剂化物；所述化合物2279‑4216的结构如下式I所示：。本申请提供的AKT3抑制剂可抑制肿瘤细胞增殖，具有良好的抗肿瘤效果，研究价值高。

Description

一种AKT3抑制剂、药物组合物及其应用
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种AKT3抑制剂、药物组合物及其应用。
背景技术
AKT也被称为蛋白激酶B (PKB)，是AGC家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，存在于三个同源的人类亚型(AKT1, AKT2, AKT3)中。AKT在影响细胞存活和增殖的信号转导和凋亡通路中起着至关重要的作用，其过表达在多种细胞类型中具有抗凋亡作用。此外，AKT的关键负调控因子PTEN在许多癌症中发生突变或缺失，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤等。因此，抑制AKT信号通路为治疗癌症提供了一种可行的策略。
AKT3是全长479个氨基酸，分子量约55.8K的AKT家族成员，常扩增在卵巢癌、子宫内膜癌和乳腺癌中，在肿瘤的增殖和凋亡过程中起到关键作用。此外AKT3被认为是肿瘤抵抗抗癌化疗的关键因素。由于AKT3与同工酶的高序列同源性，并且该系列在临床前物种中口服暴露不良，其选择性小分子抑制剂的发展受到阻碍，多家知名药企对其开发均以失败告终，更无一款小分子药物被批准上市。因此，寻求靶向人源AKT3抑制剂的小分子对研究抗肿瘤药物的开发具有重要的意义。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供一种AKT3抑制剂、药物组合物及其应用。
基于上述目的，本申请第一方面提供了一种AKT3抑制剂，所述AKT3抑制剂包括化合物2279-4216或其药学上可接受的对映异构体、盐或溶剂化物；所述化合物2279-4216的结构如下式I所示：
。
本申请第二方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述的AKT3抑制剂，和/或，药学上可接受的载体。
本申请第三方面提供了一种上述的AKT3抑制剂或者上述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
进一步地，所述AKT3抑制剂分别用于抑制MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞的浓度均为6.25-200μM；
所述AKT3抑制剂用于抑制HepG2细胞的浓度为12.5-200μM；
所述AKT3抑制剂用于抑制SNU-387细胞的浓度为50-200μM；
所述AKT3抑制剂用于抑制OVCAR-8细胞的浓度为25-200μM。
进一步地，所述AKT3抑制剂用于抑制MDA-MB-231细胞的浓度为50-200μM；
所述AKT3抑制剂分别用于抑制SNU-387细胞、OVCAR-8细胞的浓度为100-200μM。
本申请通过分析AKT1晶体结构里所有抑制剂的结合模式，发现其正构位点的结合的小分子并没有完全占据所有空腔，且带有一定的偏向性，并创新性地将此偏向性应用于AKT3抑制剂的挑选，所筛选得到的AKT3抑制剂可抑制肿瘤细胞增殖，具有良好的抗肿瘤效果，研究价值高。
附图说明
图1为本申请实施例提供的AKT3预测的结构和同源蛋白AKT1的结构比对图；
图2为本申请实施例提供的Protein Preparation Wizard模块参数图；
图3为本申请实施例提供的LigPrep模块参数图；
图4为本申请实施例提供的STSP的活性测试结果；
图5为本申请实施例提供的化合物2279-4216针对AKT3酶的活性测试结果；
图6为本申请实施例提供的化合物2279-4216的抗肿瘤测试结果。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请实施例提供了一种AKT3抑制剂，所述AKT3抑制剂包括化合物2279-4216或其药学上可接受的对映异构体、盐或溶剂化物；所述化合物2279-4216的结构如下式I所示：
。
可以理解为，式I所示的化合物及其对映异构体、多晶型物、药学上可接受的盐和衍生物可以用于抑制肿瘤细胞增殖。
在某些实施例中，所述AKT3抑制剂是式I所示的化合物的衍生物。本申请中使用的术语“衍生物”包括式I或其对映异构体、多晶型物或药学上可接受的盐的种或多种化学修饰。也就是说，“衍生物”可以是式I的功能等同物，其能够在给定受试者中诱导改善的药理学功能活性和/或行为应答。这样的化学修饰的示例是用卤素基团、烷基基团或氨基基团替换氢。另外，术语“药学上可接受的盐”指那些保留母体化合物的生物有效性及特性的盐。
本申请实施例提供的AKT3抑制剂可应用于制备药物组合物，具体地，所述药物组合物包括上述的AKT3抑制剂，和/或，药学上可接受的载体。
术语“药物组合物”指一种或多种本文中所述的化合物或其生理学上可接受的盐与其它化学成分(诸如生理学上可接受的载体及赋形剂)的混合物。药物组合物的目的旨在促进化合物给予生物。
术语“药学上可接受的载体”指药学领域常规的药物载体，对生物不产生明显刺激且不会消除所给予的化合物的生物活性及特性的载体，例如：稀释剂，如水等；填充剂，如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂，如甘油；崩解剂，如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如十六烷醇；吸附载体，如高岭土和皂粘土；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁和聚乙二醇等。另外，还可以在上述药物组合物中加入其它辅料，如香味剂和甜味剂等。
所述AKT3抑制剂是通过以下虚拟筛选方法筛选得到：
对AKT3靶蛋白结构分别进行键级优化、质子化、限制性能量优化处理，以消除结构上的原子间冲突，使重原子的RMSD收敛于0.3 Å，进行侧链位置优化；
对化合物库进行质子化，去盐，生成互变异构体，以及对小分子进行构象生成处理，经多次筛选以及小分子柔性对接，结合对骨架多样性和结合模式的分析，确定候选化合物；
基于AKT1晶体结构中各个抑制剂的特定结合模式以及各个所述候选化合物的选择结合自由能，经活性测试，筛选出AKT3抑制剂；所述特定结合模式为正构位点结合的小分子并没有完全占据所有空腔，且带有偏向性。
具体而言，该AKT3抑制剂的虚拟筛选方法如下所示：
AKT3结构：人源AKT3目前只有其PH结构域（5-107aa）有晶体结构解析，PDB ID:2X18，其激酶功能域（148-405aa）尚未解析出晶体结构，本申请实验选择AlphaFold预测的结构进行研究。从AlphaFold官网下载其预测的AKT3结构（https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9Y243），如图1所示。
化合物库：本申请构建了一个新颖的结构多样的，可以快速得到的化合物库。其融合了ChemDiv（https://www.chemdiv.com）、Vitas-M（https://vitasmlab.biz/）、Lifechemicals（https://lifechemicals.com/）三个化合物库，共计约350万化合物。
分子对接：本申请实验选择AlphaFold构建的AKT3结构，选择其及激酶功能域进行筛选。
靶蛋白结构的处理：使用Schrödinger软件中的Protein Preparation Wizard模块对靶蛋白结构分别进行键级优化，加氢，二硫键分配，采用PROPKA方法在pH 7.0下进行质子化；用OPLS4力场进行限制性能量优化，消除结构上的原子间冲突，使重原子的RMSD收敛于0.3 Å，进行侧链位置优化获得良好的侧链结构。Protein Preparation Wizard模块参数如图2所示。
小分子化合物库的准备：采用Schrödinger软件中LigPrep模块（LigPrep, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2021）对化合物库进行处理，采用Epik方法在pH 7.0±2.0条件下进行质子化，去盐，生成互变异构体，保持原有原子手性。为了保证虚拟筛选过程中小分子全局构象，对小分子进行构象生成，每个小分子最多生成32个构象。将准备好的化合物库保存，用于后续虚拟筛选。LigPrep模块参数如图3所示。
筛选流程：导入准备好的受体和配体文件，采用Glide-HTVS[高通量筛选]进行初筛，保留前10%的结果进行后续分析，采用Glide-SP[标准精度模式]进行再次筛选，对接参数设为默认值，采用小分子柔性对接方式，对接后进行能量优化，保留前10%的结果进行分析。采用Glide-XP[额外精度模式]进行再次筛选，对接参数设为默认值，采用小分子柔性对接方式，对接后进行能量优化，保留前10%的结果进行分析。
结果分析：通过分子对接获得3075个化合物构象，Lifechemical化合物库整体结果较差，对ChemDiv和Vita-m化合物库结果进一步分析，通过分析其骨架多样性和结合模式，分别得到161个和154个化合物。对得到的结果进一步筛选，得到282个化合物。分析AKT1晶体结构里所有抑制剂的结合模式，发现其正构位点的结合的小分子并没有完全占据所有空腔，且带有一定的偏向性。将此偏向性应用于AKT3抑制剂的挑选，最终结合MM/GBSA计算的选择结合自由能打分，选择结合自由能小于-50的104个化合物。对化合物进行活性测试，从中获得可作为AKT3抑制剂的式I所示的活性化合物2279-4216。
本申请实施例还提供了一种上述的AKT3抑制剂或者上述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
其中，所述肿瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、子宫内膜癌、白血病。
其中，所述AKT3抑制剂可用于抑制肿瘤细胞增殖。所述肿瘤细胞包括但不限于OVCAR-8、HepG2、SNU-387、MCF-7、MDA-MB-231。
所述AKT3抑制剂分别用于抑制MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞的浓度均为6.25-200μM；
所述AKT3抑制剂用于抑制HepG2细胞的浓度为12.5-200μM；
所述AKT3抑制剂用于抑制SNU-387细胞的浓度为50-200μM；
所述AKT3抑制剂用于抑制OVCAR-8细胞的浓度为25-200μM。
优选地，所述AKT3抑制剂用于抑制MDA-MB-231细胞的浓度为50-200μM；
所述AKT3抑制剂分别用于抑制SNU-387细胞、OVCAR-8细胞的浓度为100-200μM。
所述AKT3抑制剂分别用于抑制MCF-7细胞、HepG2细胞的浓度均为200μM。
以下给出本申请AKT3抑制剂的活性测试以及抗肿瘤测试相关实施例，以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
另外，需要说明的是，以下实施例中所给出的数值是尽可能精确，但是本领域技术人员理解由于不可能避免的测量误差和实验操作问题，每一个数字都应该被理解为约数，而不是绝对准确的数值。
实施例1活性测试
利用ADP-Glo方法检测式I所示的化合物（2279-4216）在AKT3酶上的作用，化合物测试50 µM和1 µM，n=2；阳性药为STSP（Staurosporine，星形孢菌素），检测浓度为10 µM，5倍稀释，8个浓度点，n=1，结果显示化合物在AKT3酶上有不同作用。
1、实验材料
1.1试剂与耗材
1）AKT3, Active(0.1μg/μl)，SignalChem，货号：A18-10G
2）AKT(SGK)Substrate (1mg/ml)，SignalChem，货号：A08-58
3）Kinase Assay Buffer III，Signal Chem，货号：K03-09
4）DTT，Aladdin，货号：D104859-5g
5）ADP-Glo™ Kinase Assay，Promega，货号：V9101
6）二甲亚砜（DMSO），国药，货号：30072418
7）Staurosporine，陶术，货号：T6680
8）384 well small volume white plate，Greiner，货号：784075
Nivo，PerkinElmer
1.2化合物信息，如下表1所示：
2、实验方法
2.1化合物工作液浓度的配制
根据检测要求，将待测化合物分别用100% DMSO稀释至所需浓度，然后用1X缓冲液进行20倍稀释，配制成5 X的化合物工作液。
2.2实验步骤
1）冰上解冻AKT3酶，AKT(SGK)Substrate，kinase assay buffer III（5 X缓冲液），DTT（2 M）和ATP（10 mM），并且以上试剂在整个实验过程中需要一直放置在冰上。
2）将5X的缓冲液用去离子水配置成1X的缓冲液，并在其中加入DTT，DTT在1X缓冲液中的浓度为50 μM；
3）将1 μl/孔5X待测化合物加入到白色微孔板中，微孔板在离心机上1000转离心1分钟；
阳性对照孔（Pos.Ctrl）：1μl/孔化合物稀释溶剂
空白对照孔（Blank）：1μl/孔 1 X缓冲液
4）AKT3酶完全解冻后，使用1 X的缓冲液将AKT3酶稀释到0.5ng/μl，取2μl/孔加入到白色微孔板中，此时每孔中AKT3的酶量为1ng；空白对照孔加入2μl/孔1X缓冲液；此步骤在冰上进行，加完后，微孔板在离心机上1000转离心1分钟；
5）配制AKT(SGK)Substrate /ATP混合液：
AKT(SGK)Substrate /ATP混合液：取410μl的AKT(SGK)Substrate（1mg/ml）加入10.25 μl l0 mM ATP和400 μl的2 X缓冲液（注意此处是按比例稀释），此时ATP浓度为125μM，AKT(SGK)Substrate浓度为0.5 mg/ml；此步骤在冰上进行；
6）取2μl/孔AKT(SGK)Substrate/ATP的混合溶液到白色微孔板中，此时AKT(SGK)Substrate浓度为0.2mg/ml，ATP浓度为50 μM，加完后微孔板1000转离心1分钟；
7）离心完毕后，给微孔板贴上膜，压紧贴膜，在25℃中孵育1小时；
8）将Promega的试剂盒中需要用的ADP-GloTM reagent和Kinase Detection相关试剂平衡到室温，并按照说明书将Kinase Detection buffer和Kinase DetectionSubstrate混合备用。
9）结束孵育后，取5μl/孔ADP-GloTM reagent加入到白色微孔板中，微孔板1000转离心1分钟，25℃中孵育40分钟；
10）结束孵育后，取Kinase Detection混合液10μl/孔加入到微孔板中，微孔板1000转离心1分钟，25℃中孵育30分钟；
11）结束孵育后在读板器上进行化学发光（Luminescence）检测，读取发光值（RLU）；
12）酶抑制率计算：
%Inhibition=100-（RLU(Sample)-RLU(Blank)）/（RLU(Pos.Ctrl)-RLU(Blank)）×100%
3、实验结果
如图4-5所示，STSP的IC50为38.77nM；式I所示化合物的IC50为34.36μM。
实施例2 AKT-3抑制剂抗肿瘤测试
1、实验材料
1.1细胞株信息
1）OVCAR-8 人卵巢癌细胞：培养基成分为RPMI-1640 + 10% FBS + 1% PS
2）HepG2 人肝癌细胞：培养基成分为MEM + 10% FBS + 1% PS
3）SNU-387 人肝癌细胞：培养基成分为RPMI-1640 + 10% FBS + 1% PS + 1%Sodium Pyruvate
4）MCF-7 人乳腺癌细胞：培养基成分为MEM + 10% FBS + 1% PS
5）MDA-MB-231 人乳腺癌细胞：培养基成分为L15 + 10% FBS + 1% PS
1.2试剂与耗材
1）RPMI-1640培养基：Gibco，货号：61870
2）MEM培养基：Gibco，货号：10370
3）L15培养基：源培，货号：L620KJ
4）胎牛血清（FBS，新西兰血源），Hyclone，货号：SH30406.05
5）青霉素-链霉素溶液(100X) ，碧云天，货号：C0222
6）Sodium Pyruvate溶液(100X) ，Gibco，货号：C022211360070
7）PBS，碧云天，货号：C0221A
8）阳性化合物STSP（10 mM DMSO储存液），Targetmol，货号：T6680
9）CTG，Promega，货号：G7573
10）DMSO，Adamas，货号：75927L
11）384孔白色透底细胞培养板，Corning，货号：3765
12）96孔平底细胞培养板，Corning，货号：3596
13）96孔V底化合物稀释板，Nest，货号：701201
14）100 mm细胞培养皿，Corning，货号：430167
1.3仪器设备
1）离心机，Thermo Fisher，型号：75009880
2）生物安全柜，苏净安泰，型号：BSC-1604IIA2
3）二氧化碳培养箱：Thermo Fisher，型号：311
4）倒置生物显微镜：Olympus，型号：CKX53
5）多功能酶标仪：Tecan，型号：SPARK
1.4化合物信息
受试化合物形式为DMSO储存液，详细信息见上表1，于-20℃下保存。
2、实验方法
2.1细胞培养
当细胞汇合度达到80~90%左右时进行传代，传代时，小心移除大部分原培养基，用剩余的培养基轻轻吹打贴壁松散的细胞，待细胞完全从培养皿表面脱落后，稍作离心后弃去上清液，用新鲜培养基重悬细胞，并将细胞按适当比例传至新的培养皿中，放入37 ℃，5%CO2培养箱中培养。
2.2细胞接种及药物处理
2.2.1化合物工作液浓度的配制
384孔板：将化合物储存液稀释至最高终浓度的2倍，然后用DMSO含量与前述稀释液一致的培养基进行梯度稀释。
96孔板：将化合物储存液稀释至最高终浓度的10/3倍，然后用DMSO含量与前述稀释液一致的培养基进行梯度稀释。
2.2.2细胞接种及药物处理
1）收集处于对数生长期的细胞，按相应密度将细胞接种至96或384孔板中，每孔接种70或25 µl细胞悬液，于37 ℃，5% CO2培养箱中过夜。各个细胞每孔的铺板密度如下：
2）待次日细胞贴壁完全后，每孔加入30 µl（96孔板）或25 µl（384孔板）对应的化合物稀释液，并继续孵育72小时。
3）结束孵育后：
CTG：每孔加入50 µl C试剂以裂解细胞，半小时内在酶标仪上测定发光值。
2.3数据处理
%抑制率=(1- (SS- SBLK) / (SNC–SBLK))×100%
其中：
SS：样品孔的信号值（细胞+待测化合物）
SNC：阴性孔的信号值（细胞+溶媒）
SBLK:空白孔的信号值（培养基+溶媒）
3、实验结果
如图6以及下表2-3所示，对MDA-MB-231、MCF-7、HepG2、SNU-387、OVCAR8的IC50值分别为20.02μM、8.53μM、94.68μM、31.38μM、16.81μM。
本实施例利用CTG法针对式I所示的化合物2279-4216对几种常见肿瘤细胞的增殖抑制作用进行评价，以仅加溶媒的细胞培养孔为阴性对照，不含细胞的溶媒孔为空白对照，并以10µM阳性化合物STSP处理的细胞孔为阳性对照。所有受试组别均设3个重复孔。实验体系为384或96孔板。如图6以及表2-3所示结果显示：化合物2279-4216在所有参试肿瘤细胞株上均体现出了增殖抑制活性，且在高浓度时在所有细胞上都能达成近100%的抑制作用，但其在各个细胞上的IC50并不总是与细胞的磷酸激酶B-γ（AKT-3，PKBγ）表达量呈正相关；另外，该化合物活性普遍较强，但在低浓度时对某些特定的肿瘤细胞株反而可能促进其增殖。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种AKT3抑制剂，其特征在于，所述AKT3抑制剂包括化合物2279-4216或其药学上可接受的对映异构体、盐或溶剂化物；所述化合物2279-4216的结构如下式I所示：
。
2.根据权利要求1所述的AKT3抑制剂，其特征在于，所述AKT3抑制剂是通过以下虚拟筛选方法筛选得到：
对AKT3靶蛋白结构分别进行键级优化、质子化、限制性能量优化处理，以消除结构上的原子间冲突，使重原子的RMSD收敛于0.3 Å，进行侧链位置优化；
对化合物库进行质子化，去盐，生成互变异构体，以及对小分子进行构象生成处理，经多次筛选以及小分子柔性对接，结合对骨架多样性和结合模式的分析，确定候选化合物；
基于AKT1晶体结构中各个抑制剂的特定结合模式以及各个所述候选化合物的选择结合自由能，经活性测试，筛选出AKT3抑制剂；所述特定结合模式为正构位点结合的小分子并没有完全占据所有空腔，且带有偏向性。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1所述的AKT3抑制剂，和/或，药学上可接受的载体。
4.一种如权利要求1所述的AKT3抑制剂或者如权利要求3所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、子宫内膜癌、白血病。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述AKT3抑制剂用于抑制肿瘤细胞增殖。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括OVCAR-8、HepG2、SNU-387、MCF-7、MDA-MB-231。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述AKT3抑制剂分别用于抑制MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞的浓度均为6.25-200μM；
所述AKT3抑制剂用于抑制HepG2细胞的浓度为12.5-200μM；
所述AKT3抑制剂用于抑制SNU-387细胞的浓度为50-200μM；
所述AKT3抑制剂用于抑制OVCAR-8细胞的浓度为25-200μM。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述AKT3抑制剂用于抑制MDA-MB-231细胞的浓度为50-200μM；
所述AKT3抑制剂分别用于抑制SNU-387细胞、OVCAR-8细胞的浓度为100-200μM。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述AKT3抑制剂分别用于抑制MCF-7细胞、HepG2细胞的浓度均为200μM。
CN202410149810.7A 2024-02-01 2024-02-01 一种akt3抑制剂、药物组合物及其应用 Pending CN118026951A (zh)

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